肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法
专利汇可以提供肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，可有效解决在不同肾脏 疾病 中研究足细胞损伤的作用机制的问题，其解决的技术方案是，通过基因工程技术对前期建立的携带FLOX-DLX6-os1转基因小鼠与另一种携带足细胞特异的NPHS2-Cre基因的转基因小鼠进行多代的繁殖杂交，实现肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育，本发明为明确lncRNA DLX6-os1在足细胞损伤中的作用提供了非常好的动物模型，有效解决在不同肾脏疾病中研究足细胞损伤的作用机制的问题，是转基因小鼠的培育方法上的创新。，下面是肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法专利的具体信息内容。
1.一种肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，其特征在于，通过基因工程技术对前期建立的携带FLOX-DLX6-os1转基因小鼠与另一种携带足细胞特异的NPHS2- Cre基因的转基因小鼠进行多代的繁殖杂交，具体是：
1）基因动物打靶培育F0代：将Southern blot验证基因为阳性的ES细胞用于基因打靶，即将基因敲除质粒载体导入ES细胞中，通过显微注射到囊胚中，再移植到代孕母鼠的子宫内发育下一代，获得携带FLOX-DLX6-os1的首建鼠F0代；
2）F1代杂合子小鼠繁殖：利用携带FLOX-DLX6-os1的首建鼠与野生型小鼠交配，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/+基因型的小鼠作为F1代杂合子；
3）F2代组织特异性KO杂合子小鼠繁殖：将F1代杂合子小鼠与带有NPHS2-Cre 基因型的小鼠杂交，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为F2代组织特异性KO杂合子；
4）纯合子足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠繁殖：将F2代组织特异性KO杂合子相互交配，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为组织特异性KO纯合子，即得足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠。
2.根据权利要求1所述的肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1、基因动物打靶培育F0代：
将靶向的ES细胞克隆6F4注射到C57BL/6白化胚胎中，然后将其重新植入CD-1假妊娠雌性中，通过其毛色辨别亲本，用C57BL/6雌性育种并随后对后代进行基因分型确认种系传递：
A、ES打靶-电转
（1）、DMEM培养基加入15%胎牛血清，37℃，5%CO2培养ES细胞；
（2）、胰酶消化，进行细胞计数，确定细胞量足够电转；
（3）、离心收集细胞，加入电转缓冲液和线性化质粒DNA，冰浴片刻，将混合物加入电转杯进行电转；
（4）、电转后冰浴片刻，接种于培养ES细胞的培养基，所述的培养基由DMEM培养基加入
15%胎牛血清组成；
（5）、培养过夜，次日加药，进行抗药性筛选；
（6）、继续培养，待细胞生长稳定后，挑单克隆于96孔板；
（7）、将96孔板ES细胞转移至新的96孔板，传代培养；
（8）、细胞生长稳定后，96孔板细胞送检PCR，做初次打靶筛选；同时，备份板于-80℃保存；
B、ES打靶-PCR筛选：
（1）、SDS裂解液和蛋白酶K混合液裂解96孔板ES细胞，过夜裂解；
（2）、次日，用无水冰乙醇和氯化钠混合液沉淀基因组DNA；
（3）、质量浓度70%乙醇清洗沉淀，去除残留乙醇，加入RNAaseA和注射水混合液，封口37℃培养箱过夜，作为PCR模板；
（4）、准备96孔PCR板，进行PCR扩增及电泳检测；
PCR引物：
5’arm-F (P1): 5’-CTACTAGCCACATGCTTCTCTTGTGAGG-3’
5’arm-R (P2): 5’-TCGAACTTGTGGCCGTTTACGTG-3’
野生型: N.A.
