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EE3蛋白家族及相应的DNA序列

阅读：185发布：2020-05-23

专利汇可以提供EE3蛋白家族及相应的DNA序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及(i)DNA序列，(ii)含所述DNA序列的表达载体，(iv)含所述表达载体的宿主细胞，(v)由所述序列编码的基因产物，(vi)用改变相关所述序列的转基因动物，(vii)抗所述基因产物的 抗体 ，(viii)表达和分离所述基因产物的方法，(iv)所述DNA序列或基因产物作为药物的用途，(x)药用组合物及其制备方法及和应用，和(xi)所述DNA序列或基因产物的非 治疗 用途 。，下面是EE3蛋白家族及相应的DNA序列专利的具体信息内容。

1.DNA序列，其特征在于它包含编码多肽的序列区，所述多 肽含有如附图13、14、15A、15B、15C、16或18所示的多肽的至少 20个氨基酸长度的部分序列，包括所有的功能同源衍生物、片段、等 位基因或与其杂交的DNA序列，所述附图也是本权利要求的一部分。
2.如权利要求1所述的DNA序列，其特征在于它含有编码如 附图13、14、15A、15B、15C、16和18所示多肽的序列区，包括所 有的功能同源衍生物、片段、等位基因或与其杂交的DNA序列。
3.如权利要求1或2所述的DNA序列，其特征在于它编码如 附图13、14、15A、15B、15C、16和18所示的多肽，包括所有的功 能同源衍生物、片段、等位基因或与其杂交的DNA序列。
4.如前面任意一项权利要求所述的DNA序列，其特征在于它 包含如附图9A，10，11A，11B，11C，12或17所示(c)DNA序列的 至少60个核苷长度的部分序列，特别是包含附图9A，10，11A，11B， 11C，12或17中所示的翻译区(以大写字母表示)。
5.表达载体，其特征在于它含有权利要求1至4任意一项所述 的DNA序列。
6.宿主细胞，其特征在于它是用权利要求5所述表达载体转化 的。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于它是哺乳动物细 胞，特别是人类细胞。
8.一种纯化的基因产物，其特征在于所述基因产物由权利要求 1至4任意一项的DNA序列所编码。
9.如权利要求8所述的纯化基因产物，其特征在于该产物是多 肽。
10.权利要求8或9所述的纯化基因产物，其特征在于它包含如 附图13、14、15A、15B、15C、16或18所示的氨基酸序列，以及所 述产物的功能同源的等位基因、片段或衍生物。
11.一种转基因动物，其特征在于与正常动物相比，该转基因动 物被遗传修饰，所述遗传修饰包括权利要求9或10所述的至少一条 氨基酸序列数量的(特异性)改变，特别是附图13、14、15A、15B、 15C、16和18所示的氨基酸序列的改变或权利要求9或10所述的氨 基酸序列相对于天然ee3氨基酸序列(优选附图13、14、15A、15B、 15C、16或18所示的序列)在序列顺序上的特异性改变，所述遗传 修饰还包括缺失或改变至少一条天然ee3氨基酸序列特别是权利要求 9所述的序列或如附图13、14、15A、15B、15C、16和18所示的序 列或其部分。
12.一种抗体，其特征在于它识别权利要求8-10任意一项所述 基因产物的表位。
13.权利要求12所述的抗体，其特征在于它是单克隆抗体。
14.权利要求12或13所述的抗体，其特征在于它以胞外区的序 列片段作为识别的表位。
15.一种表达权利要求8-10任意一项所述基因产物的方法，其 特征在于用权利要求5所述的表达载体转化宿主细胞。
16.一种分离权利要求8-10任意一项所述基因产物的方法，其 特征在于在合适的、有利于表达的条件下培养权利要求6或7所述的 宿主细胞，然后从培养基中纯化基因表达产物。
17.权利要求1-4任意一项所述DNA序列或权利要求8-10任意 一项所述基因产物作为药物的用途。
18.权利要求1-4任意一项所述DNA序列或权利要求8-10任意 一项所述基因产物用于治疗肿瘤，急慢性缺氧，心血管疾病，(神经) 变性疾病，免疫系统疾病，特别是自身免疫性疾病，神经系统疾病， 特别是中风，多发性硬化症，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，遗传 退化性共济失调，亨廷顿氏病，神经病和癫痫症的用途(和/或制备治 疗这些疾病的药物的用途)。
19.一种化合物，其特征在于它调节，特别是抑制ee3蛋白的胞 内和/或胞内功能，例如针对ee3蛋白细胞质结构的胞内抗体。
20.权利要求19所述的化合物，其特征在于它是一种有机化合 物，分子量优选＜3000。
21.权利要求19或20所述的化合物，其特征在于它能够以扩散 的方式或通过膜转运蛋白穿过细胞膜。
22.一种鉴别权利要求19-21任意一项所述药物活性化合物的方 法，其特征在于(a)用权利要求5所述的表达载体，特别是编码如附图 13、14、15A、15B、15C、16或18所示的蛋白的表达载体，和任选 一种编码至少一种报告基因的表达载体转化合适的宿主细胞，和(b)加 入待鉴别化合物后，采用适宜的分析系统以不加待鉴别化合物为对照 对由(a)得到的宿主细胞的一些参数进行测定，所述参数反映了权 利要求8-10任一项所述本发明的基因产物所介导的功能，特别是凋 亡，细胞生长，细胞增殖和/或细胞塑性的功能。
23.权利要求22所述的方法，其特征在于该方法还包括另一步 骤(c)以适当的生物化学或结构-生物学方法确定药物活性化合物与 本发明所述蛋白的结合位点。
24.权利要求22或23所述的方法，其特征在于在(b)步骤中 测定细胞内Ca释放量。
25.权利要求19-22所述的化合物用于治疗会发生或伴有急慢性 缺氧现象的疾病的用途(或制备治疗这些疾病的药物的用途)，例如 心肌梗塞，心力衰竭，原发性心肌症，心肌炎，心包炎，心包心肌炎， 冠心病，左右分流先天性心脏病，法乐四联症/五联症，Eisenmenger 综合征，中风，末端灌注不足，动脉闭合症(AVK)，外周动脉闭合 症(PAVK)，颈动脉狭窄，肾动脉狭窄，脑中微循环紊乱(小血管症)， 大脑内出血，大脑静脉和窦血栓症，血管畸形，蛛网膜下出血，宾斯 旺格痴呆，皮层下动脉硬化性脑病，栓塞引起的多重皮层梗死，脉管 炎，糖尿病性视网膜病，不同原因引起的贫血症连续症状(例如，再 生障碍性贫血，脊髓发育不良综合症，红血球增多症，巨红细胞贫血 症，缺铁性贫血症，肾贫血症，球形红细胞溶血性贫血症，地中海贫 血症，血红蛋白病，6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症，输血感染，恒河猴 不相容疾病，疟疾，心(脏)瓣膜移植，出血性贫血，脾机能亢进症)， 肺纤维化，肺气肿，肺水肿：ARDS，IRDS，复发性肺栓塞，肿瘤(例 如，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌)，免疫系统疾病(例如，自身 免疫病，特别是糖尿病，银屑病，免疫缺陷病，多发性硬化症，风湿 性关节炎或遗传性过敏症，哮喘)，病毒感染性疾病(例如，HIV，丙 型或乙型肝炎感染，细菌感染(例如，链球菌或葡萄球菌感染)，变 性疾病，特别是神经变性疾病，例如肌肉萎缩症，GvHD(例如，肝， 肾或心)，或其他神经系统疾病(特别是，但不限于下述疾病：中风， 多发性硬化症，帕金森氏症，蛛网膜下出血，肌萎缩性侧索硬化，遗 传退化性共济失调，亨廷顿氏病，神经病，癫痫症，脑组织损伤，阿 尔茨海默病)；肌松症(例如，肌肉麻痹)，内分泌疾病(例如，骨质 疏松症或甲状腺功能亢进)，皮肤病(例如，银屑病，神经性皮炎)； 控制锐痛或钝痛，遗传性疾病以及心理疾病(例如，精神分裂症或抑 郁症)，愈合伤口，改善性功能，心血管疾病(例如，局部缺血性梗 塞，心机能不全，心律失常，高血压)，提高大脑功能，神经变性性 疾病，特别是阿尔茨海默痴呆病和帕金森氏病，肌肉萎缩症，病毒感 染疾病，肿瘤，自身免疫病或大脑局部缺血。
26.一种鉴别ee3蛋白质或其天然等位基因、片段、衍生物的细 胞相互作用物质的方法，其特征在于使用“酵母双-杂交系统”。
27.权利要求1-4任意一项所述DNA序列或权利要求8-10任意 一项所述基因产物用于鉴别参与ee3蛋白质介导的信号传导过程的其 他蛋白质的应用。

说明书全文

本发明涉及(i)DNA序列，(ii)含本发明DNA序列的表达载体，(iv) 含本发明表达载体的宿主细胞，(v)本发明DNA序列编码的基因产物， (vi)关于本发明DNA序列的转基因动物，(vii)抗本发明基因产物的抗 体，(viii)表达和/或分离本发明基因产物的方法，(ix)本发明DNA序 列和/或基因产物作为药物的用途，(x)药用活性化合物以及制备和使 用这类本发明化合物的方法和(xi)本发明DNA序列和/或基因产物的 非治疗用途。

目前已知许多蛋白属于G-蛋白偶联受体(GPCRs)。它们构成涉 及信号传导的膜结合分子的超家族。它们由众多的配体和其他的刺激 激活，比如光(视紫质)、气味(气味受体)、钙、氨基酸或生物胺、 核苷酸、肽、脂肪酸和脂肪酸衍生物和各种多肽。估计在哺乳动物中 GPCRs超家族包含约1500种不同的蛋白，其中大约1200种编码嗅 觉、味觉或犁鼻受体。孤儿GPCRs(即，至今为止未发现与任何功 能相关的受体)的总数估计有200-500(Howard AD，McAllister G， Feighner SD，Liu Q，Nargund RP，Van der Ploeg LH，Patchett AA(2001)孤儿G-蛋白偶联受体和天然配体的发现，Trends Pharmacol Sci.22：132-140.)。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，GPCR 序列约占基因组的5％和大约编码1000种GPCR受体蛋白(Bargmann CI(1998)秀丽隐杆线虫基因组的神经生物学，Science 282：2028-2033 和Bargmann CI，Kaplan JM(1998)秀丽隐杆线虫神经系统中的信号 传导，Annu Rev Neurosci 21：279-308)。

现有技术中已知约有200种黑腹果蝇GPCR序列(Brody T， Cravchik A(2000)黑腹果蝇G-蛋白偶联受体．J Cell Biol.150：83- 88)。这一系列构象相似的分子被认为以会聚形式形成，目的是与G 蛋白偶联。

根据现有技术，GPCRs可分为3或4个家族。其中，A家族至今 为止包含最多的成员，它包括比如嗅觉受体(Buck L，Axel R(1991)一 个新的多基因家族可能编码嗅觉受体：气味识别分子，Cell 65：175- 187)。B家族包括分泌素、VIP和降钙素受体。C家族包括的受体比 如有代谢性的谷氨酸受体、钙受体、GABA-B受体、味觉受体和信息 素受体。但是，几乎所有的孤儿GPCR序列都属于A家族。

GPCR家族的一个特点就是通过G蛋白来进行信号传导。与细胞 外的配体结合引起传导信号的G蛋白激活。大约有200种不同的G 蛋白，而且每种细胞可能都有不同的一套。G蛋白的激活形式是G蛋 白结合形式，所述的G蛋白在失活状态与GDP相连。因为G蛋白是 一GTP激酶(GTPase)，在与GTP结合后G-蛋白自身失活。因为这 个原因，通过G蛋白的信号传导总是瞬间的事件。每种G蛋白包含3 个亚单位，α、β和γ。α亚单位可与GTP结合，因此能充分地控 制下游的信使(“第二信使”系统)。比如G蛋白Gs激活腺甘酸环化 酶，导致胞内信使cAMP的浓度升高。G蛋白Gi抑制腺甘酸环化酶 和Gq激活磷酸激酶C(第二信使：肌醇三磷酸酯和二酰基甘油)。其 他经常涉及的第二信使系统例如有钙、K、cGMP等。也存在嵌合G 蛋白。Gβ和γ亚单位在三聚蛋白复合体形成后同样可导致信号传导， 比如可能存在MAP激酶激活信号传导途径。特定GPCR的G蛋白偶 联的特异性是一个重要的药理特征，特别是这可用于建立分析体系， 典型的是测定下游信使浓度的变化，比如钙、cAMP或IP3。最近， 文献资料的初步结论认为MAP激酶信号传导途径同样可传导GPCR 信号(Marinissen MJ，Gutkind JS(2001)G蛋白偶联受体和信号网 络：出现变化．Trends Pharmacol Sci.22：368-376.)。

最后，从原理上讲，还可能存在一种G蛋白非依赖性信号传导， 即，比如β-2-肾上腺素能受体与NHERF直接作用调节Na/H交换器 的活性(Hall RA，Premont RT，Chow CW，Blitzer JT，Pitcher JA， Claing A，Stoffel RH，Barak LS，Shenolikar S，Weinman EJ，Grinstein S，Lefkowitz RJ(1998)β-2-肾上腺素能受体与Na+/H+-交换器调节因 子作用控制Na+/H+交换，Nature 392：626-630)。

大部分并不是全部GPCR受体都有的另一个特征是寡聚化。在此 特别感兴趣的是不同GPCRs之间的异源二聚体，这可能改变药理特 性和配体特异性(Bouvier M.(2001)G蛋白偶联传递受体的寡聚化，Nat Rev Neurosci 2：274-286)。因此，比如GABA-B受体只有形成GBR1 和GBR2的异源二聚体才能起作用(Kuner R，Kohr G，Grunewald S， Eisenhardt G，Bach A，Kornau HC(1999)，异源体形成在GABAB受 体功能中的作用，Science，283：74-77)。自此已报道许多这样的GPCRs 的异源二聚合，比如mGluR5、δ-阿片样物质受体等。最近，证据显 示在惊厥之前GPCR异源二聚体中一种成分的过量表达导致发病。缓 激肽II受体的增强表达导致缓激肽II-血管紧张素II受体异源二聚体 的增加，它可改变药理学应答，这可解释高张性表型(AbdAlla，Lother， Massiery和Quitterer，Nat.Medicine(2001)，7，1003-1009)。

最后，GPCR类蛋白是优选的药理靶分子。在销售最好的100种 药物中超过25％的药物药理性作用于GPCR类蛋白(Flower等 人，1999，Biochim.Biophys.Acta，1422，207-234)。因而特别是下列受 体的拮抗剂和激动剂具有重要的药理作用：肾上腺素受体组、血管紧 张素II受体、5-HT受体、多巴胺受体、组胺受体、白三烯/前列腺素 受体。作用于所述受体的药物涉及治疗众多的疾病范围，从精神病症 状(精神分裂症、抑郁)、影响高血压到心搏停止的急救药物。已知 的作用于这些受体的传统药物，比如是α-肾上腺素受体激动剂(去甲 苯福林)、β-肾上腺素受体激动剂(异丙肾上腺素、非诺特罗)、α- 肾上腺素受体阻断剂(哌唑嗪)、β-肾上腺素受体阻断剂(萘心安)、 5-HT拮抗剂(赛庚啶)、H2受体阻断剂(西咪替丁)、H1受体阻断 剂(特非那定)、多巴胺受体激动剂(溴隐亭)等。

尽管已付出了许多努力，然而所述受体影响的信号传导途径还是 没有完全阐明清楚。除此之外，对于各种GPCR系统相互影响的复杂 网络和对下游胞内过程的作用，特别是与外表生理状态的关系缺乏进 一步的了解。

本发明的一个目的是发现GPCR蛋白的新成员和相应的核苷酸 序列。本发明的另一个目的是根据已鉴定的蛋白提供能研制治疗性干 预病理生理学的治疗有效物质的方法，所述病理生理学是由比如表达 失调和/或无活性变异体的表达导致的，但在生理表达情况下也可能出 现。对此，提供相应的物质也是本发明的一个目的。

本发明的这些目的通过权利要求1、5、6、8、11、12、15、16、 17、20、23、26和27的主题实现。有利的实施方案描述于相关的从 属权利要求中。

本发明的一个主题涉及核苷酸序列，特别是DNA序列，它包括 编码具有氨基酸序列AA10-AA45(附图13中的序列5，都是从氨基 端到羧基端)，优选为AA10-65、AA10-AA45(附图14中的序列6)， 更优选为AA10-75、AA10-AA45(附图15A中的序列7A)，更优选为 AA10-60、AA10-AA45(附图15B中的序列7B)，更优选为AA10-60， 更进一步优选为AA10-AA100、AA10-AA45(附图15C中的序列7C)， 更优选为AA10-60，更进一步优选为AA10-AA100、AA10-AA45(附 图15B中的序列7B)，更优选为AA10-60，更进一步优选为AA10- AA70、AA10-AA45(附图16中的序列8)，更优选为AA10-60，更进 一步优选为AA10-AA100或AA10-AA45(附图18中的序列11)，更 优选为AA10-60，更进一步优选为AA10-AA100的序列区，包括任何 功能性同源衍生物、片段或等位基因。更进一步优选为那些核苷酸序 列，特别是DNA序列，它包括编码具有ee3家族蛋白的氨基酸序列 的多肽，特别是包括本发明蛋白的C-端胞内区或相应片段(优选为至 少25个氨基酸长度)。特别是包括公开的可与本发明序列杂交的任何 核苷酸序列，包括在各种情况下双链中的互补链序列。

另一个优选的实施方案披露了DNA序列，其基因产物编码如附 图13、14、15A、15B、15C、16和18中的相应序列5、6、7A、7B、 7C、8和11所示的多肽，包括这些DNA序列中任一个的任何功能性 同源衍生物、等位基因或片段，以及可抑制生理功能如凋亡信号级联 的非功能性衍生物、等位基因、类似物或片段(比如DN变异体)。 也披露了可与本发明所述的DNA序列杂交的任何DNA序列(包括互 补DNA链序列)。优选地，具有序列5-8，或其他的ee3家族的天然 成员的本发明的氨基酸序列的衍生物、等位基因、片段或类似物，至 少保留一种生物特性。通过标准方法(Sambrook等人1989和2001， Molecular Cloning：实验手册，Cold Spring Harbor，NY)制备这种 变异体、类似物、片段或等位基因。在属于ee3家族的本发明的DNA 序列比如根据附图9、10、11A、11B、11C或12中的一个或多个密 码子的插入、缺失或取代，以在转录和翻译后获得不同于相应的天然 ee3蛋白，特别是如附图13、14、15A、15B、15C、16或18中所示 的序列的多肽，所述不同至少为一个氨基酸。

