一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1
阅读：262发布：2023-03-12
专利汇可以提供一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种能识别多种 脊椎动物 vigilin的单链 抗体 P33D1，并给出了编码单链抗体P33D1的DNA序列及其 蛋白质 氨 基酸预测序列，涉及内分泌干扰物潜在 生物 标志物vigilin的检测，该单链抗体P33D1通过 噬菌体 展示技术制备。本发明的优点是：提供一种低成本检测vigilin的分子工具，制备价格低廉，方法简便，能够批量生产。？？，下面是一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1专利的具体信息内容。
1.一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列为：
ATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTACGGGTAACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA。
2.根据权利要求1所述的一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1，其特征在于，该单链抗体P33D1的氨基酸序列为：
MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA。
3.实现权利要求1所述的一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的制备方法，该方法包含下列步骤：
（1）选取斑马鱼vigilin碳末端的序列，将该序列克隆到pET28a载体中，在大肠杆菌BL21中表达重组vigilin蛋白，用His bind树脂纯化，将纯化后的vigilin重组蛋白固定在Ni-NTA HisSorb Plate上；
（2）将鼠源天然抗体噬菌体展示单链抗体文库拯救后，用重组vigilin蛋白对噬菌体展示单链抗体文库进行三轮淘选，得到单链抗体文库的菌液；
（3）将菌液涂在氨苄抗性的平板上，30℃培养至长出单菌落；
（4）对各单菌落用ELISA方法鉴定可特异识别重组vigilin蛋白的单链抗体阳性克隆菌株，选取A450nm值较高的单链抗体阳性克隆菌株，将该克隆株命名为P33D1菌株；
（5）对P33D1菌株的单链抗体进行DNA测序，如果该DNA序列与权利要求1所述的一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同，进行步骤(6)；如果该DNA序列与权利要求1所述的一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列不同，返回步骤(1)；
（6）将P33D1菌株诱导表达为可溶性单链抗体P33D1；
（7）用Western Blot方法检测单链抗体P33D1对成年雄性和雌性斑马鱼肝脏、小鼠肝脏以及人的子宫颈癌细胞vigilin的识别，结果显示该单链抗体P33D1能够特异识别斑马鱼，小鼠以及人的vigilin；
（8）该单链抗体即为一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1。
一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1
技术领域
背景技术
[0002] 卵黄蛋白原是卵生脊椎动物合成卵黄蛋白的前体，正常条件下，卵黄蛋白原只分布在性成熟雌性个体中；但当雄性个体以及幼体在受到环境中类雌激素作用时，也可以产生卵黄蛋白原，卵黄蛋白原是有效的类雌激素生物标志物，但它仅分布于卵生脊椎动物中，导致其作为生物标志物的使用受到很大的限制。Vigilin(目前还没有中文译文)分子量约为150 kDa，在物种间高度保守，与RNA结合发挥多种功能，它广泛分布于真核生物当中，已有文献报道，vigilin可以稳定卵黄蛋白原的mRNA使其不受核酸内切酶的降解，同时，vigilin也受雌激素的诱导，可能是潜在的生物标志物，能够应用于环境监测中。抗体是检测生物标志物的重要手段之一，目前已报道的识别vigilin的抗体有Chiu et al., High-density lipoprotein-binding protein (HBP)/vigilin is expressed in human atherosclerotic lesions and colocalizes with apolipoprotein E, Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology, 1997, 17(11): 2350-2358；Dodson et al., Vigilin, a ubiquitous protein with 14 K homology domains, is the estrogen-inducible vitellogenin mRNA 3'-untranslated region-binding protein, The Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(19): 12249-12252；以及Goolsby et al., RNAi-mediated depletion of the 15 KH domain protein, vigilin, induces death of dividing and non-dividing human cells but does not initially inhibit protein synthesis, Nucleic Acids Research, 2003, 31(19):5644-5653 等，这 些vigilin抗体都是多克隆抗体，其不足之处在于，它们只能专一地识别单种属的vigilin。
