黄酮化合物在制备调节疾病PD-L1水平药物中的用途
阅读：675发布：2023-01-23
专利汇可以提供黄酮化合物在制备调节疾病PD-L1水平药物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及黄 酮 化合物在制备调节 疾病 中PD-L1 水 平的药物中的用途，特别是对于与PD-L1相关的癌症，表现出了良好的药学效果。本发明为黄酮化合物在 治疗 癌症的靶向提供了进一步的研究方向。，下面是黄酮化合物在制备调节疾病PD-L1水平药物中的用途专利的具体信息内容。
1.下式(I)黄酮化合物在制备用于调节疾病中PD-L1水平的药物中的用途
R选自氢、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基、卤素、氰基或者含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基。
2.如权利要求1所述的用途，其中R选自甲氧基或者卤原子取代的甲基。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的卤原子为氟。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述的式(I)黄酮化合物为具有如下式(II)所示结构的化合物
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述的式(I)黄酮化合物为具有如下式(III)所示结构的化合物
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疾病为肿瘤。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、白血病、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宫癌、肺癌和黑色素瘤中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为口服制剂或注射剂。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的注射剂为肌肉注射剂或静脉注射剂。
10.一种调节疾病中PD-L1水平的药物，该药物含有权利要求1、4或5所述结构的黄酮化合物，优选地，所述的疾病为肿瘤。
黄酮化合物在制备调节疾病PD-L1水平药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及黄酮化合物在制备用于调节疾病PD-L1水平的药物中的用途，属于医药领域。
背景技术
[0002] 肿瘤逃逸是目前肿瘤免疫治疗公认的障碍，患者肿瘤细胞自身的缺陷和免疫系统的功能障碍共同起作用促进了肿瘤的疯狂生长。肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗的过程中早期肿瘤特异性的CD8+T细胞是激活的，随着肿瘤生长到后期，CD8+T细胞失去了杀伤的功能，肿瘤产生了抵抗力。总而言之，无论是通过调节细胞因子还是免疫细胞的修饰都是为了极大限度地提高病人自身的免疫系统反应。不但要在体内激活原有自身的免疫系统反应，还要让已经调动的反应持续增强。
[0003] 人PD-L1是1999年克隆的分子量约30-35KD、由290个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因子TNF超家族的成员之一。人PD-L1分子主要表达在静止和活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞上，以及心脏、胎盘、血管上皮、肝脏、肺、肾和骨骼肌等非淋巴组织细胞表面，此外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等癌组织细胞上均有表达。许多癌组织被诱导后还可使PD-L1的表达上调。程序死亡受体1(PD-1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区，跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体PD1相互作用，当两者形成通路后，可以减弱T淋巴细胞免疫反应，甚至导致T淋巴细胞功能衰竭。在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且表达广泛。通过阻断PD-L1/PD-1信号通路可有效抑制肿瘤的生长。
