[0001] 本
申请要求2014年10月1日提交的美国临时
专利申请序列号62/058,535和2015年6月30日提交的美国临时专利申请序列号62/186,527的优先权权益，每个美国临时专利申请据此通过引用整体并入。
发明领域
[0002] 本发明涉及具有破坏的过敏反应盒的新型激发子肽及其用于诱导
植物主动应答的用途，所述植物主动应答尤其包括生长增强、抗病性、
害虫或昆虫抗性和胁迫抗性。
[0003] 发明背景
[0004] 对harpin蛋白的鉴定和分离源于在康奈尔大学试图了解植物病原菌与植物如何相互作用的
基础研究。第一道防线是过敏反应(HR)，即感染部位的局部植物细胞死亡。细胞死亡对病原体的移动造成物理障碍并且在一些植物中，死细胞可以释放对入侵病原体有毒的化合物。研究表明，病原菌可能具有负责触发HR的单一因子。康奈尔研究的基本目标是鉴定负责激发HR的特定细菌
蛋白质。已知靶蛋白由一类称为过敏反应和致病性(hrp)基因簇的细菌基因之一编码。剖析了在梨树和苹果树中引起火疫病的细菌梨火疫病菌(Erwinia amylovora，Ea)中的hrp簇，并且鉴定出在某些植物中激发HR的单一蛋白质。该蛋白质被命名为harpin(及后来称为harpin Ea)并将相应的基因命名为hrpN。这是从所有细菌种类鉴定的此类蛋白质和基因的第一个实例。
[0005] 已经从欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和泛菌属(Pantoea)的种等鉴定了许多不同的harpin蛋白。在一级
氨基酸序列
水平上不同的harpin蛋白共有常见的
生物化学和生物物理学特征以及生物功能。基于其独特的性质，文献中将harpin蛋白视为属于单独的一类蛋白质。
[0006] 在其鉴定和分离之后，之后发现harpin可以在植物中激发抗病性并增加植物生长。一个重要的早期发现是，施用纯化的harpin蛋白使得植物对后续病原体攻击有抗性，并且在植物上的
位置远离
注射部位。这意味着harpin蛋白可以触发系统获得性抗性(SAR)，这是一种提供对多种病毒、细菌和
真菌病原体的抗性的植物防御机制。
[0007] 在作物保护中，始终需要改善植物健康的组合物。期望更健康的植物，因为它们产生更好的产量和/或更好的植物或作物品质。更健康的植物也更好地抵御生物和
非生物胁迫。对生物胁迫的高抗性又使种植者减少施用的
农药量，并从而减缓对各种农药的抗性的发展。
[0008] Harpinαβ是源自几种不同harpin的融合蛋白。已经证实Harpinαβ会阻遏
线虫卵产生，增强植物的生长、
质量和产量，并增加植物的活
力。在美国申请公布第2010/0043095号中详细描述了其氨基酸和核苷酸序列。
[0009] 迄今为止，harpin和harpinαβ生产及其在农业和
园艺应用中的使用一直是涂在
淀粉上的粉末状固体。这限制了harpin蛋白的使用和通用性，因为粉末状harpin蛋白在水中的液体悬浮液在发生显著降解和活性丧失之前有效使用寿命只有48-72小时。harpin溶液的另一个问题是蛋白质溶解性和
稳定性。
[0010] 将期望鉴定易溶于水溶液、稳定、抗化学降解且有效地诱导植物主动应答的合成和衍生的harpin肽，所述植物主动应答尤其包括植物生长和生产增强、以及对非生物和生物胁迫的抗性。
[0011] 本发明旨在克服本领域中的这些和其它限制。发明概要
[0012] 本发明的第一个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0013] J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J(SEQ ID NO:1)其中
[0014] 所述肽不含半胱氨酸和甲硫氨酸；
[0015] 位置2、3、7、8、12和13处的每个X是任选的，并且当存在时，为任何氨基酸；
[0016] 位置4、9和14处的每个X为任何氨基酸；
[0017] 位置1、5、6、10、11、15和16处的1至3个J残基为非疏水性氨基酸或A，并且所有其它J残基是L、I、V或F，且所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0018] 本发明的第二个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0019] XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX(SEQ ID NO:2，修饰的P1/P4共有)，其中
[0020] 位置1处的X是任选的并且可为S、N、D、isoD、G、A或S；
[0021] 位置2处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0022] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0023] 位置9处的X为M、L、I、F或V，或非疏水性氨基酸；
[0024] 位置10处的X是任选的并且可为D或isoD；
[0025] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0026] 位置12处的X为M、L、I或F，或非疏水性氨基酸；
[0027] 位置13处的X为M、L或I，或非疏水性氨基酸；
[0028] 位置14处的X是任选的并且可为任何亲水性氨基酸，优选S、T、D、isoD、K或Q，且任选A或C；
[0029] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、K或I；
[0030] 位置16处的X为M、L、I、V或F，或非疏水性氨基酸；
[0031] 位置17处的X为M、L、I、A或V，或非疏水性氨基酸；
[0032] 位置18处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、M、T或K；
[0033] 位置19处的X为A、D、isoD、S、V、T、K、R、E、H或G；
[0034] 位置20处的X为M、L或I；
[0035] 位置21处的X为M、L、I、V、S或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0036] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S；
[0037] 位置23处的X为P、Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0038] 其中位置9、12、13、16、17和20处的残基中的至少一个是非疏水性氨基酸，或位置21处的残基是除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；且其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0039] 本发明的第三个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0040] SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP(SEQ ID NO:3，修饰的P4共有)，其中
[0041] 位置2处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0042] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0043] 位置9处的X为M、S、L、A、I、V或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0044] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0045] 位置12处的X为L、I或F，或非疏水性氨基酸；
[0046] 位置13处的X为L、A、I、V或F，或非疏水性氨基酸；
[0047] 位置14处的X为任何亲水性氨基酸；
[0048] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、K或I；
[0049] 位置16处的X为L、A、I、V、M或F，或非疏水性氨基酸；
[0050] 位置17处的X为M、I、S或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0051] 位置18处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0052] 位置20处的X为M、L、I、V或F，或非疏水性氨基酸；
[0053] 位置21处的X为M、L或F，或非疏水性氨基酸；并且
[0054] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S，
[0055] 其中位置9、12、13、16、20和21处的残基中的一个为非疏水性氨基酸或A，或位置17处的残基是除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；且其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0056] 本发明的第四个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0057] XXGISEKXJDXJJTXJJXAJJXX(SEQ ID NO:4，修饰的P1共有)，其中
[0058] 位置1处的X为N、D、isoD、G、A或S；
[0059] 位置2处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0060] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0061] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0062] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0063] 位置18处的X为M、T、K、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0064] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0065] 位置23处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0066] 位置9、12、13、16、17、20和21处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0067] 本发明的第五个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0068] (i)KPXDSXSXJAKJJSXJJXSJJX(SEQ ID NO:5，修饰的P15b/P20共有)，其中[0069] 位置3处的X为N、D或isoD；
[0070] 位置6处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0071] 位置8处的X为N、D或isoD；
[0072] 位置15处的X是任选的并且可为任何氨基酸；
[0073] 位置18处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0074] 位置22处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0075] 位置9、12、13、16、17、20和21处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；
[0076] 或
[0077] (ii)JAKJJSXJJXSJJX(SEQ ID NO:6，修饰的P15/20min共有)，其中
[0078] 位置7处的X是任选的并且可为任何氨基酸；
[0079] 位置10处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0080] 位置14处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0081] 位置1、4、5、8、9、12和13处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；并且
[0082] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0083] 本发明的第六个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0084] PSPJTXJJXXJJGXJJXAXN(SEQ ID NO:7，修饰的P6/6a共有)，其中
[0085] 位置6处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0086] 位置9处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0087] 位置10处的X为H或N；
[0088] 位置14处的X为E、g-谷氨酸、D或isoD；
[0089] 位置17处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0090] 位置19处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0091] 位置4、7、8、11、12、15和16处的J是选自L、V、I、M和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0092] 本发明的第七个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0093] (i)XXXXXXJXXJJXXJJXJJK(SEQ ID NO:8，修饰的P14d共有)，其中
[0094] 位置1处的X可为：Q、N、D、E、g-谷氨酸、isoD或S；
[0095] 位置2处的X可为：D、E、g-谷氨酸、isoD；
[0096] 位置3处的X可为：P、D、E、isoD或g-谷氨酸；
[0097] 位置4处的X可为M、A、S、D、E、isoD或g-谷氨酸
[0098] 位置5处的X可为Q、E或g-谷氨酸；
[0099] 位置6处的X可为A、E或g-谷氨酸；
[0100] 位置8处的X可为M、L、E、Q、D、N、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0101] 位置9处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0102] 位置12处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0103] 位置13处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0104] 位置16处的X可为K、Q、N、E、D、R、G、A或S；并且
[0105] 位置7、10、11、14、15、17和18处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；或
[0106] (ii)JXXJJXXJJXJJK(SEQ ID NO:9，修饰的P14d min共有)，其中
[0107] 位置2处的X可为M、L、E、Q、D、N、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0108] 位置3处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0109] 位置6处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0110] 位置7处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0111] 位置10处的X可为K、Q、N、E、D、R、G、A或S；并且
[0112] 位置1、4、5、8、9、11和12处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0113] 本发明的第八个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0114] (i)JXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:10，修饰的P25共有)其中
[0115] 位置2处的X可为Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0116] 位置3处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0117] 位置6处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0118] 位置9处的X可为E、g-谷氨酸、D、isoD、Q、N、T、S、A或G；
[0119] 位置10处的X可为A、G、S、T、E、g-谷氨酸、D、isoD、Q或N；并且
[0120] 位置1、4、5、7、8、10和11处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；或
[0121] (ii)JXXJJXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:11，修饰的P25共有)其中
[0122] 位置2处的X可为T、S、A、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q或N；
[0123] 位置3处的X可为G、T、S、A、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q或N；
[0124] 位置6处的X可为Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0125] 位置7处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0126] 位置10处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0127] 位置13处的X可为E、g-谷氨酸、D、isoD、Q、N、T、S、A或G；
[0128] 位置14处的X可为A、G、S、T、E、g-谷氨酸、D、isoD、Q或N；