基因敲除: 2.7 kb
~
Distal loxP PCR:
Distal-loxP-F (P3): 5’-GCCCCAAACTAGAAATCCCTCATC-3’
Distal-loxP-R (P4): 5’-TTGTATGGAGTTGACCCAAAGGGAG-3’
Wildtype: 238 bp
Targeted: 325 bp
（5）、电泳完成，记录检测结果；
C、ES打靶-细胞复苏传代：
（1）、准备细胞复苏所需试剂及物品；
（2）、取出-80℃冻存的备份板；
（3）、将PCR阳性克隆从96孔板传代至12孔板；
（4）、12孔板细胞生长稳定后，传至6cm培养皿；
（5）、再将6cm培养皿细胞传至10cm培养皿；
（6）、待细胞生长稳定后，消化，离心收集细胞，一部份冻存；一部分送检Southern Blot；
D、ES打靶-Southern Blot
（1）、PCR法制备地高辛标记探针；
（2）、ES细胞基因组DNA的抽提；
（3）、基因组DNA酶切，酶切产物进行电泳分离；
（4）、电泳凝胶转膜，将凝胶上的DNA转移至尼龙膜；
（5）、紫外交联固定尼龙膜；
（6）、DNA预杂交；
（7）、预杂交完成后，进行杂交过夜；
（8）、杂交后，进行洗膜和阻断；
（9）、加入抗体孵育，洗涤缓冲液洗涤后，加入检测缓冲液平衡；
（10）、将膜放入底物显色液中，避光显色，使用碧云天公司显色试剂盒显色；
（11）、显色完成，洗膜缓冲液洗涤，观察结果；
E、囊胚注射：
（1）、从交配后3.5天的供体母鼠子宫内获取囊胚；
（2）、安装显微注射设备，准备所需试剂及物品；
（3）、挑选形态良好、发育状态适中的囊胚，转移至注射皿的培养基内；
（4）、将待注射ES转移至注射皿的细胞培养基内，使其均匀排列，密度适中；
（5）、将ES细胞吸入注射针，将其逐个注射入囊胚腔；
（6）、注射完成后，可在囊胚腔内看到ES细胞；
F、代孕鼠制备及胚胎移植：
（1）、选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠；
（2）、将注射ES细胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宫内；
（3）、将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；
（4）、囊胚移植完成，待嵌合体小鼠出生；
（5）、嵌合体出生1周后编号，3周后进行分笼；
2、正确打靶的F1代杂合子小鼠繁殖：
（1）、步骤1中的雄性嵌合体出生满8周，与8周龄B6或Flp/Cre工具母鼠合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄，剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的具有flox/+基因型的F1代杂合子小鼠；
3、F2代组织特异性KO杂合子小鼠繁殖：
（1）、步骤2中的F1代杂合子小鼠杂交雄性嵌合体出生满8周，与带有NPHS2-Cre基因型的8周龄母鼠合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的F2代组织特异性KO杂合子小鼠；
4、纯合子足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠繁殖：
（1）、步骤3中的F2代组织特异性KO 杂合子小鼠出生满8周相互交配合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，确定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为组织特异性KO 纯合子，即足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠。
肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育
方法
技术领域
背景技术
发明内容
2）F1代杂合子小鼠繁殖：利用携带FLOX-DLX6-os1的首建鼠与野生型小鼠交配，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/+基因型的小鼠作为F1代杂合子；
3）F2代组织特异性KO杂合子小鼠繁殖：将F1代杂合子小鼠与带有NPHS2-Cre 基因型的小鼠杂交，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为F2代组织特异性KO杂合子；
4）纯合子足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠繁殖：将F2代组织特异性KO杂合子相互交配，得到新生小鼠，剪鼠尾进行PCR作为基因鉴定，确定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为组织特异性KO 纯合子，即得足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠。
具体实施方式
将靶向的ES 细胞克隆6F4 注射到C57BL/6 白化胚胎中，然后将其重新植入CD-1 假妊娠雌性中，通过其毛色辨别亲本，用C57BL/6 雌性育种并随后对后代进行基因分型确认种系传递：
A、ES打靶-电转
（1）、DMEM培养基加入15%胎牛血清，37℃，5%CO2培养ES细胞；
（2）、胰酶消化，进行细胞计数，确定细胞量足够电转；
（3）、离心收集细胞，加入电转缓冲液和线性化质粒DNA，冰浴片刻，将混合物加入电转杯进行电转；
（4）、电转后冰浴片刻，接种于培养ES细胞（胚胎干细胞）的培养基（DMEM培养基加入15%胎牛血清）中；
（5）、培养过夜，次日加药，进行抗药性筛选；
（6）、继续培养，待细胞生长稳定后，挑单克隆于96孔板；
（7）、将96孔板ES细胞转移至新的96孔板，传代培养；
（8）、细胞生长稳定后，96孔板细胞送检PCR，做初次打靶筛选；同时，备份板于-80℃保存；
B、ES打靶-PCR筛选：
（1）、SDS裂解液和蛋白酶K混合液裂解96孔板ES细胞，过夜裂解；
（2）、次日，用无水冰乙醇和氯化钠混合液沉淀基因组DNA；
（3）、质量浓度70%乙醇清洗沉淀，去除残留乙醇，加入RNAaseA和注射水混合液，封口37℃培养箱过夜，作为PCR模板；
（4）、准备96孔PCR板，进行PCR扩增及电泳检测；
PCR引物：
5’arm-F (P1): 5’-CTACTAGCCACATGCTTCTCTTGTGAGG-3’
5’arm-R (P2): 5’-TCGAACTTGTGGCCGTTTACGTG-3’
野生型: N.A.
