技术领域
[0001] 本
发明涉及一种制备细菌菌液的方法，尤其涉及一种制备光合细菌菌液的方法。 背景技术
[0002] 光合细菌(photosynthetic bacteria，简称PSB)，是地球上最古老的具有原始光能合成体系的原核
生物，是在厌
氧条件下进行光合作用且不产生氧气一类细菌的总称，这是与绿色
植物、藻类及其他光合作用生物不同之处。光合细菌广泛分布于
沼泽、池塘、湖泊、河流、
水沟、海洋及
土壤中，是一种优良的水产环境改良剂和
饲料添加剂。目前光合细菌菌液制备方法都很繁琐，培养基的成分复杂，大多是在特殊培养基中进行培养，而且是在一定的pH值和光照强度下进行培养，现有制备方法的
缺陷在于制备所用的培养基中往往需要添加某种或某些特殊物质，如促酵剂、木瓜提取液、槲寄生提取物等，成分复杂，配制繁琐，而且制备过程中多数需要特殊的光照。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是：提供一种培养过程简单的制备光合细菌菌液的方法。
[0004] 本发明解决技术问题的技术方案是：
[0005] 一种制备光合细菌菌液的方法，其步骤是：
[0006] (1)菌种的复苏
[0007] 将装有光合细菌菌种的冻存管进行菌种快速溶解复苏，溶解后的菌液成为复苏菌液；
[0008] (2)菌液划线及静置培养
[0009] 在超净
工作台上，用复苏菌液在平板固体培养基上划线，将划线后的平板固体培养基在30℃恒温
培养箱中静置培养24～36小时长出单菌落后，用接种环挑取平板固体培养基上的单菌落在斜面培养基上划线，划线后的斜面培养基在30℃培养箱中静置培养24～36小时菌落长出；
[0010] (3)菌落洗脱及培养：
[0011] 菌落长出后，用光合细菌菌液培养基将斜面培养基上的菌落洗脱下来成 为菌落溶液，菌落溶液进行初次培养即可得到初次培养菌液，初次培养菌液再进行转接培养即可得到转接培养菌液。
[0012] 在上述步骤(1)中，所述菌种快速溶解复苏的方法是：将装有光合细菌菌种的冻存管立即放置于
温度为38℃～40℃的水浴中复苏并快速摇动，直到冻存管内部结
冰全部溶解为止。
[0013] 在上述步骤(2)中，所述平板固体培养基配制方法为：将5克蛋白胨、1克
酵母浸粉、0.1克
磷酸高
铁、20克琼脂、1000毫升煮沸
海水加热溶解，并用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液调节到pH为7.6的培养基溶解液装于锥形瓶中，然后将装有培养基溶解液的锥形瓶置于高压
蒸汽灭菌器中，在温度121℃，压
力105kPa的条件下灭菌25分钟，然后将装有培养基溶解液的锥形瓶从高压蒸汽灭菌器取出，锥形瓶内的培养基溶解液在
凝固之前倒入经灭菌的培养皿中冷却凝固到室温即可得到平板固体培养基。
[0014] 在上述步骤(2)中，所述斜面固体培养基配制方法为：将5克蛋白胨、1克酵母浸粉、0.1克磷酸高铁、20克琼脂、1000毫升煮沸海水加热溶解，用浓度为1mol/L氢氧化钠溶液调节到pH为7.6成为培养基溶解液分装于试管中，试管用
棉塞封口，然后试管竖直置放入高压蒸汽灭菌器中，在温度121℃，压力105kPa的条件下灭菌25分钟，然后试管从高压蒸汽灭菌器取出，在培养基溶解液凝固之前，将试管倾斜成与水平面成45度
角的斜面，培养基溶解液自然凝固到室温即可得到斜面固体培养基。
[0015] 在上述步骤(3)中，所述初次培养是将菌落溶液混合均匀后装入三角烧瓶中，
