一种抗PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂在抗肿瘤中的应用
阅读：753发布：2023-01-22
专利汇可以提供一种抗PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂在抗肿瘤中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医药技术领域，具体为抗PD-L1人源化单克隆 抗体 和干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂联合使用在 治疗 肿瘤 中的应用。本发明研究表明，PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂可以抑制肿瘤生长，激活T细胞，且优于单独使用PD-L1人源化单克隆抗体或干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂，因此，PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂可用于制备抗肿瘤药物。，下面是一种抗PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂在抗肿瘤中的应用专利的具体信息内容。
1.一种抗PD-L1的人源化单克隆抗体，包含轻链和重链，其特征在于，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
3.权利要求1所述抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物原料中的应用。
4.根据权利要求2-3所述应用，其特征在于，在制备PD-L1通路阻断剂中应用，以及在激活IL-2和IFN-ϒ分泌，激活T细胞中的应用。
5.干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂在制备原料药中的应用。
6.根据权利要求1所述抗体联合干扰素基因刺激蛋白激动剂在抗肿瘤中的应用。
7.根据权利要求1所述抗体联合干扰素基因刺激蛋白激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求5-7所述干扰素基因刺激蛋白激动剂包括但不限于c-AMP-GMP, c-di-AMP, c-di-GMP以及硫取代衍生物及其混合物。
9.根据权利要求5-7所述的肿瘤，包括但不限于以下癌症：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌、白血病等。
10.根据权利要求5-7所述的STING激动剂按常规药剂学制成各种剂型，所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种）等中的一种或多种给药途径进行抗肿瘤及其直接相关的癌症预防或治疗。
一种抗PD-L1人源化单克隆抗体联合干扰素基因刺激蛋白
（STING）激动剂在抗肿瘤中的应用
技术领域
[0002]
背景技术
[0003] PD-1，又称为程序性死亡受体1，为CD28超家族成员, 由日本京都大学本庶佑教授于1992年发现。PD-1的受体PD-L1，又叫细胞程式死亡-配体1或表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或 B7同源体（B7 homolog 1，B7-H1），是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PD-L1 是大小为 40kDa 的跨膜蛋白，与免疫系统抑制有关。正常情形下，免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性CD8+T细胞的增生。细胞程序化死亡受体-1（PD-1）与细胞程式死亡-配体1（PD-L1）结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+ T细胞的增生，而通过阻断PD-1与PD-L1结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号，激活杀伤性T细胞或者效应T细胞。使用单克隆抗体阻断PD-L1与PD-1结合，可以活化效应T细胞，进而利用激活的效应T细胞杀伤肿瘤细胞，从而成为癌症免疫疗法的重要治疗手段。
[0004] PD-L1蛋白是免疫靶点抑制剂，直接作用于这些靶点的免疫治疗可以向免疫系统释放制动信号，使其对肿瘤细胞进行攻击。抗PD-L1蛋白的抑制剂包括单克隆抗体在多种肿瘤类型当中有疗效，如肺癌。研究证明，PD-L1单克隆抗体无论是在非小细胞肺癌还是在小细胞肺癌中都能有效的提高患者的总生存率，并延长患者寿命。
[0005] 2013年世界肺癌会议上公布，正在临床研究中的PD-L1抗体就是罗氏制药公司的MPDL3280A（Atezolizumab），该药在所有的非小细胞肺癌患者中的总缓解率达到23%。而最新的MPDL3280A对比多西他赛二/三线治疗非小细胞肺癌的疗效性安全性和预测性生物标志物结果的II期临床研究表示，PD-L1单抗随着PD-L1表达的增高而显著改善生存，PD-L1表达结果可以作为MPDL3280A治疗的预测指标。该药治疗晚期非小细胞肺癌具有显著的疗效，疾病控制率达到42%，客观缓解率为16%，此外具有可控的安全性，未发生3-4级药物相关性肺炎等导致的死亡事件。PD-L1单克隆抗体药物MPDL3280A已在临床上展现出广泛的应用前景和惊人的肿瘤治疗效果，可用于多个类型肿瘤的治疗，因此，开发与PD-L1单克隆抗体药物MPDL3280A同样具有高亲和力的抗体药物，并联合其他用于肿瘤治疗的药物，用于癌症的免疫治疗，使其具有更好的治疗效果，更低的毒副作用，具有非常重要的意义。
