使用过水解酶酶法生产过酸
阅读：308发布：2021-07-11
专利汇可以提供使用过水解酶酶法生产过酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了以下方法，该方法用至少一种具有过 水 解 酶活性的酶，在过 氧 化氢(浓度至少为500mM)存在下，在中性至酸性反应条件下，从合适的 羧酸 酯(包括甘油酯)和/或酰胺底物原位产生浓 过酸 水溶液。所产生的浓过 酸溶液 足以用于各种消毒和/或漂白应用中。，下面是使用过水解酶酶法生产过酸专利的具体信息内容。
1.一种产生浓过酸水溶液的方法，所述方法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少 为500mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催 化剂选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在约2.5至约7.5的pH下组合，由此在 将所述各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生出浓过酸 溶液。
2.权利要求1的方法，其中所述pH为3-7。
3.权利要求2的方法，其中所述pH为4-6.5。
4.权利要求1的方法，其中所述过酸浓溶液的过酸浓度为至少 10ppm。
5.权利要求4的方法，其中所述过酸浓度为至少100ppm。
6.权利要求5的方法，其中所述过酸浓度为至少500ppm。
7.权利要求6的方法，其中所述过酸浓度为至少1000ppm。
8.权利要求7的方法，其中所述过酸浓度为至少5000ppm。
9.权利要求1的方法，其中所述各反应成分包含至少一种脂肪 酶和至少一种选自酯、甘油酯和它们的混合物的底物。
10.权利要求1或9的方法，其中所述至少一种底物是选自以下 的酯底物：乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧 基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯和 它们的混合物。
11.权利要求1或9的方法，其中所述至少一种底物是选自以下 的甘油酯底物：一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁 精、甘油一辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们的混合物。
12.权利要求11的方法，其中所述甘油酯底物选自一醋精、二 醋精、三醋精和它们的混合物。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种酶催化剂是至少一种 由选自以下的属的生物产生的脂肪酶：曲霉属(Aspergillus)、根霉属 (Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、毛霉属(Mucor)、嗜热霉属(Thermomyces)、产碱菌属 (Alcaligenes)和猪属(Sus)。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一种脂肪酶由选自以下 的生物产生：曲霉属、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉属、米根霉 (Rhizopus oryzae)、青霉属I(Penicillium sp.I)、青霉属II(Penicillium sp. II)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、南极假丝酵母(Candida antartica)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、细毛嗜热霉(Thermomyces languinosus)、 米黑毛霉(Mucor miehei)和产碱菌属(Alcaligenes sp.)。
15.权利要求14的方法，其中所述脂肪酶选自曲霉属脂肪酶、 黑曲霉脂肪酶、米根霉脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵 母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、假单胞菌属脂肪酶、洋葱假单 胞菌脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶、细毛嗜热霉脂肪酶、米黑毛霉 脂肪酶、产碱菌属脂肪酶和它们的混合物。
16.权利要求15的方法，其中所述脂肪酶选自BioCatalytics ICR-101曲霉属脂肪酶、BioCatalytics ICR-102根霉属脂肪酶、 BioCatalytics ICR-103米根霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-104青霉属I 脂肪酶、BioCatalytics ICR-105青霉属II脂肪酶、BioCatalytics ICR-106 皱褶假丝酵母脂肪酶、BioCatalytics ICR-107洋葱假单胞菌脂肪酶、 BioCatalytics ICR-108假单胞菌属脂肪酶、BioCatalytics ICR-109荧光 假单胞菌脂肪酶、BioCatalytics ICR-110南极假丝酵母脂肪酶B、 BioCatalytics ICR-111假丝酵母属脂肪酶、BioCatalytics ICR-112南极 假丝酵母脂肪酶A、BioCatalytics ICR-113假单胞菌属脂肪酶、 BioCatalytics ICR-114猪胰腺脂肪酶、BioCatalytics ICR-115细毛嗜 热霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-116米黑毛霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-117产碱菌属脂肪酶、BioCatalytics IMB-111固定化南极假丝酵 母脂肪酶B、Amano脂肪酶AY30皱褶假丝酵母脂肪酶、Amano脂 肪酶R娄地青霉脂肪酶、Amano脂肪酶F-AP15米根霉脂肪酶、Amano 脂肪酶M10爪哇毛霉脂肪酶、Amano脂肪酶A12黑曲霉脂肪酶、 Amano脂肪酶G50卡门柏青霉脂肪酶、Amano F-DS米根霉脂肪酶、 Amano DS黑曲霉脂肪酶、Novozym CALB L南极假丝酵母脂肪酶 B、Novozym 435固定化南极假丝酵母脂肪酶B和Novozym Palatase 20000L米曲霉脂肪酶、Lipozyme TL细毛嗜热霉脂肪酶、Chirazyme L2 南极假丝酵母脂肪酶B、Validase AN黑曲霉脂肪酶、Dietrenz CR皱 褶假丝酵母脂肪酶、Enzeco MLC黑曲霉脂肪酶和它们的混合物。
17.权利要求15的方法，其中所述脂肪酶选自南极假丝酵母脂 肪酶B和黑曲霉脂肪酶。
18.权利要求1的方法，其中所述至少一种酶催化剂是至少一种 蛋白酶。
19.权利要求18的方法，其中所述至少一种底物选自酯、甘油 酯和它们的混合物。
20.权利要求19的方法，其中所述底物是选自以下的酯底物： 乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、 甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯和它们的混合物。
21.权利要求19的方法，其中所述底物是选自以下的甘油酯底 物：一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、甘油一 辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们的混合物。
22.权利要求21的方法，其中所述甘油酯底物选自一醋精、二 醋精、三醋精和它们的混合物。
23.权利要求18的方法，其中所述至少一种底物是选自乙酰胺、 二乙酰胺及乙酰胺和二乙酰胺混合物的酰胺。
24.权利要求18的方法，其中所述至少一种蛋白酶由选自以下 的属的生物产生：曲霉属、根霉属、芽孢杆菌属(Bacillus)、番木瓜属 (Carica)、凤梨属(Ananas)、链霉菌属、麦轴霉属(Tritirachium)和猪属。
25.权利要求24的方法，其中所述蛋白酶由选自以下的生物产 生：斋滕曲霉(Aspergillus saitoi)、米根霉属、芽孢杆菌属、枯草芽孢 杆菌、野猪(Sus scrota)、番木瓜(Carica papaya)、菠萝(Ananas comosus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和白色麦轴霉(Tritirachium album)。
26.权利要求25的方法，其中所述蛋白酶选自斋滕曲霉XIII型 蛋白酶、米根霉属XVIII型蛋白酶、芽孢杆菌属蛋白酶、野猪胃蛋白 酶、番木瓜的木瓜凝乳蛋白酶、番木瓜的木瓜蛋白酶、菠萝的菠萝 蛋白酶、灰色链霉菌的链霉蛋白酶、白色麦轴霉蛋白酶K和它们的 混合物。
27.权利要求26的方法，其中所述蛋白酶选自灰色链霉菌的链 霉蛋白酶、白色麦轴霉蛋白酶K和它们的混合物。
28.权利要求18的方法，其中所述至少一种蛋白酶具有朊病毒 降解活性和过水解酶活性。
29.权利要求1的方法，其中所述各反应成分包含至少一种脂肪 酶和至少一种朊病毒降解蛋白酶。
30.权利要求29的方法，其中所述朊病毒降解蛋白酶选自蛋白 酶K、链霉蛋白酶和它们的混合物。
31.权利要求1的方法，其中所产生的所述过酸选自过乙酸、过 丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过β-羟基丁酸、过辛酸 和它们的混合物。
32.权利要求31的方法，其中所述过酸是过乙酸。
33.一种消毒具有一定浓度微生物或病毒或其组合的部位的方 法，所述方法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少 为500mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催 化剂选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在约2.5至约7.5的pH下组合，由此在 将所述各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内形成过酸浓度 为至少10ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释所述过酸水溶液；
d)使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液接触，由 此使得所述微生物的浓度减少至少3个对数级。
34.权利要求33的方法，其中在将所述各反应成分组合后约48 小时内，使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液接触。
35.权利要求34的方法，其中在将所述各反应成分组合后约24 小时内，使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液接触。
36.权利要求33的方法，其中所述微生物的浓度减少至少6个 对数级。
37.权利要求33的方法，其中所述pH为3-7。
38.权利要求37的方法，其中所述pH为4-6.5。
39.权利要求33的方法，其中所述过酸浓度为至少100ppm。
40.权利要求39的方法，其中所述过酸浓度为至少500ppm。
41.权利要求40的方法，其中所述过酸浓度为至少1000ppm。
42.权利要求41的方法，其中所述过酸浓度为至少5000ppm。
43.权利要求33的方法，其中所述各反应成分包含至少一种脂 肪酶和至少一种选自酯、甘油酯和它们的混合物的底物。
44.权利要求33或43的方法，其中所述至少一种底物是选自以 下的酯底物：乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲 氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯 和它们的混合物。
45.权利要求33或43的方法，其中所述至少一种底物是选自以 下的甘油酯底物：一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三 丁精、甘油一辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们的混合 物。
46.权利要求45的方法，其中所述甘油酯底物选自一醋精、二 醋精、三醋精和它们的混合物。
47.权利要求33的方法，其中所述至少一种酶催化剂是至少一 种由选自以下的属的生物产生的脂肪酶：曲霉属、根霉属、青霉属、 假丝酵母属、假单胞菌属、毛霉属、嗜热霉属、产碱菌属和猪属。
48.权利要求47的方法，其中所述至少一种脂肪酶由选自以下 的生物产生：曲霉属、黑曲霉、根霉属、米根霉、青霉属I、青霉属 II、皱褶假丝酵母、南极假丝酵母、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、 细毛嗜热霉、米黑毛霉和产碱菌属。
49.权利要求48的方法，其中所述至少一种脂肪酶选自曲霉属 脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、米根霉脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、南 极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、假单胞菌属脂肪酶、 洋葱假单胞菌脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶、细毛嗜热霉脂肪酶、 米黑毛霉脂肪酶、产碱菌属脂肪酶和它们的混合物。
50.权利要求49的方法，其中所述脂肪酶选自BioCatalytics ICR-101曲霉属脂肪酶、BioCatalytics ICR-102根霉属脂肪酶、 BioCatalytics ICR-103米根霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-104青霉属I 脂肪酶、BioCatalytics ICR-105青霉属II脂肪酶、BioCatalytics ICR-106 皱褶假丝酵母脂肪酶、BioCatalytics ICR-107洋葱假单胞菌脂肪酶、 BioCatalytics ICR-108假单胞菌属脂肪酶、BioCatalytics ICR-109荧光 假单胞菌脂肪酶、BioCatalytics ICR-110南极假丝酵母脂肪酶B、 BioCatalytics ICR-111假丝酵母属脂肪酶、BioCatalytics ICR-112南极 假丝酵母脂肪酶A、BioCatalytics ICR-113假单胞菌属脂肪酶、 BioCatalytics ICR-114猪胰腺脂肪酶、BioCatalytics ICR-115细毛嗜 热霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-116米黑毛霉脂肪酶、BioCatalytics ICR-117产碱菌属脂肪酶、BioCatalytics IMB-111固定化南极假丝酵 母脂肪酶B、Amano脂肪酶AY30皱褶假丝酵母脂肪酶、Amano脂 肪酶R娄地青霉脂肪酶、Amano脂肪酶F-AP15米根霉脂肪酶、Amano 脂肪酶M10爪哇毛霉脂肪酶、Amano脂肪酶A12黑曲霉脂肪酶、 Amano脂肪酶G50卡门柏青霉脂肪酶、Amano F-DS米根霉脂肪酶、 Amano DS黑曲霉脂肪酶、Novozym CALB L南极假丝酵母脂肪酶 B、Novozym 435固定化南极假丝酵母脂肪酶B和Novozym Palatase 20000L米曲霉脂肪酶、Lipozyme TL细毛嗜热霉脂肪酶、Chirazyme L2 南极假丝酵母脂肪酶B、Validase AN黑曲霉脂肪酶、Dietrenz CR皱 褶假丝酵母脂肪酶、Enzeco MLC黑曲霉脂肪酶和它们的混合物。
51.权利要求49的方法，其中所述至少一种脂肪酶选自南极假 丝酵母脂肪酶B和黑曲霉脂肪酶。
52.权利要求33的方法，其中所述酶催化剂是至少一种蛋白酶。
53.权利要求52的方法，其中所述底物是至少一种选自乙酰胺、 二乙酰胺及乙酰胺和二乙酰胺混合物的酰胺底物。
54.权利要求52的方法，其中所述底物是至少一种选自以下的 甘油酯底物：一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、 甘油一辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们的混合物。
55.权利要求54的方法，其中所述至少一种甘油酯底物选自一 醋精、二醋精、三醋精和它们的混合物。
56.权利要求52的方法，其中所述至少一种蛋白酶由选自以下 的属的生物产生：曲霉属、根霉属、芽孢杆菌属、番木瓜属、凤梨 属、链霉菌属、麦轴霉属和猪属。
57.权利要求56的方法，其中所述至少一种蛋白酶由选自以下 的生物产生：斋滕曲霉、米根霉属、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、 野猪、番木瓜、菠萝、灰色链霉菌和白色麦轴霉。
58.权利要求57的方法，其中所述至少一种蛋白酶选自斋滕曲 霉XIII型蛋白酶、米根霉属XVIII型蛋白酶、芽孢杆菌属蛋白酶、 野猪胃蛋白酶、番木瓜的木瓜凝乳蛋白酶、番木瓜的木瓜蛋白酶、 菠萝的菠萝蛋白酶、灰色链霉菌的链霉蛋白酶、白色麦轴霉蛋白酶 K和它们的混合物。
59.权利要求58的方法，其中所述至少一种蛋白酶选自灰色链 霉菌的链霉蛋白酶、白色麦轴霉蛋白酶K和它们的混合物。
60.权利要求52的方法，其中所述至少一种蛋白酶具有朊病毒 降解活性和过水解酶活性。
61.权利要求33的方法，其中所述各反应成分包含至少一种脂 肪酶和至少一种朊病毒降解蛋白酶。
62.权利要求61的方法，其中所述各反应成分包含至少一种脂 肪酶和至少一种选自蛋白酶K、链霉蛋白酶和其混合物的朊病毒降 解蛋白酶。
63.权利要求33的方法，其中所产生的所述过酸选自过乙酸、 过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过β-羟基丁酸、过辛 酸和它们的混合物。
64.权利要求63的方法，其中所述过酸是过乙酸。
65.一种对污染一种或多种包括传染性朊病毒或朊病毒颗粒的病 原体的部位进行净化或消毒的方法，所述方法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链 或支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至 少为500mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶 催化剂选自脂肪酶、蛋白酶和它们的混合物；
4)至少一种朊病毒降解蛋白酶，其中一种或多种所述朊 病毒降解蛋白酶可与(a)(3)中提供过水解酶活性的酶催化剂相同；
b)将所述各反应成分在2.5-7.5的pH下组合，由此在将所 述各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生过酸浓度为至 少10ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释步骤(b)中所产生的所述过酸溶液；
d)使污染微生物、病毒、朊病毒或朊病毒颗粒或其组合的 部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触，由此消毒所述部 位，降解所述朊病毒颗粒。
66.权利要求65的方法，其中在将所述各反应成分组合后约48 小时内，使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液接触。
67.权利要求66的方法，其中在将所述各反应成分组合后约24 小时内，使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液接触。
68.权利要求65的方法，其中所述pH为3-7。
69.权利要求66的方法，其中所述pH为4-6.5。
70.权利要求65的方法，其中所述过酸浓度为至少100ppm。
71.权利要求70的方法，其中所述过酸浓度为至少500ppm。
72.权利要求71的方法，其中所述过酸浓度为至少1000ppm。
73.权利要求72的方法，其中所述过酸浓度为至少5000ppm。
74.权利要求65的方法，其中所述各反应成分还包含至少一种 表面活性剂。
75.权利要求74的方法，其中所述至少一种表面活性剂是十二 烷基硫酸钠。
76.权利要求65的方法，所述方法还包括将所述部位与至少一 种表面活性剂接触的步骤。
77.权利要求65、74或76中任一项的方法，其中所述方法还包 括在将所述部位与所述过酸水溶液接触之前或之后，将所述部位加 热到至少80℃的温度保持至少1分钟至48小时的时间的步骤。
78.权利要求1的方法原位产生的浓过酸溶液，其中所述溶液包 含至少一种适合于朊病毒降解的蛋白酶。
79.一种多功能消毒剂组合物，所述组合物包含由权利要求1的 方法产生的浓过酸溶液，其中所述组合物适合于朊病毒降解、适合 用作杀生物剂、适合用作杀病毒剂或它们的组合。
发明领域
本发明涉及有机过酸合成和酶催化领域。
发明背景
过酸已在多种应用中被用于消毒。美国专利第6,545,047 B1号 描述了用含有一种或多种过酸的抗微生物组合物对动物畜体进行卫 生处理的方法。美国专利第6,183,807 B1号描述了用含有一种或多种 过酸的抗微生物组合物对肉制品进行清洁和卫生处理的方法。美国 专利第6,183,807 B2号描述了通过口服给予有效量的过酸来控制动物 胃肠道中微生物群的方法。美国专利申请出版物第20030026846 A1 号描述了使用过酸/酸组合物来控制活植物组织上的病原生物的方 法。美国专利第5,683,724号描述了防止用于传送或加工食物产品和 包装食品的水流(aqueous stream)中微生物生长的方法，该方法使用有 效抗微生物浓度的过酸。
过酸可通过羧酸与过氧化氢的化学反应来制备(参见Organic Peroxides，Daniel Swern(编辑)，第1卷第313-516页；Wiley Interscience， New York)。该反应往往通过强无机酸如浓硫酸催化。过氧化氢与羧 酸的反应是一个平衡反应，使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸或者 除去水来有利于过酸的生产。该用于过酸生产的化学反应有几个缺 点：1)用以促成过酸生产的高浓度羧酸可导致使用含过酸溶液时的不 适宜气味，2)过酸在溶液中随时间推移往往不稳定，在使用前的储藏 过程中溶液中的过酸浓度会降低，3)由于使用了浓硫酸作为催化剂， 配方往往呈强酸性。克服过酸化学生产的缺点的一种方法是采用酶 催化剂代替强酸催化剂。酶催化剂的使用使得可以在使用时快速生 产出过酸，避免了储藏过酸溶液的问题和使用化学法生产的所含过 酸浓度未知的过酸溶液的问题。通常通过与过氧化氢的直接化学反 应用于生产过酸的高浓度羧酸，对于过酸的酶法生产是不需要的， 在酶法生产中酶催化的反应可使用羧酸酯或酰胺作为底物，其浓度 比通常在化学反应中所用的要低得多。酶反应可在很大pH范围内进 行，这取决于给定pH下的酶活性和稳定性以及给定pH下过水解酶 的底物特异性。
酶能催化酯和酰胺的过水解(perhydrolysis)产生相应的过氧羧酸 (方程式1和2)，但是，大多数已知的使用酶催化剂从相应羧酸酯或 酰胺制备过酸的方法，其所产生和积累的过酸都达不到各种应用中 有效消毒的足够高浓度。
方程式1.
RAC(O)ORB 无机过氧化物脂肪酶、酯酶或蛋白酶 RA-C(O)OOH+HORB
方程式2.