基因敲除: 2.7 kb
~
Distal loxP PCR:
Distal-loxP-F (P3): 5’-GCCCCAAACTAGAAATCCCTCATC-3’
Distal-loxP-R (P4): 5’-TTGTATGGAGTTGACCCAAAGGGAG-3’
Wildtype: 238 bp
Targeted: 325 bp
（5）、电泳完成，记录检测结果；
C、ES打靶-细胞复苏传代：
（1）、准备细胞复苏所需试剂及物品；
（2）、取出-80℃冻存的备份板；
（3）、将PCR阳性克隆从96孔板传代至12孔板；
（4）、12孔板细胞生长稳定后，传至6cm培养皿；
（5）、再将6cm培养皿细胞传至10cm培养皿；
（6）、待细胞生长稳定后，消化，离心收集细胞，一部份冻存；一部分送检Southern Blot；
D、ES打靶-Southern Blot
（1）、PCR法制备地高辛标记探针；
（2）、ES细胞基因组DNA的抽提；
（3）、基因组DNA酶切，酶切产物进行电泳分离；
（4）、电泳凝胶转膜，将凝胶上的DNA转移至尼龙膜；
（5）、紫外交联固定尼龙膜；
（6）、DNA预杂交；
（7）、预杂交完成后，进行杂交过夜；
（8）、杂交后，进行洗膜和阻断；
（9）、加入抗体孵育，洗涤缓冲液洗涤后，加入检测缓冲液平衡；
（10）、将膜放入底物显色液中，避光显色，使用碧云天公司显色试剂盒（C3206）显色；
（11）、显色完成，洗膜缓冲液洗涤，观察结果；
E、囊胚注射：
（1）、从交配后3.5天的供体母鼠子宫内获取囊胚；
（2）、安装显微注射设备，准备所需试剂及物品；
（3）、挑选形态良好、发育状态适中的囊胚，转移至注射皿的培养基内；
（4）、将待注射ES转移至注射皿的细胞培养基内，使其均匀排列，密度适中；
（5）、将ES细胞吸入注射针，将其逐个注射入囊胚腔；
（6）、注射完成后，可在囊胚腔内看到ES细胞；
F、代孕鼠制备及胚胎移植：
（1）、选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠；
（2）、将注射ES细胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宫内；
（3）、将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；
（4）、囊胚移植完成，待嵌合体小鼠出生；
（5）、嵌合体出生1周后编号，3周后进行分笼；
2、正确打靶的F1代杂合子小鼠繁殖：
（1）、步骤1中的雄性嵌合体出生满8周，与8周龄母鼠（B6或Flp/Cre工具鼠）合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄，剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的具有flox/+基因型的F1代杂合子小鼠；
3、F2代组织特异性KO杂合子小鼠繁殖：
（1）、步骤2中的F1代杂合子（flox/+）小鼠杂交雄性嵌合体出生满8周，与带有NPHS2-Cre 基因型的8周龄母鼠合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的F2代组织特异性KO杂合子小鼠；
4、纯合子足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠繁殖：
（1）、步骤3中的F2代组织特异性KO 杂合子小鼠（flox/+，NPHS2-Cre）出生满8周相互交配合笼；
（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；
（3）、待1周龄剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；
