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一种抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用

阅读:712发布:2023-01-01

专利汇可以提供一种抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抑制人circ_0001016环状RNA表达的核苷酸及其应用,其特征是:所述的核苷酸特异性结合于人circ_0001016环状RNA,所述核苷酸的序列由AUUCUUUGCUUCGCACUGGUUCC序列或者互补序列中的18-23个连续核苷酸序列组成,特别是其包含序列:AUUCUUUGCUUCGCACUGG和UCUUUGCUUCGCACUGGUUCC。本发明抑制人circ_0001016环状RNA,能够有效抑制A549和MBA-MD-231细胞中circ_0001016环状RNA表达,与抗 肿瘤 药物联合可以增加其抑制其生长和增殖,从而有效 治疗 多种肿瘤。,下面是一种抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用专利的具体信息内容。

1.一种抑制circ_0001016环状RNA表达的核苷酸,其特征在于:所述核苷酸的序列由AUUCUUUGCUUCGCACUGGUUCC序列或者互补序列中的18-23个连续核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的核苷酸,其特征在于其序列为AUUCUUUGCUUCGCACUGG或者
UCUUUGCUUCGCACUGGUUCC及其互补序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸,其特征在于:所述核苷酸为核糖核苷酸、脱核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。
4.根据权利要求2所述的核苷酸,其特征在于所述核苷酸进一步被核糖修饰、基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。
5.根据权利要求4所述的核苷酸,其特征在于所述修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。
6.一种药物组合物,其特征在于包含权利要求 1-5 任一项所述的核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物。
7.根据权利要求6所述药物组合物,其特征在于其他抗肿瘤治疗药物为三价无机砷。
8.权利要求 7所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
9.权利要求 8 所述的应用,其中所述癌症包括 :肝癌、癌、胰腺癌、乳腺癌宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、口腔癌、贲癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。

说明书全文

一种抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学材料技术和药物领域 ,具体地本发明涉及一种环状RNAs核苷酸,尤其是涉及人环状RNAs核苷酸。该核苷酸可与circ_0001016互补,从而抑制人circ_0001016的表达,与其他抗肿瘤药物其起到抗肿瘤的作用。

背景技术

[0002] CircRNAs是一种普遍的其分子呈封闭环状结构的RNA,可由外显子或内含子、非编码RNA等环化形成。ADAR1、QKI、 FUS、 HNRNPL和DHX9等参与了circRNAs形成过程的调控。CircRNAs通过多种方式发挥作用,研究表明circRNAs含有miRNA应答元件可以竞争性结合miRNA,通过影响miRNA方式调节基因表达的;有的circRNAs可与小核糖核蛋白相互作用,调控基因的转录; 部分circRNAs可以调节pre-mRNA的剪接,改变mRNA含量,从而影响蛋白质的产量。在细胞的生长、增值、分化、周期调控和应激等多个过程中circRNAs均起重要作用,其表达变化与神经系统疾病、糖尿病、冠心病以及多种癌症的发生、发展、和预后密切相关。
[0003] RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源RNA从而沉默靶基因,从而实现干扰靶基因的功能。
[0004] 近年,尽管临床上肿瘤的联合疗法得到普及,但是联合疗法对肿瘤患者的5年生存率提高不大,中晚期患者生存率更低,约为20%。部分化疗药物副作用大限制了药物的运用。因此,寻找更安全有效的靶向性联合疗法是提高肿瘤患者生存的途径。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种能够特异高效地抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用。
[0006] 本 发 明 的 目 的 是 这 样 实 现 的 ,包 括 合 成 核 苷 酸 的 序 列 由AUUCUUUGCUUCGCACUGGUUCC(SEQ ID NO.1)序列中的18-23个连续核苷酸序列组成或者互补序列中的18-23个连续核苷酸序列组成。特别是其包含序列:AUUCUUUGCUUCGCACUGG(SEQ ID NO.2)和UCUUUGCUUCGCACUGGUUCC (SEQ ID NO.3)。核苷酸为核糖核苷酸、脱核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。核苷酸进一步被核糖修饰、基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物特别是三价无机砷。制备治疗癌症药物中的应用。癌症包括 :肝癌、癌、胰腺癌、乳腺癌宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、口腔癌、贲癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。本课题受南省运用基础研究计划-面上项目 2017FB123支持。
[0007] 本发明(优点):发明的核苷酸具有很好的circ_0001016抑制效果,作用于特异性的靶位点,特异性强、毒性低、副作用小和修饰半衰期长,可以与多种抗肿瘤药物合用。