[0006] T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T淋巴细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类： 1、细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）或效应T细胞：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞。2、辅助T细胞（helper T cell）在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。3、调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。4、记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作用。
[0007] 干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；干扰素同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡作用，从而杀灭肿瘤细胞。
干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。
干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。
[0008] γ干扰素由Younger和Salvin发现，由于抗原性不同于发现的干扰素，遂命名Ⅱ型干扰素IFN，或IFN-γ。γ干扰素是最重要的Th1型细胞因子之一,可由多种类型的免疫效应细胞、CD4+Th1细胞、CD8+CTL细胞、NK细 胞、B细胞、NKT细胞和APC产生。γ干扰素，具有直接抑制肿瘤细胞增殖，增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子表达，抗肿瘤血管生成等多种抗肿瘤作用。近年来研究发现，IFN-γ可以通过调控肿瘤细胞的Fas/FasL表达以及增强肿瘤细胞对Fas所介导凋亡途径的敏感性，使肿瘤细胞逃避免疫系统攻击的能力降低，从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖。
[0009] IL-2即白细胞介素-2（interleukin-2），又名T细胞生长因子(T cell growth factor，TCRF)。主要由活化的CD4+Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进Th0和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。
[0010] 干扰素基因刺激蛋白（STING）是一种跨膜蛋白，通常在152-173位区域（dimerization domain，DD）交接形成二聚体并处于自我抑制状态。当受到部分配体（比如CDN）的刺激后分子构型发生变化并被激活，招募细胞质中的TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），介导TBK1对IRF3的磷酸化，导致干扰素（interferon，IFN）-β和其它多种细胞素（cytokines）的形成。IFNβ的产生是STING活化的标志(Yasuo Tanaka & Zhijian J. Chen. Sci Signal. 2012 Mar 6; 5(214))。环二核苷酸cGAMP，是到目前为止发现的唯一一类既能直接激活鼠源又能激活人源STING蛋白的激动剂。
[0011] 激动剂是指能与细胞上受体或信号转导途径的蛋白分子相结合，并产生天然物质的典型生理效能的化学品或药物。环二核苷酸cGAMP，作为STING的天然激动剂，能够诱导I性干扰素产生（X Cai, YH Chiu, ZJ Chen ,Molecular cell, Volume 54, Issue 2, 24 April 2014, Pages 289–296）。STING激活剂为环二核苷酸，包括：c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, c-GMP-IMP等。STING激动剂能够诱导干扰素（interferon，IFN）-β的产生，可以起到抑制肿瘤的效果。由于STING激动剂作用机制的特殊性，STING激动剂可以联合其他抗肿瘤药物一起治疗肿瘤。
发明内容
[0012] 本发明提供了一种抗PD-L1人源化单克隆抗体，所采取的技术方案如下：本发明的目的在于提供一种抗PD-L1人源化单克隆抗体，包含轻链和重链。其中，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] 优选地，所述抗PD-L1人源化单克隆抗体是抗PD-L1人源化单克隆抗体11D8，包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015] 所述抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
[0016] 所述抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物原料中的应用。具体地，在制备PD-L1通路阻断剂中应用。
[0017] 所述抗体联合STING激动剂在治疗或辅助治疗肿瘤中的应用。
[0018] 所述抗体联合STING激动剂在制备治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
[0019] STING激动剂制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物原料中的应用。
[0020] 更具体地，本发明所述的单克隆抗体或者单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：高亲和力结合PD-L1的药物、阻断PD-1与PDL1结合的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达的药物。
