人类乳头瘤病毒免疫原性多肽、其制备方法及应用
阅读：895发布：2023-02-21
专利汇可以提供人类乳头瘤病毒免疫原性多肽、其制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了多条 人类 乳头 瘤病毒 免疫原性长多肽，所述长多肽的 氨 基酸序列如 序列表 中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10中的一种所示。本发明还提供了所述的免疫原性长多肽在制备 预防 和 治疗 人类乳头瘤 病毒感染 所引起的感染性 疾病 和 肿瘤 性疾病的 疫苗 中的应用。本发明提供了较 现有技术 相比特异性更强、 覆盖 率更高、安全性更好的HPV多肽疫苗。，下面是人类乳头瘤病毒免疫原性多肽、其制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.人类乳头瘤病毒预防和治疗性疫苗，其特征在于，该疫苗包括人类乳头瘤病毒免疫原性多肽，所述人类乳头瘤病毒免疫原性多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂或辅助性多肽。
3.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为无机佐剂、有机佐剂、细菌佐剂、核酸佐剂或细胞因子佐剂。
4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述无机佐剂为氢氧化铝；所述有机佐剂为不完全弗氏佐剂；所述细菌佐剂为BCG；所述核酸佐剂为CpG；所述细胞因子佐剂为IL2、IFN-α、IFN-γ和GM-CSF中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述辅助性多肽为MHC II限制性多肽。
6.人类乳头瘤病毒免疫原性多肽在制备预防和治疗人类乳头瘤病毒感染所引起的感染性疾病和肿瘤性疾病的疫苗中的应用，所述人类乳头瘤病毒免疫原性多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述感染性疾病为人类乳头瘤病毒感染性性病。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤性疾病包括人类乳头瘤病毒感染所致子宫颈、外阴、肛门、阴茎和口咽增生性病变、良性肿瘤、癌前病变及癌。
人类乳头瘤病毒免疫原性多肽、其制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及人类乳头瘤病毒免疫原性多肽、其制备方法及应用，尤指具有免疫原性的、能与人类白细胞抗原(HLA)-A1、A2、A3、A11和A24结合的人类乳头瘤病毒HPV16和18的E6和E7多肽序列、这些多肽的制备方法及其用于制备预防和治疗HPV感染和由HPV感染引起的性病和良、恶性肿瘤的药物的应用，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 乳头瘤病毒(Papillomavirus)可感染多种生物，它具有种属特异性。动物乳头瘤病毒不会感染人类，同样人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)不会感染动物。HPV属于双链脱氧核糖核酸无被膜病毒，有嗜组织特异性，易感染人体皮肤和粘膜的上皮组织，常引起男女肛门生殖器炎症，上皮增生，进而发展为良性肿瘤如尖锐湿疣(又称性病湿疣)，或恶性肿瘤如子宫颈癌。子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一。据WHO统计，全球现有宫颈癌患者约170万，每年约50万新发病例，20多万死亡病例。我国现有宫颈癌患者约
14万，每年新增病例约4万。对于HPV感染病人的传统治疗方法主要有药物和物理治疗两类。其中治疗用药物有普达非任脂、5-氟尿嘧啶、争光霉素和干扰素等；物理治疗有电烙、激光治疗、冷冻外科手术和外科手术切除等方法。现有技术的局限性在于：现有的药物治疗没有特异性，全身用药有明显的副作用，而局部用药又不方便；物理治疗不适用于HPV感染早中期病人，只适用于病人发生了上皮不典型增生和癌肿后的情况，而且会给病人带来痛苦和不良后果。宫颈发展为浸润性肿瘤后通常必须采取部分或全部子宫颈切除手术，这不利于妇女的生育和其它的正常生理功能。在目前的疗法下，尖锐湿疣有20-50％的机会复发，浸润性宫颈癌的死亡率高达60％，复发病例的2年存活率只有5％。子宫颈癌是全球妇女因肿瘤死亡的第二常见原因。由此可见，HPV感染目前还没有一种特异有效的疗法，研发一种特异有效的疗法势在必行。
14万，每年新增病例约4万。对于HPV感染病人的传统治疗方法主要有药物和物理治疗两类。其中治疗用药物有普达非任脂、5-氟尿嘧啶、争光霉素和干扰素等；物理治疗有电烙、激光治疗、冷冻外科手术和外科手术切除等方法。现有技术的局限性在于：现有的药物治疗没有特异性，全身用药有明显的副作用，而局部用药又不方便；物理治疗不适用于HPV感染早中期病人，只适用于病人发生了上皮不典型增生和癌肿后的情况，而且会给病人带来痛苦和不良后果。宫颈发展为浸润性肿瘤后通常必须采取部分或全部子宫颈切除手术，这不利于妇女的生育和其它的正常生理功能。在目前的疗法下，尖锐湿疣有20-50％的机会复发，浸润性宫颈癌的死亡率高达60％，复发病例的2年存活率只有5％。子宫颈癌是全球妇女因肿瘤死亡的第二常见原因。由此可见，HPV感染目前还没有一种特异有效的疗法，研发一种特异有效的疗法势在必行。
[0003] HPV有130余个不同的亚型，在肛门生殖器普查中发现的HPV约有23种，其中有些常常引起良性病变，称为低危型HPV(low-risk HPV)，如HPV11和HPV6。有些常常引起恶性病变，称为高危型HPV(high-risk HPV)，如HPV16和18。85-90％的子宫颈癌以及35-50％的外阴癌患者呈HPV16和HPV18阳性(W.J.van Driel，et al，Eur J Cancer，35：946-952，1999)。子宫颈癌的发生通常在HPV感染十年以后，多发生于生育期妇女。有报导称大约