RAC(O)NRBRC 无机过氧化物蛋白酶 RA-C(O)OOH+HNRBRC
将过氧化氢用作羧酸酯或酰胺的酶促过水解的酶底物会有问 题，因为已知过氧化氢会氧化性地使多种酶失活(M.R.Gray，Biotech Adv.，7：527(1989))。K.Kleppe(Biochemistry，5：139(1966))报道说，过 氧化氢通过修饰蛋白质中的某些氨基酸残基来使酶失活，其中在酸 性pH值下甲硫氨酸容易被氧化呈甲硫氨酸亚砜，在碱性pH值下色 氨酸被破坏。D.A.Estell等(J.Biol.Chem.，260：6518(1985))描述了过 氧化氢对含有甲硫氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的酶的失活作用， 证明分别用0.1M或1.0M过氧化氢不到6分钟或4分钟就使解淀粉 芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的枯草杆菌蛋白酶＞80％失活。 M.B.Arnao等(Biochim.Biophys.Acta，1041：43(1990))报道了5mM- 50mM过氧化氢对过氧化物酶的失活作用，B.Valderrama等 (Chemistry & Biology，9：555(2002))综述了氧化物质如过氧化氢对过氧 化物酶的失活作用。P.F.Greenfield等(Anal.Biochem.，65：109 (1975)) 报道了过氧化氢浓度增加会导致葡糖氧化酶的失活增加。对于头孢 菌素C向7-氨基头孢烷酸的转化，D-氨基酸氧化酶和戊二酰酰化酶 都被氧化酶所产生的过氧化氢副产物所失活(F.Lopez-Gallego等，Adv. Synth.Catal.，347：1804(2005))。鉴于这些和其它的教导内容，先前报 道的过酸的酶促生产方法采用了低浓度的所添加过氧化氢，其中低 浓度的过氧化氢预期会减少或限制过水解反应过程中的酶失活作 用。
美国专利第3,974,082号(“′082专利”)描述了适于衣用洗涤剂应 用的漂白组合物的生产，该应用是将待漂白材料与含有能释放氧的 无机过氧化合物、酰基烷基酯和能够水解该酯的酯酶或脂肪酶的水 溶液相接触。′082专利中所述的漂白组合物具有高度碱性(使用了诸 如三磷酸五钠或碳酸钠的缓冲剂)，但有关所述的组合物中所产生的 过酸的浓度或者有关所述的组合物对衣物漂白的效用的数据并没有 给出。′082专利中所述的漂白组合物含有最高达40％重量的过氧化 合物(per-compound)，例如过氧化氢或者过碳酸、过硼酸、过硅酸和 过磷酸的碱金属盐。该漂白组合物以最高达12.5克/升水的量加入到 水中，以引发酶催化的过水解反应，其中酶催化的过水解反应中存 在的过氧化氢的最大浓度为5克/升，相当于大约147mM过氧化氢。
美国专利第5,296,161号(“′161专利”)描述了在高温和低温洗涤 应用中都能提供增强的污垢除去能力的活化氧化剂系统。该氧化剂 系统能够通过酶促过水解原位产生＞0.1ppm过酸，其中在不添加酶 的情况下酯底物不能够发生实质性化学过水解。该氧化剂系统使用 过氧源(source of peroxygen)、脂肪酶或酯酶和甘油酯或单酰基化乙二 醇或丙二醇衍生物来产生过酸。′161专利的氧化剂系统中最优选的酶 底物是三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯，酶促反应在7.5-11.0的pH下 进行，该专利的任何所附实施例都没有证实生产出大于10ppm的过 酸。在所例举的过水解反应中存在的过氧化氢最高浓度是1314ppm， 相当于大约38.6mM H2O2。
美国专利第5,364,554号描述了使用蛋白酶、过氧化氢源和优选 化学上不可过水解的酯底物在水溶液中原位产生过酸的活化氧化剂 系统。还公开了漂白的方法和形成过酸的方法。酶促反应在约8.0-10.5 的pH下进行，该专利的任何所附实施例都没有证实生产出大于5ppm 的过酸。在所例举的过水解反应中存在的过氧化氢最高浓度是400 ppm，相当于大约11.8mM H2O2。
O.Kirk等(Biocatalysis，11：65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、 酯酶和蛋白酶)催化用过氧化氢对酰基底物过水解而形成过氧羧酸的 能力，报道说过水解在含水系统中进行的效率非常低。此外，他们 发现脂肪酶和酯酶将过羧酸降解成了相应的羧酸和过氧化氢。他们 还发现蛋白酶在水中既不降解也不催化羧酸酯的过水解。作者推断， 酯酶、脂肪酶和蛋白质一般来说不适宜于在含水环境中催化简单的 酯如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯的过水解。
所要解决的问题是，提供在中性至酸性条件下从无毒和廉价的 羧酸酯、酰胺和/或甘油酯原位产生过酸组合物的含水酶促方法，其 浓度在多种应用中适合用作消毒剂。优选地，该方法在至少约5分 钟时间内将产生过酸的浓水溶液。故此，酶促过水解方法应在至少500 mM过氧化氢(过氧源)存在下进行。已有报道说，对于一些消毒、清 洁或漂白应用，优选非碱性过酸溶液。故此，该方法应在中性至酸 性条件下、更优选在酸性条件下在单个步骤中产生过酸水溶液。该 方法优选需要产生包含至少10ppm过酸(例如过乙酸)、更优选至少 100ppm、甚至更优选约100至约5000ppm之间的过酸组合物，其 中所产生的过酸组合物可直接使用，或者在使用前稀释到所需的过 酸浓度，以在约0℃至约60℃、优选约4℃至约30℃、最优选10℃ 至约25℃的温度下，在约5分钟至约10分钟内引起目标传染性微 生物的浓度减少5个或6个对数级。
第二个要解决的问题是，提供产生具有消毒、漂白和朊病毒降 解活性的多功能组合物的方法。该方法应能原位产生包含足够的消 毒和/或漂白浓度的过酸和一种或多种朊病毒降解蛋白酶的过酸水溶 液。
另外要解决的问题在于缺乏酶催化剂和酶底物的组合，该组合 能导致羧酸酯或酰胺转化成的过羧酸的浓度与先前在现有技术中所 公开的过酸浓度相比，对洗衣应用中的漂白更加有效。该问题的解 决办法需要1)有效地产生出过酸水溶液，其中过酸以足够充当消毒 剂或漂白剂的浓度存在；2)使用具有合适的过水解酶(perhydrolase)活 性的酶催化剂，用于在水溶液中将羧酸酯、酰胺和/或甘油酯转化成 相应的过酸；3)提供改进催化剂稳定性以提高催化剂生产率的方法， 从而降低催化剂成本；和4)提供有效地和经济地从相对廉价和无毒 的原料获得过酸的方法。
发明概述
上述问题已通过提供以下方法而得到解决，该方法用至少一种 具有过水解酶活性的酶，在过氧化氢(浓度至少为500mM)存在下， 在中性至酸性反应条件下，从合适的羧酸酯(包括甘油酯)和/或酰胺底 物原位产生过酸水溶液。所产生的过酸的浓度足以用于多种消毒和/ 或漂白应用中。
本发明的一个方面提供产生浓过酸水溶液的方法，所述方法包 括
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述各反应成分组合时即能提供浓度至少为 500mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在约2.5至约7.5的pH下组合，由此在将 所述各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生出浓过酸溶 液。
这个方法产生出过酸浓度为至少10ppm的浓过酸溶液。
在本发明的一个方面，所述至少一种底物是选自以下的酯底物： 乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、 甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯和它们的混合物。
在本发明的另一个方面，所述至少一种底物是选自一醋精、二 醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、甘油一辛酸酯、甘油二 辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们混合物的甘油酯底物。
在本发明的又一个方面，所述至少一种底物是选自甘油一乙酸 酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和它们混合物的甘油酯底物。
在本发明的一个方面，所述至少一种酶催化剂是至少一种由选 自以下属的生物产生的脂肪酶：曲霉属(Aspergillus)、根霉属 (Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、毛霉属(Mucor)、嗜热霉属(Thermomyces)、产碱菌属 (Alcaligenes)和猪属(Sus)。
在另一个方面，酶催化剂是至少一种选自南极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶B和黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的脂肪酶。
在本发明的另一个方面，所述至少一种酶催化剂是至少一种具 有过水解活性和朊病毒降解活性的蛋白酶。
在本发明的另一个方面，酶催化剂包括至少一种脂肪酶和至少 一种朊病毒降解蛋白酶。
在本发明的许多方面，由各反应成分的组合所产生的过酸是过 乙酸。
本发明的另一个方面提供对具有一定浓度的微生物或病毒或它 们的组合的部位进行消毒的方法，所述方法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支 链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支 链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少为500 mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在2.5至7.5的pH下组合，由此在将所述 各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内形成过酸浓度为至少10 ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释所述过酸水溶液；
d)使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触，由 此使得所述微生物的浓度减少至少3个对数级。
在本发明的另一个方面，在将所述各反应成分组合后约48小时 内，或者在约5分钟至约48小时内，使所述部位与如上所述在步骤 b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触。
本发明的另一个方面提供对污染一种或多种包括传染性朊病毒 或朊病毒颗粒在内的病原体的部位进行净化或消毒的方法，所述方 法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少为500 mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、蛋白酶和它们的混合物；
4)至少一种朊病毒降解蛋白酶，其中一种或多种所述朊病毒降 解蛋白酶可与(a)(3)中提供过水解酶活性的酶催化剂相同；
b)将所述各反应成分在2.5-7.5的pH下组合，由此在将所述各 反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生过酸浓度为至少10 ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释步骤(b)所产生的所述过酸溶液；
d)使污染微生物、病毒、朊病毒或朊病毒颗粒或它们的组合的 部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触，由此使得所述部 位被消毒，所述朊病毒颗粒被降解。
本发明的另一个方面提供由上述方法原位产生的浓过酸溶液， 其中所述溶液包含至少一种适合于朊病毒降解的蛋白酶。
本发明的又一个方面提供包含由上述方法产生的浓过酸溶液的 多功能消毒剂组合物，其中所述组合物适合于朊病毒降解、适合用 作杀生物剂、适合用作杀病毒剂或它们的组合。
发明详述
上述问题由于发现了酶与羧酸酯或酰胺的组合而得到解决，所 述组合在无机的过氧源(例如过氧化氢)存在下能产生足以适合消毒或 漂白应用的过酸浓度。意想不到的是，在酶催化的过水解反应中可 采用约500mM至约2500mM的过氧化氢浓度，来在5-10分钟内产 生浓度高达5000ppm的过酸，其中这些高过氧化物浓度曾被认为会 使过水解酶催化剂快速失活。
与先前报道的通过酯的酶促过水解产生的过酸浓度进行比较时 发现，本发明的酶和酶底物在本文报道的浓度范围内的组合意想不 到地和有效地产生出足够高浓度的过酸水溶液，该浓度使过酸水溶 液能充当杀生物或杀病毒消毒剂及漂白剂。用酶催化剂(例如脂肪酶、 蛋白酶)按本文的描述产生出了超过10ppm(通常大于约75ppm)的过 酸浓度，其中所产生的含过酸溶液或其稀释液能在约25℃下在5-10 分钟内减少传染性细菌5个或6个对数级。
PCT出版物第WO2004039418 A1号和美国专利申请出版物第 20020172989 A1号描述了应用蛋白酶或蛋白酶混合物来破坏传染性 朊病毒蛋白质的朊病毒净化方法。在本发明的另一个方面，提供了 包含朊病毒降解蛋白酶及原位产生的具有杀生物和/或杀病毒活性的 过酸浓度的清洁和消毒组合物。在又一个方面，朊病毒降解蛋白酶(例 如蛋白酶K、链霉蛋白酶和它们的组合)能够催化酯和/或酰胺的过水 解，产生其浓度能有效进行消毒的对应过酸，从而产生出具有朊病 毒降解活性的杀生物剂和/或杀病毒剂。在本发明的再一个方面，可 在单独蛋白酶不能产生有效浓度的过酸的pH下(例如在4.0-6.5的pH 下)，将朊病毒降解蛋白酶与添加的具有过水解活性的酶(如脂肪酶) 组合使用。该组合还可产生协同浓度(a synergistic concentration)的过 酸，即其所产生的过酸浓度大于单独蛋白酶或脂肪酶所产生的过酸 浓度之和。
所有引述的参考文献通过引用具体结合到本文中，除非另有规 定。此外，当量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或一列 优选上限值和优选下限值给出时，这应理解为明确地公开了由任何 一对任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值所构成的所有 范围，而不论范围是否单独公开。在本文叙述了数值范围的地方， 除非另有规定，否则该范围意指包括其端点和落入其中的所有整数 和分数。不想使本发明的范围受限于定义某个范围时所叙述到的具 体数值。
在本文公开内容中，使用了许多术语和缩写。适用以下定义， 除非另外明确规定。
本文所用的修饰所采用的本发明成分或反应物的量的术语 “约”，指例如由于以下原因可能会出现的数量变化：由于用以在现实 中制备浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理程序；由于在这些 程序中的因疏忽所致的误差；由于用来制造组合物或实施方法的各 成分在制造、来源或纯度上的差异；等等。术语“约”还涵括由于具体 的初始混合物所致的组合物平衡条件不同而不同的数量。不管是否 受术语“约”的修饰，各权利要求包括各量的相当量。在一个实施方案 中，术语“约”指在所报道的数值的±10％范围内，优选在所报道的数 值的±5％范围内。
本文所用的术语“包含”指存在着各权利要求中所提到的规定特 征、整体、步骤或成分，但它并没有排除一种或多种其它特征、整 体、步骤、成分或者它们的组群的存在或增加。
本文所用术语“过酸(peracid)”与过氧酸(peroxyacid、peroxy acid、 peroxoic acid)、过羧酸(percarboxylic acid)同义。众所周知，过酸包括 过乙酸。
本文所用的术语“过乙酸”缩写为“PAA”，与过氧乙酸、乙烷过氧 酸和CAS登记号79-21-0的所有其它同义词同义。
术语“三醋精”与甘油三乙酸酯(glycerin triacetate、glycerol triacetate、glyceryl triacetate)、1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三 乙酸酯和CAS登记号102-76-1的所有其它同义词同义。
本文所用的术语“合适的酶促反应混合物”指反应物和酶催化剂 在其中发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的 各成分，本领域技术人员会理解适合于本方法的成分变化范围。在 一个实施方案中，当将各反应成分组合时，合适的酶促反应混合物 即原位产生过酸。故此，可将各反应成分作为多成分系统来提供， 其中一种或多种反应成分保持分离至使用时。用以组合多个活性成 分的系统的设计是本领域公知的，通常须由各个反应成分的物理形 式而定。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相 系统(美国专利申请出版物第2005/0139608号；美国专利第5,398,846 号、第5,624,634号、第6,391,840号；欧洲专利第0807156B1号； 美国专利申请出版物第2005/0008526号；PCT出版物第WO 00/11713A1号)，如在一些漂白应用中所见的，其中当将各反应流体 混合时即产生所需的漂白剂。其它形式的用以产生过酸的多成分系 统可包括但不限于为一种或多种固体成分或固-液成分的组合设计的 系统，如粉末剂(例如许多市售的漂白组合物，美国专利第5,116,575 号)、多层片剂(美国专利第6,210,639号)、具有多个区室(compartment) 的水可溶解小包(packet)(美国专利第6,995,125号)和在加水时发生反 应的固体聚集物(美国专利第6,319,888号)。
本文所用的术语“过水解”定义为选定的底物与过氧化物形成过 酸的反应。通常，使无机过氧化物与选定的底物在催化剂的存在下 反应产生过酸。本文所用的术语“化学过水解”指过水解反应，其中将 底物(过酸前体)与过氧化氢源组合，在不存在酶催化剂情况下形成过 酸。本文所用的术语“酶促过水解”指通常归类为水解酶的酶帮助或催 化的过水解反应。
“羧酸酯水解酶”指催化酯的水解的酶(E.C.3.1.1.-)。羧酸酯水解 酶家族包括但不限于脂肪酶(例如三酰基甘油脂肪酶[E.C.3.1.1.3])和 酯酶。
“脂肪酶”指通过水解酯键而催化脂肪水解成甘油和脂肪酸的酶 (EC 3.1.1.3)。一些脂肪酶据报道具有过水解活性。
“酯酶”指催化酯的水解的酶(E.C.3.1.1.-)。一些酯酶据报道具有 过水解活性。
“蛋白酶”指通过肽键的水解而催化蛋白质的水解分解的酶(EC 3.4.-)。如本文所描述，一些蛋白酶显示过水解活性。
本文所用的术语“过水解酶催化剂”和“至少一种具有过水解酶活 性的合适酶催化剂”在本文中指以过水解酶活性为特征的酶催化剂。 该酶催化剂选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和/或它们的混合物，其中该 催化剂具有过水解活性。该酶催化剂可为如下形式：完整微生物细 胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、 部分纯化酶或纯化酶。本文所用的术语“从生物体产生”用以描述合适 的催化剂的来源。酶催化剂可从目标生物体产生，或者可在合适的 生产宿主中重组产生。
本文所用的“一单位的酶活性”或“一单位的活性”或“U”定义为在 指定温度下每分钟产生1μmol过酸产物所需的酶活性的量。
本文所用的术语“过水解酶活性”指每单位质量(例如毫克)的蛋白 质、固体或液体含酶组合物、干燥细胞或固定化催化剂的酶活性。 各催化剂的过水解酶活性经比较确定与干燥细胞重量、固体或液体 含酶组合物或蛋白质催化剂重量成比例。
本文所用的术语“消毒”指进行清洁以消灭病原微生物或防止其 生长的过程。本文所用的术语“消毒剂”指通过消灭、中和致病微生物 或抑制其生长进行消毒的物质。通常，消毒剂用来处理无生命物体 或表面。本文所用的术语“防腐剂”指抑制致病微生物生长的化学物 质。
本文所用的术语“杀病毒剂”指抑制或消灭病毒的物质。将显示 出抑制或消灭病毒的能力的物质描述为具有“杀病毒”活性。过酸可具 有杀病毒活性。本领域公知的可适合与本发明一起使用的典型替代 性杀病毒剂包括例如醇类、醚类、氯仿、甲醛、苯酚、β-丙内酯、碘、 氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和去污剂。
本文所用的术语“杀生物剂”指能失活或消灭微生物的、通常广 谱的化学物质。将显示出失活或消灭微生物的能力的化学物质描述 为具有“杀生物”活性。过酸会具有杀生物活性。本领域公知的可适合 与本发明一起使用的典型替代性杀生物剂包括例如氯、二氧化氯、 氯代异氰尿酸、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺类、氯化苯酚、铜盐、 有机硫化合物和季铵化合物。
本文所用的词语“最小杀生物浓度”指对于特定的接触时间，将 会引起目标微生物活群体发生所需的致命性不可逆的减少的杀生物 剂最小浓度。有效性可通过处理后活微生物的log10减少来测量。在 一个方面，处理后活细胞的目标减少量是减少3个对数级，更优选 减少4个对数级，最优选至少减少5个对数级。在另一个方面，最 小杀生物浓度是使活微生物细胞减少6个对数级。
本文所用的术语“朊病毒”、“朊病毒颗粒”和“传染性朊病毒颗粒” 指与神经变性性疾病有关的传染性蛋白质，所述神经变性性疾病包 括但不限于瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、传染性海绵状脑病(TSE)、 慢性消耗性疾病和Creutzfeldt-Jacob病。术语“朊病毒破坏性蛋白酶” 或“朊病毒降解性蛋白酶”指至少一种可用于降解或破坏传染性朊病毒 颗粒的蛋白酶(优选两种或多种蛋白酶的组合)(例如参见WO 2004039418 A1和US 20020172989 A1)。在一个实施方案中，朊病毒 破坏性蛋白酶选自蛋白酶K、链霉蛋白酶和它们的混合物。在一个 优选的实施方案中，朊病毒破坏性蛋白酶是蛋白酶K和链霉蛋白酶 的混合物。
在一个方面，当应用在某部位之上和/或之处时，本发明方法所 形成的过酸可用来减少微生物群体。本文所用的本发明“部位(locus)” 包括适合于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括 所有会潜在污染微生物、病毒、朊病毒或它们的组合的表面。其非 限制性实例包括食品或饮料工业中存在的设备表面(如罐、传送装置、 地面、排水沟、冷却器、冷冻设备、设备表面、墙、阀门、传送带、 管道、排水道、接缝、裂缝、它们的组合等等)；建筑表面(如墙、地 面和窗)；非食品工业相关的管道和排水道，包括水处理设施、泳池 和温泉区及发酵罐；医院和兽医表面(如墙、地面、床、设备(如内诊 镜)、在医院/兽医或其它保健环境中穿戴的衣服(包括洗擦布、鞋子) 和其它医院或兽医表面)；餐馆表面；浴室表面；卫生间；服装和鞋 子；牲畜如禽、牛、奶牛、山羊、马和猪的棚或厩的表面；禽或虾 的孵卵所。另外的表面还包括食物产品如牛肉、禽柔、猪肉、蔬菜、 水果、海产和它们的组合等等。部位还可包括吸水材料如受感染的 亚麻布或其它纺织品。部位还包括收获的植物或植物产品(包括种子、 玉米、块茎、水果和蔬菜)、生长中的植物特别是生长中的作物(包括 谷物、叶菜和用来作色拉的蔬菜、根菜、豆类、浆果类、柑橘类和 硬肉水果)。
表面材料的非限制性实例有金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、 铜、黄铜、铝和它们的合金)、矿物(例如混凝土)、聚合物和塑料(例 如聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯 腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(丙烯腈、丁二烯)、 丙烯腈丁二烯)；聚酯如聚对苯二甲酸乙二酯和聚酰胺如尼龙)。另外 的表面包括砖、瓦、陶、瓷、木、乙烯树脂、油布和地毯。
从羧酸酯和/或酰胺和过氧化氢酶催化制备过酸的合适水性反应条件
提供了产生包含过酸的含水混合物的方法，即通过使合适的底 物、至少一种具有过水解活性的酶催化剂和过氧源发生反应，所述 过氧源在中性至酸性pH下能提供500mM或更高的过氧化氢浓度。 本文所用术语“过氧源”指当在水溶液中时能够提供浓度为至少500 mM或更高的过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢 加合物、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所述，当将各反应成分组合 时，过氧源能够提供出过氧化氢浓度为至少500mM的混合物。
本文所用的术语“合适的底物”、“过酸前体”和“漂白激活剂”用来 描述能够用本发明的反应条件进行酶促过水解以产生过酸的底物。 底物在酶的存在或不存在下，还可进行部分的化学过水解。故此， 适合于本发明的底物是在相同反应条件下进行酶促过水解比进行化 学过水解多产生至少10ppm过酸的底物，优选至少100ppm，更优 选至少250ppm，甚至更优选至少500ppm，又甚至更优选至少1000 ppm，还甚至更优选至少2000ppm，最优选至少5000ppm的过酸。
合适的底物可包括在本发明反应条件下能够进行酶促过水解的 一种或多种羧酸酯、酰胺、甘油酯(一、二和/或三甘油酯)或它们的混 合物。在一个实施方案中，底物可任选被取代，特别是被烷氧基和/ 或羟基取代。在另一个实施方案中，底物可以是酰化多元醇。在又 一个实施方案中，酰化多元醇选自从甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、木 糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘露糖醇和山梨糖醇衍生的一、二或 多酰化多元醇。
在一个优选的实施方案中，合适的底物包括具有选自以下的化 学式的羧酸酯、酰胺和/或甘油酯：
a)下式的酯：
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支链烷基， R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH， n＝1-10；
b)下式的甘油酯：
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支链烷基， R3和R4各自为H或R1C(O)；
c)下式的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基。在一个实施方案中，底 物可以是一种或多种本文所述的合适底物的混合物。
在一个优选的实施方案中，底物选自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙 醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基 丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、 葡糖酸内酯、一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、 甘油一辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯、乙酰胺、二乙酰胺 和它们的混合物。
