治疗用DLL4结合蛋白
专利汇可以提供治疗用DLL4结合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了改进的DLL4结合蛋白，其包括 抗体 、CDR-嫁接的抗体、人抗体及其DLL4结合 片段 、具有高亲和 力 的结合DLL4的蛋白以及中和DLL4活性的DLL4结合蛋白。所述DLL4结合蛋白用于 治疗 或 预防 癌症和 肿瘤 以及特别用于治疗或预防肿瘤血管发生和/或其他血管发生依赖性 疾病 例如眼部新生血管化或血管发生非依赖性疾病(其特征在于异常DLL4表达或活性)例如自身免疫病其包括多发性硬化症。，下面是治疗用DLL4结合蛋白专利的具体信息内容。
1.一种包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包
括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：99)，其中；
X1是S或N；
X2是S、G或N；
X3是S、N、T、G或R；
X4是Y；
X5是Y或H；
X6是W；和
X7是G；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQ ID NO：100)，其中；
X1是D；
X2是I；
X3是Y、N或S；
X4是Y；
X5是T、N、A、I、S或R；
X6是G；
X7是S、N、T或G；
X8是T；
X9是Y；
X10是Y；
X11是N；
X12是P；
X13是S；
X14是L；
X15是K；和
X16是S、N、D或G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO：101)，其中；
X1是E、Y、F、Q、W、L或A；
X2是D、A、S、G、V、E或N；
X3是V、M、L、P或A；
X4是I、A、P、R、S、K、Q、V、G、M或E；
X5是L、Y、F或M；
X6是R、G、S、Q或A；
X7是G；
X8是G、A或S；
X9是S、A、L、V、R或G；
X10是D；和
X11是Y、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、Q或K；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO：102)，其中；
X1是S；
X2是G；
X3是Q、E或D；
X4是R、S、G、M、K、L或T；
X5是L；
X6是G；
X7是D或E；
X8是K；
X9是Y；
X10是A或V；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：103)，其中；
X1是E或Q；
X2是D；
X3是S、L、T、A、E或F；
X4是K、T、E、N、Q、S或M；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：104)，其中；
X1是Q；
X2是A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、M、E、N、G或K；
X6是D或E；
X7是T、V、A、S或M；
X8是G、A或C；和
X9是V.
2.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：1的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：1的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：
1的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：111的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：111的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：111的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：117(CDR-H1)；SEQ ID NO：118(CDR-H2)；SEQ ID NO：119(CDR-H3)；
SEQ ID NO：121(CDR-H1)；SEQ ID NO：122(CDR-H2)；SEQ ID NO：123(CDR-H3)；
SEQ ID NO：125(CDR-H1)；SEQ ID NO：126(CDR-H2)；SEQ ID NO：127(CDR-H3)；
SEQ ID NO：129(CDR-H1)；SEQ ID NO：130(CDR-H2)；SEQ ID NO：131(CDR-H3)；
SEQ ID NO：133(CDR-H1)；SEQ ID NO：134(CDR-H2)；SEQ ID NO：135(CDR-H3)；
SEQ ID NO：137(CDR-H1)；SEQ ID NO：138(CDR-H2)；SEQ ID NO：139(CDR-H3)；
SEQ ID NO：141(CDR-H1)；SEQ ID NO：142(CDR-H2)；SEQ ID NO：143(CDR-H3)；
SEQ ID NO：145(CDR-H1)；SEQ ID NO：146(CDR-H2)；SEQ ID NO：147(CDR-H3)；
SEQ ID NO：149(CDR-H1)；SEQ ID NO：150(CDR-H2)；SEQ ID NO：151(CDR-H3)；
SEQ ID NO：153(CDR-H1)；SEQ ID NO：154(CDR-H2)；SEQ ID NO：155(CDR-H3)；
SEQ ID NO：157(CDR-H1)；SEQ ID NO：158(CDR-H2)；SEQ ID NO：159(CDR-H3)；
SEQ ID NO：161(CDR-H1)；SEQ ID NO：162(CDR-H2)；SEQ ID NO：163(CDR-H3)；
SEQ ID NO：165(CDR-H1)；SEQ ID NO：166(CDR-H2)；SEQ ID NO：167(CDR-H3)；
SEQ ID NO：169(CDR-H1)；SEQ ID NO：170(CDR-H2)；SEQ ID NO：171(CDR-H3)；
SEQ ID NO：173(CDR-H1)；SEQ ID NO：174(CDR-H2)；SEQ ID NO：175(CDR-H3)；
SEQ ID NO：177(CDR-H1)；SEQ ID NO：178(CDR-H2)；SEQ ID NO：179(CDR-H3)；
SEQ ID NO：181(CDR-H1)；SEQ ID NO：182(CDR-H2)；SEQ ID NO：183(CDR-H3)；
SEQ ID NO：185(CDR-H1)；SEQ ID NO：186(CDR-H2)；SEQ ID NO：187(CDR-H3)；
SEQ ID NO：189(CDR-H1)；SEQ ID NO：190(CDR-H2)；SEQ ID NO：191(CDR-H3)；
SEQ ID NO：193(CDR-H1)；SEQ ID NO：194(CDR-H2)；SEQ ID NO：195(CDR-H3)；
SEQ ID NO：197(CDR-H1)；SEQ ID NO：198(CDR-H2)；SEQ ID NO：199(CDR-H3)；
SEQ ID NO：201(CDR-H1)；SEQ ID NO：202(CDR-H2)；SEQ ID NO：203(CDR-H3)；
SEQ ID NO：205(CDR-H1)；SEQ ID NO：206(CDR-H2)；SEQ ID NO：207(CDR-H3)；
SEQ ID NO：209(CDR-H1)；SEQ ID NO：210(CDR-H2)；SEQ ID NO：211(CDR-H3)；
SEQ ID NO：213(CDR-H1)；SEQ ID NO：214(CDR-H2)；SEQ ID NO：215(CDR-H3)；
SEQ ID NO：217(CDR-L1)；SEQ ID NO：218(CDR-L2)；SEQ ID NO：219(CDR-L3)；
SEQ ID NO：221(CDR-L1)；SEQ ID NO：222(CDR-L2)；SEQ ID NO：223(CDR-L3)；
SEQ ID NO：225(CDR-L1)；SEQ ID NO：226(CDR-L2)；SEQ ID NO：227(CDR-L3)；
SEQ ID NO：229(CDR-L1)；SEQ ID NO：230(CDR-L2)；SEQ ID NO：231(CDR-L3)；
SEQ ID NO：233(CDR-L1)；SEQ ID NO：234(CDR-L2)；SEQ ID NO：235(CDR-L3)；
SEQ ID NO：237(CDR-L1)；SEQ ID NO：238(CDR-L2)；SEQ ID NO：239(CDR-L3)；
SEQ ID NO：241(CDR-L1)；SEQ ID NO：242(CDR-L2)；SEQ ID NO：243(CDR-L3)；
SEQ ID NO：245(CDR-L1)；SEQ ID NO：246(CDR-L2)；SEQ ID NO：247(CDR-L3)；
SEQ ID NO：249(CDR-L1)；SEQ ID NO：250(CDR-L2)；SEQ ID NO：251(CDR-L3)；
SEQ ID NO：253(CDR-L1)；SEQ ID NO：254(CDR-L2)；SEQ ID NO：255(CDR-L3)；
SEQ ID NO：257(CDR-L1)；SEQ ID NO：258(CDR-L2)；SEQ ID NO：259(CDR-L3)；
SEQ ID NO：261(CDR-L1)；SEQ ID NO：262(CDR-L2)；SEQ ID NO：263(CDR-L3)；
SEQ ID NO：265(CDR-L1)；SEQ ID NO：266(CDR-L2)；SEQ ID NO：267(CDR-L3)；
SEQ ID NO：269(CDR-L1)；SEQ ID NO：270(CDR-L2)；SEQ ID NO：271(CDR-L3)；
SEQ ID NO：273(CDR-L1)；SEQ ID NO：274(CDR-L2)；SEQ ID NO：275(CDR-L3)；
SEQ ID NO：277(CDR-L1)；SEQ ID NO：278(CDR-L2)；SEQ ID NO：279(CDR-L3)；
SEQ ID NO：281(CDR-L1)；SEQ ID NO：282(CDR-L2)；SEQ ID NO：283(CDR-L3)；
SEQ ID NO：285(CDR-L1)；SEQ ID NO：286(CDR-L2)；SEQ ID NO：287(CDR-L3)；
SEQ ID NO：289(CDR-L1)；SEQ ID NO：290(CDR-L2)；SEQ ID NO：291(CDR-L3)；
SEQ ID NO：293(CDR-L1)；SEQ ID NO：294(CDR-L2)；SEQ ID NO：295(CDR-L3)；
SEQ ID NO：297(CDR-L1)；SEQ ID NO：298(CDR-L2)；SEQ ID NO：299(CDR-L3)；
SEQ ID NO：301(CDR-L1)；SEQ ID NO：302(CDR-L2)；SEQ ID NO：303(CDR-L3)；
SEQ ID NO：305(CDR-L1)；SEQ ID NO：306(CDR-L2)；SEQ ID NO：307(CDR-L3)；
SEQ ID NO：309(CDR-L1)；SEQ ID NO：310(CDR-L2)；SEQ ID NO：311(CDR-L3)；
SEQ ID NO：313(CDR-L1)；SEQ ID NO：314(CDR-L2)；SEQ ID NO：315(CDR-L3)；
SEQ ID NO：334的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：334的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：334的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：335的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：335的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：335的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：336的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：336的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：336的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：337的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：337的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：337的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：338的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：338的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：338的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：339的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：339的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：339的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：340的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：340的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：340的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：341的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：341的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：341的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：342的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：342的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：342的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：343的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：343的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：343的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：344的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：344的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：344的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：345的残基24-34(CDR-L1)；SEQ ID NO：345的残基50-56(CDR-L2)；SEQ ID NO：345的残基89-97(CDR-L3)；
SEQ ID NO：346的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：346的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：346的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：347的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：347的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：347的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：348的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：348的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：348的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：349的残基24-34(CDR-L1)；SEQ ID NO：349的残基50-56(CDR-L2)；SEQ ID NO：349的残基89-97(CDR-L3)；
SEQ ID NO：350的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：350的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：350的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：351的残基24-34(CDR-L1)；SEQ ID NO：351的残基50-56(CDR-L2)；SEQ ID NO：351的残基89-97(CDR-L3)；
SEQ ID NO：352的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：352的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：352的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：353的残基24-34(CDR-L1)；SEQ ID NO：353的残基50-56(CDR-L2)；SEQ ID NO：353的残基89-97(CDR-L3)；
SEQ ID NO：354的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：354的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：354的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：355的残基24-34(CDR-L1)；SEQ ID NO：355的残基50-56(CDR-L2)；SEQ ID NO：355的残基89-97(CDR-L3)；
SEQ ID NO：356的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：356的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：356的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：357的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：357的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：357的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：358的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：358的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：358的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：359的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：359的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：359的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：360的残基31-37(CDR-H1)；SEQ ID NO：360的残基52-67(CDR-H2)；SEQ ID NO：360的残基100-110(CDR-H3)；
SEQ ID NO：361的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：361的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：361的残基88-96(CDR-L3)。
3.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDR。
