假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法
阅读：137发布：2020-05-14
专利汇可以提供假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 假 马 齿苋 总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法。本发明采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量。包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、采用AgelaPromsil C18，5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％ 磷酸 ，NaOH调pH＝3为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测 波长 ，洗脱45分钟同时实现五个皂苷成分的含量测定。有效地阐明分析了假马齿苋总皂苷提取物中的有效成分，建立了假马齿苋总皂苷提取物的有效成分 质量 标准，为假马齿苋总皂苷提取物的制备提供质量 稳定性 的保障，有较大的应用价值。，下面是假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法专利的具体信息内容。
1.假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
一、仪器与试药
(一)仪器
Agilent-1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KS5200H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；BP211D型电子天平，德国Sartorius；Milli-Q50SP纯水系统，美国Millipore公司；
(二)试剂
乙腈，色谱纯，Merck公司；磷酸，色谱纯，Tedia公司；超纯水自制由Milli-Q纯水机，Merk Millipore制得；其它试剂均为分析纯。
(三)供试品
供试品：假马齿苋总皂苷提取物
其中，Bacopaside I纯度95％，Chromadex，购自深圳虹彩祥根生物科技有限公司；
Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C由实验室自制，纯度95％：
二、HPLC-UV法测定假马齿苋总皂苷提取物主要成分
(一)溶液的配制
1、对照品溶液的制备
精密称取Bacopaside I 10.07mg，Bacoside A310.51mg，Bacopaside II 10.46mg，Bacopasaponin C isomer 10.47mg，Bacopasaponin C 10.43mg，用甲醇溶解，定容于25ml容量瓶，置于4℃冰箱内冷藏备用；
2、供试品溶液的制备
样品假马齿苋总皂苷提取物，实施例1制得，直接研磨成细粉，取粉末10.0mg，精密称定，加入适量甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，摇匀，离心，上清液过0.22μm滤膜即得；
(二)HPLC测定假马齿苋总皂苷提取物含量
采用AgelaPromsil C18，5μm，4.6mm×250mm色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％磷酸，NaOH调pH＝3为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟同时实现五个皂苷成分的含量测定。
2.根据权利要求1所述的假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤一(三)对照品通过下列方法制备：
假马齿苋总皂苷提取物，首先用硅胶柱分离，以氯仿-甲醇20∶1、10∶1、4∶1、3∶1、1∶1、0∶
1梯度洗脱得6个部位，将部位3、4、5合并，得粗品，粗品再用C18硅胶柱分离，甲醇-水1∶9、3∶
7依次洗脱，收集洗脱部位2，含有5个皂苷成分，再经制备型HPLC制备得到，所述制备柱规格：10×250mm，5μm；色谱条件：205nm，30％甲醇水等度洗脱，制得Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C；经MS、1H-NMR、13C-NMR测定，确认其化学结构。
3.根据权利要求1所述的假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤一(三)供试品：假马齿苋总皂苷提取物通过下列方法制得：取假马齿苋药材
5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩，-
0.6Bar压力、60℃至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为
0.311g·mL-1的上样液；取预处理完毕的HP-20大孔树脂，湿法装柱，径高比1∶10，柱体积
500mL，取上样液800mL，0.5kg药材/L树脂，用浓盐酸调至pH值为2.0，以0.5BV·h-1流速上样至完全，依次用2BV的30％乙醇pH 2.0、5BV的40％乙醇pH 2.0除杂，流速2.5BV/h，采用2 BV