[0129] 位置1、4、5、8、9、11、12和15处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；并且位置16处的J是任选的并且为选自L、V、I和F的疏水性氨基酸；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0130] 本发明的第九个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0131] (i)XXXXXXXXXXXJXXJJXXJJXXJJXXX(SEQ ID NO:12，修饰的P17/18)，其中[0132] 位置1处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0133] 位置2处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0134] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选P、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0135] 位置4处的X可为任何氨基酸，但优选I、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、N、isoD、K或R；
[0136] 位置5处的X可为任何氨基酸，但优选D、isoD、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、N、Q、K或R；
[0137] 位置6处的X可为任何氨基酸，但优选R、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N或K；
[0138] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0139] 位置8处的X可为任何氨基酸，但优选T、Q、S、E、g-谷氨酸、A、G、D、isoD、N、K或R；
[0140] 位置9处的X可为任何氨基酸，但优选I、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0141] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选E、g-谷氨酸、Q、S、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0142] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0143] 位置13处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0144] 位置14处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0145] 位置17处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0146] 位置18处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0147] 位置21处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0148] 位置22处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0149] 位置25处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0150] 位置26处的X可为任何氨基酸，但优选P、S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0151] 位置27处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0152] 位置12、15、16、19、20、23和24处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；或
[0153] (ii)JXXJJXXJJXXJJ(SEQ ID NO:13，修饰的P17/18min共有)，其中
[0154] 位置2处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0155] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0156] 位置6处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0157] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0158] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0159] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；并且
[0160] 位置1、4、5、8、9、12和13处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0161] 本发明的第十个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0162] XJXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:14，修饰的P19共有)，其中
[0163] 位置1处的X是任选的并且可为L、I、V、F或M；
[0164] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0165] 位置4处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0166] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0167] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0168] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选R、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或K；并且
[0169] 位置2、5、6、8、9、12和13处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0170] 本发明的第十一个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0171] Z1–LLXLFXXIL–Z2(SEQ ID NO:126，P3最小)其中
[0172] 位置3处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0173] 位置6处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0174] 位置7处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；并且
[0175] 其中Z1和Z2中的一个是存在的，但优选不同时存在，Z1包含LXX-，其中每个X为亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R，且Z2包含-XXLF，其中每个X为亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R。
[0176] 本发明的第十二个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：L-X-X-(L/I)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I/V)(SEQ ID NO:116)，其中所述肽不含半胱氨酸和甲硫氨酸；位置2、3、6、7处的每个X为任何氨基酸；并且所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0177] 本发明的第十三个方面涉及一种融合蛋白，其包括本发明第一至第十二个方面的肽中的一种，连同纯化标签、溶解性标签或根据本发明第一至第十二个方面中的一个的第二肽中的一种或多种。
[0178] 本发明的第十四个方面涉及一种分离的肽，其选自由以下组成的组：DVGQLIGELIDRGLQ(SEQ ID NO:15)、GDVGQLIGELIDRGLQSVLAG(SEQ ID NO:16)、
SSRALQEVIAQLAQELTHN(SEQ ID NO:17)或GLEDIKAALDTLIHEKLG(SEQ ID NO:18)。本发明的这个方面还涵盖融合蛋白，其包括这些肽中的一种，连同纯化标签、溶解性标签或根据本发明第一至第十二和第十四个方面中的一个的第二肽中的一种或多种。
[0179] 本发明的第十五个方面涉及一种组合物，其包含根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的一种或多种肽或融合蛋白，及载体。
[0180] 本发明的第十六个方面涉及一种赋予植物抗病性的方法。这种方法包括：向植物或植物
种子或该植物生长或预期生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效赋予抗病性。
[0181] 本发明的第十七个方面涉及一种增强植物生长的方法。这种方法包括：向植物或植物种子或该植物生长或预期生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效增强植物生长。
[0182] 本发明的第十八个方面涉及一种增加植物对生物胁迫因素的耐受性和抗性的方法。这种方法包括：向植物或植物种子或该植物生长或预期生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效增加植物对选自昆虫、蜘蛛类、线虫类、
杂草及其组合的生物胁迫因素的耐受性和抗性。
[0183] 本发明的第十九个方面涉及一种增加植物对非生物胁迫的耐受性的方法。这种方法包括：向植物或植物种子或该植物生长或预期生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效增加植物对选自
盐胁迫、
水分胁迫(包括干旱和洪水)、臭
氧胁迫、重金属胁迫、低温胁迫、高温胁迫、营养胁迫(
磷酸盐、
钾、氮缺乏)及其组合的非生物胁迫因素的耐受性。
[0184] 本发明的第二十个方面涉及一种赋予取自观赏植物的插条抗干燥性的方法。这种方法包括：向植物或该植物生长的场所施用根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效赋予取自观赏植物的插条抗干燥性。
[0185] 本发明的第二十一个方面涉及一种赋予水果或蔬菜采后抗病性或采后抗干燥性的方法。这种方法包括：向含有水果或蔬菜的植物或该植物生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物；或向采收的水果或蔬菜施用有效量的分离的肽或组合物，其中所述施用有效赋予水果或蔬菜采后抗病性或抗干燥性。
[0186] 本发明的第二十二个方面涉及一种增强水果或蔬菜成熟寿命的方法。这种方法包括：向含有水果或蔬菜的植物或该植物生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽或融合蛋白，或根据本发明第十五个方面的组合物；或向采收的水果或蔬菜施用有效量的分离的肽或组合物，其中所述施用有效增强水果或蔬菜成熟寿命。
[0187] 本发明的第二十三个方面涉及一种调节植物的一个或多个生物
信号传导过程的方法。这种方法包括：向植物或该植物生长的场所施用有效量的根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的分离的肽，或根据本发明第十五个方面的组合物，其中所述施用有效引发一个或多个生物化学信号传导过程。
[0188] 本发明的第二十四个方面涉及一种DNA构建体，其包括编码根据本发明第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个方面的肽或含有其的融合多肽的第一核酸分子；及与第一核酸分子可操作地偶合的启动子有效性核酸分子。本发明的这个方面还涵盖含有DNA构建体的重组表达载体、含DNA构建体的重组宿主细胞，以及包括本发明的重组植物细胞(其含有DNA构建体)的转基因植物或植物种子。
[0189] 本发明的第二十五个方面涉及一种赋予植物抗病性，增强植物生长，赋予对生物胁迫因素的耐受性和抗性，赋予对非生物胁迫的耐受性，或调节植物生物化学信号传导的方法。这种方法包括提供用根据本发明第二十四个方面的DNA构建体转化的转基因植物；并且使该植物在有效地容许DNA构建体表达所述肽或融合多肽的条件下生长以对转基因植物赋予抗病性，增强植物生长，赋予对生物胁迫因素的耐受性和抗性，赋予对非生物胁迫的耐受性，或调节生物化学信号传导。
[0190] 本发明的第二十六个方面涉及一种赋予取自观赏植物的插条抗干燥性，赋予水果或蔬菜采后抗病性或采后抗干燥性，或增强水果或蔬菜成熟寿命的方法。该方法包括提供用根据本发明第二十四个方面的DNA构建体转化的转基因植物；并且使该植物在有效地容许DNA构建体表达所述肽或融合多肽的条件下生长以赋予取自转基因观赏植物的插条抗干燥性，赋予取自转基因植物的水果或蔬菜采后抗病性或抗干燥性，或增强取自转基因植物的水果或蔬菜的成熟寿命。
[0191] 本发明的第二十七个方面涉及一种赋予植物抗病性，增强植物生长，赋予对生物胁迫因素的耐受性和抗性，赋予对非生物胁迫的耐受性，或调节生物化学信号传导的方法。这种方法包括提供用根据本发明第二十四个方面的DNA构建体转化的转基因植物种子；在
土壤中种植所述转基因植物种子；并且由所述转基因植物种子繁殖转基因植物以容许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予抗病性，增强植物生长，赋予对生物胁迫的耐受性和对生物胁迫因素的抗性，或赋予对非生物胁迫的耐受性。
[0192] 本发明的第二十八个方面涉及一种赋予取自观赏植物的插条抗干燥性，赋予水果或蔬菜采后抗病性或采后抗干燥性，或增强水果或蔬菜成熟寿命的方法。该方法包括提供用根据本发明第二十四个方面的DNA构建体转化的转基因植物种子；在土壤中种植所述转基因植物种子；并且由所述转基因植物种子繁殖转基因植物以容许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予取自转基因观赏植物的插条抗干燥性，赋予取自转基因植物的水果或蔬菜采后抗病性或抗干燥性，或增强取自转基因植物的水果或蔬菜的成熟寿命。
[0193] 通过提供不引发过敏反应但引发其它植物主动应答的肽，所述植物主动应答尤其包括过氧化物产生、生长增强、及对生物和非生物胁迫抗性，其中此类肽理想地表现出提高的溶解性、稳定性、对化学降解的抗性或这些性质的组合，将为种植者在制备、处理和向其田间或
温室的植物输送有效量的含有这些HR阴性肽的组合物方面提供更高的灵活性。为种植者简化施用过程将产生更高的依从性，并且因此关于抗病性、生长增强、对生物胁迫因素的耐受性和抗性、对非生物胁迫的耐受性、取自观赏植物的插条的抗干燥性、从植物采收的水果或蔬菜的采后抗病性或抗干燥性中的一种或多种的结果改善，和/或从植物采收的水果或蔬菜的水果或蔬菜成熟寿命提高。这些和其它益处在本文中有描述。
[0194] 发明详述
[0195] 本发明的一个方面涉及具有诱导植物主动应答而不诱导过敏反应的能力的新型肽，其提供以下一种或多种属性：改变的生物化学信号传导；增强的生长；
病原体抗性；和/或生物或非生物胁迫抗性。
[0196] 如本文中所用，天然存在的氨基酸通篇根据以下列表用对应于氨基酸的俗名的常规三字母和/或单字母缩写来标识：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酸(Glu，E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、
色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。缩写是肽领域中公认的并且由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐。氨基酸的天然存在的变型包括但不限于γ-谷氨酸(g-Glu)和异天冬氨酸(iso-Asp或isoD)。
[0197] 术语“氨基酸”还包括本文提到的任何具体氨基酸的类似物、衍生物和同源物，以及C末端或N末端受保护的氨基酸衍生物(例如，经N末端、
侧链或C末端保护基团修饰，包括但不限于乙酰化、甲酰化、甲基化、酰胺化、酯化、PEG化和脂质增加)。非天然存在的氨基酸是公知的并且可以使用如下所述的固相合成引入到本发明的肽中。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。因此，本文用其名称、三字母或单字母符号标识而未特别标识为具有D或L构型的氨基酸，应被理解为假定D或L构型中的任一种。在一个实施方案中，肽包含所有L-氨基酸。
[0198] 在某些实施方案中，经鉴定肽“由”所列举的序列组成，在这种情况下该肽仅包括所列举的氨基酸序列，在其N末端或C末端无任何额外的氨基酸。就所列举的序列呈共有序列的形式来说，其中一个或多个所指示的X或Xaa残基可以是一种或多种氨基酸中的任一种，则由此类所列举的序列组成的肽包括多个肽序列。
[0199] 在某些其它实施方案中，经鉴定肽“基本上由”所列举的序列组成，在这种情况下该肽包括所列举的一个或多个氨基酸序列，任选地在其N末端和/或C末端有一个或多个额外的氨基酸，所述额外的氨基酸不实质性改变一种或多种以下性质：(i)肽诱导植物主动应答的能力，(ii)肽在水或水溶液中的溶解性，(iii)溶于50℃的水或水溶液中的肽在一段时间(例如，3周)内的稳定性，(iv)50℃下在包括杀生剂(例如， GXL)的水性缓冲溶液的存在下在一段时间(例如，3周)内肽对化学降解的抗性；及(v)一旦浸润或施用于植物，所述肽不能诱导过敏反应。
[0200] 简言之，可以如下使用初始纯度为至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％的肽样品，评估肽的稳定性和对化学降解的抗性。对于水稳定性，将肽直接溶于去离子水中。对于化学降解测试，将肽溶于含50mM pH缓冲液和0.25％Proxel GXL的水溶液中。示例性pH缓冲液包括但不限于(i)
柠檬酸盐pH 5.6；(ii)MES pH 6.2；(iii)MOPS pH 6.5；(iv)咪唑pH
7.0；(v)柠檬酸盐pH 7.2；(vi)EDDS，pH 7.3；(vii)EDTA pH 8.0；(viii)磷酸钠pH 8.0；或(ix)TES pH 8.0。首先将肽溶于浓度为0.5mg/ml的水溶液中。在50℃下温育样品以允许
加速降解。取出肽的初始样品，用水稀释10x，并通过反相HPLC分析。简言之，将20μl样品注入HPLC仪器的
溶剂流中并在C18HPL
C柱(YMC ProPack C18,YMC,Japan或C18Stablebond,Agilent Technologies,USA)上使用于水/乙腈中的三乙胺磷酸盐梯度或于水中的0.1％TFA/于乙腈中的0.1％TFA梯度进行分析以分离不同的肽种类。通过218nm下的紫外吸光度监测洗脱肽并基于峰下面积定量。将初始肽样品的峰下面积处理成用于后续运行中的相对定量的标准。每隔一定时间(例如，1、3、7、10、14、17和21天)，测量每份肽样品并如上所述通过HPLC分析。如有必要观察降解(即，肽表现出高度化学稳定性时)，该方案可延长几周以观察降解。后续肽运行的定量表示为原始(第0天)HPLC结果的百分比。