本申请也涉及本发明天然ee3序列，比如附图9、10、11A、11B、 11C或12所示的序列的部分DNA序列。典型地，这些部分序列包括 附图9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列的片段，这些 片段包含有至少60个，更优选为至少150个，更进一步优选为至少250 个核苷酸。优选的部分序列编码特别是延伸自下列的多肽：AA20 (SEQ.5)、AA20(SEQ.6)、AA20(SEQ.7A)、AA20(SEQ.7B)、AA10 (SEQ.7C)和AA20(SEQ.8)，至C端至少20AA，优选为至少40AA， 最优选为延伸至C端(相应于如附图13、14、15A、15B、15C、16 或18中所示的序列)。另一方面，编码至少20AA的部分序列也可起 始于上述提到的点附近或有一定的距离的密码子。也公开了上述部分 序列的任何衍生物、类似物或等位基因。也公开了本发明所述的DNA 部分序列编码的AA序列其本身或作为较大的重组蛋白的一部分。特 别是本申请公开的本发明序列组成部分的任何可想到的或天然的剪接 变异体。

更优选的为核苷酸序列，特别是DNA序列，它编码与本发明的 序列5、6、7和8至少60％同源，优选为至少80％同源，更优选为 至少95％同源的蛋白质。本发明的核苷酸序列，例如附图9、10、11A、 11B、11C或12中所示核苷酸序列，或其功能性或非功能性等价变异 体如等位基因变异体或异构体可在分离和测序后获得。等位基因变异 体在本发明意义上是指在氨基酸水平上60-100％同源，优选70- 100％，更优选为90-100％同源的变异体。等位基因变异体特别是包 括那些功能性或非功能性变异体，其可由天然ee3序列的核苷酸，例 如根据附图9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列通过缺 失、插入或替代得到，仍保留至少一种基本的生物特性。

按一般方法通过与本发明核苷酸序列的样品或其部分杂交、同源 筛选可以从任何哺乳动物或其他物种包括人体中分离同源物或序列相 关的DNA序列。功能等价物也是指天然ee3序列的同源物，例如附 图9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列的同源物，例如 来自其他哺乳类的它们的同源物、截断的序列、编码和非编码DNA 序列的单链DNA或RNA。这些功能等价物可通过比如由附图9、10、 11A、11B、11C或12中所示的DNA-序列或这些序列的一部分，从 其他脊椎动物如哺乳类中通过一般的杂交方法或PCR技术获得。根 据本发明，这包括与天然ee3序列杂交的任何序列，特别是与附图9、 10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列杂交的序列。这些DNA 序列与本发明序列在标准的条件下进行杂交。有利地是可将由本领域 技术人员可获知的保守区的短的寡核苷酸用于杂交。然而，也可以用 本发明核苷酸的更长的片段或完整的序列来进行杂交。

所述的杂交的标准条件根据使用的核苷酸序列(寡核苷酸，更长 的片段或完整的序列)和/或核苷酸种类(DNA或RNA)而变化。因 而，比如DNA：DNA杂交体的解链温度比相同长度的DNA：RNA要低 10度。根据所用核苷酸，标准条件为含浓度0.1-5xSSC(1xSSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)的水缓冲溶剂中的温度为42-58℃， 或者另外在50％的甲酰胺存在下，如42℃在5xSSC，50％甲酰胺中。 DNA:DNA杂交的有利条件为0.1xSSC，温度约为20-45℃，优选为 约30-45℃。而对于DNA：RNA杂交的有利条件为0.1xSSC，温度 约为30-55℃，优选为约45-55℃。所述的杂交温度比如是对于具有约 100个核苷酸长度，G+C含量为50％的核酸，不存在甲酰胺的条件下 的解链温度计算值。DNA杂交的实验条件在遗传学的有关教科书中 都有记载，如Sambrook等人所著的书(“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。本领域技术人员可以根据已知公式计算得 出，如根据核酸的长度、杂交的类型或G+C含量计算。本领域技术 人员可以从下面的教科书中获得杂交的进一步信息：Ausübel等人 (eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。

本发明的核酸序列的等价物特别是还包括如附图9、10、11A、11B、 11C或12中所示序列的衍生物，比如像启动子变异体。一起或单独 连接在所述核苷酸的上游的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换。 通过插入和/或缺失而改变，这样就可以根据要求保留或者改变启动子 的功能或活性。因而可以通过改变其序列提高其活性或者用其他更有 效的启动子甚至是其他物种的启动子整个替换。根据本发明，衍生物 也包括其核苷酸序列起始密码子的上游1-1000范围内的改变从而改 变，优选提高基因表达和/或蛋白表达的变体。

此外，衍生物也包括优选在3’-端修饰过的变异体。如本领域熟知 的“标记”，例如六组氨酸锚定或可被各种抗体识别的抗原的表位(如 flag标记)(Studier等人，Meth.Enzymol.，185，1990：60-89和 Ausubel等人(eds.)1998，分子生物学手册(Current Protocols in Nolecular Biology)，John Wiley&Sons，New York)，和/或至少一个转 运翻译蛋白的信号序列如运输至特定细胞器官或胞外空间。

除此之外，本发明的核酸构建体或本发明的核酸，如附图9、10、 11A、11B、11C或12中所示、或其衍生物、变异体、同源物或者特 别是片段也可被表达成适于治疗或诊断的形式。为了产生重组蛋白可 应用载体系统或者寡核苷酸，它们将所述核酸或核酸构建体加长特定 的核苷酸序列并由此编码改变了的多肽，所述载体系统或寡核苷酸使 纯化简化，特别是，由此也将上述标记序列加长。

此外优选包括或相当于本发明基因组DNA序列的(c)DNA序列 的DNA序列。

此外本发明还特别公开了编码与本发明蛋白质的氨基酸序列5、 6、7A、7B、7C、8或11基本相同的蛋白质的任何DNA序列。这些 DNA序列与上述附图所示的序列相比只有小部分序列作了修饰，比 如也可以是异构体。所做修饰的序列长度一般不超过10个。与编码 蛋白质序列5、6、7A、7B、7C、8和/或11的DNA序列基本相同的 且同样编码生物活性蛋白质的这样的DNA序列可通过已知的突变方 法获得，突变体编码蛋白的生物活性可通过筛选方法确定的，如与神 经元处理或凋亡相关的结合试验或表达生物功能的能力。相应的突变 方法包括定点突变，它包括自动合成至少一个碱基修饰的引物。PCR 后，将异源双链核酸分子的载体转入合适的细胞系统(如E.coli)和 分离合适的转化的克隆。

本发明序列的功能直接与鉴定本发明蛋白引起的信号级联反应的 末梢元件相关。对此，根据本发明已发现本发明的受体激活MAP激 酶。除使用合适的报道分子分析(见实施例)确定所述的MAP激酶 以外，对此目的也可以使用预制的试剂盒(如Clontech的Mercury 体内激酶分析试剂盒)。这涉及与磷酸化靶(转录因子，如Jun)的反 式激活蛋白区融合的tet抑制蛋白的表达。tet抑制蛋白元件调控的荧 光素酶构建体的活化只有在反式激活蛋白区被激酶特异性磷酸化以后 才发生。根据本发明，由此方式可确定本发明ee3家族的受体或本发 明的变异体在细胞内信号传导途径中的活性。

此外，本发明序列的鉴定也是基于在一个具有高EPO表达的动 物模型中本发明的鼠源ee3-1-m的正调节引起涉及所述受体的病理生 理的过程的功能性认识，所述病理生理过程影响在这种状态下细胞存 活或细胞适应。因此，本发明的受体对伴随氧供给减少特别是大脑氧 供给减少的疾病有特别的药理学重要性。

除此之外，任何本领域技术人员所知的本发明DNA序列的制备、 修饰和/或检测的方法都适用，在体内、原位或体外的都可以(PCR(Innis 等人PCR手册：方法和应用指南)或化学合成)。合适的PCR引物可 例如赋予本发明DNA序列新的功能，如限制性酶切位点、终止密码 子。对此，可以设计将本发明序列转入相应的克隆载体。

本发明进一步涉及表达载体或包含本发明核酸序列，如上所述， 一般是DNA序列的重组核酸构建体。此处的本发明的核苷酸序列在 功能上与至少一个遗传调控元件如转录和翻译信号相连是有利的，这 种连接根据需要可导致与天然表达效率相同或增强或减少天然基因的 表达。用这种方法制备的表达载体可用于转化宿主有机体或宿主细胞 如哺乳动物细胞的细胞培养物。

在本发明的表达载体中，一般可以使用天然调控元件如本发明ee3 家族蛋白，特别是序列5、6、7A、7B、7C、8和11的蛋白的基因的 启动子和/或增强子，例如来源于哺乳类特别是相应的人源的调控序 列。上面所述的天然调控序列可根据要求进行基因修饰以改变表达效 率。除了上述提到的天然调控序列或代替这些天然调控序列，也可以 将其它基因的天然调控序列连接在本发明DNA序列的下游和/或上游 (5’或3’调控序列)并任选进行基因修饰，以切断由上述天然调控序 列控制的天然调控。

本发明方法的有利的调控序列包含在启动子，比如cos，tac，trp，tet， trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，1-PR或 1-PL启动子中，这些启动子用在革兰氏阴性菌中比较好。其它有利 的调控序列包含在革兰氏阳性的启动子例如amy和SPO2，酵母启动 子如ADC1，MFa，AC，P-60，CYC1，GAPDH或哺乳动物启动子如CaM 激酶II，CMV，Nestin，L7，BDNF，NF，MBP，NSE，beta-globin，GFAP， GAP43，酪氨酸羟化酶，kainate-受体亚基1，谷氨酸-受体亚基B中。 原则上，任何带有调控序列的天然启动子例如上述提到的都可以用于 本发明的表达载体。

另外，有利的是也可以使用合成的启动子。这些调控序列的目的 是使得本发明的核酸序列能够表达。根据宿主有机体的不同，也就是 说，基因是在诱导后表达和/或过量表达或者直接表达和/或过量表达。 因此，优选这些调控序列或因子有利地影响并因此增强表达。因而通 过使用强转录信号如启动子和/或增强子可在转录水平上有利地增强调 控序列。另外，例如也可以通过提高mRNA的稳定性来增强翻译。

调控序列是指任何本领域技术人员所知的元件，它可以影响本发 明的序列的转录水平和/或翻译水平。除了启动子序列外，特别强调“增 强子”序列，它通过提高RNA聚合酶和DNA的作用而增强表达。另 外一些作为例子提到的调控序列有“基因座控制区”，“沉默基因”或 其各自的部分序列。这些序列可用于组织特异性表达。本发明的表达 载体也包括“终止子序列”，根据本发明它也包括在术语“调控序列” 中。

本发明的一个优选实施方案就是连接本发明的核酸序列和一个启 动子，所述的启动子典型地位于本发明的DNA序列的5’上游。另外 一些调控信号比如3’终止子，多腺苷酸化信号或增强子都可在表达载 体中起作用。另外，依照本发明的基因构建体或可能的话是分离的基 因构建体中可以存在本发明核酸序列的一个或多个拷贝，特别是如附 图9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列或相应的蛋白。

术语“表达载体”包括如前所述的重组核酸构建体或基因构建体 和除了本发明的DNA序列和可能的调控序列以外还含有另外的元件 的完整的载体构建体。这些载体构建体或载体用于在合适的宿主有机 体中表达。有利的是将至少一种本发明的DNA序列，如人源ee3家 族基因，特别是ee3_1或ee3_2或这些基因的一部分插入到宿主特异 性载体中，它可以保证基因在所选的宿主中最优的表达。载体可以是 本领域技术人员所知的和比如可在“克隆载体(Cloning Vectors)”(Eds. Pouwels P.H.等Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985， ISBN0444904018)中找到。载体除了质粒外也指本领域技术人员所知 的其他载体，举例来说有噬菌体，病毒比如SV40、CMV、杆状病 毒、腺病毒、辛德比斯病毒、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、 线性或环状DNA。所述载体可在宿主有机体中或染色体上自主复制。 对于在哺乳类中的整合一般用线性DNA。

通过增加基因的拷贝数和/或通过有利于基因表达的调控因子的增 强可有利地提高本发明核酸序列的表达。因而，这使得通过增强的转 录信号比如启动子和增强子在转录水平上增强调控元件成为可能。然 而除了这些也可以例如通过提高mRNA的稳定性或增强核糖体上所 述mRNA的阅读效率来提高翻译水平。将核酸序列或同源基因例如 构建到核酸片段或载体中来提高基因拷贝数，其中的载体优选含有分 配各种基因的调控基因序列或类似作用的启动子活性。特别是使用那 些可提高基因表达的调控序列。

可将本发明的核酸序列与编码相互作用或者潜在地相互作用的蛋 白的序列克隆到一个单个的载体中，然后在体外宿主细胞或体内宿主 有机体中表达。或者，也可以将每种潜在的相互作用的核酸序列和本 发明的ee3家族的编码序列导入单个载体并将所述载体通过一般的方 法转入各种有机体中，所述一般方法如转化、转染、转导、电穿孔或 粒子枪。

在另一个优选的实施方案中，至少一个标记基因(比如抗体抑制 基因和/或编码荧光蛋白的基因特别是编码GFP的基因)存在于本发 明的表达载体中，特别是在完全载体构建体中。

本发明进一步涉及的是用本发明DNA序列和/或本发明的表达载 体特别是载体构建体转化的宿主细胞。合适的宿主细胞原则上是任何 允许本发明的DNA序列(对此包括衍生物、等位基因或功能等价物) 单独表达或与其他序列特别是调控序列一起表达的细胞。合适的宿主 细胞可以是所有原核或真核细胞，如细菌、真菌、酵母、植物或动物 细胞。优选的宿主细胞是细菌如大肠杆菌、链霉菌、杆状菌或假单胞 菌，真核微生物如曲霉菌或啤酒酵母或普通的面包酵母(Stinchcomb 等，Nature，282：39，(1997))。甲基营养酵母特别是毕赤酵母(Pichia pastoris)有利于制备相对大量的本发明蛋白。为了这个目的，将受 体克隆到合适的表达载体中，所述的表达载体也可表达带适用于纯化 的标记序列的融合蛋白。最后，酵母电穿孔后，挑选稳定的克隆。 Invitrogen公司提供一种很好的方法的说明和对此所需的所有试剂。 表达产物可根据功能表征，合适的话可用于本发明的筛选方法。

然而在一个优选的实施方案中，选择来源于多细胞有机体的细胞 用于表达本发明的DNA序列。这与传统的编码蛋白需要糖基化(N- 和/或O-连接)相反。与原核细胞不同，高级真核细胞在合适的条件 下可达到这个功能。原则上，任何高等真核细胞培养物都可以作为宿 主细胞，但是特别优选是哺乳动物细胞如猴子、大鼠、仓鼠或人的。 已建立的细胞系的多样性是本领域技术人员所知的。下面所述的细胞 系是其中的非限制性列举的一部分：293T(胚胎肾细胞系)，(Graham 等，J.Gen.Virol.，36：59(1997))，BHK(幼仓鼠肾细胞系)，CHO(仓鼠 卵巢细胞)，(Urlaub和Chasin，P.N.A.S.(USA)77：4216，(1980))， HeLa(人子宫颈的癌细胞)和其他细胞系，特别是那些为实验目的建 立的细胞系比如CHO-，HeLa-，HEK293-，Sf9-或COS细胞。特别优 选的是人类细胞，特别是免疫系统或成人干细胞如造血系统的干细胞 (来源于骨髓)。本发明的人类转化细胞，特别是病人自体同源的细 胞(特别在体外)在用本发明的DNA序列或本发明的表达载体转化 后，特别适合作为药物，比如用于基因治疗等，即在进行细胞采集、 任选的体外扩增、转化、筛选和最后的重新移植后。

本发明的显著优点是在昆虫细胞中异源制备本发明的ee3家族蛋 白用于功能性表征和本发明的筛选方法。因为昆虫细胞的内源G蛋白 的含量相对比较低，也就是说，例如在Western印迹中测不到Gi蛋 白，而且昆虫细胞通常并不表达所研究的受体，所以所述昆虫细胞适 用于体内构建本发明的ee3族受体的信号传导途径。在这种情况下， 通过杆状病毒表达系统在各种昆虫细胞系中表达ee3家族受体，其中 昆虫细胞系例如Sf9、Sf21、Tn368或Tn High 5或MB细胞。为了 这个目的，比如通过Pharmingen的BaculoGold试剂盒制备重组杆状 病毒并感染上述细胞系。为了研究本发明的G蛋白偶联，进行共感染。 为了这个目的，用受体病毒并另外还用带有能表达三种G蛋白亚基的 病毒感染细胞，进行相应的分析比如cAMP分析。这样可以研究不同 G蛋白亚基对受体活性的影响。表达受体的昆虫细胞或它们的膜都可 以用于筛选分析。昆虫细胞可在发酵槽或摇瓶中容易地大量繁殖，由 此为筛选方法和受体纯化提供重组细胞或膜原料的合适原料。

宿主细胞和适合宿主细胞的本发明的表达载体例如质粒、病毒或 噬菌体，比如含有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体1、Mu 或其他温和噬菌体或转座子和/或其他适中的调控序列组合可产生本发 明的宿主细胞，它也可以作为表达系统。基于本发明宿主细胞的优选 的本发明表达系统的例子是哺乳类动物细胞如CHO细胞和载体如 pcDNA3neo载体或者是HEK293细胞和CMV载体的组合，后者特 别适合于哺乳动物细胞。

本发明的另一方面涉及的是本发明DNA序列的基因产物。在本 发明中，基因产物是指初级转录如RNA优选为mRNA和蛋白质和/或 多肽，特别是纯化形式的。特别是这些蛋白调控或传输凋亡或坏死以 及可能的炎性信号或与细胞生长或细胞可塑性相关的信号时。如果纯 化的基因产物包括该序列的功能同源物或抑制该功能(无活性)的等 位基因、片段、类似物或衍生物，或典型地由这样的氨基酸序列组成， 那么该纯化的基因产物是优选的。根据本发明，功能同源物在此定义 为至少含有如附图13-16和/或18所示具有序列5、6、7a、7b、7c、8 和11的蛋白的一个基本功能特性。典型地，功能同源的本发明蛋白 特别是与本发明的蛋白的生物功能片段(例如蛋白作用部位)相比具 有特征的序列等同性，例如至少60％，优选至少80％的序列等同性。 根据本发明，特别是在实施例6中公开了也包括在染色体3、5、8和 X上的同源序列，及相应的变异体。