15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5BV/h，再用5BV 60％乙醇洗脱，流速2.5BV/h，收集洗脱液，减压蒸干-0.6Bar压力，60℃得假马齿苋总皂苷提取物14lg。
4.根据权利要求1所述的假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤一(三)的HP-20大孔树脂用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗进行预处理。
假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药有效成分的测定方法，具体涉及假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法。
背景技术
[0002] 假马齿苋是玄参科植物假马齿苋Bacopamonnieri(L.)Wettst的全草，又名白花猪母菜。具有清热凉血，解毒消肿之功效。假马齿苋主要活性部位为其皂苷类有效成分，Bacopaside I等五个皂苷化合物，(达玛烷型三萜皂苷化合物Bacopaside I(BM28)，Bacoside A3(BM37)，Bacopaside II(BM29)，Bacopasaponin C isomer(BM35i)及Bacopasaponin C(BM35)，五个皂苷成分结构式如下：
[0003]
[0004]
[0005] 但是，对于上述有效成分的测定方法至今未有报道，为确保假马齿苋总皂苷提取物的质量稳定性，应建立相应的检测方法以及质量控制标准。高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、灵敏度高、重现性好、分析速度快等优点，在中药定量分析中已被广泛应用。因此，宜研究采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的方法。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的方法。
[0007] 本发明提供了假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法。
[0008] 本发明采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量。
[0009] 本发明方法包括下列步骤：
[0010] 一、仪器与试药
[0011] (一)仪器
[0012] Agilent-1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KS5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius)；Milli-Q50 SP纯水系统(美国Millipore公司)。
[0013] (二)试剂
[0014] 乙腈(色谱纯，Merck公司)；磷酸(色谱纯，Tedia公司)；超纯水自制由Milli-Q纯水机(Merk Millipore)制得；其它试剂均为分析纯。
[0015] (三)供试品及标准品
[0016] 取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(-0.6Bar压力，60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·mL-1的上样液。取预处理(用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗)完毕的HP-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500mL。取上样液800mL(0.5kg药材/L树脂)，用浓盐酸调至pH值为2.0，以0.5BV·h-1流速上样至完全，依次用2BV的30％乙醇(pH 2.0)、5BV的40％乙醇(pH 2.0)除杂，流速2.5BV/h，采用2BV 15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5BV/h，再用5BV 60％乙醇洗脱，流速2.5BV/h，收集洗脱液，减压蒸干(-0.6Bar压力，60℃)得假马齿苋总皂苷提取物141g，经HPLC检测，总皂苷的纯度为55.67％，总皂苷转移率为
78.29％。
78.29％。
[0017] 对照品Bacopaside I(纯度95％)，Chromadex，购自深圳虹彩祥根生物科技有限公司)，Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C由实验室自制(纯度95％)：上述制得的假马齿苋总皂苷提取物，首先用硅胶柱分离，以氯仿-甲醇20∶1、10∶1、4∶1、3∶1、1∶1、0∶1梯度洗脱得6个部位，将部位3、4、5合并，得粗品，粗品再用C18硅胶柱分离，甲醇-水1∶9、3∶7依次洗脱，收集洗脱部位2(含有5个皂苷成分)，再经制备型HPLC制备得到(制备柱规格：10×250mm，5μm；色谱条件：205nm，30％甲醇水等度洗脱)。制得的产品是Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C
[0018] 经MS、1H-NMR、13C-NMR测定，确认其化学结构，具体波谱数据参数如下：
[0019] Bacoside A3