25-33％的子宫颈癌发生于尖锐湿疣后二十五年。超过百分之九十四的子宫颈癌患者的病灶中可以发现HPV DNA，说明HPV感染与子宫颈癌相关。1992年WHO宣布高危型人乳头瘤病毒感染是引起宫颈癌变的首要因素。随着HPV与宫颈癌之间病因学联系的明确，HPV防治研究的重点转向HPV疫苗的研究和开发。
25-33％的子宫颈癌发生于尖锐湿疣后二十五年。超过百分之九十四的子宫颈癌患者的病灶中可以发现HPV DNA，说明HPV感染与子宫颈癌相关。1992年WHO宣布高危型人乳头瘤病毒感染是引起宫颈癌变的首要因素。随着HPV与宫颈癌之间病因学联系的明确，HPV防治研究的重点转向HPV疫苗的研究和开发。
[0004] HPV的基因组含有8000个碱基对，包括早期和晚期基因。早期(E)基因编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等早期蛋白，参与DNA复制，蛋白质转录和细胞转化(transformation)，晚期(L)基因负责指导合成病毒衣壳蛋白(L1和L2)。E6基因表达的蛋白能够与p53蛋白结合，E7基因表达的蛋白能够与视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白结合。p53和Rb蛋白是肿瘤抑制蛋白，在正常情况下它们参与控制细胞的分裂和增生。E6和E7蛋白与其结合后使其失活，激活细胞转录机制，使被感染细胞进入细胞增殖周期，增生转化和癌变。由于这两个癌基因只在HPV转化的恶性细胞中持续表达，而在正常组织中不表达。因此，属于肿瘤特异性抗原，是进行肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。此外，还发现HPV E6和E7蛋白中含有MHC I类限制性T细胞抗原决定簇(MHC class I restricted T cell epitopes)，因此，这奠定了一种设计以E6和E7抗原决定簇为内容的、用于预防和治疗HPV感染及其引起的良性或恶性肿瘤疫苗的基础。
[0005] 免疫系统是生物体抵抗和清除入侵病原体和突变细胞的保护系统，其可分为体液免疫系统(抗体)和细胞免疫系统。大量基础和临床免疫学研究已经证实HPV抗原能够诱导HPV特异性细胞免疫反应，细胞免疫在控制HPV所致病变中起重要作用。临床观察发现大多数妇女在感染HPV 9-15个月后会通过自身免疫把病毒清除掉，甚至有些患者的生殖器疣可以自然消退。重度子宫颈和外阴上皮内瘤(Cervical Intraepithelial neoplasia，Vulvar Intraepithelial neoplasia，CIN/VIN)病人的T淋巴细胞对HPV L1、E2、E4和E7蛋白刺激可产生增生反应。在小鼠实验中，用表达HPV E7和T细胞共刺激分子(costimulatory molecule)B7的肿瘤细胞，或转染HPV16完整基因的肿瘤细胞，或用含全长HPV E7 cDNA的牛痘病毒构件可以诱导产生HPV E7特异性T杀伤细胞。HPV E7多肽联合佐剂(IFA)免疫小鼠能够保护小鼠抵抗随后的HPV E7阳性肿瘤的攻击。给已建立HPV肿瘤无T淋巴细胞免疫能力的裸鼠过继性输入HPV16E7多肽性疫苗所诱导的细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)能清除已建立的HPV肿瘤。HPV可以诱导HPV特异性细胞免疫反应的发现在HPV16阳性子宫颈不典型增生和子宫颈癌患者得到进一步证实。患者外周血和淋巴结的淋巴细胞在用结合有HPV E7多肽的抗原提呈细胞反复刺激后，表现出HPV E7特异杀伤功能。研究还发现病毒阳性，CIN阴性病人的细胞杀伤功能比CIN阳性病人强。有报导在某些HPV感染患者体内存在HPV特异性记忆性T杀伤细胞。另有报导HPV特异性T杀伤细胞在病变的晚期多见于早期，这些发现提示HPV特异性杀伤细胞功能影响着肿瘤的发生和发展。美国南加州大学HPV16E7多肽疫苗一期临床实验的结果显示，66％的HPV16阳性高度子宫颈和外阴上皮内瘤患者在第四次注射疫苗后子宫颈刮片证明病毒被清除。病灶部分或全部消退率达50％。HPV E6和E7抗原诱导的免疫反应可能能够控制HPV急性感染期的病毒活动(M.R.Hilleman，J.Clin.Virology，19：79-90，2000)。综上所述，HPV抗原能够诱导宿主产生HPV抗原特异性细胞免疫反应，这种细胞免疫反应有抵抗病毒感染，预防肿瘤发生，抑制肿瘤生长和促使肿瘤消退的作用。HPV多肽疫苗的应用能够主动地诱导这种保护性的细胞免疫反应，增强机体的免疫能力，预防HPV感染及其诱发的感染性疾病和肿瘤。
[0006] HPV感染后发展为子宫颈癌的潜伏期至少需要十年时间，这非常适合于应用一种预防和治疗性疫苗来控制由HPV引起的性病如尖锐湿疣和男女外生殖器癌前病变及早期癌等。已经公认HPV抗原能够诱导抗HPV的细胞和体液免疫反应，人们普遍认为HPV疫苗是目前预防和治疗由HPV引起的性病和男女外生殖器癌最有希望的疗法之一。发展HPV疫苗是当今HPV感染及其所致疾病防治领域的主攻方向之一。由于HPV不能体外培养，所以不适合发展减毒或灭活的传统病毒疫苗。目前在临床实验应用的HPV疫苗基本上可以归纳为DNA、蛋白质或多肽三类疫苗。
[0007] 第一类为DNA疫苗，它属于基因疗法的范畴。DNA疫苗的优势是能够在体内持续性地表达抗原。另外这种抗原的表达与自然状况下的抗原表达近似，因此能够有效持久地诱导体内的免疫系统产生保护性的免疫反应。然而，由于基因疗法在临床实验中出现的安全问题以及其在体内的作用机制复杂，FDA对于基因疗法的临床实验实行更谨慎的态度，使得基因疗法在美国乃至西方国家进展缓慢，这同样影响到HPV DNA疫苗的发展。
[0008] 第二类为蛋白质疫苗或成分疫苗，用于疫苗的蛋白质可用基因工程法获得，或从生物体液内分离提纯获得。蛋白质疫苗的优点是包含全部或大部分抗原，这符合疫苗的设计原则。但生产蛋白质疫苗有蛋白质来源的困难。从生物体液内分离提纯蛋白质一般认为不安全，已不提倡，因为它可能造成隐性传染源的传播。基因工程法生产重组蛋白质是目前生产蛋白质疫苗的主要手段，但现今水平的基因工程法不能高效生产分子量较大的蛋白质。