[0201] 至少部分溶于水或水溶液的肽表现出高于0.1mg/ml，优选至少约1.0mg/ml、至少约2.0mg/ml、至少约3.0mg/ml或至少约4.0mg/ml的溶解性。在某些实施方案中，肽在水中或水溶液中表现出高溶解性，溶解性为至少约5.0mg/ml、至少约10.0mg/ml、至少约15.0mg/ml或至少约20mg/ml。
[0202] 在水或水溶液中稳定的肽在50℃下温育
指定时间段，表现出原始肽浓度的至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约
80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％或至少约90％。在某些实施方案中，指定时间段为3天、7天、14天、21天、28天、一个月、两个月或三个月。
[0203] 抗化学降解的肽在50℃下温育指定时间段，表现出原始肽浓度的至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％或至少约90％。在某些实施方案中，指定时间段为3天、7天、14天、21天、28天、一个月、两个月、三个月或四个月。50℃下四个月的稳定性大致相当于室温下2年的稳定性。
[0204] 肽浸润或施用到植物组织后，肽引发或不引发过敏反应的性质，可以通过向植物，特别是但也不完全是植物
叶片施用呈干粉形式或呈溶液形式的肽来测量。施用量包括1-500ug/ml(对于液体溶液而言)和0.0001-0.5％(w/w，对于粉末施用而言)。呈溶液形式的肽的示例性施用在所附
实施例中有描述。植物如果表现出广泛的肉眼可见的大范围细胞死亡，48小时内伴有受影响组织的萎蔫和褐变，则将其视为HR阳性(“HR+”)。植物如果未表现出明显萎蔫或肉眼可观察到的组织死亡，则将其视为HR阴性(“HR-”)。HR-肽有可能在经处理的组织中引起肉眼观察不到的较小比例的细胞死亡。
[0205] 在某些实施方案中，所述一种或多种性质的实质性改变旨在意指在将具有所述一个或多个额外氨基酸的肽与另外没有所述一个或多个额外氨基酸的相同肽比较时，在所列举的性质上存在小于20％的变化、小于15％的变化、小于10％的变化或小于5％的变化。在某些实施方案中，N末端或C末端额外氨基酸的数量在一端或两端多达20个氨基酸，在一端或两端多达15个氨基酸，在一端或两端多达10个氨基酸，在一端或两端多达7个氨基酸，在一端或两端多达5个氨基酸，或在一端或两端多达3个氨基酸。进一步地，就所列举的序列呈共有序列的形式来说，其中一个或多个所指示的X或Xaa残基可以是一种或多种氨基酸中的任一种，则基本上由此类所列举的序列组成的肽包括多个肽序列，不考虑因其N末端和/或C末端处额外氨基酸的存在而给予的此类序列另外的变化。
[0206] 在本发明的各个实施方案中，公开的肽可包括亲水性氨基酸序列，例如在指定肽序列的N末端或C末端。亲水性氨基酸序列长度为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸，并且包括有助于与指定肽(即，诱导植物主动应答的肽)的氨基酸序列相邻的氨基酸序列的亲水性的氨基酸残基。在本领域中已经使用不同方法计算氨基酸残基和蛋白质的相对疏水性/亲水性(Kyte等，“A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein,”J.Mol.Biol.157:105-32(1982)；Eisenberg D,“Three-dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins,”Ann.Rev.Biochem.53:595-623(1984)；Rose等，“Hydrogen Bonding,Hydrophobicity,Packing,and Protein Folding,”Annu.Rev.Biomol.Struct.22:381-415(1993)；Kauzmann“,Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation,”Adv.Protein Chem.14:1-63(1959)，其据此通过引用整体并入)。这些疏水性量表中的任一种均可用于本发明的目的；然而Kyte-Doolittle疏水性量表可能是最常参考的量表。这些亲水量表为氨基酸残基的相对疏水性提供了等级列表。例如，有助于亲水性的氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)和His(H)以及(尽管是在较小程度上)Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。例如，聚谷氨酸序列可用于增强蛋白质和其它药物分子的溶解性(Lilie等，Biological Chemistry 394(8):995-1004(2013)；Li等，Cancer Research 58:2404-2409(1998))，其每一个据此通过引用整体并入)。
[0207] 蛋白质或氨基酸序列的“亲水指数”是表示其平均亲水性或疏水性的数值。负的亲水指数定义目标氨基酸序列的亲水性。亲水指数与目标氨基酸序列的亲水性成正比；因此，指数越为负，其亲水性越高。在某些实施方案中，上述添加的亲水性氨基酸序列的亲水指数小于0、-0.4、-0.9、-1.3、-1.6、-3.5、-3.9或-4.5。在某些实施方案中，所得整个肽的亲水指数将小于0.3、0.2、0.1或0.0，优选小于-0.1、-0.2、-0.3、-0.4，更优选小于-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9或-1.0。
[0208] 在本发明的肽中，对于作为一个整体的肽或添加的亲水性氨基酸序列，有助于亲水性亲水指数的氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、His(H)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。其中，优选Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)或其变体。示例性变体包括g-谷氨酸(对于Glu而言)和异天冬氨酸(或isoD)(对于Asp而言)。
[0209] 如本文中所用，在本发明的这个和其它方面，术语“疏水性氨基酸”旨在指对指定氨基酸序列的亲水指数促成疏水性的氨基酸。对于作为一个整体的肽或其特定氨基酸序列，有助于疏水性亲水指数的氨基酸包括Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)和Ala(A)。在某些实施方案中，术语“疏水性氨基酸”可以指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)和Ala(A)中的任一种；或可选地，指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)和Ala(A)中的任一种。在某些其它实施方案中，术语“疏水性氨基酸”可以指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)和Phe(F)的任一种。
[0210] 如本文中所用，“非疏水性氨基酸”旨在意指在以上鉴定的一个疏水性量表上为亲水性(或不为疏水性)的氨基酸。该术语通常是指对于作为一个整体的肽或添加的亲水性氨基酸序列，有助于亲水性亲水指数的那些氨基酸。
[0211] 在本发明的一个方面，所述肽包括以下氨基酸序列：
[0212] J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J(SEQ ID NO:1)
[0213] 其中所述肽不含半胱氨酸和甲硫氨酸，位置2、3、7、8、12和13处的每个X是任选地并且当存在时，为任何氨基酸，位置4、9和14处的每个X残基为任何氨基酸，位置1、5、6、10、11、15和16处的1至3个J残基为非疏水性氨基酸或A(优选地，当A存在时，其在位置1、5、6、
10、15或16中的一个处)，且所有其它J残基为L、I、V或F(优选L、I或V)；且其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0214] 在某些实施方案中，所述肽不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：DVGQLIGELIDRGLQ(SEQ ID NO:15)、GDVGQLIGELIDRGLQSVLAG(SEQ ID NO:16)、
SSRALQEVIAQLAQELTHN(SEQ ID NO:17)或GLEDIKAALDTLIHEKLG(SEQ ID NO:18)。这些肽各自在以下文献中得以鉴定：Haapalainen等人“, Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein
Oligomerization,Lipid Interactions,and Plant Defence Induction,”Mol.Plant Pathol.12(2):151-66(2011)，其据此通过引用整体并入。
[0215] 在一个实施方案中，位置1、5、6、10、11、15和16处的1至3个J残基为非疏水性氨基酸，且所有其它优选为L、I、V或F。根据具体的实施方案，位置1、5、6、10、11、15和16处不超过两个J残基为非疏水性的。在另一实施方案中，位置1、5、6、10、11、15和16处不超过一个J残基为非疏水性的。
[0216] 在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在位置1、5、6、10、15和16中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在位置1、5、6、10、15和
16中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V或F。
[0217] 在某些实施方案中，将位置1处的残基与位置5和6、位置10和11、及位置15和16分隔的氨基酸数目可在1至3个氨基酸之间变化。在一个实施方案中，位置2和3处的一个X残基不存在，位置7和8处的一个X残基不存在，位置12和13处的一个X残基不存在，或在这些位置处的两个或更多个X残基不存在。例如，在一个实施方案中，位置2和3处的一个X残基及位置7和8处的一个X残基不存在。在另一实施方案中，位置12、13或这两者处的X残基不存在。在另一实施方案中，位置2和3处的一个X残基、位置7和8处的一个X残基及位置12和13处的一个X残基不存在。
[0218] 在另一实施方案中，位置2、3、7和8处的每个X残基是存在的(即，所述肽包括将位置1处的残基与位置5和6处的残基、及位置5和6处的残基与位置10和11处的残基分隔的三个氨基酸)。在另一实施方案中，位置12处的X残基存在或位置12和13处的X残基存在(即，所述肽包括将位置10和11处的残基与位置15和16处的残基分隔的两个或三个氨基酸)。
[0219] 在前面的段落中，残基编号是指SEQ ID NO:1，不过因为某些残基是任选的，所以J残基和插入残基的实际位置在任一具体的肽中可不同。
[0220] 在此实施方案中，肽长度小于100个氨基酸，或替代地小于90个氨基酸、小于80个氨基酸、小于70个氨基酸、小于60个氨基酸、或小于约50个氨基酸。在某些实施方案中，肽长度介于12与约50个氨基酸之间。
[0221] 在如上所述的实施方案中，其中在SEQ ID NO:1的位置2、3、7、8、12(当存在时)的每个处的X残基可为任何氨基酸，在某些实施方案中，这些残基独立地选自以下的组：Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、异天冬氨酸(isoD)和g-谷氨酸，且在位置4、9和13处的每个X残基独立地选自由以下组成的组：G、A、S、T、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K和R。
[0222] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和
杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0223] 根据本发明第一个方面的示例性肽包含下表1中所鉴定的氨基酸序列：
[0224] 表1
[0225]
[0226] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:19-46中的一个或多个的氨基序列。
[0227] 根据本发明第一个方面的其它示例性肽包含下表2中所鉴定的氨基酸序列：
[0228] 表2
[0229]
[0230] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:47-68中的一个或多个的氨基序列。
[0231] 根据本发明第一个方面的进一步示例性肽包含下表3中所鉴定的氨基酸序列：
[0232] 表3
[0233]
[0234] 在表3中，肽包括溶解性标签SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表3中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0235] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:69-84中的一个或多个的氨基序列。
[0236] 本发明第一个方面的肽还可包含下表4中所鉴定的氨基酸序列：
[0237] 表4
[0238]
[0239] 在表4中，肽包括溶解性标签SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表4中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0240] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:85-98中的一个或多个的氨基序列。
[0241] 在本发明第一个方面的另一实施方案中，肽包含下表5中所鉴定的氨基酸序列：
[0242] 表5
[0243]
[0244] 在表5中，肽包括溶解性标签SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表5中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0245] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:99-112中的一个或多个的氨基序列。
[0246] 本发明的另一个方面涉及一种分离的肽，其包含如下表6中所示的SEQ ID NO:113、114、117-123、127、133-138、140-142、144、145、148-150和153-155中的一个的氨基酸序列。
[0247] 表6
[0248]
[0249] 在表6中，若干肽包括溶解性标签S-聚E，其中聚E段含有3至7个Glu(E)残基，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表6中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0250] 在某些实施方案中，这些肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:113、114、117-123、127、133-138、140-142、144、145、148-150、153-159中的一个或多个的氨基序列。
[0251] 本发明的另一个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0252] XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX(SEQ ID NO:2，修饰的P1/P4共有)，其中
[0253] 位置1处的X是任选的并且可为S、N、D、isoD、G、A或S；
[0254] 位置2处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0255] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0256] 位置9处的X为M、L、I、F或V，或非疏水性氨基酸；
[0257] 位置10处的X是任选的并且可为D或isoD；
[0258] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0259] 位置12处的X为M、L、I或F，或非疏水性氨基酸；
[0260] 位置13处的X为M、L或I，或非疏水性氨基酸；
[0261] 位置14处的X是任选的并且可为任何亲水性氨基酸、S、T、D、isoD、K或Q，且任选A或C；
[0262] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、K或I；
[0263] 位置16处的X为M、L、I、V或F，或非疏水性氨基酸；
[0264] 位置17处的X为M、L、I、A或V，或非疏水性氨基酸；
[0265] 位置18处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、M、T或K；
[0266] 位置19处的X为A、D、isoD、S、V、T、K、R、E、H或G；
[0267] 位置20处的X为M、L或I；
[0268] 位置21处的X为M、L、I、V、S或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0269] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S；
[0270] 位置23处的X为P、Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0271] 其中位置9、12、13、16、17和20处的残基中的至少一个是非疏水性氨基酸，或位置21处的残基是除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；且其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0272] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0273] 根据本发明的这个方面的肽的一个示例性家族具有氨基酸序列：
[0274] SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP(SEQ ID NO:3，修饰的P4共有)，其中
[0275] 位置2处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0276] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0277] 位置9处的X为M、S、L、A、I、V或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0278] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0279] 位置12处的X为L、I或F，或非疏水性氨基酸；