在又一个优选的实施方案中，底物选自一醋精、二醋精、三醋 精、乙酰胺、二乙酰胺和它们的混合物。
酶底物在反应混合物中存在的浓度，在发生酶催化过水解时足 以产生出所需浓度的过酸。所附实施例中证明，存在着可产生适需 浓度过酸的酶底物和酶催化剂的优选组合。底物不需要完全可溶于 反应混合物中，但应有足够的溶解度，以便酶催化剂将酯或酰胺转 化成相应的过酸。底物在反应混合物中的存在浓度为占反应混合物 的0.05wt％-40wt％，优选占反应混合物的0.1wt％-20wt％，更优选 占反应混合物的0.5wt％-10wt％。当使用脂肪酶、酯酶或蛋白酶作 为催化剂，或者使用脂肪酶和/或蛋白酶的组合作为催化剂时，优选 的底物包括一醋精、二醋精、三醋精和一醋精/二醋精/三醋精混合物。 当使用蛋白酶作为催化剂，或者使用脂肪酶和蛋白酶的组合作为催 化剂时，另外优选的底物包括乙酰胺、二乙酰胺和它们的混合物。
过氧源可包括但不限于过氧化氢、过硼酸盐(例如过硼酸钠)和过 碳酸盐(例如过碳酸钠)。反应混合物中的过氧化合物浓度可在0.1wt％ 至约50wt％的范围，优选1wt％至约40wt％，更优选2wt％至约30 wt％。
当将各反应成分组合时，含水反应混合物中过氧化合物所提供 的过氧化氢浓度最初至少为500mM或更高。在一个实施方案中，含 水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。在另一个实施 方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为2500mM或更高
含水反应混合物中过氧化氢与底物的摩尔比(H2O2∶底物)可为约 0.1-20，优选约0.5-10，最优选约2-5。
各反应成分可在单独的批次中组合，或者可用连续工艺组合。
酶催化剂选自水解酶类，其包括酯酶、脂肪酶和蛋白酶(分别为 EC 3.1.1.-、EC 3.1.1.3和EC 3.4.-.-)、 具体的说，可用于本发明的酶 是水解酶类如酯酶、脂肪酶和蛋白酶，其催化活性通常是将酯水解 成相应的羧酸和醇，或将酰胺水解成相应的羧酸和氨或胺，其中在 过氧化氢(或功能上相当的含过氧化合物)的存在下，酯或酰胺经历酶 催化的过水解，产生出相应的过羧酸。
在一个方面，酶催化剂是得自真核生物或原核生物的脂肪酶。 在另一个方面，所述脂肪酶得自选自以下的属的生物：曲霉属、根 霉属、青霉属、假丝酵母属、假单胞菌属、毛霉属、嗜热霉属、产 碱菌属和猪属。在一个优选的方面，脂肪酶的来源选自以下：黑曲 霉(Aspergillus niger)、米根霉(Rhizopus oryzae)、青霉属I(Penicillium sp. I)、青霉属II(Penicillium sp.II)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、南 极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、洋 葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、细毛嗜热霉(Thermomyces languinosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、野猪(Sus scrota)和产碱菌属(Alcaligenes sp.)。在还一个优选 的方面，脂肪酶选自曲霉属脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、南极假丝酵母 脂肪酶B、假单胞菌属脂肪酶、产碱菌属脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪 酶、米根霉脂肪酶和它们的混合物。许多本文例示的脂肪酶获自 BioCatalytics Inc.(Pasadena，CA)，按其相应的目录号(实施例1，表1) 进行指称。因此，在还一个优选的方面，脂肪酶选自ICR-101曲霉 属脂肪酶、ICR-102根霉属脂肪酶、ICR-103米根霉脂肪酶、ICR-104 青霉属I脂肪酶、ICR-105青霉属II脂肪酶、ICR-106皱褶假丝酵母 脂肪酶、ICR-107洋葱假单胞菌脂肪酶、ICR-108假单胞菌属脂肪酶、 ICR-109荧光假单胞菌脂肪酶、ICR-110南极假丝酵母脂肪酶B、 ICR-111南极假丝酵母属脂肪酶、ICR-112南极假丝酵母脂肪酶A、 ICR-113假单胞菌属脂肪酶、ICR-114猪胰腺脂肪酶、ICR-115细毛 嗜热霉脂肪酶、ICR-116米黑毛霉脂肪酶和ICR-117产碱菌属脂肪酶。 在还一个优选的方面，脂肪酶选自：脂肪酶AY“Amano”30(皱褶假 丝酵母脂肪酶)、脂肪酶R“Amano”(娄地青霉(Penicillium roqueforti) 脂肪酶)、脂肪酶F-APl5(米根霉脂肪酶)、脂肪酶M“Amano”10(爪 哇毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶)、脂肪酶A“Amano”12(黑曲霉脂肪 酶)、脂肪酶G“Amano”50(卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪 酶)、Amano F-DS脂肪酶(米根霉脂肪酶)、Amano DS脂肪酶(黑曲霉 脂肪酶)(均自Amano)，和CALB L(南极假丝酵母脂肪酶B的液体 制剂)、Novozym 435(固定化南极假丝酵母脂肪酶B)、Lipozyme TL(，细 毛嗜热霉脂肪酶)、Palatase 20000L(米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶) (均自Novozymes)，Validase AN脂肪酶(黑曲霉脂肪酶)、Dietrenz CR 脂肪酶(皱褶假丝酵母脂肪酶)(均自Valley Research)和Enzeco MLC 脂肪酶(的获自黑曲霉的微生物脂肪酶浓缩物，Enzyme Development Corporation出售)。最优选地，脂肪酶选自BioCatalytics ICR-101(曲 霉属脂肪酶)、BioCatalytics ICR-110(南极假丝酵母脂肪酶B)、 BioCatalytics Chirazyme L2脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶B)、 BioCatalytics ICR-113(假单胞菌属脂肪酶)、BioCatalytics CR-117(产 碱菌属脂肪酶)、脂肪酶A“Amano”12(黑曲霉脂肪酶)、Novozym CALB L(南极假丝酵母脂肪酶B)、Novozym 435(固定化南极假丝酵 母脂肪酶B)、Novozym Palatase 20000L(米曲霉脂肪酶)和valley Research Validase AN(黑曲霉脂肪酶)。
在一个实施方案中，酶催化剂是得自真核生物或原核生物的蛋 白酶E.C.3.4.-.-)。在另一个实施方案中，所述蛋白酶得自选自以下 的属的生物：曲霉属、根霉属、芽孢杆菌属(Bacillus)、猪属、番木瓜 属(Catica)、凤梨属(Ananas)、假单胞菌属、毛霉属、嗜热霉属、产 碱菌属和猪属。在还一个优选的方面，蛋白酶的来源选自斋滕曲霉 (Aspergillus saitoi)、米根霉属、芽孢杆菌属、野猪(Sus scrota)、番木 瓜(Catica papaya)、菠萝(Ananas comosus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和白色麦轴霉(Tritirachium album)。在一个优选的实施方案 中，蛋白酶选自斋滕曲霉XIII型蛋白酶、米根霉属XVIII型蛋白酶、 芽孢杆菌属蛋白酶、野猪胃蛋白酶、番木瓜的木瓜凝乳蛋白酶、菠 萝的菠萝蛋白酶、番木瓜的木瓜蛋白酶、灰色链霉菌的链霉蛋白酶(也 称Pronase E_)、白色麦轴霉蛋白酶K(包括从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组产生的蛋白酶K)和它们的混合物。
许多酶催化剂(完整细胞、部分纯化的或纯化的)据报道具有过氧 化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。 在一个优选的实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性， 或者经工程改造或纯化降低或消除了过氧化氢酶活性。
含水反应混合物中采用的酶催化剂的浓度，部分取决于酶催化 剂的比催化活性，故对其进行选择以获得所需的反应速度。在过水 解反应中用作催化剂的可溶性酶的重量通常在0.01mg-10mg酶/mL 总反应体积的范围内，优选0.10mg-2.0mg酶/mL。酶还可用本领域 技术人员公知的方法固定化在可溶性或不溶性载体上；参见例如 Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff(编辑)； Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化酶可以使酶催化剂 得以回收并在随后的反应中再使用。可用于本发明的另外形式的酶 催化剂包括完整微生物细胞、细胞提取物和部分纯化的酶。这些另 外形式的酶催化剂还可用以上提到的方法进行固定化。
在一个方面，底物的化学过水解和酶促过水解的组合所产生的 过酸的浓度，足以为在所需pH下进行的漂白或消毒提供有效浓度的 过酸。在另一个方面，本发明方法提供酶和酶底物的组合来产生所 需有效浓度的过酸，其中在不添加酶的情况下，所产生的过酸的浓 度明显低得多。尽管在一些情况下，无机过氧化物与酶底物的直接 化学反应会使酶底物发生实质的化学过水解，但可能不会产生出足 够浓度的过酸来在所需应用中提供有效浓度的过酸，故通过向反应 混合物中添加适当的酶催化剂来实现总过酸浓度的显著提高。
本发明方法产生出浓过酸水溶液，其在使用前可任选进行稀释 (例如用水稀释)。本文所用的“过酸溶液”、“过酸水溶液”和“浓过酸水 溶液”是指本发明酶催化过水解方法所产生的浓过酸溶液。在一个实 施方案中，“浓过酸水溶液”包含至少10ppm过酸、优选至少100ppm 过酸、更优选至少200ppm过酸、甚至更优选至少250ppm过酸、 又甚至更优选至少500ppm、还甚至更优选至少1000ppm、再甚至 更优选至少2000ppm、最优选至少5000ppm。包含过酸的产物混合 物可任选用水或主要由水组成的溶液稀释，以产生具有所需较低浓 度的过酸的混合物。要稀释本发明方法所产生的过酸水溶液的决定 取决于多个因素，包括但不限于应用目标(动物健康消毒剂、仪器杀 菌剂、家庭清洁剂、漂白剂等)、确保应用目标达到所需功效水平而 要求的温度和时间、在目标部位之处和/或之上的污物数量以及目标 病原体对过酸消毒剂的敏感性。为产生所需浓度的过酸而要求的反 应时间不超过约2小时，优选不超过约30分钟，更优选不超过约10 分钟，最优选约5分钟或更少时间。随着反应的继续进行，过酸的 浓度会增加到平衡点。故此，本发明涉及在约5分钟内产生高浓度 的方法，所述浓度可继续升高，直到达到反应平衡。
选择过酸合成反应的温度，以兼顾控制反应速度和酶催化剂活 性的稳定性。反应的温度范围可从刚好高于反应混合物的冰点(大约 0℃)至约65℃，优选的反应温度范围是约约5℃至约35℃。
含有过酸的最终反应混合物的pH(即当将各反应混合物组合后 反应混合物的pH)为2.5-7.5，优选3-7，更优选3.5-6.5，最优选4-6.5。 反应的pH和最终反应混合物的pH可任选通过加入合适的缓冲剂来 控制，缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐 或柠檬酸盐，缓冲剂的浓度为0.1mM-1.0M，优选1mM-100mM， 最优选10mM-50mM。
在另一个方面，酶促过水解产物可含有能提供所需功能性的另 外成分。这些另外成分包括但不限于洗涤助剂、乳化剂、表面活性 剂、腐蚀抑制剂、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。 许多这些另外成分是洗涤剂工业公知的(参见例如美国专利第 5,932,532号，其通过引用结合到本文中)。乳化剂的实例包括聚乙烯 醇或聚乙烯基吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)。表面活性剂的实例包括a) 非离子型表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基 化或丙氧基化直链或支链伯醇和仲醇及脂族氧化膦；b)阳离子型表面 活性剂如季铵化合物，特别是其中C8-C20烷基结合到氮原子，而氮 原子另外又结合到三个C1-C2烷基的季铵化合物；c)阴离子型表面活 性剂如烷基羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、烷基磺酸盐(十 二烷基硫酸钠“SDS”)或直链或支链的烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐；d) 两性表面活性剂和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸和 烷基甜菜碱。另外成分可包括香料、染料、过氧化氢的稳定剂(例如 1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(Dequest 2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO))、 酶活性的稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、洗涤助剂和金属螯合物(例如 乙二胺四乙酸(EDTA))。
过酸的酶促原位产生
本发明的含水酶促方法能原位产生高浓度的一种或多种过酸。 所产生的过酸反应性非常高和相对不稳定，通常随时间推移浓度会 降低。故此，宜将各反应成分保持分开，特别是对于液体配方。在 一个方面，过氧化氢源与底物或酶分开，优选与这两者分开。这可 用多种技术来实现，这些技术包括但不限于使用多室分配器(美国专 利第4,585,150号)，然后物理上将酶催化剂与本发明的底物和过氧化 氢源组合，以引发含水酶促过水解反应。可将酶催化剂固定化在反 应器的腔室当中，或者在接触要进行处理的表面和/或物体前先将酶 催化剂与包含过酸的反应产物相分离(例如过滤分离等)。酶催化剂可 在液体基质中，或者为固体形式(例如粉末、片剂)，或者包埋在固体 基质当中，该固体基质之后与底物和过氧化氢源混合而引发酶促过 水解反应。在又一个方面，酶催化剂可装在可溶解的或多孔的小袋 中，该小袋可加入到含水底物基质中而引发酶促过水解。
测定过酸和过氧化氢的浓度的HPLC测试方法
有多种分析方法可用于本发明以分析反应物和产物，包括但不 限于滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS) 和毛细管电泳法(CE)。
如本文所述，采用了U.Karst等(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627 (1997))所描述的分析程序来分析含过酸和过氧化氢的产物混合物。 简单的说，分析样品中的过乙酸(PAA)的浓度在0.025mM-10mM 的范围，H2O2的浓度在0.075mM-3mM的范围。如有需要，在分 析前，将含有过酸和/或过氧化氢的反应混合物进行稀释，以产生在 这些范围内的过酸或过氧化氢浓度。向4mL小瓶中装入0.100mL 的20mM甲基对甲苯基硫醚(MTS)乙腈溶液、0.300mL的蒸馏并去 离子的水(dd)和0.100mL的样品溶液(不稀释或者用dd稀释最多25 倍以分析过酸)，或者将0.100mL的20mM MTS乙腈溶液和0.390mL 的dd水加入到0.010mL的1∶10稀释的样品溶液(为分析过氧化氢)。 反应10分钟时间后(暗处、不搅拌)，加入0.400mL的CH3CN和0.100 mL的40mM三苯膦(TPP)的CH3CN溶液，启动第二衍生化反应以 检测过氧化物。将溶液在暗处静置30分钟，完成测试反应。30分钟 结束时，加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯酰胺(DEET，HPLC 外标物)，将所得溶液进行HPLC分析：带预柱的Supelco Discovery C8 10-cm柱，10-μL注射，225nm处紫外检测，溶剂A：乙腈，溶剂B： 去离子水，1mL/min梯度如下：
时间(分:秒) ％CH3CN ％H2O 0:00 3:00 3:10 4:00 4:10 7:00(停止) 40 40 100 100 40 40 60 60 0 0 60 60
过酸的最小杀生物浓度的测定
采用J.Gabrielson等(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所描 述的方法来测定过酸的最小杀生物浓度(MBC)或者测定过氧化氢和酶 底物的MBC。该测试方法基于XTT还原抑制作用，其中XTT ((2，3- 双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑_，内盐， 一钠盐)是氧化还原染料，可通过490nm或450nm处测量的光密度 (OD)变化指示微生物呼吸活性。但是，有多种其它方法可供测试消 毒剂和防腐剂的活性，包括但不限于活菌平板计数、直接显微镜计 数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.， Disinfection，Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。
消毒剂和防腐剂的杀病毒活性的测定
评估消毒剂和防腐剂的杀病毒活性的方法是本领域公知的(Brock， S.，出处同上，Papageorgiou等，Appl.Environ.Microbiol.，67(12)： 5844-5848(2001))。本发明过酸组合物预期能显示杀病毒活性。据报 道，酸性条件(pH＜7)可增强杀病毒活性。因此，在又一个方面，本 发明的过酸组合物可具有酸性pH(pH＜7)。在另一个实施方案中，pH 小于6.5，优选小于6，更优选小于约5。
酶法制备的过酸组合物的应用
根据本发明方法酶促产生的过酸可用于多种应用中，以减少本 文所定义部位的微生物、真菌、病毒和传染性蛋白质(即朊病毒)的污 染，如用以对以下部位进行去污染：医疗器械(例如内诊镜)、纺织品 (例如服装、地毯)、食品制作表面、食品储藏和食品包装设备、用于 包装食物产品的材料，小鸡孵育和生长设施、动物围栏、水处理设 施、泳池和温泉区、发酵罐及具有微生物和/或病毒活性的工艺废水。 在一个优选方面，本发明过酸组合物特别适用作不可高压灭菌的医 疗器械和食品包装设备的清洁消毒剂。由于含过酸的配方可用GRAS 安全或食品级的成分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)来制备，酶产 生的过酸还可用于动物畜体、肉、水果和蔬菜的净化，或者用于预 制食品的净化。酶产生的过酸可掺入到其最终形式为粉末、液体、 凝胶、固体或气溶胶的产品中。酶产生的过酸可稀释到仍能提供有 效的净化作用的浓度。
包含有效浓度的过酸的组合物可用来清洁和消毒污染(或怀疑污 染)病原微生物、病毒和/或朊病毒的表面和/或物体，即通过使表面和 /或物体与本发明方法所产生的产物相接触来进行清洁和消毒。本文 所用的“接触”指将包含有效浓度的过酸的消毒组合物置于与怀疑污染 致病实体(disease-causing entity)的部位保持接触的状态长达足以清洁 和消毒的一段时间。本领域技术人员能容易地确定当接触所需部位 时所要用的时间、温度和有效浓度。接触包括将包含有效浓度的过 酸的过酸溶液对怀疑受污染的表面或无生命物体进行喷雾、处理、 浸渍、冲洗、灌倒、混合、组合、涂敷、包覆、施加、粘附及以别 的方式发生联系。
具有朊病毒降解活性的过酸消毒剂
专利申请PCT出版物第2004039418 A1号和美国专利申请出版 物第20020172989 A1号描述了应用蛋白酶或蛋白酶混合物来消灭传 染性朊病毒蛋白质的朊病毒清除方法(Langeveld等，J.Infect.Diseases， 188：1782-1789(2003))。本申请中随附的实施例也证明，能够清除传 染性朊病毒的蛋白酶能催化酯或酰胺的过水解，产生出相应的其浓 度能有效进行消毒的过酸，从而使得有可能用单一酶体系就能产生 出同时含有抗微生物过酸和朊病毒降解蛋白酶的混合物。该包含朊 病毒降解蛋白酶和有效浓度的过酸的组合物，可任选包括一种或多 种表面活性剂，可包括一段时间的加热以帮助净化朊病毒。在一个 实施方案中，当净化朊病毒时所要用的表面活性剂的浓度可在0.01-50 wt％的范围，优选0.1-10wt％。热处理步骤通常在至少40℃-130℃ 的温度下进行，优选至少80℃，最优选至少100℃。该任选的热处 理的时间通常为至少1分钟直至48小时，优选小于24小时，最优 选小于2小时。在一个实施方案中，降解朊病毒的方法包括表面活 性剂和热处理两者。另外，可在单独蛋白酶可能不会产生有效浓度 的过酸的pH下(例如在pH4.0下)组合使用蛋白酶与添加的脂肪酶， 蛋白酶和脂肪酶的协同组合使用所产生的过酸浓度，比单独使用蛋 白酶或脂肪酶所产生的过酸浓度总和要高。
用本发明的过酸水溶液净化污染(或者至少怀疑污染)传染性朊病 毒的部位的方法，可另外包括至少一个以下步骤，即在用本发明方 法产生的过酸水溶液接触该部位之前或之后，用表面活性剂处理该 部位。在另一个实施方案中，可任选在接触该朊病毒污染的部位之 前将表面活性剂包括在过酸反应混合物中。在又一个实施方案中， 本发明方法可任选包括热处理步骤，其中在用过酸水溶液接触该部 位之前、过程中或之后对该部位进行热处理。在还另一个实施方案 中，本发明方法可包括任选的加热步骤和表面活性剂处理步骤两者。
一般方法
提供以下实施例来说明本发明的优选的各方面。本领域技术人 员应认识到，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人所发现的 在本发明的实施中发挥良好的技术，因此它们可被认为构成了实施 本发明的优选方式。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应认 识到，可不偏离本发明的精神和范围，对所公开的具体实施方案作 出许多改变，而仍获得同样或相似的结果。
所有试剂和材料均获自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、 GIB CO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、Charkit Chemical Corporation(Darien，CT)、Eastman Chemical Co.(Kingsport， TN)或Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有指 明。酶获自Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)、 BioCatalytics(Pasadena，CA)、Amano Enzymes USA(Lombard，IL)、 Valley Research(South Bend，IN)、Enzyme Development Corporation (New York，NY)和Novozymes(Franklinton，NC)。
说明书中的缩写对应于测量单位、技术、特性或化合物如下： “sec”指秒，“min”指分钟、“h”或“hr”指小时、“d”指密度(g/mL)、“μl” 指微升、“mL”指毫升、“L”指升、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔 浓度、“mmol”指毫摩尔、“wt”指重量、“wt％”指重量百分比、“g”指 克、“μg”指微克、“HPLC”指高效液相色谱、“O.D.”指在指定波长处 的光密度、“dew”指干燥细胞重量、“CFU”指菌落形成单位、“ATCC” 指美国模式培养物保藏中心、“U”指过水解酶活性的单位、“RPM”指 每分钟转速、“EDTA”指乙二胺四乙酸、“dd”指蒸馏并去离子，“DTT” 指二硫苏糖醇。
实施例1
pH6.5下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中)、0.900mL的278mM三醋精(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5) 中，250mM三醋精终浓度)和0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓 度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000标称 分子量限度(Nominal Molecular Weight Limit，NMWL)过滤器 (Millipore UltraFree-MC，Millipore Corp.，Billerica，MA)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表1)。
表1.pH6.5下脂肪酶催化的250mM三醋精的过水解
酶 酶来源 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 曲霉属 根霉属 米根霉 青霉属I 青霉属II 皱褶假丝酵母 洋葱假单胞菌 假单胞菌属 荧光假单胞菌 南极假丝酵母脂肪酶B 假丝酵母属 南极假丝酵母脂肪酶A 假单胞菌属 猪胰腺 细毛嗜热霉 米黑毛霉 产碱菌属 282 80 113 131 144 171 179 180 183 337 238 134 241 135 216 238 293 179 235 36 142 66 105 0 30 11 398 117 0 358 0 113 117 370
实施例2
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲 液(pH4.0)中)、0.900mL的278mM三醋精(于50mM乙酸钠/乙酸 缓冲液(pH4.0)中，250mM三醋精终浓度)和0.052mL 30％过氧化氢 (500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进行 过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸分 析(表2)。
表2.pH4.0下脂肪酶催化的250mM三醋精的过水解
酶 酶来源 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 曲霉属 根霉属 米根霉 青霉属I 青霉属II 皱褶假丝酵母 洋葱假单胞菌 假单胞菌属 荧光假单胞菌 南极假丝酵母脂肪酶B 假丝酵母属 南极假丝酵母脂肪酶A 假单胞菌属 猪胰腺 细毛嗜热霉 米黑毛霉 产碱菌属 10 238 11 0 9 11 23 32 33 32 362 24 151 221 165 206 14 185 9.6 555 0 4 16 19 34 135 53 68 688 79 86 370 53 132 0 710
实施例3
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入2mg酶(脂肪酶ICR 101 或ICR 110，BioCatalytics，Pasadena，CA)及1.0mL的含有250mM或 500mM三醋精和500mM或2500mM过氧化氢的50mM乙酸钠/乙 酸缓冲液(pH4.0)。在23℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表3)。