4.根据权利要求3的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包括选自下述的可变结构域CDR
组：
VH E9CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：1的残基31-37
CDR-H2：SEQ ID NO：1的残基52-67
CDR-H3SEQ ID NO：1的残基100-110
VL E9CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：111的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：111的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：111的残基88-96
VH E9.4CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：117
CDR-H2：SEQ ID NO：118
CDR-H3：SEQ ID NO：119
VL E9.4CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：229
CDR-L2：SEQ ID NO：230
CDR-L3：SEQ ID NO：231
VH E9.11CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：121
CDR-H2：SEQ ID NO：122
CDR-H3：SEQ ID NO：123
VL E9.11CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：233
CDR-L2：SEQ ID NO：234
CDR-L3：SEQ ID NO：235
VH E9.14CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：125
CDR-H2：SEQ ID NO：126
CDR-H3：SEQ ID NO：127
VL E9.14CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：237
CDR-L2：SEQ ID NO：238
CDR-L3：SEQ ID NO：239
VH E9.17CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：129
CDR-H2：SEQ ID NO：130
CDR-H3：SEQ ID NO：131
VL E9.17CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：241
CDR-L2：SEQ ID NO：242
CDR-L3：SEQ ID NO：243
VH E9.18CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：133
CDR-H2：SEQ ID NO：134
CDR-H3：SEQ ID NO：135
VL E9.18CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：245
CDR-L2：SEQ ID NO：246
CDR-L3：SEQ ID NO：247
VH E9.19CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：137
CDR-H2：SEQ ID NO：138
CDR-H3：SEQ ID NO：139
VL E9.19CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：249
CDR-L2：SEQ ID NO：250
CDR-L3：SEQ ID NO：251
VH E9.22CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：141
CDR-H2：SEQ ID NO：142
CDR-H3：SEQ ID NO：143
VL E9.22CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：253
CDR-L2：SEQ ID NO：254
CDR-L3：SEQ ID NO：255
VH E9.48CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：145
CDR-H2：SEQ ID NO：146
CDR-H3：SEQ ID NO：147
VL E9.48CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：257
CDR-L2：SEQ ID NO：258
CDR-L3：SEQ ID NO：259
VH E9.65CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：149
CDR-H2：SEQ ID NO：150
CDR-H3：SEQ ID NO：151
VL E9.65CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：261
CDR-L2：SEQ ID NO：262
CDR-L3：SEQ ID NO：263
VH E9.66CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：153
CDR-H2：SEQ ID NO：154
CDR-H3：SEQ ID NO：155
VL E9.66CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：265
CDR-L2：SEQ ID NO：266
CDR-L3：SEQ ID NO：267
VH E9.71CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：157
CDR-H2：SEQ ID NO：158
CDR-H3：SEQ ID NO：159
VL E9.71CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：269
CDR-L2：SEQ ID NO：270
CDR-L3：SEQ ID NO：271
VH E9.13CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：161
CDR-H2：SEQ ID NO：162
CDR-H3：SEQ ID NO：163
VL E9.13CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：217
CDR-L2：SEQ ID NO：218
CDR-L3：SEQ ID NO：219
VH E9.16CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：165
CDR-H2：SEQ ID NO：166
CDR-H3：SEQ ID NO：167
VL E9.16CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：221
CDR-L2：SEQ ID NO：222
CDR-L3：SEQ ID NO：223
VH E9.38CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：169
CDR-H2：SEQ ID NO：170
CDR-H3：SEQ ID NO：171
VL E9.38CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：225
CDR-L2：SEQ ID NO：226
CDR-L3：SEQ ID NO：227
VH E9.2B CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：173
CDR-H2：SEQ ID NO：174
CDR-H3：SEQ ID NO：175
VL E9.2B CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：273
CDR-L2：SEQ ID NO：274
CDR-L3：SEQ ID NO：275
VH E9.1F CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：177
CDR-H2：SEQ ID NO：178
CDR-H3：SEQ ID NO：179
VL E9.1F CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：277
CDR-L2：SEQ ID NO：278
CDR-L3：SEQ ID NO：279
VH E9.10H CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：181
CDR-H2：SEQ ID NO：182
CDR-H3：SEQ ID NO：183
VL E9.10H CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：301
CDR-L2：SEQ ID NO：302
CDR-L3：SEQ ID NO：303
VH E9.5E CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：185
CDR-H2：SEQ ID NO：186
CDR-H3：SEQ ID NO：187
VL E9.5E CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：293
CDR-L2：SEQ ID NO：294
CDR-L3：SEQ ID NO：295
VH E9.10C CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：189
CDR-H2：SEQ ID NO：190
CDR-H3：SEQ ID NO：191
VL E9.10C CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：281
CDR-L2：SEQ ID NO：282
CDR-L3：SEQ ID NO：283
VH E9.7E CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：193
CDR-H2：SEQ ID NO：194
CDR-H3：SEQ ID NO：195
VL E9.7E CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：289
CDR-L2：SEQ ID NO：290
CDR-L3：SEQ ID NO：291
VH E9.12B CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：197
CDR-H2：SEQ ID NO：198
CDR-H3：SEQ ID NO：199
VL E9.12B CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：297
CDR-L2：SEQ ID NO：298
CDR-L3：SEQ ID NO：299
VH E9.10E CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：201
CDR-H2：SEQ ID NO：202
CDR-H3：SEQ ID NO：203
VL E9.10E CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：285
CDR-L2：SEQ ID NO：286
CDR-L3：SEQ ID NO：287
VH E9.6A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：205
CDR-H2：SEQ ID NO：206
CDR-H3：SEQ ID NO：207
VL E9.6A CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：305
CDR-L2：SEQ ID NO：306
CDR-L3：SEQ ID NO：307
VH E9.7A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：209
CDR-H2：SEQ ID NO：210
CDR-H3：SEQ ID NO：211
VL E9.7A CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：309
CDR-L2：SEQ ID NO：310
CDR-L3：SEQ ID NO：311
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5.根据权利要求4的结合蛋白，其包括至少两个可变结构域CDR组。
6.根据权利要求5的结合蛋白，其中所述至少2个可变结构域CDR组选自：
VH E9CDR组和VL E9CDR组，
VH E9.4CDR组和VL E9.4CDR组，
VH E9.11CDR组和VL E9.11CDR组，
VH E9.14CDR组和VL E9.14CDR组，
VH E9.17CDR组和VL E9.17CDR组，
VH E9.18CDR组和VL E9.18CDR组，
VH E9.19CDR组和VL E9.19CDR组，
VH E9.22CDR组和VL E9.22CDR组，
VH E9.48CDR组和VL E9.48CDR组，
VH E9.65CDR组和VL E9.65CDR组，
VH E9.66CDR组和VL E9.66CDR组，
VH E9.71CDR组和VL E9.71CDR组，
VH E9.13CDR组和VL E9.13CDR组，
VH E9.16CDR组和VL E9.16CDR组，
VH E9.38CDR组和VL E9.38CDR组，
VH E9.2B CDR组和VL E9.2B CDR组，
VH E9.1F CDR组和VL E9.1F CDR组，
VH E9.10H CDR组和VL E9.10H CDR组，
VH E9.5E CDR组和VL E9.5E CDR组，
VH E9.10C CDR组和VL E9.10C CDR组，
VH E9.7E CDR组和VL E9.7E CDR组，
VH E9.12B CDR组和VL E9.12B CDR组，
VH E9.10E CDR组和VL E9.10E CDR组，
VH E9.6A CDR组和VL E9.6A CDR组，
VH E9.7A CDR组和VL E9.7A CDR组，
VH E9.8H CDR组和VL E9.8H CDR组，
VH E9-SE1CDR组和VL E9-SE 1CDR组，
VH E9-SE2CDR组和VL E9-SE2CDR组，
VH E9-SE3CDR组和VL E9-SE3CDR组，
VH E9-SE4CDR组和VL E9-SE4CDR组，
VH E9-SE5CDR组和VL E9-SE5CDR组，
VH E9-SE6CDR组和VL E9-SE6CDR组，
VH E9-SE7CDR组和VL E9-SE7CDR组，
VH E9-SE8CDR组和VL E9-SE8CDR组，
VH E9-FR1CDR组和VL E9-FR1CDR组，
VH E9-FR2CDR组和VL E9-FR2CDR组，
VH E9.71CDR组和VL E9.71CDR组，
VH E9.71(M)CDR组和VL E9.71(M)CDR组，和
VH E9.71(L)CDR组和VL E9.71(L)CDR组。
7.根据权利要求1-6中任一项的结合蛋白，其进一步包括人接纳体构架。
8.根据权利要求7的结合蛋白，其中所述人接纳构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQ ID NO：6-22，
重链接纳体序列SEQ ID NO：35-62，
轻链接纳体序列SEQ ID NO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQ ID NO：63-98。
9.根据权利要求7或8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基
酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
10.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括在关键残基处的至少一
个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中
的残基。
11.根据权利要求10的结合蛋白，其中所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、
34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、
76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、
49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
12.根据权利要求11的结合蛋白，其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。
13.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列
的至少一个可变结构域：SEQ ID NO：1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、
136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、
272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、
212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、
351、352、353、354、355、356、357、358、359、360和361。
14.根据权利要求13的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述
2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：1和111、SEQ ID NO：116和228、SEQ ID NO：120和232、SEQ ID NO：124和236、SEQ ID NO：128和240、SEQ ID NO：132和
244、SEQ ID NO：136和248、SEQ ID NO：140和252、SEQ ID NO：144和256、SEQ ID NO：148和260、SEQ ID NO：152和264、SEQ ID NO：156和268、SEQ ID NO：160和216、SEQ ID NO：
164和220、SEQ ID NO：168和224、SEQ ID NO：172和272、SEQ ID NO：176和276、SEQ ID NO：180和300、SEQ ID NO：184和292、SEQ ID NO：188和280、SEQ ID NO：192和288、SEQ ID NO：196和296、SEQ ID NO：200和284、SEQ ID NO：204和304、SEQ ID NO：208和308、SEQ ID NO：212和312、SEQ ID NO：334和335、SEQ ID NO：336和337、SEQ ID NO：338和
339、SEQ ID NO：340和341、SEQ ID NO：342和343、SEQ ID NO：344和345、SEQ ID NO：346和347、SEQ ID NO：348和349、SEQ ID NO：350和351、SEQ ID NO：352和353、SEQ ID NO：
354和355、SEQ ID NO：356和357、SEQ ID NO：358和359、SEQ ID NO：360和361。
15.根据权利要求11的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列
的至少一个可变结构域：SEQ ID NO：1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、
136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、
272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、
212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、
351、352、353、354、355、356、357、358、359、360和361。
16.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括VH。
17.根据权利要求16的结合蛋白，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、
176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、
352、354、356、358和360。
18.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VL.