[0021] 更具体地，本发明所述的单克隆抗体或者单克隆抗体偶联物联合STING激动剂在制备如下药物中的用途：抑制肿瘤生长的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达的药物。
[0022] 更具体地，本发明所述的STING激动剂作为制备如下药物原料中的用途：抑制肿瘤生长的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达的药物。
[0024] 本文提及PD-L1，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及NCBI数据库、欧洲基因数据库一致。其GENE 名为：CD274；GENE ID为：29126；PD-L1公开的其它命名包括：B7-H, B7H1 , PDCD1L1, PDCD1LG1, PDL1。
[0025] 本文提及STING，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及NCBI数据库、欧洲基因数据库一致。其GENE 名为：TMEM173；GENE ID为：340061；STING公开的其它命名包括：Transmembrane Protein 173, ERIS, MITA, MPYS, NET23, SAVI, STING, hMITA, hSTING。
[0026] 本文提及的STING激动剂，包括但不限制于c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, c-GMP-IMP以及硫取代衍生物及其混合物。
[0027] 本文提及的STING激动剂CDN，包括但不限制于c-AMP-GMP, c-di-AMP, c-di-GMP以及硫取代衍生物及其混合物。
[0028]本发明获得的有益效果如下：
本发明研制的PD-L1人源化抗体，是利用人源化抗体噬菌体库和噬菌体展示技术进行抗体筛选和亲和力成熟获得，具有极高亲和力，可以更有效的发挥拮抗PD-L1功能的作用。
本发明研制的PD-L1人源化抗体，是利用人源化抗体噬菌体库和噬菌体展示技术进行抗体筛选和亲和力成熟获得，具有极高亲和力，可以更有效的发挥拮抗PD-L1功能的作用。
[0029] 本发明新发现了一种能阻断PD-L1功能的人源化抗体11D8，人源化抗体11D8与PD-L1抗原特异性结合，SPR方法测定人源化抗体11D8亲和力为69 pM，其亲和力优于罗氏制药公司开发的PD-L1抗体Atezolizumab。本发明的人源化抗体11D8作为PD-1/PD-L1通路的阻断剂，可以激活T淋巴细胞，抑制肿瘤生长，从而成为肿瘤免疫治疗新药物中的关键组分。
[0030]本发明新发现了一种能阻断PD-L1功能的人源化抗体11D8，11D8联合STING激动剂使用，抑制肿瘤效果要优于单独用药、优于罗氏制药公司开发的PD-L1抗体Atezolizumab。本发明的人源化抗体11D8联合STING激动剂，可以增强激活T淋巴细胞，增强抑制肿瘤生长，从而成为肿瘤免疫治疗新药物中关键的组分。
附图说明
附图说明
[0031]
[0032] 图1为人PD-L1抗原SDS-PAGE电泳检测结果。
[0033] 图2为人源化抗体11D8 的SDS-PAGE电泳检测结果。
[0034] 图3为SPR方法测定人源化抗体11D8亲和力的结果。
[0035] 图4为人源化抗体11D8与STING激动剂诱导T细胞IL-2分泌结果。
[0036] 图5为人源化抗体11D8与STING激动剂诱导T细胞IFN-γ分泌。
[0037] 图6为人源化抗体11D8与STING激动剂抑制肿瘤生长结果。
具体实施方式
[0038]
[0039] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0040] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0041]实施例1.PD-L1抗原的制备
由南京金斯瑞公司合成人的PD-L1 的cDNA，Gene ID为ID: 29126。在合成的胞外区PD-L1基因后加上His标签，连接到pcDNA3.1表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染DH5α，挑取单克隆，接种到LB液体培养基，至OD600为1-1.5时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒（购自Qiagen公司）提取质粒。将测序鉴定正确的表达载体转染Expi293细胞（购自Thermo公司），37度，5 % CO2，130 rpm/min 培养5天后，抽滤收集上清。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用结合缓冲液(TrisCl，pH7.4，400 mM NaCl) 平衡好的5ml HisTrap FF柱(购自GE生命科学)；待样品上完后用含20mM咪唑的相同缓冲液冲洗，流速5 ml/min。最后用洗脱缓冲液（Tris.HCl，pH 7.4，400 mM NaCl， 250 mM Imidazole）洗脱，流速1 ml/min，收集流出峰，用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS 中，由此得到PD-L1的His标签抗原。 PD-L1抗原SDS-PAGE 电泳检测结果见图 1。