[0003] 噬菌体展示单链抗体主要通过将工程化的抗体可变区基因片段插入到噬菌体外壳蛋白基因中，达到抗体可变区与噬菌体外壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面的目的。通过几轮对目的抗原的淘选，目标抗体即可快速且廉价地获得，此单链抗体在大肠杆菌中表达分泌，可批量制备；另外，由于不需要免疫动物，通过噬菌体展示技术获得的单克隆抗体比多克隆抗体更加方便快捷。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1，该单链抗体P33D1通过噬菌体展示技术制备。本发明的优点在于，单链抗体P33D1可以特异性识别从鱼类到高等哺乳动物等多种脊椎动物vigilin。本发明成本低、制备简便、可大量制备，以单链抗体P33D1为分子工具，可进一步检测潜在生物标志物vigilin的表达以及研究其功能。
[0005] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列为：
ATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTACGGGTAACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA
一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的氨基酸序列为：
MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA
制备一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的方法，该方法包含下列步骤：
(1)选取斑马鱼vigilin碳末端的序列，将该序列克隆到pET28a载体（美国Novagen公司产品）中，在大肠杆菌BL21 (DE3) （美国Novagen公司产品）中表达重组vigilin蛋白，用His bind（美国Novagen公司产品）树脂纯化，将纯化后的vigilin重组蛋白固定在Ni-NTA HisSorb Plate（德国Qiagen产品）上；
(2)将鼠源天然抗体噬菌体展示单链抗体文库（文库的制备方法见Rao et al., Novel recombinant monoclonal antibodies for vitellogenin assays in cyprinid fish species. Diseases of Aquatic Organisms, 2010, 93: 83—91）拯救后，用重组vigilin蛋白对噬菌体展示单链抗体文库进行三轮淘选，得到单链抗体文库的菌液；
(3)将菌液涂在氨苄抗性的平板上，30℃培养至长出单菌落；
(4)对各单菌落用ELISA方法鉴定可特异识别重组vigilin蛋白的单链抗体阳性克隆菌株，选取A450nm值较高的单链抗体阳性克隆菌株，将该克隆株命名为P33D1菌株；
(5)对P33D1菌株的单链抗体进行DNA测序，如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同，进行步骤(6)；如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列不同，返回步骤(1)；（经过多次重复试验，一般不超过4次，便可得到与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同的单链抗体）；
(6)将P33D1菌株诱导表达为可溶性单链抗体P33D1；
(7)用Western Blot方法检测单链抗体P33D1对成年雄性和雌性斑马鱼肝脏、小鼠肝脏以及人的子宫颈癌细胞（Hela细胞）vigilin的识别，结果显示该单链抗体P33D1能够特异识别斑马鱼，小鼠以及人的vigilin；
(8)该单链抗体即为一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1。
ATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTACGGGTAACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA
一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的氨基酸序列为：
MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA
制备一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的方法，该方法包含下列步骤：
(1)选取斑马鱼vigilin碳末端的序列，将该序列克隆到pET28a载体（美国Novagen公司产品）中，在大肠杆菌BL21 (DE3) （美国Novagen公司产品）中表达重组vigilin蛋白，用His bind（美国Novagen公司产品）树脂纯化，将纯化后的vigilin重组蛋白固定在Ni-NTA HisSorb Plate（德国Qiagen产品）上；
(2)将鼠源天然抗体噬菌体展示单链抗体文库（文库的制备方法见Rao et al., Novel recombinant monoclonal antibodies for vitellogenin assays in cyprinid fish species. Diseases of Aquatic Organisms, 2010, 93: 83—91）拯救后，用重组vigilin蛋白对噬菌体展示单链抗体文库进行三轮淘选，得到单链抗体文库的菌液；
(3)将菌液涂在氨苄抗性的平板上，30℃培养至长出单菌落；
(4)对各单菌落用ELISA方法鉴定可特异识别重组vigilin蛋白的单链抗体阳性克隆菌株，选取A450nm值较高的单链抗体阳性克隆菌株，将该克隆株命名为P33D1菌株；
(5)对P33D1菌株的单链抗体进行DNA测序，如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同，进行步骤(6)；如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列不同，返回步骤(1)；（经过多次重复试验，一般不超过4次，便可得到与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同的单链抗体）；
(6)将P33D1菌株诱导表达为可溶性单链抗体P33D1；
(7)用Western Blot方法检测单链抗体P33D1对成年雄性和雌性斑马鱼肝脏、小鼠肝脏以及人的子宫颈癌细胞（Hela细胞）vigilin的识别，结果显示该单链抗体P33D1能够特异识别斑马鱼，小鼠以及人的vigilin；
(8)该单链抗体即为一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1。
[0006] 本发明的优点和效果:通过噬菌体展示技术得到的单链抗体P33D1，能够特异性识别多种脊椎动物的vigilin。相对于多克隆抗体和杂交瘤细胞制备的单克隆抗体，本发明的单链抗体制备过程简单，可以通过大肠杆菌的发酵大量生产，减少人力物力消耗。而且，已报道的能识别vigilin的抗体，仅能应用于单一种属，而我们发明的单链抗体，则能够识别从鱼类到高等哺乳动物等多种脊椎动物vigilin，以单链抗体P33D1为分子工具，可进一步检测潜在生物标志物vigilin的表达以及研究其功能。
附图说明
附图说明
[0007] 图1：用Western Blot方法检测单链抗体P33D1对斑马鱼，小鼠以及人类Hela细胞vigilin的识别；其中，“1”泳道为雌性小鼠肝脏匀浆液上清；
“2”泳道为雄性斑马鱼肝脏匀浆液上清，其无vigilin表达，作为阴性对照；
“3”泳道为雌性性斑马鱼肝脏匀浆液上清；
“4” 泳道为人子宫颈癌Hela细胞裂解液上清。
具体实施方案
“2”泳道为雄性斑马鱼肝脏匀浆液上清，其无vigilin表达，作为阴性对照；
“3”泳道为雌性性斑马鱼肝脏匀浆液上清；
“4” 泳道为人子宫颈癌Hela细胞裂解液上清。
具体实施方案
[0008] 一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列为：ATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTACGGGTAACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA
一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的氨基酸序列为：
MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA
制备一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的方法，该方法包含下列步骤：
(1) 选 取 斑 马 鱼 vigilin 碳 末 端 的 序 列，设 计 上 游 引 物 5'- CCCAAGCTTTTCCAGACCGAGAAGAACAG -3'和下游引物5'- CCGCTCGAGCTACATATAGGCCATTTTGGCT -3'，其中下划线碱基分别表示的是HindIII 和XhoI限制性内切酶酶切位点，提取斑马鱼肝脏总RNA，逆转录成cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增所选择的DNA序列后，用HindIII 和XhoI两种限制性内切酶（日本Takara产品）酶切后，克隆进pET28a载体中，化转到大肠杆菌BL21 (DE3)中，将菌液涂在LB+Kana的平板上，37℃培养至长出单菌落；挑取单克隆，经Invitrogen公司测序验证所得克隆构建成功；