[0004] 因此，已经提出抑制PD-L1信号传导作为增强用于治疗癌症和感染的T细胞免疫力的手段。在公开号为CN102245640的中国专利申请中提出了抗PD-L1抗体及它们用于增强T细胞功能的用途。该申请中的抗体用于增强T细胞的功能，提供T细胞功能障碍病症，其中该病症包括感染(例如急性的和慢性的)和肿瘤免疫。
[0005] 因此，以PD-L1为靶向的药物已经成了肿瘤以及免疫治疗的新的研究方向。
[0006] 黄酮化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的一类化合物。已有研究证明黄酮化合物具有心血管系统活性、抗菌、抗病毒活性以及抗肿瘤活性。
[0008]
[0009] 该化合物的制备方法公开于CN101302548，该方法以淫羊藿苷为原料，以β-葡萄糖苷酶进行水解，水解产物离心得到的沉淀用丙酮溶解，离心过滤得到上清液。再将离心得到的上清液用水进行重结晶，得到阿可拉定纯品。
[0010] 在申请号为200780039276.9的中国专利中公开了一种用于治疗与雌激素受体相关的疾病的化合物和方法，该专利中公开了阿可拉定用于治疗与雌激素受体ER-α36相关的肝癌。
[0011] 在现有技术中，并没有针对阿可拉定这一类化合物对ER-α36以外的其他治疗靶点的进一步研究。
发明内容
[0012] 本发明人惊奇地发现，本发明的一类黄酮化合物能够调节疾病中PD-L1水平。
[0013] 本发明的一个目的是提供本发明的黄酮化合物在制备用于调节疾病中PD-L1水平的药物中的用途。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种调节疾病中PD-L1水平的药物，该药物中含有本发明所述结构的黄酮化合物。
[0015] 本发明一方面提供了本发明的黄酮化合物在制备用于调节疾病中PD-L1水平的药物中的用途
[0016]
[0018] 优选地，其中R选自甲氧基或者卤原子取代的甲基。
[0019] 优选地，其中所述的卤原子为氟。
[0020] 优选地，其中所述的式(I)黄酮化合物为具有如下式(II)所示结构的化合物[0021]
[0022] 优选地，其中所述的式(I)黄酮化合物为具有如下式(Ⅲ)所示结构的化合物[0023]
[0024] 优选地，所述疾病为肿瘤。
[0026] 优选地，所述的药物为口服制剂或注射剂。
[0027] 优选地，所述的注射剂为肌肉注射剂或静脉注射剂。
[0028] 本发明另一方面还提供了一种调节疾病中PD-L1水平的药物，该药物含有本发明的黄酮化合物。
[0029] 优选地，所述的疾病为肿瘤。
[0030] 更优选地，所述的肿瘤选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、白血病、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宫癌、肺癌和黑色素瘤中的一种或几种。
[0031] 本发明的有益效果在于：本发明的黄酮化合物在调节疾病中的PD-L1水平取得了非常好的效果，对于PD-L1高表达的肿瘤表现出了良好的药学效果，通过治疗，将PD-L1的水平有所降低，从而将肿瘤进行了抑制。因此，本发明为黄酮化合物在PD-L1相关治疗中提供了进一步的研究方向。附图说明
[0032] 图1表示实施例3的阿可拉定对肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表达水平抑制图。
[0033] 图2表示实施例4的阿可拉定对肺癌细胞H460中的PD-L1蛋白表达水平抑制图。
[0034] 图3表示实施例5阿可拉定对黑色素瘤细胞A375中的PD-L1蛋白表达水平抑制图。
[0035] 图4表示式(III)化合物对肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表达水平的抑制图。
[0036] 图5表示实施例7阿可拉定对人黑色素瘤细胞A875中的PD-L1蛋白表达水平抑制图。
[0037] 图6表示实施例8阿可拉定对人多发性骨髓瘤细胞U266细胞中的PD-L1蛋白表达水平抑制图。
[0038] 图7表示在11例服用阿可拉定的肝癌患者中，血液PD-L1的变化趋势。
具体实施方式
[0040] 术语“疾病中PD-L1水平”指的是疾病相关的组织细胞或血清中的PD-L1表达水平。
[0041] 术语“调节疾病中PD-L1水平”指的是通过本发明药物的治疗，病人肿瘤细胞，肿瘤组织或患者血液中的PD-L1表达量进行下调。
[0042] 术语“肌肉注射剂”指的是注射于肌肉组织中的注射剂。
[0043] 术语“静脉注射剂”指的是注入静脉进入血液的注射剂。