衍生物特别是指那些侧链作了修饰的AA序列，比如将一种抗体、 酶或受体连接到本发明的AA序列上。衍生物也可指连有糖基(通过 N-或O-糖苷键)或脂肪(酸)残基(如肉豆蔻酸)、一个或更多个磷 酸基团和/或侧链的任何修饰，特别是自由羟基或氨基或在本发明的寡 -或多肽的N和C端。另外，术语“衍生物”也包括融合蛋白，也就 是说在其中本发明氨基酸序列与任何寡-或多肽偶联。

类似物是指与天然序列相比至少有一个AA作了改变(插入、取 代)。在本发明的范围内，优选是那些取代的氨基酸(极性氨基酸、 长的脂肪链、短的脂肪链、带正电荷或负电荷的氨基酸、带芳香基团 的氨基酸)的保守性取代，仍然保留原有的物理化学特征(大小、碱 度、疏水性等)。取代可导致生物功能，特别是功能或生物无功能序 列。比如，Arg可取代Lys、Ile可取代Val或Glu可取代Asp。也可 通过加或减或改变一个或更多个氨基酸的位置或多种这些措施相互组 合。用这种方法改变的蛋白与天然ee3蛋白相比，特别是与附图13、 14、15A、15B、15C、16或18中所示的相比，与上述附图所示序列 相比一般至少有60％同源，优选至少70％和更优选至少90％同源， 根据Altschul等人(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)的算法计算得 到。可以从哺乳动物脑中分离蛋白和其功能变异体，哺乳动物比如有 人、沟鼠或小鼠。功能变异体也可包括来源于其他哺乳动物的同源物。

根据本发明，优选的是那些保留天然序列二级结构的类似物。根 据本发明除了保守取代以外，也可以对天然序列进行弱保守AA的取 代。由此保留其生物功能，特别是作为凋亡或坏死信号的传递者或细 胞繁殖、细胞可塑性或细胞生长的信号传递者。可以通过合适的方法， 例如结合分析或细胞毒性分析来检验取代或缺失的效果。

然而，本发明也包括可导致“显性负性”效应的序列，也就是改 变了一级序列仍然有结合细胞外配体的活性，但是不能向下也就是胞 内继续传递信号。在此举的例子是C端截断的ee3_1序列变异体，或 者是如附图11B或11C以及附图15B或15C的两个剪切变异体。这 些类似物可作为生物功能的抑制剂，特别是抑制凋亡。这样的类似物 是通过基因工程制备的，特别是通过编码本发明蛋白(序列5、6、7 (b，c)、8和11)的DNA序列的定点突变。所产生的DNA序列(类 似物就是建立在这样DNA序列)可最终在重组细胞培养基中表达蛋 白(Sambrook等，1989，见上面)。也公开了上述类似物的任何衍生 物以及编码上述AA序列的DNA序列。

本发明进一步包括本发明天然AA序列的片段。片段以缺失(N- 或C-端或其他内部序列)为特征。它们可能具有显性负性或显性正性 效应。

然而，本发明的基因产物(蛋白)也包括那些附图所示的DNA 序列的DNA衍生物、DNA片段或DNA等位基因转录和翻译后的基 因产物(蛋白)。

另外，本发明的蛋白也可作化学修饰，如在N-端加保护基团。糖 基可连接到羟基或氨基上，脂类可与本发明蛋白共价连接，也包括磷 酸基或乙酰基等。任何化学物质、化合物或基团都可以通过任何合成 途径与本发明蛋白相连。另外的氨基酸如游离氨基酸或肽形式或蛋白 区域形式等，都可以与本发明蛋白的N-和/或C-端连接。

特别优选本发明蛋白氨基酸序列的N-端的“信号”或“引导”序 列，它可以将多肽在翻译同时或者在翻译之后引导至特定细胞器内或 胞外空间(或培养基)。作为抗原的氨基酸序列也可连接在C-端或N- 端，其中的抗原可使得本发明的氨基酸序列与抗体连接。特别要提到 Flag多肽，其序列为：DYKDDDDK(单字母表示)。或其他的如His 标签，其具有至少3个，优选至少6个组氨酸残基。这些序列具有强 的抗原特性，可以快速测定和简化纯化重组蛋白。Eastman Kodak Co.， Scientific Imaging Systems Division，New Haven，Connenticut提供与 Flag肽结合的单克隆抗体。

本发明进一步涉及天然ee3序列的部分，特别是附图13、14、15A、 15B、15C、16或18中所示的序列的部分，其中至少包括20个，优 选为至少30个和更优选为50个氨基酸。本领域技术人员可以通过常 用方法例如化学合成的方法合成这样的部分序列，它可优选作为产生 抗体的抗原。优选这些部分序列和/或其衍生物、其等位基因或片段是 公开的序列，这些序列在蛋白原的空间模型中形成在本发明天然ee3 序列，特别是附图13、14、15A、15B、15C、16所示的序列中构成至 少部分蛋白质表面的区域。优选的长度至少为20AA的部分序列至少 部分地包含本发明ee3家族蛋白的胞内部分和特别优选的本发明的部 分序列包括如附图8所示序列600-752位的至少20个氨基酸(根据附 图8)，如肽WWFGIRKDFCQFLLEIFPFLRE(从609至630，21AA)。

此外，本发明的氨基酸序列，如人源蛋白ee3_1或ee3_2序列， 具有与其他代表性的GPCR一样的特定序列基序。这样，例如典型的 标志三联体序列也出现在GPCR类蛋白的第3个跨膜区的下游(包含 序列DRY(单字母表示)的序列)。

在本发明的ee3_1中，序列DRI(103-105位置)出现在TM3 (83-102)的下游(根据附图15A)。根据现有技术已知的典型的GPCR 类(Galanine-2受体、C5a受体(大鼠)、BK-2(人)或CXCR-5(人)) 在相应的位置都存在序列DRY或DRF。

因此，如上所述的特别优选的本发明的肽是至少含有20AA，并 且含有AA三联体DRI。作为这种本发明的肽的例子可提及具有序列 VLVCDRIERGSHFWLLVFMP的肽。这样的本发明的肽可用于受体 生理功能的调节。假如在细胞中掺入或一般性提供这样的肽序列，可 影响激动剂依赖性激活的胞内信号传导过程、激活本发明的受体与G 蛋白的相互作用以及可能的受体的内化。本发明的一些寡-或多肽有可 能导致下游信号传导途径的组成型激活。因此本发明的寡-或多肽特别 地可作为药物或适用于制备药物。

另外，至少含有20个氨基酸的本发明的寡-或多肽在前两个胞外 环例如ee3_1(见附图8)中优选可包括2个保守半胱氨酸(根据附 图15A，在ee3_1的位置78和145)，这是GPCR蛋白的典型特征(序 列GETCV在第一个胞外环的末端，序列ELEILCSVNIL在第2个胞 外环的中间)。因此，本发明的寡肽序列包括例如上述提到的两个序 列。

最后，也特别优选那些至少包含ee3家族蛋白序列的20个AA的 肽，来源于TM区，比如肽LDGHNAFSCIPIFVPLWLSLIT(包含C- 端的TM区)。本发明的这类肽优先适用于调节特别是抑制ee3蛋白 的受体作用，这样的肽的治疗性能涉及下述本发明的适应症。抑制TM 结构的肽由于不能正常结合而导致功能改变，丧失受体的特异性。与 此相关例如参见涉及β-2-肾上腺素能受体的第6个TM区的参考文献 (Hebert TE，Moffett S，Morello JP，Loisel TP，Bichet DG，Barret C， Bouvier M(1996)来源于β-2-肾上腺素能受体跨膜区的肽抑制受体二 聚化和激活，J Biol Chem 271：16384-16392)。另外，本发明至少含 有来源于ee3家族蛋白序列的20AA的结合配体的肽片段也可以用作 药物或用于制备药物，它与天然配体(胞外或胞内配体)竞争结合位 点，这样可以阻断天然ee3配体的结合。本发明的这类肽作为“诱饵 受体”在本申请提到的所有适应症中导致治疗效果。

也公开了本发明的抑制肽的鉴定方法，根据本发明，合适的方法 是Tarasova等人在另一篇文章(Tarasova NI，Rice WG，Michejda CJ (1999)通过破坏跨膜区域的相互作用抑制G蛋白偶联受体功能，J Biol Chem 274：34911-34915))中所描述的方法，将关于该方法的全部内 容引入本文作为本发明公开的一部分。这些本发明的抑制肽可以调 节，比如抑制如不同TM区的分子间相互作用，这是本发明的ee3家 族蛋白发挥作用的重要前提条件。这类本发明的肽也可作为药物或用 来制备药物。

上述提到的本发明的肽也可以肽类似物的形式(仿肽体)存在。 在这种情况下，骨架上的酰胺键优先被另外的但结构相当的键替代， 替代的键优选不会被天然人源酶裂解。例如，合适的有寡氨基甲酸酯。 容易制得N-端保护的单体氨基烷基碳酸酯，比如从相应的氨基醇得到 并且可在用碱性不稳定的Fmoc基团转化成活化酯后引入固相合成。 因为这样的类似物比相应的肽具有更好的疏水性，其特别适用于透过 血脑屏障，也就是说特别是用作神经疾病的药物。

本发明也涉及转基因动物。本发明的转基因动物是遗传修饰过的 动物，以表达或包含相对于正常动物来说在至少一个组织中改变量的 本发明的基因产物(如通过修饰本发明基因的启动子区域)，或者包 含或表达一种修饰的基因产物(如本发明ee3族蛋白的衍生物，或者 是片段)。根据本发明，这包括(a)在基因水平部分或全部不再有天 然的本发明DNA序列或(b)虽然在基因水平仍然保留本发明的序列 但是不能转录和/或翻译所述序列因而不含有基因产物的动物。另外， 在转基因动物中的本发明的天然序列也就是ee3蛋白家族序列，如序 列5、6、7(包括7b和7c)、8和11(不管有还是没有)，包含至少 一种本发明的DNA序列和/或被至少一种本发明的DNA序列所取代。 特别地，取代和/或插入的序列可以是本发明的不具有天然性能的序 列。

制备关于本发明序列的转基因动物和/或敲除动物，特别是大鼠、 小鼠、猪、牛、羊、果蝇、黑腹果蝇或斑马鱼，用本领域技术人员所 知的方法进行。至此，本发明的cDNA序列或天然或人工变异体已经 在转基因小鼠中表达，如在神经元中NSE启动子，在少突胶质细胞 中MBP启动子等。遗传修饰的动物可以作为研究不同疾病的模型(比 如实验导致中风、MCAO)。制备敲除动物可以提供在整个有机体中 抑制剂效果的更多信息，因为敲除动物相当于抑制本发明的天然序 列。这类方法已用于本发明抑制剂如本发明的肽、肽类似物或其他小 分子有机化合物的临床前的测试。

根据本发明，所有多细胞的有机体都可以转基因，特别是哺乳类 动物，比如大鼠、小鼠、羊、牛或猪。转基因植物原则上也是可以的。 转基因有机体可以是敲除动物。在本文中，转基因动物可包含本发明 的功能或非功能性核酸或功能性或非功能性核酸构建体单独或与编码 本发明蛋白的功能性或非功能性序列的组合。

上述转基因动物进一步的实例是转基因动物，在生殖细胞或其所 有/部分体细胞或在生殖细胞或所有/部分体细胞中，本发明ee3家族 的核苷酸序列，特别是序列1-4被通过基因工程方法改变或通过插入 DNA元件被间隔。本发明的核苷酸序列或其部分的另外一种用途是 产生转基因或敲除动物或有条件的或区域特异性敲除的动物或特异性 突变的遗传修饰动物(Ausubel等人(eds.)1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York和Torres等人，(eds.) 1997，Laboratory protocols for conditional gene targeting，Oxford University Press，Oxford)。另外，也可导入特定的突变，如修饰启动 子或插入增强子，以制备如在转基因动物(“Knock-in”动物)的组 成型活性的ee3蛋白。根据本发明这样的动物也可用于例如临床前试 验的ee3蛋白功能的潜在激动剂的类似模型。

通过转基因过量表达或在胚胎干细胞，通过同源重组产生遗传突 变(无义突变或定点删除、插入或修饰)，可以制备动物模型，它可 以提供本发明序列(病理)生理学的有用信息。这种方法制备的动物 模型是开发新的治疗药物的基本测试系统，所述药物影响本发明蛋白 特别是具有序列5-8的蛋白对神经、免疫、繁殖或其他过程的生物 活性。

本发明进一步涉及抗体，其可识别本发明ee3基因产物，特别是 附图13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白质或其衍生物、 片段或同工型或等位基因的表位，但也可针对比如本发明的mRNA。 本发明的术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体、嵌合抗体、抗 独特型抗体(针对本发明抗体)，所有的抗体都可以结合形式或水溶 性形式存在，并可任选用标签标记，以及所述抗体的片段。除了分离 的本发明的抗体片段以外，本发明抗体也可以与其他(蛋白)成分作 为融合蛋白的重组形式出现。片段本身或本发明抗体片段作为融合蛋 白的一部分，一般可以通过酶切、蛋白合成或本领域技术人员所知的 重组方法制得。因而，根据本发明的抗体可指多克隆、单克隆、人源 或人源化或重组抗体或其片段，单链抗体或其他合成抗体。

多克隆抗体是异源抗体分子的混合物，是从抗原免疫的动物血清 中获得。然而本发明也包括多克隆单种属的抗体，是纯化抗体得到(比 如通过装填特异性表位的肽的柱)。单克隆抗体包含基本上特异针对 抗原的均一抗体，有相同的表位结合位点。单克隆抗体可以通过现有 的技术的方法制备(例如Khler和Milstein，Nature，256，495-397， (1975)；US-Patent 4,376,110；Ausübel等人，Harlow和Lane ″Antikrper″：Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory (1988)；Ausubel等人(eds)，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)。将上述文献并入本文作为 本发明公开的一部分。

也可以用例如本申请上述提到的方法制备本发明的基因工程抗 体。简言之，所述方法包括抗体产生细胞的培育和在细胞达到合适的 光密度时通过已知的方法用硫氰酸胍裂解细胞，用醋酸钠酸化，用苯 酚、氯仿/异戊醇提取，用异丙醇沉淀和用乙醇清洗而从所述细胞中分 离出mRNA。然后从mRNA反转录合成cDNA。合成的cDNA直接 或作了基因修饰如定点突变、插入、缺失、转换、删除或碱基替换之 后导入合适的动物、真菌、细菌或病毒载体中，在相应的宿主有机体 中表达。优选的是细菌或酵母载体如pBR322、pUC18/19、pACYC184、 Lambda或酵母-mu-载体用于克隆基因和在细菌如E.coli或酵母如酿 酒酵母中表达。抗本发明蛋白的特异抗体可作为诊断试剂和作为ee3 家族蛋白起重要病生理作用的疾病的治疗药物。

本发明抗体属于下列免疫球蛋白类：IgG、IdD、IgM、IgE、IgA、 GILD和合适的话，所述类型的亚类如IgG的亚类或其混合物。优选 IgG和其亚类比如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgGM。 更优选为IgG的亚类IgG1/k或IgG2b/k。产生本发明单克隆抗体的 杂交瘤细胞可在体外、原位或体内培养。高浓度的单克隆抗体优选在 体内或原位获得。

本发明的嵌合抗体是包含来源于各种动物的不同部分(比如含有 小鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的保守区)的分子。优选应 用嵌合抗体，一方面是降低应用中的免疫原性，另一方面是提高产率， 比如鼠源单克隆抗体在杂交瘤细胞中的产量更高但是也在人体内产生 高的免疫原性，因此一般优先使用人/鼠嵌合抗体。嵌合抗体和其制备 方法是现有技术中已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Sci.USA 81： 3273-3277(1984)；Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：6851- 6855(1984)；Boulianne等人Nature 312643-646(1984)；Cabilly等人， EP-A-125023；Neuberger等人，Nature 314：268-270(1985)；Taniguchi 等人，EP-A-171496；Morrion等人，EP-A-173494；Neuberger等人，WO 86/01533；Kudo等人，EP-A-184187；Sahagan等人，J.Immunol.137： 1066-1074(1986)；Robinson等人，WO 87/02671；Liu等人，Proc.Natl. Acad.Sci USA 84：3439-3443(1987)；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：214218(1987)；Better等人，Science 240：1041-1043(1988)和 Harlow和Lane，Antikrper：A Laboratory Manual，同上)。这些文 献也一起并入作为本发明的参考文献。

十分特别优选针对本发明ee3蛋白，特别是如附图13、14、15A、 15B、15C、16或18中所示的蛋白的胞外区作为表位的这样的本发明 抗体。在上述公开的各种形式的本发明的抗体都可用于抑制本发明的 ee3族蛋白，比如体外实验研究，原位标记或通过静脉、皮下、动脉 或肌肉注射体内用于治疗。

本发明的抗独特型抗体可以识别决定部位，所述决定部位通常与 本发明抗体的抗原结合位点相连。抗独特型抗体的制备可以通过相同 种类和相同基因型(比如小鼠源)的动物免疫作为起始点用于本发明 抗独特型抗体针对的单克隆抗体。免疫的动物可识别免疫抗体的独特 型决定簇，这样就可以产生针对所述独特型决定簇的抗体(即本发明 抗独特型抗体)(U.S.4,699,880)。本发明的抗独特型抗体也可以作为 免疫原来激发其他动物的免疫反应从而导致在其中产生所谓的抗-抗- 独特型抗体。所述抗-抗-独特型抗体可以，但不必需，其表位的构造 与引起抗独特型反应的原单克隆抗体一样。通过这种方法，可以应用 针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体来识别其他表达相同特异性抗 体的克隆。

可应用针对本发明蛋白、本发明蛋白的类似物、片段、衍生物的 单克隆抗体，以在相应动物如BALB/c小鼠中诱导抗独特型抗体的结 合。来源于这种免疫小鼠的脾细胞可用于制备分泌抗独特型单克隆抗 体的抗独特型杂交瘤细胞系。此外，抗独特型单克隆抗体也可以与载 体(KLH、匙孔血蓝蛋白)偶联，然后用于进一步免疫BALB/c小鼠。 这些小鼠的血清中就含有抗-抗-独特性抗体，它具有与原单克隆抗体 结合的特性，并特异性针对本发明蛋白或其片段或其衍生物的表位。 这样，抗独特型单克隆抗体有自己的独特型表位或结构上与所研究的 表位相似的“独特位”。