19.根据权利要求18的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、
272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、
351、353、355、357、359和361。
20.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH和VL.
21.根据权利要求19的结合蛋白，其进一步包括VH，其中所述VH包括选自下述的氨基
酸序列：
SEQ ID NO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、
176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、
352、354、356、358和360。
22.根据权利要求20的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、
272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、
351、353、355、357、359和361。
23.根据权利要求2的结合蛋白，其进一步包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构
域：人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。
24.根据权利要求23的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域是人IgG1恒定
结构域。
25.根据权利要求24的结合蛋白，其中所述人IgG1恒定结构域包括选自SEQ ID NO：
2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
26.根据权利要求2的结合蛋白，其进一步包括轻链免疫球蛋白恒定结构域选自：人Ig κ恒定结构域和人Igλ恒定结构域。
27.根据权利要求26的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Ig κ
恒定结构域，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：4。
28.根据权利要求26的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igλ恒
定结构域，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：5。
29.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自：免疫球蛋白分子，scFv，单克隆抗体，人抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单结构域抗体，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2，Fv，二硫键连接的Fv，单结构域抗体，双抗体，多特异性抗体，双特异性抗体和双重特异性抗体。
30.根据权利要求29的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
31.一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、
176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、
352、354、356、358和360；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、
272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、
351、353、355、357、359和361。
32.根据权利要求31的结合蛋白，其中所述Ig恒定轻链区是SEQ ID NO：5.
33.根据权利要求1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与
Notch蛋白的相互作用，所述Notch蛋白选自Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其组合。
34.根据权利要求33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1和
Notch-4的相互作用。
35.根据权利要求33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1的相互
作用。
36.根据权利要求33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-4的相互
作用。
37.根据权利要求1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节DLL4的生物
学功能。
38.根据权利要求1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和DLL4。
39.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述DLL4选自：人DLL4、小鼠DLL4、食蟹
猴DLL4和大鼠DLL4。
40.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减少DLL4与其受体结合
的能力。
41.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能够降低正常血管生
成。
42.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离常数(KD)选
-7 -8 -9 -10 -11 -12
自：至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M和-13
至多10 M。
43.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的结合速率选自：
2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
至少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s 和至少约10M s 。
44.根据权利要求38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离速率选自：
-3 -1 -4 -1 -5 -1 -6 -1
至多约10 s ；至多约10 s ；至多约10 s 和至多约10 s 。
45.一种包括权利要求1-32中任一项的结合蛋白的标记的结合蛋白，其中所述结合蛋
白与可检测标记缀合。
46.权利要求45的标记的结合蛋白，其中所述可检测标记选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
3 14 35
47.权利要求46的标记的结合蛋白，其中所述标记是放射性标记，其选自：H、C、S、
90 99 111 125 131 177 166 153
Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho和 Sm。
48.一种包括权利要求1-32中任一项所述的结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体
进一步包括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。
49.根据权利要求48的抗体构建体，其选自
免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR嫁接的抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab′，
F(ab′)2，
Fv，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单结构域抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，和
双特异性抗体。
50.根据权利要求48的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括重链免疫球蛋白恒定结
构域，其选自：
人IgM恒定结构域，
人IgG1恒定结构域，
人IgG2恒定结构域，
人IgG3恒定结构域，
人IgG4恒定结构域，
人IgE恒定结构域，
人IgA恒定结构域，
和具有一个或多个突变、改变与Fc新生受体、Fc γ受体或C1q结合强度的IgG恒定
结构域变体。
51.根据权利要求48的抗体构建体，其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白
恒定结构域：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及其组合。
52.一种包括如权利要求48中所述的抗体构建体的抗体缀合物，其中所述抗体构建体
与治疗剂和细胞毒剂缀合。
53.根据权利要求52的抗体缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷
化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
54.一种分离的核酸，其编码选自下述的多肽：包括重链可变结构域的多肽，其中所述重链可变结构域包括一种或多种如权利要求1中所述的CDR-H 1、CDR-H2或CDR-H3；包括轻链可变结构域的多肽，其中所述轻链可变结构域包括一种或多种如权利要求1中所述的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3；或两种多肽的组合。
55.一种载体，其包括根据权利要求54的分离的核酸。
56.权利要求55的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。
57.一种宿主细胞，其包括根据权利要求55和56任一项的载体。
58.根据权利要求57的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
59.根据权利要求58的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
60.根据权利要求59的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
61.根据权利要求60的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
62.根据权利要求61的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、鸟类细胞
和昆虫细胞的动物细胞。
63.根据权利要求62的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
64.根据权利要求62的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS细胞。
65.根据权利要求61的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
66.根据权利要求62的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
67.一种产生结合人DLL4的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合人DLL4的结合蛋
白的条件下，在培养基中培养权利要求57-66中任一项的宿主细胞。
68.一种结合蛋白，其根据权利要求67的方法产生。
69.一种结晶结合蛋白，其包括根据权利要求1-32任一项的结合蛋白，其中所述结合
蛋白以晶体存在。
70.根据权利要求69的结晶结合蛋白，其中所述晶体是无载体的药学控释晶体。
71.根据权利要求69的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶
性配对物更长的体内半衰期。
72.根据权利要求69的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物学活性。
73.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括：
(a)制剂，其中所述制剂包括根据权利要求69-72中任一项的结晶结合蛋白和成分；和
(b)至少一种聚合载体。
74.根据权利要求73的组合物，其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚
合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。
75.根据权利要求73的组合物，其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
76.一种用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的根据权利要求73
的组合物的步骤。
77.一种药物组合物，其包含权利要求1-32中任一项的结合蛋白和药学可接受的载
体。
78.权利要求77的药物组合物，其进一步包含用于治疗其中DLL4活性是有害的病症的
至少一种另外的治疗剂。
79.权利要求78的药物组合物，其中所述另外的试剂选自：血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506和非类固醇消炎药。
80.一种用于减少人DLL4活性的方法，其包括使人DLL4与权利要求1-32中任一项的
结合蛋白接触，从而使得人DLL4活性减少。
81.一种用于减少患有其中DLL4活性是有害的病症的人受试者中的人DLL4活性的方
法，其包括给所述人受试者施用权利要求1-32中任一项的结合蛋白，从而使得所述人受试者中的人DLL4活性减少。
82.一种用于治疗受试者的其中DLL4活性是有害的疾病或病症的方法，其通过下述实
现：给所述受试者施用权利要求1-32中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
83.权利要求82的方法，其中所述病症选自：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺体癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌、造血恶性肿瘤的实体肿瘤、肿瘤转移、眼部新生血管化、水肿、类风湿关节炎、多发性硬化症、动脉硬化斑块、克罗恩病、炎症性肠病、顽固性腹水、牛皮癣、结节病、动脉血管硬化、败血症、消化道溃疡、烧伤和胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、良性前列腺增生和其他独立于和依赖于血管生成的疾病，其特征在于异常DLL4活性。
84.权利要求83的方法，其中所述病症是原发性和转移性癌症。
85.权利要求83的方法，其中所述尿道癌选自肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌。
86.权利要求83的方法，其中所述的女性生殖道癌选自子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病。
87.权利要求83的方法，其中所述男性生殖道癌选自前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤。
88.权利要求83的方法，其中所述内分泌腺体癌选自甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺
癌。
89.权利要求83的方法，其中所述肉瘤选自骨肉瘤/软组织肉瘤和卡波西氏肉瘤。
90.权利要求83的方法，其中所述脑膜癌选自星形胶质细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞
瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤。
91.权利要求83的方法，其中所述造血恶性肿瘤的实体肿瘤是白血病、霍奇金氏白血
病、非霍奇氏白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
92.权利要求83的方法，其中所述眼部新生血管化选自糖尿病失明、视网膜病变、年龄引起的黄斑变性和虹膜发红。
93.一种治疗患有其中DLL4是有害的病症的患者的方法，其包括在第二种试剂施用之
前、同时或之后，施用权利要求1-32中任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自能够结合人VEGFR2的抗体或其片段；氨甲蝶呤；能够结合人TNF的抗体或其片段；皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、FK506和非类固醇消炎药。
94.一种包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包
括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO：105)，其中；
X1是S、N或D；
X2是H或Y；
X3是W；
X4是M；
X5是S或H；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO：106)，其中；
X1是I、D、M或T；
X2是I；
X3是S；
X4是Y、N、S、Q、V、T、H或D；
X5是D；
X6是G；
X7是S、R、I、T、G、K、H或N；
X8是N、Y、S、I或T；
X9是K、M、N、Q、E、T、R、S、A或L；
X10是Y、D或E；
X11是S或Y；
X12是A；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO：107)，
其中；
X1是A；
X2是G、A或R；
X3是G；
X4是G、S或A；
X5是N；
X6是V或M；
X7是G；
X8是F、L、Y或M；
X9是D；和
X10是I、S或L；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO：108)，
其中；
X1是S；
X2是A或G；
X3是D；
X4是K、N、L、Q、M、E、S、T、G或D；
X5是L；
X6是G；
X7是T、S、N、A、G或E；
X8是K、Q、N或R；
X9是Y；
X10是V或I；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：109)，其中；
X1是Q；
X2是D；
X3是A、G、W、S或D；
X4是K、M、Q、N、L、T、I或E；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：110)，其中；
X1是Q；
X2是S或A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、Q、P、A、V、W或M；
X6是S、G、I、N、R或T；
X7是D或G；
X8是V、A、P或E；和
X9是V.