[0044] 本发明中的“人肝癌细胞PLC/PRF/5”购自于日本癌症研究银行Japanese Cancer Research Bank(JCRB)，Tokyo，Japan，商品名称PLC/PRF/5，商品编号为JCRB0406。
[0045] 除非另外说明，本文中的“肺癌H460细胞”购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，商品名称为NCI-H460，商品编号为3111C0001CCC000355。
[0046] 除非另外说明，本文中的“黑色素瘤A375细胞”购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，商品名称为A375，商品编号为3111C0001CCC000126。
[0047] 除非另外说明，本文中的“黑色素瘤A875细胞”购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，商品名称为A875，商品编号为3111c0001ccc000094。
[0048] 除非另外说明，本文中的“人骨髓瘤U266细胞”购自北京北纳生物技术研究院，商品名称为U266，商品编号为BNCC337642。
[0049] 除非另外说明，本发明中“阿可拉定”通过实施例1方法制备。
[0050] 除非另外说明，本文中的“部分缓解(PR)”指的是经过治疗，病人得到了部分缓解。在治疗结束时，通过影像检测，如果病人肿瘤病灶未发生转移，检测肿瘤病灶最长直径；当病人肿瘤转移到了淋巴结以外的其他器官，检测转移病灶的最长直径，当检测到的肿瘤病灶最长径总和缩小≥30％或者更多，即称为部分缓解；如果病人的肿瘤病灶转移到了淋巴结，通过检测病人淋巴结转移病灶的最短直径，如果检测到的转移病灶最短径总和缩小≥
30％或者更多，即被称为部分缓解。
30％或者更多，即被称为部分缓解。
[0051] 除非另外说明，本文中的“疾病稳定(SD)”指的是经过治疗，病人的疾病稳定。在治疗结束时，通过影像检测，如果病人肿瘤病灶未发生转移，检测肿瘤病灶最长直径；当病人肿瘤转移到了淋巴结以外的器官，检测转移病灶的最长直径，当检测到的肿瘤病灶最长径总和缩小未达到30％或者增加未达到20％，即称为疾病稳定；如果病人的肿瘤转移到了淋巴结，通过检测病人淋巴结肿瘤的最短直径；如果检测到的转移病灶总和缩小未达到30％或者增加未达到20％，即称为疾病稳定。.
[0052] 除非另外说明，本文中的“疾病进展(PD)”指的是经过治疗，病人出现疾病进展。在治疗结束时，通过影像检测，如果病人肿瘤病灶未发生转移，检测肿瘤病灶最长直径；当病人肿瘤转移到了淋巴结以外的器官，检测转移病灶的最长直径，当检测到的肿瘤病灶最长径总和增加达到20％，即称为疾病进展；如果病人的肿瘤转移到了淋巴结，通过检测病人淋巴结肿瘤的最短直径，如果检测到的转移病灶最短直径总和增加达到20％，即称为疾病进展。
[0053] 用于蛋白质印迹法(Western blot)的PD-L1抗体购自于细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology)，商品编号为#13684。
[0054] 实施例1
[0055] 阿可拉定的制备
[0056] 阿可拉定又名淫羊藿素，是从中药淫羊藿中提取分离得到。
[0057] 在公开号为CN101302548的专利中公开了淫羊藿的制备方法。该方法以淫羊藿苷为原料，以β-葡萄糖苷酶进行水解，水解产物离心得到的沉淀用丙酮溶解，离心过滤得到上清液。再将离心得到的上清液用水进行重结晶，得到淫羊藿纯品。本发明中的淫羊藿苷购自陕西嘉禾植物化工有限责任公司公司，纯度90％。
[0058] 实施例2
[0059] 式(I)化合物的制备
[0060] 式(I)化合物的制备路线如下：
[0061]
[0062] 在该方法中，P为保护基团，将化合物v的保护基脱除可得到化合物ⅵ。根据保护基不同，去除的方法也相应变化，主要参见“有机合成中的保护基团”(Greene T.W等著。John Wiley&Sons，纽约，1991)其中的方法。优选的保护基为苄基、苯甲酰基、苄氧羰基、TBDMS(叔丁基二甲基硅基)、THP(四氢吡喃基)、甲基、MOM(甲氧基甲基)、PMB(对甲氧基苄基)等。