术语“抗体”包括完整的分子和其片段。所述片段可提及任何具 有一个或两个抗原-互补结合位点的截短或改变的抗体片段，例如具有 相应于所述抗体并由轻链和重链构成的一个结合位点的抗体部分，如 Fv-、Fab-或F(ab′)2片段或单链片段。优选为截短的双链片段如 Fv-、Fab-或F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少例如在完整抗体 中存在的Fc片段，以便它们可以在血液循环中较快运输和与完整抗 体相比具有较低的非特异性组织结合。在这里要强调本发明抗体的Fab 和F(ab′)2片段以及这些抗体本身，都可以用于检测(定性)和定 量本发明蛋白(合适的话，也可用于检测本发明蛋白的活性如特异磷 酸化)，因此定性的和/或定量的检测本发明蛋白的蛋白活性的方法也 是本发明的一部分。

可以使用酶进行蛋白裂解制备这样的片段，其中应用酶，如木瓜 蛋白酶(制备Fab片段)或胃蛋白酶(制备F(ab′)2片段)或通过 化学氧化或抗体基因的基因修饰制备。

本发明也包括抗体混合物。除了所述抗体，在所有本发明方法和 应用中都可使用抗体混合物。单克隆抗体的纯化部分、多克隆抗体或 单克隆抗体的混合物都可作为药物应用和用于制备治疗下述疾病的药 物：脑局部缺血(也就是中风)、退化性紊乱特别是神经变性性紊乱 和神经系统疾病如癫痫症。

本发明抗体，包括这些抗体片段和/或混合物，都可以用于在样品 中定性或定量检测本发明ee3基因产物，特别是如附图13、14、15A、 15B、15C、16或18中所示的蛋白或其片段或衍生物，或检测表达和 任选分泌本发明蛋白的细胞。对此公开了本发明的抗体作为诊断剂的 用途。因而，可以由本发明抗体确定本发明基因产物的量和它的活性 (比如特异性磷酸化)，比如附图13、14、15A、15B、15C、16或18 中所示的蛋白的活性。所述检测也借助免疫荧光方法进行，其中使用 荧光标记的抗体与光学显微镜、流式细胞仪或荧光测定联合进行。

根据本发明的抗体(包括所述抗体片段或抗体混合物)可用于组 织学的研究，比如在免疫电镜或免疫荧光过程中，用于原位检测本发 明蛋白。原位检测可通过获取病人的组织学样本，并将标记的本发明 抗体加到样本来进行。抗体(或这些抗体的片段)都可作为生物样本 的标记形式。这样不仅可以确定样本中本发明蛋白的存在而且可以研 究本发明蛋白在所研究的组织中的分布。生物样本可以是生物流体、 组织提取物、收获的细胞如免疫细胞或心肌细胞或肝细胞、或在组织 培养基中培育的任何细胞。可用现有技术的方法并根据标记的种类(比 如荧光方法)来进行标记抗体的检测。然而，也可以将生物样本负载 于固相载体比如硝化纤维或其他载体上，以便固定细胞、细胞部分或 可溶性蛋白。载体可以用合适的缓冲液冲洗一次或几次，然后用本发 明可检测的标记抗体处理。可以用缓冲液第二次冲洗固相载体以去除 未结合的抗体。结合在固相载体上的标记的量可根据传统方法确定。

合适的载体特别是玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、 尼龙淀粉酶、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺和磁石。为了满足本 发明的条件，载体可以是部分可溶或完全不可溶的。载体的材料可以 是任何形状的，比如小球状(珠子)或圆柱状或球状，优选的为小球状 聚苯乙烯。

有好多种方法进行可检测到的抗体标记。比如，抗体可与最终在 免疫分析(EIA)中用到的酶连接。所用的酶可与相应的底物反应产 生用本领域技术人员已知的方法检测或任选定量的化合物，如通过分 光光度测定法、荧光测定法或其他光学方法。酶可以是苹果酸脱氢酶、 葡萄状球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷 酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天(门) 冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过 氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶或乙酰胆碱酯酶。可应 用对于标记所用的酶特异性的生色底物来进行检测，比如，最后通过 酶反应转化的物质与对照标准的光学比较进行。

此外，也可以用其他的免疫分析法来检测，比如通过抗体或抗体 片段的放射性同位素标记(也就是放射性免疫分析(RIA；Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.等人 North Holland Publishing Company，New York(1978))。可用闪烁计 数器或自动射线照相术来检测和定量放射性同位素。

荧光化合物也可以用来标记，如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻 红蛋白、藻胆青素、异构藻胆青素、o-苯二醛和荧光胺。也可以用可 发荧光的金属152E或镧系元素。这些金属通过螯合基团如二亚乙基三 胺五乙酸(ETPA)或EDTA与抗体连接。本发明抗体可以通过借助 化学发光的化合物来连接。可以通过化学反应产生的化学发光来检测 化学发光标记的抗体。这样的化合物有鲁米诺、异鲁米诺、吖啶鎓酯、 咪唑、吖啶鎓盐或草酸酯。也可以用生物发光化合物。生物发光是化 学发光的一种，它可发生在生物系统和其中催化蛋白增强化学发光反 应。生物发光蛋白也可以通过荧光法检测，如虫萤光素、荧光素酶和(水 母体内的)发光蛋白质等生物发光蛋白。

本发明的抗体也可以用于免疫测定分析，也就是“双位的”或“三 明治”法。典型的免疫测定分析系统包括“前沿”分析，其显著特征 是将本发明的抗体与固相系统相连并通过这种方式使抗体与所研究的 样本相接触。以这种方式，通过形成二元固相-抗原-抗体复合物而从 样本中分离抗原。经过适宜的培育时间，冲洗固相载体以去掉残留的 液体样本包括未结合的抗原，然后与含有未知量的标记检测抗体的溶 液接触。其中的标记抗体作为所谓的“报道分子”。经过第二次培育 以便标记的抗体与已连到固相载体上的抗原结合后，再次冲洗固相载 体而去除未反应的标记抗体。

另外一种分析方法是“三明治”法。在这种方法中，如果将固相 连接的抗体和标记抗体同时加到分析样本中则只需要一次培育。在培 育后冲洗固相载体去除残留的液体样本和未结合的标记抗体。固相载 体上的标记抗体的存在可与传统的前沿的三明治法一样准确确定。在 所谓的反向分析中，在培育一段合适的时间后，首先是向液体样本中 逐步加入标记抗体溶液，然后混入与固相载体的未标记抗体。在第二 次培育步骤后，如传统方法一样冲洗固相载体以去掉残留的液体样本 和未反应的标记抗体。固相载体反应的标记抗体的确定同上。

本发明进一步公开了表达本发明ee3基因产物，特别是如附图13、 14、15A、15B、15C、16或18中所示的多肽包括其所有衍生物、类 似物和片段的基因产物的方法，其中为此用本发明的表达载体转化宿 主细胞。基于本发明DNA序列的基因产物的表达方法并不提供浓缩 和纯化的相应的基因产物，而是通过导入能表达相应基因产物的本发 明DNA序列而影响细胞代谢。特别是用表达载体转化的宿主细胞作 为药物的应用或用来制备药物，特别是用于治疗疾病，如肿瘤、神经 疾病、神经变性性紊乱(如多发性硬化，帕金森)和脑局部缺血(例 如中风)。本发明的宿主细胞可用于治疗凋亡、坏死、细胞生长、细 胞分裂、细胞分化或细胞可塑性失调的疾病。根据本发明的方法，可 将这种来自体内转化的自体或异体同源的宿主细胞移植给病人。

本发明另外一方面包括分离基因产物的方法，所述基因产物至少 含有与本发明氨基酸序列，特别是与序列5、6、7(包括7b和7c)、 8和11同源的部分序列，而且至少含20AA、优选为至少30AA，其 中包括用本发明的表达载体转化宿主细胞和在合适的、能促进表达的 条件下培养所述细胞，以使最终能从培养物中纯化基因产物。根据表 达系统，本发明DNA序列的基因产物可以从培养基或细胞提取物中 分离。对于本领域技术人员来说，分离和纯化本发明DNA表达、重 组的蛋白的方法主要依赖于宿主细胞的种类或其他问题如蛋白是否分 泌到培养基中，这是已知的。例如可以使用重组蛋白是宿主细胞分泌 的表达载体。在这种情况下，就要使用商业上可获得的蛋白浓缩过滤 器如Amicon或微孔Pelicon来浓缩培养基。浓缩步骤后再进行纯化 步骤，比如凝胶过滤步骤或柱色谱纯化步骤。或者也可以使用带DEAE 基质的阴离子交换剂。

作为基质可应用任何蛋白纯化的已知的物质，比如丙烯酰胺或琼 脂糖或葡聚糖等。然而也可以使用通常含羧甲基的阳离子交换剂。也 可以用HPLC步骤进一步纯化本发明DNA编码的多肽。可以进行一 步或多步，特别是应用反相方法。所述方法可以获得本发明DNA序 列的基本同源的重组蛋白。

除了用于分离基因产物的细胞培养基，也可以应用转化的酵母细 胞。在这种情况下，翻译蛋白可以是分泌型的，以简化纯化。从酵母 宿主细胞中得到的分泌的重组蛋白可以通过Urdal等人(J.Chromato. 296：171(1994))公开的方法获得，该方法也是本发明公开的一部分。

本发明的核酸序列，特别是本发明DNA序列和/或本发明基因产 物都可以作为药物应用或用来制备药物。所述的药物可以直接施用(比 如经颊、静脉、口服、肠胃外、经鼻、皮下)或与其他活性化合物、 赋形剂或常用药物添加剂一起施用。本发明的核酸可以作为裸核酸， 特别是静脉注射施用，或采用载体施用于患者。载体可以是质粒或病 毒载体，特别是逆转录病毒或腺病毒载体，或含有本发明的裸DNA 的脂质体或含有本发明DNA的质粒。

本发明的序列特别是核苷酸序列或氨基酸序列1-8或其变异体， 以及本发明的蛋白异体和由其衍生的本发明的试剂(寡核苷酸、抗体、 肽)都可以用于制备治疗药物，也就是用于治疗疾病的药物。优选的 是治疗由细胞死亡和繁殖的自我平衡失调引起的疾病或病理生理状 态。

本文中发现决定细胞转录行为变化的EPO可直接或间接地促使 本发明的受体，例如ee3_1，转录的增强，此发现具有重要性。即本 发明的受体调节EPO的作用，因此对于与此相关的疾病有重要作用。 这意味着本发明受体可选择性地影响EPO的某些作用，例如神经保 护性作用(比如在神经变性性疾病中)，其中激活转录因子NF-kappaB 在EPO的神经保护行为中是关键的一个步骤，或增强脑的功能(比 如在痴呆中)。动物试验的相应研究表明本发明的物质可用于神经疾 病的模型如脑局部缺血，试验引起的脑脊髓炎或蛛网膜下出血。

对于这部分作用是希望的，因为除了神经保护作用外施用EPO 可导致血球密度的增强(与所述的神经保护行为有一点矛盾)，因为 血液流变学特性恶化(对微循环具有负面效应)，如在过量表达红细 胞生成素的小鼠中体现的(Wiessner等人，2001，J Cereb Blood Flow Metab，21，857-64)。

因而，可应用与调节有关的本发明物质如本发明的核苷酸、寡-或 多肽、表达载体、宿主细胞或能与本发明的受体的任何位点相连的替 代配体，特别是用于制备治疗神经性失调，尤其是神经变性性疾病的 药物。

通过本发明的应用可影响细胞死亡过程，如在任何表达本发明ee3 族蛋白或其变异体的细胞中，特别是在神经细胞中影响导致凋亡的级 联或导致坏死的过程，如通过调节细胞之间的相互作用特别是那些涉 及G蛋白偶联蛋白的相互作用。

根据本发明，本发明的天然蛋白，特别是序列5-8的蛋白，作为 受体是胞内信号传导途径的一部分。它们通常是信号级联的起点，他 们的失调可导致多种疾病。因此，发现上面所述的本发明蛋白在下列 胞内过程中作为组分和具有细胞作用，比如在：可作用于细胞分化、 细胞分裂、生长、可塑性、再生的一般的信号传导，细胞分化，繁殖 或细胞死亡。相应地，通过本发明蛋白(如ee3_1或ee3_2)的失活， 或通过无功能表达或通过过量表达都可导致伴随如细胞分化、细胞生 长、细胞可塑性或细胞再生失调的病理生理学状态。另一方面，其他 机制也可能导致病理生理学状态，例如本发明ee3受体的天然配体的 无活性形式或过量的活性形式。根据病理生理学紊乱的分子机制，给 予本发明活性蛋白或至少增强的所述蛋白的表达或抑制胞内过量表达 或表达无活性蛋白对于治疗目的都是希望的。考虑到其在神经细胞死 亡、兴奋和形成中的作用，优选使用本发明序列，特别是序列1-11的 序列。本发明的这些发现导致使用本发明序列(核酸-和氨基酸序列) 和相应的衍生物(如肽、寡核苷酸或抗体)来制备治疗肿瘤和神经疾 病的药物，特别是缺血状态(中风)，多发性硬化，神经变性疾病比 如帕金森疾病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、遗传性退化共济失调、神 经病、亨廷顿疾病、癫痫和老年性痴呆。另外，由于增强的红细胞生 成素的表达的正调节，本发明的物质可用于其中EPO起(保护)作 用的任何病理过程(比如中风、和任何形式的急性和慢性组织缺氧)。

根据本发明，基于细胞的HTS分析功能受体的激活，测定酶的互 补作用，被证实可用于获得分子之间关系的基础信息。这种分析是基 于GPCRs的一般调控机制，测定激活的受体和β-(视紫红质)抑制蛋 白之间的相互作用。失活的β-半乳糖苷酶片段互补融合到受体的C- 端和β-(视紫红质)抑制蛋白。所述受体活化恢复β-(视紫红质)抑制蛋 白，这使得两个半个的β-半乳糖苷酶连在一起，导致有活性的β-半 乳糖苷酶，它可转化作为测定信号(ICAST系统)的相应的底物。原 则上任何能表达为两个互补的一半的融合蛋白形式并能进行根据常规 方法记录的底物反应的酶都能应用上述分析。

本发明进一步涉及本发明序列的治疗用途，也就是本发明核酸序 列或蛋白序列的用途，特别是序列1-4或5-8的核苷酸序列或蛋白质 序列，或如上限定的变异体，特别是片段的用途，用于哺乳动物的基 因治疗如人、或其他的基因治疗方法。基因治疗包括任何形式的治疗， 或者是导入如权利要求1-4中任何一项的本发明序列到身体或其部分 如个体组织，或者影响本发明序列的表达。因此，任何本领域技术人 员熟知的修饰都可以在基因治疗中使用，比如寡核苷酸(如反义或杂 交RNA-DNA寡核苷酸)，包括任何含有本发明序列的修饰物都可以 使用。也可以使用包含本发明任何序列(包括任何变异体如片段、异 构体、等位基因、衍生物)的病毒构建体。相应的本发明的裸DNA 序列也适用于基因治疗。同样的，基因治疗也可以使用具有酶活性(例 如核糖酶)的核酸片段。

除了治疗用途，本发明的核酸或多肽、蛋白异体和由其衍生的本 发明试剂(寡核苷酸、抗体、肽)都可以用于诊断，如诊断人体病症 或基因遗传缺陷。所述的病症或基因遗传缺陷特别是指上述治疗用途 中涉及的紊乱，特别是神经疾病或免疫疾病或肿瘤。诊断方法可在体 内进行，不过一般都不在体内进行。本发明的典型非体内诊断用途是 在生物样本中定量和/或定性检测本发明核酸。此方法优选包括如下步 骤：(a)温育包含已知量本发明核酸或适用于扩增本发明核酸的已知量 寡核苷酸引物的生物样品，(b)通过特定的杂交或PCR扩增检测本发 明核酸，(c)比较杂交核酸的量或PCR扩增得到的核酸的量与数量标 准。

而且，本发明涉及在生物样本中定量和/或定性检测本发明蛋白异 体或本发明蛋白的方法，它包含如下步骤：(a)温育包含特异性针对本 发明蛋白质异体或蛋白质/多肽的生物样品，(b)检测抗体抗原复合物， (c)比较抗体抗原复合物的量与数量标准。标准通常是来源于正常有 机体的生物样本。为了诊断目的，特别是应用本发明基因如ee3_1基 因的特性，在特定病理生理学的刺激(中风、心肌梗塞、肿瘤等)后， 胞内本发明序列的mRNA的量发生变化如增强。因而根据本发明， 可以预测(诊断)伴随本发明蛋白质表达量的变化的疾病(如中风)，进 行成功的治疗的评估或疾病的分类。最后，本发明的方法也可以用于 监测上述疾病的治疗。

本发明序列可用于如在人体中测定所述序列多态性的方法。测定 本发明序列多肽性不但作为本发明公开的一部分，而且可以作为诊断 的预测标记或诊断与本发明序列的无活性表达、本发明无活性序列的 表达和/或过量表达相关的疾病的遗传缺陷。另外，用本发明序列可以 研究人类遗传疾病，包括单基因和多基因疾病。

除了在人和/或兽医(学)的治疗和/或诊断用途外，本发明的核酸或 多肽也可用于科研用途。特别是，本发明序列允许在单细胞或多细胞 有机体中用本领域技术人员所知的方式鉴定相关序列，比如用cDNA 文库，或在人类基因组中定位相关序列。本发明核苷酸序列，特别是 序列1-4(包括任何变异体)，都可以应用一般的方法通过同源筛选， 如用于老鼠或其他动物基因组和人类基因组中用于分离、绘图和与标 记联系在一起编码所述核酸或功能等价物、同源物或衍生物的人类遗 传疾病基因mRNAs。这个过程允许，比如，人体中ee3族序列的染 色体座位(染色体2(2q14.2)、X染色体(Xq28，座位编号：84548)、 染色体5、染色体8、染色体3、染色体7)与特定表型即遗传疾病联 系在一起，特别是肿瘤(如肝细胞肿瘤)，因此大大简化了诊断所述 疾病和使得出现新的治疗方法成为可能。本发明的蛋白也是同样的。