[0009] 默克公司(Merck)和葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline，GSK)公司用HPV衣壳蛋白L1组装成病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLPs)作为疫苗。VLPs在形态上与HPV病毒颗粒相似，但不含HPV DNA，故属于成分疫苗。默克公司和葛兰素史克公司研制的HPV疫苗分别于2006年和2007年完成临床实验，获FDA批准，进入临床应用，疫苗的商品名分别为Gardasil(加德西)和Cervarix。加德西为四价疫苗，包含HPV16、18、11、6的VLPs。Cervarix为双价疫苗，包含HPV16和HPV18的VLPs。在最早的加德西临床实验中，接种HPV VLPs疫苗的HPV患者体内抗HPV抗体滴度比未接种疫苗的HPV患者高40倍(Harold Connett，Nature Medicine，7：388，2001)，疫苗的保护作用已经持续了5年半。疫苗的作用能够维持多少年，还在继续跟踪。该疫苗诱导机体产生抗HPV抗体，可中和细胞外HPV病毒，适合于保护健康人群免受HPV感染，属于预防性疫苗。根据公认的病毒学和免疫学对病毒致病机理的理解，病毒进入细胞内寄生并致病。抗体主要作用于细胞外病毒，对细胞内病毒几乎无能为力。细胞内病毒主要靠细胞免疫清除，因此，加德西和Cervarix对HPV已感染人群无效。目前，已有80多个国家和地区批准使用和加德西和Cervarix，其中包括中香港、中国台湾和中国澳门。中国国家药品食品管理局(SFDA)还没有批准加德西和Cervarix进入中国市场。
[0010] 第三类为多肽疫苗，多肽可化学合成或用生化法从细胞膜提取或利用基因工程方法既原核或真核表达系统表达获得。多肽疫苗的最大特点是安全，合成容易。由于分子量小，同样剂量HPV疫苗可以包含更多有效抗原决定簇的多肽。已有足够的临床前和临床实验表明HPV多肽疫苗安全有效。如前所述美国南加州大学HPV16E7多肽疫苗一期临床实验结果显示安全有效，但是南加州大学HPV多肽疫苗仅包含HLA-A2限制性HPV16的E7多肽。已知HLA-A2约占总人群的50％，HPV16感染也只占大约子宫颈癌的50％，所以南加州大学HPV16的E7多肽疫苗仅能覆盖25％的HPV感染群体。实际上，目前在临床实验中的所有HPV疫苗都存在同样覆盖率的问题，因为绝大多数HPV疫苗只针对一种HPV亚型和一种靶抗原，含几个抗原表位。近年已有人尝试针对二种HPV亚型的一种靶抗原，或一种HPV亚型的二种靶抗原的HPV疫苗。这些HPV疫苗作用对象各不相同，它们主要分别针对HPV16，18，11和6病毒亚型，但没有或很少有HPV疫苗针对二种或二种以上不同型别的HPV。就抗原而言，它们也各有选择。有以早期基因E6或E7产物为抗原的，也有以晚期基因L1或L2产物为抗原的。同样，没有或很少有HPV疫苗包含二种或二种以上不同的抗原。
[0011] 迄今为止，欧美总共大约有近十个HPV治疗性疫苗处于临床试验的一期或二期；我国尚无开展HPV预防性以及治疗性疫苗临床试验的报导。
发明内容
[0012] 本发明的第一个目的是提供能与HLA-A1、A2、A3、A11和A24结合的人类乳头瘤病毒免疫原性多肽。
[0013] 本发明的第二个目的是提供所述人类乳头瘤病毒免疫原性多肽的制备方法。
[0014] 本发明的第三个目的是提供所述人类乳头瘤病毒免疫原性多肽用于制备预防和治疗HPV感染和由HPV感染引起的性病和良、恶性肿瘤的药物的应用。
[0015] 本发明的再一个目的是提供一种预防和治疗HPV感染以及预防由HPV感染引起的男女性病、肛门、外阴、宫颈和阴茎良、恶性肿瘤的新型疫苗。
[0016] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0018] 所述的长多肽涉及HPV多肽的重迭(Overlaps)和组合，本发明中涉及的HPV抗原表位为8到10个氨基酸长度，有些抗原表位中的氨基酸序列有部分相同，表现为部分序列重迭现象，为了便于临床应用、合成方便及降低成本，本发明利用序列重迭现象将一个以上抗原表位编入一条长度在20到34个氨基酸之间的多肽，即所述的长多肽(long peptide)。
[0019] 所述人类乳头瘤病毒免疫原性长多肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0020] (1)从蛋白质文库调出人类乳头瘤病毒HPV16和18亚型的E6和E7蛋白质序列，用生物信息学(Bioinformatics)分析预测HLA-A1、A2、A3、A11和A24限制性抗原决定簇，建立HPV16及HPV18的E6和E7多肽文库(Peptide Library)；
[0021] (2)用抑制性竞争受体-配体亲和法从该多肽文库筛选出与HLA-A1、A2、A3、A11和A24有结合能力的多肽；
[0022] (3)通过体外免疫法进一步筛选出具有免疫原性的多肽；
[0023] (4)通过体内免疫法进一步筛选和证实了这些免疫原性多肽在体内诱导HPV16、18-E6和E7多肽特异性T细胞免疫反应的能力。
[0024] 所述体外免疫法，是在特定的细胞培养条件下用HPV多肽反复刺激正常人的淋巴细胞。能够刺激和诱导正常人淋巴细胞产生HPV多肽特异性免疫反应的多肽称为免疫原性多肽，具有作为疫苗的可能性。
[0025] 所述体内免疫法，是为了证实被体外免疫法筛选出的多肽具有免疫原性而将这些多肽用来免疫动物。本发明中，用所述被筛选出的多肽分别免疫Balb/c、C57和C3H小鼠，二周后进行一次加强免疫，第四周分离实验小鼠的脾脏淋巴细胞，用细胞增殖法评价HPV长多肽特异性T细胞增殖功能，用免疫酶联斑点技术(ELISPOT)检测小鼠的HPV长多肽特异性T细胞免疫反应，以及用51Cr释放法分析HPV长多肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能。结果表明本发明筛选出的HPV多肽能够成功地在体内诱导出HPV多肽特异性T细胞保护性免疫反应。
[0026] 如上所述的免疫原性多肽在制备预防和治疗人类乳头瘤病毒感染所引起的感染性疾病和肿瘤性疾病的疫苗中的应用。
[0027] 如上所述的应用，其中优选地，所述感染性疾病为人类乳头瘤病毒感染性性病。