[0280] 位置13处的X为L、A、I、V或F，或非疏水性氨基酸；
[0281] 位置14处的X为任何亲水性氨基酸；
[0282] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A、S、K或I；
[0283] 位置16处的X为L、A、I、V、M或F，或非疏水性氨基酸；
[0284] 位置17处的X为M、I、S或F，或除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；
[0285] 位置18处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0286] 位置20处的X为M、L、I、V或F、或非疏水性氨基酸；
[0287] 位置21处的X为M、L或F，或非疏水性氨基酸；并且
[0288] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0289] 其中位置9、12、13、16、20和21处的残基中的一个为非疏水性氨基酸或A，或位置17处的残基是除丝氨酸外的非疏水性氨基酸；且其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在位置9、12、13、16、20和21处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸，或位置17处的残基是除丝氨酸外的非疏水性氨基酸。
[0290] 在某些实施方案中，根据SEQ ID NO:2的这些肽还满足定义SEQ ID NO:1的肽的结构特点，在此情况下，甲硫氨酸和半胱氨酸残基不存在。因此，在这些实施方案中，位置14处的X可为除甲硫氨酸或半胱氨酸外的任何亲水性氨基酸，优选S或T。
[0291] 与SEQ ID NO:3享有共有结构或衍生自SEQ ID NO:3的示例性肽在下表7中鉴定：
[0292] 表7：肽P4的肽变体(共有SEQ ID NO:3)
[0293]
[0294] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:48-56、58、59、61和161-163中的一个或多个的氨基酸序列。
[0295] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0296] 根据本发明的此方面的肽的另一个示例性家族具有氨基酸序列：
[0297] XXGISEKXJDXJJTXJJXAJJXX(SEQ ID NO:4，修饰的P1共有)，其中
[0298] 位置1处的X为N、D、isoD、G、A或S；
[0299] 位置2处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0300] 位置8处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0301] 位置11处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0302] 位置15处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0303] 位置18处的X为M、T、K、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0304] 位置22处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0305] 位置23处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0306] 位置9、12、13、16、17、20和21处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在位置9、12、13、16、17、20和21处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在位置9、12、13、16、20和21中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在位置9、12、13、16、20和21中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V或F。
[0307] 在某些实施方案中，根据SEQ ID NO:4的这些肽还满足定义SEQ ID NO:1的肽的结构特点，在此情况下，甲硫氨酸和半胱氨酸残基不存在。因此，在那些实施方案中，位置18处的X为T、K、E、g-谷氨酸、G、A或S。
[0308] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0309] 与SEQ ID NO:4享有共有结构的示例性肽在下表8中鉴定：
[0310] 表8：P1的肽变体(共有SEQ ID NO:4)
[0311]
[0312] 这些肽的另外变体可包括如上所述在位置18处用T、K、E、g-谷氨酸、G、A或S对甲硫氨酸的取代。
[0313] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:164、166-179中的一个或多个的氨基酸序列。
[0314] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0315] 本发明的又一个方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0316] (i)KPXDSXSXJAKJJSXJJXSJJX(SEQ ID NO:5，修饰的P15b/P20共有)，其中[0317] 位置3处的X为N、D或isoD；
[0318] 位置6处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0319] 位置8处的X为N、D或isoD；
[0320] 位置15处的X是任选的并且可为任何氨基酸；
[0321] 位置18处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0322] 位置22处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0323] 位置9、12、13、16、17、20和21处的J是选自L、V、I、F和A的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个为非疏水性氨基酸；或
[0324] (ii)JAKJJSXJJXSJJX(SEQ ID NO:6，修饰的P15/20min共有)，其中
[0325] 位置7处的X是任选的并且可为任何氨基酸；
[0326] 位置10处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0327] 位置14处的X是任选的并且可为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0328] 位置1、4、5、8、9、12和13处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；并且
[0329] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在SEQ ID NO:5的位置9、12、13、16、17、20和21处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A；并且在SEQ ID NO:6的位置1、4、5、8、9、12和13处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:5的位置9、12、13、16、20和21或SEQ ID NO:6的位置1、4、5、8、12和13中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:5的位置9、12、13、16、20和21或SEQ ID NO:6的位置1、4、5、8、12和13中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V或F。
[0330] 与SEQ ID NO:5或6享有共有结构的示例性肽在下表9中鉴定：
[0331] 表9：P15/20的肽变体(共有SEQ ID NO:5或6)
[0332]
[0333] 这些肽的另外变体可包括如上所述在位置18处用E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K对甲硫氨酸的取代。
[0334] 在某些其它实施方案中，所述肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:180-193中的一个或多个的氨基序列。
[0335] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0336] 本发明的又一方面涉及一种分离的肽，其具有氨基酸序列：
[0337] PSPJTXJJXXJJGXJJXAXN(SEQ ID NO:7，修饰的P6/6a共有)，其中
[0338] 位置6处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0339] 位置9处的X为M、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K；
[0340] 位置10处的X为H或N；
[0341] 位置14处的X为E、g-谷氨酸、D或isoD；
[0342] 位置17处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；
[0343] 位置19处的X为Q、E、g-谷氨酸、G、A或S；并且
[0344] 位置4、7、8、11、12、15和16处的J是选自L、V、I、M和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个为非疏水性氨基酸或A；
[0345] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在位置4、7、8、11、12、15和16处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:7的位置4、7、8、11、15和16中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V、M或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:7的位置4、7、8、11、15和16中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V、M或F。
[0346] 与SEQ ID NO:7享有共有结构的示例性肽在下表10中鉴定：
[0347] 表10：P6/6a的肽变体(共有SEQ ID NO:7)
[0348]
[0349] 这些肽的另外变体可包括如上所述在位置7处用L、I、V、F、非疏水性氨基酸或A对甲硫氨酸的取代；和如上所述在位置9处用L、E、g-谷氨酸、G、A、S、T或K对甲硫氨酸的取代。
[0350] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:194-207中的一个或多个的氨基酸序列。
[0351] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0352] 本发明的另一个方面涉及一种肽，其具有氨基酸序列：
[0353] (i)XXXXXXJXXJJXXJJXJJK(SEQ ID NO:8，修饰的P14d共有)，其中
[0354] 位置1处的X可为：Q、N、D、E、g-谷氨酸、isoD或S；
[0355] 位置2处的X可为：D、E、g-谷氨酸、isoD；
[0356] 位置3处的X可为：P、D、E、isoD或g-谷氨酸；
[0357] 位置4处的X可为M、A、S、D、E、isoD或g-谷氨酸
[0358] 位置5处的X可为Q、E或g-谷氨酸；
[0359] 位置6处的X可为A、E或g-谷氨酸；
[0360] 位置8处的X可为M、L、E、Q、D、N、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0361] 位置9处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0362] 位置12处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0363] 位置13处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0364] 位置16处的X可为K、Q、N、E、D、R、G、A或S；并且
[0365] 位置7、10、11、14、15、17和18处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个为非疏水性氨基酸或A；或
[0366] (ii)JXXJJXXJJXJJK(SEQ ID NO:9，修饰的P14d min共有)，其中
[0367] 位置2处的X可为M、L、E、Q、D、N、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0368] 位置3处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0369] 位置6处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0370] 位置7处的X可为Q、N、E、D、G、A、S、isoD或g-谷氨酸；
[0371] 位置10处的X可为K、Q、N、E、D、R、G、A或S；并且
[0372] 位置1、4、5、8、9、11和12处的J是选自L、V、I和F的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在SEQ ID NO:8的位置7、10、11、14、15、17和18处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A；并且在SEQ ID NO:9的位置1、4、5、8、9、11和12处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:8的位置7、10、11、14、17和18或SEQ ID NO:9的位置1、4、5、8、11和12中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:8的位置7、10、11、
14、17和18或SEQ ID NO:9的位置1、4、5、8、11和12中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V或F。
[0373] 与SEQ ID NO:8或9享有共有结构的示例性肽在下表11中鉴定：
[0374] 表11：P14d的肽变体(共有SEQ ID NO:8或9)
[0375]
[0376] 这些肽的另外变体可包括如上所述在位置4和8的一个或两个处用L、E、Q、D、N、G、A、S、isoD或g-谷氨酸对甲硫氨酸的取代。
[0377] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:208-221中的一个或多个的氨基酸序列。
[0378] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0379] 本发明的又一方面涉及一种肽，其具有氨基酸序列：
[0380] (i)JXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:10，修饰的P25共有)其中
[0381] 位置2处的X可为Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0382] 位置3处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0383] 位置6处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0384] 位置9处的X可为E、g-谷氨酸、D、isoD、Q、N、T、S、A或G；
[0385] 位置10处的X可为A、G、S、T、E、g-谷氨酸、D、isoD、Q或N；并且
[0386] 位置1、4、5、7、8、10和11处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；或
[0387] (ii)JXXJJXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:11，修饰的P25共有)其中
[0388] 位置2处的X可为T、S、A、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q或N；
[0389] 位置3处的X可为G、T、S、A、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q或N；
[0390] 位置6处的X可为Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0391] 位置7处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0392] 位置10处的X可为K、Q、N、E、g-谷氨酸、D、isoD、T、S、A或G；
[0393] 位置13处的X可为E、g-谷氨酸、D、isoD、Q、N、T、S、A或G；
[0394] 位置14处的X可为A、G、S、T、E、g-谷氨酸、D、isoD、Q或N；
[0395] 位置1、4、5、8、9、11、12和15处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；并且
[0396] 位置16处的J是任选的并且为选自L、V、I和F的疏水性氨基酸；
[0397] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在SEQ ID NO:10的位置1、4、5、7、8、10和11处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸，并且在SEQ ID NO:11的位置1、4、5、8、9、11、12、15和16处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:10的位置1、4、5、7、10和11或SEQ ID NO:11的位置1、4、5、8、11、12、15和16中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V或F。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:10的位置1、4、5、7、10和11或SEQ ID NO:11的位置1、4、5、8、11、12、15和16中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V或F。