牛皮纸包扎封口后，置于摇床上震荡培养，摇床上震荡培养的条件是温度28℃～35℃，转速50rpm。
[0016] 在上述步骤(3)中，所述转接培养为摇床震荡培养，摇床震荡培养的条件是接种量10％，温度28℃～35℃，转速50rpm。
[0017] 在上述步骤(3)中，所述转接培养为在恒温培养箱中的静置培养，静置培养的条件是接种量20％，温度28℃～35℃，每天不定时摇晃3～6次。
[0018] 在上述步骤(3)中，所述光合细菌菌液培养基配制方法为：称取酵母浸粉0.5克，称取蛋白胨3克溶于1升煮沸海水，溶解后的溶液装入三角烧瓶中，用牛皮纸包扎封口后，在高压蒸汽灭菌器中，在温度121℃，压力105kPa的条件下灭菌25分钟，灭菌后自然冷却到室温即可得到光合细菌菌液培养基。
[0019] 本发明的技术效果是：本发明固体培养基配制简单，仅需要酵母浸粉、蛋白胨、磷酸高铁、琼脂和煮沸海水配制，光合细菌菌液培养基仅需要酵母浸粉、蛋白胨和煮沸海水。培养所需设备简单，仅需要一个可温控的摇床培养箱或恒温培养箱即可。制备出来的光合细菌菌液浓度高，
质量好。因此，本发明方法具有培养基配制及培养过程简单，菌液浓度高，质量好的特点。
附图说明
[0020] 图1、本发明
实施例平板固体培养基划线分区示意图。
[0021] 图2、本发明实施例接种10％嗜硫小红卵菌培养液时的照片。
[0022] 图3、本发明实施例接种10％嗜硫小红卵菌培养液培养到第4天时的照片。 具体实施方式
[0023] 一、本发明实施例固体培养基的配置
[0024] 本发明实施例固体培养基采用2216E固体培养基，2216E固体培养基简称固体培养基，是一种培养海洋细菌的专用培养基，用于海洋细菌的划线培养或涂布培养。本发明实施例固体培养基分为平板培养基和斜面培养基，用培养皿制备的固体培养基，叫做平板培养基；用试管制备的固体培养基叫斜面培养基。本发明实施例固体培养基的成分和配制方法如下：
[0025] 制备固体培养基的材料准备：用
电子天平称取蛋白胨5克，酵母浸粉1克，磷酸高铁0.1克，琼脂20克，以及量取煮沸海水1升。
[0026] 平板培养基的制备：将上述称取量的蛋白胨、酵母浸粉、磷酸高铁、琼脂，以及量取的煮沸海水加热溶解，本实施例用2升的锥形瓶混合，电炉加热溶解，煮沸5分钟，以将内容物完全溶解为准。再用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液将溶解后的液体调节到pH为7.6即得到培养基溶解液，然后将该培养基溶解液分装于多个锥形瓶，本实施例每个250毫升的锥形瓶中分装100毫升的培养基溶解液，共需要10个锥形瓶。装有培养基溶解液的锥形瓶置于高压蒸汽灭菌器中，在温度121℃，压力105kPa的条件下灭菌25分钟后，将灭菌后的锥形瓶从高压蒸汽灭菌器取出，位于锥形瓶内的培养基溶解液在凝固之前，将该培养基溶解液分别倒入经灭菌的培养皿，灭菌的培养皿于高压蒸汽灭菌器在温度121℃，压力105kPa的条件下灭菌25分钟。本实施例培养皿的直径为9厘米，每个培养皿倒入15毫升经灭菌 的培养基溶解液，待培养基溶解液冷却到室温凝固后置4℃
冰箱内冷藏保存备用。 [0027] 斜面培养基的制备：用电子天平称取蛋白胨5克，酵母浸粉1克，磷酸高铁0.1克，琼脂20克，以及量取煮沸海水1升加热溶解，用浓度为1mol/L氢氧化钠溶液调节到pH为7.6即得到培养基溶解液。培养基溶解液分装于试管中，本实施例需50个试管，每个试管装20毫升培养基溶解液，试管用棉塞封口，竖直放入高压蒸汽灭菌器中，在温度121℃，压力为105kPa的条件下灭菌25分钟，然后将试管从高压蒸汽灭菌器取出，培养基溶解液在凝固之前，将试管倾斜成与桌面(水平面)成45度角的斜面，让试管内的培养基溶解液自然凝固到室温后置4℃冰箱内冷藏保存备用。