[0028] 如上所述的应用，其中优选地，所述肿瘤性疾病包括人类乳头瘤病毒感染所致子宫颈、外阴、肛门、阴茎和口咽增生性病变、良性肿瘤、癌前病变及其癌。
[0029] 如上所述的免疫原性长多肽在制备检测人类乳头瘤病毒感染所引起的感染性疾病和肿瘤性疾病的试剂中的应用。
[0030] 人类乳头瘤病毒预防和治疗性疫苗，该疫苗包括如上所述的人类乳头瘤病毒免疫原性长多肽。
[0031] 如上所述的疫苗，其中所述疫苗还可以包括佐剂或其它辅助性多肽。
[0032] 所述佐剂为能增强机体免疫应答的物质。将佐剂与所述抗原长多肽注入机体后，将在局部形成抗原储存库，使抗原缓慢释放至免疫系统，使得抗原作用时间延长；还能刺激机体形成局部炎症或肉芽肿，增强抗原与免疫细胞接触的机会；还能刺激免疫细胞产生细胞因子，扩大由抗原所诱导的免疫反应。
[0033] 如上所述的疫苗，其中所述佐剂可以为无机佐剂、有机佐剂、细菌佐剂、核酸佐剂或细胞因子佐剂。
[0034] 如上所述的疫苗，其中所述无机佐剂可以是但不限于氢氧化铝、有机佐剂可以是但不限于不完全弗氏佐剂IFA(Montanide ISA-51)、细菌佐剂可以是但不限于BCG(卡介苗)，核酸佐剂可以是但不限于CpG寡聚脱氧核糖核酸，细胞因子佐剂可以是但不限于IL-2(白介素2)、IFN-α(干扰素α)、IFN-γ(干扰素γ)、GM-CSF(粒细胞集落刺激生物因子)等。
[0035] 如上所述的疫苗，其中优选地，所述辅助性多肽为MHC II限制性多肽。在体内，T杀伤细胞实施其杀伤功能时，有赖于T辅助细胞的帮助；MHC II限制性多肽可以激活T辅助细胞。因此，在HPV长多肽疫苗中加入MHC II限制性多肽会增强HPV长多肽疫苗的免疫预防和治疗作用。
[0036] 如上所述的疫苗，其可制成制剂，所述制剂包括HPV免疫原性长多肽、溶剂和佐剂。所述HPV免疫原性长多肽可制成如白色粉末状；所述溶剂可以是但不限于无菌生理盐水；所述佐剂可以是但不限于不完全弗氏佐剂(IFA)。所述的白色粉末状HPV免疫原性长多肽以20mg/支装于小玻璃瓶中储藏于4℃，临用前溶解于0.25mL无菌生理盐水，然后与0.25mL佐剂混合，用旋涡振荡器(Votex)震动成乳剂后用于皮下注射，但不限于皮下注射。
[0037] 本发明的有益效果在于：
[0038] 针对现有HPV疫苗覆盖率不足等问题，本发明设计了一种新型HPV疫苗，该疫苗能覆盖诱发子宫颈癌的主要HPV亚型16和18亚型，包含了能够诱导细胞免疫功能的主要蛋白E6和E7的抗原决定簇；能应用于多个HLA亚型的群体：HLA-A1、A2、A3、A11和A24；是目前世界上覆盖面最广的HPV多肽疫苗。本发明提供的疫苗能诱导机体产生抗HPV细胞免疫，主要适合于保护HPV感染者清除细胞内病毒，防止HPV感染相关肿瘤的发生，属于治疗性疫苗，同时兼有预防HPV感染的作用。
[0039] 本发明选择多肽作为HPV疫苗的载体，因为作为疫苗的多肽来源容易、应用安全，且便于生产和保证质量。在体内，蛋白性抗原降解为多肽后，结合于细胞表面的HLA分子，然后由HLA递呈给相应的T淋巴细胞，诱导细胞免疫反应。多肽只有结合于HLA以后才能发挥免疫诱导作用，这种多肽与HLA的结合具有专一性。例如HLA-A2限制性多肽，只能结合于A2而不能结合于其它的HLA亚型。HLA-A2是HLA的最主要亚型，约占总群体的50％。目前已进入临床实验的HPV多肽性疫苗基本上都是针对HLA-A2群体，但是还有50％的非A2HPV患者得不到保护。本发明公开的疫苗不仅针对HLA-A2群体，还针对HLA-A1、A3、A11和A24，从而提高了疫苗的人群覆盖率。
[0040] 本发明提供的多肽疫苗涉及HPV多肽的重迭(Overlapes)和组合。本发明中涉及的抗原表位为8到10个氨基酸长度。有些抗原表位中的氨基酸序列部分或大部分相同，但在它们的氨基端或羧基端有一个或一个以上的氨基酸不同，表现为部分序列重迭现象。为了便于临床应用、合成方便及降低成本，本发明利用序列重迭现象将一个以上抗原表位编入一条长多肽，其长度在20到34个氨基酸之间。本发明的长多肽还包含了MHC II限制性Th抗原表位以加强疫苗的免疫效用。
[0042] 图1为HPV16和18免疫原性长多肽能够诱导正常人外周血T细胞HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ分泌。
[0043] 图2为HPV16和18免疫原性长多肽在小鼠(C3H和Balb/c)体内诱导HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ阳性T细胞增殖。
[0044] 图3为HPV16和18免疫原性长多肽在Balb/c小鼠体内诱导HPV特异性T细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ阳性T细胞产生。
[0045] 图4为HPV16和18的E6和E7免疫原性长多肽能够在体内诱导产生HPV多肽特异性T杀伤细胞。
具体实施方式
[0046] 本发明中的使用的多肽序列为20-34个氨基酸长多肽，每一个长多肽均包括多个抗原表位：
[0047] SEQ ID No.1：包含HPV16-E6的44-68位点；
[0048] SEQ ID No.2：包含HPV16-E6的79-101位点；
[0049] SEQ ID No.3：包含HPV16-E7的6-27位点；
[0050] SEQ ID No.4：包含HPV16-E7的42-76位点；
[0051] SEQ ID No.5：包含HPV16-E7的66-98位点；
[0052] SEQ ID No.6：包含HPV18-E6的12-41位点；
[0053] SEQ ID No.7：包含HPV18-E6的84-110位点；
[0054] SEQ ID No.8：包含HPV18-E7的6-26位点；
[0055] SEQ ID No.9：包含HPV18-E7的43-72位点；
[0056] SEQ ID No.10：包含HPV18-E7的75-102位点。
[0057] 实施例1预测抗原决定簇
[0058] 从NIH数据库(www.ncbi.nlm.nih.org)调出HPV 16和18的E6和E7蛋白质序列，用Rammensee软件(Rammensee，Friede，Stevanovic，MHC ligands and peptide motifs：st