95.权利要求94的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：112的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：112的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：112的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：113的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：113的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：113的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：316的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：316的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：316的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：317的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：317的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：317的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：318的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：318的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：318的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：319的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：319的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：319的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：320的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：320的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：320的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：321的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：321的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：321的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：322的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：322的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：322的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：323的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：323的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：323的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：324的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：324的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：324的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：325的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：325的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：325的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：326的残基31-35(CDR-H1)；SEQ ID NO：326的残基50-66(CDR-H2)；SEQ ID NO：326的残基99-108(CDR-H3)；
SEQ ID NO：327的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：327的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：327的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：328的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：328的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：328的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：329的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：329的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：329的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：330的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：330的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：330的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：331的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：331的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：331的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：332的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：332的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：332的残基88-96(CDR-L3)；
SEQ ID NO：333的残基23-33(CDR-L1)；SEQ ID NO：333的残基49-55(CDR-L2)；SEQ ID NO：333的残基88-96(CDR-L3)。
96.权利要求95的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDR。
97.权利要求96的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包括选自下述的可变结构域CDR
组：
VH A10CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：112的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：112的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：112的残基99-108
VL A10CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：113的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：113的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：113的残基88-96
VH A10.3 CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：316的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：316的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：316的残基99-108
VL A10.3CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：327的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：327的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：327的残基88-96
VH A10.K30CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：317的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：317的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：317的残基99-108
VH A10.K42CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：318的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：318的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：318的残基99-108
VH A10.9A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：319的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：319的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：319的残基99-108
VH A10.8A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：320的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：320的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：320的残基99-108
VH A10.1A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：321的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：321的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：321的残基99-108
VH A10.5D CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：322的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：322的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：322的残基99-108
VH A10.3A CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：323的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：323的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：323的残基99-108
VL A10.3A CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：330的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：330的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：330的残基88-96
VH A10.6B CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：324的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：324的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：324的残基99-108
VL A10.6B CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：331的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：331的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：331的残基88-96
VH A10.3D CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：325的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：325的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：325的残基99-108
VL A10.3D CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：332的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：332的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：332的残基88-96
VH A10.4C CDR组
CDR-H1：SEQ ID NO：326的残基31-35
CDR-H2：SEQ ID NO：326的残基50-66
CDR-H3：SEQ ID NO：326的残基99-108
VL A10.4C CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：333的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：333的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：333的残基88-96
VL A10.L45CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：328的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：328的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：328的残基88-96
VL A10.L73CDR组
CDR-L1：SEQ ID NO：329的残基23-33
CDR-L2：SEQ ID NO：329的残基49-55
CDR-L3：SEQ ID NO：329的残基88-96
98.权利要求97的结合蛋白，其包括至少两个可变结构域CDR组。
99.权利要求98的结合蛋白，其中所述至少两个可变结构域CDR组选自：
VH A10CDR组和VL A10CDR组；
VH A10.3CDR组和VL A10.3CDR组；
VH A10.3A CDR组和VL A10.3A组；
VH A10.6B CDR组和VL A10.6B组；
VH A10.3D CDR组和VL A10.3D CDR组；
VH A10.4C CDR组和VL A10.4C CDR组；
VH A10.K30CDR组和VL A10.3CDR组；
VH A10.K42CDR组和VL A10.3CDR组；
VH A10.3CDR组和VL A10.L45CDR组；
VH A10.3CDR组和VL A10.L73CDR组；
VH A10.9A CDR组和VL A10.3CDR组；
VH A10.8A CDR组和VL A10.3CDR组；
VH A10.1A CDR组和VL A10.3CDR组；和
VH A10.5D CDR组和VL A10.3CDR组。
100.权利要求94-99中任一项的结合蛋白，其进一步包括人接纳体构架。
101.权利要求100的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQ ID NO：6-22，
重链接纳体序列SEQ ID NO：35-62，
轻链接纳体序列SEQ ID NO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQ ID NO：63-98。
102.权利要求100或101的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨
基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
103.权利要求101的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括在关键残基处的至少一个
构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中
的残基。
104.权利要求103的结合蛋白，其中所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、
34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、
76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、
49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L.