因此，借助于本发明地核酸序列可以诊断人类遗传疾病，包括单 基因和多基因疾病，结果是所述的核酸用作本发明遗传疾病的诊断方 法的标记。

本发明特别公开了用于科研用途的基于本发明的氨基酸和/或核苷 酸序列的分析系统。与此相关，cDNA、基因组DNA、本发明核酸序 列调控元件和多肽及其重组或其非重组形式的片段被用于分析系统。 这样的本发明分析系统特别适合于测定启动子或蛋白在待测物质存在 下的活性。优选的所述分析系统包括可以快速测定大量待测物质的简 单测量方法(比色法、光度计法、荧光或同位素法)(Bhm，Klebe， Kubinyi，1996，Wirkstoffdesign(药物设计)，Spektrum-Verlag， Heidelberg)。分析系统可以用化学文库来筛选抑制或激活的方式作用 于本发明蛋白质，特别是序列5-8(及其衍生物或片段)的物质。鉴 定这样的物质是鉴定新的特异性作用于ee3相关信号传导的药物的第 一步。其中特别涉及提供运用了与G蛋白偶联的蛋白的特性的分析系 统，如下面公开的分析系统。

本发明蛋白(特别是如附图13、14、15A、15B、15C、16或18 中所示的蛋白)的生物活性的抑制，典型的是与细胞凋亡、繁殖、再 生、细胞生长相关的活性的抑制，如在中风、败血症性休克、GvHD (移植物抗宿主疾病)、变性疾病，特别是神经变性疾病，急性肝炎 或其他上述公开的症状中所希望的抑制，可通过本领域技术人员熟知 的方法导入至少10个核苷长度的寡核苷酸至感染的细胞，其中的寡 核苷酸编码具有序列5、6、7A、7B、7C、8和11的蛋白质序列的天 然序列的(一部分)反义链。由此阻断了在相应的转化细胞中本发明 ee3族蛋白(比如ee3_1或ee3_2)天然mRNA的翻译，这导致了转染细 胞存活能力的增强或对细胞生长、细胞可塑性和细胞繁殖的调节。其 中，上述方法也可以用重组病毒。

用核糖酶的方法也可以治疗基于相应的本发明序列失调(如上述 提到的指征)的疾病中的病理性增强的细胞凋亡和细胞繁殖。对此使 用能剪切靶mRNA的核糖酶。既然这样，本发明公开了涉及并公开 了能裂解天然ee3(比如ee3_1或ee3_2)-mRNA的核糖酶。本发明的 核糖酶必须能与本发明目的靶mRNA相互作用，如通过碱基配对， 然后裂解所述mRNA以阻断如ee3_1或ee3_2的翻译。本发明的核糖 酶经合适的载体导入目标细胞中(特别是质粒、修饰的动物病毒特别 是逆转录病毒)，其中所述的载体除了任选具有其他序列以外，含有 本发明核糖酶cDNA序列。

调节本发明基因产物，特别是根据附图13、14、15A、15B、15C、 16或18的基因产物的生物活性，典型地调节本发明基因产物在凋亡 或坏死、繁殖或生长-指示信号传导中的活性，除了上述可能性外，也 可以借助于本发明其他的主题。本发明化合物可以调节，典型地抑制 或激活特别是本发明ee3族蛋白的胞内功能或在基于本发明DNA序 列的水平上，比如通过结合DNA(比如启动子区域)或结合任何控 制本发明基因的转录因子而影响的生物活性。本发明化合物典型的都 是特异性结合本发明蛋白，特别是具有序列1-4的序列的蛋白或本发 明核酸序列，特别是序列5-8的核酸序列，因而产生一个药理学的特 别是神经保护或免疫调节或抗凋亡或抗繁殖的作用。

因此。本发明公开了化合物，优选为有机化合物，其分子量小于 5000，优选为小于3000，更优选为小于1500，其具有好的生理耐受 性和能较好的通过血-脑屏障。需要的话，所述化合物可以是组合物的 一部分，所述组合物至少含有一种其他活性化合物和优选含有辅料和/ 或添加剂，而且可以作为药物应用。特别优选能与本发明蛋白结合， 特别是与本发明蛋白的C-端、胞质区或胞外区结合的结合常数至少为 107mol-1的有机分子。本发明化合物优选的是能以扩散或膜(内)运 输蛋白的方式通过细胞膜，需要的话，其在作了合适的修饰后比如连 有AA序列。进一步优选的是那些能抑制或增强本发明ee3族蛋白与 结合配偶体的相互作用，特别是关于凋亡或坏死、繁殖或生长指示或 再生信号的传导的化合物。这样的化合物占据了特别是本发明蛋白的 表面位点或导致本发明蛋白的局部构像变化，以阻断本发明蛋白的天 然结合配偶体的结合。

经过本发明蛋白的结构分析可有针对性地发现具有特异性结合亲 和性的本发明化合物(Rationales Drug Design(Bhm，Klebe，Kubinyi， 1996，Wirkstoffdesign，Spektrum-Verlag，Heidelberg))。在此，任何 本发明蛋白(特别是具有序列5-8的蛋白)的结构或部分结构、衍生 物、等位基因、异构体或其的一部分，可以通过NMR-或X-射线晶体 分析方法(如按照“悬挂液滴”法)鉴定，如果无法获得高分辨率的 结构，可根据结构预测算法(比如也根据同源蛋白(如视紫质)的已 知结构)建立本发明蛋白结构模型，所述结构或结构模型结合分子模 型程序可用于鉴定可作为拮抗剂或激动剂的化合物，以可预测与本发 明蛋白具有高亲和性的化合物。需要的话，上述定义的方法可以相互 结合用于结构分析。合适的力场可以用来模拟潜在亲和性的化合物与 感兴趣的本发明蛋白的亚结构(比如活性中心、结合腔或铰链区)的亲 和力。然后合成这样的物质并用合适的方法测试其结合能力和他们用 于治疗的可用性。这种用硅胶方法鉴定显示具有与本发明ee3蛋白结 合的潜在活性化合物同样是本发明的主题。

在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明化合物是一种抗体， 优选的是抗本发明ee3族蛋白(比如ee3_l、ee3_2或ee3_5)的抗体， 或抗基于的mRNA的抗体，其中抗体通过非体内方式导入、重新移 植的宿主细胞或通过体内基因治疗的方法导入宿主细胞并在那里不作 为“细胞内抗体”分泌但是发挥其胞内作用。这样的本发明胞内抗体 可以保护细胞免于错误指导的凋亡反应，比如过量表达本发明蛋白。 这样的过程一般适合于那些组织的细胞，其中的组织在患者体内显示 出病理生理学的过量凋亡行为，即，比如胰腺细胞、角化细胞、结缔 组织细胞、免疫细胞、神经元或肌细胞。除了抗体或胞内抗体 (intrabodies)以外，通过这种方式用本发明胞内抗体基因治疗修饰的 细胞也是本发明的一部分。

本发明的化合物，其具有阻断作用，需要的话，激活本发明天然 ee3蛋白的生物活性，比如序列5、6、7A、7B、7C、8和11，或相 应的天然等位基因或天然剪切的变异体，比如凋亡作用，可以用做药 物。此处的化合物包括任何上述变异体，也就是，比如有机化合物、 抗体、反义寡核苷酸、核糖酶。本发明化合物特别适合于(制备药物) 治疗疾病，特别是神经疾病、免疫疾病或增殖疾病。因而，可将本发 明的天然蛋白，特别是一种具有序列5-8的蛋白或其天然变异体的细 胞功能抑制剂(如抑制作用的抗体(特别是胞内抗体)、核糖酶、反 义RNA、显性阴性突变体或上述之一，任选的抑制性有机化合物， 优选高亲和力的化合物，如用上述方法获得的化合物)，比如凋亡反 应的抑制剂作为药物和特别是用于治疗下述疾病或制备治疗下述疾病 的药物：心肌梗塞，心力衰竭，原发性心肌症，心肌炎，心包炎，心 包心肌炎，冠心病，左右分流先天性心脏病，法乐四联症/五联症， Eisenmenger综合征，中风，末端灌注不足，动脉闭合症(AVK)，外 周动脉闭合症(PAVK)，颈动脉狭窄，肾动脉狭窄，脑中微循环紊乱 (小血管症)，大脑内出血，大脑静脉和窦血栓症，血管畸形，蛛网 膜下出血，宾斯旺格痴呆(biswanger’s disease)，皮层下动脉硬化性 脑病，栓塞引起的多重皮层梗死，脉管炎，糖尿病性视网膜病，不同 原因引起的贫血症连续症状(例如，再生障碍性贫血，脊髓发育不良 综合症，红血球增多症，巨红细胞贫血症，缺铁性贫血症，肾贫血症， 球形红细胞溶血性贫血症，地中海贫血症，血红蛋白病，6-磷酸葡萄 糖脱氢酶缺乏症，输血感染，恒河猴不相容疾病，疟疾，心(脏)瓣膜 移植，出血性贫血，脾机能亢进症)，肺纤维化，肺气肿，肺水肿：ARDS， IRDS，复发性肺栓塞。

肿瘤(例如，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌)，免疫系统疾病(例 如，自身免疫病，特别是糖尿病，银屑病，免疫缺陷病，多发性硬化 症，风湿性关节炎或遗传性过敏症，哮喘)，病毒感染性疾病(例如， HIV，丙型或乙型肝炎感染，细菌感染(例如，链球菌或葡萄球菌感 染)，变性疾病，特别是神经变性疾病，例如肌肉萎缩症，GvHD(例 如，肝，肾或心)，或其他神经系统疾病(特别是，但不限于下述疾 病：中风，多发性硬化症，帕金森氏症，蛛网膜下出血，肌萎缩性侧 索硬化，遗传退化性共济失调，亨廷顿氏病，神经病，癫痫症，脑组 织损伤，阿尔茨海默病)；肌松症(例如，肌肉麻痹)，内分泌疾病(例 如，骨质疏松症或甲状腺功能亢进)和皮肤病(例如，银屑病，神经 性皮炎)；控制锐痛或钝痛，遗传性疾病以及心理疾病(例如，精神 分裂症或抑郁症)，愈合伤口，改善性功能，心血管疾病(例如，局 部缺血性梗塞，心机能不全，心律失常，高血压)，提高大脑功能。

所有上述提到的症状领域都适合于应用本发明的基因产物或本发 明DNA序列制备药物。

上述提到的本发明物质也可以是药用组合物的组成部分，其可包 含其它的药用载体、辅料和/或添加剂，以例如稳定所述用于治疗给药 的组合物，提高生物获得性和/或药效。

本发明进一步涉及鉴定药物活性化合物的方法(筛选方法)，特别 是那些对于引起或传导本发明序列导致的生理学反应的信号具有抑制 特性的化合物。这样的药学活性化合物既可以在胞外端、TM区阻断 本发明受体(在此，比如，消弱二聚或多聚合化)，也可以阻断胞内 的信号传导，比如阻断或激活ee3蛋白和胞内信号传导蛋白的相互作 用，特别是影响(激活或抑制)胞内蛋白ranbpm和/或MAP1a/MAP1b 之间的相互作用。

本发明方法提供给(a)用权利要求5的表达载体转染的细胞，所 述表达载体特别是编码本发明多肽，比如具有序列5、6、7A、7B、7C、 8和11的多肽的表达载体，和任选至少一种编码至少一个报告基因的 表达载体；和(b)适用于观察本发明蛋白介导的功能的参数，比如 再生或增殖过程中的信号传导，特别是(a)获得的宿主细胞体系在 添加待测化合物后，与不加待测化合物的对照比较测定Caspase-3的 激活。对此，按照本发明方法优选用递增浓度的待测物质平行进行多 个实验，以在有药物活性的情况下能够测定例如待测物质的凋亡抑制 作用-ID50值。

Ee3蛋白的一级序列可以用作制备重组构建体，其运用了现有技 术中已知的GPCR的特性。因而可以，比如用本发明ee3蛋白的特定 序列区域替换已知的、良好表征的GPCR的特定序列。得到的构建体 可以用于通过用已知的配体或激动剂鉴定G蛋白偶联和所用的第二信 使系统，或使用已知G蛋白的偶联寻找配体、激动剂或阻断剂。比如 用于上述用途的本发明的嵌合受体的制备，例如可根据Kobilka等人 所述的方法(将这种方法包括在本发明公开中)(Kobilka BK，Kobilka TS，Daniel K，Regan JW Caron MG，Lefkowitz RJ(1988)Chimeric alpha 2-，beta 2-adrenergic receptors：delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity.Science 240：1310- 1316)。

根据本发明进一步可以使用ee3族的组成型活性受体突变体，以 表征所述受体对于信号传导途径的影响和用于筛选配体。作为代表性 的7TM-蛋白类的本发明受体可以特定方法突变，使得所述受体的生 理学的和药理学的行为发生变化。这可以例如当天然配体或一种激动 剂是未知的时候，用于鉴定胞内信号传导途径。特别适合的是在ee3 蛋白DRI恒定区进行这样的突变，比如DRY序列的R突变为Lys、 His、Glu、Asp、Ala、Asn和Ile(Scheer A，Costa T，FanelliF，De Benedetti PG，Mhaouty-Kodja S，Abuin L，Nenniger-Tosato M， Cotecchia S(2000)Mutational analysis of the highly conserved arginine within the Glu/Asp-Arg-Tyr motif of the alpha(1b)-adrenergic receptor：effects on receptor isomerization and activation.Mol Pharmacol 57：219-231)导致在突变为Lys时组成型活性很大的增强。 突变为His或Asp则导致组成激活较小的增强。有趣的是，突变为Arg 增强激动剂的亲和力，因此这些突变体也是HTS筛选所感兴趣的。

同样地，在第三个TM区的保守的Arg是突变的可能位点 (Ballesteros J，Kitanovic S，Guarnieri F，Davies P，Fromme BJ， Konvicka K，ChiL，Millar RP，Davidson JS，Weinstein H，Sealfon SC (1998)Functional microdomains in G-protein-coupled receptors.The conserved arginine-cage motif in the gonadotropin-releasing hormone receptor。J Biol Chem 273：10445-10453)。

或者，基于应用固定化的本发明受体的方法可以用于鉴定内源性 或替代配体。因而本发明ee3族的受体可以与GST、Flag标签或TAP 标签作为融合蛋白表达，正如本发明公开的。相应的细胞或者是根据 一般方法处理得到膜或直接用于溶解。合适的清洁剂，比如十二烷酸 麦芽苷(maltoside)、洋地黄皂苷、胆酸盐、或清洁剂混合物，都可以 用于溶解受体，然后连接到相应的亲和性基质，如GST Sepharose、 抗-Flag-M2-琼脂糖或IgG Sepharose等。冲洗基质后，与组织提取物 或细胞上清液一起培育，然后又清洗。如果提取物含活性配体比如肽， 则所述配体与固定化的受体结合，在洗脱后可以用分析方法比如质谱 法鉴定。

根据本发明，所谓的“内化分析”代表另外一种过程，可以鉴定 本发明受体(比如ee3_1)的天然或特别是替代配体。在此也运用到 GPCR类蛋白的不同的特性。比如可以运用GPCR类蛋白的内化行 为。这可以理解为激活受体后的调控机制。基于内化行为的筛选方法 有不需要特定受体的详细生理学知识的好处。特别是，不需要用到偶 联G蛋白和所用的信号传导途径的知识。

比如lenkei等(2000，J Histochem Cytochem，48，1553-64)描述 了这样的一种分析，根据本发明其类似地也可用于本发明的受体。对 此，根据本发明，首先制备本发明蛋白与EGFP的C-端融合构建体。 然后就可以根据标准方法制备稳定的CHO细胞。根据EGFP荧光借 助FACS分类子挑选出稳定的克隆。借助荧光-显微镜判断表面表达进 行最后的选择。然后将细胞与组织提取物的HPLC级分一起培育，用 共聚焦显微镜测定内化。根据荧光信号的细胞中心距离原则，借助形 态度量的软件(NIH图像)进行评估。频率/距离分布对所述内化进 行了较好的鉴别。

为了找到未知的配体，进行连续的分级分离以分出纯的相应的肽， 然后比如通过测序或MALDI-TOF进行鉴定。Ghosh(2000， Biotechniques，29，170-5；Conway等人，1999，J Biomol Screen，4，75-86) 等描述了原则上相同方法的另外的应用。将这两种全部引入本发明作 为本发明公开的一部分。

然而，也可以使用功能性Ca分析鉴定配体和/或任选表征本发明 的受体。根据本发明，在HEK293细胞、CHO细胞或其他细胞中产 生的多种7TM受体(带有7个跨膜区的受体)通过与Gq类G蛋白 偶联，激活PLC和释放胞内Ca。如果本发明的某些受体与Gq类G 蛋白不偶联，则所述受体可以通过共表达嵌合G蛋白或相对地与受体 非特异性偶联的G蛋白G15或G16经由PLC，即Ca释放产生信号 传导。本发明ee3族受体典型地在HEK293和CHO细胞中既可以稳 定地也可以瞬时地、单独和与嵌合G蛋白Gqi5或者与G蛋白Gq15 一起表达。所述细胞优选用能透过膜的Ca-结合荧光染料比如Fura-2 或Fluo-3或-4负载，并在冲洗细胞后，加入各种待测物质，同时测定 Ca释放，比如用Molecular Device公司的FLIPR设备。最后，在(仅 用载体转染的)对照细胞中测定显示阳性信号的待测物质，如果发现 信号是特异性的，则进行药学上表征，即通过剂量-应答曲线。

另外，可以通过其他的Ca测试法测定配体引发的Ca-应答，比 如Euroscreen的 AequoScreen(Brüssel，Belgien；参见例如 http：// www.pharmaceuticaltechnology.com/contractors/compound_ma n/euroscreen/)。其中用到表达水母发光蛋白部分蛋白基因的细胞。在 用与水母发光蛋白结合的Coelenterazin处理细胞后产生水母发光蛋 白。如果配体引发Ca释放，所述的Ca激活水母发光蛋白氧化 Coelenterazin，由此发光。发射光的强度与胞内Ca浓度的增加成比 例，由此可用于测定发现的配体的活性(考虑相应的对照)。

为了鉴定本发明的拮抗剂，在足够高浓度的各种配体存在下用已 知的激动剂刺激受体。与对照(只是激动剂，没有其他配体)相比信 号的改变，例如Ca信号的降低，显示竞争性拮抗剂。