（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，确定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作为组织特异性KO 纯合子，即足细胞特异敲除DLX6-os1的转基因小鼠。
Step 1 基因组DNA提取，Triton X-100和蛋白酶混合物裂解液，裂解样品过夜Step 2 次日，高温灭活蛋白酶，离心收集上清，作为PCR模板
Step 3 PCR扩增及电泳检测
1. Neo PCR
引物序列:
F1: 5’-TGGGAGGCTTTTGAGTTAGGAAT-3’
R1: 5’-ATTGGACCATCTTACTGGACAGG-3’
目标产物:
野生型(MT): 222 bp
目标产物(MT): 327 bp
体系:
成分x1
小鼠基因组1.5 μl
上游引物(10 μM) 1.0 μl
下游引物(10 μM) 1.0 μl
Taq 聚合酶12.5 μl
ddH2O 9.0 μl
总计25.0 μl
程序:
步骤温度. 时间循环数
预变性94 °C 3 min
变性94 °C 30 s
退火62 °C 35 s 33 x
延伸72 °C 35 s
终延伸72 °C 5 min
小鼠基因组DNA 1.5 μl
上游引物(10 μM) 1.0 μl
上游引物(10 μM) 1.0 μl
Taq 聚合酶12.5 μl
ddH2O 9.0 μl
总和25.0 μl
PCR 条件:
步骤Temp. Time Cycles
预变性94 ℃ 3 min
变性94 ℃ 30s
退火62 ℃ 35s 33 x
延伸72 ℃ 35s
终延伸72 ℃ 5 min
Step 4 记录阳性样品编号
结果:
通过Neo PCR 确认1＃，2＃，3＃，4＃，5＃，6＃，7＃，9＃，11＃，12＃，13＃，16＃，21＃，
23＃，24＃，56＃、68＃为阳性（图1）。
F3: 5’-CGGTTATTCAACTTGCACCA-3’
R3: 5’-GCGCTGCTGCTCCAG-3’
目标产物:
野生型: N.A.
目标产物: 200 bp
体系:
成分x1
小鼠基因组1.5 μl
上游引物(10 μM) 1.0 μl
下游引物(10 μM) 1.0 μl
Taq 聚合酶12.5 μl
ddH2O 9.0 μl
总计25.0 μl
程序:
步骤温度. 时间循环数
预变性94 °C 3 min
变性94 °C 30 s
退火62 °C 35 s 33 x
延伸72 °C 35 s
终延伸72 °C 5 min
结果：
通过NPHS2-cre PCR 确认1＃，2＃，3＃，4＃，5＃，6＃，7＃，9＃，11＃，12＃，13＃，
16＃，21＃，23＃，24＃，56＃、68＃为阳性（图2）。
F2: 5’-TTGATGGTTTTGGTAGATTATGCCC-3’
R2: 5’-TGAAAAGTCAGAAGCACTGTTACC-3’
目标产物:
野生型(MT): 170 bp
目标产物(MT): 257 bp
体系:
成分x1
小鼠基因组1.5 μl
上游引物(10 μM) 1.0 μl
下游引物(10 μM) 1.0 μl
Taq 聚合酶12.5 μl
ddH2O 9.0 μl
总计25.0 μl
程序:
步骤温度. 时间循环数
预变性94 °C 3 min
变性94 °C 30 s
退火62 °C 35 s 33 x
延伸72 °C 35 s
终延伸72 °C 5 min
结果：
通过5'arm PCR 确认1＃，2＃，3＃，4＃，5＃，6＃，7＃，9＃，11＃，12＃，13＃，16＃，
21＃，23＃，24＃，56＃、68＃为阳性（图3）。
7＃，9＃，11＃，12＃，13＃，16＃，21＃，23＃，24＃，56＃来自68＃）均为阳性。
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