105.权利要求104的结合蛋白，其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。
106.权利要求94的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的
至少一个可变结构域：
SEQ ID NO：112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、330、324、331、325、
332、326、333、328和329。
107.权利要求106的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述2
个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：112和113、SEQ ID NO：316和327、SEQ ID NO：323和330、SEQ ID NO：324和331、SEQ ID NO：325和332、SEQ ID NO：326和
333。
108.权利要求104的结合蛋白，，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列
的至少一个可变结构域：SEQ ID NO：112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、
330、324、331、325、332、326、333、328和329。
109.权利要求95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH.
110.权利要求109的结合蛋白，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326。
111.权利要求95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VL。
112.权利要求111的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：113、327、328、329、330、331、332和333。
113.权利要求95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH和VL。
114.权利要求112的结合蛋白，其进一步包括VH，其中所述VH包括选自下述的氨基酸
序列：
SEQ ID NO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326。
115.根据权利要求20的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：113、327、328、329、330、331、332和333。
116.权利要求95的结合蛋白，其进一步包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：
人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。
117.权利要求117的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域是人IgG1恒定结
构域。
118.权利要求117的结合蛋白，其中所述人IgG1恒定结构域包括选自SEQ ID NO：2和
SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
119.权利要求95的结合蛋白，其进一步包括轻链免疫球蛋白恒定结构域选自：人Ig
κ恒定结构域和人Igλ恒定结构域。
120.权利要求119的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Ig κ恒
定结构域，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：4。
121.权利要求119的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igλ恒定
结构域，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：5。
122.权利要求94的结合蛋白其中所述结合蛋白选自：免疫球蛋白分子；scFv；单克隆
抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab’片段；F(ab’)2；Fv；
二硫键连接的Fv，单结构域抗体，双抗体，多特异性抗体，双特异性抗体和双重特异性抗体。
123.权利要求122的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
124.一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NO：113、327、328、329、330、331、332和333。
125.权利要求124的结合蛋白，其中所述Ig恒定轻链区是SEQ ID NO：5。
126.根据权利要求94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与
Notch蛋白的相互作用，所述Notch蛋白选自Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其组合。
127.权利要求126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1和
Notch-4的相互作用。
128.权利要求126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1的相互作
用。
129.权利要求126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-4的相互作
用。
130.权利要求94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节DLL4的生物
学功能。
131.权利要求94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和DLL4。
132.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述DLL4选自：人DLL4、小鼠DLL4、食蟹猴
DLL4和大鼠DLL4。
133.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减少DLL4与其受体结合的
能力。
134.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能够降低正常血管生成。
135.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离常数(KD)选
-7 -8 -9 -10 -11 -12
自：至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M和-13
至多10 M。
136.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的结合速率选自：至
2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s 和至少约10M s 。
137.权利要求131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离速率选自：至
-3 -1 -4 -1 -5 -1 -6 -1
多约10 s ；至多约10 s ；至多约10 s 和至多约10 s 。
138.一种包括权利要求94-137中任一项的结合蛋白的标记的结合蛋白，其中所述结
合蛋白与可检测标记缀合。
139.权利要求138的标记的结合蛋白，其中所述可检测标记选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
3 14
140.权利要求139的标记的结合蛋白，其中所述标记是放射性标记，其选自：H、C、
35 90 99 111 125 131 177 166 153
S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho和 Sm。
141.一种抗体构建体，其包括权利要求94-137中任一项所述的结合蛋白和进一步包
括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。
142.根据权利要求141的抗体构建体，其选自：
免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR嫁接的抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab′，
F(ab′)2，
Fv，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单结构域抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，和
双特异性抗体。
143.根据权利要求141的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括重链免疫球蛋白恒定
结构域，其选自：
人IgM恒定结构域，
人IgG1恒定结构域，
人IgG2恒定结构域，
人IgG3恒定结构域，
人IgG4恒定结构域，
人IgE恒定结构域，
人IgA恒定结构域，
和具有一个或多个突变、改变与Fc新生受体、Fc γ受体或C1q结合强度的IgG恒定
结构域变体。
144.根据权利要求141的抗体构建体，其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋
白恒定结构域：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及其组合。
145.一种包括如权利要求141中所述的抗体构建体的抗体缀合物，其中所述抗体构建
体与治疗剂和细胞毒剂缀合。
146.根据权利要求145的抗体缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
147.一种分离的核酸，其编码选自下述的多肽：包括重链可变结构域的多肽，其中所
述重链可变结构域包括一种或多种如权利要求94中所述的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3；包括轻链可变结构域的多肽，其中所述轻链可变结构域包括一种或多种如权利要求94中所述的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3；或两种多肽的组合。
148.一种载体，其包括根据权利要求147的分离的核酸。
149.权利要求148的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。
150.一种宿主细胞，其包括根据权利要求148和149任一项的载体。
151.根据权利要求150的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
152.根据权利要求151的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
153.根据权利要求152的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
154.根据权利要求153的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
155.根据权利要求154的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、鸟类细
胞和昆虫细胞的动物细胞。
156.根据权利要求155的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
157.根据权利要求155的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS细胞。
158.根据权利要求154的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
159.根据权利要求155的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
160.一种产生结合人DLL4的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合人DLL4的结合
蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求150-159中任一项的宿主细胞。
161.一种结合蛋白，其根据权利要求160的方法产生。
162.一种结晶结合蛋白，其包括根据权利要求94-137任一项的结合蛋白，其中所述结
合蛋白以晶体存在。
163.根据权利要求162的结晶结合蛋白，其中所述晶体是无载体的药学控释晶体。
164.根据权利要求162的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可
溶性配对物更长的体内半衰期。
165.根据权利要求162的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物学活性。
166.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括：
(a)制剂，其中所述制剂包括根据权利要求162-165中任一项的结晶结合蛋白和成分；
和
(b)至少一种聚合载体。
167.根据权利要求166的组合物，其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚
合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。
168.根据权利要求166的组合物，其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
169.一种用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的根据权利要求
166的组合物的步骤。
170.一种药物组合物，其包含权利要求94-137中任一项的结合蛋白和药学可接受的
载体。
172.权利要求170的药物组合物，其进一步包含用于治疗其中DLL4活性是有害的病症
的至少一种另外的治疗剂。
173.权利要求172的药物组合物，其中所述另外的试剂选自：血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506和非类固醇消炎药。
174.一种用于减少人DLL4活性的方法，其包括使人DLL4与权利要求94-137中任一项
的结合蛋白接触，从而使得人DLL4活性减少。
175.一种用于减少患有其中DLL4活性是有害的病症的人受试者中的人DLL4活性的方
法，其包括给所述人受试者施用权利要求94-137中任一项的结合蛋白，从而使得所述人受试者中的人DLL4活性减少。
176.一种用于治疗受试者的其中DLL4活性是有害的疾病或病症的方法，其通过下述
实现：给所述受试者施用权利要求94-137中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
177.权利要求176的方法，其中所述病症选自：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺体癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌、造血恶性肿瘤的实体肿瘤、肿瘤转移、眼部新生血管化、水肿、类风湿关节炎、多发性硬化症、动脉硬化斑块、克罗恩病、炎症性肠病、顽固性腹水、牛皮癣、结节病、动脉血管硬化、败血症、消化道溃疡、烧伤和胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、良性前列腺增生和其他独立于和依赖于血管生成的疾病，其特征在于异常DLL4活性。
178.权利要求177的方法，其中所述病症是原发性和转移性癌症。
179.权利要求177的方法，其中所述尿道癌选自肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌。
180.权利要求177的方法，其中所述的女性生殖道癌选自子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病。
181.权利要求177的方法，其中所述男性生殖道癌选自前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤。
182.权利要求177的方法，其中所述内分泌腺体癌选自甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体
腺癌。
183.权利要求177的方法，其中所述肉瘤选自骨肉瘤/软组织肉瘤和卡波西氏肉瘤。
184.权利要求177的方法，其中所述脑膜癌选自星形胶质细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤。
185.权利要求177的方法，其中所述造血恶性肿瘤的实体肿瘤是白血病、霍奇金氏白
血病、非霍奇氏白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
186.权利要求83的方法，其中所述眼部新生血管化选自糖尿病失明、视网膜病变、年
龄引起的黄斑变性和虹膜发红。
187.一种治疗患有其中DLL4是有害的病症的患者的方法，其包括在第二种试剂施用
之前、同时或之后，施用权利要求94-137中任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自能够结合人VEGFR2的抗体或其片段；氨甲蝶呤；能够结合人TNF的抗体或其片段；
皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、FK506和非类固醇消炎药。
治疗用DLL4结合蛋白
Shutter等人，Genes Dev.，14(11)：1313-1318(2000)；Gale等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101(45)：15949-15954(2004)；Krebs等人，Genes Dev.，14(11)：1343-1352(2000))。
DLL4杂合小鼠是胚胎致死的，原因在于血管发育的主要缺陷(Gale等人，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，101(45)：15949-15954(2004)；Duarte 等 人，Genes Dev.，18(20)：
