人工抗原的合成是重金属免疫分析技术中关键环节之一，它 是利用双功能螯合剂先与重金属离子形成稳定的螯合物(半抗原 分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质的螯 合物(人工抗原)。目前双功能螯合剂的种类非常少，并且价格偏 高，阻碍了重金属人工抗原合成的研究。本申请人曾在先申请了 镉离子人工抗原螯合剂的合成方法，继而介绍了对应的镉离子人 工抗原和单克隆抗体的合成，并将抗体应用于镉离子污染的检测， 但对于重金属镍而言，目前国内并没有关于制备其人工抗原的相 关报道，因此，寻找新型、价廉的双功能螯合剂，并进一步制备 相应的人工抗原和单克隆抗体，对应用于重金属镍残留污染的快 速检测具有十分重要的现实意义。

针对现有技术的上述不足，本发明的目的是研制出一种双功 能的镍离子人工抗原螯合剂6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′- 四乙酸)二甲胺基喹喔啉(6-bromine acetamido-2，3-(N，N，N′， N′-tetraacethyl)dimethylamino-quinoxaline，BATDQ)合成 对应于重金属镍的人工抗原，并公开基于此人工抗原的重金属镍 单克隆抗体的制备方法，以及运用酶联免疫吸附法(Enzyme -linked immunosorbent assay，ELISA)中的间接竞争法检测富 含镍离子污染的样品。
本发明的目的通过如下措施实现：
1.镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下：
1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：
将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧 瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽 滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二 甲基喹喔啉；
2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：
取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g 偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单 口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝 管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中， 强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后， 将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却， 得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；
3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成：
在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加 入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无 水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基 -2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却， 滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体； 往上述油状液中加入含3.48g结晶氢氧化钡(Ba(OH)2·8H2O)的 饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤 钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸 馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊， 过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤 液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′- 四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合 成：
将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三 口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在 80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷 却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′- 四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹 喔啉的合成：
取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢 钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺 基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时 把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′， N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系 的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出， 加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加 入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的 乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；
2.镍人工抗原的合成包括下列步骤：
1)重金属镍半抗原的合成：
取BATDQ 0.8mg，用pH＝7.5，浓度为0.1mol·L-1的磷酸盐 缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)定容至2mL，加 入0.4mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30min；
2)重金属镍人工抗原的合成：
将5mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)用pH＝9.6 的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工 抗原；
3)重金属镍包被抗原的合成：
将5mg人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)用pH＝9.6 的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被 抗原；
3.镍单克隆抗体制备包括下列步骤：
1)小鼠免疫及抗血清制备：
选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1∶1 体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2 mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次， 但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高 的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；
加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温 2h后，4℃冰箱中静置8-10h，使血清充分析出，收集血清，将 血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃ 保存；
2)间接ELISA法检测抗血清效价：
包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L-1的碳酸盐缓冲液将包 被抗原稀释至2μg·mL-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反 应12h或37℃水浴3h；
洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mol·L-1，含 0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤3次，5min/次， 拍干；
封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵 育3h，同前洗涤，拍干；
加抗血清：抗血清按400、800、1600、3200、6400、12800、 25600、51200倍稀释，100μL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠 血清作为阴性对照，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的用辣根过氧化物标记的 羊抗小鼠(IgG-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍 干；
显色：加入使用前配制的邻苯二胺底物溶液 (O-phenylenediamine，OPD)，100μL/孔，37℃显色15min；
终止：加2mol·L-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值，经间接ELISA 法检测抗血清的效价达到1×105；
3)细胞融合：
在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最 后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0 骨髓瘤细胞；
取1.0×108个脾细胞，2.0-5.0×107个Sp2/0细胞，按1-10∶ 1的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000r/min离心10 min，弃上清液；
将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散 均匀成糊状；