此外，也可以应用cAMP分析用于表征本发明的ee3族受体和用 于鉴定配体。关于用于本发明ee3受体药理学表征的方法和用于鉴定 配体(激动剂或拮抗剂)的基础是GPCRs类受体的特性，也就是说， 例如，本发明蛋白以刺激或抑制方式作用于腺苷酸环化酶，通常是激 活“激活Gs”或“抑制Gi”蛋白。根据待测物质的作用，例如在高 通量筛选中，可以通过直接或间接的测定相关联的胞内cAMP水平的 变化。对此涉及在哺乳动物细胞中稳定或瞬时表达受体基因(见实施 例2)。在激活腺苷酸环化酶的GPCRs情况下，通过细胞中cAMP水 平提高，通过与对照细胞相比cAMP浓度的增强可以鉴定待测物质中 的潜在的激动剂。待测物质中的拮抗剂，例如在HTS方法中，是通 过他们阻断激动剂引发的cAMP浓度的增加而测定的。至于本发明Gi- 偶联的ee3受体，在测定中或者直接用毛喉素刺激腺苷酸环化酶或通 过刺激激活Gs-偶联受体而提高cAMP水平。Gi-偶联受体的激动剂抑 制这种提高。一些商业上可获得的分析，例如Amersham公司的 cAMP[3H]分析体系可以用于直接的cAMP测定，它是基于在例如通过 添加同位素(氚)标记的cAMP竞争性取代内源性产生的cAMP的原 理。间接的cAMP测定通常通过报道分子分析的方式进行。为此，在 含有报道分子系统，例如CRE-荧光素酶系统的细胞系中表达受体。 cAMP激活荧光素酶的表达，荧光素酶的活性由其转化相应的底物和 产物的荧光测定法来测定。报道分子分析特别适用于大规模的筛选方 法。

最后，除了上述方法外，根据本发明也可以使用下面的分析系统 来表征本发明受体的第二信使系统和/或鉴定本发明ee3受体的配体， 根据本发明特别是根据Salomon(Salomon等人，(1979).Adv.Cyclic Nucleotide Res.10，35-55)测定细胞内或膜的腺苷酸环化酶活性，以 测定肌醇-3-磷酸的浓度或测定花生四烯酸释放的变化。例如，可以在 普通细胞系中过量表达ee3_1并通过用组织提取物激活后测定上述第 二信使系统的活性。个别地，本领域技术人员熟知的GPCR类的第二 信使系统的分析，有的也可以在文献中找到，例如Signal Transduction：A practical approach，G.Milligan，Ed.Oxford University Press，Oxford，England。用于筛选的其它报道分子分析包 括MAP激酶/荧光素酶和NFAT-荧光素酶系统。

基于本发明的发现，即ee3受体信号传导也可以通过MAP激酶 信号传导途径传导，可以开发筛选分析方法来寻找配体或鉴定抑制 剂，例如通过NF-kB报道分子系统或荧光素酶系统。

正如上面所述，第二信使的激活也可以用于鉴定与本发明受体结 合的配体、激动剂或拮抗剂，其中可以显示其对某些胞内过程的激动 和/或阻断作用。例如，微量生理功能测定仪可以用于鉴定配体、激动 剂或拮抗剂。Ee3族受体与配体结合引发的信号代表能量消耗的过程。 因而，这样的过程总是伴随着微小的代谢变化，尤其是微小的pH移 动。例如，所述的变化可以通过微量生理功能测定仪(细胞感受器， Molecular Devices)胞外纪录。

在鉴定与本发明ee3族受体蛋白具有结合潜力的配体、激动剂或 拮抗剂后，根据本发明通过配体结合实验可以进一步的表征。配体结 合实验使得可以直接测定受体的药理学，即各种配体对所述受体的亲 和性。对于结合研究，典型的是对通过上述方法之一鉴定的或其他方 式已知的化学纯的配体进行强特异性活性(30-2000Ci/mmol)的同位 素标记，使这样的标记不会降低关于配体对所述受体的活性。优化对 于用于表达受体的细胞以及与由此制备的膜有关的缓冲液组成、盐、 调节剂(例如核苷酸)或稳定剂(如甘油)的测试条件，以得到可用 的信号-背景比率。对于这些结合实验而定义特异受体结合为与受体制 备物(细胞或膜)相关连的不同的总的放射活性，也就是说，只在特 异的同位素配体存在下测定与在同位素配体和过量的非同位素标记的 配体存在下测定放射活性的差别。其中未标记的配体竞争性取代同位 素的配体。可能的话，为了测定非特异结合使用至少两种化学不同的 竞争性配体。合适的特异结合占总结合的至少50％。结合实验要么是 不均匀的如过滤实验，要么是均一的如闪烁亲近测定法。

在第一种方法中，将包含受体的制备物(细胞或膜)与配体在合 适的缓冲液中温育直到达到结合平衡，典型的为在RT下1小时和4 ℃过夜，然后用合适过滤器过滤，例如Whatman或Schleicher&Schuell 的任选经过预处理的玻璃纤维过滤器，例如用聚乙烯亚胺过滤，以将 结合的同位素配体与未结合的分开。清洗过滤器后，在干燥或在湿的 状态，用合适的闪烁剂处理和可能需要的培育后，用闪烁计数仪测定 放射活性。在闪烁亲近测定法中，在合适的缓冲液中温育合适的闪烁 珠子(例如WGA珠子)和配体和包含受体的膜直到达到结合平衡， 然后用合适的闪烁计数仪测定放射活性。两种结合实验都可以HTS 形式进行。

溶解的或纯化的受体的测定可以采用闪烁亲近测定法或用普通非 均相测定法例如PEG沉淀后的过滤实验、吸收实验或凝胶过滤实验 (Hulme E，Birdsall N(1986)Distinctions in acetylcholine receptor activity.Nature 323：396-397)。

代替同位素配体，也可以使用荧光配体例如与荧光染料(例如 BODIPY)共价结合的配体。荧光配体与受体结合的测定是通过荧光 偏振进行的。这种方法也适用于HTS形式的初步筛选和二级分析。

此外，在一个优选的实施方案中，本发明进一步公开了鉴定配体 (激动剂或拮抗剂)的高通量筛选方法(HTS)，特别是鉴定本发明ee3 序列的抑制剂。对此，特别优选使用MAP信号传导途径中的(所有 已知的)元件，以在本发明方法中鉴定抑制剂，特别是鉴定小的有机 化合物。优选的系统是包含闪烁亲近测定法(SPA)(Amersham Life Science，MAP kinase SPA(s.McDonald等人，1999，Anal Biochem，268， 318-29)。将所述文献全部引入作为本发明公开的一部分。在此，在体 外构建MAP级联，用GST融合蛋白(E.coli表达)的一部分或在cRAF1 情况下用杆状病毒系统制备。为了可靠的测定抑制剂，级联反应 (MAP-KKK)的第一个元件必须恒久和平稳地激活。这通常在杆状 病毒系统中以与src共表达的方式进行，由此保证ras类似物激活 cRaf。在用本发明核苷酸序列转染后，进行级联反应的调节，以能在 HTS中测定通过加入待测物质测定对所述调节的影响。

在用本发明上述方法鉴定高亲和力的选择性物质后，测试所述物 质作为药物治疗癫痫、中风和其他神经的、免疫的或增殖的疾病(肿 瘤)的用途。除此之外，通过用酵母双杂交系统或其他测定方法可以 确定所鉴定的和药理学上有活性的物质与本发明ee3基因产物，特别 是序列5、6、7A、7B、7C、8和11的结合位点，也就是说，限定参 与相互作用的氨基酸，例如天然蛋白之间的相互作用。在下一个步骤 中可以鉴定具有高亲和力的物质(替代配体)，这种物质特异性结合 事先已通过本专利申请描述的筛选方法鉴定的负责天然相互作用部分 (结构区)的氨基酸。这样，也可以发现影响特别是抑制本发明多肽 和其可能的天然胞内相互作用配偶体的物质。由此，本发明公开了利 用与本发明蛋白具有特异性结合亲和力的物质的发现方法。对此，特 别的参考文献如Klein等(1998，Nat Biotechnol，16，1334-7))描述的 方法。此外，也可以应用属于G蛋白偶联受体(与G蛋白偶联，传 导信号)的本发明蛋白的已知特性以鉴定本发明的抑制剂。

由于ee3族，特别是ee3_1和ee3_2序列，和/或它们天然变异体 的本发明基因或本发明基因产物在治疗例如神经变性、增殖，特别是 肿瘤的疾病(肿瘤，例如实体瘤(肉瘤(皮肤肉瘤(Kaposi肉瘤)、 母细胞瘤、肝癌、肠癌、胰腺癌、胃癌或肺癌)或造血系统的肿瘤， 特别是淋巴瘤或白血病)，或低凋亡或高凋亡疾病等疾病的药理学上 的重要性，根据本发明方法鉴定的药理学上有活性的物质具有很广泛 的用途。除了抑制与一种或更多种其他分子的相互作用，例如在信号 途径中下游蛋白激酶或调节剂(Adaptoren)，特别是也可以用于影响本 发明蛋白在细胞中的转录或转录的量，这就是药理活性的基础。例如 可提及的一个例子是通过本发明化合物抑制病理过程后本发明DNA 序列转录的快速正调节，特别是通过转录激活的快速调节。药物活性 物质的优选靶标是调节转录，例如所述物质通过特异性结合本发明基 因产物的调节区(例如启动子或增强子序列)，结合本发明基因产物 的一个或更多个转录因子(导致激活或抑制所述转录因子)或调节这 样的转录因子(转录或翻译)本身的表达。

除了转录调节，即调节细胞中本发明基因的mRNA的量以外，本 发明药物活性的化合物也可以干涉其他胞内控制过程，这些过程例如 影响本发明蛋白的表达比率(例如翻译、剪切过程、本发明基因产物 的天然衍生物例如磷酸化，或调节本发明基因产物的降解。

本发明进一步涉及鉴定本发明ee3族多肽，即特别是是蛋白 ee3_1、ee3_2或ee3_5和/或它们天然的变异体(异构体、等位基因、 剪切形式、片段)的胞内相互作用配偶体的方法。用这种方式可以鉴 定蛋白的相互作用配偶体，其对本发明蛋白具有特异性结合亲和力， 或鉴定编码对本发明蛋白具有特异性结合亲和力的蛋白的核酸。本发 明ee3蛋白类的蛋白的胞内相互作用配偶体的例子有其他的GPCRs 或离子通道。

优选单独使用酵母双-杂交筛选方法(y2h筛选)或与其他生物化 学方法联合实施这类本发明的方法或应用本发明所述多肽、核酸序列 和/或核酸构建体实施这类方法(Fields and Song，1989，Nature，340， 245-6)。Van Aelst等人(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6213-7) 和Vojtek等人(1993，Cell，74，205-14)也描述了这种筛选方法。通常， 也可以如Luo等人所述(1997，Biotechniques，22，350-2)，使用哺乳动 物系统代替酵母系统来实施本发明所述的方法。前面所述的试验方法 利用了GPCR蛋白家族的典型性质，例如，经由G蛋白，即已知的 细胞内相互作用配偶体，介导的信号转导。

对于y2h筛选，例如将本发明序列，特别是序列1-4或其天然 变体的开放阅读框，更优选本发明序列的胞内区，例如ee3_1或ee3_2， 克隆到具有GAL4结合域的所谓“诱饵载体”(bait vector)中(Clontech 公司的pGBT10或pGBKT7)。可以根据已知的方法用所谓的“捕获 文库”(prey library)在酵母菌中搜索相互作用蛋白。另外，y2h系 统也可用于实施所谓的“定位试验”(mapping experiments)，以确定 特异性的相互作用区域。

在双杂交系统中，也优选使用其它融合配偶体或其它细胞系，例 如Stratagene公司的BacterioMatch系统或Stratagene公司的 CytotTrap系统。作为y2h筛选方法的另一种形式，也可以如本发明 所述，使用相应的哺乳动物细胞系，例如Luo等人(1997， Biotechniques，22，350-2)所描述的，将该文献引入本文作为本发明 公开的一部分。

如本发明所述，也可以利用免疫共沉淀反应，从用本发明所述表 达载体转化的细胞中分离相互作用物质，以纯化与之结合的蛋白，随 后通过蛋白测序方法(例如，MALDI-TOF，ESI-tandem-MALDI) 确定该蛋白相应的基因。

本发明进一步涉及酵母双杂交系统或现有技术中已知的类似方法 或其它生化方法的应用，以确定本发明ee3蛋白和/或其天然变体的相 互作用区域，以及所述相互作用区域(天然序列的片段)在药物治疗 干预中的应用。

本发明还提供了鉴定ee3族内源性或替代配体，即具有与本发明 ee3家族受体相结合功能的非天然化合物的方法，该方法通过应用以 下起始物质的试验进行：(a)应用各种各样的组织提取物和细胞培养 上清夜，所述组织或细胞可以是预先以促红细胞生成素之类的物质处 理过的，然后将提取物分级，并用每个级分再进行试验，直到分离出 配体。(b)利用商品化物质库，例如Sigma公司的LOPAC。该物质 库包含孤儿受体的可能配体，特别是(神经)递质、生物活性肽、激 素、化学激素和其它天然存在的物质，根据现有技术，这些物质能够 与7TM受体相结合，因此它们也有可能与本发明的ee3家族受体相 结合。(c)使用组合的肽文库。或(d)使用组成成分差异较大的商 品化物质库。

EPO对例如ee3_1的正向调节作用说明ee3_1与细胞存活相关， 因为EPO具有神经保护作用。因此，本发明的多肽，特别是应对其 生物学功能进行研究的它们的天然形式或其它非天然的、人工产生的 变体，可如本发明所述用于凋亡试验或用于研究本发明多肽在诱导、 转导或抑制细胞死亡信号或其它细胞生理过程中的功能和/或效率的方 法中。可以通过用含有本发明ee3序列，特别是序列1-4，或其变体 的表达构建体转染真核细胞，然后可以研究凋亡的诱导，从而来研究 本发明ee3家族的蛋白或前文所述的变体在例如凋亡级联过程中的参 与情况(因此，本发明也公开了他们在这类研究中的应用)。这例如 可通过用Annexin(Roche Diagnostics)进行染色，通过识别Caspase-3 活性形式的抗体(New England Biolabs)或通过识别DNA-组蛋白片段 的ELISAs(细胞死亡ELISA，Roche Diagnostics)。所述的凋亡诱导 对细胞型是任选特异性的，所以本发明优选方案中研究了多个细胞系 和初级细胞。凋亡诱导对刺激物也是任选特异性的，所以在优选方案 中，本发明所述的方法采用了多种应激条件作为基础，例如热冲击、 缺氧环境、细胞因子(如IL-1，IL-6，TNF-α)或H2O2处理。适用 于本发明所述方法的典型细胞都是一些常规的细胞系，例如COS细 胞，HEK细胞，PC21细胞，THP-1细胞或初级细胞，例如神经元细 胞、星形胶质细胞，以及根据需要使用的其它无限增殖的初级细胞。

本发明进一步涉及本发明的核酸、核酸构建体或基因产物用于实 施增殖试验和/或用上述本发明物质进行类似方法的应用。与前面所述 的凋亡试验相类似，可以通过用含有本发明ee3多核苷酸，例如ee3_1 或ee3_2，或其相应变体的表达构建体转染真核细胞，并且随后利用 软琼脂试验(Housey等人，1988，Adv.Exp.Med.Biol.，234，127-40)， 研究例如肿瘤发生的诱导，来研究ee3序列，特别是ee3_1或ee3_2， 及其天然或非天然变体在细胞生长、细胞周期或肿瘤生成转化过程中 的参与情况。优选的细胞类型是一些常规的细胞系，例如COS细胞， HEK细胞，PC12细胞，THP-1细胞或初级细胞，例如神经元细胞， 星形胶质细胞，也可根据需要使用其它无限增殖的初级细胞。尤其可 以利用本发明所述的方法研究本发明基因产物在ras-信号传导通路中 的功能，研究本发明基因产物与ras信号传导通路中的其它成分的相 互作用，特别是在增殖过程中的相互作用。

本发明进一步涉及权利要求1-4任一项所述的DNA序列或权利要 求8-10任一项所述的基因产物作为自杀基因/自杀蛋白在体内和体外 转化宿主细胞的用途。由于本发明蛋白具有凋亡信号转导和/或坏死信 号转导的生物学功能，所以有可能通过这种途径引发宿主细胞的细胞 死亡。对此，优选应用本发明的DNA序列和/或本发明的蛋白作为自 杀基因与启动子可操作的连接，该基因的转录只在需要时被抑制和被 激活。优选在基因治疗过程中，当患者细胞进行移植后，在体内或体 外靶向性的关闭转染细胞的导入。

总之，如本发明所述，在哺乳动物体系中鉴定了一种新的膜结合 G蛋白偶联受体家族(GPCRs)，它与现有技术中已知的受体家族有 明显的区别。本发明新的蛋白家族及其DNA序列的鉴定，由于它在 中枢神经系统中的分化调节作用，所以能够阐明和表征许多生理学和 病理生理学过程。

按照本发明，通过所述的EPO(直接或间接)诱导的ee3_1蛋白转 录的正向调节进行鉴定，这说明ee3_1的激动剂和拮抗剂可以促进或 取代EPO的作用，或对抗不希望有的作用。可能选择性的影响EPO 的特殊活性，例如，神经保护作用(如在神经变性疾病中)或脑功能 增强(如在痴呆症中)。

本发明提供的基因是一种新的小鼠或人的7-跨膜蛋白质，主要在 脑组织中表达。它是一种G蛋白偶联受体。

通过在EMBL序列数据库中进行同源检索，发现与A家族的 GPCRs有较远的相似性，尤其是肽受体方面。

另外，ee3_1通过下述神经性疾病模型非限制性或仅限制性地调 节：癫痫(海马，癫痫发作5期，发作后2h)，皮层中风(皮层，闭 塞2.5h和再灌注2和6h)，大鼠全身性缺血(整个脑组织，缺血后3 和6小时)。这显示了与立即早期基因相比，EPO调节的高度特异性。

以下面的附图详细说明本发明：

图1a表示的是Epo小鼠脑组织的转录分析结果。该图显示了DNA 阵列杂交试验的实验数据。以EPO转基因动物的信号(Y轴)对野 生型小鼠的信号(X轴)作图，所述信号是(相对)荧光信号。在斜 线上方的点代表EPO转基因动物脑组织中上调的基因产物。在斜线2 的上方有8个阳性信号(斜线2表示转基因动物EPO的过表达量是 野生型的2倍)。图1b表示的是微阵列试验结果，此图是以EPO转 基因小鼠脑组织ee3_1的(相对)诱导因子(右边)对野生型动物脑 ee3_1的诱导因子作图。野生型动物的诱导因子称为平均诱导值，是 从2个独立的杂交试验获得的。单位诱导因子对应于同种对照动物脑 中ee3_1的浓度，本发明序列的表达量几乎是对照的4倍。