[0028] 若配制2216E液体培养基，则不需要加琼脂，其成分，灭菌和制作方法与上述相同。
[0029] 二、本发明实施例光合细菌菌液培养基的配置
[0030] 本发明实施例光合细菌菌液培养基配制方法：用电子天平称取酵母浸粉0.5克，蛋白胨3克溶于1升煮沸海水中，溶解后的培养溶液装入规格为2升的三角烧瓶中，用牛皮纸包扎封口三角烧瓶后，封口后的三角烧瓶在高压蒸汽灭菌器中在温度121℃，压力为105kPa的条件下灭菌25分钟后自然冷却到室温备用。
[0031] 三、本发明实施例具体操作方法
[0032] 本发明实施例具体操作方法以光合细菌中的嗜硫小红卵菌菌种进行实验，包括实验室保存的嗜硫小红卵菌菌种的复苏、初次培养和转接培养。嗜硫小红卵菌(Rhodovulum sulfidophilus)属于细菌类，α
变形菌纲，红细菌目，红细菌科，小红卵菌属(Rhodovulum Hiraishi and Ueda)，细胞卵圆形至杆形，0.5～0.9μm×0.9～2.0μm。单极生鞭毛运动或不运动。细胞行二分分裂，革兰氏
染色阴性。兼性厌氧光养菌，即光照厌氧和黑暗好氧条件下均能很好生长。最佳生长方式是利用各种有机化合物进行光合异养生长。在
硫化氢和
硫代硫酸钠存在时，可进行光自养或光异养生长。嗜硫小红卵菌是小红卵菌属的一个模式种。嗜硫小红卵菌作为光合细菌的一种，广泛应用于改善水质，减少病原
微生物和不良藻类，以及作为鱼虾的饵料添加剂。
[0033] 1、菌种的复苏：
[0034] 将在-80℃保存的装有嗜硫小红卵菌的冻存管取出，立即放置于38℃～40℃水浴中快速复苏并快速摇动，本实施例用手摇动，即手握冻存管抖动
手腕，直到内部结冰全部溶解为止，需要50秒～100秒。在超净工作台上打开冻存管，超净工作台需要提前用紫外灯照射15分钟消毒。用接种环沾取少取嗜硫小红卵菌菌液，即将接种环的环体伸入菌液中沾取菌液，沾取的体积约为5微升，在平板固体培养基上划线，划线时，如图1所示，将一个平板固体培养基分成四个小区进行划线，第一小区作为A区，用作待分离菌的菌源区；第二小区和第三小区分别作为B区和C区，是逐级稀释的过渡区，第四小区作为D区则是关键区，使D区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。首先划A区：将平板固体培养基置于酒精灯旁(距离酒精灯10厘米)，左手持培养皿，左手手掌托住皿底，用拇指和食指将皿盖掀开，与皿底呈45度角并且开口朝向酒精灯，右手拿已沾取嗜硫小红卵菌菌液的接种环先在A区划3～4条连续的平行线，线条多少应依挑菌量的多少而定，若挑菌量多可以多划几条平行线。本实施例线长1～3厘米，上下相邻平行线间距1厘米。在A区划线后应立即烧掉接种环上的残菌，以免因嗜硫小红卵菌过多而影响后面各区的分离效果。然后划其它区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却1分钟左右，温度冷却到不烫手即可，并使平板培养基B区转到靠近酒精灯的一面，接种环通过A区(菌源区)将嗜硫小红卵菌带到B区，随即划数条致密的平行线，本实施例B区线长1～3厘米，上下相邻平行线间距1厘米。再从B区作C区的划线，即从B区将嗜硫小红卵菌带到C区，从B区将嗜硫小红卵菌带到C区前要烧掉接种环上的残菌。最后经C区作D区的划线，即从C区将嗜硫小红卵菌带到D区，在D区划线，从C区将嗜硫小红卵菌带到D区前也要烧掉接种环上的残菌，划D区时切勿重新