1 listing，Immunogenestics，41，178-228，1995)分析预测可能作为疫苗抗原决定簇的寡多肽序列，建立HPV16和18的E6和E7多肽文库(Peptide Library)。该软件从化学结构，如氨基酸组成、序列、固定氨基酸(Anchor amino acid)的位置来预测寡多肽与MHC的结合能力，给序列内的每一个氨基酸打分。最理想的固定氨基酸给15分，具有最低结合能力的氨基酸给1分，不具有结合能力的氨基酸给负分。该软件会自动为每一寡多肽序列给出总分。用此法发明人建立了拥有2435个9个氨基酸长的多肽序列。在每一HPV亚型和HLA亚型的多肽序列中取积分处于前十位的多肽用于筛选实验。HLA-A2多肽取积分处于前二十位的多肽用于筛选实验。用于本发明筛选实验的多肽共240个，由哈佛医学院合成。
1 listing，Immunogenestics，41，178-228，1995)分析预测可能作为疫苗抗原决定簇的寡多肽序列，建立HPV16和18的E6和E7多肽文库(Peptide Library)。该软件从化学结构，如氨基酸组成、序列、固定氨基酸(Anchor amino acid)的位置来预测寡多肽与MHC的结合能力，给序列内的每一个氨基酸打分。最理想的固定氨基酸给15分，具有最低结合能力的氨基酸给1分，不具有结合能力的氨基酸给负分。该软件会自动为每一寡多肽序列给出总分。用此法发明人建立了拥有2435个9个氨基酸长的多肽序列。在每一HPV亚型和HLA亚型的多肽序列中取积分处于前十位的多肽用于筛选实验。HLA-A2多肽取积分处于前二十位的多肽用于筛选实验。用于本发明筛选实验的多肽共240个，由哈佛医学院合成。
[0059] 表1本发明中用生物信息学所建立的HPV多肽文库有关数据
[0060]
[0061] 实施例2应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力[0062] 实施例1得到的240条待测多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和125
法判断。将浓度固定为50μM(所述μM表示μmol/L，下同)的标记 I的MHC限制性多肽以及不同浓度(1-50μM)的MHC限制性待测多肽(哈佛医学院合成)加入反应体系(磷酸盐缓冲液和MHC，例如HLA-A2)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和
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I标记多肽复合物。待测多肽与 I标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司出品，厂址：Beverly，MA，USA)分离游离多肽和多肽MHC复合物，
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然后测定多肽MHC复合物的 I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50％标记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。待测多肽IC50值≤10μM定为结合能力阳性多肽。用上述同样方法测定HLA-A1、A2、A3、A11和A24限制性多肽与MHC结合能力。从240多种HPV多肽中筛选出98种与MHC具有有效结合能力的多肽。
法判断。将浓度固定为50μM(所述μM表示μmol/L，下同)的标记 I的MHC限制性多肽以及不同浓度(1-50μM)的MHC限制性待测多肽(哈佛医学院合成)加入反应体系(磷酸盐缓冲液和MHC，例如HLA-A2)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和
125 125
I标记多肽复合物。待测多肽与 I标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司出品，厂址：Beverly，MA，USA)分离游离多肽和多肽MHC复合物，
125
然后测定多肽MHC复合物的 I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50％标记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。待测多肽IC50值≤10μM定为结合能力阳性多肽。用上述同样方法测定HLA-A1、A2、A3、A11和A24限制性多肽与MHC结合能力。从240多种HPV多肽中筛选出98种与MHC具有有效结合能力的多肽。
[0063] 表2HPV 16的E6和E7多肽与MHC结合实验结果
[0064]
[0065] 表3HPV 18的E6和E7多肽与MHC结合实验结果
[0066]
[0067] 实施例3体外免疫实验
[0068] 用体外免疫实验进一步筛选经MHC结合实验筛选出的98个HPV多肽。本发明中的体外免疫实验分三步：第一步是分离HLA特异性的外周血单个核细胞(PBMC)，第二步是用HPV多肽与PBMC共培养，第三步是测定培养上清中的IFNγ细胞因子。
[0069] 用FICOLL密度梯度离心法(Boyum A：Scand J Clin Lab Invest 21(Suppl97)：77，1968)分离正常人(HLA-A1、A2、A3、A11和A24)外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640完全培养液(10％(体积百分比，下同)人AB血清RPMI1640培养液，5mL青霉素/链霉素，
6
5mL L-谷氨酸，0.5mL 2-巯基乙醇(mercaptoethanol))调整PBMC于2×10/mL。在48-孔板上每孔种加1mL含PBMC培养液，加HPV多肽刺激，多肽浓度为10μg/mL。对照组仅加培养液不加HPV多肽。细胞在37℃、5％(体积百分比，下同)CO2条件下培养21天，7天为一周期。在第一刺激周期，多肽直接加入PBMC中刺激培养。在第二和第三刺激周期，用装有多肽(peptide-pulsed)的抗原提呈细胞刺激培养。具体做法如下：在第7和14天，在新的