[0020] 白色针晶，mp：250-252℃(CH3OH/H2O)，ESI-MS m/z：951[M+Na]+；1H-NMR(Py-d5)H-3(δH 3.27，1H，dd，J＝4.0，12.0Hz)，H-13(δH 2.82，1H，m)，H-18(δH 1.07，3H，s)，H-19(δH
0.68，3H，s)，H-21(δH 1.38，3H，s)，H-23(δH 5.20，1H，m)，H-24(δH 5.52，1H，d，J＝8.0Hz)，H-26(δH 1.69，3H，s)，H-27(δH 1.67，3H，s)，H-28(δH 1.28，3H，s)，H-29(δH 1.06，3H，s)。
13C-NMR(Py-d5)δc：38.4(C-1)，26.4(C-2)，88.8(C-3)，39.4(C-4)，55.9(C-5)，18.0(C-6)，
35.7(C-7)，37.2(C-8)，52.7(C-9)，36.9(C-10)，21.4(C-11)，28.2(C-12)，36.8(C-13)，
53.4(C-14)，36.5(C-15)，110.2(C-16)，53.7(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，68.2(C-
20)，29.7(C-21)，45.1(C-22)，68.3(C-23)，126.8(C-24)，133.8(C-25)，25.2(C-26)，18.2(C-27)，27.5(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Glu：104.8(C-1)，78.8(C-2)，88.4(C-
3)，70.0(C-4)，77.6(C-5)，62.4(C-6)；Ara(f)：109.6(C-1)，83.4(C-2)，77.4(C-3)，84.7(C-4)，61.8(C-5)；Glu：104.4(C-1)，75.1(C-2)，78.1(C-3)，71.3(C-4)，78.2(C-5)，62.1(C-6)。
0.68，3H，s)，H-21(δH 1.38，3H，s)，H-23(δH 5.20，1H，m)，H-24(δH 5.52，1H，d，J＝8.0Hz)，H-26(δH 1.69，3H，s)，H-27(δH 1.67，3H，s)，H-28(δH 1.28，3H，s)，H-29(δH 1.06，3H，s)。
13C-NMR(Py-d5)δc：38.4(C-1)，26.4(C-2)，88.8(C-3)，39.4(C-4)，55.9(C-5)，18.0(C-6)，
35.7(C-7)，37.2(C-8)，52.7(C-9)，36.9(C-10)，21.4(C-11)，28.2(C-12)，36.8(C-13)，
53.4(C-14)，36.5(C-15)，110.2(C-16)，53.7(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，68.2(C-
20)，29.7(C-21)，45.1(C-22)，68.3(C-23)，126.8(C-24)，133.8(C-25)，25.2(C-26)，18.2(C-27)，27.5(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Glu：104.8(C-1)，78.8(C-2)，88.4(C-
3)，70.0(C-4)，77.6(C-5)，62.4(C-6)；Ara(f)：109.6(C-1)，83.4(C-2)，77.4(C-3)，84.7(C-4)，61.8(C-5)；Glu：104.4(C-1)，75.1(C-2)，78.1(C-3)，71.3(C-4)，78.2(C-5)，62.1(C-6)。
[0021] Bacopaside II
[0022] 白色针晶，mp：249-251℃(CH3OH/H2O)，ESI-MS m/z：951[M+Na]+；1H-NMR(Py-d5)H-3(δH 3.28，1H，dd，J＝4.0，11.0Hz)，H-13(δH 2.83，1H，m)，H-18(δH 1.08，3H，s)，H-22(δH
2.60，1H，d，J＝8.0Hz)，H-23a(δH 3.88，1H，dd，J＝2.0，10.0Hz)，H-23b(δH 4.72，1H，dd，J＝2.0，10.0Hz)，H-24(δH 5.85，1H，d，J＝11.0Hz)，H-26(δH 1.69，3H，s)，H-27(δH 1.61，
3H，s)，H-28(δH 1.28，3H，s)，H-29(δH 1.04，3H，s)。13C-NMR(Py-d5)δc：38.1(C-1)，26.3(C-
2)，88.8(C-3)，39.4(C-4)，55.8(C-5)，17.9(C-6)，35.7(C-7)，37.1(C-8)，52.6(C-9)，36.8(C-10)，21.3(C-11)，28.2(C-12)，36.7(C-13)，53.1(C-14)，36.6(C-15)，109.9(C-16)，
50.9(C-17)，18.4(C-18)，15.9(C-19)，71.5(C-20)，26.8(C-21)，45.9(C-22)，65.7(C-23)，
123.8(C-24)，132.5(C-25)，25.7(C-26)，18.1(C-27)，27.4(C-28)，16.2(C-29)，65.6(C-
30)；3-O-Glu：104.8(C-1)，78.7(C-2)，88.4(C-3)，70.0(C-4)，77.6(C-5)，62.4(C-6)；Ara(f)：109.6(C-1)，83.4(C-2)，77.4(C-3)，84.6(C-4)，61.8(C-5)；Glu：104.4(C-1)，75.1(C-