[0063] 化合物ⅵ与异戊烯基溴在碱性条件下反应，可制备化合物ⅷ。适用该反应的溶剂包括：甲醇、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、THF(四氢呋喃)、水、甲苯、DME(1，2-二甲氧基乙烷)以及混合溶剂，如甲醇-水、DMF-水、四氢呋喃-水等等。在反应中使用的溶剂优选为水。适用于该反应的碱包括：如氢氧化钾、碳酸钾、碳酸铯、甲醇钠、氢化钠、叔丁醇钾、DBU(1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)、正丁基锂、LDA(二异丙基氨基锂)、LHMDS(六甲基二硅基氨基锂)等等，反应温度通常在约0-100℃之间，反应时间为1-20小时。
[0064] 其中式(ⅰ)化合物间苯三酚购自Acros公司，商品号为131040250。
[0065] 式(Ⅲ)化合物的制备
[0066] 式(Ⅲ)化合物按照方案1制备路线，其中P为甲基，化合物 购自Acros公司，商品号为125660050；化合物 购自Acros公司，商品号为
303420010。
303420010。
[0067] 实施例3
[0068] 检测阿可拉定对肝癌细胞PLC/PRF/5细胞PD-L1表达水平的抑制。
[0069] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)的PLC/PRF/5肝癌细胞，分配到无酚红体积浓度为2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)中培养24小时；细胞密度在30％左右时进行阿可拉定处理加药处理。2小时后根据实验设计在有IL-6存在的组别中对细胞用IL-6(10ng/ml)处理，与阿可拉定共同作用48小时收取细胞。
[0070] 4个组别依次是在培养体系中只加入DMSO对照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、加入5μmol/L阿可拉定DMSO溶液、加入10ng/ml的IL-6、加入5μmol/L阿可拉定DMSO溶液和10ng/ml的IL-6的混合溶液，混合溶液中DMSO和IL-6的体积相等。
[0072] 检测结果通过图1上半图可见，与DMSO对照组相比，加入5μmol/L阿可拉定的肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表达明显降低；加入10ng/ml的IL-6的肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表达水平与只加DMSO对照比升高；在阿可拉定和IL-6共同存在的情况下，IL-6作用下表达升高的PD-L1也能被阿可拉定抑制。通过图1下半图可见，各组细胞中内参蛋白GAPDH表达水平没有改变。
[0073] 实施例4
[0074] 不同浓度阿可拉定分别作用肺癌H460细胞12小时、24小时和48小时后，PD-L1表达水平检测。
[0075] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)的H460肺癌细胞，分配到无酚红体积浓度为2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)中培养24小时；细胞密度在30％左右时对细胞进行阿可拉定处理(DMSO体积终浓度1:1000)；
[0076] 加入二甲基亚砜(DMSO)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMSO对照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μmol/L阿可拉定DMSO溶液和20μmol/L的阿可拉定DMSO溶液，分别收取作用12小时、24小时和48小时后细胞；
[0077] 收下来的细胞杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和PD-L1抗体，蛋白质印迹法(western blot)进行检测。
[0078] 检测结果通过图2上半图可见，与DMSO对照组相比，在12小时结束后，加入10μmol/L和20μmol/L的阿可拉定的肺癌细胞H460中的PD-L1蛋白表达与DMSO对照组相比有一定下降趋势；在24小时结束后，加入10μmol/L阿可拉定的肺癌细胞H460中的PD-L1蛋白表达相对于对照组DMSO有一定下降趋势，加入20μmol/L阿可拉定的肺癌细胞H460中的PD-L1蛋白表达降低量非常明显；药物处理48小时对PD-L1的抑制作用与药物处理24小时结果类似。通过图2下半图可见，10μmol/L阿可拉定、20μmol/L阿可拉定对于细胞中GAPDH表达不产生任何改变。
[0079] 实施例5
[0080] 不同浓度阿可拉定对于人黑色素瘤细胞A375的PD-L1表达水平检测。