接触A区、B区，以免该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。烧去接种环上的残菌，倒置培养皿，倒置培养皿比正放培养皿更加不容易污染杂菌，因为空气中也有杂菌，另外皿底和皿盖虽然消毒杀菌，但在操作过程中，接触的外表仍然可能污染，倒置可以使杂菌尽可能少接触培养基。倒置培养皿也可以防止培养皿内的培养基水分
蒸发，使培养基保持湿润。倒置也可以防止水分冷凝后滴到培养基上，导致菌落蔓延，无法计数。划线后的平板固体培养基在30℃恒温培养箱中静置培养24～36小时。平板固体培养基D区长出单菌落后，用接种环挑取 平板固体培养基D区上的单菌落，在斜面培养基上划线培养，本实施例在斜面培养基上呈“之”字形划线，划线后的斜面培养基在30℃恒温培养箱中静置培养24～36小时后菌落长出。
[0035] 菌落长出后，用光合细菌菌液培养基将斜面固体培养基上的菌落洗脱下来，洗脱步骤如下：在超净工作台中，用微量移液器将1ml光合细菌菌液培养基放入培养有嗜硫小红卵菌菌落的斜面固体培养基的试管中，在震荡器上剧烈震荡(
温度控制在15～30℃)，直到斜面固体培养基上的菌落全部洗脱下来成为菌液。
[0036] 斜面固体培养基长出的菌落是固体培养基上挑出的单菌落长出来的，是一个扩大培养的步骤。
[0037] 本实施例的嗜硫小红卵菌是从海水中分离纯化鉴定而来的，即从山东牟平海区取回海水样本100微升，在2216E固体平板培养基上涂布均匀，倒置培养皿置于28℃恒温培养箱中培养，2～3天观察，用接种环挑取紫色菌落，再在2216E固体平板培养基上进行划线，3～5天后可见平板培养基上有散的紫色菌落生长，挑取单个的紫色菌落经分子生物学方法鉴定即为嗜硫小红卵菌。
[0038] 2、初次培养
[0039] 1ml复苏洗脱下来的菌液和100ml光合细菌菌液培养基混合均匀后装入三角烧瓶中，牛皮纸包扎封口后，置于摇床上震荡培养，摇床上震荡培养可使细菌悬浮，繁殖速度快。摇床上震荡培养的条件是温度28℃～35℃，转速50rpm，3天～4天即可得到菌液浓度达到
10
约200亿个/毫升(2×10 /ml)的初次培养菌液。
[0040] 本发明实施例菌液浓度测定方法：将上述从斜面固体培养基洗脱下来的菌液用无菌海水以10倍浓度依次稀释，即，100uL菌液加900uL无菌海水，菌液浓度稀释到前次菌液-10浓度的1/10，如此稀释10次，从而稀释到原有浓度的10 倍，所以最后得到稀释后菌液浓-10 -10
度为之前的10 倍浓度，最后用100uL的微量移液器吸取100uL稀释了10 倍的菌液在平板固体培养基上用涂布棒涂布，涂布在超净工作台内操作，靠近酒精灯的火焰(间距10厘米)，涂布前先将涂布棒在浓度为75％酒精浸泡30秒消毒，然后于酒精灯火焰上来回烧三遍，稍冷却后进行涂布，将菌液涂布均匀，涂布时皿盖稍开即可，不要将皿盖全拿下来，即掀开皿盖一端，使涂布棒伸进培养 基涂布，涂布好的培养皿盖好皿盖后倒置放于30℃恒温培
10
养箱中培养，3天后计数培养基上的单个菌落数，再乘以10 ，即为1ml原菌液里的浓度。菌落直径1～3mm，数量为2～10个。
[0041] 3、转接培养