表3.pH4.0下脂肪酶催化的250mM或500mM三醋精的过水解
酶 三醋精 (mM) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-110 无酶 ICR-101 ICR-110 无酶 ICR-101 ICR-110 250 250 250 250 250 250 500 500 500 500 500 500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 10 461 498 17 656 1570 10 612 1860 10 1030 568 15 1158 2880 207 1109 3755
实施例4
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中)、0.900mL的含有二醋精(278mM)、三醋精(144mM)和一醋 精(131mM)(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物，以及 0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)或0.026mL 30％过氧化氢 (250mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进行 过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸分 析(表4)。
表4.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(278mM)、三醋精(144mM)和一 醋精(131mM)混合物的过水解
250mM H2O2 250mM H2O2 500mM H2O2 500mM H2O2 酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 16 136 127 139 151 0 0 0 3 0 451 0 0 34 0 0 0 114 56 250 159 133 174 0 16 102 27 38 384 21 24 202 0 8 7 353 19 194 26 275 284 0 29 17 0 38 669 12 20 80 0 11 0 61 44 277 232 223 286 0 47 54 7 0 484 43 38 236 0 8 0 456
实施例5
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101、110、 113或117，BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM乙酸 钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有a)二醋精(278mM)、三 醋精(144mM)和一醋精(131mM)(于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0)中)或b)二醋精(131mM)、三醋精(68mM)和一醋精(62mM)(于50 mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0)中)的含水混合物以及0.052mL 30％ 过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL 样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表5)。
表5.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物过水解
底物浓度 二醋精(131mM) 三醋精(68mM) 一醋精(62mM) 二醋精(278mM) 三醋精(144mM) 一醋精(131mM) 酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-110 ICR-113 ICR-117 4 502 2 616 1 183 982 102 208 2 457 948 358 896
实施例6
pH4.0下蛋白酶催化的乙酰胺和二乙酰胺的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有a)乙 酰胺(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0))中或b)二乙酰 胺(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)的含水混合物 以及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30 分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree- MC)在12,000RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品 用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测 试方法直接进行过酸分析(表7)。
表6.蛋白酶和供应商
酶，来源 目录号 供应商 蛋白酶XIII型，斋滕曲霉 蛋白酶XVIII型，根霉属 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶，猪胃 木瓜凝乳蛋白酶，木瓜乳胶 菠萝蛋白酶，菠萝茎 木瓜蛋白酶，木瓜乳胶 链霉蛋白酶，灰色链霉菌 蛋白酶K，白色麦轴霉，在巴 斯德毕赤酵母中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 P2143 P5027 P5985 P6887 C8526 3000 GDU P3125 81748 3115879 70663 Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Hong Mao Biochemicals Sigma Biochemika Roche Novagen
表7.pH4.0下蛋白酶催化的乙酰胺(250mM)和二乙酰胺(250mM)的 过水解
乙酰胺 (250mM) 乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 蛋白酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K，白色麦轴 霉，在巴斯德毕赤酵母 中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 0 35 27 48 45 66 57 81 2 26 34 0 49 41 61 65 65 63 105 43 43 49 4 88 94 95 97 100 92 135 16 116 107 138 120 131 130 172
实施例7
pH4.0下蛋白酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有三醋 精(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)的含水混合物 以及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30 分钟后，将0.050mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree- MC)在12,000RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品 用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测 试方法直接进行过酸分析(表8)。
表8.pH4.0下蛋白酶催化的三醋精(250mM)的过水解
三醋精(250mM) 三醋精(250mM) 蛋白酶 过乙酸(ppm)，5min 过乙酸(ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 10 209 65 74 65 72 83 85 10 358 30 55 44 57 59 48
实施例8
pH6.5下蛋白酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中)、0.900mL的含有三醋精(278 mM，于50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250 mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10 稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接 进行过酸分析(表9)。
表9.pH6.5下蛋白酶催化的三醋精(250mM)的过水解
三醋精(250mM) 三醋精(250mM) 蛋白酶 过乙酸(ppm)，5min 过乙酸(ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 51 135 89 93 111 69 161 203 26 136 119 64 163 167 170 142
实施例9
pH6.5下蛋白酶催化的乙酰胺和二乙酰胺的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)、0.900mL的含有a)乙酰胺(278 mM，于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)或b)二乙酰胺(278mM，于 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物以及0.052mL 30％过 氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL 样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表10)。
表10.pH6.5下蛋白酶催化的乙酰胺(250mM)和二乙酰胺(250mM)的 过水解
乙酰胺 (250mM) 乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 蛋白酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 链霉蛋白酶 蛋白酶K，白色麦轴 霉，在巴斯德毕赤酵母 中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 23 126 150 270 21 42 58 89 81 94 108 199 26 168 194 214 0 32 33 73 67 12 112 157 59 17 66 104 0 218 226 807 259 218 311 342 62 17 99 100 33 206 180 181 198 170 202 187
实施例10
pH4.0和6.5下用脂肪酶和蛋白酶的组合进行的三醋精酶促过水解
制备反应混合物，其含有1mg脂肪酶(ICR 101，ICR-110或ICR- 117，BioCatalytics，Pasadena，CA)、0.3mg蛋白酶K(白色麦轴霉)和1.2 mg链霉蛋白酶(于1.0mL的50mM缓冲液(pH4.0的乙酸钠/乙酸缓 冲液或pH6.5的磷酸钾缓冲液)中)，另外还含有三醋精(250mM)和 过氧化氢(500mM)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样 品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下 离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进 行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸 分析(表11)。还单独用脂肪酶或单独用蛋白酶进行反应，以比较没有 脂肪酶和蛋白酶的组合时所产生的过乙酸浓度。
表11.pH4.0和6.5下用脂肪酶和蛋白酶的组合进行的三醋精(250mM) 酶促过水解
酶来源 pH 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶K 链霉蛋白酶 蛋白酶K/链霉蛋白酶 ICR-101 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR101 ICR-110 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR110 ICR-117 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR117 无酶(对照) 蛋白酶K 链霉蛋白酶 蛋白酶K/链霉蛋白酶 ICR-101 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR101 ICR-110 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR110 ICR-117 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR117 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 10 24 17 8 238 252 362 460 284 401 22 323 114 225 306 359 337 406 438 579 10 7 5 15 555 542 688 679 927 909 59 669 484 433 588 576 398 364 984 1189
实施例11(比较实施例)
pH6.5下乙酸丙酯或三醋精的酶促过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入2mg溶于0.050mL的50 mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)的以下酶之一：乙酰胆碱酯酶(Sigma，C- 2888)、脂肪酶G“Amano”50(Amano)或Chirazyme L2，冻干(南极假 丝酵母脂肪酶B，BioCatalytics)。然后向小瓶中加入a)0.930mL的含 有50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)和215mM乙酸丙酯的溶液，接着是 0.021mL 30％过氧化氢(200mM终过氧化氢浓度)，或者b)0.900mL 的含有278mM三醋精(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)、0.024mL 的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)和0.026mL 30％过氧化氢(250mM 终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离心过滤2 分钟。将一部分的所得滤液用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析， 剩余部分的滤液用HPLC测试方法直接进行过酸分析(表12)。
表12.pH6.5下乙酸丙酯(200mM)或三醋精(200mM)的酶促过水解
酶 乙酸丙酯 (250mM) H2O2 (250mM) 乙酸丙酯 (250mM) H2O2 (250mM) 三醋精 (250mM) H2O2 (250mM) 三醋精 (250mM) H2O2 (250mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 乙酰胆碱酯酶 脂肪酶G“Amano”50 Chirazyme L2 12 0 18 19 69 0 46 1 22 78 192 70 173
实施例12
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)、 ICR 110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)、Dietrenz CR(皱褶假 丝酵母脂肪酶，Valley Research)、Amano F-DS(米根霉脂肪酶， Amano)、Amano DS(黑曲霉脂肪酶，Amano)或Enzeco MLC(微生物 脂肪酶浓缩物，黑曲霉脂肪酶，Enzyme Development Corporation))溶 于含有二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一醋精(181mM)混合物及 2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5) 中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250 mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释， 用HPLC测试方法进行过酸分析(表13)。
表13.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一 醋精(181mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 Dietrenz CR Amano F-DS Amano DS Enzeco MLC ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 Dietrenz CR Amano F-DS Amano DS Enzeco MLC 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 0.2 0 1 1 1 1 1 1 1 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 500 500 500 500 500 500 500 500 80 460 590 2290 420 190 2100 610 90 310 340 1240 240 220 335 70 10 170 155 380 40 215 120 240 0 35 60 145 60 520 510 2350 350 390 2240 1850 110 580 550 1030 525 470 595 240 10 430 390 410 30 490 500 490 210 75 305 405
实施例13
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR 110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(236 mM)、三醋精(83mM)和一醋精(181mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备 1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过 滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表14)。
表14.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一 醋精(181mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 10 870 510 1670 240 270 1740 480 10 320 270 1080 870 40 605 560 2250 700 600 2180 1470 10 600 690 920 1060
实施例14
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg或1mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪酶， Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)或 ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(500 mM)、三醋精(176mM)和一醋精(383mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，制备1-mL 反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过滤2分钟。 将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC测试方法进 行过酸分析(表15)。
表15.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(500mM)、三醋精(176mM)和三 醋精(383mM)混合物的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0 2 2 2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 11 394 354 5224 290 220 3290 70 420 490 2900 13 860 650 7130 710 450 6130 50 930 890 2600
实施例15
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg或1mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪酶， Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)或 ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(500 mM)、三醋精(176mM)和一醋精(383mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备1 mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过 滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表16)。
表16.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精(500mM)、三醋精(176mM)和三 醋精(383mM)混合物的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0 2 2 2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 10 380 440 5760 180 170 3960 10 380 400 2970 10 920 930 7210 480 520 7450 10 900 1150 2510
实施例16
pH6.5下脂肪酶催化的三醋精的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有500mM三 醋精和2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲 液(pH6.5)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟 后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC) 在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25 稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表17)。
表17.pH6.5下脂肪酶催化的三醋精(500mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 80 800 790 2710 670 460 1840 1120 130 970 770 760 450 170 1390 1180 2880 1070 810 2421 760 80 1250 1310 1400 680
实施例17
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有三醋精(500 mM)和2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸 缓冲液(pH4.0)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30 分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应 样品用dd水1∶25稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表18)。
表18.pH4.0下脂肪酶催化的三醋精(500mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 10 1030 920 2810 570 570 2120 510 5 1100 930 1540 370 20 1370 840 3700 740 680 2860 780 5 1520 1230 1670 600
实施例18
pH4.0和pH6.5下CALB L催化的三醋精的过水解
将0.010mL的CALB L脂肪酶(市售的南极假丝酵母脂肪酶B 液体制剂，Novozymes)溶于另外含有三醋精(250mM)和过氧化氢 (2500mM)的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)或1.0mL 50 mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅 拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应 样品用dd水1∶20稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表19)。
表19.pH4.0或pH6.5下CALB L脂肪酶催化的三醋精(250mM)的 过水解
酶 pH H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 CALB L 无酶 CALB L 4.0 4.0 6.5 6.5 2500 2500 2500 2500 28 439 226 1294 15 1120 108 678
实施例19
pH4.0下用固定化南极假丝酵母脂肪酶B进行的三醋精过水解