2474-2478(2004)；Krebs等人，Genes Dev.，18(20)：2469-2473(2004))。DLL4的表达被VEGF诱导(Liu等人，Mol.Cell Biol.，23(1)：14-25(2003)；Lobov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104(9)：3219-3224(2007))。反过来，DLL4可负调节VEGF信号通路，部分通过抑制VEGFR2和诱导VEGR1(Harrington等人，Microvasc.Res.，75(2)：144-154(2008)；Suchting等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104(9)：3225-3230(2007))。DLL4和VEGF之间的精妙配合对功能性血管发生是必需的。
69(2-3)：135-144(2001)；Patel 等 人，Cancer Res.，65(19)：8690-8697(2005)；Patel等 人，Clin.Cancer Res.，12(16)：4836-4844(2006)；Noguera-Troise 等 人，Nature，
444(7122)：1032-1037(2006))。DLL4的阻止有效地在多种模型中抑制原发性肿瘤生长(Noguera-Troise 等 人，Nature，444(7122)：1032-1037(2006)；Ridgway 等 人，Nature，
444(7122)：1083-1087(2006)；Scehnet等人，Blood，109(11)：4753-4760(2007))。DLL4抑制甚至针对对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤有效。DLL4和VEGF的组合抑制提供了增强的抗肿瘤活性。有趣的是，不像VEGF的抑制减少肿瘤血管形成，DLL4阻止(blockade)导致肿瘤血管密度的增加，其中所述血管是异常的，不能支持有效的血液输送并且不起有效作用。因此，DLL4为治疗癌症提供了潜在靶向。
2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、
71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、
335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、
354、355、356、357、358、359、360和361。
180和300、SEQ ID NO：184和292、SEQ ID NO：188和280、SEQ ID NO：192和288、SEQ ID NO：196和296、SEQ ID NO：200和284、SEQ ID NO：204和304、SEQ ID NO：208和308、SEQ ID NO：212和312、SEQ ID NO：334和335、SEQ ID NO：336和337、SEQ ID NO：338和339、SEQ ID NO：340和341、SEQ ID NO：342和343、SEQ ID NO：344和345、SEQ ID NO：346和
347、SEQ ID NO：348和349、SEQ ID NO：350和351、SEQ ID NO：352和353、SEQ ID NO：354和355、SEQ ID NO：356和357、SEQ ID NO：358和359、SEQ ID NO：360和361。
350、352、354、356、358和360。
349、351、353、355、357、359和361。
350、352、354、356、358和360；和
349、351、353、355、357、359和361。
2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、
71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
-6 -7 -8
信号通路的相互作用的抗体，其具有约至少10 M、至少10 M或至少10 M的IC50值。
于DLL4的结合速率(on rate)常数(Kon)为：至少约10M s ；至少约10M s ；至少约
4 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
10M s ；至少约10M s ；或至少约10M s 。优选地，如通过表面等离振子共振测量的，本
2 -1 -1 3 -1 -1 3 -1 -1
发明的结合蛋白具有对于DLL4的结合速率常数(Kon)为10M s 至10M s 之间；10M s
4 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
至10M s 之间；10M s 至10M s 之间或10M s 至10M s 之间。
约10 s 。优选地，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的-3 -1 -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1
解离速率常数(Koff)为10 s 至10 s ；10 s 至10 s ；或10 s 至10 s 。
-13 -7 -8 -8
10 M。优选地，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的解离常数(KD)为10 M至10 M；10 M
-9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13
至10 M；10 M至10 M；10 至10 M；10 M至10 M；或of10 M至10 M。
是放射性标记，其选自：H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho和 Sm。在优选的实施方案中，所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5,648,260和
5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗用抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与Fc γRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。
在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的
二聚化来介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人，Nature；264：415-420(1976；
Thies等人，J Mol Biol；293：67-79(1999))。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责CH3二聚化的残基已得到鉴定
(Dall’Acqua，Biochemistry 37：9266-9273(1998))。因此，可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman，Ann Immunol
129：855-70(1978)；Biewenga等人，Clin Exp Immunol 51：395-400(1983))。FcRn∶Ig Fc区的化学计量已测定为2∶1(West等人，Biochemistry 39：9698-708(2000))，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人，Eur J Immunol；24：542-548(1994))。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不利作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3b折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性完全取决于IgG Fc片段N-联聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，这样就可以生成合适的IgG1 Fc片段，从而生成具有大大增强的能力的完全重组的唾液酸化IgG1 Fc(Anthony，R.M.，等人，Science 320：373-376(2008))。
等人，Nature，341：544-546(1989)；PCT公开号WO 90/05144A1，它包含单个可变结构域；
和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开
的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单
链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人Science，242：423-426(1988)；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988))。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Poljak等人Structure，2：1121-1123(1994))。此种抗体结合部分是本领域已知的(参见Kontermann和Dubel编，Antibody Engineering(2001)(Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN
3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。
Acids Res.，20：6287-6295(1992)；Kellermann 和 Green，Curr.Opin.Biotechnol.，13：
593-597(2002)；Little等人，Immunol.Today，21：364-370(2000))或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系谱内非天然存在的序列。
877-883(1989))发现Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为“L1”、“L2”和“L3”或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为“Chothia CDR”，所述Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的限定CDR的其他边界已
由PadlanFASEB J.，9：133-139(1995)和MacCallum J.Mol.Biol.，262(5)：732-45(1996)描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上文系统之一，但仍将与Kabat CDR重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDR并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。
190：382-391(1971)和Kabat，E.A.，等 人Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号
91-3242(1991))。对于重链可变区(VH)，高变区对于CDR1为氨基酸位置31-35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95-102。对于轻链可变区(VL)，高变区对于CDR1为氨基酸位置24-34，对于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置
89-97。
在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
169：147-155(1995)；Yelton 等 人，J.Immunol.，155：1994-2004(1995)；Jackson 等 人，J.Immunol.，154(7)：3310-3319(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)。
在美国专利号6,914,128B1中描述了由活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置及在接触或高变位置的选择性突变。
这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。
“DVD-Ig”。此类DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体的并象IgG分子一样，但提供比IgG分子更多的抗原结合部位。因此，每一半的四聚体DVD-Ig分子象IgG分子的一半，并且包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但是不象提供单个抗原结合结构域的IgG分子的一对重链和轻链，DVD-Ig的一对重链和轻链提供两个或多个抗原结合部位。
3个抗原结合部位，并且其中一对重和轻链可以与另一对重和轻链结合，以形成具有6个抗原结合部位的四聚结合蛋白。
1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基，其不在人抗体的一个或多个特定位置上出现。接纳体构架区和/或一个或多个接纳体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或可通过商业途径获得的抗体)。
FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR′s。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，且FR代表构成构架区的4个亚区中的2
个或更多。
Recognit.，8：125-131(1995)；和Johnsson等人，Anal.Biochem.，198：268-277(1991)。
于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho和
153
Sm)，色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明和镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素化基团，由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域和表位标签)，和磁性试剂(例如钆螯合物)。免疫测定一般采用的代表性标记实例包括产生光的部分，例如吖啶 (acridinium)化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记是本领域已知的或如此处所述。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。使用“可检测地标记的”意指包含后一种类型的可检测标记。
变体DLL4保持野生型DLL4的原始抗体结合部位(表位))。氨基酸保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换，被本领域认可为一般涉及小改变。如本领域所理解的，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些小改变(见，例如Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以取代具有相似亲水指数的氨基酸，而仍然保持蛋白功能。一方面，取代具有亲水指数±2的氨基酸。也可以使用氨基酸亲水性来揭示将引起保持生物学功能的蛋白的取代。在肽的上下文中，考虑氨基酸的亲水性允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度(参见，例如，美国专利号4,554,101)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物学活性的肽，所述生物学活性例如免疫原性。一方面，用彼此具有±2以内的亲水性值的氨基酸来实施取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与那个观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸取代理解为取决于氨基酸、且尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。“变体”也可用于描述已经经过不同加工(例如蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰)而仍然保持其生物学活性或抗原反应性(例如结合DLL4的能力)的多肽或其片
段。除非另外与上下文相矛盾，此处使用“变体”意在包含变体的片段。
链恒定区和重链的CH1结构域。
缺陷的工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专 利号5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；
6,114,598和6,130,364。还参见于PCT公开号WO 91/10741；WO 94/02602；WO 96/34096；
WO 96/33735；WO98/16654；WO 98/24893；WO 98/50433；WO 99/45031；WO 99/53049；WO
00/09560和WO 00/37504。XENOMOUSE 转基因小鼠生产全人抗体的成体样人谱，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE 转基因小鼠包含约80％人抗体谱。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.，188：483-495(1998)，其公开内容在此引入作为参考。
且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公开号WO 92/18619(Kang等人)；PCT公开号WO 91/17271(Dower等人)；PCT公开号
WO 92/20791(Winter等人)；PCT公开号WO 92/15679(Markland等人)；PCT公开号WO
93/01288(Breitling等人)；PCT公开号WO92/01047(McCafferty等人)；PCT公开号WO