[0081] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)的A375黑色素瘤细胞，分配到无酚红体积浓度为2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)中培养24小时；在30％左右时对细胞进行阿可拉定处理(DMSO体积终浓度1:1000)；
[0082] 加入二甲基亚砜(DMSO)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMSO对照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μM浓度的阿可拉定DMSO溶液和20μM浓度的阿可拉定DMSO溶液，并使每个反应体系中DMSO体积浓度的终值为0.1％。
[0083] 药物处理12小时后收细胞，收下来的细胞裂解液杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和PD-L1抗体，蛋白质印迹法(western blot)进行检测。
[0084] 检测结果通过图3上半图可见，加入10μM阿可拉定12小时，黑色素瘤A375细胞的PD-L1蛋白表达有一定下降趋势，加入20μM阿可拉定12小时，黑色素瘤A375细胞的PD-L1蛋白明显下降。通过图3下半图可见，阿可拉定对于细胞中GAPDH表达不产生任何改变。
[0085] 实施例6
[0086] 在IL-6存在或不存在的条件下，式(III)化合物对肝癌PLC/PRF/5细胞PD-L1表达水平的抑制。
[0087] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)的肝癌PLC/PRF/5细胞，分配到无酚红体积浓度为2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)中培养24小时；细胞密度在30％左右时对细胞加入式(III)化合物处理(DMSO在溶液中的体积中浓度为1:1000)；2小时后根据实验设计在有IL-6存在的组别中对细胞分别用IL-6(10ng/ml)处理，式(III)化合物(3μM)处理，等体积的式(III)化合物(3μM)与IL-6共同作用48小时收取细胞。
[0088] 4个组别依次是在培养体系中只加入DMSO对照(即不含式(III)化合物的DMSO溶液)、加入3μmol/L式(III)化合物的DMSO溶液、加入10ng/ml的IL-6、加入3μmol/L式(III)化合物的DMSO溶液和10ng/ml的IL-6的混合溶液。
[0089] 收下来的细胞杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和PD-L1抗体，蛋白质印迹法(western blot)进行检测。
[0090] 检测结果通过图4上半图可见，加入式(III)化合物的肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1表达水平与DMSO组相比明显降低；加入IL-6的肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1与DMSO对照组相比表达上调；加入IL-6和式(III)化合物混合溶液的肝癌细胞PLC/PRF/5中的PD-L1表达水平与只加入IL-6组相比下降明显。通过图4下半图可见，阿可拉定对于细胞中GAPDH不产生任何改变。
[0091] 实施例7
[0092] 不同浓度阿可拉定对于人黑色素瘤细胞A875的PD-L1表达水平检测。
[0093] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培养基(即DMEM培养基)的A875人黑色素瘤细胞，培养至细胞生长至对数生长期，接种于100mm直径的培养皿中，用含10％的胎牛血清的有酚红的氨基酸和葡萄糖培养基(DMEM培养基)，在37℃，5％CO2的温箱中培养24小时；
[0094] 加入二甲基亚砜(DMSO)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMSO对照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、5μM浓度的阿可拉定DMSO溶液、10μM浓度的阿可拉定DMSO溶液和20μM浓度的阿可拉定DMSO溶液，并使每个反应体系中DMSO体积浓度的终值为0.1％。