将100mg的IMB-111(固定化南极假丝酵母脂肪酶B， BioCatalytics)悬浮于另外含有三醋精(500mM)和过氧化氢(2500mM) 的10.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备反应混合物。 在旋转平台上25℃下混合2-30分钟的预定时间后，将0.100mL液 体部分的样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在 12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20 稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表20)。
表20.pH4.0下用固定化南极假丝酵母脂肪酶B(IMB-111)催化的三 醋精(500mM)的过水解
时间(分钟) 无酶，过乙酸(ppm) 10.0mL IMB-111，过乙酸(ppm) 2 5 10 15 20 25 30 42 50 49 24 43 49 57 911 1667 2244 2755 3261 3369 3757
用新鲜的催化剂重复以上反应，30分钟后，过乙酸的浓度为3621 ppm。将催化剂从反应混合物中回收，用10.0mL的50mM乙酸钠/ 乙酸缓冲液(pH4.0)洗涤两次，用回收的酶重复进行反应，30分钟后， 过乙酸的浓度为2274ppm。
实施例20
pH6.5下三醋精的酶促过水解的时间进程
将1.0mg/mL的DS脂肪酶(黑曲霉，Amano)溶于含有过氧化氢 (2500mM)和三醋精(500mM)的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)所成的 反应混合物在25℃进行搅拌。在预定的各个时间抽取0.100mL等分 试样，用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM 下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表21)。
表21.pH6.5下DS脂肪酶催化的三醋精的过水解的时间进程(500 mM)
时间 (min或h) 无酶 过乙酸(ppm) 1mg/mL DS脂肪酶 过乙酸(ppm) 5min 30min 2h 5h 19h 10 149 26 78 27 367 522 819 1481 1895
实施例21
从三醋精、过氧化氢和南极假丝酵母脂肪酶B 制备的过乙酸制剂的杀生物活性
用Chirazyme L2脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶B)作为酶催化剂 进行反应，以产生过乙酸。向装有磁力搅拌棒的20-mL玻璃小瓶中 装入9.00mL的278mM三醋精(于50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)、 0.258mL的30％过氧化氢和1.0mL的20mg/mL Chirazyme L2(于50 mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)，将所得混合物在室温下搅拌5分钟。 用30K NMWL过滤装置(Millipore UltraFree-MC)过滤产物混合物以 使反应终止，在12,000rpm下离心2分钟以除去酶，将滤液在湿冰 上保藏。用HPLC测试方法对滤液进行过乙酸(PAA)和过氧化氢分 析；对照反应在不添加酶和加入或不加入三醋精下进行。已过滤的 酶产生的产物混合物含有192ppm PAA，其由三醋精与过氧化氢的 化学反应和酶促反应两者产生；产物混合物中的过氧化氢浓度为6431 ppm。用250-mM三醋精不加酶进行的对照反应产生出22ppm PAA， 其由三醋精和过氧化氢的化学反应产生。
将已过滤的酶产生的产物混合物用无菌水1∶5稀释，所得的溶液 用无菌水再作四次1∶1系列稀释，获得表22所列的PAA和过氧化氢 浓度。
表22.用以评估杀生物活性的稀释系列
稀释倍数 PAA(ppm) H2O2(ppm) 1∶5 38.3 1286 1∶10 19.2 643 1∶20 9.6 322 1∶40 4.8 161 1∶80 2.4 80
如下对1∶5稀释液和四个系列稀释液进行杀生物活性评估：将 0.100mL的含PAA溶液与0.100mL的含2.7×106CFU/mL大肠杆菌 (E.coli，ATCC 11229，美国模式培养物保藏中心，Manassas，VA)的接 种物在用Butterfield缓冲液稀释的Millers LB肉汤中混合；每个混合 物作八个重复样，装入无菌96孔微量滴定板的各个孔中。让所得的 细胞悬浮液在室温下静置10分钟，然后用生长指示剂XTT((2，3-双[2- 甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑_，内盐，一 钠盐；CAS RN 111072-31-2)，按照Gabrielson等(J.Microbiol.Methods， 50：63-73(2002))的方法测试生存力。直到2.4ppm的PAA最小杀生 物浓度都没有观察到1.35×106CFU/mL的细胞生长(6-log杀灭)(由 用XTT在450nm处无OD测量值所表明)(表23)。
表23.脂肪酶催化的三醋精过水解所产生的过乙酸对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的测定
PAA(ppm) H2O2(ppm) 19.15 643.1 9.6 321.6 4.8 160.8 2.4 80.4 1.2 40.2 对照 0 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.403 0.383 0.379 0.387 0.381 0.382 0.382 0.403 0.427 0.398 0.392 0.395 0.404 0.409 0.394 0.422 0.418 0.393 0.388 0.399 0.398 0.404 0.401 0.471 0.406 0.400 0.397 0.403 0.401 0.409 0.407 0.543 0.692 0.674 0.635 0.658 0.625 0.639 0.520 0.496 2.177 2.142 2.007 2.114 2.171 2.347 2.323 2.582 0.418 0.415 0.414 0.418 0.409 0.405 0.407 0.428 平均重复样OD(450 nm) 空白校正的平均OD： 0.388 -0.029 0.405 -0.009 0.409 -0.005 0.421 0.007 0.617 0.203 2.233 1.819 0.414 0
另外将细胞接种物分别用三醋精(表24)或过氧化氢(于50mM磷 酸盐缓冲液(pH6.5)中，表25)的无菌溶液以表23中各杀生物剂稀释 液的浓度处理，测定这些杀生物剂溶液成分的MBC。
表24.三醋精对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的测 定
三醋精(ppm) 5455 2728 1364 682 341 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 2.210 2.136 2.091 2.229 2.124 2.263 2.407 2.539 2.280 2.208 2.222 2.273 2.167 2.358 2.454 2.663 2.337 2.265 2.198 2.140 2.266 2.485 2.632 2.823 2.213 2.156 2.218 2.304 2.310 2.560 2.601 2.605 2.408 2.507 2.189 2.568 2.563 2.601 2.58 3.148 2.375 2.397 2.386 2.557 2.491 2.582 2.603 2.952 0.401 0.420 0.402 0.409 0.413 0.410 0.410 0.455 平均重复样OD(450 nm) 空白校正的平均OD： 2.250 1.835 2.328 1.913 2.393 1.978 2.371 1.956 2.571 2.156 2.543 2.128 0.415 0
表25.过氧化氢对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的 测定
H2O2(ppm) 680.5 340.2 170.1 85.1 42.5 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.456 0.436 0.446 0.433 0.440 0.426 0.430 0.453 0.440 0.428 0.424 0.423 0.439 0.425 0.432 0.452 0.401 0.422 0.470 0.435 0.402 0.424 0.462 0.414 1.880 1.793 1.834 1.889 1.815 1.795 1.962 2.153 2.170 2.082 2.034 2.007 2.027 1.971 2.117 2.666 2.371 2.226 2.158 2.216 2.372 2.581 2.741 2.821 0.423 0.417 0.415 0.422 0.417 0.419 0.442 0.439 平均重复样OD(450nm) 空白校正的平均OD： 0.440 0.016 0.433 0.009 0.4295 0.005 1.890 1.466 2.134 1.710 2.436 2.012 0.424 0
在80ppm过氧化氢存在下测出的PAA对大肠杆菌ATCC 11229 的MBC＞2.4ppm(表23)；过氧化氢的MBC＞170ppm(表25)，这 证实PAA试验溶液的杀生物活性是由PAA而不是H2O2所致。三醋 精在试验的最高浓度下(5455ppm，表24)都没有杀生物作用。酶法产 生的PAA的MBC非常符合用市售来源的过乙酸所测出的MBC(表 26，MBC＞2.3ppm PAA)。
表26.市售过乙酸对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC) 的测定
PAA(ppm) 18.75 9.4 4.7 2.3 1.15 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.306 0.292 0.289 0.288 0.296 0.294 0.296 0.300 0.301 0.296 0.290 0.294 0.291 0.294 0.299 0.295 0.310 0.297 0.294 0.295 0.298 0.294 0.293 0.304 0.303 0.288 0.292 0.291 0.294 0.292 0.303 0.318 1.734 1.367 1.343 1.377 1.368 1.378 1.324 1.386 2.098 1.832 1.816 1.874 1.869 1.874 1.817 1.869 0.305 0.295 0.295 0.292 0.294 0.290 0.227 0.173 平均重复样OD(450nm) 空白校正的平均OD： 0.295 0.024 0.295 0.024 0.298 0.027 0.298 0.026 1.410 1.138 1.881 1.610 0.271 0
本申请要求2005年4月29日提交的美国临时申请第60/676,116 号的权益。
过酸可通过羧酸与过氧化氢的化学反应来制备(参见Organic Peroxides，Daniel Swern(编辑)，第1卷第313-516页；Wiley Interscience， New York)。该反应往往通过强无机酸如浓硫酸催化。过氧化氢与羧 酸的反应是一个平衡反应，使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸或者 除去水来有利于过酸的生产。该用于过酸生产的化学反应有几个缺 点：1)用以促成过酸生产的高浓度羧酸可导致使用含过酸溶液时的不 适宜气味，2)过酸在溶液中随时间推移往往不稳定，在使用前的储藏 过程中溶液中的过酸浓度会降低，3)由于使用了浓硫酸作为催化剂， 配方往往呈强酸性。克服过酸化学生产的缺点的一种方法是采用酶 催化剂代替强酸催化剂。酶催化剂的使用使得可以在使用时快速生 产出过酸，避免了储藏过酸溶液的问题和使用化学法生产的所含过 酸浓度未知的过酸溶液的问题。通常通过与过氧化氢的直接化学反 应用于生产过酸的高浓度羧酸，对于过酸的酶法生产是不需要的， 在酶法生产中酶催化的反应可使用羧酸酯或酰胺作为底物，其浓度 比通常在化学反应中所用的要低得多。酶反应可在很大pH范围内进 行，这取决于给定pH下的酶活性和稳定性以及给定pH下过水解酶 的底物特异性。
酶能催化酯和酰胺的过水解(perhydrolysis)产生相应的过氧羧酸 (方程式1和2)，但是，大多数已知的使用酶催化剂从相应羧酸酯或 酰胺制备过酸的方法，其所产生和积累的过酸都达不到各种应用中 有效消毒的足够高浓度。
方程式1.
RAC(O)ORB 无机过氧化物脂肪酶、酯酶或蛋白酶 RA-C(O)OOH+HORB
方程式2.
RAC(O)NRBRC 无机过氧化物蛋白酶 RA-C(O)OOH+HNRBRC
将过氧化氢用作羧酸酯或酰胺的酶促过水解的酶底物会有问 题，因为已知过氧化氢会氧化性地使多种酶失活(M.R.Gray，Biotech Adv.，7：527(1989))。K.Kleppe(Biochemistry，5：139(1966))报道说，过 氧化氢通过修饰蛋白质中的某些氨基酸残基来使酶失活，其中在酸 性pH值下甲硫氨酸容易被氧化呈甲硫氨酸亚砜，在碱性pH值下色 氨酸被破坏。D.A.Estell等(J.Biol.Chem.，260：6518(1985))描述了过 氧化氢对含有甲硫氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的酶的失活作用， 证明分别用0.1M或1.0M过氧化氢不到6分钟或4分钟就使解淀粉 芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的枯草杆菌蛋白酶＞80％失活。 M.B.Arnao等(Biochim.Biophys.Acta，1041：43(1990))报道了5mM- 50mM过氧化氢对过氧化物酶的失活作用，B.Valderrama等 (Chemistry & Biology，9：555(2002))综述了氧化物质如过氧化氢对过氧 化物酶的失活作用。P.F.Greenfield等(Anal.Biochem.，65：109 (1975)) 报道了过氧化氢浓度增加会导致葡糖氧化酶的失活增加。对于头孢 菌素C向7-氨基头孢烷酸的转化，D-氨基酸氧化酶和戊二酰酰化酶 都被氧化酶所产生的过氧化氢副产物所失活(F.Lopez-Gallego等，Adv. Synth.Catal.，347：1804(2005))。鉴于这些和其它的教导内容，先前报 道的过酸的酶促生产方法采用了低浓度的所添加过氧化氢，其中低 浓度的过氧化氢预期会减少或限制过水解反应过程中的酶失活作 用。
美国专利第3,974,082号(“′082专利”)描述了适于衣用洗涤剂应 用的漂白组合物的生产，该应用是将待漂白材料与含有能释放氧的 无机过氧化合物、酰基烷基酯和能够水解该酯的酯酶或脂肪酶的水 溶液相接触。′082专利中所述的漂白组合物具有高度碱性(使用了诸 如三磷酸五钠或碳酸钠的缓冲剂)，但有关所述的组合物中所产生的 过酸的浓度或者有关所述的组合物对衣物漂白的效用的数据并没有 给出。′082专利中所述的漂白组合物含有最高达40％重量的过氧化 合物(per-compound)，例如过氧化氢或者过碳酸、过硼酸、过硅酸和 过磷酸的碱金属盐。该漂白组合物以最高达12.5克/升水的量加入到 水中，以引发酶催化的过水解反应，其中酶催化的过水解反应中存 在的过氧化氢的最大浓度为5克/升，相当于大约147mM过氧化氢。
美国专利第5,296,161号(“′161专利”)描述了在高温和低温洗涤 应用中都能提供增强的污垢除去能力的活化氧化剂系统。该氧化剂 系统能够通过酶促过水解原位产生＞0.1ppm过酸，其中在不添加酶 的情况下酯底物不能够发生实质性化学过水解。该氧化剂系统使用 过氧源(source of peroxygen)、脂肪酶或酯酶和甘油酯或单酰基化乙二 醇或丙二醇衍生物来产生过酸。′161专利的氧化剂系统中最优选的酶 底物是三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯，酶促反应在7.5-11.0的pH下 进行，该专利的任何所附实施例都没有证实生产出大于10ppm的过 酸。在所例举的过水解反应中存在的过氧化氢最高浓度是1314ppm， 相当于大约38.6mM H2O2。
美国专利第5,364,554号描述了使用蛋白酶、过氧化氢源和优选 化学上不可过水解的酯底物在水溶液中原位产生过酸的活化氧化剂 系统。还公开了漂白的方法和形成过酸的方法。酶促反应在约8.0-10.5 的pH下进行，该专利的任何所附实施例都没有证实生产出大于5ppm 的过酸。在所例举的过水解反应中存在的过氧化氢最高浓度是400 ppm，相当于大约11.8mM H2O2。
O.Kirk等(Biocatalysis，11：65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、 酯酶和蛋白酶)催化用过氧化氢对酰基底物过水解而形成过氧羧酸的 能力，报道说过水解在含水系统中进行的效率非常低。此外，他们 发现脂肪酶和酯酶将过羧酸降解成了相应的羧酸和过氧化氢。他们 还发现蛋白酶在水中既不降解也不催化羧酸酯的过水解。作者推断， 酯酶、脂肪酶和蛋白质一般来说不适宜于在含水环境中催化简单的 酯如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯的过水解。
所要解决的问题是，提供在中性至酸性条件下从无毒和廉价的 羧酸酯、酰胺和/或甘油酯原位产生过酸组合物的含水酶促方法，其 浓度在多种应用中适合用作消毒剂。优选地，该方法在至少约5分 钟时间内将产生过酸的浓水溶液。故此，酶促过水解方法应在至少500 mM过氧化氢(过氧源)存在下进行。已有报道说，对于一些消毒、清 洁或漂白应用，优选非碱性过酸溶液。故此，该方法应在中性至酸 性条件下、更优选在酸性条件下在单个步骤中产生过酸水溶液。该 方法优选需要产生包含至少10ppm过酸(例如过乙酸)、更优选至少 100ppm、甚至更优选约100至约5000ppm之间的过酸组合物，其 中所产生的过酸组合物可直接使用，或者在使用前稀释到所需的过 酸浓度，以在约0℃至约60℃、优选约4℃至约30℃、最优选10℃ 至约25℃的温度下，在约5分钟至约10分钟内引起目标传染性微 生物的浓度减少5个或6个对数级。
第二个要解决的问题是，提供产生具有消毒、漂白和朊病毒降 解活性的多功能组合物的方法。该方法应能原位产生包含足够的消 毒和/或漂白浓度的过酸和一种或多种朊病毒降解蛋白酶的过酸水溶 液。
另外要解决的问题在于缺乏酶催化剂和酶底物的组合，该组合 能导致羧酸酯或酰胺转化成的过羧酸的浓度与先前在现有技术中所 公开的过酸浓度相比，对洗衣应用中的漂白更加有效。该问题的解 决办法需要1)有效地产生出过酸水溶液，其中过酸以足够充当消毒 剂或漂白剂的浓度存在；2)使用具有合适的过水解酶(perhydrolase)活 性的酶催化剂，用于在水溶液中将羧酸酯、酰胺和/或甘油酯转化成 相应的过酸；3)提供改进催化剂稳定性以提高催化剂生产率的方法， 从而降低催化剂成本；和4)提供有效地和经济地从相对廉价和无毒 的原料获得过酸的方法。
发明概述
上述问题已通过提供以下方法而得到解决，该方法用至少一种 具有过水解酶活性的酶，在过氧化氢(浓度至少为500mM)存在下， 在中性至酸性反应条件下，从合适的羧酸酯(包括甘油酯)和/或酰胺底 物原位产生过酸水溶液。所产生的过酸的浓度足以用于多种消毒和/ 或漂白应用中。
本发明的一个方面提供产生浓过酸水溶液的方法，所述方法包 括
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述各反应成分组合时即能提供浓度至少为 500mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在约2.5至约7.5的pH下组合，由此在将 所述各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生出浓过酸溶 液。
这个方法产生出过酸浓度为至少10ppm的浓过酸溶液。
在本发明的一个方面，所述至少一种底物是选自以下的酯底物： 乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、 甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯和它们的混合物。
在本发明的另一个方面，所述至少一种底物是选自一醋精、二 醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、甘油一辛酸酯、甘油二 辛酸酯、甘油三辛酸酯和它们混合物的甘油酯底物。
在本发明的又一个方面，所述至少一种底物是选自甘油一乙酸 酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和它们混合物的甘油酯底物。
在本发明的一个方面，所述至少一种酶催化剂是至少一种由选 自以下属的生物产生的脂肪酶：曲霉属(Aspergillus)、根霉属 (Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、毛霉属(Mucor)、嗜热霉属(Thermomyces)、产碱菌属 (Alcaligenes)和猪属(Sus)。
在另一个方面，酶催化剂是至少一种选自南极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶B和黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的脂肪酶。
在本发明的另一个方面，所述至少一种酶催化剂是至少一种具 有过水解活性和朊病毒降解活性的蛋白酶。
在本发明的另一个方面，酶催化剂包括至少一种脂肪酶和至少 一种朊病毒降解蛋白酶。
在本发明的许多方面，由各反应成分的组合所产生的过酸是过 乙酸。
本发明的另一个方面提供对具有一定浓度的微生物或病毒或它 们的组合的部位进行消毒的方法，所述方法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支 链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支 链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少为500 mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和它们的混合物；
b)将所述各反应成分在2.5至7.5的pH下组合，由此在将所述 各反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内形成过酸浓度为至少10 ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释所述过酸水溶液；
d)使所述部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触，由 此使得所述微生物的浓度减少至少3个对数级。
在本发明的另一个方面，在将所述各反应成分组合后约48小时 内，或者在约5分钟至约48小时内，使所述部位与如上所述在步骤 b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触。
本发明的另一个方面提供对污染一种或多种包括传染性朊病毒 或朊病毒颗粒在内的病原体的部位进行净化或消毒的方法，所述方 法包括：
a)提供一组过酸反应成分，所述成分包括：
1)至少一种选自以下的底物：
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或 (CH2CH(CH3)-O)nH，n＝1-10；
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或 支链烷基，R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)具有以下结构的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基；
2)过氧源，其在将所述反应成分组合时即能提供浓度至少为500 mM的过氧化氢；
3)至少一种具有过水解酶活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂 选自脂肪酶、蛋白酶和它们的混合物；
4)至少一种朊病毒降解蛋白酶，其中一种或多种所述朊病毒降 解蛋白酶可与(a)(3)中提供过水解酶活性的酶催化剂相同；
b)将所述各反应成分在2.5-7.5的pH下组合，由此在将所述各 反应成分组合后至少约5分钟至约2小时内产生过酸浓度为至少10 ppm的浓过酸水溶液；
c)任选稀释步骤(b)所产生的所述过酸溶液；
d)使污染微生物、病毒、朊病毒或朊病毒颗粒或它们的组合的 部位与步骤b)或步骤c)产生的过酸水溶液相接触，由此使得所述部 位被消毒，所述朊病毒颗粒被降解。
本发明的另一个方面提供由上述方法原位产生的浓过酸溶液， 其中所述溶液包含至少一种适合于朊病毒降解的蛋白酶。
本发明的又一个方面提供包含由上述方法产生的浓过酸溶液的 多功能消毒剂组合物，其中所述组合物适合于朊病毒降解、适合用 作杀生物剂、适合用作杀病毒剂或它们的组合。
发明详述
上述问题由于发现了酶与羧酸酯或酰胺的组合而得到解决，所 述组合在无机的过氧源(例如过氧化氢)存在下能产生足以适合消毒或 漂白应用的过酸浓度。意想不到的是，在酶催化的过水解反应中可 采用约500mM至约2500mM的过氧化氢浓度，来在5-10分钟内产 生浓度高达5000ppm的过酸，其中这些高过氧化物浓度曾被认为会 使过水解酶催化剂快速失活。
与先前报道的通过酯的酶促过水解产生的过酸浓度进行比较时 发现，本发明的酶和酶底物在本文报道的浓度范围内的组合意想不 到地和有效地产生出足够高浓度的过酸水溶液，该浓度使过酸水溶 液能充当杀生物或杀病毒消毒剂及漂白剂。用酶催化剂(例如脂肪酶、 蛋白酶)按本文的描述产生出了超过10ppm(通常大于约75ppm)的过 酸浓度，其中所产生的含过酸溶液或其稀释液能在约25℃下在5-10 分钟内减少传染性细菌5个或6个对数级。
PCT出版物第WO2004039418 A1号和美国专利申请出版物第 20020172989 A1号描述了应用蛋白酶或蛋白酶混合物来破坏传染性 朊病毒蛋白质的朊病毒净化方法。在本发明的另一个方面，提供了 包含朊病毒降解蛋白酶及原位产生的具有杀生物和/或杀病毒活性的 过酸浓度的清洁和消毒组合物。在又一个方面，朊病毒降解蛋白酶(例 如蛋白酶K、链霉蛋白酶和它们的组合)能够催化酯和/或酰胺的过水 解，产生其浓度能有效进行消毒的对应过酸，从而产生出具有朊病 毒降解活性的杀生物剂和/或杀病毒剂。在本发明的再一个方面，可 在单独蛋白酶不能产生有效浓度的过酸的pH下(例如在4.0-6.5的pH 下)，将朊病毒降解蛋白酶与添加的具有过水解活性的酶(如脂肪酶) 组合使用。该组合还可产生协同浓度(a synergistic concentration)的过 酸，即其所产生的过酸浓度大于单独蛋白酶或脂肪酶所产生的过酸 浓度之和。