将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇 4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60s内加完；
在90s内缓慢滴加无血清的DMEM培养基30-40mL，终止融 合，37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；
将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养 基使细胞悬浮，混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板， 100μL/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆：
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的 HT培养基稀释至每毫升含10、15和20个细胞3种不同的稀释度， 分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔， 100μL/孔；
于37℃、5％CO2培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆 即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的 2倍为阳性；
取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；
5)腹水型单克隆抗体的制备：
腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5mL；
7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只 小鼠注射5×105个细胞；
间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以 手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3 次，每只小鼠采5-10mL腹水；
将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和 其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻 干保存；
6)腹水型单克隆抗体的纯化：
用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃， 10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物 质；
饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；
DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化；
4.应用镍单克隆抗体检测含镍污水的方法按如下步骤进行：
1)包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L-1的碳酸盐缓冲液 稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置 12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mol·L-1， PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37 ℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1∶1的体积充分 混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤3 次，5min/次，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/ 孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显 色15min；
7)终止：加2mol·L-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
9)数据处理：根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应的 样品浓度。
本发明的有益效果是：
1)本单克隆抗体对镍残留污染的检测专一性强，且与其他金 属的交叉反应弱；
2)原料便宜，总成本低，价格为30元/mg；
3)通过原子吸收分光光度法测定的Ni-BATDQ-BSA、 Ni-BATDQ-HSA的偶联比为22∶1、28∶1，偶联比较高；
4)合成的人工抗原免疫原性强，稳定性好，以间接ELISA法 测定的抗血清效价达到1×105，获得的单克隆抗体检出限为1pbb。
具体实施方案
本发明的实验反应路线：

本发明是利用了BATDQ的四乙酸结构与重金属镍离子形成稳 定的螯合物，另一方面又利用它的溴乙酰氨基结构与蛋白质上的 巯基在弱碱性条件下发生缩合反应，从而实现了重金属镍人工抗 原的合成，这为重金属镍的酶免疫分析技术奠定了基础。同时， 本发明是对传统的重金属镍离子的检测技术进行的有益补充，其 快速、高灵敏度、在线操作等特点成为重金属检测的新发展方向。
最佳实施例：
镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下：
1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：
将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧 瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽 滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二 甲基喹喔啉；
2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：
取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g 偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单 口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝 管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中， 强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后， 将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却， 得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；
3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成：
在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加 入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无 水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基 -2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却， 滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体； 往上述油状液中加入含3.48g Ba(OH)2·8H2O的饱和溶液，室温 下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水 充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合 物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡， 再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷 却8-10h得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔 啉；
4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合 成：
将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三 口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在 80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷 却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′- 四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹 喔啉的合成：
取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢 钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺 基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时 把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′， N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系 的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出， 加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加 入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的 乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；
镍人工抗原的合成包括下列步骤：
1)重金属镍半抗原的合成：
取BATDQ 0.8mg，用pH＝7.5，0.1mol·L-1的PBS定容至2mL， 加入0.4mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30min；
2)重金属镍人工抗原的合成：
将5mg BSA用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓 慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反 应20h，即得重金属镍人工抗原；
3)重金属镍包被抗原的合成：