2)，78.1(C-3)，71.3(C-4)，78.2(C-5)，62.0(C-6)。
2.60，1H，d，J＝8.0Hz)，H-23a(δH 3.88，1H，dd，J＝2.0，10.0Hz)，H-23b(δH 4.72，1H，dd，J＝2.0，10.0Hz)，H-24(δH 5.85，1H，d，J＝11.0Hz)，H-26(δH 1.69，3H，s)，H-27(δH 1.61，
3H，s)，H-28(δH 1.28，3H，s)，H-29(δH 1.04，3H，s)。13C-NMR(Py-d5)δc：38.1(C-1)，26.3(C-
2)，88.8(C-3)，39.4(C-4)，55.8(C-5)，17.9(C-6)，35.7(C-7)，37.1(C-8)，52.6(C-9)，36.8(C-10)，21.3(C-11)，28.2(C-12)，36.7(C-13)，53.1(C-14)，36.6(C-15)，109.9(C-16)，
50.9(C-17)，18.4(C-18)，15.9(C-19)，71.5(C-20)，26.8(C-21)，45.9(C-22)，65.7(C-23)，
123.8(C-24)，132.5(C-25)，25.7(C-26)，18.1(C-27)，27.4(C-28)，16.2(C-29)，65.6(C-
30)；3-O-Glu：104.8(C-1)，78.7(C-2)，88.4(C-3)，70.0(C-4)，77.6(C-5)，62.4(C-6)；Ara(f)：109.6(C-1)，83.4(C-2)，77.4(C-3)，84.6(C-4)，61.8(C-5)；Glu：104.4(C-1)，75.1(C-
2)，78.1(C-3)，71.3(C-4)，78.2(C-5)，62.0(C-6)。
[0023] Bacopasaponin C isomer
[0024] 白色针晶，mp：250-252℃(CH3OH/H2O)，ESI-MS m/z：921[M+Na]+；1H-NMR(Py-d5)H-3(δH 3.23，1H，dd，J＝4.0，12.0Hz)，H-13(δH 2.81，1H，m)，H-18(δH 1.06，3H，s)，H-19(δH
0.69，3H，s)，H-21(δH 1.37，3H，s)，H-22a(δH 1.65，1H，dd，J＝2.0，14.0Hz)，H-22b(δH
1.74，1H，dd，J＝2.0，14.0Hz)，H-23(δH 5.21，1H，m)，H-24(δH 5.52，1H，d，J＝8.0Hz)，H-26
13
(δH 1.68，3H，s)，H-27(δH 1.66，3H，s)，H-28(δH 1.27，3H，s)，H-29(δH 1.05，3H，s)。C-NMR(Py-d5)δc：38.4(C-1)，26.4(C-2)，88.3(C-3)，39.5(C-4)，55.8(C-5)，17.9(C-6)，35.7(C-7)，37.2(C-8)，52.7(C-9)，36.9(C-10)，21.4(C-11)，28.2(C-12)，36.8(C-13)，53.4(C-
14)，36.5(C-15)，110.2(C-16)，53.6(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，68.1(C-20)，29.7(C-21)，45.1(C-22)，68.3(C-23)，126.8(C-24)，133.7(C-25)，25.2(C-26)，17.9(C-27)，
27.4(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Ara：105.3(C-1)，76.7(C-2)，83.2(C-3)，68.2(C-4)，65.4(C-5)；Ara(f)：110.0(C-1)，83.5(C-2)，77.8(C-3)，84.6(C-4)，61.7(C-5)；
Glu：104.6(C-1)，74.9(C-2)，77.6(C-3)，71.2(C-4)，78.1(C-5)，62.2(C-6)。
0.69，3H，s)，H-21(δH 1.37，3H，s)，H-22a(δH 1.65，1H，dd，J＝2.0，14.0Hz)，H-22b(δH
1.74，1H，dd，J＝2.0，14.0Hz)，H-23(δH 5.21，1H，m)，H-24(δH 5.52，1H，d，J＝8.0Hz)，H-26
13
(δH 1.68，3H，s)，H-27(δH 1.66，3H，s)，H-28(δH 1.27，3H，s)，H-29(δH 1.05，3H，s)。C-NMR(Py-d5)δc：38.4(C-1)，26.4(C-2)，88.3(C-3)，39.5(C-4)，55.8(C-5)，17.9(C-6)，35.7(C-7)，37.2(C-8)，52.7(C-9)，36.9(C-10)，21.4(C-11)，28.2(C-12)，36.8(C-13)，53.4(C-
14)，36.5(C-15)，110.2(C-16)，53.6(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，68.1(C-20)，29.7(C-21)，45.1(C-22)，68.3(C-23)，126.8(C-24)，133.7(C-25)，25.2(C-26)，17.9(C-27)，