所有引述的参考文献通过引用具体结合到本文中，除非另有规 定。此外，当量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或一列 优选上限值和优选下限值给出时，这应理解为明确地公开了由任何 一对任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值所构成的所有 范围，而不论范围是否单独公开。在本文叙述了数值范围的地方， 除非另有规定，否则该范围意指包括其端点和落入其中的所有整数 和分数。不想使本发明的范围受限于定义某个范围时所叙述到的具 体数值。
在本文公开内容中，使用了许多术语和缩写。适用以下定义， 除非另外明确规定。
本文所用的修饰所采用的本发明成分或反应物的量的术语 “约”，指例如由于以下原因可能会出现的数量变化：由于用以在现实 中制备浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理程序；由于在这些 程序中的因疏忽所致的误差；由于用来制造组合物或实施方法的各 成分在制造、来源或纯度上的差异；等等。术语“约”还涵括由于具体 的初始混合物所致的组合物平衡条件不同而不同的数量。不管是否 受术语“约”的修饰，各权利要求包括各量的相当量。在一个实施方案 中，术语“约”指在所报道的数值的±10％范围内，优选在所报道的数 值的±5％范围内。
本文所用的术语“包含”指存在着各权利要求中所提到的规定特 征、整体、步骤或成分，但它并没有排除一种或多种其它特征、整 体、步骤、成分或者它们的组群的存在或增加。
本文所用术语“过酸(peracid)”与过氧酸(peroxyacid、peroxy acid、 peroxoic acid)、过羧酸(percarboxylic acid)同义。众所周知，过酸包括 过乙酸。
本文所用的术语“过乙酸”缩写为“PAA”，与过氧乙酸、乙烷过氧 酸和CAS登记号79-21-0的所有其它同义词同义。
术语“三醋精”与甘油三乙酸酯(glycerin triacetate、glycerol triacetate、glyceryl triacetate)、1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三 乙酸酯和CAS登记号102-76-1的所有其它同义词同义。
本文所用的术语“合适的酶促反应混合物”指反应物和酶催化剂 在其中发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的 各成分，本领域技术人员会理解适合于本方法的成分变化范围。在 一个实施方案中，当将各反应成分组合时，合适的酶促反应混合物 即原位产生过酸。故此，可将各反应成分作为多成分系统来提供， 其中一种或多种反应成分保持分离至使用时。用以组合多个活性成 分的系统的设计是本领域公知的，通常须由各个反应成分的物理形 式而定。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相 系统(美国专利申请出版物第2005/0139608号；美国专利第5,398,846 号、第5,624,634号、第6,391,840号；欧洲专利第0807156B1号； 美国专利申请出版物第2005/0008526号；PCT出版物第WO 00/11713A1号)，如在一些漂白应用中所见的，其中当将各反应流体 混合时即产生所需的漂白剂。其它形式的用以产生过酸的多成分系 统可包括但不限于为一种或多种固体成分或固-液成分的组合设计的 系统，如粉末剂(例如许多市售的漂白组合物，美国专利第5,116,575 号)、多层片剂(美国专利第6,210,639号)、具有多个区室(compartment) 的水可溶解小包(packet)(美国专利第6,995,125号)和在加水时发生反 应的固体聚集物(美国专利第6,319,888号)。
本文所用的术语“过水解”定义为选定的底物与过氧化物形成过 酸的反应。通常，使无机过氧化物与选定的底物在催化剂的存在下 反应产生过酸。本文所用的术语“化学过水解”指过水解反应，其中将 底物(过酸前体)与过氧化氢源组合，在不存在酶催化剂情况下形成过 酸。本文所用的术语“酶促过水解”指通常归类为水解酶的酶帮助或催 化的过水解反应。
“羧酸酯水解酶”指催化酯的水解的酶(E.C.3.1.1.-)。羧酸酯水解 酶家族包括但不限于脂肪酶(例如三酰基甘油脂肪酶[E.C.3.1.1.3])和 酯酶。
“脂肪酶”指通过水解酯键而催化脂肪水解成甘油和脂肪酸的酶 (EC 3.1.1.3)。一些脂肪酶据报道具有过水解活性。
“酯酶”指催化酯的水解的酶(E.C.3.1.1.-)。一些酯酶据报道具有 过水解活性。
“蛋白酶”指通过肽键的水解而催化蛋白质的水解分解的酶(EC 3.4.-)。如本文所描述，一些蛋白酶显示过水解活性。
本文所用的术语“过水解酶催化剂”和“至少一种具有过水解酶活 性的合适酶催化剂”在本文中指以过水解酶活性为特征的酶催化剂。 该酶催化剂选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶和/或它们的混合物，其中该 催化剂具有过水解活性。该酶催化剂可为如下形式：完整微生物细 胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、 部分纯化酶或纯化酶。本文所用的术语“从生物体产生”用以描述合适 的催化剂的来源。酶催化剂可从目标生物体产生，或者可在合适的 生产宿主中重组产生。
本文所用的“一单位的酶活性”或“一单位的活性”或“U”定义为在 指定温度下每分钟产生1μmol过酸产物所需的酶活性的量。
本文所用的术语“过水解酶活性”指每单位质量(例如毫克)的蛋白 质、固体或液体含酶组合物、干燥细胞或固定化催化剂的酶活性。 各催化剂的过水解酶活性经比较确定与干燥细胞重量、固体或液体 含酶组合物或蛋白质催化剂重量成比例。
本文所用的术语“消毒”指进行清洁以消灭病原微生物或防止其 生长的过程。本文所用的术语“消毒剂”指通过消灭、中和致病微生物 或抑制其生长进行消毒的物质。通常，消毒剂用来处理无生命物体 或表面。本文所用的术语“防腐剂”指抑制致病微生物生长的化学物 质。
本文所用的术语“杀病毒剂”指抑制或消灭病毒的物质。将显示 出抑制或消灭病毒的能力的物质描述为具有“杀病毒”活性。过酸可具 有杀病毒活性。本领域公知的可适合与本发明一起使用的典型替代 性杀病毒剂包括例如醇类、醚类、氯仿、甲醛、苯酚、β-丙内酯、碘、 氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和去污剂。
本文所用的术语“杀生物剂”指能失活或消灭微生物的、通常广 谱的化学物质。将显示出失活或消灭微生物的能力的化学物质描述 为具有“杀生物”活性。过酸会具有杀生物活性。本领域公知的可适合 与本发明一起使用的典型替代性杀生物剂包括例如氯、二氧化氯、 氯代异氰尿酸、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺类、氯化苯酚、铜盐、 有机硫化合物和季铵化合物。
本文所用的词语“最小杀生物浓度”指对于特定的接触时间，将 会引起目标微生物活群体发生所需的致命性不可逆的减少的杀生物 剂最小浓度。有效性可通过处理后活微生物的log10减少来测量。在 一个方面，处理后活细胞的目标减少量是减少3个对数级，更优选 减少4个对数级，最优选至少减少5个对数级。在另一个方面，最 小杀生物浓度是使活微生物细胞减少6个对数级。
本文所用的术语“朊病毒”、“朊病毒颗粒”和“传染性朊病毒颗粒” 指与神经变性性疾病有关的传染性蛋白质，所述神经变性性疾病包 括但不限于瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、传染性海绵状脑病(TSE)、 慢性消耗性疾病和Creutzfeldt-Jacob病。术语“朊病毒破坏性蛋白酶” 或“朊病毒降解性蛋白酶”指至少一种可用于降解或破坏传染性朊病毒 颗粒的蛋白酶(优选两种或多种蛋白酶的组合)(例如参见WO 2004039418 A1和US 20020172989 A1)。在一个实施方案中，朊病毒 破坏性蛋白酶选自蛋白酶K、链霉蛋白酶和它们的混合物。在一个 优选的实施方案中，朊病毒破坏性蛋白酶是蛋白酶K和链霉蛋白酶 的混合物。
在一个方面，当应用在某部位之上和/或之处时，本发明方法所 形成的过酸可用来减少微生物群体。本文所用的本发明“部位(locus)” 包括适合于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括 所有会潜在污染微生物、病毒、朊病毒或它们的组合的表面。其非 限制性实例包括食品或饮料工业中存在的设备表面(如罐、传送装置、 地面、排水沟、冷却器、冷冻设备、设备表面、墙、阀门、传送带、 管道、排水道、接缝、裂缝、它们的组合等等)；建筑表面(如墙、地 面和窗)；非食品工业相关的管道和排水道，包括水处理设施、泳池 和温泉区及发酵罐；医院和兽医表面(如墙、地面、床、设备(如内诊 镜)、在医院/兽医或其它保健环境中穿戴的衣服(包括洗擦布、鞋子) 和其它医院或兽医表面)；餐馆表面；浴室表面；卫生间；服装和鞋 子；牲畜如禽、牛、奶牛、山羊、马和猪的棚或厩的表面；禽或虾 的孵卵所。另外的表面还包括食物产品如牛肉、禽柔、猪肉、蔬菜、 水果、海产和它们的组合等等。部位还可包括吸水材料如受感染的 亚麻布或其它纺织品。部位还包括收获的植物或植物产品(包括种子、 玉米、块茎、水果和蔬菜)、生长中的植物特别是生长中的作物(包括 谷物、叶菜和用来作色拉的蔬菜、根菜、豆类、浆果类、柑橘类和 硬肉水果)。
表面材料的非限制性实例有金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、 铜、黄铜、铝和它们的合金)、矿物(例如混凝土)、聚合物和塑料(例 如聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯 腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(丙烯腈、丁二烯)、 丙烯腈丁二烯)；聚酯如聚对苯二甲酸乙二酯和聚酰胺如尼龙)。另外 的表面包括砖、瓦、陶、瓷、木、乙烯树脂、油布和地毯。
从羧酸酯和/或酰胺和过氧化氢酶催化制备过酸的合适水性反应条件
提供了产生包含过酸的含水混合物的方法，即通过使合适的底 物、至少一种具有过水解活性的酶催化剂和过氧源发生反应，所述 过氧源在中性至酸性pH下能提供500mM或更高的过氧化氢浓度。 本文所用术语“过氧源”指当在水溶液中时能够提供浓度为至少500 mM或更高的过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢 加合物、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所述，当将各反应成分组合 时，过氧源能够提供出过氧化氢浓度为至少500mM的混合物。
本文所用的术语“合适的底物”、“过酸前体”和“漂白激活剂”用来 描述能够用本发明的反应条件进行酶促过水解以产生过酸的底物。 底物在酶的存在或不存在下，还可进行部分的化学过水解。故此， 适合于本发明的底物是在相同反应条件下进行酶促过水解比进行化 学过水解多产生至少10ppm过酸的底物，优选至少100ppm，更优 选至少250ppm，甚至更优选至少500ppm，又甚至更优选至少1000 ppm，还甚至更优选至少2000ppm，最优选至少5000ppm的过酸。
合适的底物可包括在本发明反应条件下能够进行酶促过水解的 一种或多种羧酸酯、酰胺、甘油酯(一、二和/或三甘油酯)或它们的混 合物。在一个实施方案中，底物可任选被取代，特别是被烷氧基和/ 或羟基取代。在另一个实施方案中，底物可以是酰化多元醇。在又 一个实施方案中，酰化多元醇选自从甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、木 糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘露糖醇和山梨糖醇衍生的一、二或 多酰化多元醇。
在一个优选的实施方案中，合适的底物包括具有选自以下的化 学式的羧酸酯、酰胺和/或甘油酯：
a)下式的酯：
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支链烷基， R2＝C1-C10直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH， n＝1-10；
b)下式的甘油酯：
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C10直链或支链烷基， R3和R4各自为H或R1C(O)；
c)下式的酰胺：
其中R5和R6＝H或C1-C5直链或支链烷基。在一个实施方案中，底 物可以是一种或多种本文所述的合适底物的混合物。
在一个优选的实施方案中，底物选自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙 醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基 丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、 葡糖酸内酯、一醋精、二醋精、三醋精、一丁精、二丁精、三丁精、 甘油一辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油三辛酸酯、乙酰胺、二乙酰胺 和它们的混合物。
在又一个优选的实施方案中，底物选自一醋精、二醋精、三醋 精、乙酰胺、二乙酰胺和它们的混合物。
酶底物在反应混合物中存在的浓度，在发生酶催化过水解时足 以产生出所需浓度的过酸。所附实施例中证明，存在着可产生适需 浓度过酸的酶底物和酶催化剂的优选组合。底物不需要完全可溶于 反应混合物中，但应有足够的溶解度，以便酶催化剂将酯或酰胺转 化成相应的过酸。底物在反应混合物中的存在浓度为占反应混合物 的0.05wt％-40wt％，优选占反应混合物的0.1wt％-20wt％，更优选 占反应混合物的0.5wt％-10wt％。当使用脂肪酶、酯酶或蛋白酶作 为催化剂，或者使用脂肪酶和/或蛋白酶的组合作为催化剂时，优选 的底物包括一醋精、二醋精、三醋精和一醋精/二醋精/三醋精混合物。 当使用蛋白酶作为催化剂，或者使用脂肪酶和蛋白酶的组合作为催 化剂时，另外优选的底物包括乙酰胺、二乙酰胺和它们的混合物。
过氧源可包括但不限于过氧化氢、过硼酸盐(例如过硼酸钠)和过 碳酸盐(例如过碳酸钠)。反应混合物中的过氧化合物浓度可在0.1wt％ 至约50wt％的范围，优选1wt％至约40wt％，更优选2wt％至约30 wt％。
当将各反应成分组合时，含水反应混合物中过氧化合物所提供 的过氧化氢浓度最初至少为500mM或更高。在一个实施方案中，含 水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。在另一个实施 方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为2500mM或更高
含水反应混合物中过氧化氢与底物的摩尔比(H2O2∶底物)可为约 0.1-20，优选约0.5-10，最优选约2-5。
各反应成分可在单独的批次中组合，或者可用连续工艺组合。
酶催化剂选自水解酶类，其包括酯酶、脂肪酶和蛋白酶(分别为 EC 3.1.1.-、EC 3.1.1.3和EC 3.4.-.-)、 具体的说，可用于本发明的酶 是水解酶类如酯酶、脂肪酶和蛋白酶，其催化活性通常是将酯水解 成相应的羧酸和醇，或将酰胺水解成相应的羧酸和氨或胺，其中在 过氧化氢(或功能上相当的含过氧化合物)的存在下，酯或酰胺经历酶 催化的过水解，产生出相应的过羧酸。
在一个方面，酶催化剂是得自真核生物或原核生物的脂肪酶。 在另一个方面，所述脂肪酶得自选自以下的属的生物：曲霉属、根 霉属、青霉属、假丝酵母属、假单胞菌属、毛霉属、嗜热霉属、产 碱菌属和猪属。在一个优选的方面，脂肪酶的来源选自以下：黑曲 霉(Aspergillus niger)、米根霉(Rhizopus oryzae)、青霉属I(Penicillium sp. I)、青霉属II(Penicillium sp.II)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、南 极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、洋 葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、细毛嗜热霉(Thermomyces languinosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、野猪(Sus scrota)和产碱菌属(Alcaligenes sp.)。在还一个优选 的方面，脂肪酶选自曲霉属脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、南极假丝酵母 脂肪酶B、假单胞菌属脂肪酶、产碱菌属脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪 酶、米根霉脂肪酶和它们的混合物。许多本文例示的脂肪酶获自 BioCatalytics Inc.(Pasadena，CA)，按其相应的目录号(实施例1，表1) 进行指称。因此，在还一个优选的方面，脂肪酶选自ICR-101曲霉 属脂肪酶、ICR-102根霉属脂肪酶、ICR-103米根霉脂肪酶、ICR-104 青霉属I脂肪酶、ICR-105青霉属II脂肪酶、ICR-106皱褶假丝酵母 脂肪酶、ICR-107洋葱假单胞菌脂肪酶、ICR-108假单胞菌属脂肪酶、 ICR-109荧光假单胞菌脂肪酶、ICR-110南极假丝酵母脂肪酶B、 ICR-111南极假丝酵母属脂肪酶、ICR-112南极假丝酵母脂肪酶A、 ICR-113假单胞菌属脂肪酶、ICR-114猪胰腺脂肪酶、ICR-115细毛 嗜热霉脂肪酶、ICR-116米黑毛霉脂肪酶和ICR-117产碱菌属脂肪酶。 在还一个优选的方面，脂肪酶选自：脂肪酶AY“Amano”30(皱褶假 丝酵母脂肪酶)、脂肪酶R“Amano”(娄地青霉(Penicillium roqueforti) 脂肪酶)、脂肪酶F-APl5(米根霉脂肪酶)、脂肪酶M“Amano”10(爪 哇毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶)、脂肪酶A“Amano”12(黑曲霉脂肪 酶)、脂肪酶G“Amano”50(卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪 酶)、Amano F-DS脂肪酶(米根霉脂肪酶)、Amano DS脂肪酶(黑曲霉 脂肪酶)(均自Amano)，和CALB L(南极假丝酵母脂肪酶B的液体 制剂)、Novozym 435(固定化南极假丝酵母脂肪酶B)、Lipozyme TL(，细 毛嗜热霉脂肪酶)、Palatase 20000L(米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶) (均自Novozymes)，Validase AN脂肪酶(黑曲霉脂肪酶)、Dietrenz CR 脂肪酶(皱褶假丝酵母脂肪酶)(均自Valley Research)和Enzeco MLC 脂肪酶(的获自黑曲霉的微生物脂肪酶浓缩物，Enzyme Development Corporation出售)。最优选地，脂肪酶选自BioCatalytics ICR-101(曲 霉属脂肪酶)、BioCatalytics ICR-110(南极假丝酵母脂肪酶B)、 BioCatalytics Chirazyme L2脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶B)、 BioCatalytics ICR-113(假单胞菌属脂肪酶)、BioCatalytics CR-117(产 碱菌属脂肪酶)、脂肪酶A“Amano”12(黑曲霉脂肪酶)、Novozym CALB L(南极假丝酵母脂肪酶B)、Novozym 435(固定化南极假丝酵 母脂肪酶B)、Novozym Palatase 20000L(米曲霉脂肪酶)和valley Research Validase AN(黑曲霉脂肪酶)。
在一个实施方案中，酶催化剂是得自真核生物或原核生物的蛋 白酶E.C.3.4.-.-)。在另一个实施方案中，所述蛋白酶得自选自以下 的属的生物：曲霉属、根霉属、芽孢杆菌属(Bacillus)、猪属、番木瓜 属(Catica)、凤梨属(Ananas)、假单胞菌属、毛霉属、嗜热霉属、产 碱菌属和猪属。在还一个优选的方面，蛋白酶的来源选自斋滕曲霉 (Aspergillus saitoi)、米根霉属、芽孢杆菌属、野猪(Sus scrota)、番木 瓜(Catica papaya)、菠萝(Ananas comosus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和白色麦轴霉(Tritirachium album)。在一个优选的实施方案 中，蛋白酶选自斋滕曲霉XIII型蛋白酶、米根霉属XVIII型蛋白酶、 芽孢杆菌属蛋白酶、野猪胃蛋白酶、番木瓜的木瓜凝乳蛋白酶、菠 萝的菠萝蛋白酶、番木瓜的木瓜蛋白酶、灰色链霉菌的链霉蛋白酶(也 称Pronase E_)、白色麦轴霉蛋白酶K(包括从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组产生的蛋白酶K)和它们的混合物。
许多酶催化剂(完整细胞、部分纯化的或纯化的)据报道具有过氧 化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。 在一个优选的实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性， 或者经工程改造或纯化降低或消除了过氧化氢酶活性。
含水反应混合物中采用的酶催化剂的浓度，部分取决于酶催化 剂的比催化活性，故对其进行选择以获得所需的反应速度。在过水 解反应中用作催化剂的可溶性酶的重量通常在0.01mg-10mg酶/mL 总反应体积的范围内，优选0.10mg-2.0mg酶/mL。酶还可用本领域 技术人员公知的方法固定化在可溶性或不溶性载体上；参见例如 Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff(编辑)； Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化酶可以使酶催化剂 得以回收并在随后的反应中再使用。可用于本发明的另外形式的酶 催化剂包括完整微生物细胞、细胞提取物和部分纯化的酶。这些另 外形式的酶催化剂还可用以上提到的方法进行固定化。
在一个方面，底物的化学过水解和酶促过水解的组合所产生的 过酸的浓度，足以为在所需pH下进行的漂白或消毒提供有效浓度的 过酸。在另一个方面，本发明方法提供酶和酶底物的组合来产生所 需有效浓度的过酸，其中在不添加酶的情况下，所产生的过酸的浓 度明显低得多。尽管在一些情况下，无机过氧化物与酶底物的直接 化学反应会使酶底物发生实质的化学过水解，但可能不会产生出足 够浓度的过酸来在所需应用中提供有效浓度的过酸，故通过向反应 混合物中添加适当的酶催化剂来实现总过酸浓度的显著提高。
本发明方法产生出浓过酸水溶液，其在使用前可任选进行稀释 (例如用水稀释)。本文所用的“过酸溶液”、“过酸水溶液”和“浓过酸水 溶液”是指本发明酶催化过水解方法所产生的浓过酸溶液。在一个实 施方案中，“浓过酸水溶液”包含至少10ppm过酸、优选至少100ppm 过酸、更优选至少200ppm过酸、甚至更优选至少250ppm过酸、 又甚至更优选至少500ppm、还甚至更优选至少1000ppm、再甚至 更优选至少2000ppm、最优选至少5000ppm。包含过酸的产物混合 物可任选用水或主要由水组成的溶液稀释，以产生具有所需较低浓 度的过酸的混合物。要稀释本发明方法所产生的过酸水溶液的决定 取决于多个因素，包括但不限于应用目标(动物健康消毒剂、仪器杀 菌剂、家庭清洁剂、漂白剂等)、确保应用目标达到所需功效水平而 要求的温度和时间、在目标部位之处和/或之上的污物数量以及目标 病原体对过酸消毒剂的敏感性。为产生所需浓度的过酸而要求的反 应时间不超过约2小时，优选不超过约30分钟，更优选不超过约10 分钟，最优选约5分钟或更少时间。随着反应的继续进行，过酸的 浓度会增加到平衡点。故此，本发明涉及在约5分钟内产生高浓度 的方法，所述浓度可继续升高，直到达到反应平衡。
选择过酸合成反应的温度，以兼顾控制反应速度和酶催化剂活 性的稳定性。反应的温度范围可从刚好高于反应混合物的冰点(大约 0℃)至约65℃，优选的反应温度范围是约约5℃至约35℃。
含有过酸的最终反应混合物的pH(即当将各反应混合物组合后 反应混合物的pH)为2.5-7.5，优选3-7，更优选3.5-6.5，最优选4-6.5。 反应的pH和最终反应混合物的pH可任选通过加入合适的缓冲剂来 控制，缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐 或柠檬酸盐，缓冲剂的浓度为0.1mM-1.0M，优选1mM-100mM， 最优选10mM-50mM。
在另一个方面，酶促过水解产物可含有能提供所需功能性的另 外成分。这些另外成分包括但不限于洗涤助剂、乳化剂、表面活性 剂、腐蚀抑制剂、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。 许多这些另外成分是洗涤剂工业公知的(参见例如美国专利第 5,932,532号，其通过引用结合到本文中)。乳化剂的实例包括聚乙烯 醇或聚乙烯基吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)。表面活性剂的实例包括a) 非离子型表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基 化或丙氧基化直链或支链伯醇和仲醇及脂族氧化膦；b)阳离子型表面 活性剂如季铵化合物，特别是其中C8-C20烷基结合到氮原子，而氮 原子另外又结合到三个C1-C2烷基的季铵化合物；c)阴离子型表面活 性剂如烷基羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、烷基磺酸盐(十 二烷基硫酸钠“SDS”)或直链或支链的烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐；d) 两性表面活性剂和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸和 烷基甜菜碱。另外成分可包括香料、染料、过氧化氢的稳定剂(例如 1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(Dequest 2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO))、 酶活性的稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、洗涤助剂和金属螯合物(例如 乙二胺四乙酸(EDTA))。
过酸的酶促原位产生