其中： LB+Kana平板的制备方法：在LB固体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g,琼脂粉15g，加水至总体积为1L）中，加入卡那霉素（Kana）至终浓度50 微克/毫升，将混合物倒在平板中；
(2)在大肠杆菌BL21(DE3)表达vigilin重组蛋白；
2a 挑取单克隆于20 毫升 LB+Kana培养基中，在 30℃，200转/分钟的条件下，振荡培养过夜，得菌液；
其中：LB+Kana培养基制备方法为：在LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠
5g,加水至总体积为1L）中，加入卡那霉素至终浓度50 微克/毫升
2b 取菌液6 毫升接种到300 毫升LB+Kana培养基培养液中，在30 ℃摇床中200转/分钟振荡培养至A600nm=0.5-0.8；
2c 再加入IPTG至终浓度为1毫摩/升，30℃，200转/分钟振荡培养过夜；
其中：IPTG即为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
2d 将菌液， 4℃，4000转/分离心15 分钟；
2e 去上清，加入蛋白纯化结合缓冲液15毫升，重悬沉淀，超声波破菌；
其中：结合缓冲液配方：500毫摩/升氯化钠, 5毫摩/升咪唑, 20毫摩/升Tris base用浓盐酸将PH调至7.7；
2f 4℃，10000转/分钟离心15 分钟，收集上清；
2g 用His Bind树脂纯化上清，得到目的蛋白，该蛋白即为纯化的大肠杆菌表达的vigilin重组蛋白。
一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的氨基酸序列为：
MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA
制备一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的方法，该方法包含下列步骤：
(1) 选 取 斑 马 鱼 vigilin 碳 末 端 的 序 列，设 计 上 游 引 物 5'- CCCAAGCTTTTCCAGACCGAGAAGAACAG -3'和下游引物5'- CCGCTCGAGCTACATATAGGCCATTTTGGCT -3'，其中下划线碱基分别表示的是HindIII 和XhoI限制性内切酶酶切位点，提取斑马鱼肝脏总RNA，逆转录成cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增所选择的DNA序列后，用HindIII 和XhoI两种限制性内切酶（日本Takara产品）酶切后，克隆进pET28a载体中，化转到大肠杆菌BL21 (DE3)中，将菌液涂在LB+Kana的平板上，37℃培养至长出单菌落；挑取单克隆，经Invitrogen公司测序验证所得克隆构建成功；
其中： LB+Kana平板的制备方法：在LB固体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g,琼脂粉15g，加水至总体积为1L）中，加入卡那霉素（Kana）至终浓度50 微克/毫升，将混合物倒在平板中；
(2)在大肠杆菌BL21(DE3)表达vigilin重组蛋白；
2a 挑取单克隆于20 毫升 LB+Kana培养基中，在 30℃，200转/分钟的条件下，振荡培养过夜，得菌液；
其中：LB+Kana培养基制备方法为：在LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠
5g,加水至总体积为1L）中，加入卡那霉素至终浓度50 微克/毫升
2b 取菌液6 毫升接种到300 毫升LB+Kana培养基培养液中，在30 ℃摇床中200转/分钟振荡培养至A600nm=0.5-0.8；
2c 再加入IPTG至终浓度为1毫摩/升，30℃，200转/分钟振荡培养过夜；
其中：IPTG即为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
2d 将菌液， 4℃，4000转/分离心15 分钟；
2e 去上清，加入蛋白纯化结合缓冲液15毫升，重悬沉淀，超声波破菌；
其中：结合缓冲液配方：500毫摩/升氯化钠, 5毫摩/升咪唑, 20毫摩/升Tris base用浓盐酸将PH调至7.7；
2f 4℃，10000转/分钟离心15 分钟，收集上清；
2g 用His Bind树脂纯化上清，得到目的蛋白，该蛋白即为纯化的大肠杆菌表达的vigilin重组蛋白。
[0009] (3)鼠源天然抗体噬菌体展示抗体文库的拯救；3a 在300 毫升 2YT-AG培养基中加入1.5 毫升鼠源天然噬菌体展示单链抗体文库大肠杆菌，37 ℃，200转/分钟震荡培养，得到A600nm＝0.5－0.6的大肠杆菌菌液；
其中：2YT培养基的配方为：酵母膏10g，蛋白胨17g，氯化钠5g，加水至总体积为1L。AG表示，在原培养基的基础上，加入质量体积比为2%的葡萄糖，及100微克/毫升的氨苄青霉素
3b 在大肠杆菌菌液中加入辅助噬菌体M13K07（美国 Invitrogen公司产品），大肠杆菌数目：辅助噬菌体M13K07数目＝1：5，37 ℃，200转/分钟震荡培养1小时；