27.4(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Ara：105.3(C-1)，76.7(C-2)，83.2(C-3)，68.2(C-4)，65.4(C-5)；Ara(f)：110.0(C-1)，83.5(C-2)，77.8(C-3)，84.6(C-4)，61.7(C-5)；
Glu：104.6(C-1)，74.9(C-2)，77.6(C-3)，71.2(C-4)，78.1(C-5)，62.2(C-6)。
[0025] Bacopasaponin C
[0026] 白色针晶，mp：222-223℃(CH3OH/H2O)，ESI-MS m/z：921[M+Na]+；1H-NMR(Py-d5)H-3(δH 3.27，1H，dd，J＝4.0，12.0Hz)，H-13(δH 2.83，1H，m)，H-18(δH 1.09，3H，s)，H-19(δH
0.75，3H，s)，H-21(δH 1.38，3H，s)，H-22(δH 2.62，1H，d，J＝10.0Hz)，H-23a(δH 3.87，1H，dd，J＝2.0，11.0Hz)，H-23b(δH 4.69，1H，dd，J＝2.0，11.0Hz)，H-24(δH 5.84，1H，d，J＝
10.0Hz)，H-26(δH 1.71，3H，s)，H-27(δH 1.63，3H，s)，H-28(δH 1.29，3H，s)，H-29(δH
1.07，3H，s)，H-30a(δH 4.29，1H，d，J＝7.0Hz)，H-30b(δH 4.16，1H，d，J＝7.0Hz)。13C-NMR(Py-d5)δc：38.5(C-1)，26.4(C-2)，88.3(C-3)，39.5(C-4)，56.0(C-5)，18.0(C-6)，35.8(C-
7)，37.2(C-8)，52.8(C-9)，37.0(C-10)，21.4(C-11)，28.3(C-12)，36.8(C-13)，53.2(C-
14)，36.6(C-15)，109.9(C-16)，51.0(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，71.5(C-20)，26.8(C-21)，46.0(C-22)，65.8(C-23)，123.8(C-24)，132.5(C-25)，25.6(C-26)，18.1(C-27)，
27.6(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Ara：105.3(C-1)，76.6(C-2)，83.1(C-3)，68.1(C-4)，65.3(C-5)；Ara(f)：110.1(C-1)，83.4(C-2)，77.8(C-3)，84.8(C-4)，61.9(C-5)；
Glu：104.6(C-1)，74.9(C-2)，77.8(C-3)，71.3(C-4)，78.1(C-5)，62.4(C-6)。
0.75，3H，s)，H-21(δH 1.38，3H，s)，H-22(δH 2.62，1H，d，J＝10.0Hz)，H-23a(δH 3.87，1H，dd，J＝2.0，11.0Hz)，H-23b(δH 4.69，1H，dd，J＝2.0，11.0Hz)，H-24(δH 5.84，1H，d，J＝
10.0Hz)，H-26(δH 1.71，3H，s)，H-27(δH 1.63，3H，s)，H-28(δH 1.29，3H，s)，H-29(δH
1.07，3H，s)，H-30a(δH 4.29，1H，d，J＝7.0Hz)，H-30b(δH 4.16，1H，d，J＝7.0Hz)。13C-NMR(Py-d5)δc：38.5(C-1)，26.4(C-2)，88.3(C-3)，39.5(C-4)，56.0(C-5)，18.0(C-6)，35.8(C-
7)，37.2(C-8)，52.8(C-9)，37.0(C-10)，21.4(C-11)，28.3(C-12)，36.8(C-13)，53.2(C-
14)，36.6(C-15)，109.9(C-16)，51.0(C-17)，18.5(C-18)，16.0(C-19)，71.5(C-20)，26.8(C-21)，46.0(C-22)，65.8(C-23)，123.8(C-24)，132.5(C-25)，25.6(C-26)，18.1(C-27)，
27.6(C-28)，16.2(C-29)，65.5(C-30)；3-O-Ara：105.3(C-1)，76.6(C-2)，83.1(C-3)，68.1(C-4)，65.3(C-5)；Ara(f)：110.1(C-1)，83.4(C-2)，77.8(C-3)，84.8(C-4)，61.9(C-5)；
Glu：104.6(C-1)，74.9(C-2)，77.8(C-3)，71.3(C-4)，78.1(C-5)，62.4(C-6)。
[0027] 二、HPLC-UV法测定假马齿苋总皂苷提取物主要成分
[0028] (一)溶液的配制
[0029] 1、对照品溶液的制备
[0030] 精密称取Bacopaside I 10.07mg，Bacoside A310.51mg，Bacopaside II 10.46mg，Bacopasaponin C isomer 10.47mg，Bacopasaponin C 10.43mg。用甲醇溶解，定容于25ml容量瓶，置于4℃冰箱内冷藏备用。
[0031] 2、供试品溶液的制备
[0033] (二)HPLC测定假马齿苋总皂苷提取物含量