[0398] 与SEQ ID NO:10或11享有共有结构的示例性肽在下表12中鉴定：
[0399] 表12：P25的肽变体(共有SEQ ID NO:10或11)
[0400]
[0401] 这些肽的另外变体可包括如上所述在位置13处用L、V、I和F对甲硫氨酸的取代。
[0402] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:222-239中的一个或多个的氨基酸序列。
[0403] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0404] 本发明的又另一个方面涉及一种肽，其具有氨基酸序列：
[0405] (i)XXXXXXXXXXXJXXJJXXJJXXJJXXX(SEQ ID NO:12，修饰的P17/18)，其中[0406] 位置1处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0407] 位置2处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0408] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选P、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0409] 位置4处的X可为任何氨基酸，但优选I、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、N、isoD、K或R；
[0410] 位置5处的X可为任何氨基酸，但优选D、isoD、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、N、Q、K或R；
[0411] 位置6处的X可为任何氨基酸，但优选R、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N或K；
[0412] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0413] 位置8处的X可为任何氨基酸，但优选T、Q、S、E、g-谷氨酸、A、G、D、isoD、N、K或R；
[0414] 位置9处的X可为任何氨基酸，但优选I、Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0415] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选E、g-谷氨酸、Q、S、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0416] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、E、g-谷氨酸、A、T、G、D、isoD、N、K或R；
[0417] 位置13处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0418] 位置14处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0419] 位置17处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0420] 位置18处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0421] 位置21处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0422] 位置22处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0423] 位置25处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0424] 位置26处的X可为任何氨基酸，但优选P、S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0425] 位置27处的X可为任何氨基酸，但优选Q、S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；并且
[0426] 位置12、15、16、19、20、23和24处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；
[0427] 或
[0428] (ii)JXXJJXXJJXXJJ(SEQ ID NO:13，修饰的P17/18min共有)，其中
[0429] 位置2处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0430] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0431] 位置6处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0432] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选Q、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、N、K或R；
[0433] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0434] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选S、A、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；并且
[0435] 位置1、4、5、8、9、12和13处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；
[0436] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在SEQ ID NO:12的位置12、15、16、19、20、23和24处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A；并且在SEQ ID NO:13的位置1、4、5、8、9、12和13处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸或A。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:12的位置12、15、16、19、23和24或SEQ ID NO:13的位置1、4、5、8、12和13中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V、F或M。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:12的位置12、15、16、19、23和24或SEQ ID NO:13的位置1、4、5、8、12和13中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V、F或M。
[0437] 与SEQ ID NO:12或13享有共有结构或衍生自SEQ ID NO:12或13并且满足SEQ ID NO:1的共有结构的示例性肽在下表13中鉴定：
[0438] 表13：P17/P18的肽变体(共有SEQ ID NO:12或13)
[0439]
[0440] 在表13中，肽包括溶解性标签SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表13中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0441] 在某些其它实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:85-98中的一个或多个的氨基酸序列。
[0442] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0443] 本发明的又一个方面涉及一种肽，其具有氨基酸序列：
[0444] XJXXJJXJJXXJJ(SEQ ID NO:14，修饰的P19共有)，其中
[0445] 位置1处的X是任选的并且可为L、I、V、F或M；
[0446] 位置3处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0447] 位置4处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0448] 位置7处的X可为任何氨基酸，但优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0449] 位置10处的X可为任何氨基酸，但优选A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K或R；
[0450] 位置11处的X可为任何氨基酸，但优选R、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或K；并且
[0451] 位置2、5、6、8、9、12和13处的J是选自L、V、I、F和M的疏水性氨基酸，例外的是在这些位置处的氨基酸中的至少一个是非疏水性氨基酸或A；
[0452] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。优选地，在位置2、5、6、8、9、12和13处的一个至四个、不超过三个、不超过两个或正好一个残基为非疏水性氨基酸。在一个实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:14的位置2、5、6、8、12和13中的一个处；剩余J残基中的一个或两个任选为非疏水性氨基酸，且所有其它J残基为L、I、V、F或M。在某些实施方案中，不超过一个J残基为A，且优选地，A残基在SEQ ID NO:14的位置2、5、6、8、12和13中的一个处；且所有其它J残基为L、I、V、F或M。
[0453] 与SEQ ID NO:14享有共有结构或衍生自SEQ ID NO:14并且满足SEQ ID NO:1的共有结构的示例性肽在下表14中鉴定：
[0454] 表14：P19的肽变体(共有SEQ ID NO:14)
[0455]
[0456] 在表14中，肽包括溶解性标签SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表14中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0457] 在某些实施方案中，所述分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列。
[0458] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0459] 本发明的又一方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0460] Z1–LLXLFXXIL–Z2(SEQ ID NO:126，P3最小)其中
[0461] 位置3处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0462] 位置6处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；
[0463] 位置7处的X为任何亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R；并且
[0464] 其中Z1和Z2中的一个是存在的，但优选不同时存在，Z1包含LXX-，其中每个X为亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R，且Z2包含-XXLF，其中每个X为亲水性氨基酸，优选K、A、S、T、G、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N或R。
[0465] 其中所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0466] 在一个实施方案中，Z1而非Z2是存在的。在一个替代实施方案中，Z2而非Z1是存在的。
[0467] 与SEQ ID NO:126享有共有结构或衍生自SEQ ID NO:126并且满足SEQ ID NO:1的共有结构的示例性肽在下表15中鉴定：
[0468] 表15：P3的肽变体(共有SEQ ID NO:126)
[0469]
[0470] 在表15中，肽包括溶解性标签SEEE、SEEEE和SEEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表15中所示的序列但缺乏此特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0471] 在某些实施方案中，分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:156-159的氨基酸序列。
[0472] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0473] 本发明的另一个方面涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列：
[0474] L-X-X-(L/I)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I/V)(SEQ ID NO:116)
[0475] 其中所述肽不含半胱氨酸和甲硫氨酸；位置2、3、6、7处的每个X为任何氨基酸；并且所述肽当施用于植物组织时诱导植物主动应答，但不诱导过敏反应。
[0476] 在某些实施方案中，在位置2、3、6和7的一个或多个处的X为非疏水性氨基酸，在位置2、3、6和7的两个或更多个处的X为非疏水性氨基酸，在位置2、3、6和7的三个或更多个处的X为非疏水性氨基酸，或在位置2、3、6和7的每个处的X为非疏水性氨基酸。在这个实施方案中，非疏水性氨基酸可独立地为以下中的任一个：G、A、S、T、D、isoD、E、g-谷氨酸、Q、N、K和R。
[0477] 根据本发明这个方面的肽一般由HR盒序列的截短表示，所述HR盒序列描述于2015年10月1日提交的、名称为“Hypersensitive Response Elicitor Peptides and Use Thereof”的共同未决的PCT申请PCT/US15/53387中，其据此通过引用整体并入。因此，借助于HR盒序列的截短，通过肽的终止或形成HR盒序列的一部分的氨基酸残基的取代，根据这个方面的分离的肽不包含氨基酸序列：
[0478] (L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)(SEQ ID NO:125)
[0479] 其中位置2、3、6、7、10、11处的每个X为任何氨基酸。
[0480] 与SEQ ID NO:116享有共有结构的示例性肽在下表16中鉴定：
[0481] 表16
[0482]
[0483] 在表16中，肽包括溶解性标签SEEEE和SEEEEE，由斜体字表示。本文还涵盖了包含表15中所示的序列但缺乏特定的溶解性标签(或具有不同溶解性标签)的肽。
[0484] 在某些实施方案中，分离的肽基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:115、124、128-132、139、143、146、147、151、152和160的氨基酸序列。
[0485] 在这个实施方案中，分离的肽溶于水中时优选稳定；如上所述，在pH缓冲液和杀生物剂的存在下在水性条件下抗化学降解；和/或在水溶液中的溶解性为至少约1.0mg/ml。
[0486] 本发明的分离的肽也可以融合肽的形式呈现，融合肽另外包括经由肽键与本发明肽偶合的第二氨基酸序列。第二氨基酸序列可为纯化标签，如聚组氨酸(His6-)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)或麦芽糖结合蛋白(MBP-)，其有助于纯化但随后可去除，即在回收之后从肽上裂解。可在纯化标签和所需肽之间引入蛋白酶特异性裂解位点或化学特异性裂解位点(即，在可裂解接头序列中)。蛋白酶特异性裂解位点是文献中公知的并且包括但不限于在赖氨酸之后裂解的肠激酶特异性裂解位点(Asp)4-Lys；在精氨酸之后裂解的因子Xa特异性裂解位点Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg；在Lys和Arg之后裂解的胰蛋白酶特异性裂解位点；及GenenaseTM I特异性裂解位点Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr。化学药品及其特异性裂解位点包括但不限于溴化氰(CNBr)，其在甲硫氨酸(Met)残基处裂解；BNPS-粪臭素，其在色氨酸(Trp)残基处裂解；
甲酸，其在天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)肽键处裂解；羟胺，其在天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly)肽键处裂解；及2-硝基-5-氰硫基
苯甲酸(NTCB)，其在半胱氨酸(Cys)残基处裂解(参见Crimmins等，“Chemical Cleavage of Proteins in Solution,”Curr.Protocol.Protein Sci.，第11章:第11.4单元(2005)，其据此通过引用整体并入)。为了使用这些裂解方法的中的一种，可能必须通过突变从所需肽序列内去除不需要的裂解位点。例如，为了与胰蛋白酶相容已经使P14-22E,26E-R(SEQ ID NO:23)突变：位置9处的赖氨酸残基突变为谷氨酸并且添加C末端精氨酸以呈现理论上胰蛋白酶裂解的产物。可进一步纯化所需肽产物以去除裂解的纯化标签。
[0487] 本发明的分离的肽也可以融合肽的形式呈现，该融合肽包括通过接头序列连接在一起的多个本发明的肽序列，其可能或可能不呈上述类型的可裂解氨基酸序列的形式。此类多聚体融合蛋白可能或可能不包括纯化标签。在一个实施方案中，每个
单体序列可包括通过第一可裂解肽序列与本发明的肽连接的纯化标签；并且几个单体序列可通过第二可裂解肽序列与相邻单体序列连接。因此，在多聚体融合蛋白表达后，即在宿主细胞中，可用蛋白酶或有效裂解第二可裂解肽序列的化学药品处理回收的融合蛋白，从而释放含有纯化标签的单个单体肽序列。亲和纯化后，可用蛋白酶或有效裂解第一可裂解肽序列的化学药品处理回收的单体肽序列并从而使纯化标签从目标肽上释放。后者可使用如下文所述的凝胶过滤和/或HPLC进一步纯化。