3c 4℃，4000转/分钟，离心10 分钟，取沉淀物，用200 毫升 2YT-AK培养基重悬， 37 ℃，200转/分钟震荡培养2小时；
其中：AK表示在2YT培养液中加入100微克/毫升的氨苄青霉素（Amp），和50 微克/毫升的卡那霉素(Kana)
3d 4 ℃，10000转/分钟离心20 分钟，加入 2YT-AK培养基体积1/5体积的PEG/NaCl，冰浴1小时；
其中：PEG/NaCl的配方为：质量体积比为20%的聚乙二醇8000 ，2.5摩尔/升的氯化钠，其余为水
3e 4 ℃，10000转/分钟离心20分钟，取沉淀物，用0.5毫升2YT培养基重悬，得到拯救的噬菌体展示单链抗体文库溶液。
其中：2YT培养基的配方为：酵母膏10g，蛋白胨17g，氯化钠5g，加水至总体积为1L。AG表示，在原培养基的基础上，加入质量体积比为2%的葡萄糖，及100微克/毫升的氨苄青霉素
3b 在大肠杆菌菌液中加入辅助噬菌体M13K07（美国 Invitrogen公司产品），大肠杆菌数目：辅助噬菌体M13K07数目＝1：5，37 ℃，200转/分钟震荡培养1小时；
3c 4℃，4000转/分钟，离心10 分钟，取沉淀物，用200 毫升 2YT-AK培养基重悬， 37 ℃，200转/分钟震荡培养2小时；
其中：AK表示在2YT培养液中加入100微克/毫升的氨苄青霉素（Amp），和50 微克/毫升的卡那霉素(Kana)
3d 4 ℃，10000转/分钟离心20 分钟，加入 2YT-AK培养基体积1/5体积的PEG/NaCl，冰浴1小时；
其中：PEG/NaCl的配方为：质量体积比为20%的聚乙二醇8000 ，2.5摩尔/升的氯化钠，其余为水
3e 4 ℃，10000转/分钟离心20分钟，取沉淀物，用0.5毫升2YT培养基重悬，得到拯救的噬菌体展示单链抗体文库溶液。
[0010] (4)用vigilin重组蛋白对单链抗体文库进行淘选4a 取步骤2g中纯化的大肠杆菌表达的vigilin重组蛋白10微克以及带有pET28a表达标签的纯化蛋白10微克，分别用200微升 PBS 稀释，加入到Ni-NTA HisSorb Plate（德国Qiagen产品），4℃放置过夜进行蛋白包被后，PBS清洗三次备用；
其中：PBS配方为：1 L水中溶解 8 g 氯化钠，0.2 g KCl，3.7 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，用NaOH调节pH值为7.4。
其中：PBS配方为：1 L水中溶解 8 g 氯化钠，0.2 g KCl，3.7 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，用NaOH调节pH值为7.4。
[0011] 4b 将步骤3e中的单链抗体文库溶液200微升加入4a包被好带pET28a表达标签纯化蛋白的Ni-NTA HisSorb Plate中，室温孵育1小时后，取上清液；4c 将步骤4b中的上清液加入到步骤4a中包被好vigilin重组蛋白的Ni-NTA HisSorb Plate中，室温孵育1小时后，去掉上清液，用PBST清洗10遍后再用PBS清洗10遍；
其中：PBST配方为：1 L水中溶解 8 g 氯化钠，0.2 g KCl，3.7 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，用NaOH调节pH值为7.4，加入1毫升吐温-20。
其中：PBST配方为：1 L水中溶解 8 g 氯化钠，0.2 g KCl，3.7 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，用NaOH调节pH值为7.4，加入1毫升吐温-20。
[0012] 4d 加入100毫摩尔三乙胺溶液200微升，震荡15分钟后，取出液体到一灭菌三角瓶中，加入100微升1摩尔/升Tris-HCl溶液（pH为7.5）中和；其中：100毫摩尔三乙胺溶液配方：1 L水中溶解10.12 g三乙胺；1摩/升Tris-HCl溶液配方为：1 L水中溶解121.14 Tris base，用盐酸调 pH至 7.5
4e 将10毫升大肠杆菌TG1加入到4d混合液中，37℃静置培养1小时，得到大肠杆菌TG1菌液；
其中：该大肠杆菌TG1表示，将TG1在2YT培养液中，200转/分钟，37℃条件下生长，使A600nm达到0.3-0.5
4f 将大肠杆菌TG1菌液涂在SOBAG平板上，30℃培养至长出菌落；
其中，SOBAG平板制备方法为：胰蛋白胨20g， 酵母提取5g， 氯化钠 0.5g，加水至总体积为1L，高温灭菌后，加入氯化镁至10毫摩/升，氨苄青霉素100微克/毫升，质量体积比为2%的葡萄糖
4g 取SOBAG平板上的菌落，得到淘选后的鼠源天然噬菌体展示单链抗体文库大肠杆菌；
4h 重复步骤(3) (4)两次；
(5) 用ELISA方法鉴定可特异识别vigilin重组蛋白的单链抗体阳性克隆菌株
5a 选取步骤(4)经三轮淘选的SOBAG平板上的各单菌落，分别加入200 微升 2YT-AG培养基，30 ℃培养过夜；
5b 吸取25 微升菌液，再加入175微升2YT-AG培养基，30 ℃培养3 小时；
5c 3500转/分钟，离心10 分钟，取沉淀物，200 微升2YT-AI重悬，30 ℃诱导过夜；