本发明的含水酶促方法能原位产生高浓度的一种或多种过酸。 所产生的过酸反应性非常高和相对不稳定，通常随时间推移浓度会 降低。故此，宜将各反应成分保持分开，特别是对于液体配方。在 一个方面，过氧化氢源与底物或酶分开，优选与这两者分开。这可 用多种技术来实现，这些技术包括但不限于使用多室分配器(美国专 利第4,585,150号)，然后物理上将酶催化剂与本发明的底物和过氧化 氢源组合，以引发含水酶促过水解反应。可将酶催化剂固定化在反 应器的腔室当中，或者在接触要进行处理的表面和/或物体前先将酶 催化剂与包含过酸的反应产物相分离(例如过滤分离等)。酶催化剂可 在液体基质中，或者为固体形式(例如粉末、片剂)，或者包埋在固体 基质当中，该固体基质之后与底物和过氧化氢源混合而引发酶促过 水解反应。在又一个方面，酶催化剂可装在可溶解的或多孔的小袋 中，该小袋可加入到含水底物基质中而引发酶促过水解。
测定过酸和过氧化氢的浓度的HPLC测试方法
有多种分析方法可用于本发明以分析反应物和产物，包括但不 限于滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS) 和毛细管电泳法(CE)。
如本文所述，采用了U.Karst等(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627 (1997))所描述的分析程序来分析含过酸和过氧化氢的产物混合物。 简单的说，分析样品中的过乙酸(PAA)的浓度在0.025mM-10mM 的范围，H2O2的浓度在0.075mM-3mM的范围。如有需要，在分 析前，将含有过酸和/或过氧化氢的反应混合物进行稀释，以产生在 这些范围内的过酸或过氧化氢浓度。向4mL小瓶中装入0.100mL 的20mM甲基对甲苯基硫醚(MTS)乙腈溶液、0.300mL的蒸馏并去 离子的水(dd)和0.100mL的样品溶液(不稀释或者用dd稀释最多25 倍以分析过酸)，或者将0.100mL的20mM MTS乙腈溶液和0.390mL 的dd水加入到0.010mL的1∶10稀释的样品溶液(为分析过氧化氢)。 反应10分钟时间后(暗处、不搅拌)，加入0.400mL的CH3CN和0.100 mL的40mM三苯膦(TPP)的CH3CN溶液，启动第二衍生化反应以 检测过氧化物。将溶液在暗处静置30分钟，完成测试反应。30分钟 结束时，加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯酰胺(DEET，HPLC 外标物)，将所得溶液进行HPLC分析：带预柱的Supelco Discovery C8 10-cm柱，10-μL注射，225nm处紫外检测，溶剂A：乙腈，溶剂B： 去离子水，1mL/min梯度如下：
时间(分:秒) ％CH3CN ％H2O 0:00 3:00 3:10 4:00 4:10 7:00(停止) 40 40 100 100 40 40 60 60 0 0 60 60
过酸的最小杀生物浓度的测定
采用J.Gabrielson等(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所描 述的方法来测定过酸的最小杀生物浓度(MBC)或者测定过氧化氢和酶 底物的MBC。该测试方法基于XTT还原抑制作用，其中XTT ((2，3- 双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑_，内盐， 一钠盐)是氧化还原染料，可通过490nm或450nm处测量的光密度 (OD)变化指示微生物呼吸活性。但是，有多种其它方法可供测试消 毒剂和防腐剂的活性，包括但不限于活菌平板计数、直接显微镜计 数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.， Disinfection，Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。
消毒剂和防腐剂的杀病毒活性的测定
评估消毒剂和防腐剂的杀病毒活性的方法是本领域公知的(Brock， S.，出处同上，Papageorgiou等，Appl.Environ.Microbiol.，67(12)： 5844-5848(2001))。本发明过酸组合物预期能显示杀病毒活性。据报 道，酸性条件(pH＜7)可增强杀病毒活性。因此，在又一个方面，本 发明的过酸组合物可具有酸性pH(pH＜7)。在另一个实施方案中，pH 小于6.5，优选小于6，更优选小于约5。
酶法制备的过酸组合物的应用
根据本发明方法酶促产生的过酸可用于多种应用中，以减少本 文所定义部位的微生物、真菌、病毒和传染性蛋白质(即朊病毒)的污 染，如用以对以下部位进行去污染：医疗器械(例如内诊镜)、纺织品 (例如服装、地毯)、食品制作表面、食品储藏和食品包装设备、用于 包装食物产品的材料，小鸡孵育和生长设施、动物围栏、水处理设 施、泳池和温泉区、发酵罐及具有微生物和/或病毒活性的工艺废水。 在一个优选方面，本发明过酸组合物特别适用作不可高压灭菌的医 疗器械和食品包装设备的清洁消毒剂。由于含过酸的配方可用GRAS 安全或食品级的成分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)来制备，酶产 生的过酸还可用于动物畜体、肉、水果和蔬菜的净化，或者用于预 制食品的净化。酶产生的过酸可掺入到其最终形式为粉末、液体、 凝胶、固体或气溶胶的产品中。酶产生的过酸可稀释到仍能提供有 效的净化作用的浓度。
包含有效浓度的过酸的组合物可用来清洁和消毒污染(或怀疑污 染)病原微生物、病毒和/或朊病毒的表面和/或物体，即通过使表面和 /或物体与本发明方法所产生的产物相接触来进行清洁和消毒。本文 所用的“接触”指将包含有效浓度的过酸的消毒组合物置于与怀疑污染 致病实体(disease-causing entity)的部位保持接触的状态长达足以清洁 和消毒的一段时间。本领域技术人员能容易地确定当接触所需部位 时所要用的时间、温度和有效浓度。接触包括将包含有效浓度的过 酸的过酸溶液对怀疑受污染的表面或无生命物体进行喷雾、处理、 浸渍、冲洗、灌倒、混合、组合、涂敷、包覆、施加、粘附及以别 的方式发生联系。
具有朊病毒降解活性的过酸消毒剂
专利申请PCT出版物第2004039418 A1号和美国专利申请出版 物第20020172989 A1号描述了应用蛋白酶或蛋白酶混合物来消灭传 染性朊病毒蛋白质的朊病毒清除方法(Langeveld等，J.Infect.Diseases， 188：1782-1789(2003))。本申请中随附的实施例也证明，能够清除传 染性朊病毒的蛋白酶能催化酯或酰胺的过水解，产生出相应的其浓 度能有效进行消毒的过酸，从而使得有可能用单一酶体系就能产生 出同时含有抗微生物过酸和朊病毒降解蛋白酶的混合物。该包含朊 病毒降解蛋白酶和有效浓度的过酸的组合物，可任选包括一种或多 种表面活性剂，可包括一段时间的加热以帮助净化朊病毒。在一个 实施方案中，当净化朊病毒时所要用的表面活性剂的浓度可在0.01-50 wt％的范围，优选0.1-10wt％。热处理步骤通常在至少40℃-130℃ 的温度下进行，优选至少80℃，最优选至少100℃。该任选的热处 理的时间通常为至少1分钟直至48小时，优选小于24小时，最优 选小于2小时。在一个实施方案中，降解朊病毒的方法包括表面活 性剂和热处理两者。另外，可在单独蛋白酶可能不会产生有效浓度 的过酸的pH下(例如在pH4.0下)组合使用蛋白酶与添加的脂肪酶， 蛋白酶和脂肪酶的协同组合使用所产生的过酸浓度，比单独使用蛋 白酶或脂肪酶所产生的过酸浓度总和要高。
用本发明的过酸水溶液净化污染(或者至少怀疑污染)传染性朊病 毒的部位的方法，可另外包括至少一个以下步骤，即在用本发明方 法产生的过酸水溶液接触该部位之前或之后，用表面活性剂处理该 部位。在另一个实施方案中，可任选在接触该朊病毒污染的部位之 前将表面活性剂包括在过酸反应混合物中。在又一个实施方案中， 本发明方法可任选包括热处理步骤，其中在用过酸水溶液接触该部 位之前、过程中或之后对该部位进行热处理。在还另一个实施方案 中，本发明方法可包括任选的加热步骤和表面活性剂处理步骤两者。
一般方法
提供以下实施例来说明本发明的优选的各方面。本领域技术人 员应认识到，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人所发现的 在本发明的实施中发挥良好的技术，因此它们可被认为构成了实施 本发明的优选方式。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应认 识到，可不偏离本发明的精神和范围，对所公开的具体实施方案作 出许多改变，而仍获得同样或相似的结果。
所有试剂和材料均获自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、 GIB CO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、Charkit Chemical Corporation(Darien，CT)、Eastman Chemical Co.(Kingsport， TN)或Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有指 明。酶获自Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)、 BioCatalytics(Pasadena，CA)、Amano Enzymes USA(Lombard，IL)、 Valley Research(South Bend，IN)、Enzyme Development Corporation (New York，NY)和Novozymes(Franklinton，NC)。
说明书中的缩写对应于测量单位、技术、特性或化合物如下： “sec”指秒，“min”指分钟、“h”或“hr”指小时、“d”指密度(g/mL)、“μl” 指微升、“mL”指毫升、“L”指升、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔 浓度、“mmol”指毫摩尔、“wt”指重量、“wt％”指重量百分比、“g”指 克、“μg”指微克、“HPLC”指高效液相色谱、“O.D.”指在指定波长处 的光密度、“dew”指干燥细胞重量、“CFU”指菌落形成单位、“ATCC” 指美国模式培养物保藏中心、“U”指过水解酶活性的单位、“RPM”指 每分钟转速、“EDTA”指乙二胺四乙酸、“dd”指蒸馏并去离子，“DTT” 指二硫苏糖醇。
实施例1
pH6.5下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中)、0.900mL的278mM三醋精(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5) 中，250mM三醋精终浓度)和0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓 度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000标称 分子量限度(Nominal Molecular Weight Limit，NMWL)过滤器 (Millipore UltraFree-MC，Millipore Corp.，Billerica，MA)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表1)。
表1.pH6.5下脂肪酶催化的250mM三醋精的过水解
酶 酶来源 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 曲霉属 根霉属 米根霉 青霉属I 青霉属II 皱褶假丝酵母 洋葱假单胞菌 假单胞菌属 荧光假单胞菌 南极假丝酵母脂肪酶B 假丝酵母属 南极假丝酵母脂肪酶A 假单胞菌属 猪胰腺 细毛嗜热霉 米黑毛霉 产碱菌属 282 80 113 131 144 171 179 180 183 337 238 134 241 135 216 238 293 179 235 36 142 66 105 0 30 11 398 117 0 358 0 113 117 370
实施例2
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲 液(pH4.0)中)、0.900mL的278mM三醋精(于50mM乙酸钠/乙酸 缓冲液(pH4.0)中，250mM三醋精终浓度)和0.052mL 30％过氧化氢 (500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进行 过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸分 析(表2)。
表2.pH4.0下脂肪酶催化的250mM三醋精的过水解
酶 酶来源 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 曲霉属 根霉属 米根霉 青霉属I 青霉属II 皱褶假丝酵母 洋葱假单胞菌 假单胞菌属 荧光假单胞菌 南极假丝酵母脂肪酶B 假丝酵母属 南极假丝酵母脂肪酶A 假单胞菌属 猪胰腺 细毛嗜热霉 米黑毛霉 产碱菌属 10 238 11 0 9 11 23 32 33 32 362 24 151 221 165 206 14 185 9.6 555 0 4 16 19 34 135 53 68 688 79 86 370 53 132 0 710
实施例3
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入2mg酶(脂肪酶ICR 101 或ICR 110，BioCatalytics，Pasadena，CA)及1.0mL的含有250mM或 500mM三醋精和500mM或2500mM过氧化氢的50mM乙酸钠/乙 酸缓冲液(pH4.0)。在23℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表3)。
表3.pH4.0下脂肪酶催化的250mM或500mM三醋精的过水解
酶 三醋精 (mM) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-110 无酶 ICR-101 ICR-110 无酶 ICR-101 ICR-110 250 250 250 250 250 250 500 500 500 500 500 500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 10 461 498 17 656 1570 10 612 1860 10 1030 568 15 1158 2880 207 1109 3755
实施例4
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101-117， BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中)、0.900mL的含有二醋精(278mM)、三醋精(144mM)和一醋 精(131mM)(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物，以及 0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)或0.026mL 30％过氧化氢 (250mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离 心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进行 过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸分 析(表4)。
表4.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(278mM)、三醋精(144mM)和一 醋精(131mM)混合物的过水解
250mM H2O2 250mM H2O2 500mM H2O2 500mM H2O2 酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-102 ICR-103 ICR-104 ICR-105 ICR-106 ICR-107 ICR-108 ICR-109 ICR-110 ICR-111 ICR-112 ICR-113 ICR-114 ICR-115 ICR-116 ICR-117 16 136 127 139 151 0 0 0 3 0 451 0 0 34 0 0 0 114 56 250 159 133 174 0 16 102 27 38 384 21 24 202 0 8 7 353 19 194 26 275 284 0 29 17 0 38 669 12 20 80 0 11 0 61 44 277 232 223 286 0 47 54 7 0 484 43 38 236 0 8 0 456
实施例5
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg酶(ICR 101、110、 113或117，BioCatalytics，Pasadena，CA，于0.050mL的50mM乙酸 钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有a)二醋精(278mM)、三 醋精(144mM)和一醋精(131mM)(于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0)中)或b)二醋精(131mM)、三醋精(68mM)和一醋精(62mM)(于50 mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0)中)的含水混合物以及0.052mL 30％ 过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL 样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表5)。
表5.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物过水解
底物浓度 二醋精(131mM) 三醋精(68mM) 一醋精(62mM) 二醋精(278mM) 三醋精(144mM) 一醋精(131mM) 酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 ICR-101 ICR-110 ICR-113 ICR-117 4 502 2 616 1 183 982 102 208 2 457 948 358 896
实施例6
pH4.0下蛋白酶催化的乙酰胺和二乙酰胺的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有a)乙 酰胺(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0))中或b)二乙酰 胺(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)的含水混合物 以及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30 分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree- MC)在12,000RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品 用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测 试方法直接进行过酸分析(表7)。
表6.蛋白酶和供应商
酶，来源 目录号 供应商 蛋白酶XIII型，斋滕曲霉 蛋白酶XVIII型，根霉属 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶，猪胃 木瓜凝乳蛋白酶，木瓜乳胶 菠萝蛋白酶，菠萝茎 木瓜蛋白酶，木瓜乳胶 链霉蛋白酶，灰色链霉菌 蛋白酶K，白色麦轴霉，在巴 斯德毕赤酵母中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 P2143 P5027 P5985 P6887 C8526 3000 GDU P3125 81748 3115879 70663 Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Hong Mao Biochemicals Sigma Biochemika Roche Novagen
表7.pH4.0下蛋白酶催化的乙酰胺(250mM)和二乙酰胺(250mM)的 过水解
乙酰胺 (250mM) 乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 蛋白酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K，白色麦轴 霉，在巴斯德毕赤酵母 中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 0 35 27 48 45 66 57 81 2 26 34 0 49 41 61 65 65 63 105 43 43 49 4 88 94 95 97 100 92 135 16 116 107 138 120 131 130 172
实施例7
pH4.0下蛋白酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)、0.900mL的含有三醋 精(278mM，于50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中)的含水混合物 以及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30 分钟后，将0.050mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree- MC)在12,000RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品 用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测 试方法直接进行过酸分析(表8)。
表8.pH4.0下蛋白酶催化的三醋精(250mM)的过水解
三醋精(250mM) 三醋精(250mM) 蛋白酶 过乙酸(ppm)，5min 过乙酸(ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 10 209 65 74 65 72 83 85 10 358 30 55 44 57 59 48
实施例8
pH6.5下蛋白酶催化的三醋精的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中)、0.900mL的含有三醋精(278 mM，于50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物及0.052mL 30％过氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250 mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10 稀释，进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接 进行过酸分析(表9)。
表9.pH6.5下蛋白酶催化的三醋精(250mM)的过水解
三醋精(250mM) 三醋精(250mM) 蛋白酶 过乙酸(ppm)，5min 过乙酸(ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 51 135 89 93 111 69 161 203 26 136 119 64 163 167 170 142
实施例9
pH6.5下蛋白酶催化的乙酰胺和二乙酰胺的过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入1mg蛋白酶(表6，于0.050 mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)、0.900mL的含有a)乙酰胺(278 mM，于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)或b)二乙酰胺(278mM，于 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)的含水混合物以及0.052mL 30％过 氧化氢(500mM终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL 样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM 下离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释， 进行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过 酸分析(表10)。
表10.pH6.5下蛋白酶催化的乙酰胺(250mM)和二乙酰胺(250mM)的 过水解
乙酰胺 (250mM) 乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 二乙酰胺 (250mM) 蛋白酶 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 链霉蛋白酶 蛋白酶K，白色麦轴 霉，在巴斯德毕赤酵母 中重组表达 蛋白酶K，白色麦轴霉 无酶(对照) 蛋白酶XIII型 蛋白酶XVIII型 蛋白酶，芽孢杆菌属 胃蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 23 126 150 270 21 42 58 89 81 94 108 199 26 168 194 214 0 32 33 73 67 12 112 157 59 17 66 104 0 218 226 807 259 218 311 342 62 17 99 100 33 206 180 181 198 170 202 187
实施例10
pH4.0和6.5下用脂肪酶和蛋白酶的组合进行的三醋精酶促过水解
制备反应混合物，其含有1mg脂肪酶(ICR 101，ICR-110或ICR- 117，BioCatalytics，Pasadena，CA)、0.3mg蛋白酶K(白色麦轴霉)和1.2 mg链霉蛋白酶(于1.0mL的50mM缓冲液(pH4.0的乙酸钠/乙酸缓 冲液或pH6.5的磷酸钾缓冲液)中)，另外还含有三醋精(250mM)和 过氧化氢(500mM)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样 品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下 离心过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶10稀释，进 行过氧化氢分析，剩余部分的样品用HPLC测试方法直接进行过酸 分析(表11)。还单独用脂肪酶或单独用蛋白酶进行反应，以比较没有 脂肪酶和蛋白酶的组合时所产生的过乙酸浓度。