[0488] 这些融合蛋白可包括如上鉴定为SEQ ID NO:15-18的序列，这些序列先前在以下文献中鉴定：Haapalainen等人“,Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein Oligomerization,Lipid Interactions,and Plant Defence Induction,”Mol.Plant Pathol.12(2):151-66(2011)，其据此通过引用整体并入。
[0489] 根据一种方法，可以通过标准肽合成操作来合成本发明的肽。这些包括FMOC(9-芴基甲氧基-羰基)和tBoc(叔丁氧基-羰基)合成方案，其可以在自动化固相肽合成仪器上进行，包括但不限于Applied Biosystems 431A、433A合成仪和Peptide Technologies Symphony或大规模Sonata或CEM Liberty自动化固相肽合成仪。也预期替代性肽合成仪器的使用。使用固相合成制备的肽呈大体上纯的形式回收。
[0490] 也可通过使用重组表达系统，接着分离并纯化重组制备的肽来制备本发明的肽。通常，这涉及将编码核酸分子插入到该分子异源(即，一般不存在)的表达系统中。可将编码本发明肽的一个或多个所需核酸分子插入载体中。将异源核酸分子以相对于启动子和任何其它5'和3'调控分子的适当有义(5'—3')取向和正确阅读框插入至所述表达系统或载体中。下面表17中包括了用于在细菌和植物宿主中表达的代表性核苷酸序列：
[0491] 表17
[0492]
[0493]
[0494] 就对本文列出的编码的氨基酸序列及所需
转基因生物的认识，仅用常规技术可以产生另外的密码子优化的DNA序列和RNA序列。
[0495] DNA构建体对本发明的肽或融合多肽的表达(包括转录和翻译)可以就表达水平、进行表达的组织类型和/或表达的发育阶段进行调控。许多异源
调控序列(例如，启动子和增强子)可用于控制DNA构建体的表达。这些包括组成型、诱导型和可调型启动子，以及以组织或
时空特异性方式控制表达的启动子和增强子。示例性组成型启动子包括覆盆子E4启动子(美国专利第5,783,393和5,783,394号，其各自据此通过引用整体并入)、胭脂
碱合酶(NOS)启动子(Ebert等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:5745-5749(1987)，其据此通过引用整体并入)、章鱼碱合酶(OCS)启动子(其携带在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)的致瘤质粒上)、花椰菜病毒(caulimovirus)启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)
19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9:315-324(1987)，其据此通过引用整体并入)和CaMV 35S启动子(Odell等，Nature 313:810-812(1985)，其据此通过引用整体并入)、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利第5,378,619号，其据此通过引用整体并入)、来自于核
酮糖-
1,5-双磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的光诱导型启动子、Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:6624-6628(1987)，其据此通过引用整体并入)、
蔗糖合酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87:4144-4148(1990)，其据此通过引用整体并入)、R基因复合物启动子(Chandler等，Plant Cell 1:1175-1183(1989)，其据此通过引用整体并入)、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、CsVMV启动子(Verdaguer等，Plant Mol Biol.,37:1055-1067(1998)，其据此通过引用整体并入)和甜瓜肌动蛋白启动子(PCT公布第WO00/56863号，其据此通过引用整体并入)。示例性组织特异性启动子包括西红柿E4和E8启动子(美国专利第5,859,330号，其据此通过引用整体并入)和西红柿2AII基因启动子(Van Haaren等，Plant Mol Bio.,21:625-640(1993)，其据此通过引用整体并入)。
[0496] 在一个优选的实施方案中，DNA构建体的表达受来自其表达与早期种子和/或胚发育相关的基因的调控序列控制。实际上，在一个优选的实施方案中，所用启动子为种子增强型启动子。此类启动子的实例包括来自诸如以下的基因的5'调控区：napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1:209:219(1991)，其据此通过引用整体并入)、球蛋白(Belanger和Kriz，Genet.129:863-872(1991),GenBank登记号L22295，其各自据此通过引用整体并入)、γ玉米蛋白Z 27(Lopes等，Mol Gen Genet.247:603-613(1995)，其据此通过引用整体并入)、L3油质蛋白(oleosin)启动子(美国专利第6,433,252号，其据此通过引用整体并入)、菜豆蛋白(phaseolin)(Bustos等，Plant Cell 1(9):839-853(1989)，其据此通过引用整体并入)、arcelin5(美国申请公布第2003/0046727号，其据此通过引用整体并入)、大豆7S启动子、7Sa启动子(美国申请公布第2003/0093828号，其据此通过引用整体并入)、大豆7Sαβ伴大豆球蛋白 启动子、7Sα启动子(Beachy等，EMBO J.4:3047(1985)；Schuler等，
Nucleic Acid Res.10(24):8225-8244(1982)，其各自据此通过引用整体并入)、大豆胰蛋白酶
抑制剂(Riggs等，Plant Cell 1(6):609-621(1989)，其据此通过引用整体并入)、ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.,22(2):255-267(1993)，其据此通过引用整体并入)、硬脂酰-ACP脱饱和酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4):167-176(1994)，其据此通过引用整体并入)、大豆 伴大豆球蛋白的a'亚基(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.83:8560-8564(1986)，其据此通过引用整体并入)、蚕豆(Vicia faba)USP(美国申请公布第2003/229918号，其据此通过引用整体并入)和玉米L3油质蛋白启动子(Hong等，Plant Mol.Biol.,34(3):549-555(1997)，其据此通过引用整体并入)。
[0497] 可经由固相合成，使
用例如亚磷酰胺法和源自受保护的2′-脱氧核苷的亚磷酰胺构建模
块(building block)来制备编码本发明的肽的核酸分子。为获得所需寡核苷酸，按产物序列所需的顺序使构建模块依序与增长的寡核苷酸链偶合。链组装完成之后，产物从固相释放到溶液中，去保护、收集并且通常使用HPLC纯化。固相合成的界限适于制备长度长达约200nt的寡核苷酸，其编码约65个氨基酸或更少数量级的肽。可以将合成的寡核苷酸的末端设计为包括特异性限制酶裂解位点以促进合成的寡核苷酸连接到表达载体中。
[0498] 对于较长的肽，可经由固相合成制备寡核苷酸，然后使用各种技术将合成的寡核苷酸序列连接在一起。综述了构造完整合成基因的重组技术，例如，在Hughes等，“Chapter Twelve–Gene Synthesis:Methods and Applications,”Methods in Enzymology 498:277-309(2011)中，其据此通过引用整体并入。
[0499] 一旦选择了合适的表达载体，就使用本领域中的标准克隆程序将所需的核酸序列克隆到载体中，如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Laboratory,Cold Springs Harbor,N.Y.(1989)，或Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号所述，其据此通过引用整体并入。然后将载体引入合适的宿主中。
[0500] 可利用各种宿主-载体系统重组表达本发明的肽。主要地，载体系统必须与所用宿主相容。宿主-载体系统包括但不限于以下：经
噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；
微生物诸如含有
酵母载体的酵母；经病毒(例如，
牛痘病毒、腺病毒等)感染的
哺乳动物细胞系统；经病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和受农杆菌(Agrobacterium)感染的植物细胞。这些载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任一种来实现本发明的这个和其它方面。
[0501] 可通过几种方法获得纯化肽。优选通过传统技术产生呈纯化形式(优选纯度为至少约80％或85％，更优选纯度为至少约90％或95％)的肽。根据是否使重组宿主细胞将肽分泌到生长培养基中(参见Bauer等的美国专利第6,596,509号，其据此通过引用整体并入)，可通过离心(以将细胞组分与含有分泌的肽的上清液分开)，接着通过上清液的连续
硫酸铵沉淀来分离和纯化所述肽。含所述肽的成分在适当尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中经受凝胶过滤以将所述肽与其它蛋白质分开。如有必要，可通过HPLC进一步纯化肽成分。
[0502] 可选地，如果未分泌目标肽，则可以使用标准的分离和纯化方案将其从重组细胞分离。这包括破坏细胞(例如，通过超声处理、冷冻、弗氏压碎器(French press)等)，然后从细胞碎片中回收所述肽。纯化可以使用上述的离心、沉淀和纯化程序实现。使用上述纯化标签可以简化这个过程。
[0503] 在某些实施方案中，不需要纯化。不进行纯化时，可以在离心去除细胞碎片之后回收无细胞裂解物。所得的无细胞裂解物可经足够时间的
热处理以灭活回收成分中的任何天然蛋白酶，例如在100℃下10分钟。若需要，可向此类无细胞制剂中引入杀生剂、蛋白酶抑制剂和非离子型
表面活性剂中的一种或多种(参见Wei的美国申请公布第20100043095号，其据此通过引用整体并入)。
[0504] 一旦回收本发明的肽，就可将其用于制备包括载体和选自由以下组成的组的一种或多种添加剂的组合物：
杀菌剂或杀生剂、蛋白酶抑制剂、非离子型表面活性剂、
肥料、
除草剂、
杀虫剂、杀真菌剂、
杀线虫剂、
生物接种剂、植物调节剂及其混合物。
[0505] 在某些实施方案中，所述组合物包括大于约1nM的肽、大于约10nM的肽、大于约20nM的肽、大于约30nM的肽、大于约40nM的肽、大于约50nM的肽、大于约60nM的肽、大于约
70nM的肽、大于约80nM的肽、大于约90nM的肽、大于约100nM的肽、大于约150nM的肽、大于约
200nM的肽或大于约250nM的肽。在某些实施方案中，所述组合物包括小于约1nM的肽。例如，某些肽可以低于约2ng/ml、低于约1.75ng/ml、低于约1.5ng/ml、低于约1.25ng/ml、低于约
1.0ng/ml、低于约0.75ng/ml、低于约0.5ng/ml、低于约0.25ng/ml或甚至低于约0.1ng/ml的浓度存在。
[0506] 合适的载体包括水、任选含有一种或多种共溶剂的水溶液、浆料和固体载体颗粒。示例性固体载体包括矿物土如
硅酸盐、硅胶、滑石、
高岭土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白
云石、
硅藻土、硫酸
钙、
硫酸镁、氧化镁、
研磨合成材料，和植物来源的产物，如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉、
纤维素粉、淀粉和淀粉衍生物，以及其它单糖、
二糖和多糖。
[0507] 合适的肥料包括但不限于硫酸铵、磷酸铵、
硝酸铵、尿素及其组合。
[0508] 合适的杀虫剂包括但不限于新烟碱类成员，如吡虫啉(imidicloprid)、噻虫胺(clothianidin)和噻虫嗪(thiamethoxam)；有机磷酸酯类成员，如毒死蜱(chlorpyrifos)和
马拉硫磷(malathion)；拟
除虫菊酯类成员，如氯菊酯(permethrin)；其它天然杀虫剂，如烟碱(nicotine)、降烟碱(nornicotine)和
除虫菊酯(pyrethrin)；氨基甲酸酯类成员，如涕灭威(aldicarb)、呋喃丹(carbofuran)和西维因(carbaryl)；大环内酯类成员，如各种阿维菌素(abamectin)、除虫菌素(avermectin)和伊维菌素(ivermectin)产品；二酰胺类成员，如氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、氰虫酰胺(cyantraniliprole)和氟苯虫酰胺(flubendiamide)；几丁质合成抑制剂，特别是苯甲酰脲类的那些，如氯芬奴隆(lufenuron)和除虫脲(diflubenzuron)；及其任何组合，包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种杀虫剂的组合。农药通用名纲要(Compendium of Pesticide Common Names)中列出了另外的杀虫剂，其由Alan Wood操作的
数据库并且在alanwood.net互联网
网站上以
电子形式可用。
[0509] 合适的杀真菌剂包括但不限于甲氧
丙烯酸酯类成员，如嘧菌酯(azoxystrobin)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、肟菌酯(trifloxystrobin)、啶氧菌酯(picoxystrobin)和氟嘧菌酯(fluoxastrobin)；三唑类成员，如种菌唑(ipconazole)、叶菌唑(metconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、灭菌唑(triticonazole)、四氟醚唑(tetraconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、粉唑醇(flutriafol)、丙环唑(propiconazole)和丙硫菌唑(prothioconazole)；
琥珀酸脱氢酶类成员，如萎锈灵(carboxin)、氟唑菌酰胺
(fluxapyroxad)、啶酰菌胺(boscalid)和氟唑环菌胺(sedaxane)；苯基酰胺类成员，如甲霜灵(metalaxyl)、精甲霜灵(mefenoxam)、苯霜灵(benalaxyl)和恶霜灵(oxadiyxl)；苯基吡咯类成员，如咯菌腈(fludioxonil)；邻苯二甲酰亚胺类成员，如克菌丹(captan)；二硫代氨基甲酸酯类成员，如代森锰(mancozeb)和福美双(thiram)；苯并咪唑类成员，如噻苯咪唑(thiabendazole)；及其任何组合，包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种杀真菌剂的组合。农药通用名纲要中列出了另外的杀真菌剂，其由Alan Wood操作的数据库并且在alanwood.net互联网网站上以电子形式可用。
[0510] 合适的杀线虫剂包括但不限于氨基甲酸酯类化学药品，如涕灭威、涕灭砜威(aldoxycarb)、杀线威(oxamyl)、呋喃丹和cleothocarb；及有机磷酸酯类化学药品，如硫磷嗪(thionazin)、灭线磷(ethoprophos)、苯线磷(fenamiphos)、丰索磷(fensulfothion)、特丁磷(terbufos)、氯唑磷(isazofos)和硫线磷(ebufos)。农药通用名纲要中列出了另外的杀线虫剂，其由Alan Wood操作的数据库并且在alanwood.net互联网网站上以电子形式可用。
[0511] 合适的杀菌剂包括但不限于基于双氯酚和苯甲醇半缩甲
醛的那些(来自ICI的或来自Thor Chemie的 RS和来自Rohm&Haas的 MK)和异噻唑啉酮衍生物如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的 MBS；来
自ICI的 GXL)。农药通用名纲要中列出了另外的杀菌剂，其由Alan Wood操作的数据库并且在alanwood.net互联网网站上以电子形式可用。
[0512] 合适的接种剂包括但不限于慢生根瘤菌属种(Bradyrhizobium spp.)，特别是慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(BASF 产品)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、木霉属种(Trichoderma spp.)、巴斯德氏菌属种(Pasteuria spp.)和根瘤细胞的其它培养物(BASF 和 )及
其任何组合，包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种接种剂的组合。
[0513] 植物调节剂是刺激或抑制植物生物化学信号传导的天然或合成的化学物质。这些通常但不完全受细胞表面上的受体识别，在细胞中引起级联反应。合适的植物调节剂包括但不限于乙烯利(ethephon)；乙烯；水杨酸；乙酰水杨酸；茉莉酸；茉莉
酮酸甲酯；二氢茉莉酮酸甲酯；几丁质；壳聚糖；脱落酸；任何生长素(auxin)化合物或抑制剂，包括但不限于(4-氯苯氧基)乙酸、(2,4-二氯苯氧基)乙酸和2,3,5-三碘苯甲酸；任何细胞分裂素(cytokinin)，包括但不限于激动素(kinetin)和玉米素(zeatin)；赤霉素(gibberellin)；
芸苔素内酯(brassinolide)；及其任何组合，包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种调节剂的组合。
[0514] 其它合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、涂层剂和研磨剂。这些物质可用于促进根据本发明的组合物的应用。另外，所述组合物可以和其它常规种子制剂和处理物质，包括粘土和多糖一起施用于植物种子。
[0515] 用于植物种子处理的组合物或系统包括：本发明的一种或多种肽，优选但不完全是肽p4-14s-9a(SEQ ID NO:57)、p4-14s-12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14-22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1-29(SEQ ID NO:130)和p4-14S-16S(SEQ ID NO:55)中的一种或多种，联合一种或多种杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、其它接种剂或其它植物调节剂，包括多种杀虫剂或多种杀线虫剂、多种杀真菌剂、多种其它接种剂或多种植物调节剂的组合。对于这些组合处理的合适的杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、接种剂和植物调节剂包括以上鉴定的那些。这些组合物在种子处理时以单一组合物的形式呈现。相反，用于种子处理的系统可涉及多种处理，例如在一种处理中使用含所述肽的组合物而在不同的处理中使用含所述一种或多种杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、植物调节剂和/或杀菌剂的组合物。在后一种实施方案中，这两种处理在大约相同的时间，即种植之前或大约种植时进行。