其中：2YT-AI 表示在2YT 培养液里加入氨苄青霉素100微克/毫升，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1摩尔/升
5d 4 ℃，3500转/分钟，离心10 分钟，取上清，上清即为单链抗体溶液；
5e 将步骤2g中纯化的vigilin重组蛋白用PBS稀释，100纳克/100微升/孔加入到酶标板（广州BIOFIL公司)，4℃放置过夜；
5f 倾掉包被液后，以PBS洗3次，用4%的PBSM封闭1 小时；
其中：4%的PBSM表示，在PBS溶液中，加入质量体积分数为4%的脱脂奶粉
5g 倾掉4%的PBSM，用PBS洗3次，加入50 微升步骤5d中的单链抗体溶液和50 微升
4% PBSM，于37 ℃保温1小时；
5h 用PBS和PBST各洗3次，加入100微升4%PBSM稀释的HRP/ E-Tag conjugate溶液(美国Abcam公司产品)，37 ℃保温1小时；
HRP/ E-Tag conjugate表示辣根过氧化物酶标记的E tag 抗体，
5i 再用PBST和PBS各洗3次，加入100微升TMB底物溶液，显色10 分钟，再加入25微升2 摩尔/升的硫酸，中止反应，酶标仪测定A450nm值，A450nm≥0.05为单链抗体阳性克隆菌株；
其中：TMB溶液的配方为：浓度为1 摩尔/升的醋酸钠溶液 (pH6.0) 2.5 毫升，22.5 毫升 H2O，250微升 TMB储液：称取60毫克 TMB粉末溶于1 毫升二甲亚枫 (DMSO) 中，10微升双氧水。
4e 将10毫升大肠杆菌TG1加入到4d混合液中，37℃静置培养1小时，得到大肠杆菌TG1菌液；
其中：该大肠杆菌TG1表示，将TG1在2YT培养液中，200转/分钟，37℃条件下生长，使A600nm达到0.3-0.5
4f 将大肠杆菌TG1菌液涂在SOBAG平板上，30℃培养至长出菌落；
其中，SOBAG平板制备方法为：胰蛋白胨20g， 酵母提取5g， 氯化钠 0.5g，加水至总体积为1L，高温灭菌后，加入氯化镁至10毫摩/升，氨苄青霉素100微克/毫升，质量体积比为2%的葡萄糖
4g 取SOBAG平板上的菌落，得到淘选后的鼠源天然噬菌体展示单链抗体文库大肠杆菌；
4h 重复步骤(3) (4)两次；
(5) 用ELISA方法鉴定可特异识别vigilin重组蛋白的单链抗体阳性克隆菌株
5a 选取步骤(4)经三轮淘选的SOBAG平板上的各单菌落，分别加入200 微升 2YT-AG培养基，30 ℃培养过夜；
5b 吸取25 微升菌液，再加入175微升2YT-AG培养基，30 ℃培养3 小时；
5c 3500转/分钟，离心10 分钟，取沉淀物，200 微升2YT-AI重悬，30 ℃诱导过夜；
其中：2YT-AI 表示在2YT 培养液里加入氨苄青霉素100微克/毫升，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1摩尔/升
5d 4 ℃，3500转/分钟，离心10 分钟，取上清，上清即为单链抗体溶液；
5e 将步骤2g中纯化的vigilin重组蛋白用PBS稀释，100纳克/100微升/孔加入到酶标板（广州BIOFIL公司)，4℃放置过夜；
5f 倾掉包被液后，以PBS洗3次，用4%的PBSM封闭1 小时；
其中：4%的PBSM表示，在PBS溶液中，加入质量体积分数为4%的脱脂奶粉
5g 倾掉4%的PBSM，用PBS洗3次，加入50 微升步骤5d中的单链抗体溶液和50 微升
4% PBSM，于37 ℃保温1小时；
5h 用PBS和PBST各洗3次，加入100微升4%PBSM稀释的HRP/ E-Tag conjugate溶液(美国Abcam公司产品)，37 ℃保温1小时；
HRP/ E-Tag conjugate表示辣根过氧化物酶标记的E tag 抗体，
5i 再用PBST和PBS各洗3次，加入100微升TMB底物溶液，显色10 分钟，再加入25微升2 摩尔/升的硫酸，中止反应，酶标仪测定A450nm值，A450nm≥0.05为单链抗体阳性克隆菌株；
其中：TMB溶液的配方为：浓度为1 摩尔/升的醋酸钠溶液 (pH6.0) 2.5 毫升，22.5 毫升 H2O，250微升 TMB储液：称取60毫克 TMB粉末溶于1 毫升二甲亚枫 (DMSO) 中，10微升双氧水。
[0013] 5j 将单链抗体阳性克隆菌株中A450nm值最高的菌株命名为P33D1菌株。
[0014] (6)对P33D1菌株的单链抗体进行DNA测序，如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列相同，进行步骤(7)；如果该DNA序列与前述一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1的DNA序列不同，返回步骤(3)；(7) 单链抗体P33D1的诱导表达
7a 取P33D1菌株于20毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养过夜；
7b 将6毫升菌液转接至300毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养至A600nm达到0.5-0.8；
7c 4500转/分，离心15 分钟，取沉淀物，300毫升2YT-AI重悬，30℃，200转/分，培养过夜；