由南京金斯瑞公司合成人的PD-L1 的cDNA，Gene ID为ID: 29126。在合成的胞外区PD-L1基因后加上His标签，连接到pcDNA3.1表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染DH5α，挑取单克隆，接种到LB液体培养基，至OD600为1-1.5时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒（购自Qiagen公司）提取质粒。将测序鉴定正确的表达载体转染Expi293细胞（购自Thermo公司），37度，5 % CO2，130 rpm/min 培养5天后，抽滤收集上清。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用结合缓冲液(TrisCl，pH7.4，400 mM NaCl) 平衡好的5ml HisTrap FF柱(购自GE生命科学)；待样品上完后用含20mM咪唑的相同缓冲液冲洗，流速5 ml/min。最后用洗脱缓冲液（Tris.HCl，pH 7.4，400 mM NaCl， 250 mM Imidazole）洗脱，流速1 ml/min，收集流出峰，用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS 中，由此得到PD-L1的His标签抗原。 PD-L1抗原SDS-PAGE 电泳检测结果见图 1。
[0042]实施例2 PD-L1抗体11D8的表达与纯化
由南京金斯瑞公司合成抗体11D8的轻链cDNA（其翻译氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示），抗体11D8重链的cDNA（其翻译氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。将合成的cDNA分别克隆到pcDNA3.1质粒中，并通过测序验证质粒构建正确。将测序鉴定正确的11D8重链表达载体和轻链表达载体(1:1)共转染到expi293细胞中，37度， 8% CO2，130 rpm/min， 培养5天后，离心收集上清。将上清6000rpm、4度离心30min，并用0.22μm 滤膜过滤，收集滤液；滤液加入400mM NaCl；调整PH至7.5。样品经0.22 μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4，pH7.4) 平衡好的5 ml HiTrap Protein A 柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5 ml/min，紫外监测为水平。Buffer B（1 M Glycine，pH 3.5）洗脱，流速1 ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH 7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS 中，由此得到抗体11D8蛋白。抗体11D8的SDS-PAGE电泳检测结果见图2。
由南京金斯瑞公司合成抗体11D8的轻链cDNA（其翻译氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示），抗体11D8重链的cDNA（其翻译氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。将合成的cDNA分别克隆到pcDNA3.1质粒中，并通过测序验证质粒构建正确。将测序鉴定正确的11D8重链表达载体和轻链表达载体(1:1)共转染到expi293细胞中，37度， 8% CO2，130 rpm/min， 培养5天后，离心收集上清。将上清6000rpm、4度离心30min，并用0.22μm 滤膜过滤，收集滤液；滤液加入400mM NaCl；调整PH至7.5。样品经0.22 μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4，pH7.4) 平衡好的5 ml HiTrap Protein A 柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5 ml/min，紫外监测为水平。Buffer B（1 M Glycine，pH 3.5）洗脱，流速1 ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH 7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS 中，由此得到抗体11D8蛋白。抗体11D8的SDS-PAGE电泳检测结果见图2。
[0043]实施例3 SPR方法测定PD-L1人源化抗体11D8的亲和力Kd
PD-L1抗原的获得参见实施例1，Biacore 3000仪器以及相关SA芯片均购自GE生命科学。本实验采用Biacore 3000分析抗PD-L1抗体11D8的结合动力学。利用生物素标记试剂盒（Pierce公司）将重组人PD-L1胞外区蛋白与生物素共价偶联，然后流过亲和素标记的SA芯片，使RU反应值至450。将抗体以不同浓度（包括：0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μM）和50 μl/min 的流速在PBS缓冲液中流动，检测并测量结合常数。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用BI Aevaluation软件将结合和解离曲线拟合至1∶1 朗格缪尔(Langmuir) 结合模型。实验结果（重复三次实验测定的Kd、Kon 和Koff 值）见图3。
PD-L1抗原的获得参见实施例1，Biacore 3000仪器以及相关SA芯片均购自GE生命科学。本实验采用Biacore 3000分析抗PD-L1抗体11D8的结合动力学。利用生物素标记试剂盒（Pierce公司）将重组人PD-L1胞外区蛋白与生物素共价偶联，然后流过亲和素标记的SA芯片，使RU反应值至450。将抗体以不同浓度（包括：0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μM）和50 μl/min 的流速在PBS缓冲液中流动，检测并测量结合常数。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用BI Aevaluation软件将结合和解离曲线拟合至1∶1 朗格缪尔(Langmuir) 结合模型。实验结果（重复三次实验测定的Kd、Kon 和Koff 值）见图3。
[0044]实施例4人源化抗体11D8与STING激活剂CDN体外诱导T细胞分泌IL-2