6
48孔板上的每孔里加1mL浓度为2x10/mL的自体PBMC，在室温孵育1小时。用PBS洗去非粘附细胞，加10μg/mL多肽于PBS室温孵育2小时。从前一刺激周期的培养板收集已被刺激的细胞。细胞在洗涤后用1mL培养液重悬每孔细胞，并将细胞种植于安装有多肽的抗原提呈细胞的新培养板。在每一个刺激周期的第2天加入10单位IL-2(R&D Systems公司出品，厂址：Minneapolis，MN 55413，USA)于培养液。在第21天终止细胞培养。
6
5mL L-谷氨酸，0.5mL 2-巯基乙醇(mercaptoethanol))调整PBMC于2×10/mL。在48-孔板上每孔种加1mL含PBMC培养液，加HPV多肽刺激，多肽浓度为10μg/mL。对照组仅加培养液不加HPV多肽。细胞在37℃、5％(体积百分比，下同)CO2条件下培养21天，7天为一周期。在第一刺激周期，多肽直接加入PBMC中刺激培养。在第二和第三刺激周期，用装有多肽(peptide-pulsed)的抗原提呈细胞刺激培养。具体做法如下：在第7和14天，在新的
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48孔板上的每孔里加1mL浓度为2x10/mL的自体PBMC，在室温孵育1小时。用PBS洗去非粘附细胞，加10μg/mL多肽于PBS室温孵育2小时。从前一刺激周期的培养板收集已被刺激的细胞。细胞在洗涤后用1mL培养液重悬每孔细胞，并将细胞种植于安装有多肽的抗原提呈细胞的新培养板。在每一个刺激周期的第2天加入10单位IL-2(R&D Systems公司出品，厂址：Minneapolis，MN 55413，USA)于培养液。在第21天终止细胞培养。
[0070] 实施例4 ELISA
[0071] 我们运用ELISA检测HPV多肽特异性IFN-γ细胞因子。该ELISA实验过程分两个阶段：刺激阶段和ELISA阶段。
[0072] 一、刺激阶段
[0073] 收集经过上述三个周期HPV多肽刺激的细胞，洗涤后用新鲜培养液将细胞调整到6
1×10细胞/mL作为ELISA刺激期的效应细胞。安置相关HPV多肽于抗原提呈细胞(自体粘附性PBMC)。对照组为不安置任何多肽和安置无关多肽的抗原提呈细胞。将经上述处理过的抗原提呈细胞与效应细胞置于96孔板，在37℃，5％CO2条件下共同孵育2-4小时。收集上清用ELISA测定IFN-γ的释放以判断经过HPV多肽反复刺激的效应细胞是否能够产生HPV多肽特异性免疫反应，进而判断被测试的多肽有没有免疫原性。
1×10细胞/mL作为ELISA刺激期的效应细胞。安置相关HPV多肽于抗原提呈细胞(自体粘附性PBMC)。对照组为不安置任何多肽和安置无关多肽的抗原提呈细胞。将经上述处理过的抗原提呈细胞与效应细胞置于96孔板，在37℃，5％CO2条件下共同孵育2-4小时。收集上清用ELISA测定IFN-γ的释放以判断经过HPV多肽反复刺激的效应细胞是否能够产生HPV多肽特异性免疫反应，进而判断被测试的多肽有没有免疫原性。
[0074] 二、ELISA阶段
[0075] 用结合溶液稀释捕获抗体(鼠抗人IFN-γ，PharMingen公司出品)至2μg/mL，加50μL稀释过的抗体于ELISA板的每孔内，于4℃包被过夜。用0.1MPBS/0.02％吐温-20(即向0.1mol/L浓度的PBS中加入0.02％的吐温-20，下文中简写为PBS/吐温)洗板以除去未结合的捕获抗体。每孔加200μL封闭液，盖板并于室温放置2小时。用PBS/吐温洗一次。每三孔加50μL同样的标准IFN-γ，样本(上述的培养上清)和空白对照，室温下反应
2-4小时。用PBS/吐温洗三次以除去未结合的IFN-γ。用稀释液稀释生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体(PharMingen)至1μg/mL。每孔加50μL稀释后抗体，盖板后于室温反应1小时。用PBS/吐温洗三次以除去未结合的生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体。用稀释液稀释Streptavidin-HRP至1∶4000。每孔加50μL稀释的Streptavidin-HRP(抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶)。盖板后于室温反应半小时。用PBS/吐温洗5次以除去未结合的Streptavidin-HRP。每孔加50μL ABTS/3％H2O2于室温反应半小时。
2-4小时。用PBS/吐温洗三次以除去未结合的IFN-γ。用稀释液稀释生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体(PharMingen)至1μg/mL。每孔加50μL稀释后抗体，盖板后于室温反应1小时。用PBS/吐温洗三次以除去未结合的生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体。用稀释液稀释Streptavidin-HRP至1∶4000。每孔加50μL稀释的Streptavidin-HRP(抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶)。盖板后于室温反应半小时。用PBS/吐温洗5次以除去未结合的Streptavidin-HRP。每孔加50μL ABTS/3％H2O2于室温反应半小时。
[0076] 用ELISA阅读机在405nm读每孔的OD值。根据标准曲线算出IFN-γ的浓度(pg/mL)。阳性结果的判断：设多肽实验组IFN-γ的浓度均值为阴性对照组IFN-γ的浓度均值的倍数为刺激指数，刺激指数≥2.0为阳性结果。图1为HPV16和18免疫原性长多肽能够诱导正常人外周血T细胞HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ分泌。
[0077] 至此，本发明筛选出41种有免疫原性的HPV多肽，能够在体外诱导HPV多肽特异性T细胞免疫反应，具有作为疫苗的可能性。
[0078] 表4HPV 16和18的E6和E7多肽体外免疫实验结果
[0079]
[0080] 实施例5小鼠体内免疫实验