[0042] 以10％的接种量将初次培养菌液和光合细菌菌液培养基混合，例如要培养1升菌液，即需要100ml初次培养好的初次培养菌液和900ml的光合细菌菌液培养基用三角烧瓶混合均匀后装入规格为2升的三角烧瓶中，置于摇床(28℃～35℃，转速50rpm)，本实施例摇床采用全温培养摇床，3天～4天即可得到浓度达200亿个/毫升的转接培养菌液。 [0043] 转接培养也可在恒温培养箱中静置培养，接种量20％(如200ml初次培养好的初次培养菌液和800ml的光合细菌菌液培养基混合均匀)，温度28℃～35℃，每天不定时摇晃几次，本实施例每天摇晃5～6次，或间隔3～4小时摇一次，5天～6天也可得到浓度达200亿个/毫升的嗜硫小红卵菌菌液。
[0044] 1、本实施例配置固体培养基和光合细菌菌液培养基用到如下具体的仪器和
试剂：
[0045] 电子天平：亚太计量仪器有限公司生产，型号DS-200。
[0046] 高压蒸汽灭菌器：山东新华安得医疗用品有限公司生产，YXQG02型手提式电
热压力蒸汽消毒器。
[0047] 玻璃仪器：直径为9厘米的培养皿；直径(外径)为1.8cm，长度18cm的玻璃试管；规格分别为1L和2L的三角烧瓶；规格分别为500ml和1L的烧杯均购自四川蜀牛玻璃仪器公司。
[0048] 酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司生产，250g装，BR生化试剂(Biological reagent生物染色剂)，微黄或类白色粉末。
[0049] 蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司生产，250g装，BR生化试剂(Biological reagent生物染色剂)，白色至浅黄色粉末。
[0050] 磷酸高铁：天津市光复精细化工研究所生产，250g装，灰白或淡粉红色粉末。 [0051] 琼脂：北京康倍斯(chembase)科技有限公司生产，500g装，淡黄色粉末。 [0052] 氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂生产，分析纯，500g装，白色粒状。 [0053] 煮沸海水：用规格为2L的三角烧瓶取1L海水煮沸5分钟冷却到室温即为煮沸海水。
[0054] 2、本发明实施例所用到的其它仪器和试剂：
[0055] 接种环：北京泰怡达生物科技有限公司生产，杆长50毫米，杆的直径为0.5毫米。 [0056] 微量移液器：德国
艾本德(Eppendorf)公司生产，量程为100μL和1mL。 [0057] 震荡器：海
门市其林贝尔仪器制造有限公司生产，型号VOR76X-5。 [0058] 恒温培养箱：上海一恒科技仪器有限公司生产，型号DHP-9162。 [0059] 超净工作台：苏净集团安泰公司生产，型号AIR TECH。
[0060] 电热恒温水箱：上海一恒科技仪器有限公司生产，型号DKB-600B。 [0061] 全温培养摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司生产，型号QYC-200。 [0062] 无菌海水：将煮沸海水在高压蒸汽灭菌器中在温度121℃，压力105kPa条件下灭菌25min，灭菌后，冷却到室温即为无菌海水。
[0063] 按照上述的操作步骤，以10％的接种量将培养的嗜硫小红卵菌菌液和光合细菌菌液培养基在三角烧瓶中混合均匀，见图2，然后置于摇床(28℃～35℃，转速50rpm)培养，4天即可得到200亿个/毫升的高浓度菌液，见图3。
[0064] 经试验，本发明方法也适用于光合细菌其他种属如深红红螺菌，球形红色假单孢菌，荚膜红色假单孢菌的培养。