[0034] 采用AgelaPromsil C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％磷酸(NaOH调pH＝3)为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟同时实现五个皂苷成分的含量测定。
[0035] 本发明提供的假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法，有效地阐明分析了假马齿苋总皂苷提取物中的有效成分情况，为假马齿苋总皂苷提取物制备药物提供基础。并且由此建立起假马齿苋总皂苷提取物的有效成分质量标准，为假马齿苋总皂苷提取物的制备提供质量稳定性的保障，有较大的应用价值。附图说明
[0036] 图1实施例1总皂苷Agela Promosil-C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱分析图谱
[0037] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0038] 图2实施例1总皂苷SHISEIDO MP C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱分析图谱
[0039] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0040] 图3实施例1总皂苷Agilent(5μm，4.6×150mm)色谱柱分析图谱
[0041] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0042] 图4实施例1总皂苷甲醇-水为流动相梯度洗脱色谱图
[0043] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0044] 图5实施例1总皂苷乙腈-0.05％磷酸为流动相梯度洗脱色谱图
[0045] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0046] 图6实施例1总皂苷乙腈-0.2％磷酸(pH＝3)为流动相等度洗脱色谱图
[0047] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0048] 图7实施例1总皂苷最佳色谱条件下液相图谱
[0049] (1：Bacopaside I；2：Bacoside A3；3：Bacopaside II；4：Bacopasaponin C isomer；5：Bacopasaponin C)
[0050] 图8 Bacopaside I的标准曲线图.横坐标代表Bacopaside I浓度(μg/ml)，纵坐标代表峰面积
[0051] 图9 Bacoside A3的标准曲线图。横坐标代表Bacoside A3浓度(μg/ml)，纵坐标代表峰面积
[0052] 图10 Bacopaside II的标准曲线图.横坐标代表Bacopaside II浓度(μg/ml)，纵坐标代表峰面积
[0053] 图11 Bacopasaponin C isomer的标准曲线图.横坐标代表Bacopasaponin C isomer浓度(μg/ml)，纵坐标代表峰面积
[0054] 图12 Bacopasaponin C的标准曲线图.横坐标代表Bacopasaponin C浓度(μg/ml)，纵坐标代表峰面积
具体实施方式
[0055] 实施例1
[0056] 假马齿苋总皂苷提取物制备
[0057] 取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(-0.6Bar压力，60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，-1抽滤，制成药材含量为0.311g·mL 的上样液。取预处理(用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗)完毕的HP-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500mL。取上样液800mL(0.5kg药材/L树脂)，用浓盐酸调至pH值为2.0，以0.5BV·h-1流速上样至完全，依次用2BV的30％乙醇(pH 2.0)、5BV的40％乙醇(pH 2.0)除杂，流速2.5BV/h，采用2BV 15％乙醇，冲洗除酸，流速
2.5BV/h，再用5BV 60％乙醇洗脱，流速2.5BV/h，收集洗脱液，减压蒸干(-0.6Bar压力，60℃)得假马齿苋总皂苷提取物141g，经HPLC检测，总皂苷的纯度为55.67％，总皂苷转移率为
78.29％。
2.5BV/h，再用5BV 60％乙醇洗脱，流速2.5BV/h，收集洗脱液，减压蒸干(-0.6Bar压力，60℃)得假马齿苋总皂苷提取物141g，经HPLC检测，总皂苷的纯度为55.67％，总皂苷转移率为
78.29％。
[0058] 实施例2
[0059] 实施例2a
[0060] 实施例1制得的假马齿苋总皂苷提取物采用AgelaPromsil C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％0.2％磷酸水(NaOH调pH＝3)为流动相，1ml/min流速，
30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。测得假马齿苋总皂苷提取物总皂苷的纯度为
55.67％，总皂苷转移率为78.29％。