92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人，Bio/Technology，9：1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas，3：81-85(1992)；Huse 等 人，Science，246：1275-1281(1989)；
McCafferty 等 人，Nature，348：552-554(1990)；Griffiths 等 人，EMBO J.，12：
725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature，
352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580(1992)；Garrard等 人，Bio/Technology，9：1373-1377(1991)；Hoogenboom 等 人，Nucl.Acids Res.，19：
4133-4137(1991)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)；美国专利申请公开号2003/0186374；和PCT公开号WO 97/29131，其各自公开内容在此引入作为参考。
Brinkmann等人，J.Immunol.Methods，182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods，
184：177-186(1995)；Kettleborough等 人，Eur.J.Immunol.，24：952-958(1994)；Persic等人，Gene，187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology，57：191-280(1994)；
PCT 公 开 号 WO 92/01047；PCT 公 开 号 WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；
WO 92/18619；WO 93/11236；WO95/15982；WO 95/20401；和 美 国 专 利 号 5,698,426；
5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；
5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108；其各自在此整体引入作为参考。
那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology，203：
46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science，240：1038-1041(1988)。
体的分离的抗-DLL4抗体CDR序列建立两个新的DLL4结合蛋白家族，并且其包括包含源自E9和其亲和力成熟克隆或源自A10和其亲和力成熟克隆的CDR序列的多肽。E9单克隆抗
体和其亲和力成熟的衍生物的可变区和CDR列于表4，8，14，18和19。A10单克隆抗体和其亲和力成熟的衍生物可变区和CDR列于表4，9和10。为了产生和选择相对于人DLL4具有优选DLL4结合和/或中和活性的根据本发明的结合蛋白的CDR，可以使用本领域已知的用于产生本发明的结合蛋白和评估那些结合蛋白的DLL4结合和/或中和特征的标准方法，其包括但不限于本文具体所述的那些。
Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature，314：452-454(1985)，其整体引入本文作为参考。
分子的构架区。已知的人Ig序列在例如下述万维网网站(www.)中公开，例如：ncbi.
nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；atcc.org/phage/hdb.html；sciquest.com/；abcam.com/；antibodyresource.com/onlinecomp.html；public.iastate.edu/.about.pedro-/research_tools.html；mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html；whfreeman.com/
immunology-/CH05/kuby05.htm；library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.
html；hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；path.-cam.ac.uk/.about.mrc7/
mikeimages.html；antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks-/Immunology.html；immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html；
biotech.ufl.edu/.about.hcl/；pebio.com/pa/340913-/340913.html；nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito/Elisa.html；biodesign.com/table.asp；icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/；mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；ibt.unam.mx/-vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；anti-body.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；unizh.ch/.about.honegger/AHO-seminar/Slide01.html；cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；
nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；biosci.missouri.edu/
smithgp/index.html；cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages-/Pept/
spottech.html；jerini.de/frroducts.htm；patents.ibm.com/ibm.html。Kabat 等 人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，各自在此整体引入作为参考。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
Sims 等 人，J.Immunol.，151：2296-2308(1993)；Chothia 和 Lesk，J.Mol.Biol.，196：
901-917(1987)，Carter 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)；Presta等 人，J.Immunol.，151：2623-2632(1993)；Padlan E.A.，Molecular Immunology，
28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering，7(6)：805-814(1994)；
Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973(1994)；PCT公开号WO 91/09967；
WO 99/06834(PCT/US98/16280)，WO 97/20032(PCT/US96/18978)，WO 92/11272(PCT/
US91/09630)，WO 92/03461(PCT/US91/05939)，WO 94/18219(PCT/US94/01234)，WO
92/01047(PCT/GB91/01134)，WO 93/06213(PCT/GB92/01755)，WO90/14443，WO90/14424和WO90/14430；；欧洲公开号EP 0592106；EP 0 519 596和EP 0 239 400；美国专利
号 5,565,332；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；
5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；
5,585,089；5,225,539；和4,816,567，各自在此整体引入作为参考，包括其中引用的参考文献。
为约至少10 M；至少10 M，或至少10 M。
人DLL4解离，或或以约1x10 M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活性。可替代地，如-2 -1
通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10 s 或更少的koff速-7
率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10 M或更少的IC50抑制人DLL4和/或人DLL4活性。
-3 -1
可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10 s 或-8
更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10 M或更少的IC50抑制人DLL4。可替-4 -1
代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10 s 或更少-9
的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10 M或更少的IC50抑制DLL4活性。可替代-5 -1
地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10 s 或更少的-10
koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10 M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活-5 -1
性。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10 s-11
或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10 M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活性。
3
素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括 H、
14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或 Sm。
1527-1533(1990))；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.，14：201-240(1987)；Buchwald等人，Surgery，88：507-516(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.，321：574-579(1989))。
在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明疗法的控释或持续释放。参见
例 如，Goodson，J.M，In Medical Applications of Controlled Release，Vol.II，Applications和Evaluations，(Langer和Wise，eds.)，(CRC Press Inc.，Boca Raton，
1984)，第6章，第115-138页；Controlled Drug Biovailability，Drug Product Design and Performance，Smolen 和 Ball(eds.)(Wiley，New York，1984)；Langer 和 Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.Phys.，C23：61-126(1983)；see also，Levy等 人，Science，228：190-192(1985)；During等人，Ann.Neurol.，25：351-356(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.，71：105-112(1989)；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；
5,989,463；和5,128,326；和PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在优选实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分(参见，例如，Goodson，In Medical Applications of Controlled Release，(1984)第115-138页)。
Intl.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，24：853-854(1997)， 和 Lam 等
人，″Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，″Proceed.Intl.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.：24：759-760(1997)，其各自在此整体引入作为参考。
Pennsylavania，1995)。对于不可喷雾的局部剂型，一般采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有优选大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，优选与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如FREON )在混合物中包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，其各自在此整体引入引用作为参考。在具体实施方案中，本发明的抗体、组合疗法、和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR 肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Massachusetts，US)来施用。
150mM)的溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳
0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0-0.05％聚山梨醇酯80(最佳0.005-0.01％)包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596；Mulligan，Science，260：
926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，″Human Gene Therapy，″Ann.Rev.Biochem.，
62：191-217(1993)；Robinson，C.，Trends Biotechnol.，11：155(1993)。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(eds)，Current Protocols in
Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，(Stockton Press，New York，1990)。各种基因治疗方法的详细描述于在此引入作为参考的美国申请公开号US 2005/0042664A1中公开。
p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(Enbrel 和p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801和美苏帕玛(Mesopram)。优选组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；和针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、DLL4、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的DLL4结合蛋白可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的DLL4结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)抑制剂。
剂。本发明的结合蛋白可以与皮质类固醇组合，例如布地奈德和地塞米松。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的DLL4结合蛋白还可以与T细胞发信号抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的DLL4结合蛋白可以与IL-11组合。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异 唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰素γ。
的80μl/min流速下测定结合与解离常数，Kon(M s )和Koff(s )。在不同的抗原浓度范围(从1.23-900nM，作为3倍稀释系列)并包括只有缓冲液的注射(用作双重参照)条件下，通过进行动力学结合测量产生速率常数。然后通过以下公式：KD＝Koff/Kon，从动力学速率常数计算抗体与目标抗原之间反应的平衡解离常数KD(M)。以时间函数来记录结合并计算
6 -1 -1 -6 -1
动力学速率常数。在本试验中，可以测量到快至10M s 的结以及慢至10 s 的解离。
温育过夜。用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗涤ELISA板3次，然后用200ml/孔封闭缓冲液(D-PBS，1％B SA，1mM CaCl2，0.05％Tween-20)在25℃封闭一小时。将板子洗涤3次后与100μl/孔DLL4抗体(0.0001-100nM，在封闭缓冲液中做10-倍系列稀释)在25℃