7d 4℃，4500转/分，离心15分钟，取沉淀物，3毫升预冷的1×TES溶液重悬，再加入预冷的1/5×TES溶液4.5毫升，混匀，冰浴30分钟；
7e 4℃，10000转/分，离心15 min，收集上清，此即为可溶性单链抗体P33D1。
7a 取P33D1菌株于20毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养过夜；
7b 将6毫升菌液转接至300毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养至A600nm达到0.5-0.8；
7c 4500转/分，离心15 分钟，取沉淀物，300毫升2YT-AI重悬，30℃，200转/分，培养过夜；
7d 4℃，4500转/分，离心15分钟，取沉淀物，3毫升预冷的1×TES溶液重悬，再加入预冷的1/5×TES溶液4.5毫升，混匀，冰浴30分钟；
7e 4℃，10000转/分，离心15 min，收集上清，此即为可溶性单链抗体P33D1。
[0015] 用Western blot方法检测本发明的一种能识别多种脊椎动物vigilin的单链抗体P33D1对斑马鱼，小鼠以及人类vigilin的识别，其方法按下列步骤进行：1)样品制备，取雄性斑马鱼肝脏，雌性斑马鱼肝脏和雌性小鼠肝脏，称重后加入10倍体积的RIPA蛋白抽提液（抽提液里面含有蛋白酶抑制剂，DBI公司），匀浆后去上清；取人类
6
子宫颈癌Hela细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，按10 加入500微升上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清。
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子宫颈癌Hela细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，按10 加入500微升上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清。
[0016] 2)分别取以上的肝脏匀浆液以及Hela细胞裂解液100微升，加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸8分钟后上样，进行10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒定电压140伏，电泳至溴酚蓝染料快到玻璃板边缘时；其中：2×上样缓冲液配方：SDS 0.4克， 溴酚蓝 0.1毫克，0.5摩尔/升 This-Cl (pH
6.8) 2.5毫升，甘油 2.0毫升，β-巯基乙醇 0.2毫升，双蒸水5.2毫升
10%SDS-PAGE配方：质量体积比为30%的聚丙烯酰胺 1.7毫升，1.5 摩尔/升的Tris-Cl(PH 8.8) 1.3毫升，质量体积比为10%的SDS 0.05毫升，质量体积比为10%的过硫酸铵0.05毫升，四甲基乙二胺 0.002毫升。
6.8) 2.5毫升，甘油 2.0毫升，β-巯基乙醇 0.2毫升，双蒸水5.2毫升
10%SDS-PAGE配方：质量体积比为30%的聚丙烯酰胺 1.7毫升，1.5 摩尔/升的Tris-Cl(PH 8.8) 1.3毫升，质量体积比为10%的SDS 0.05毫升，质量体积比为10%的过硫酸铵0.05毫升，四甲基乙二胺 0.002毫升。
[0017] 3)将变性分离蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜（NC膜，美国Millipore产品）上，恒定电流100毫安，持续时间1小时；4)取出NC膜，用4%PBSM封闭1h，PBS洗三次后，加入用4%PBSM稀释100倍后的本发明的可溶性单链抗体P33D1溶液，37℃保温孵育1小时；
5)PBST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入PBSM稀释（1:5000）的HRP/E tag conjugate抗体，37℃保温孵育1小时；
6)PBST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入超敏ECL化学发光即用型底物（武汉博士德公司），显色拍照。
5)PBST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入PBSM稀释（1:5000）的HRP/E tag conjugate抗体，37℃保温孵育1小时；
6)PBST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入超敏ECL化学发光即用型底物（武汉博士德公司），显色拍照。
[0018] 结果如图1所示，雄性斑马鱼肝脏匀浆液（泳道2）中因不含有vigilin，检测不到信号；雌性斑马鱼肝脏匀浆液（泳道3）可能是因为vigilin蛋白的降解检测到多条vigilin信号；同样在雌性小鼠肝脏匀浆液（泳道1）和人类Hela细胞（泳道4）中都检测到强烈的信号，表明本发明的单链抗体P33D1能特异识别多种脊椎动物的vigilin。
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