[0095] 药物处理48小时后收细胞，收下来的细胞裂解液杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和PD-L1抗体，蛋白质印迹法(western blot)进行检测。
[0096] 检测结果通过图5上半图可见，加入10μM阿可拉定48小时，黑色素瘤A875细胞的PD-L1蛋白表达有一定下降趋势，加入20μM阿可拉定48小时，黑色素瘤A875细胞的PD-L1蛋白明显下降。通过图5下半图可见，阿可拉定对于细胞中GAPDH表达不产生任何改变。
[0097] 实施例8
[0098] 不同浓度的阿可拉定对人多发性骨髓瘤U266细胞的PD-L1表达水平的检测[0099] 实验步骤：细胞培养：首先将密度为90％以上的生长在有酚红的含有体积浓度为10％胎牛血清的1640培养基(即DMEM培养基)的U266人多发性骨髓瘤细胞，分配至有酚红，
2.5％的胎牛血清1640培养基中培养24小时。
2.5％的胎牛血清1640培养基中培养24小时。
[0100] 加入二甲基亚砜(DMSO)和阿可拉定：在培养体系中分别加入DMSO对照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μM浓度的阿可拉定DMSO溶液、20μM浓度的阿可拉定DMSO溶液和30μM浓度的阿可拉定DMSO溶液，并使每个反应体系中DMSO体积浓度的终值为0.1％。
[0101] 药物处理48小时后收细胞，收下来的细胞裂解液杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和PD-L1抗体，蛋白质印迹法(western blot)进行检测。
[0102] 检测结果通过图6上半图可见，加入10μM阿可拉定48小时，人多发性骨髓瘤细胞U266的PD-L1蛋白表达有一定下降趋势，分别加入20μM和30μM的阿可拉定48小时，人多发性骨髓瘤细胞U266的PD-L1蛋白明显下降。通过图6下半图可见，阿可拉定对于细胞中GAPDH表达不产生任何改变。
[0103] 实施例9
[0104] 阿可拉定对血液中PD-L1表达值的下调。
[0105] 实验方法：
[0106] 1.样品的收集
[0107] 采集受试者静脉血5ml至无抗凝剂的采血管。室温条件下，将血液静置30分钟，1000g离心15分钟，收集血清，并进行快速分析。
[0108] 2.分析方法
[0109] 实验前一天采用俘获抗体包被ELISA平板，孵育过夜。
[0110] 正式开始检测实验前将所有的试剂和样品放置于室温下平衡。
[0111] 去除板中包被液，每孔加入400μL洗涤液，洗涤后在干净的吸水纸上拍干充分去除残留液体。重复洗涤四次。
[0112] 向每个检测孔加入100μL分析稀释液，之后向对应的实验孔分别加入100μL标准品、对照品或者样品。封板后将样品置于水平轨道式(0.12”orbit)摇床，500转/分钟(rpm)室温震荡培养2小时。
[0113] 去除板中反应液，洗涤平板四次。
[0114] 向每个孔加入200μL的PD-1络合物，封板后在摇床上室温继续培养两个小时。
[0115] 抽吸、洗涤平板四次。
[0116] 向每个孔加入200μL底物溶液，室温条件下避光孵育30分钟。
[0117] 向每个孔加入50μL终止溶液，孔内颜色由蓝变黄，如颜色变化不均一则轻拍平板彻底混匀孔中液体。
[0118] 30分钟内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，如果波长校正是有效的，设为540nm或570nm。如果波长校正不可用，从450nm波长读数减去540nm或570nm波长读数。这种方法可以校正板的光学缺陷。直接在450nm而无校正读数可能会偏高或偏低。
[0119] 3.计算结果
[0120] 标准品、阳性对照品以及样品的OD值减去空白孔的OD值，取两个复孔的均值。以标准品吸光度的Log值为纵坐标，浓度的log值为横坐标，通过能够产生4参数拟合曲线的计算机软件绘制标准曲线。将样品的吸光度代入标准曲线中，从标准曲线上读取样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中PD-L1的实际浓度。
[0121] 结论：
[0122] 见图7，病人服用阿可拉定后，PR与SD病人血液中的PD-L1出现降低或维持相对稳定(病例A04、A08-1、A07、00502、0121)，但PD病人血液中的PD-L1则出现显著升高(病例0212、0411、00501、0108、A05、A06)，提示药物可能通过调节PD-L1信号通路发挥治疗作用。
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