表11.pH4.0和6.5下用脂肪酶和蛋白酶的组合进行的三醋精(250mM) 酶促过水解
酶来源 pH 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 蛋白酶K 链霉蛋白酶 蛋白酶K/链霉蛋白酶 ICR-101 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR101 ICR-110 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR110 ICR-117 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR117 无酶(对照) 蛋白酶K 链霉蛋白酶 蛋白酶K/链霉蛋白酶 ICR-101 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR101 ICR-110 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR110 ICR-117 蛋白酶K/链霉蛋白酶/ICR117 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 10 24 17 8 238 252 362 460 284 401 22 323 114 225 306 359 337 406 438 579 10 7 5 15 555 542 688 679 927 909 59 669 484 433 588 576 398 364 984 1189
实施例11(比较实施例)
pH6.5下乙酸丙酯或三醋精的酶促过水解
向装有搅拌棒的4-mL玻璃小瓶中加入2mg溶于0.050mL的50 mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)的以下酶之一：乙酰胆碱酯酶(Sigma，C- 2888)、脂肪酶G“Amano”50(Amano)或Chirazyme L2，冻干(南极假 丝酵母脂肪酶B，BioCatalytics)。然后向小瓶中加入a)0.930mL的含 有50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)和215mM乙酸丙酯的溶液，接着是 0.021mL 30％过氧化氢(200mM终过氧化氢浓度)，或者b)0.900mL 的含有278mM三醋精(于50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中)、0.024mL 的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)和0.026mL 30％过氧化氢(250mM 终浓度)。在22℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下离心过滤2 分钟。将一部分的所得滤液用dd水1∶10稀释，进行过氧化氢分析， 剩余部分的滤液用HPLC测试方法直接进行过酸分析(表12)。
表12.pH6.5下乙酸丙酯(200mM)或三醋精(200mM)的酶促过水解
酶 乙酸丙酯 (250mM) H2O2 (250mM) 乙酸丙酯 (250mM) H2O2 (250mM) 三醋精 (250mM) H2O2 (250mM) 三醋精 (250mM) H2O2 (250mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶(对照) 乙酰胆碱酯酶 脂肪酶G“Amano”50 Chirazyme L2 12 0 18 19 69 0 46 1 22 78 192 70 173
实施例12
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)、 ICR 110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)、Dietrenz CR(皱褶假 丝酵母脂肪酶，Valley Research)、Amano F-DS(米根霉脂肪酶， Amano)、Amano DS(黑曲霉脂肪酶，Amano)或Enzeco MLC(微生物 脂肪酶浓缩物，黑曲霉脂肪酶，Enzyme Development Corporation))溶 于含有二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一醋精(181mM)混合物及 2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5) 中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250 mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释， 用HPLC测试方法进行过酸分析(表13)。
表13.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一 醋精(181mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 Dietrenz CR Amano F-DS Amano DS Enzeco MLC ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 Dietrenz CR Amano F-DS Amano DS Enzeco MLC 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 0.2 0 1 1 1 1 1 1 1 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 500 500 500 500 500 500 500 500 80 460 590 2290 420 190 2100 610 90 310 340 1240 240 220 335 70 10 170 155 380 40 215 120 240 0 35 60 145 60 520 510 2350 350 390 2240 1850 110 580 550 1030 525 470 595 240 10 430 390 410 30 490 500 490 210 75 305 405
实施例13
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR 110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(236 mM)、三醋精(83mM)和一醋精(181mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备 1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过 滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表14)。
表14.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精(236mM)、三醋精(83mM)和一 醋精(181mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 10 870 510 1670 240 270 1740 480 10 320 270 1080 870 40 605 560 2250 700 600 2180 1470 10 600 690 920 1060
实施例14
pH6.5下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg或1mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪酶， Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)或 ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(500 mM)、三醋精(176mM)和一醋精(383mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，制备1-mL 反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000 NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000 RPM下过滤2分钟。 将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC测试方法进 行过酸分析(表15)。
表15.pH6.5下脂肪酶催化的二醋精(500mM)、三醋精(176mM)和三 醋精(383mM)混合物的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0 2 2 2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 11 394 354 5224 290 220 3290 70 420 490 2900 13 860 650 7130 710 450 6130 50 930 890 2600
实施例15
pH4.0下脂肪酶催化的二醋精、三醋精和一醋精混合物的过水解
将2mg或1mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪酶， Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research)或 ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有二醋精(500 mM)、三醋精(176mM)和一醋精(383mM)混合物及2500mM或1000 mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备1 mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟后，将0.250mL样品 用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过 滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表16)。
表16.pH4.0下脂肪酶催化的二醋精(500mM)、三醋精(176mM)和三 醋精(383mM)混合物的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0 2 2 2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 10 380 440 5760 180 170 3960 10 380 400 2970 10 920 930 7210 480 520 7450 10 900 1150 2510
实施例16
pH6.5下脂肪酶催化的三醋精的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有500mM三 醋精和2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM磷酸钾缓冲 液(pH6.5)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30分钟 后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC) 在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶25 稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表17)。
表17.pH6.5下脂肪酶催化的三醋精(500mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 80 800 790 2710 670 460 1840 1120 130 970 770 760 450 170 1390 1180 2880 1070 810 2421 760 80 1250 1310 1400 680
实施例17
pH4.0下脂肪酶催化的三醋精的过水解
将2mg、1mg或0.2mg的酶(A“Amano”12脂肪酶(黑曲霉脂肪 酶，Amano)、Validase脂肪酶AN(黑曲霉脂肪酶，Valley Research) 或ICR110(南极假丝酵母脂肪酶，BioCatalytics)溶于含有三醋精(500 mM)和2500mM或1000mM过氧化氢的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸 缓冲液(pH4.0)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅拌5或30 分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应 样品用dd水1∶25稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表18)。
表18.pH4.0下脂肪酶催化的三醋精(500mM)的过水解
酶 [酶] (mg/mL) H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 无酶 A“Amano”12 Validase AN ICR-110 ICR-110 0 2 2 2 1 1 1 0.2 0 2 2 2 0.2 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 2500 1000 1000 1000 1000 1000 10 1030 920 2810 570 570 2120 510 5 1100 930 1540 370 20 1370 840 3700 740 680 2860 780 5 1520 1230 1670 600
实施例18
pH4.0和pH6.5下CALB L催化的三醋精的过水解
将0.010mL的CALB L脂肪酶(市售的南极假丝酵母脂肪酶B 液体制剂，Novozymes)溶于另外含有三醋精(250mM)和过氧化氢 (2500mM)的1.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)或1.0mL 50 mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，制备1-mL反应混合物。在25℃下搅 拌5或30分钟后，将0.250mL样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应 样品用dd水1∶20稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表19)。
表19.pH4.0或pH6.5下CALB L脂肪酶催化的三醋精(250mM)的 过水解
酶 pH H2O2 (mM) 过乙酸 (ppm)，5min 过乙酸 (ppm)，30min 无酶 CALB L 无酶 CALB L 4.0 4.0 6.5 6.5 2500 2500 2500 2500 28 439 226 1294 15 1120 108 678
实施例19
pH4.0下用固定化南极假丝酵母脂肪酶B进行的三醋精过水解
将100mg的IMB-111(固定化南极假丝酵母脂肪酶B， BioCatalytics)悬浮于另外含有三醋精(500mM)和过氧化氢(2500mM) 的10.0mL 50mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH4.0)中，制备反应混合物。 在旋转平台上25℃下混合2-30分钟的预定时间后，将0.100mL液 体部分的样品用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在 12,000RPM下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20 稀释，用HPLC测试方法进行过酸分析(表20)。
表20.pH4.0下用固定化南极假丝酵母脂肪酶B(IMB-111)催化的三 醋精(500mM)的过水解
时间(分钟) 无酶，过乙酸(ppm) 10.0mL IMB-111，过乙酸(ppm) 2 5 10 15 20 25 30 42 50 49 24 43 49 57 911 1667 2244 2755 3261 3369 3757
用新鲜的催化剂重复以上反应，30分钟后，过乙酸的浓度为3621 ppm。将催化剂从反应混合物中回收，用10.0mL的50mM乙酸钠/ 乙酸缓冲液(pH4.0)洗涤两次，用回收的酶重复进行反应，30分钟后， 过乙酸的浓度为2274ppm。
实施例20
pH6.5下三醋精的酶促过水解的时间进程
将1.0mg/mL的DS脂肪酶(黑曲霉，Amano)溶于含有过氧化氢 (2500mM)和三醋精(500mM)的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)所成的 反应混合物在25℃进行搅拌。在预定的各个时间抽取0.100mL等分 试样，用30,000NMWL过滤器(Millipore UltraFree-MC)在12,000RPM 下过滤2分钟。将一部分的已过滤反应样品用dd水1∶20稀释，用HPLC 测试方法进行过酸分析(表21)。
表21.pH6.5下DS脂肪酶催化的三醋精的过水解的时间进程(500 mM)
时间 (min或h) 无酶 过乙酸(ppm) 1mg/mL DS脂肪酶 过乙酸(ppm) 5min 30min 2h 5h 19h 10 149 26 78 27 367 522 819 1481 1895
实施例21
从三醋精、过氧化氢和南极假丝酵母脂肪酶B 制备的过乙酸制剂的杀生物活性
用Chirazyme L2脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶B)作为酶催化剂 进行反应，以产生过乙酸。向装有磁力搅拌棒的20-mL玻璃小瓶中 装入9.00mL的278mM三醋精(于50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)、 0.258mL的30％过氧化氢和1.0mL的20mg/mL Chirazyme L2(于50 mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中)，将所得混合物在室温下搅拌5分钟。 用30K NMWL过滤装置(Millipore UltraFree-MC)过滤产物混合物以 使反应终止，在12,000rpm下离心2分钟以除去酶，将滤液在湿冰 上保藏。用HPLC测试方法对滤液进行过乙酸(PAA)和过氧化氢分 析；对照反应在不添加酶和加入或不加入三醋精下进行。已过滤的 酶产生的产物混合物含有192ppm PAA，其由三醋精与过氧化氢的 化学反应和酶促反应两者产生；产物混合物中的过氧化氢浓度为6431 ppm。用250-mM三醋精不加酶进行的对照反应产生出22ppm PAA， 其由三醋精和过氧化氢的化学反应产生。
将已过滤的酶产生的产物混合物用无菌水1∶5稀释，所得的溶液 用无菌水再作四次1∶1系列稀释，获得表22所列的PAA和过氧化氢 浓度。
表22.用以评估杀生物活性的稀释系列
稀释倍数 PAA(ppm) H2O2(ppm) 1∶5 38.3 1286 1∶10 19.2 643 1∶20 9.6 322 1∶40 4.8 161 1∶80 2.4 80
如下对1∶5稀释液和四个系列稀释液进行杀生物活性评估：将 0.100mL的含PAA溶液与0.100mL的含2.7×106CFU/mL大肠杆菌 (E.coli，ATCC 11229，美国模式培养物保藏中心，Manassas，VA)的接 种物在用Butterfield缓冲液稀释的Millers LB肉汤中混合；每个混合 物作八个重复样，装入无菌96孔微量滴定板的各个孔中。让所得的 细胞悬浮液在室温下静置10分钟，然后用生长指示剂XTT((2，3-双[2- 甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑_，内盐，一 钠盐；CAS RN 111072-31-2)，按照Gabrielson等(J.Microbiol.Methods， 50：63-73(2002))的方法测试生存力。直到2.4ppm的PAA最小杀生 物浓度都没有观察到1.35×106CFU/mL的细胞生长(6-log杀灭)(由 用XTT在450nm处无OD测量值所表明)(表23)。
表23.脂肪酶催化的三醋精过水解所产生的过乙酸对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的测定
PAA(ppm) H2O2(ppm) 19.15 643.1 9.6 321.6 4.8 160.8 2.4 80.4 1.2 40.2 对照 0 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.403 0.383 0.379 0.387 0.381 0.382 0.382 0.403 0.427 0.398 0.392 0.395 0.404 0.409 0.394 0.422 0.418 0.393 0.388 0.399 0.398 0.404 0.401 0.471 0.406 0.400 0.397 0.403 0.401 0.409 0.407 0.543 0.692 0.674 0.635 0.658 0.625 0.639 0.520 0.496 2.177 2.142 2.007 2.114 2.171 2.347 2.323 2.582 0.418 0.415 0.414 0.418 0.409 0.405 0.407 0.428 平均重复样OD(450 nm) 空白校正的平均OD： 0.388 -0.029 0.405 -0.009 0.409 -0.005 0.421 0.007 0.617 0.203 2.233 1.819 0.414 0
另外将细胞接种物分别用三醋精(表24)或过氧化氢(于50mM磷 酸盐缓冲液(pH6.5)中，表25)的无菌溶液以表23中各杀生物剂稀释 液的浓度处理，测定这些杀生物剂溶液成分的MBC。
表24.三醋精对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的测 定
三醋精(ppm) 5455 2728 1364 682 341 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 2.210 2.136 2.091 2.229 2.124 2.263 2.407 2.539 2.280 2.208 2.222 2.273 2.167 2.358 2.454 2.663 2.337 2.265 2.198 2.140 2.266 2.485 2.632 2.823 2.213 2.156 2.218 2.304 2.310 2.560 2.601 2.605 2.408 2.507 2.189 2.568 2.563 2.601 2.58 3.148 2.375 2.397 2.386 2.557 2.491 2.582 2.603 2.952 0.401 0.420 0.402 0.409 0.413 0.410 0.410 0.455 平均重复样OD(450 nm) 空白校正的平均OD： 2.250 1.835 2.328 1.913 2.393 1.978 2.371 1.956 2.571 2.156 2.543 2.128 0.415 0
表25.过氧化氢对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC)的 测定
H2O2(ppm) 680.5 340.2 170.1 85.1 42.5 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.456 0.436 0.446 0.433 0.440 0.426 0.430 0.453 0.440 0.428 0.424 0.423 0.439 0.425 0.432 0.452 0.401 0.422 0.470 0.435 0.402 0.424 0.462 0.414 1.880 1.793 1.834 1.889 1.815 1.795 1.962 2.153 2.170 2.082 2.034 2.007 2.027 1.971 2.117 2.666 2.371 2.226 2.158 2.216 2.372 2.581 2.741 2.821 0.423 0.417 0.415 0.422 0.417 0.419 0.442 0.439 平均重复样OD(450nm) 空白校正的平均OD： 0.440 0.016 0.433 0.009 0.4295 0.005 1.890 1.466 2.134 1.710 2.436 2.012 0.424 0
在80ppm过氧化氢存在下测出的PAA对大肠杆菌ATCC 11229 的MBC＞2.4ppm(表23)；过氧化氢的MBC＞170ppm(表25)，这 证实PAA试验溶液的杀生物活性是由PAA而不是H2O2所致。三醋 精在试验的最高浓度下(5455ppm，表24)都没有杀生物作用。酶法产 生的PAA的MBC非常符合用市售来源的过乙酸所测出的MBC(表 26，MBC＞2.3ppm PAA)。
表26.市售过乙酸对大肠杆菌ATCC 11229的最小杀生物浓度(MBC) 的测定
PAA(ppm) 18.75 9.4 4.7 2.3 1.15 对照 0 空白 重复样1 OD(450nm) 重复样2 OD(450nm) 重复样3 OD(450nm) 重复样4 OD(450nm) 重复样5 OD(450nm) 重复样6 OD(450nm) 重复样7 OD(450nm) 重复样8 OD(450nm) 0.306 0.292 0.289 0.288 0.296 0.294 0.296 0.300 0.301 0.296 0.290 0.294 0.291 0.294 0.299 0.295 0.310 0.297 0.294 0.295 0.298 0.294 0.293 0.304 0.303 0.288 0.292 0.291 0.294 0.292 0.303 0.318 1.734 1.367 1.343 1.377 1.368 1.378 1.324 1.386 2.098 1.832 1.816 1.874 1.869 1.874 1.817 1.869 0.305 0.295 0.295 0.292 0.294 0.290 0.227 0.173 平均重复样OD(450nm) 空白校正的平均OD： 0.295 0.024 0.295 0.024 0.298 0.027 0.298 0.026 1.410 1.138 1.881 1.610 0.271 0
本申请要求2005年4月29日提交的美国临时申请第60/676,116 号的权益。
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