30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。测得假马齿苋总皂苷提取物总皂苷的纯度为
55.67％，总皂苷转移率为78.29％。
[0061] 实施例2b
[0062] 实施例1制得的假马齿苋总皂苷提取物采用资生堂Capcell-C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％0.2％磷酸水(NaOH调pH＝3)为流动相，1ml/min流速，
30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。测得假马齿苋总皂苷提取物总皂苷的纯度为
55.62％，总皂苷转移率为77.97％。
30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。测得假马齿苋总皂苷提取物总皂苷的纯度为
55.62％，总皂苷转移率为77.97％。
[0063] 实施例2c
[0064] 实施例1制得的假马齿苋总皂苷提取物采用 SymmetryShield RP18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以31.5％乙腈/68.5％0.2％磷酸水(NaOH调pH＝3)为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。测得假马齿苋总皂苷提取物总皂苷的纯度为55.19％，总皂苷转移率为78.12％。
[0065] 实施例3
[0066] 本发明假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量测定方法的研究设计试验
[0067] (一)方法建立
[0068] 1、色谱柱的考察
[0069] (1)选用Agela Promosil-C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱：Bacopaside I出峰时间约为21分钟，5个化合物分离度较好，见图1；
[0070] (2)选用SHISEIDO MP C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱：Bacopaside I出峰时间约为27分钟，且Bacopaside I与Bacoside A3峰重叠较多，分离度较差，见图2；
[0071] (3)选用Agilent(5μm，4.6×150mm)色谱柱：Bacopaside I出峰时间约为10min，分离度良好；但是Bacoside A3，Bacopaside II分离度较差，见图3；
[0072] 综合对比不同品牌、型号的色谱柱，初步判断选择色谱柱长度为25cm时分离效果更好，且为保证更好的分离度，故研究中选用Agela Promosil-C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱进行样品测定。
[0073] 2、流动相的考察
[0074] (1)选用流动相比例(表1)为：
[0075] 表1 流动相选择1
[0076]
[0077] Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C分离较好，但是Bacopaside I未出峰，见图4；
[0078] (2)选用流动相比例为：
[0079] 表2 流动相选择2
[0080]
[0081] Bacopaside I出峰时间约为21min；但是Bacopaside I，Bacoside A3，Bacopaside II三个峰未得到完全分离，见图5。
[0082] (3)选用流动相比例为：乙腈-0.2％磷酸(32.5∶67.5)(NaOH调pH＝3)。Bacopaside I出峰时间约为21min；且各峰出峰时间、峰形、分离度为最佳，见图6，故选取此流动相。
[0083] 实验中还考察了流动相不变的情况下，只改变有机相比例的出峰情况。乙腈比例为35％时，出峰时间变短，但是Bacoside A3与Bacopaside II有一部分重叠未分开；而乙腈采用30％时，各峰得到较好分离，但此时分析时间过长，所以还是采用32.5％乙腈进行HPLC分析。
[0084] 流速考察了0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min和1.2ml/min五种不同流速下液相分析情况。0.8ml/min、0.9ml/min分析时间过长，而流速为1.1ml/min或1.2ml/min时，Bacoside A3、Bacopaside II分离度小于1.5。所以选择流速1.0ml/min进行HPLC分析。
[0085] 温度考察了25℃、30℃和35℃三种不同柱温下液相分析情况。35℃分析时Bacopaside I拖尾因子较大，而柱温为25℃时，Bacoside A3、Bacopaside II分离度小于
1.5。所以选择柱温30℃进行HPLC分析。
1.5。所以选择柱温30℃进行HPLC分析。
[0086] 综上所述，确立了HPLC法测定假马齿苋总皂苷提取物中五个主要皂苷成分含量方法，即：
[0087] 流动相：32.5％乙腈：67.5％磷酸(NaOH调pH＝3)
[0088] 色谱柱：AgelaPromsil C18(5μm，4.6mm×250mm)
[0089] 流速：1ml/min
[0090] 检测波长：205nm
[0091] 柱温：30℃
[0092] 进样体积：10μl
[0093] 洗脱时间：45min
[0094] 表3 最佳色谱条件下化合物保留时间、塔板数和分离度