将5mg HSA用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓 慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反 应20h，即得重金属镍包被抗原；
4)原子吸收分光光度法鉴定偶联比：
分别配制镍标准液(0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L-1)， 制做标准曲线，将偶联产物取1mL稀释20倍，用原子吸收法检 测重金属镍的含量。利用原子吸收分光光度法检测人工抗原 Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA，检测到重金属镍离子的 含量分别为20.0mg·L-1、25.0mg·L-1，经计算两种人工抗原的 偶联比分别为22∶1、28∶1，偶联比符合制备抗体要求。
5)SDS-PAGE法对偶联结果的鉴定：
采用SDS-PAGE不连续电泳，以Tris-HCl作为缓冲体系，10％ 分离胶，5％浓缩胶。样品在浓缩胶上电泳时以恒定电流(20mA) 电泳，待其转入分离胶后恒定电流(30mA)，电泳至溴酚蓝距分 离胶底边1cm左右停止。卸开电泳槽，取出胶板，固定液固定 40min，敏化30min，水洗4次，银染，最后显色呈像。电泳结 果显示，人工抗原Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA在电 泳中的泳动速度明显落后于其相应的载体蛋白，且偶联后的人工 抗原与原载体蛋白相比增加的分子量在6000D左右。
镍单克隆抗体制备包括下列步骤：
1)小鼠免疫及抗血清制备：
选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1∶1 体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2 mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次， 但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高 的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；
加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温 2h后，4℃冰箱中静置8-10h，使血清充分析出，收集血清，将 血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃ 保存；
2)间接ELISA法检测抗血清效价：
包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L-1的碳酸盐缓冲液将包 被抗原稀释至2μg·mL-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反 应12h或37℃水浴3h；
洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mo l·L-1的PBS-T 洗涤3次，5min/次，拍干；
封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵 育3h，同前洗涤，拍干；
加抗血清：抗血清按400、800、1600、3200、6400、12800、 25600、51200倍稀释，100μL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠 血清作为阴性对照，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/孔， 37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显色 15min；
终止：加2mol·L-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值，经间接ELISA 法检测抗血清的效价达到1×105；
3)细胞融合：
在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最 后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0 骨髓瘤细胞；
取1.0×108个脾细胞，2.0-5.0×107个Sp2/0细胞，按1-10∶ 1的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000r/min离心10 min，弃上清液；
将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散 均匀成糊状；
将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇 4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60s内加完；
在90s内缓慢滴加无血清的DMEM培养基30-40mL，终止融 合，37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；
将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养 基使细胞悬浮，混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板， 100μL/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆：
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的 HT培养基稀释至每毫升含10、15和20个细胞3种不同的稀释度， 分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔， 100μL/孔；
于37℃、5％CO2培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆 即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的 2倍为阳性；
取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；
5)腹水型单克隆抗体的制备：
腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5mL；
7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只 小鼠注射5×105个细胞；
间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以 手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3 次，每只小鼠采5-10mL腹水；
将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和 其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻 干保存；
6)腹水型单克隆抗体的纯化：
用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃， 10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物 质；
饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；
DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化。
至此，本发明对镍人工抗原螯合剂的合成方法及对应镍的人 工抗原和镍单克隆抗体的制备，都作了完整而清楚的介绍，穿插 介绍了人工抗原偶联结果的两种鉴定方法及抗血清效价的检测 方法。
为更进一步说明本发明，下面再介绍重金属镍离子标准曲线 的建立，并以水中重金属镍离子的含量为例介绍快速检测法，便 于公众全面了解本发明。
为检测抗体的检测限，下面介绍重金属镍标准曲线的建立方 法：
1)包被：用pH为9.6，浓度为0.05mol·L-1的碳酸盐包被 缓冲液稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4 ℃放置12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去包被液，用PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37 ℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：取系列浓度(0、10、50、100、250、500、1000和 5000ng·mL-1)的镍标液加入适宜浓度的EDTA中，按1∶1的体积 比加入最佳稀释浓度的抗血清，室温下反应30min，100μL/孔， 37℃反应1h，同前洗涤，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/ 孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显 色15min；
7)终止：加2mol·L-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值
9)抑制率的计算

然后以I％为纵坐标，以标样的自然对数浓度值为横坐标，做 标准曲线。
下面以水体中重金属镍含量的快速检测为例加以说明：
水体样品的前处理：取含镍水样1000μL，用0.45μm的微 孔滤膜过滤出去杂质。
1)包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mo l·L-1的碳酸盐缓冲液 稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置 12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mo l·L-1， PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37 ℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1∶1的体积充分 混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，同前洗 涤，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/ 孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显 色15min；
7)终止：加2mo l·L-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
9)数据处理：根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应样 品的浓度。