具体实施方式

[0008] 下面结合附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。
[0009] 具体实施方式:实施例1
本实施例中的沉默RNA序列为:AUUCUUUGCUUCGCACUGGdTdT(SEQ ID NO.2) ,以及互补序列CCAGUGCGAAGCAAAGAAUdTdT(SEQ ID NO.4),所有的序列都是从5端到3端,其中dTdT是不足19核苷酸加上去了TT尾巴。circ_0001016的RNA序列信息存在于UCSC数据库中。本课题受云南省运用基础研究计划-面上项目 2017FB123支持。
[0010] 对照合成首先,由上海吉玛制药技术有限公司合成核苷酸,合成包含其互补序列的双链RNA序列,对照组使用吉玛制药技术有限公司的A06001序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO.5)以及互补的
ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO.6)作为阴性对照。
[0011] 细胞培养:将A549或者MBA-MD-231细胞在含有10%胎血清的1640培养基中培养,胎牛血清购自cellmax公司,1640培养基来自于Hyclone,于37℃,5%CO2条件下培养。收集生长状态良好的细胞,离心计数,以5000个每孔铺于96孔板内200000个接种于六孔板内,37℃,5%CO2培养。
[0012] RNA转染:采用碧云天公司Lipo8000™转染试剂,按照操作说明进行操作,A549使用六孔板转染时候,六孔板中SIRNA量为每孔20ul,转染试剂为15ul,培养基为2ml,MBA-MD-231使用六孔板转染时候,六孔板中SIRNA量为每孔10ul,转染试剂为7.5ul,培养基为2ml,96小时检测沉默效果,其结果见表1。
[0013] 表1.circ_0001016沉默效果沉默效果 对照组 沉默组1 沉默组1
A549 1.02±0.07 0.24±0.04 0.26±0.05
MBA-MD-231 1.04±0.09 0.15±0.05 0.18±0.06
表1为本发明SIRNA沉默的效果,对照组使用的是阴性对照片段,沉默组1为实施例1沉默核苷酸片段的结果;沉默组2为实施例2沉默核苷酸片段的的结果,数据使用2^-ΔΔCt表示。
[0014] A549使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.5ul,转染试剂为0.5ul培养基为0.1ml, MBA-MD-231使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.25ul,转染试剂为0.25ul培养基为0.1ml,二者转染后24小时加入亚砷酸钠A549加入30uM(微摩尔每升), MBA-MD-231 5uM,其中一排不加入亚砷酸钠,再培养48小时后MTS检测细胞活,其结果见表2。
[0015] 表2.circ_0001016沉默后加入砷后活力(%)活力% 未加砷组 对照组 实验组1 实验组2
A549 100±4.53 83±3.52 68±3.45 71±2.31
MBA-MD-231 101±5.62 84±3.77 61±2.56 65±4.01
表2为本发明MTT的结果表2;未加入砷组:不加入亚砷酸钠,对照组:为使用阴性对照片段后加入亚砷酸钠的结果,定为100%,实验组1实施例1沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果,实验组2实施例2沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果。
[0016] MTS检测采用Promega公司CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,an说明书的方法进行操作计算。
[0017] 检测沉默效果采用荧光定量PCR,PCR的条件是1、95度2-10分,2、95度10秒,3、60度10秒,4、72度15秒,PCR试剂采用罗氏或者康为世纪的,引物序列如下:
GGAACCAGTGCGAAGCAAAG(SEQ ID NO.7)和TTCCAAAATTGTGTCGACTCTTGT(SEQ ID NO.8).采用
2^ΔΔCt表示表达量。
[0018] 实施例2本实施例中的RNA序列为:UCUUUGCUUCGCACUGGUUCC(SEQ ID NO.3),以及互补序列GGAACCAGUGCGAAGCAAAGA(SEQ ID NO.9)。细胞培养和转染等试验方法同实施例1,仅使用的沉默RNA序列不同。沉默效果,其结果见表1,MTT其结果见表2。
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