Ficoll试剂购自GE生命科学，STING激活剂CDN购自Sigma或Invivogen公司，破伤风毒素购自Sigma公司，人细胞因子IL-2检测试剂盒购自R&D公司， T 细胞、DC细胞富集柱、单核细胞纯化试剂盒均购自Miltenyi Biotech公司，GM-CSF 和IL-4均购自PeproTech公司。用Ficoll离心法参照说明提取制备新鲜的人PBMC，分离T细胞和DC细胞，使用Miltenyi CD14 单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF 和IL-4一起培养7天后生成DC细胞。将细胞铺板至96 孔平底板中，培养过夜后，加入1 nmol、5 nmol、25 nmol三种不同浓度11D8抗体、或一起加入1 mM的STING激活剂（CDN），所有孔均加入80 ng/ml 的破伤风毒素(TT)，加入5 nmol浓度的同种型对照抗体作为阴性对照，培养3 天后收集上清液，用Luminex 仪(购自LifeTechnology公司)和人细胞因子IL-2检测试剂盒检测培养基上清IL-
2的分泌水平, 数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。结果(见图4)显示人源化抗体11D8可有效刺激T细胞的功能，分泌IL-2，且与抗体浓度有关，人源化抗体
11D8联合STING激活剂CDN能够增强IL-2分泌，进而增强T细胞活化效果。
Ficoll试剂购自GE生命科学，STING激活剂CDN购自Sigma或Invivogen公司，破伤风毒素购自Sigma公司，人细胞因子IL-2检测试剂盒购自R&D公司， T 细胞、DC细胞富集柱、单核细胞纯化试剂盒均购自Miltenyi Biotech公司，GM-CSF 和IL-4均购自PeproTech公司。用Ficoll离心法参照说明提取制备新鲜的人PBMC，分离T细胞和DC细胞，使用Miltenyi CD14 单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF 和IL-4一起培养7天后生成DC细胞。将细胞铺板至96 孔平底板中，培养过夜后，加入1 nmol、5 nmol、25 nmol三种不同浓度11D8抗体、或一起加入1 mM的STING激活剂（CDN），所有孔均加入80 ng/ml 的破伤风毒素(TT)，加入5 nmol浓度的同种型对照抗体作为阴性对照，培养3 天后收集上清液，用Luminex 仪(购自LifeTechnology公司)和人细胞因子IL-2检测试剂盒检测培养基上清IL-
2的分泌水平, 数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。结果(见图4)显示人源化抗体11D8可有效刺激T细胞的功能，分泌IL-2，且与抗体浓度有关，人源化抗体
11D8联合STING激活剂CDN能够增强IL-2分泌，进而增强T细胞活化效果。
[0045]实施例5人源化抗体11D8与STING激活剂CDN体外诱导T细胞分泌IFN-γ
Ficoll试剂购自GE生命科学，STING激活剂CDN购自Sigma或Invivogen公司，GM-CSF 和IL-4均购自PeproTech公司，OptEIA ELISA 试剂盒购自BD Biosciences公司。 T细胞和DC细胞分离和诱导参照实施例4。将细胞铺板至96 孔平底板中，培养过夜后，每份培养物在
200 μl的总体积中包含100000个纯化的T 细胞和10000个DC细胞。加入1 nmol、5 nmol、25 nmol三种不同浓度11D8抗体，或一起加入1 mM的STING激活剂（CDN）加入同型对照抗体作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μl 培养基用于细胞因子IFN-γ测量。利用OptEIA ELISA 试剂盒测定IFN-γ的水平，数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=
0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。结果（如图5所示）显示人源化抗体11D8均可有效刺激T 细胞的功能分泌细胞因子IFN-γ，且与浓度有关，与STING激活剂CDN连用时，能够增强刺激T细胞分泌细胞因子IFN-γ。
Ficoll试剂购自GE生命科学，STING激活剂CDN购自Sigma或Invivogen公司，GM-CSF 和IL-4均购自PeproTech公司，OptEIA ELISA 试剂盒购自BD Biosciences公司。 T细胞和DC细胞分离和诱导参照实施例4。将细胞铺板至96 孔平底板中，培养过夜后，每份培养物在
200 μl的总体积中包含100000个纯化的T 细胞和10000个DC细胞。加入1 nmol、5 nmol、25 nmol三种不同浓度11D8抗体，或一起加入1 mM的STING激活剂（CDN）加入同型对照抗体作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μl 培养基用于细胞因子IFN-γ测量。利用OptEIA ELISA 试剂盒测定IFN-γ的水平，数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=
0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。结果（如图5所示）显示人源化抗体11D8均可有效刺激T 细胞的功能分泌细胞因子IFN-γ，且与浓度有关，与STING激活剂CDN连用时，能够增强刺激T细胞分泌细胞因子IFN-γ。
[0046]实施例6 人源化抗体11D8与STING激活剂CDN抑制肿瘤生长
SCID beige，SPF级，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物公司，小鼠饲养均为SPF级。