[0081] 用小鼠体内免疫实验证实经生物信息预测法、结合实验和体外免疫实验筛选出的41个多肽的免疫原性。根据多肽氨基酸序列的重迭性将41个具有9个氨基酸长的多肽组合成十个具有20至34个左右氨基酸长度不等的长多肽，分别命名为HPV长多肽1、2、
3......10，即其序列如序列表SEQ ID No.1-No.10所示的多肽。用这十个长多肽分别免疫Balb/C，C57和C3H小鼠。在8-10周龄雌性小鼠的后足垫分别注射50μg HPV长多肽和佐剂(IFB)混合乳剂，每组注射三只小鼠。对照组注射50μL PBS；二周后进行一次加强免疫，第四周后杀死小鼠取其脾脏分离其T淋巴细胞用于免疫测定。
3......10，即其序列如序列表SEQ ID No.1-No.10所示的多肽。用这十个长多肽分别免疫Balb/C，C57和C3H小鼠。在8-10周龄雌性小鼠的后足垫分别注射50μg HPV长多肽和佐剂(IFB)混合乳剂，每组注射三只小鼠。对照组注射50μL PBS；二周后进行一次加强免疫，第四周后杀死小鼠取其脾脏分离其T淋巴细胞用于免疫测定。
[0082] (1)用细胞增殖法评价HPV长多肽特异性T细胞增殖功能。
[0083] (2)用免疫酶联斑点技术(ELISPOT)检测小鼠体内有没有和有多少HPV长多肽特异性T细胞产生(HPV多肽特异性T细胞频率)。
[0084] (3)用51Cr释放法分析HPV长多肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能(CTL)。
[0085] 实施例6 细胞增殖测定
[0086] 分离经HPV长多肽免疫的Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞，制备单细胞悬液；用5
RPMI-1640完全培养液洗涤细胞，稀释细胞浓度至2x10/mL。96孔板每孔加入经上述处理
2+ 2+
的100μL淋巴细胞，设刺激组和阴性对照组。待细胞贴壁后弃去原液并以去Ca 、Mg 离子的PBS轻轻洗3遍后，刺激组每孔加5μg/mL HPV长多肽，对照组不加HPV长多肽，但加无关多肽。在37℃，5％CO2下孵育72小时。刺激期后，每孔加入10μL MTT(ATCC公司出品，产品型号cat#30-1010K)，37℃继续培养4小时，小心弃去原液，控干，每孔加入100μL DMSO溶解结晶物，37℃振荡器振荡10min，于570nm测定吸光度(OD)值。每浓度设6个复孔，每组取3次实验的平均值，根据刺激组和对照组的OD570值计算增殖指数：SI＝(刺激组OD570值-对照组OD570值)/对照组OD570值x100以评价HPV长多肽特异性T细胞增殖能力。图2为HPV16和18免疫原性长多肽在小鼠(C3H和Balb/c)体内诱导HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ阳性T细胞增殖。
RPMI-1640完全培养液洗涤细胞，稀释细胞浓度至2x10/mL。96孔板每孔加入经上述处理
2+ 2+
的100μL淋巴细胞，设刺激组和阴性对照组。待细胞贴壁后弃去原液并以去Ca 、Mg 离子的PBS轻轻洗3遍后，刺激组每孔加5μg/mL HPV长多肽，对照组不加HPV长多肽，但加无关多肽。在37℃，5％CO2下孵育72小时。刺激期后，每孔加入10μL MTT(ATCC公司出品，产品型号cat#30-1010K)，37℃继续培养4小时，小心弃去原液，控干，每孔加入100μL DMSO溶解结晶物，37℃振荡器振荡10min，于570nm测定吸光度(OD)值。每浓度设6个复孔，每组取3次实验的平均值，根据刺激组和对照组的OD570值计算增殖指数：SI＝(刺激组OD570值-对照组OD570值)/对照组OD570值x100以评价HPV长多肽特异性T细胞增殖能力。图2为HPV16和18免疫原性长多肽在小鼠(C3H和Balb/c)体内诱导HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV多肽特异性IFNγ阳性T细胞增殖。
[0087] 实施例7 ELISPOT
[0088] 每孔加150μL 封闭液(RPMI1640完全培养液)，37℃孵育2小时以阻断非特异性结合位点反应；安置相关HPV长多肽于抗原提呈细胞(同源脾细胞)，37℃孵育1小时；用每组内所含长多肽分别制备相应的抗原提呈细胞；用无关多肽和未经多肽处理的同源脾细胞作为阴性对照；用3000拉德放射剂量照射该同源脾细胞；重悬经上述处理的6
同源脾细胞于2×10/mL的细胞；收集效应细胞(T淋巴细胞)于T-细胞培养液，调整细
6
胞浓度为2×10/mL；根据每组内所含多肽数将效应细胞相应分成若干份；弃封闭液并加
100μL T淋巴细胞和100μL抗原提呈细胞于ELISPOT板；用0.5μg/mL ConA(Sigma公司)作阳性对照；在37℃，5％CO2、室温条件下反应24小时；从孵箱中取出ELISPOT板并弃细胞；用PBS/0.05％吐温-20洗板6次；每孔加100μL浓度为3ug/mL生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体(PharMingen公司)，37℃反应2小时；在用二抗反应结束前30分钟准备Avidin-Peroxidase-复合物(APC/Vector)，即加1滴溶液A和1滴溶液B于10mL PBS/0.1％吐温-20。混合均匀，置室温至少30分钟；二抗反应后，用PBS/0.05％吐温-20洗板6次；每孔加100μL APC并于室温反应1小时；弃APC并用PBS/0.05％吐温-20洗板
3次，接着用PBS洗3次；每孔加100μL底物(AEC)并在室温反应4分钟。用蒸溜水终止反应；除去ELISPOT板的底板；用吸水纸将培养孔吸干，并在黑暗中空气干燥过夜。
同源脾细胞于2×10/mL的细胞；收集效应细胞(T淋巴细胞)于T-细胞培养液，调整细
6
胞浓度为2×10/mL；根据每组内所含多肽数将效应细胞相应分成若干份；弃封闭液并加