[0516] 一个此类实例包括本发明的一种或多种肽，包括(但不限于)肽p4-14s-9a(SEQ ID NO:57)、p4-14s-12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14-22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1-29(SEQ ID NO:130)和p4-14S-16S(SEQ ID NO:55)中的一个或多个，联合可从Bayer Crop Science获得的PonchoTM(噻虫胺)，可从Bayer Crop Science获得的PonchoTM VOTiVO(噻虫胺和坚强芽孢杆菌生物杀线虫剂)及可从Bayer Crop Science获得的GauchoTM(吡虫啉)中的一个。
[0517] 另一个实例包括本发明的一种或多种肽，包括(但不限于)肽p4-14s-9a(SEQ ID NO:57)、p4-14s-12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14-22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1-29(SEQ ID NO:130)和p4-14S-16S(SEQ ID NO:55)中的一个或多个，联合可从Syngenta获得的CruiserTM(噻虫嗪)，可从Syngenta获得的CruiserMaxxTM(噻虫嗪、精甲霜灵和咯菌腈)，可从Syngenta获得的Cruiser ExtremeTM(噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈和嘧菌酯)，可从Syngenta获得的AvictaTM(噻虫嗪和阿维菌素)，和可从Syngenta获得的AvictaTM Complete(噻虫嗪、阿维菌素和含有先正达巴斯德杆菌(Pasteuria TM
nishizawae)–Pn1的Clariva Complete 生物接种剂)，及可从Syngenta获得的Avicta CompleteTM Corn(噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈、嘧菌酯、噻苯咪唑和阿维菌素)中的一个。
[0518] 另一个实例包括本发明的一种或多种肽，包括(但不限于)肽p4-14s-9a(SEQ ID NO:57)、p4-14s-12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14-22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1-29(SEQ ID NO:130)和p4-14S-16S(SEQ ID NO:55)中的一个或多个，联合可从BASF获得的Vault Liquid plus Integral(慢生根瘤菌物种和枯草芽孢杆菌菌株MBI 600接种剂)，可从BASF获得的Vault NP(慢生型大豆根瘤菌接种剂)和可从BASF获得的Subtilex NG(枯草芽孢杆菌生物接种剂)中的一个。
[0519] 本发明还涉及赋予植物抗病性，增强植物生长，实现害虫防治(包括昆虫和线虫)，赋予植物生物或非生物胁迫耐受性，和/或调节植物生物化学信号传导的方法。这些方法涉及向植物或植物种子或所述植物生长或预期生长的场所施用有效量的本发明的分离的肽或本发明的组合物。由于这样施用，肽
接触植物或植物种子的细胞，并且在植物或由植物种子长成的植物中诱导抗病性、生长增强、对生物胁迫的耐受性、对非生物胁迫的耐受性或改变的生物化学信号传导。可选地，可将本发明的肽或组合物施用给植物，使得从此类植物本身回收的种子能够在植物中赋予抗病性，增强植物生长，影响昆虫防治，赋予对生物或非生物胁迫的耐受性，和/或调节生物化学信号传导。
[0520] 在这些实施方案中，也可能选择向其施用了本发明的分离的肽或组合物的植物或植物种子或场所。例如，对于已知含有高线虫含量的田地，可通过施用如本文所述的本发明的分离的肽或组合物选择性地处理要在此类田地生长的植物或植物种子或该田地(场所)；而对于在含有低线虫含量的田地中生长的植物或植物种子，没有此类处理可能是必要的。
类似地，对于
灌溉减少的田地，可通过施用如本文所述的本发明的分离的肽或组合物选择性地处理要在此类田地生长的植物或植物种子或该田地(场所)；而对于在灌溉充足的田地中生长的植物或植物种子，没有此类处理可能是必要的。同样，对于易发洪水的田地，可通过施用如本文所述的本发明的分离的肽或组合物选择性地处理要在此类田地生长的植物或植物种子或该田地(场所)；而对于在不易发洪水的田地中生长的植物或植物种子，没有此类处理可能是必要的。作为此类选择的再一个实例，对于在生长季节的某些时间易受昆虫攻击的田地，可通过施用如本文所述的本发明的分离的肽或组合物选择性地处理要在此类田地生长的植物或植物种子或该田地(场所)；而相同田地在生长季节的无效时间可以不处理或不易受此类攻击的其它田地可不经处理。此类选择步骤可以在实践本文所述的每种使用方法，即赋予植物抗病性，增强植物生长，实现害虫防治(包括昆虫和线虫)，赋予植物生物或非生物胁迫耐受性，和/或调节植物生物化学信号传导时执行。
[0521] 作为向植物或植物种子施用分离的肽或含有分离的肽的组合物以便赋予植物抗病性，实现植物生长，防治昆虫，赋予植物或由种子长成的植物胁迫抗性和/或调节的生物化学信号传导的替代方案，可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这涉及提供经编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物并且使植物在有效地容许该DNA分子赋予植物抗病性，增强植物生长，防治昆虫，和/或赋予对生物或非生物胁迫的耐受性的条件下生长。可选地，可以提供经编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物种子并种植在土壤中。然后在有效地容许该DNA分子表达所述肽并从而赋予转基因植物抗病性，增强植物生长，防治昆虫，和/或赋予对生物或非生物胁迫的耐受性的条件下由种植的种子繁殖植物。
[0522] 在这些实施方案中，也可能选择转基因植物或植物种子用于实现本发明。例如，对于已知含有高线虫含量的田地，可选择性地使转基因植物或植物种子在此类田地中生长；而非转基因植物或植物种子可在含有低线虫含量的田地中生长。类似地，对于灌溉减少的田地，可选择性地使转基因植物或植物种子在此类田地中生长；而非转基因植物或植物种子可在灌溉充足的田地中生长。同样，对于易发洪水的田地，可使转基因植物或植物种子在此类田地中生长；而非转基因植物或植物种子可在不易发洪水的田地中生长。作为此类选择的再一个实例，对于在生长季节的某些时间易受昆虫攻击的田地，可选择性地使转基因植物或植物种子在此类田地中生长；而非转基因植物或植物种子可在不易受此类昆虫攻击的田地中生长。此类选择步骤可以在实践本文所述的每种使用方法，即赋予植物抗病性，增强植物生长，实现害虫防治(包括昆虫和线虫)，赋予植物生物或非生物胁迫耐受性，和/或调节植物生物化学信号传导时执行。
[0523] 本发明还涉及提高取自观赏植物的插条的抗干燥性，从植物采收的水果或蔬菜的采后抗病性或抗干燥性，和/或对于从植物采收的水果或蔬菜提高水果或蔬菜成熟寿命的方法。这些方法涉及向植物或植物生长的场所施用有效量的本发明的分离的肽或根据本发明的组合物。由于这样施用，肽接触植物或植物种子的细胞，并且对取自观赏植物的插条诱导抗干燥性，对从植物采收的水果或蔬菜诱导采后抗病性或抗干燥性，和/或对从植物采收的水果或蔬菜诱导提高的水果或蔬菜成熟寿命。可选地，可向采收的水果或蔬菜施用有效量的本发明的分离的肽或根据本发明的组合物。由于这样施用，肽接触采收的水果或蔬菜的细胞，并且对经处理的水果或蔬菜诱导采后抗病性或抗干燥性，和/或对经处理的水果或蔬菜诱导提高的水果或蔬菜成熟寿命。
[0524] 在这些实施方案中，也可能选择向其施用了本发明的分离的肽或组合物的植物、插条、水果、蔬菜或场所。例如，对于远距离运输或长期贮存的采收的插条或水果或蔬菜，那么这些可通过施用如本文所述的本发明的分离的肽或组合物选择性地处理；而本地运输且有意用于消费而大体上无贮存期的采收的插条或水果或蔬菜可从此类处理中排除。
[0525] 作为向植物或植物种子施用分离的肽或含有分离的肽的组合物以便对取自观赏植物的插条诱导抗干燥性，对从植物采收的水果或蔬菜诱导采后抗病性或抗干燥性，和/或对从植物采收的水果或蔬菜诱导提高的水果或蔬菜成熟寿命的替代方案，可利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这涉及提供经编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物并且使植物在有效地容许该DNA分子对取自观赏植物的插条诱导抗干燥性，对从转基因植物采收的水果或蔬菜诱导采后抗病性或抗干燥性，和/或对从转基因植物采收的水果或蔬菜诱导提高的水果或蔬菜成熟寿命的条件下生长。可选地，可以提供经编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物种子并种植在土壤中。然后在有效地容许该DNA分子表达所述肽并从而对取自观赏植物的插条诱导抗干燥性，对从转基因植物采收的水果或蔬菜诱导采后抗病性或抗干燥性，和/或对从转基因植物采收的水果或蔬菜诱导提高的水果或蔬菜成熟寿命的条件下由种植的种子繁殖植物。
[0526] 在这些实施方案中，也可能选择转基因植物或植物种子用于实现本发明。例如，当已知有意在采收后远距离运输或长期贮存采收的插条或水果或蔬菜时，可以选择转基因植物或植物种子用于生长；而当已知有意本地运输和/或消费采收的插条或水果或蔬菜，大体上无贮存期时，可以选择非转基因植物或植物种子用于生长。
[0527] 合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物，包括农业、造林、观赏和园艺植物，无论是天然的还是经遗传修饰形式。示例性植物包括但不限于苜蓿、苹果树、杏树、芦笋、鳄梨树、香蕉树、
大麦、豆类、山毛榉(山毛榉属种(Fagus spec.))、秋海棠、桦树、黑莓、
蓝莓、甘蓝、樟脑、芥花、胡萝卜、蓖麻、樱桃树、肉桂树、柑橘树、可可豆、咖啡、玉米、
棉花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、
饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草(geranium)、葡萄、落花生、大麻、
啤酒花(hop)、唐棣(juneberry)、芥菜(芥菜型油菜(Brassica juncea))、黄麻、扁豆、莴苣、亚麻籽、甜瓜、芥末、油桃、橡树、燕麦、油棕、
油籽油菜、橄榄、洋葱、辣椒、豌豆、桃树、梨树、天竺葵(pelargonium)、胡椒、矮牵牛、松树(松属种(Pinus spec.))、李树、杨树(杨属种(Populus spec.))、仁果、马铃薯、油菜、覆盆子、水稻、
橡胶树、黑麦、
高粱、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、
糖用甜菜、
甘蔗、向日葵、茶树、柚木、
烟草、西红柿、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属(Salix spec.))、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲堇(Saintpaulia)、一品红(poinsettia)、菊花(chrysanthemum)、康乃馨(carnation)和百日菊(zinnia)。
[0528] 对于改变的生物化学信号传导，这包括某些植物生物化学途径的增强和某些其它植物生物化学途径的减弱。可根据本发明改变的生物化学信号传导途径包括基因表达和蛋白质生成、代谢产物的生成及
信号分子/次生代谢产物的生成。示例性的生物化学信号传导途径及其改变包括但不限于诱导一氧化氮生成、过氧化物生成和其它次生代谢产物；乙烯信号传导途径的激动和诱导乙烯应答基因表达(参见Dong等，Plant Phys.136:3628-3638(2004)；Li等，Planta 239:831-46(2014)；Chang等，PLoS One 10,e0125498(2015)，其各自据此通过引用整体并入)；水杨酸信号传导途径的激动和诱导水杨酸应答基因表达(参见Dong等，Plant J.20:207-215(1999)，其据此通过引用整体并入)；脱落酸途径的激动和诱导脱落酸应答基因表达(参见Dong等，Planta 221:313-327(2005)，其据此通过引用整体并入)；赤霉素信号传导途径的激动和诱导赤霉素应答基因表达(参见Li等，Planta 239:831-46(2014)，其据此通过引用整体并入)；茉莉酸信号传导的拮抗和抑制茉莉酸应答基因表达(参见Dong等，Plant Phys.136:3628-3638(2004)，其据此通过引用整体并入)；诱导蛋白酶抑制剂表达(参见Laluk和Mengiste，Plant J.68:480-494(2011)；Xia等，Chin.Sci.Bull
56:2351-2358(2011)，其各自据此通过引用整体并入)；诱导植物组织中的
活性氧生成；诱导免疫相关和抗微生物肽生成，例如但不限于过氧化物酶、超氧化物歧化酶、几丁质酶和β-
1,3-葡聚糖酶(Wang等，J.Agric.Food Chem.59:12527-12533(2011)，其据此通过引用整体并入)；及诱导扩展蛋白基因表达和生成(参见Li等，Planta 239:831-46(2014)，其据此通过引用整体并入)。
[0529] 对于抗病性，可能不会授予针对感染的绝对免疫力，但降低了
疾病的严重程度并且延迟了症状发展。病变数量、病变大小和真菌病原体孢子形成的范围全部减小。这种赋予抗病性的方法具有
治疗先前无法治疗的疾病，治疗由于
费用而不能单独治疗的系统性疾病，并避免使用传染剂或环境有害物质的潜力。
[0530] 根据本发明赋予
植物病原体抗性的方法用于赋予对各种病原体包括病毒、细菌和真菌的抗性。尤其对以下病毒的抗性可以通过本发明的方法实现：烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明还可以赋予植物尤其是对以下细菌的抗性：致病性假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)、致病性欧文氏菌属种(Erwinia spp.)、致病性黄杆菌属种(Xanthomonas spp.)和致病性罗尔斯顿菌属种(Ralstonia spp.)。可通过使用本发明的方法使植物尤其抗以下真菌：镰刀菌属种(Fusarium spp.)和疫病菌属种(Phytophthora spp.)。
[0531] 关于本发明的肽或组合物用于增强植物生长的用途，可以实现各种形式的植物生长增强或促进。这可以早在由种子开始植物生长时或稍后在植物寿命期间发生。例如，根据本发明的植物生长涵盖产量更高、植物活力增强、
幼苗(即，萌芽后)活力增强、植物重量增加、生物量增加、每株植物的花数增加、粮食和/或水果产量更高、种子产量增加、萌芽种子百分比增加、萌芽速度增加、植物大小增加、植物高度减小(对于小麦而言)、生物量更高、果实更多且更大、果实着色更早、发芽、果实和植物成熟更早、分蘖或侧枝更多、叶片更大、叶片衰老延迟、枝条生长增加、根部生长增加、根/枝条分配改变、蛋白质含量增加、含油量增加、
碳水化合物含量增加、色素含量增加、叶绿素含量增加、总光合作用增加、光合作用效率增加、呼吸减少(O2用量更低)、对降低产量的处理的补偿、茎耐久性(和对茎倒伏的抗性)增强、根耐久性(和对根倒伏的抗性)增强、低光条件下的植物生长更佳及其组合。因此，本发明为种植者提供了显著的经济效益。例如，早萌芽和早熟容许作物在短的生长季节会另外妨碍其在该地的生长的区域中生长。种子萌芽百分比增加引起作物群体(crop stands)改良和种子使用更有效。更高的产量、增加的大小和增强的
生物质产量允许由给定的一块土地产生更大的收益。
[0532] 关于本发明的肽或组合物用于防治害虫(包括但不限于为生物胁迫因素的昆虫和线虫)的用途，此类害虫防治涵盖防止害虫接触已经施用了本发明的肽或组合物的植物，通过喂食损伤防止对植物的直接伤害，使害虫远离此类植物，杀灭靠近此类植物的害虫，干扰以此类植物为食的昆虫幼虫，防止昆虫定殖于
宿主植物，防止定殖昆虫释放
植物毒素，干扰宿主植物上的产卵，等等。本发明还防止由害虫感染引起的对植物的后续病害。
[0533] 本发明对各种昆虫(生物胁迫因素)有效。欧洲玉米螟(European corn borer)是玉米(马齿玉米和甜玉米)的主要害虫，但也以200多种植物种类为食，包括青豆、蜡豆和菜豆及食用大豆、胡椒、马铃薯和西红柿加上许多杂草种类。另外的损伤各种蔬菜作物的昆虫幼虫喂食害虫包括以下：甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、棉铃虫、草地粘虫、
小菜蛾、甘蓝根蛆、葱蛆、种蝇、泡菜虫(瓜虫)、胡椒蛆和番茄蠹蛾。总的来说，这类虫害代表对于全世界蔬菜生产最具经济重要性的一类害虫。本发明对线虫(另一类具经济重要性的生物胁迫因素)也有效。大豆异皮线虫(大豆孢囊线虫(Heterodera glycines))是大豆的主要害虫。肾形线虫(肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis))是棉花的主要害虫，同样可以寄生于另外的作物种类，尤其是大豆和玉米。另外的线虫类害虫包括根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫(特别是在玉米、小麦和大麦中)、异皮线虫属(Heterodera)的禾谷孢囊线虫(特别是在大豆、小麦和大麦中)、短体线虫属(Pratylenchus)的根腐线虫、粒线虫属(Anguina)的种瘿线虫(seed gall nematodes)(特别是在小麦、大麦和黑麦中)及茎线虫属(Ditylenchus)的茎线虫。其它生物胁迫因素包括蜘蛛类、杂草及其组合。
[0534] 关于本发明的肽或组合物用于赋予植物非生物胁迫抗性的用途，此类非生物胁迫涵盖对植物生理和发育有不利影响的任何环境因素。此类
环境胁迫的实例包括
气候相关的胁迫(例如，干燥、洪水、霜冻、低温、高温、过度光照和光照不足)、空气污染胁迫(例如，二氧化碳、
一氧化碳、二氧化硫、NOx、碳氢化合物、臭氧、紫外线
辐射、酸雨)、化学药品(例如，杀虫剂、杀真菌剂、除草剂、重金属)、营养胁迫(例如，肥料、微量营养素、大量营养素，特别是钾、氮衍生物和磷衍生物过多或不足)和对伤害的改善的愈合反应。使用本发明的肽赋予植物针对此类形式的环境胁迫的抗性。
[0535] 本发明的另一方面涉及本发明的肽作为安全剂联合一种或多种活性剂(即，在组合物中或在分开的组合物中)用于防治