A549人肺腺癌细胞株、A375黑色素瘤细胞株均购自ATCC，细胞培养与传代参照常用细胞培养与传代方法。肿瘤模型建立方法：免疫缺陷SCID-beige鼠80只,随机分为10组,每组8只,皮下注射肺腺细胞A549或A375黑色素瘤细胞约5×10e6个, 注射1周后肿瘤长至1-3 mm，致瘤成功；取分离好的人外周血单核细胞PBMC（分离方法参见实施例4与5）,用1640细胞培养液重悬成细胞悬液，注射至SCID-beige鼠体内。抗体治疗：分别在注射PBMC细胞后，第1天第
7天、第14天分别注射11D8或STING激活剂CDN，11D8注射剂量分别是5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg。STING激活剂CDN注射剂量为20 mg/kg。阳性抗体（Atezolizumab）注射剂量为 10 mg/kg，阴性对照组注射生理盐水。每天观察肿瘤生长状况，数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。实验结果表明（图6）：11D8能够抑制肿瘤生长，且与剂量正相关，STING激活剂CDN能够增强11D8的治疗效果。
SCID beige，SPF级，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物公司，小鼠饲养均为SPF级。
A549人肺腺癌细胞株、A375黑色素瘤细胞株均购自ATCC，细胞培养与传代参照常用细胞培养与传代方法。肿瘤模型建立方法：免疫缺陷SCID-beige鼠80只,随机分为10组,每组8只,皮下注射肺腺细胞A549或A375黑色素瘤细胞约5×10e6个, 注射1周后肿瘤长至1-3 mm，致瘤成功；取分离好的人外周血单核细胞PBMC（分离方法参见实施例4与5）,用1640细胞培养液重悬成细胞悬液，注射至SCID-beige鼠体内。抗体治疗：分别在注射PBMC细胞后，第1天第
7天、第14天分别注射11D8或STING激活剂CDN，11D8注射剂量分别是5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg。STING激活剂CDN注射剂量为20 mg/kg。阳性抗体（Atezolizumab）注射剂量为 10 mg/kg，阴性对照组注射生理盐水。每天观察肿瘤生长状况，数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组差异的显著性，显著性水平a=0.05,阴性对照组（*<0.05 ，**<0.01）。实验结果表明（图6）：11D8能够抑制肿瘤生长，且与剂量正相关，STING激活剂CDN能够增强11D8的治疗效果。
[0048] 序列表氨基酸序列
>一种抗PD-L1单克隆抗体及其应用
> SEQ ID NO.1
>人工序列 1-214
AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThr
IleThrCysGlnAlaSerGlnAspValTyrArgTyrIleAlaTrpTyrGlnGlnLysPro
GlyLysAlaProLysLeuLeuIleHisTyrSerThrThrLeuGluThrGlyValProSer
ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrIleSerSerLeuGlnPro
GluAspIleGlnThrTyrTyrCysValGlnTyrGluAsnValLeuProSerPheGlyGly
GlyThrLysLeuGluIleLysArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProPro
SerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr
ProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGln
GluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThr
LeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGly
LeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys***
> SEQ ID NO.2
>人工序列 1-445
GlnValGlnLeuVal GlnSerGlyAlaGlu ValLysLysProGlyAlaSerValLysVal
SerCysLysAlaSerAlaTyrAsnIleArgAspSerTyrIleHisTrpValArgGlnAla
ProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyArgIleGluProAlaAsnAspAsnSerSerTyr
AlaGlnLysPheGlnGlyArgValThrMetThrArgAspThrSerThrSerThrValTyr
MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysGlyLeu
LysValLysTyrPheAspValTrpGlyAlaGlyThrThrValThrValSerSerAlaSer
ThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGluSerThr
AlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsn
SerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeu
TyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrLysThrTyrThr
CysAsnValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluSerLysTyr
GlyProProCysProSerCysProAlaProGluPheLeuGlyGlyProSerValPheLeu
PheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal
ValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgVal
ValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLys
ValSerAsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln
ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGluGluMetThrLysAsnGln
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGlu
SerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGly
SerPhePheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGlyAsnVal
PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer LeuSerLeuGlyLys
>一种抗PD-L1单克隆抗体及其应用
> SEQ ID NO.1
>人工序列 1-214
AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThr
IleThrCysGlnAlaSerGlnAspValTyrArgTyrIleAlaTrpTyrGlnGlnLysPro
GlyLysAlaProLysLeuLeuIleHisTyrSerThrThrLeuGluThrGlyValProSer
ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrIleSerSerLeuGlnPro
GluAspIleGlnThrTyrTyrCysValGlnTyrGluAsnValLeuProSerPheGlyGly
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SerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr
ProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGln
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> SEQ ID NO.2
>人工序列 1-445
GlnValGlnLeuVal GlnSerGlyAlaGlu ValLysLysProGlyAlaSerValLysVal
SerCysLysAlaSerAlaTyrAsnIleArgAspSerTyrIleHisTrpValArgGlnAla
ProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyArgIleGluProAlaAsnAspAsnSerSerTyr
AlaGlnLysPheGlnGlyArgValThrMetThrArgAspThrSerThrSerThrValTyr
MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysGlyLeu
LysValLysTyrPheAspValTrpGlyAlaGlyThrThrValThrValSerSerAlaSer
ThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGluSerThr
AlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsn
SerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeu
TyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrLysThrTyrThr
CysAsnValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluSerLysTyr
GlyProProCysProSerCysProAlaProGluPheLeuGlyGlyProSerValPheLeu
PheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal
ValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgVal
ValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLys
ValSerAsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln
ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGluGluMetThrLysAsnGln
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGlu
SerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGly
SerPhePheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGlyAsnVal
PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer LeuSerLeuGlyLys
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