100μL T淋巴细胞和100μL抗原提呈细胞于ELISPOT板；用0.5μg/mL ConA(Sigma公司)作阳性对照；在37℃，5％CO2、室温条件下反应24小时；从孵箱中取出ELISPOT板并弃细胞；用PBS/0.05％吐温-20洗板6次；每孔加100μL浓度为3ug/mL生物素标记的鼠抗人IFN-γ抗体(PharMingen公司)，37℃反应2小时；在用二抗反应结束前30分钟准备Avidin-Peroxidase-复合物(APC/Vector)，即加1滴溶液A和1滴溶液B于10mL PBS/0.1％吐温-20。混合均匀，置室温至少30分钟；二抗反应后，用PBS/0.05％吐温-20洗板6次；每孔加100μL APC并于室温反应1小时；弃APC并用PBS/0.05％吐温-20洗板
3次，接着用PBS洗3次；每孔加100μL底物(AEC)并在室温反应4分钟。用蒸溜水终止反应；除去ELISPOT板的底板；用吸水纸将培养孔吸干，并在黑暗中空气干燥过夜。
[0089] 在解剖显微镜下记数斑点数，一个斑点代表一个HPV多肽特异性IFN-γ阳性T细6
胞；将斑点数转换为每百万T细胞中的斑点数(SPC/1×10)。如果处理组的每百万脾细胞中的斑点数是阴性对照组斑点数的两倍，则结果为阳性。其结果表明在经体外免疫法筛选的HPV长多肽中，有33个(80.5％)多肽在小鼠体内能够诱导HPV多肽特异性T细胞的产生。
胞；将斑点数转换为每百万T细胞中的斑点数(SPC/1×10)。如果处理组的每百万脾细胞中的斑点数是阴性对照组斑点数的两倍，则结果为阳性。其结果表明在经体外免疫法筛选的HPV长多肽中，有33个(80.5％)多肽在小鼠体内能够诱导HPV多肽特异性T细胞的产生。
[0090] 图3显示上述一系列小鼠体内免疫实验中的一个实验：三只一组的HPV长多肽免疫和非免疫(仅注射PBS)小鼠断颈处死；取出它们的脾脏分离T淋巴细胞；用IFN-γELISPOT检测HPV多肽特异性IFN-γ阳性T细胞的产生。T淋巴细胞在ELISPOT的短期培养中，在只有培养液没有多肽情况下产生的值为基础水平(Baseline)值，作为阴性对照，高于阴性对照值两倍为阳性反应。HPV长多肽免疫组的T淋巴细胞当再次遇到HPV多肽时产生显著的HPV抗原特异性的免疫回忆反应(Recall response)，表现为IFN-γ的产生。HPV长多肽免疫组的T淋巴细胞对在无关多肽刺激下不产生HPV抗原特异性的免疫回忆反应。非免疫组的T淋巴细胞对HPV多肽同样表现为阴性免疫反应。图3说明按照本发明的实施方案所发明的HPV16和18的E6和E7免疫原性长多肽能够在体内诱导HPV特异性细胞免疫反应，表现为HPV长多肽特异性IFN-γ阳性T细胞的产生。
[0091] 实施例8 小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞分析(CTL)
[0092] 一、准备效应细胞
[0093] 分离HPV长多肽免疫过的Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞，制备单个细胞悬液，合并组内三个脾脏的淋巴细胞；用RPMI-1640完全培养液洗涤效应细胞，稀释细胞浓度至5
5x10/mL；用同样方法准备对照组细胞(未免疫小鼠脾脏淋巴细胞)。
5x10/mL；用同样方法准备对照组细胞(未免疫小鼠脾脏淋巴细胞)。
[0094] 二、准备靶细胞
[0095] 收获P815细胞(ATCC公司)，用RPMI-1640完全培养液洗涤P815细胞，稀释细胞浓5
度至5x10/mL后将细胞加入96孔板，每孔3mL；加HPV多肽于P815细胞至终浓度为50μg/mL，不加任何多肽和无关多肽的P815细胞为对照组；37℃，5％CO2孵育过夜后收获P815细
7
胞，用RPMI-1640完全培养液洗涤P815细胞，在室温下以约200g离心1×10细胞5min，吸
51
去上清，仅在管内留下约0.1mL培养液，混匀细胞，加0.2～1mCi/mL Cr和20μL小牛血清(FCS)到上述细胞中；于37℃，5％CO2条件下放置60分钟；用RPMI-1640完全培养液洗
51 4
涤细胞两次除去未标记的 Cr，调节细胞浓度为2×10/mL备用。
度至5x10/mL后将细胞加入96孔板，每孔3mL；加HPV多肽于P815细胞至终浓度为50μg/mL，不加任何多肽和无关多肽的P815细胞为对照组；37℃，5％CO2孵育过夜后收获P815细
7
胞，用RPMI-1640完全培养液洗涤P815细胞，在室温下以约200g离心1×10细胞5min，吸
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去上清，仅在管内留下约0.1mL培养液，混匀细胞，加0.2～1mCi/mL Cr和20μL小牛血清(FCS)到上述细胞中；于37℃，5％CO2条件下放置60分钟；用RPMI-1640完全培养液洗
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涤细胞两次除去未标记的 Cr，调节细胞浓度为2×10/mL备用。
[0096] 三、CTL反应测定
[0097] 分别加100μL效应细胞和靶细胞于圆底96孔板，效应细胞/靶细胞比例分别为25∶1，12.5∶1，6.25∶1，3.125∶1，1.56∶1，每份样本重复3孔；对照设3孔100μL靶细胞中加入100μL 1％Triton X-100(最大同位素释放量)以及设3孔100μL靶细胞中加入100μL培养液(自发同位素释放量)，在37℃，5％CO2下培养5小时，离心并收集每孔40μL上清液于γ记数仪测定样本中靶细胞特异性溶解引起的同位素释放量；靶细胞特异性溶解百分率公式：特异性溶解％＝(样本同位素释放量-自发同位素释放量/最大同位素释放量-自发同位素释放量)×100。
[0098] 示于图4的结果证实了对带有HPV长多肽抗原的靶细胞(实验组P815)的有效杀伤，而对不带有HPV长多肽抗原的靶细胞(对照组P815)的杀伤力很低。证实了本发明的HPV长多肽能够在体内诱导产生HPV多肽特异性T杀伤细胞(CTL)，这些HPV长多肽特异性T杀伤细胞能够识别带有HPV抗原的靶细胞，并予以杀伤清除。由于CTL反应在清除HPV感染细胞和肿瘤细胞中起关键作用，因此本发明的HPV免疫原性长多肽可开发用作为预防和治疗性疫苗，预防和治疗HPV感染以及由HPV感染引起的性病和良、恶性肿瘤。
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