温育1小时，然后再洗涤3次。含有捕获的DLL4抗体的板子与生物素标记的人DLL4细胞
外结构域(10nM in封闭缓冲液，100μl/孔)在25℃温育1小时、洗涤3次、并与HRP缀合的链霉亲和素(streptavidin)(KPL#474-3000，在封闭缓冲液中1∶10,000稀释，100μl/孔)在25℃温育1小时。洗涤最后一次以后，板与100μl/孔ELISA底物(1-Step Ultra
TMB-ELISA，Pierce#340280)一起温育，在25℃温育2分钟后，用100μl/孔2N H2SO4终止反应并读取450nm下的光吸收值。使用Graphpad Prism软件分析数据并报告EC50值。
DLL4-his(1μg/ml在PBS中)在25℃振动温育1小时，然后洗板3次。然后在板中加入
100μl/孔的重组大鼠/人嵌合抗体或重组人抗-DLL4抗体(0.00164-27nM，在ELISA缓冲液PBST，10％Superblock(Pierce#37515)中的4倍系列稀释)在25℃振动1小时，然后
再洗涤3次。将板子与山羊抗-人HRP(Pierce#31412)(以1∶40,000在ELISA缓冲液
中稀释，100μl/孔)在25℃下振动温育1小时，然后洗涤3次。洗涤最后一次以后，板子与100μl/孔ELISA底物(Sigma#T8665)一起温育，在25℃温育8分钟后，用100μl/孔
1NHCl终止反应并读取450nm下的光吸收值。使用Graphpad Prism软件分析数据并报告
EC50值。
浮于含有1％牛血清蛋白和1mM CaCl2的磷酸盐缓冲液(PBS)(FACS缓冲液)中。1.5x10
个细胞与不同浓度的抗体一起在FACS缓冲液中置冰上温育60分钟，洗涤细胞两次，并加入
50μL R-藻红蛋白缀合的抗-鼠IgG，F(ab′)2片段(在FACS缓冲液中1∶200稀释)
(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania，US，Cat.#112-116-072)。在冰上温育(4℃，60分钟)后，洗涤细胞三次，并在FACS缓冲液中重新悬浮，使用Becton Dickinson FACSCalibur-HTS(Becton Dickinson，San Jose，California，US)测量荧光。使用Graphpad Prism软件分析数据并报告EC50值，作为达到DLL4抗体与表达DLL4的细胞最大结合的
50％时抗体的浓度。
并在4℃温育过夜，然后用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗板3次，并用200μl/孔封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA，1mM CaCl2，0.05％Tween-20)在25℃封闭1小时，在封闭时，生物素标记的人DLL4细胞外结构域(14nM)与抗体(30pM-66nM，在封闭缓冲液中3-倍系
列稀释)在25℃振动混合1小时。封闭后洗涤测定板，并与DLL4/抗体混合物一起温育
(100μl/孔，在25℃振动1小时)。再次洗板并加入100μl/孔与HRP缀合的链霉亲和素
(Fitzgerald#65R-S104PHRPx，在封闭缓冲液中1∶5,000稀释)在25℃振动1小时。洗
涤最后一次以后，使用100μl/孔底物(TMB Sigma#T8665)对板子进行显色，在25℃温育8分钟(对于muDLL4ELISA)和20分钟(对于huDLL4ELISA)后，用100μl/孔1N HCl终止
反应并读取450nm下的光吸收值。使用Graphpad Prism软件分析数据并报告EC50值，作为达到DLL4与Notch1结合减少50％时抗体的浓度。
中。将HEK293-hDLL4或HEK293-mDLL4细胞以1.5x10 细胞/孔分配到96孔板(v形底)
的FACS缓冲液中。在将细胞轻甩下来并弃去上清液后，在每个孔中加入50μL适当稀释的纯化的IgG，并在冰上4℃温育60分钟，接着加入0.2μg/mL(对于hDLL4-293G)或2.0μg/mL(对于mDLL4-293G)的Notch1-生物素，50μL/孔(最终1.0或0.1μg/mL)，在冰上4℃
再温育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞两次后，加入50μLR-藻红蛋白缀合的链霉亲和素(在FACS缓冲液1∶150稀释)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania，US，catalog no.016-110-084)。在冰上温育(4℃，60分钟)后，洗涤细胞三次并在FACS缓冲液中重新悬浮，使用Becton Dickinson FACSCalibur-HTS(Becton Dickinson，San Jose，California，US)测量荧光。使用Graphpad Prism软件分析数据并报告EC50值，作为达到Notch1与表达DLL4的细胞结合减少50％时抗体的浓度。
定试剂盒(Invitrogen，#C35007)检测细胞增殖。使用制造商推荐的ELISA试剂盒(R&D系统#DVR100B)检测sVEGFR1在条件培养基中的表达，以CyQUANT试验测定的RFU标准化处
理VEGFR1的表达水平来解释细胞增殖中的差异。
另外应用的测量参数是16秒的调整期、10分钟预扫描等待时间，且测量以无反馈模式进行。对于每个单独的测量，按照如下提供的填板方案，填加420μL样品/空白到DSC测量样品容器内。将所获得的热分析图拟合到非双状态模型以获得中点温度和不同转换的焓。
间的热力学关系，正的DG指示此天然状态比变性状态更稳定-DG的正值越大越稳定性。蛋白质去折叠需要打破稳定力，构象的熵值超过稳定力使蛋白质去折叠，在此温度下熵值成为主导，DSC测量由于热变形导致去折叠的蛋白质的DH。作为一般规则，可以规定转换中点温度(Tm)越高蛋白质在较低温度下越稳定。在同一个实验期间，DSC还测量引起蛋白质变性的热容量(DCp)的变化。与蛋白质去折叠相关联的热容量变化主要是由于侧链水合作用的变化，即在天然状态是被埋藏起来，而在变性状态则暴露在溶剂中。已经表明DSC是一个有价值的蛋白质和其他生物大分子液体溶液稳定性的预测器(Remmele和Gombotz，BioPharm.，13：36-46(2000)和Remmele等人，Pharm.Res.，15：200-208(1998))。
与50nM生物素标记的小鼠DLL4细胞外结构域的混合物(第3轮)、100nM生物素标记的人
DLL4细胞外结构域(第4和5轮)、稳定表达人DLL4和100nM生物素标记的人DLL4细胞
外结构域的293G细胞(第6轮)、稳定表达人和小鼠DLL4的BAF3细胞(第7轮)。A10和
E9都是从抗体文库的第7轮筛选中鉴定出来的(表4)。当被构建到野生型人IgG1中时分
别重新命名分别为A10.1和E9.1。
和15nM)。
在细胞表面表达的DLL4(表6)。
细胞中抑制DLL4-诱导的Notch激活和sVEGFR1表达(表6)。
一性的其它人抗体序列鉴定超突变的CDR残基。相应的E9CDR残基然后通过PCR用在这
些位置具有低简并性的引物进行限制性突变发生，以产生三个抗体文库，其以scFv形式，适用于亲和力成熟步骤。第一文库含有在VH CDR1和2中残基30、31、32、33、50、54、56和
65(Kabat编号)处的突变；第二文库含有在VH CDR3中残基95至100、100a、100b、100c和
102处的突变；和第三文库含有在三个VL CDR中残基27、30、31、33、52、53、93至96处的突变。为了进一步增加E9与人种系构架序列的同一性，在VL位置103处的Arg突变为Lys
并还在VL位置80(A/P)和100(S/Y)处将二元简并性引入第三文库(表7)。
IgBlast数据库下载以产生序列标识(logo)。这些序列标识用于决定哪些位置将被预测以产生亲和力成熟的文库。
源性上与E9VL最接近的种系)的VK构架上(嫁接的VL＝E9AVK)。可选地，构架(FW)的
修复也与E9VH一起进行；其FW被保持但是可能引起抗体不稳定的氨基酸被取代，(修复的VH＝E9VH4r2)。构架的回复-突变掺入到CDR-嫁接和FW-修复中以维持抗体的结构和功
能(表11和表14)。
接的VH＝E9VH1D4.1)。E9VL的CDR嫁接到抗-IL-12的VK L2/L16构架上(嫁接的VL＝
E9VL325)和抗-IL-12的VK B3构架上(嫁接的VL＝E9VL1D4.1)。构架的回复-突变掺
入到CDR-嫁接中以维持抗体的结构和功能(表15和表18)。
氨酸改变(EU编号)和在位置235的亮氨酸到丙氨酸改变(Lund等人，J.Immunol.，147：
2657(1991))。可变轻链区的插入与人λ恒定区和人κ恒定区的读码框一致。从Blue
Heron收到合成的构建体后，扩增DNA并确认序列。与每个抗体相应的、适当的CDR-嫁接的重链和轻链(表11和14)(表15和18)被共转化到HEK-293-6E细胞中，瞬时地产生全
长CDR-嫁接的抗-人DLL4抗体。表11总结了产生的所有E9抗体变体和HEK-293-6e表
达数据。用蛋白A Sepharose色谱方法纯化含有重组人抗体的细胞上清液，并且通过加入酸性缓冲液来洗脱结合的抗体。将抗体透析到PBS中。
的CDR嫁接的抗体的亲和力，所述抗体是分别在表11和表15中描述的人DLL4、鼠DLL4和食蟹猴DLL4抗体。表13和表17显示来自封闭ELISA(实施例1.4)和封闭FACS(实施例
1.5)的IC50值，对应于分别在表11和表15中描述的CDR-嫁接的人DLL4和鼠DLL4抗体。
有突变的核苷酸。以两个连续步骤进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条携带突变的核苷酸的引物和两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物扩增全部可变区基因。
(EU编号)亮氨酸到丙氨酸的改变和在位置235处亮氨酸到丙氨酸的改变(Lund等人，
J.Immunol.，147：2657(1991))。通过同源重组，可变轻链区以符合读框插入到人λ1a信号肽和人λ恒定区之间。分离细菌菌落和提取质粒DNA；cDNA插入物以其完整性测序。
对应于每个抗体的正确的重链和轻链(表19)共转染到HEK-293-6E细胞以瞬时产生全长
E9-71(M)或E9-71(L)抗-人DLL4抗体。E9.71(M)和E9.71(L)二者具有相同轻链。含有
重组人抗体的细胞上清液可以通过蛋白A葡聚糖层析纯化并且结合的抗体通过添加酸缓冲液洗脱。抗体中和并透析到PBS中。
SignalP/)或众多其他等同软件，计算机模拟(in silico)构建的具有来自λ和κ信号
肽家族不同信号肽的E9-71(M)N-末端可变区的氨基酸序列在哺乳动物表达过程中正确抗体切割的百分比预测是本领域已知的。具有最高预测百分比的正确切割的信号肽从每个家族中各选一个如下：λ家族的λ3p和κ家族的L23。还选择了原始λ1a信号肽的突变
形式，其具有两个氨基酸改变(甘氨酸到精氨酸和丝氨酸到缬氨酸)。为了构建含有λ1a信号肽的轻链，以一步进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物(其中一条含有突变的核苷酸序列)扩增全部可变区基因。为了构建含有λ3p信号肽和κL23信号肽的轻链，设计两条重叠引物以构建信号肽区然后进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物扩增全部可变区基因。使用λ3p和κL23信号肽产生两种形式的E9-71可变区：一种具有全长可变区和另
一种具有在可变区N-末端第一丝氨酸(S)缺失。仅产生具有λ1a信号肽的全长可变区。
源自每个cDNA组装的PCR产物在琼脂糖凝胶上分离并将对应于预测的可变区cDNA大小的带切割并纯化。通过细菌中的同源重组，可变重链区以符合读框插入到编码含有两个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。这些突变是在位置234处(EU编号)亮氨
酸到丙氨酸的改变和在位置235处亮氨酸到丙氨酸的改变(Lund等人，J.Immunol.，147：
2657(1991))。通过同源重组，可变轻链区以符合读框插入到人λ恒定区。分离细菌菌落和提取质粒DNA；并将cDNA插入物以其完整性测序。对应于每个抗体的正确的重链和轻链共转染到HEK-293-6E细胞以瞬时产生全长E9-71(M)抗-人DLL4抗体。含有重组人抗体
的细胞上清液通过蛋白A葡聚糖层析纯化并且结合的抗体通过添加酸缓冲液洗脱。抗体透析到PBS中。通过质谱(MS)分析纯化的E9.71(M)抗体用于证实天然(intact)抗体序列。
表20如下显示用于产生E9.71(M)的不同信号肽的氨基酸序列。表21如下显示通过质谱
分析的E9.71(M)切割部位。
Varian Diphenyl柱的Agilent6510Q-TOF LC/MS系统。缓冲液A是0.02％三氟乙酸(TFA)、
0.08％甲酸(FA)的水溶液。缓冲液B是0.02％TFA，0.08％FA的乙腈溶液。梯度起始于
5％B，在5分钟内增加到35％B并在15分钟内增加到38％B。然后梯度在1分钟内增加
到95％B并在95％B稳定4分钟，在1分钟内降低到5％B。流速是50μL/min。质谱仪
在5千伏喷雾电压运转和扫描范围是600至3200质量电荷比。轻链分子量22649道尔顿
与具有氨基酸Y为N-末端的理论值匹配良好。在分子量22014道尔顿、22737道尔顿和
22937道尔顿观察到三个次要峰。在22014道尔顿的峰与N-末端-6个氨基酸片段一致。
该峰很可能由来自全长轻链的来源内(in-source)片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”(“fragmentor value”)可导致该峰的消失。22737道尔顿与具有氨基酸S为N-末端的理论值一致。22937道尔顿与具有在N-末端上氨基酸“LS”的信号肽延伸的轻链一致。
重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50263道尔顿、50426道尔顿和50588道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
21923道尔顿的非常小的峰，虽然它很可能由来源内(片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”导致该峰的消失。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50263道尔顿、
50426道尔顿和50588道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
21923道尔顿的非常小的峰，虽然它很可能由来源内片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”导致该峰的消失。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50245道尔顿、
50407道尔顿和50569道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
A-1242367.0 1718299 DLL4-E9-11hIgG1/L 3.00
A-1242368.0 1718300 DLL4-E9-17hIgG1/L 3.00
E9.1 IgG2 3.00
A-1242369.0 1718301 DLL4-E9-18hIgG1/L 4.00
A-1242370.0 1718302 DLL4-E9-48hIgG1/L 4.00
E9.1 IgG4 5.00
DLL4-E9-3hIgG/L 6.00
A-1242371.0 1718303 DLL4-E9-66hIgG1/L 8.00
A-1241120.0 1716682 DLL4-E9-16hIgG1/L 10.00
A-1242795.0 1718785 DLL4-E9-13hIgG1/L 10.00
A-1241121.0 1716683 DLL4-E9-38hIgG1/L 11.00
A-1242800.0 1718790 DLL4-E9-71hIgG1/L 11.00
A-1242794.0 1718784 DLL4-E9-4hIgG1/L 12.00
A-1242796.0 1718786 DLL4-E9-14hIgG1/L 12.00
A-1242798.0 1718788 DLL4-E9-22hIgG1/L 12.00
A-1242797.0 1718787 DLL4-E9-19hIgG1/L 14.00
阿达木单抗 14.00
E9-SE5 6.00
E9-SE7 7.00
E9-SE4 7.50
E9-SE8 7.50
E9-SE2 9.00
E9-SE3 9.00
E9-SE6 9.50
E9-SE1 10.00
(+)E9.1 9.00
(+)E9 10.50
阿达木单抗 13.00
E9-2B 8.00
E9-1F 8.00
E9 10
阿达木单抗 14
E9 64.45 72.12 80.04 54
E9-19 65.66 77 --- 56
E9-71 65.65 75.36 81.24 54
E9-2B 64.74 80.58 83.27 52.5
E9-1F 63.84 80.51 83.26 51.3
体的降解动力学显示在21天后在50℃单体百分比的约8％下降。
21天从每个动物收集纵向血清样品(每个时间点将5μl全血以1∶50稀释在HBS-EP+缓
冲液中)。使用DLL4-特异的Biacore平台测定血清浓度。简言之，人DLL4固定至感应器芯片并将样品以5μl/分钟持续5分钟注射经流动细胞，其具有测定的并与标志物比较而得到的结合水平。血清浓度时间概况用于评估药物动力学参数Cmax(峰值血清浓度)、CL(清除)和t1/2(抗体半衰期)，如表30所概括。对于E9和A10PROfusion抗体二者，在亲和力成熟方法处理中通过CDR-工程化，它们的药物动力学性质得到改进。
A10抗体的DLL4抑制导致体外内皮细胞出芽的增强(数据未显示)。
生长的作用。简言之，2x10 个细胞皮下接种至雌性SCID-Beige小鼠的右后侧。使肿瘤生
2
长14-18天以建立，在这一点使用电子卡尺测量来肿瘤体积。使用公式：L x W/2计算肿瘤大小。将小鼠分配到处理组(n＝10/组)以使每个组动物在治疗起始前具有相等的平均
3
肿瘤体积(通常180和250mm)。然后对动物腹膜内施用抗-DLL4抗体一周两次持续两周
(共4次剂量)。在实验过程中，平局一周两次测量肿瘤体积直到每组的平均肿瘤体积达到
3
≥2,000mm 的终点。结果显示于表31。对于PROfusion抗体的E9系列，改进的药物动力学的那些(如实施例9所示)倾向于具有更强的体内抗肿瘤活性。
3
对数级比较。基于终点为2000mm。
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