[0095]
[0096]
[0097] 图7最佳色谱条件下液相图谱
[0098] (二)方法学考察
[0099] 1、线性关系
[0100] 取适量各皂苷对照品溶液混合，稀释成一系列不同浓度，按上述条件进样，测定。以对照品浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。经线性回归后得线性方程：y＝ax+b，其中y为峰面积，x为浓度，a为斜率，b为截距。各对照品的检测限LOD按信噪比的3倍来计算，定量限LOQ按信噪比的10倍来计算，结果见表4-表8，图8-图12。实验结果表明，各化合物在考察浓度范围内线性关系良好，方法灵敏度高，可用其于定量分析。
[0101] 表4 Bacopaside I的线性关系及定量限、检测限
[0102]
[0103] 图8Bacopaside I的标准曲线图
[0104] 表5 Bacoside A3的线性关系及定量限、检测限
[0105]
[0106] 图9Bacoside A3的标准曲线图
[0107] 表6 Bacopaside II的线性关系及定量限、检测限
[0108]
[0109] 图10Bacopaside II的标准曲线图
[0110] 表7 Bacopasaponin C isomer的线性关系及定量限、检测限
[0111]
[0112] 图11Bacopasaponin C isomer的标准曲线图
[0113] 表8 Bacopasaponin C的线性关系及定量限、检测限
[0114]
[0115] 图12Bacopasaponin C的标准曲线图
[0116] 2、精密度考察
[0117] 取同一混和标准品溶液，连续进样6次，测定精密度，记录各色谱峰的峰面积，计算其RSD值。结果见表9。
[0118] 结果表明其测定含量均无显著变化，表明检测方法稳定可靠，满足待测样品的要求。
[0119] 表9 五个化合物的精密度试验结果(n＝6)
[0120]
[0121] 2.3.3重复性考察
[0122] 分别称取同一批次假马齿苋总皂苷提取物6份，按“供试品的制备”方法制备，并在上述色谱条件和检测方法下测定，计算各待测化合物的含量和RSD值。结果见表10。结果表明该方法制备供试品溶液重复性良好，满足制备样品的要求。
[0123] 表10 重复性试验结果(n＝6)(以百分含量计，％)
[0124]
[0125] 2.3.4稳定性考察
[0126] 称取同一批次假马齿苋总皂苷提取物1份，按“供试品的制备”方法制备，在相应时间点采用上述色谱条件和检测方法测定，计算各待测化合物的含量和RSD值。结果见表11。结果表明该方法制备供试品溶液在24小时内稳定性良好。
[0127] 表11 稳定性试验结果(n＝6)(以百分含量计，％)
[0128]
[0129] 2.3.5加样回收率
[0130] 取同一批已知各组分含量的假马齿苋总皂苷提取物适量，精密称定，适量加入对照品(n＝6)，混合均匀，采用上述方法制备供试品溶液，在上述液相色谱条件下进行测定，记录各色谱峰的峰面积，计算回收率，结果见2-12～2-16。结果表明供试品溶液中各化合物回收率符合要求。
[0131] 加样回收率(％)＝[(C-A)/B]×100％
[0132] 式中A为样品中被测成分含量，B为对照品加入量，C为测得总量。
[0133] 表2-12 Bacopaside I加样回收试验结果(n＝6)
[0134]
[0135] 表2-13 Bacoside A3加样回收试验结果(n＝6)
[0136]
[0137] 表2-14 Bacopaside II加样回收试验结果(n＝6)
[0138]
[0139] 表2-15 Bacopasaponin C isomer加样回收试验结果(n＝6)
[0140]
[0141] 表2-16 Bacopasaponin C加样回收试验结果(n＝6)
[0142]
[0143] 三、HPLC测定假马齿苋总皂苷提取物含量
[0144] 前期提取纯化了19批假马齿苋总皂苷提取物，分别精密称取19个批次的假马齿苋总皂苷提取物样品，按照“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，按照上述的色谱条件和检测方法，对5个目标成分进行含量测定，计算各目标成分的含量，结果见表2-17。
[0145] 抗抑郁抗老年痴呆药效学研究采用其中五个皂苷含量总量为59.57％的16号皂苷提取物进行。
[0146] 表2-17 HPLC法测定19批假马齿苋总皂苷提取物的主要成分含量
[0147]
[0148] 四、小结
[0149] 通过对HPLC测定假马齿苋总皂苷提取物中五个主要皂苷成分的方法在色谱柱、流动相、柱温、流速等方面进行考察，优化后建立的色谱条件为：采用AgelaPromsil C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％0.2％磷酸水(NaOH调pH＝3)为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟。对优化的色谱条件进行方法学考察，结果表明该方法可以同时实现五个皂苷成分的含量测定，且线性、精密度、重复性、稳定性良好，加样回收率在98％-102％之间，RSD＜4％，故制定此液相检测方法为假马齿苋总皂苷的含量测定标准。
[0150] 通过上述色谱条件对本发明人制备的19批假马齿苋总皂苷提取物进行了含量测定。
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