水体中的水草的用途，如Mann的美国公布第20150218099号所述，其据此通过引用整体并入。
[0536] 本发明的再一个方面涉及本发明的肽在用于向在水灌溉减少的条件下生长的植物施用的组合物中作为植物强化剂的用途，所述组合物还包括至少一种抗
氧化剂和至少一种辐射管理剂，及任选地至少一种
植物生长调节剂，如Rees等的美国公布第20130116119号所述，其据此通过引用整体并入。
[0537] 当处理所有或部分植物，包括叶、茎、根、繁殖体(例如，插条)、果实等时，可通过多种程序进行本发明的涉及施用肽或组合物的方法。这可能(但不一定)涉及肽向植物中的浸润。合适的施用方法包括高压或低压喷雾、注射和临近进行肽施用时的叶片磨损。处理植物种子时，根据本发明的施用实施方案，可通过低压或高压喷雾、涂布、浸没(例如，浸渍)或注射来施用过敏反应激发子蛋白或多肽。本领域的技术人员可预想到其它合适的施用程序，只要其能够实现过敏反应激发子多肽或蛋白与植物或植物种子细胞的接触。一旦经本发明的肽或组合物处理，就可以将种子种植在天然或人造土壤中并且使用常规程序培育以产生植物。由根据本发明处理的种子繁殖出植物之后，可经一次或多次施用本发明的肽或组合物来处理植物以赋予植物抗病性，增强植物生长，防治植物上的昆虫，赋予生物或非生物胁迫耐受性，提高所取插条的抗干燥性，赋予采收的水果或蔬菜采后抗病性或抗干燥性，和/或对于采收的水果或蔬菜提高的水果或蔬菜成熟寿命。
[0538] 可根据本发明单独地或与其它物质混合向植物或植物种子施用本发明的肽或组合物。可选地，可单独地向植物施用所述肽或组合物，其它物质在不同时间施用。
[0539] 在本发明的涉及使用转基因植物和转基因种子的替代性实施方案中，不需要向植物或种子局部施用本发明的肽。相反，根据本领域公知的程序产生经编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物。适于在植物中表达(即，含有在植物中可操作的翻译和转录控制序列)的载体可通过使用微量移液管直接显微注射到植物细胞中以机械转移重组DNA。Crossway，Mol.Gen.Genetics,202:179-85(1985)，其据此通过引用整体并入。也可以使用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中。Krens等，Nature,296:72-74(1982)，其据此通过引用整体并入。
[0540] 用编码本发明的肽的基因转化植物细胞的另一种方法是对宿主细胞的粒子轰击(也称为基因枪转化)。这可按几种方式之一实现。第一种涉及在细胞处推进惰性或生物活性粒子。这种技术在Sanford等的美国专利第4,945,050、5,036,006和5,100,792中有描述，所述专利据此通过引用并入。通常，这个程序涉及在有效穿透细胞外表面并掺入其内部的条件下在细胞处推进惰性或生物活性粒子。当利用惰性粒子时，可通过为粒子涂上含有异源DNA的载体将载体引入细胞中。可选地，靶细胞可被载体围绕，使得载体通过粒子尾流被带进细胞中。也可将生物活性粒子(例如，含有载体和异源DNA的干燥细菌细胞)推进到植物细胞内。
[0541] 引入的另一种方法为原生质体与其它实体，微细胞、细胞、溶酶体或其它可融脂质表面体的融合。Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:1859-63(1982)，其据此通过引用整体并入 。也可通过电 穿孔将 DNA分子 引入植物 细胞内。F romm等 ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824(1985)，其据此通过引用整体并入。在这种技术中，植物原生质体在含有表达盒的质粒的存在下被电穿孔。高场强的电脉冲可逆地使
生物膜通透，从而允许引入质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并再生。
[0542] 将DNA分子引入植物细胞的另一种方法是使植物细胞感染先前经该基因转化的根癌农杆菌或发根农杆菌(A.rhizogenes)。在本领域已知的适当条件下，使转化的植物细胞生长以形成枝条和根，并进一步发育成植物。通常，这个程序涉及为植物组织接种细菌悬液并在25-28℃下在无抗生素的再生培养基上温育组织48至72小时。农杆菌是革兰氏阴性(gram-negative)家族根瘤菌科的代表属。其种是造成冠瘿(根癌农杆菌)和发根病(发根农杆菌)的原因。冠瘿瘤和发根内的植物细胞经诱导产生称为冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物，其仅被细菌分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的便利来源。另外，对冠瘿碱存在的测定可用于鉴定转化的组织。可借助于根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒，将异源基因序列引入适当的植物细胞中。Ti或Ri质粒在受农杆菌感染时传播到植物细胞并稳定地整合到植物基因组中。J.Schell，Science,237:1176-83(1987)，其据此通过引用整体并入。
[0543] 转化之后，转化的植物细胞必须再生。由培养的原生质体的植物再生在Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures，第1卷：(MacMillan Publishing Co.,New York,1983)；和Nasil I.R.(编)，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Acad.Press,Orlando，第1卷，1984和第Ill卷(1986)中有描述，其据此通过引用整体并入。
[0544] 已知几乎所有植物均可由培养的细胞或组织再生。再生方式因植物种类而不同，但通常首先提供转化原生质体的悬液或装有转化外植体的皮氏培养皿(petri plate)。形成愈伤组织并且可由愈伤组织诱导芽并且随后生根。可选地，可在愈伤组织中诱导胚形成。这些胚与天然胚一样发芽以形成植物。培养基通常会含有各种氨基酸和
激素，如生长素和细胞分裂素。向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是对于诸如玉米和苜蓿等种类而言。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养史。如果控制这三种变量，则再生通常是可重现且可重复的。
[0545] 表达盒稳定地并入转基因植物之后，可以通过有性杂交将其转移到其它植物。根据要杂交的种类，可以使用许多标准育种技术中的任一种。
[0546] 一旦产生这种类型的转基因植物，就可根据常规程序培育植物本身，编码过敏反应激发子的基因的存在产生了抗病性、增强的植物生长、植物上昆虫的防治、非生物或生物胁迫耐受性、所取插条提高的抗干燥性、采收的水果或蔬菜中的采后抗病性或抗干燥性，和/或对于采收的水果或蔬菜提高的水果或蔬菜成熟寿命。
[0547] 可选地，从转基因植物回收转基因种子。然后可将这些种子种植在土壤中并使用常规程序培育以产生转基因植物。在有效赋予植物抗病性，增强植物生长，防治昆虫，赋予非生物或生物胁迫耐受性，提高所取插条的抗干燥性，在采收的水果或蔬菜中赋予采后抗病性或抗干燥性，和/或对于采收的水果或蔬菜赋予提高的水果或蔬菜成熟寿命的条件下，由种植的转基因种子繁殖转基因植物。
[0548] 当根据本发明使用转基因植物和植物种子时，它们另外可用与用于处理施用了本发明的肽或本发明的组合物的植物和种子相同的物质处理。这些其它物质，包括本发明的肽或组合物，可通过以上提到的程序，包括高压或低压喷雾、注射、涂布和浸没向转基因植物和植物种子施用。类似地，在由转基因植物种子繁殖出植物之后，可经一次或多次施用本发明的肽或组合物来处理植物以赋予抗病性，增强生长，防治昆虫，赋予非生物或生物胁迫耐受性，所取插条的抗干燥性，在采收的水果或蔬菜中赋予采后抗病性或抗干燥性，和/或对于采收的水果或蔬菜赋予提高的水果或蔬菜成熟寿命。
[0549] 此类转基因植物也可用常规的植物处理剂，例如如上所述的杀菌剂或杀生剂、蛋白酶抑制剂、非离子型表面活性剂、肥料、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、生物接种剂、植物调节剂及其混合物处理。实施例
[0550] 提供以下实施例以说明本发明的实施方案，但决非旨在限制其范围。
[0551] 实施例1–过敏反应分析
[0552] 测试烟草中的HR，如Wei,Science 257:85-88(1992)中所述，其据此通过引用整体并入。简言之，按500μg/ml的浓度将肽溶于水溶液中。用等体积的水进行四次连续稀释，产生为500、250、125、62.5、31.25μg/ml肽溶液的肽样品。使用5-7周龄(开花前)的红花烟草(Nicotiana tabacum)栽培品种xanthi植物。用牙签在叶面(leaf panel)中部轻轻刺穿叶片。然后经由
无针注射器(needle-less syringe)将肽溶液输注到伤口内，填充叶面。将每种肽样品输注到2株不同植物的叶片中。在接下来的48小时观察叶片并对枯萎和褐变、程序性细胞死亡典型的病变进行评分。
[0553] 对许多肽进行过敏反应测试并且经测定为阴性的。一些肽还有待于测试，在下表18中被设计为“有待测定”或“TBD”，但基于密切相关的肽的结果，预期为HR阴性的。
[0554] 表18：过敏反应结果的总结
[0555]
[0556] 表18：过敏反应结果的总结
[0557]
[0558] TBD＝有待测定
[0559] 实施例2–过氧化物反应分析
[0560] 过氧化氢的三价
铁-二甲酚橙复合物测定(Gay等人,Analytical Biochemistry 273:149-55(1999)，其据此通过引用整体并入)被用于测定植物叶片组织的过氧化物产生。
简言之，通过将10mg硫酸亚铁铵与133uL硫酸与水以1mL总体积混合来制备
试剂A。通过将2g山梨糖醇与9.34mg二甲酚橙在80ml水中混合来制备试剂B。缓慢添加1M
盐酸直到溶液变黄。
然后用水稀释溶液至100mL的总体积，并且保存在4℃下的黑瓶中。
[0561] 将来自烟草植物(生长至6片真叶的植物)或大豆植物(生长至6片真叶的植物)的叶片用于测定中。首先从植物上去除叶片并置于纸巾上。然后使用皮革打孔工具从叶片处去除0.5cm叶组织圆片。接着将这些盘状物置于96孔板的各孔中。将250ml水添加到每个盘状物中。用
石蜡膜
覆盖该板并在黑暗中静置12小时。然后除去过量的水并且再用250uL水洗涤这些孔。随后将洗涤液从孔中除去并且更换为105uL的0.5ug/ml在水或水空白中的肽溶液，一般一式四份。当肽溶解性成问题时，添加pH缓冲剂到空白和肽样品中。将叶盘在
荧光照明下与肽一起培育1小时。将来自每个叶片样品的50ul溶液移到新孔中用于化学分析。
[0562] 在临分析之前，将试剂A和B以1:100比率新混合以产生测定试剂。将200ul此混合物添加到含有50ul叶片处理的溶液的每个孔中。将板在黑暗中培育20分钟并且检测在595nm下的吸光度。使用双尾学生T检验分析结果。结果被分成若干反应类别。XR++表示阳性反应，吸光度>0.05单位，超过阴性对照且学生T检验p<0.05。XR+表示吸光度<0.05单位，超过空白且学生T检验p<0.05。XR弱表示反应>0.02单位，超过阴性对照，且p值不显著。XR-表示阴性对照的吸光度在0.02单位内。应注意，在过氧化物反应方面可存在显著的生物差异，这归因于植物年龄、盘状物在叶片内的位置及其它因素。因此，来自T检验的p值是指导而不是绝对纳入标准。
[0563] 这些研究的结果总结于下表19中：
[0564] 表19：过氧化物反应的总结
[0565]
[0566] 表19：过氧化物反应的总结
[0567]
[0568] 表19：过氧化物反应的总结
[0569]
[0570] ND：未测定
[0571] 一般说来，绝大多数肽在大豆中测试为XR+。然而，烟草更易判别。在HR+序列中具有单一突变的大部分肽在烟草中为XR+。即使第二突变也常造成XR+表型。然而，对p14变体的测试显示三个亮氨酸残基突变为丙氨酸一般导致XR引发的丧失。同样，p15的C末端截短变体(p15-62和p15-63)在烟草中为XR-。
[0572] 实施例3–根和枝条生长分析
[0573] 测试肽对生长资源向枝条(地上)和根(地下)的分配的生物学影响。按0.2、2或5μg/ml将肽溶于总体积100ml的去离子水中。然后将玉米或大豆种子浸泡在肽溶液中一小时。未处理的对照(UTC)植物浸泡在去离子水中。准备300ml透明塑料饮料杯( Dart
Container Corporation)用于种植，在底部画一个十字，将底部分成四等分。然后为杯子填充已筛为1/4”的Sunshine Mix#1土壤(SunGro Horticulture)。向土壤中添加100ml水。然后通过将种子轻轻压入土壤顶部来种植经处理的种子。然后再用50ml松散土壤遮盖种子。
使种子发芽并生长12-14天。
[0574] 按照从土壤到每株植物最高的叶片稍微展开的尖端的距离来测量枝条的长度。将未能发芽或表现出生长萎缩的植物从试验中去除。萎缩定义为在数据收集时缺乏完全展开的真叶或通过眼睛判断展开的真叶<处理组平均叶片面积的1/2。通常每个处理组种植30颗种子并将15-25株植物用于数据收集。
[0575] 通过对初生根跨过杯底的四分之一标记的次数计数来估计根生长。常常沿着杯子底部周长观察到这些，尽管一些沿着容器侧面可见并且被计数好像穿过四分之一线的垂直延伸。这个数字除以4得到根生长指数。发现该指数与测量的总初生根长度(从根部冲洗土壤后并直接测量的所有初生根的长度之和)约90％相关。
[0576] 这些研究的结果总结于下表20中。每个数字表示与未处理的对照值相比的百分比增加。星号表示如由学生T检验所测定，差异是统计上显著的，其中p<0.05。
[0577] 表20：根和枝条生长的总结
[0578]
[0579]
[0580] 增强的根生长(示于p4-14s-16s、p14和p14a中)提高植物的集水能力并且将增强抗旱性和抗涝性。相反，增强的枝条生长(如在p4-14s-9a、p4-14s-20s和p14a大豆中，0.2μg/ml)增强集光性和
能量转化。值得注意的是，p14a可根据剂量造成根或枝条生长的增强。P4-14s-16s引起在资源分配上向根生长的强转移。
[0581] 实施例4–生长试验
[0582] 将大豆种子(或玉米种子，如所示)种植在平地上，温室设施内平地中每个小室2粒种子。使种子发芽并摘去较小的植物，每个小室留下一棵植物。一旦第一片真叶完全展开且第二片叶开始展开，就初始测量植物的高度。这是通过向上拉伸最高的叶片并测量到土壤的距离来进行的。将肽按指定浓度溶于水中(下表21)。然后用广泛可用的喷雾瓶用叶面喷雾处理植物，直至液体从叶片滴落。每种情况(肽或对照)处理6块平地，各14株植物。用水喷雾处理指定的未处理的
对照植物。使植物生长14天。再次测量植物的高度并将其与原始高度进行比较以量化生长。最终，通过去除枝条采集植物(所有地上物质)。对于一些实验，一旦采集便对其称重以测定鲜重(包括水重量)。然后在70℃下干燥枝条72小时，且再次称重以测定干生物量。虽然此方法使用与以上实施例3中相似的量度(生长)，但处理方法不同(种子浸泡对比叶面喷雾)。因此，实验结果可能偏离。
[0583] 表21：生长测量的总结
[0584]
[0585] ND：未测定
[0586] 若干所研究的肽引起生长增强和干生物量的增加(p4-14s-9a、p14、p14a和p14-32)。另外，若干肽与在试验完成时遭受干旱胁迫的UTC植物相比引起水保持的增强。由鲜重>10％增加表示守恒的水含量，如见于p14a和p14-32处理的植物中。生长效应不限于大豆；
一旦用p1-29进行肽处理，玉米也显示出适度的生长益处。
[0587] 显然，合并有截短的C末端的P14-dc4似乎丧失对于p14所观察到的显著生长、干生物量和鲜重益处。通过比较，P14N末端序列的去除(P14a样品)仍引起所有3种量度的增加。
[0588] 实施例5–诱导对烟草花叶病毒的抗性
[0589] 测试肽在烟草中对烟草花叶病毒(TMV)抗性的诱导。简言之，每组(样品和对照)选择三株6-8周龄的烟草植物。遮盖植物最底层的叶片并为植物喷洒水(阴性对照)、肽、或Proact(阳性对照)的溶液。施用喷雾剂，直至叶片完全润湿，以液体从叶片滴落为指示。然后使植物变干并且去除叶片遮盖物。
[0590] 处理三天后，然后为植物先前被遮盖的叶片和对侧的叶片轻轻撒上硅藻土并施用20ul的1.7ug/ml纯化的烟草花叶病毒溶液。然后通过轻轻摩擦溶液和硅藻土穿过叶片表面，使TMV溶液遍布叶片表面。接种两分钟后，用水将硅藻土从叶片上冲洗掉。TMV接种3天后，基于观察到的TMV病变数为叶片评分。还对过敏反应的迹象，包括受影响叶片的变黄和萎蔫，为叶片评分。
[0591] 表22中描述的效力是指在经处理的相对于UTC植物上，TMV病变的减退％。被遮盖叶片上的TMV的减少指示植物中的系统免疫反应，而未遮盖叶片上的减少指示局部反应。星号指示源自T检验的P值<0.05。
[0592] 表22：TMV抗性总结
[0593]
[0594] 表22：TMV抗性总结
[0595]
[0596] 表22：TMV抗性总结
[0597]
[0598] 若干HR阴性肽引起显著的局部和系统反应：P4-14S-9A、P4-14S-17A、P4-14S-12D和P4-14S-16V产生最佳结果。一般说来，大部分肽显示出一定的抗TMV活性。然而，与完整的HR-盒相比具有较大C末端截短的肽(参见2015年10月1日提交的PCT申请PCT/US15/53387，名称为“Hypersensitive Response Elicitor Peptides and Use Thereof”，其据此通过引用整体并入)(例如p4-116、P14-dc4)显示出针对TMV感染的降低的效力。较短的C末端截短一般以稍微较小的比率(50-75％对照)引发TMV抗性。间隔在P4-d10、14、18中的残基的更大破环也显示出针对TMV感染的效力的中度减小。而且，一些亮氨酸位置的突变似乎与较弱的TMV反应有关：P19min-13S、P18min-7D、P18min-11S、P14d-18D、P4-14S-20V、P4-14S-20S、P4-14s-16A。显然，虽然其含有若干疏水性序列，但P25-14显示出对TMV感染的较弱控制。在若干HR引发序列上的重要亮氨酸和异亮氨酸残基的突变的系统研究揭示了，在若干位置处的突变可造成免疫应答的减小。第一疏水性残基(在p14d-7S、p18min-7D和p25-9D中)的突变可对遮盖的叶片造成降低的功效，表明系统免疫应答减小。P15b-12S也在遮盖的叶片中展现系统应答的类似减小。P19min-13S展现不良的免疫激活。可去除最后一个疏水性双联体，其仍允许抗TMV活性(例如在P1-31和P1-111中)。然而，进一步缩短的疏水性序列与针对TMV的活性减小有关，如由P4-116和P14-dc4所证明。
[0599] 在这样描述了本发明的基本概念后，对于本领域的技术人员而言相当显而易见的是，上述详细公开内容旨在仅以举例的方式呈现，而不是限制性的。将出现各种改变、改进和
修改并且是本领域技术人员的意图，尽管本文没有明确说明。这些改变、改进和修改旨在由此提出，并且在本发明的精神和范围内。另外，所列举的处理要素或序列的顺序，或数字、字母或其它名称的使用因此并非旨在将所要求保护的方法限制为除可在
权利要求中指定的任何顺序。因此，本发明仅受以下权利要求及其等同项限制。