图2显示了对小鼠的试验结果。该试验通过定量PCR (LightCycler)，证明了在EPO转基因动物中本发明的ee3_1以及α- 球蛋白基因产物的诱导增加，α-球蛋白基因产物在EPO转基因动物 中也同样地得到上调。数据代表来自6个脑组织的总RNA样品(转 基因鼠(tg)或野生型鼠(wt))。Y轴代表相对诱导率。与对照(相 对诱导率为1)相比，本发明序列诱导增加了11倍。

图3显示了在小鼠发育过程中(7，11，15，和17天的胚胎)以 及在各种成体组织中(脑，心，肝，肾，肺，骨骼肌，脾和睾丸)， 本发明ee3_1的表达。Y轴代表ee3转录的相对丰度。试验结果说明， 在所研究的鼠胚胎发育的各个阶段以及各个组织中，都比较普遍的存 在ee3_1的表达。

根据EST数据，ee3_2在小鼠胚胎癌，肾，肝，B细胞，肺，乳 腺和子宫中表达。

图4显示了人ee3_1、ee3_2和ee3_c5在成年人体组织(心，脑， 胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾和胰腺)中的表达。数据来自定量PCR 试验(LightCycler)。Y轴数值与图3的意义相同，揭示出在所研究 的组织中，也存在ee3家族基因普遍和平行的表达。ee3家族在肾和 胰腺中的高表达非常明显，而在脑和骨骼肌中的表达较弱。ee3_1和 ee3_2的表达基本相同，因此，可以推测这两种蛋白的丰余功能。

可以从人类的下列器官中发现含ee3_1序列的ESTs：脑，眼，生 殖细胞，心，肾，肺，胎盘，前列腺，胚胎，肾上腺，乳腺，大肠， 胃和睾丸。这说明了ee3_1序列在较宽范围内表达。在脑，结肠，心， 肾，肺，胰腺，甲状旁腺，前列腺，睾丸，子宫，膀胱，乳腺和皮肤 等器官，存在ee3_2的ESTs。

图5显示了在各种人肿瘤细胞系中，本发明人ee3_1表达的 Northern印迹试验结果。在所述Northern印迹杂交试验中，使用了 包含人ee3_1开放阅读框的小鼠探针。此图显示了人ee3_1-RNA转录 子的普遍的表达。

图6显示了ee3_1在(大鼠)脑组织不同区域的表达。同样的，ee3_1 在脑组织的不同区域广泛分布，在小脑和脊髓处的表达更强。以小鼠 ee3_1作为探针。下方的图是作为加样对照的溴化乙啶染色的凝胶图。

图7显示了在结构预测的基础上，并特别考虑了跨膜区(TM区) 后得出的ee3_1_m蛋白的拓扑模型。所述模型揭示了一个典型的GPCR 蛋白拓扑构象：有7个TM区(以水平并排的形式表示)，一个短的 胞外N末端(在第1个TM区上面)和一个胞内C末端(在第7个 TM区下面)。疏水性氨基酸以绿色显示。

图8列出了本发明蛋白ee3_1(“human pro”)、ee3_2和ee3_5的 蛋白片段与现有技术中已知的各种GPCR蛋白(如，dc32-bio， ccr5_human或dop21_human)的比对(序列比较)以及已知的GPCR 蛋白家族A、B和C的共有基序(见图8的cons fam A，cons fam B)。 “Pfam”是指蛋白家族并描述了一族蛋白的共有基序。所列出的共有 基序是由pfam数据库中得到的。很显然，本发明的ee3蛋白家族与 A家族的GPCR蛋白最相似。

与已知的GPCR蛋白相比较，人ee3_1和ee3_2的下述序列部分 特别能代表本发明蛋白家族的特点(氨基酸的序数号如图8所示)：AA 75-85，AA 129-135(特别是129位的甘氨酸和132位的丝氨酸以及174 位的甘氨酸)，AA193-200(特别是198位的甘氨酸)，260和261位 的氨基酸，308位的氨基酸(半胱氨酸)，334-340位的氨基酸，539 位的氨基酸(组氨酸)，608位的氨基酸(组氨酸)，611位的氨基酸 (天冬氨酸)以及从637位开始的整个C末端序列(特别是640-655 位之间的酸性基序，666-670的碱性基序和680-685的脯氨酸富集区)。

图9A显示的是本发明的小鼠DNA序列(序列1)，称做 ee3_c1(ee3_1)。该序列包含翻译区(所列出的所有序列都按照下面的 方式读取：从左向右，从上到下连续读，即从一行的结尾读向紧接着 的下一行的左端)。该序列区中的起始密码子和终止密码子用粗体表 示。图9B是本发明的另一序列，它是图9A所示序列的子序列(3′非 翻译区)。

图10显示的是本发明的小鼠DNA序列(序列2)，称做ee3_2， 也包含翻译区。该序列区中的起始密码子和终止密码子用粗体表示。

图11A显示的是本发明的DNA序列(序列3)，称做ee3_1， 包含翻译区，该序列区中的起始密码子和终止密码子用粗体表示。另 外，推测的多聚腺苷酸信号用粗体加下划线的形式表示。图11B和图 11C是编码本发明C末端截短蛋白的C端的另一种剪接体除了在两个 图中用粗体表示起始密码子和终止密码子外，图11B也包含强调的剪 接位点的共有序列。

图12显示的是本发明的人DNA序列(序列4)，称做ee3_2，包 含翻译区，该序列区中的起始密码子和终止密码子(分别是ATG和 TAA)用粗体表示。推测的多聚腺苷酸信号也用粗体表示。图12下 方的序列是第1部分序列的延续(第1和第2部分序列的重叠区，分 别在两个部分中用斜体表示)。

图13显示的是本发明的鼠氨基酸序列(序列5)，称做ee3_1。该 序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图9的DNA序列)。

图14显示的是本发明的鼠氨基酸序列(序列6)，称做ee3_2。该 序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图10的DNA序列)。

图15A显示的是本发明的人氨基酸序列(序列7)，称做ee3_1。 该序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图11A的DNA序 列)。图15B显示的是本发明的人氨基酸序列(序列7b)，称做 ee3_1b_h。该序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图11B 的DNA序列)。图15C显示的是本发明的人氨基酸序列(序列7c)， 称做ee3_1c_h。该序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的 图11C的DNA序列)。图15B和15C的序列是由图11A所示DNA 序列的另一种剪接体的氨基酸序列。

图16显示的是本发明的人氨基酸序列(序列8)，称做ee3_2。该 序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图12的DNA序列)。

图17显示的是本发明的人cDNA序列(序列10)，称做ee3_5。 该序列包含翻译区，该序列区中的起始密码子和终止密码子(分别是 ATG和TAA)用粗体表示。

图18显示的是本发明的人氨基酸序列(序列11)，称做ee3_5。 该序列是从N端到C端的连续序列(参照所基于的图19的DNA序 列)。

图19显示的是对小鼠脑组织中ee3_1进行定量PCR的试验结果。 对试验小鼠腹腔注射了5000U/kg体重剂量的促红细胞生成素(EPO)。 注射6h或24h后，灌注并进行试验。si-6-1和si-24-1分别代表试验 动物注射生理盐水6h或24h后；ei-6-1，ei-6-2表示注射EPO后6h； ei-24-1，ei-24-2表示注射EPO后24h。试验显示，ee3RNA的表达 量增加，并且是随时间增加的。由注射EPO的动物得到的数据与注 射生理盐水的小鼠的数据存在统计学显著差异(ANOVA，随后进行 Newman-Keuls post hoc检验)。

图20显示的是对小鼠脑组织水平方向切片的原位杂交图像。所使 用的带有放射性标记的探针是ee3_1.3as AACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCAT AGATGAGG。该探针使得ee3_1在小脑(ce)、海马(hc)、齿状回(dg)、 皮层(co)，特别是在内嗅皮层(ent)以及嗅球(olf)等处的表达可以被观 察到。相应的有义对照探针ee3_1.3s， CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCC CTTCGTT没有产生特异信号(未显示)。

图21显示的是抗人ee3_1蛋白C端的多克隆抗血清的制备。a： 在C端选择具有强抗原性的多肽表位(CLHHEDNEETEETPVPEP)。 b：免疫印迹说明在瞬时转染HEK293细胞中特异性的检测到ee3_1。 每次试验，用例如表达ee3_1_h_Nter_myc的构建体转染相同数量的 HEK293细胞裂解物。该构建体能够产生N末端融合了myc标签的 ee3_1蛋白。泳道1：用myc特异性抗体(Upstate Biotechnology(购 自Biomol Feinchemikalien GmbH)，使用时稀释到1∶2000)检测到的 N末端融合了myc标签的ee3_1蛋白。泳道2-8：用不同稀释度 (1∶500-1∶12000)的ee3_1特异性抗血清AS4163检测到的ee3_1蛋 白。抗血清能够非常灵敏的、特异性识别ee3_1特异性条带(约 35kDa)。泳道9：稀释成1∶500的相应的免疫前血清(PIS)，没有检 测到任何条带。

图22显示的是AS4163抗血清对各种组织中的ee3_1的免疫组织 化学检测。A：体觉皮层中的V层神经元的特异性染色。B：A的放 大图。C：内嗅皮层的神经元。D：ee3_1在齿状回和海马CA3区的 表达情况。E：海马CA3区的放大图。F：ee3_1在海马CA3和CA2 表达的分界线。G：小脑，对浦肯野细胞层和小脑核进行了特异性免 疫组织化学染色。H：小脑浦肯野细胞。I：嗅球。J：大僧帽细胞(large mitral cell)的染色放大图。K：视网膜，其中的神经节细胞(ganglial cell)和感觉细胞(sensory cell)被染色。L：图K的放大图，视网膜 感觉细胞被染色。M：ee3_1在脊髓前角的运动神经元中的表达。N： ee3_1在三叉神经核运动核中的表达。O：黑质和网状部(pars reticulata)的染色。P：O图黑质的放大图。Q：ee3_1在肺部的神经 外表达。染色的是支气管碱性细胞和小动脉，venoles细胞未被染色。 R：典型的肺部支气管、动脉和静脉。S：支气管的放大图。在特异性 的、没有更详细定义的基底细胞中表达。T：微动脉管壁(左上)和 支气管管壁(右下)的放大图。U：小动脉的纵向剖面。内皮细胞和 血管壁个别平滑肌细胞被染色。V：小动脉横截面，对平滑肌细胞和 个别内皮细胞进行了免疫组织化学染色。W：具有隐窝和绒毛结构的 小肠。用抗ee3_1抗体染色基底隐窝部分。绒毛中的个别植物神经也 被染色。X：W图的放大图。Y：小肠壁的神经纤维，它属于小肠植 物性肠肌丛。Z：皮下脂肪/结缔组织的外周神经的横截面。AA：心肌， 其中神经纤维被特异性染色。BB：骨骼肌。图中央的免疫组织化学染 色与运动终板非常一致。右下方是肌束膜的外周神经纤维。

图23显示了野生型小鼠脊髓中ee3_1的免疫组织化学染色(图的 上部)与EPO过表达转基因小鼠(tg6)染色(图的下部)的比较结 果。同样的染色条件下，转基因小鼠的染色信号明显更强。每组试验 再使用两只小鼠，仍能证明该现象。

图24显示了小鼠中ee3_1和map1b的双免疫荧光。这两种蛋白 是作为y2h系统中的相互作用配偶体被检测到的。两种蛋白在中枢神 经系统的分布情况表现出惊人的一致性。绿色代表ee3_1染色，红色 是Map1b染色，黄色是两种信号的电子叠加。本图显示了来自脊髓 (sc)和小脑(cb)的样品。

图25显示了小鼠map1b基因突变体的免疫组织化学染色结果 (Meixner等人(2000)，J.Cell Biol.，151，1169-78)。结果表明，在map1b 纯合动物中，只能观察到痕量的ee3_1。A：海马，b：皮层，c：小脑。

图26显示了大鼠海马的成熟神经干细胞(nsc)中的ee3_1的PCR 结果。在阴性泳道(N)没有观察到信号。这些神经干细胞表达ee3_1。

图27列出了不同种属的ee3蛋白的比对结果，包括非洲爪蟾(X. Laevis)和斑马鱼(D.Rerio)的序列。

以下面的实施例详细说明本发明：

实施例1

ee3_1_m及其同源物的分子克隆和鉴别

(a)ee3_1_m的鉴别

在麻醉条件下穿心灌注后，取出促红细胞生成素过量表达的转基 因小鼠的脑组织并经液氮速冻。按照Chomczynski和Sacchi的方法 提取RNA(Anal Biochem(1987)，162，156-9)。根据Incyte的程序步骤， 在小鼠cDNA阵列(芯片)上进行2只转基因小鼠和2只同种对照小鼠 的杂交试验(参见http：//www.incyte.com/reagents/lifearray/lifearray service.s html)。这个试验还包括在两种不同标记的样品的辅助下进行 的竞争杂交试验(分别用Cy5和Cy3标记)。杂交试验产生了大量上 调序列。特别是，在重复试验中证实了EST克隆AA185432在Epo 转基因小鼠中同样发生了上调。与非转基因同种小鼠相比，相对诱导 因子为+3.9±0.1(图1)。应用LightCycler系统的定量PCR也证实了 所述上调(图2，正向引物：5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′， 反向引物：5′-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′)。

(b)ee3序列的克隆

在EST数据库BLANSTN检索的辅助下，扩展已识别的EST序 列。用这种方法鉴定了另一个小鼠同源序列ee3_2_m。使用合适的程 序(BLAST，TBLASTN)进行同源检索，有可能在EST和基因组数 据库中识别人类的同源序列(ensembl)。

在Shepard的PCR克隆方法(Shepard AR，Rae JL(1997)Magnetic bead capture of cDNA from double-stranded plasmid cDNA libraries. Nucleic Acids Res 25：3183-3185)的辅助下，在鼠和人的序列数据库 中检索(筛选)，对所获得的序列进行了确认。前面所引用的出版物 和其中引用的现有技术在本发明中均完整引用作为本发明公开的一部 分。所述的方法是基于下述步骤：将质粒文库的cDNA分子与生物素 偶联的寡核苷酸序列杂交，随后以链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠抽提 所述质粒，以诊断PCR检查抽提结果，并重复该步骤两次。然后重复 转化所获得的质粒选择直至获得单克隆。该方法使用了下述引物组合： (1)克隆全长基因片段所使用的寡核苷酸：

For ee3_1-h：

-ee3_1-5′biotin1-hs：AATTCCTCATCTATGCCTGTCTGCT

-ee3_1-3′block1-hs：GCTGTTCTCTGTGCTGCTGGCCCTTCGTTTGGATGGCATC

-ee3_1-5′block1-hs：ATGAACCTGAGGGGCCTCTTCCAGGACTTCAACCCGAGTA

-ee3_1-1s-hs：TGCTCCAATATGGCTGTGGA

-ee3_1_1as-hs：CTCTAGTGACCTGTCATGTC

-ee3_1-2s-h：GACAGAGCTTAAGTGGACTG

-ee3_1-2as-h：TACAGTTCCTACTGACTGCC

-ee3_1-5′block2-h：ACGCACTCTCTCCGCCTTCCTCTGCCCCCTCGTTCACCCC

-ee3_1-5′biotin2-h：GCAGACCAGAACCAGTACTGGAGCT

-ee3_1-3′block2-h：GGGTCTCCAGGTACGTCCATCTCATGCCTTGTTTGCATCC

For ee3_1-m

-ee3_1-5′biotin1-m：ATTCCTCATCTATGCCTGTCTGCTG

-ee3_1-3′block1-m：CTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTTTGGATGGCATCA

-ee3_1-5′block1-m：TGAACCTGAGGGGCCTCTTTCAGGACTTCAACCCGAGTAA

-ee3_1-1s-m：GGATGGCATCATTCAATGGAG

-ee3_1-1as-m：GAACAATGGCATGAAGACCAG

-ee3_1-2s-m：ACTGAGCTGGATGACCATTGT

-ee3_1-2as-m：TCCTCACTATCTTCATGGTGG

-ee3_1-5′biotin2-m：TCATCACCCAGAGCCCTGGCAAGTA

-ee3_1-5′block2-m：CCTAAAATTGCACCTATGTTCCGCAAGAAGGCCAGGGTAG

-ee3_1-3′block2-m：TGTCCTTCCTCCACCCAAACTAAATATTGAAATGCCAGAC

For ee3_2_h：

-ee3_c2-1as-h：TGAACTGCAGGATGTTGACC

-ee3_c2-1s-h：TCATCCAATGGAGCTACTGG

-ee3_c2-5′block1-h：ATGAACCCCAGGGGCCTGTTCCAGGACTTCAACCCCAGTA

-ee3_c2-5′biotin1-h：AGTTTCTCATCTACACCTGCCTGCT

-ee3_c2-3′block1-h：GCTCTTCTCGGTGCTGCTGCCCCTCCGCCTGGACGGCATC

For ee3_2-m：

-ee3_c2-3′block1-m：ACTCTTCTCCGTGCTGCTGCCCCTGCGCCTGGACGGCATC

-ee3_c2-5′biotin1-m：AGTTCCTCATTTATGCCTGCTTGCT

-ee3_c2-1as-m：TGGATAATCCTGTCCAGCCT

-ee3_c2-1s-m：ATCATCCAGTGGAGCTACTG

-ee3_c2-5′block1-m：ATGAACCCCAGGGGCCTGTTCCAGGACTTCAACCCCAGTA 

-ee3_c2-m-2s：TGTGGAAGCTCCTGGTCATCGT

-ee3_c2-m-2as：GATAATCCTGTCCAGCCTCAGG

-ee3_c2-5′block2-m：GAAGCTCCTGGTCATCGTGGGCGCCTCGGTGGGTGCGGGC

-ee3_c2-5′biotin2-m：GTGTGGGCCCGCAACCCACGCTACC

-ee3_c2-3′block2-m：GTACAGAGGGGGAAGCCTGCGTGGAATTCAAAGCCATGCT

-ee3_c2-5′biotin3-m：ACAGAGCCCTGGGAAATATGTGCCT

-ee3_c2-3′block3-m：CCACCTCCCAAGTTAAACATTGATATGCCAGACTAAACTC 

-ee3_c2-5′block3-m：TTGCTCCAATGTTTGGAAAGAAGGCGCGGGTAGTTATAAC

For ee3_c3-h：

-ee3_c3-5′block1-h：CCACCTTGGGCACCTTGGTGTCTTTCAAAAGTGCCAGGCT

-ee3_c3-5′biotin1-h：CCTTCCTGCCTCAGGGCCTTTGCAC

-ee3_c3-3′block1-h：TTGCTGCTCCCTCCGTTTGAAATACTGTATCCCAGAGAGT

-ee3_c3-1s-h：GGCACCTTGGTGTCTTTCAA

-ee3_c3-1as-h：CAGTCTGAATTAGGAGCCAG

For ee3_c5-h：

-ee3_c5-1as-h：TCGGAGCTTCTGGAACCAAT

-ee3_c5-1s-h：CCATCAGCTGGATAACGACT

-ee3_c5-5′block1-h：ACCATGGCCATCAGCTGGATAACGACTGTCATCGTGCCCC

-ee3_c5-5′biotin1-h：TGCTCACCTTTGAAGTCCTGCTGGT

-ee3_c5-3′block1-h：TCACAGACTGGATGGCCGCAATACATTCTCCTGTATCTCC

For ee3_c8-h：

-ee3_c8-5′block1-h：AATTTTGGTATATGGTGCAAAAAAAGGGGTCCAATTTCTT

-ee3_c8-5′biotin1-h：CTGCAACTGGCCAGCCAGTTATCTC

-ee3_c8-3′block1-h：AGCATCATTAATTGAATAGGGAATCCTTACCCCACTGATT

-ee3_c8-1s-h：AACTGGCCAGCCAGTTATCT

-ee3_c8-1as-h：AATGGATTGTTGGGTGCAGC

-ee3_c8-2s-h：CCAGCCAGTTATCTCAGCATCA

-ee3_c8-2as-h：ACCATGGCATGTGTATCCCAGA

(2)另外，将ee3序列的编码区克隆到GATEWAY(tm)相容性载体 以进行功能分析。使用了下述寡核苷酸：

For ee3_1-h：

-ee3_1_h_B1：

GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC

TACCATGAACCTGAGGGGCCTCTTCCA

-ee3_1_h_B2：

GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC

CTAATCTGGCATTTCGATATTTAATTTGGGAGGT

-ee3_1-h-C-fus-B2：

GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC

GCATTTCGATATTTAATTTGGGAGGTGGGAG

For ee3_2-h：

-ee3_c2-h-B1：

GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TCTACC

ATGAACCCCAGGGGCCTGTTCC

-ee3_c2-h-B2：

GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC

TTAATCTGGCATATCAATATTTAACTTGGGAGGG

-ee3_c2-h-c-fus-B2：

GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC

ATCTGGCATATCAATATTTAACTTGGGAGGG

For ee3_c2-m：

-ee3_c2-m-B1：

GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC

TCTACCATGAACCCCAGGGGCCTGTTCC

-ee3_c2-m-B2：

GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC

TTAGTCTGGCATATCAATGTTTAACTTGGGAG

(c)人cDNA文库的构建

取2μg人胎儿脑组织mRNA(Clontech，Heidelberg，Germany) 和5μg成年小鼠的脑mRNA，用Stratagene(Amsterdam， Netherlands)的cDNA合成试剂盒制备相应的cDNA文库。基本上 按照试剂盒的说明进行各个步骤的操作。首先使用试剂盒说明书所述 的oligodT引物合成第一链cDNA，然后按照试剂盒(Stratagene)的 指导，根据大小选择克隆相容性的(EcoRI/XhoI)双链cDNA片段， 并将该片段连接到pBluescript SKII质粒载体中(Stratagene)。用电 穿孔的方法将该连接体转化到大肠杆菌中(DH10B，Gibco)，在LB- 氨苄琼脂培养板上扩增培养。用碱性裂解液和离子交换色谱分离质粒 DNA(Qiagen公司的QIAfilter试剂盒，Hilden，Germany)。

人胎儿脑cDNA文库的独立克隆的复杂度是4百万。随机分析了 每个cDNA文库的24个克隆中插入片段的大小，显示插入片段长度 从800bp到4.5kB，人类文库中插入的cDNA片段的平均长度约为 1.2kB。

实施例2

促红细胞生成素(EPO)对ee3_1的调节作用

ee3_1被确定为是EPO转基因小鼠脑上调基因的产物(tg6和tg21 小鼠系)。

本发明表达所使用的小鼠，其特征已被多次描述过(Ruschitzka 等人，2000，Proc Natl Acad Sci USA，97，11609-13.；Wagner等人，2001， Blood，97，536-42.；Wiessner等人，2001，J Cereb Blood Flow Metab， 21，857-64)。按照Hergersberg描述的方法用转基因构建体处理小鼠 (Hergersberg等人，Hum.Mol.Genet.4，359-366)。该构建体含有 PDGF启动子和促红细胞生成素的编码序列。获得了很多转基因鼠系， 本发明只研究tg6和tg21鼠系。根据Ruschitzka等人的方法(2000，Proc Natl Acad Sci USA，97，11609-13)，通过血清学研究证实只有tg6小鼠 的EPO全身性表达增加了。tg21小鼠的全身EPO水平没有提高。与 Sasahara等人(1991，Cell，64，217-27)的试验结果相似，所使用的 PDGF启动子片段可能会引起转基因EPO的表达，特别是在神经元 细胞中。

在tg6鼠系小鼠中，EPO的全身性表达增加导致红血球生成的显 著提高，使红细胞增多至血细胞比容达到0.8，并且血容积显著增加 至4.0ml(Wanger等人，2001，Blood，97，536-42)。与之对照，tg21鼠 系在表型方面并不非常显著。

RNA产物，例如ee3_1基因的RNA产物，在促红细胞生成素过 量表达的转基因小鼠脑组织中的表达增加(tg6和tg21鼠系(Ruschitzka 等人，2000，Proc Natl Acad Sci USA，97，11609-13.；Wagner等人，2001， Blood，97，536-42.；Wiessner等人，2001，J Cereb Blood Flow Metab， 21，857-64))，并通过DNA阵列试验证实。通过发现另一种调节基因 产物，即α-球蛋白证明过量表达的EPO对EE3_1转录的调节在生理 学和病理生理学方面的重要性。使用微阵列通过转录分析发现α-球蛋 白在两个转基因鼠系中都被调节。利用LightCycler系统也证明了这 一点(图2)。所述的增加是可见的，特别是在海马区(原位杂交)。

实施例3

本发明的序列在哺乳动物细胞中的表达以及稳定细胞系的建立 将ee3家族基因的开放阅读框克隆到普通的真核表达载体中，如 Clontech公司的pcDNA系列(Heidelberg，Germany)。特别是通过 磷酸钙法以所获得的表达质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293)，用脂质 体转染法转染CHO细胞和CHO-dhfr-细胞，或用DEAE-葡聚糖珠转 染COS细胞，随后用400-500mg/ml G418进行选择。选择后3周， 挑选单个克隆扩大培养用于其它分析。用Northern印迹和Western 印迹方法分析了大约30个克隆。将ee3家族基因的开放阅读框克隆 到真核表达载体中，该表达载体含有二氢叶酸还原酶基因作为选择性 标记，用所获得的表达载体进行转染，以在无核苷酸的培养基中选择 转染的CHO-dhfr-细胞。用此方式转染的CHO-dhfr-细胞以及用相同 方法转染的其它细胞，用加大浓度的氨甲蝶呤处理，选择出二氢叶酸 还原酶的表达量增加，从而受体的表达也增加的细胞。

实施例4

使用ee3_1C端片段的酵母双-杂交试验

为了鉴别酵母双-杂交系统中可能的相互作用配偶体，将本发明 ee3_1的C端部分克隆到诱饵载体pGBKT7(Clontech)中。

所用的蛋白的序列为：

KGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLHHEDNEETEETPVPEPPKIAPMFRK

KARVVITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD，

相应的核苷酸序列是：

AAGGGAGGAAACCACTGGTGGTTTGGTATCCGCAAAGATTTCTGTCAGTTTCTGCTTGAA

ATCTTCCCATTTCTACGAGAATATGGAAACATTTCCTATGATCTCCATCACGAAGATAAT

GAAGAAACCGAAGAGACCCCAGTTCCGGAGCCCCCTAAAATCGCACCCATGTTTCGAAAG

AAGGCCAGGGTGGTCATTACCCAGAGCCCTGGGAAGTATGTGCTCCCACCTCCCAAATTA

AATATCGAAATGCCAGAT

根据本领域技术人员熟知的常规方法(配对法，Clontech)，使用 人脑文库筛选相互作用配偶体。结果获得了含有重叠序列的2个克隆 (克隆11和36)。

克隆11的序列如下：

GGGGACTCGGCCCTGAACGAGCAGGAGAAGGAGTTGCAGCGGCGGCTGAAGCGTCTNTAC

CCGGCCGTGGACNAACAAGAGACGCCGTTGCCTCGGTCCTGGAGCCCGAAGGACAAGTTC

AGCNTACATCGGCCTNTNTNAGAACAACCTGCGGGTGCACTACAAAGGTCATGGCAAAAC

CCCAAAAGATGCCGCGTCAGTTCGAGCCACGCATCCAATACCAGCAGCCTGTGGGATTTA

TTATTTTGAAGTAAAAATTGTCAGTAAGGGAAGAGATGGTTNCATGGGAATTGGTCTTTC

TGCTCAAGGNGTGAACATGAATAGACTACCAGGTTGGGATAAGCATTCATATGGTTACCA

TGGGGATGATGGACATTCGTTTTGTTCTTCTGGAACTGGACAACCTTATGGACCAACTTT

CACTACTGGTGATGTCATTGGCTGTTGTGTTAATCTTATCAACAATACCTGCTTTTACAC

CAAGAATGGACATAGTTTAGGTATTGCTTTCACTGACCTACCGCCAAATTTGTATCCTAC

TGTGGGGCTTCAAACACCAGGAGAAGTGGTCGATGCCAATTTTGGGCAACATCCTTTCGT

GTTTGATATAGAAGACTATNTGCGGGAGTGGAGAACCAAAATCCAGGCNCAGATAGATCG

ATT.

相互作用基因产物被鉴定为RANBPM或RANBP9(Nishitani H， Hirose E，Uchimura Y，Nakamura M，Umeda M，Nishii K，Mori N， Nishimoto T(2001)Full-sized RanBPM cDNA encodes a protein possessing a long stretch of proline and glutamine within the N- terminal region，comprising a large protein complex. Gene 272：25- 3)。同样，确定了另两个相互作用蛋白Map1a和Map1b。有趣的是， 两个蛋白的C端部分就是相互作用部分，含有同源区。Map1a和Map1b 同源区如下所示，上边的序列是Map1a，下边的序列是Map1b：

ALIGN calculates a global alignment of two sequences

version 2.0uPlease cite：Myers and Miller，CABIOS (1989)4：11-17

Sequence 1                                            212 aa vs.

Sequence 2                                            177 aa

scoring matrix：BLOSUM50， gap penalties：-12/-2

43.6％identity              Global alignment score：  614

               10        20        30        40        50

/tmp/f KEKVQGRVGRRAPGKAKPASPARRLDLRGKRSPTPGKGPADRASRAPPRP--RSTTSQVT

                                           :  ...:..    :  ... ..

Sequen -----------------------------------KKESVEKAAKPTTTPEVKAARGEEK

                                                  10        20

       60        70        80        90           100       110

/tmp/f PAEEKDGHSPMSKGLVNGLKAGPMALSSKGSS----GAPVYVDLAYIPNXCSGKTADLDF

         : :.. .  ..  ..   ::: . ..  ::    : :::.:: ::::  ..:..:..:

Sequen DKETKNAANASASKSAKTATAGPGTTKTTKSSAVPPGLPVYLDLCYIPNHSNSKNVDVEF

          30        40        50        60        70        80

          120       130       140       150       160       170

/tmp/f FRRVRASYYVVSGNDPANGXPSRAVLDALLEGKAQWGENLQVTLIPTHDTEVTREWYQQT

       :.:::.:::::::::::   ::::::::::::::::: :.:::::::::.:: :::::.:

Sequen FKRVRSSYYVVSGNDPAAEEPSRAVLDALLEGKAQWGSNMQVTLIPTHDSEVMREWYQET

          90       100       110       120       130       140

          180       190       200       210

/tmp/f HEQQQQLNVLVLASTXTVVMQDESFPACRLSSEKPPSL

       ::.::.::..::::. ::::::::::::..

Sequen HEKQQDLNIMVLASSSTVVMQDESFPACKIEL------

         150       160       170

实施例5

人ee3_1/ee3_2的同源序列

(a)在染色体5q33.1上

使用TbIastn从毗邻序列AC11406.00015中鉴别出另一个同源序 列：

> ACO11406.00015

                 Length：40,820

Minus Strand HSPs：

Score＝389(136.9bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41

Identities＝72/303(71％)，Positives＝78/303(77％)，Frame＝-1

Query：224   LLTFEILLVHKLDGHNAFSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLL 283

             LLTFE+LLVH+LDG N FSCI I VPLWL L+TLM TTF  K GNHWWFGIR+DFCQFLL

Sbjct：14312 LLTFEVLLVHRLDGRNTFSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLL 14253

Query：284   EIFPFLREYGNISYDLHHEDNXXXXXXXXXXXXKIAPMFRK 324

             EIFPFLREYGNISYDLH ED+            KIAP+F K

sbjct：14252 EIFPFLREYGNIsYDLHQEDsEGAEETLVPEAPKIAPVFGK 14010

Score＝86(30.3bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41

Identities＝15/51(88％)，Positives＝16/51(94％)，Frame＝-3

Query：334   PGKYVLPPPKLNIEMPD 350

             PGKYV PPPKLNI+MPD

Sbjct：13992 PGKYVPPPPKLNIDMPD l3942

Score＝67(23.6bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41

Identities＝12/57(63％)，Positives＝17/57(89％)，Frame＝-2

Query：206   QRRTHITMALSWMT-IVVP 223

             Q RTH+TMA+SW+T ++VP

Sbjct：14368 Q*RTHVTMAISWITTVIVP 14312

可以获得相应的cDNA，但是翻译该cDNA只能获得ee3同源蛋 白的C端片段。

与ee3_1_m序列的比较如下所示：

ALIGN calculates a global alignment of two sequences

version 2.0uPlease cite：Myers and Miller，CABIOS(1989)4：11-17

Seouence 1                                        350 aa vs.

Sequence 2                                        148 aa

scoring matrix：BLOSUM50，gap penalties：-12/-2

29.4％ identity；      Global alignment score：649

               10        20        30        40        50        60

/tmp/f MNLRGLFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLALRLDGIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIVGASV

Sequen ------------------------------------------------------------

               70        80        90       100       110       120

/tmp/f GTGVWARNPQYRAEGETCVEFKAMLIAVGIHLLLLMFEVLVCDRIERGSHFWLLVFMPLF

Sequen ------------------------------------------------------------

              130       140       150       160       170       180

/tmp/f FVSPVSVAACVWGFRHDRSLELEILCSVNILQFIFIALRLDKIIHWPWLVVCVPLWILMS

Sequen ------------------------------------------------------------

              190       200       210       220       230       240

/tmp/f FLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMALSWMTIVVPLLTFEILLVHKLDGHNA

                       .:.  .. .. : :    :.       :::::.::::.:::.:.

Sequen ----------------MRTTRAV-KNTRDH-GHQLD-NDCHRALLTFEVLLVHRLDGRNT

                                10          20        30        40

             250        260       270       280       290       300

/tmp/f FSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH

       :::: : ::::: :.:::.:::  : :::::::::.::::::::::::::::::::::::

Sequen FSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH

              50        60        70        80        90       100

              310       320       330       340       350

/tmp/f HEDSEETEETPVPEPPKIAPMFRKKARVVITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD

       .:::: .::: ::: :::::.:  :.:::.   ::::: :::::::.:::

Sequen QEDSEGAEETLVPEAPKIAPVF-GKTRVVLI--PGKYVPPPPKLNIDMPD

             110       120        130         140

因为所获得的cDNA序列与基因组数据完全一致，并且在ATG 的上游存在一个包含在阅读框中的终止子，所以自然可以产生唯一的 GPCR片段(参见序列)。

Minus Strand HSPs：

Score＝6976(1046.7bits)，Expect＝0.0，Sum P(2)＝0.0

Identities＝1396/1397(100％)，Positives＝1396/1397(100％)，Strand＝Minus/

Plus

Query：2499  AGGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 2440

             | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：13048 AAGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 13107

Query：2439  CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 2380

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13108 CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 13167

Query：2379  GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 2320

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：13168 GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 13227

Query：2319  GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 2260

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：13228 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 13287

Query：2259  GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 2200

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||  

sbjct：13288 GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 13347

Query：2199  CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 2140

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13348 CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 13407

Query：2139  CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACCAGGCACATATTGTTTTATGCAA 2080

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：13408 CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACCAGGCACATATTGTTTTATGCAA 13467

Query：2079  TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 2020

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13468 TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 13527

Query：2019  AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 1960

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13528 AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 13587

Query：1959  ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 1900

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13588 ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 13647

Query：1899  AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAAAACAGTTCAACTTACTGCC 1840

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13648 AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAJAACAGTTCAACTTACTGCC 13707

Query：1839  CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 1780

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13708 CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 13767

Query：1779  ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 1720

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13768 ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 13827

Query：1719  AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 1660

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13828 AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 13887

Query：1659  GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 1600

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：13888 GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 13947

Query：1599  GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 1540

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：13948 GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 14007

Query：1539  GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 1480

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：14008 GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 14067

Query：1479  TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 1420

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

sbjct：14068 TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 14127

Query：1419  AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACC2AACCACCAATGATTGCCCCT 1360

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：14128 AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACCAAACCACCAATGATTGCCCCT 14187

Query：1359  TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 1300

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：14188 TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 14247

Query：1299  GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT 1240

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：14248 GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT l4307

Query：1239  GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 1180

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：14308 GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 14367

Query：1179  TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 1120

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：14368 TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 14427

Query：1119  GATTCAAAACCTTTCTT l103

             |||||||||||||||||

Sbjct：14428 GATTCAAAACCTTTCTT 14444

(b)在染色体8q11.22上

从Ensembl毗邻序列Ac034174中鉴别出另一个同源序列。

同源核苷酸片段所对应的蛋白质序列如下：

AATTTTGGTATATGGTGCAAAAAAAGGGGTCCAATTTCTTCTGCAACTGGCCAGCCAGTTATCTCAGCATCATTAATTGA

ATAGGGAATCCTTACCCCACTGATTGTTTTTGTCAGGTTTGTCAAAGATGAAATAGTTGTAGGTGTATGGTCTTATTTCT

GGGTTCCCCATTCTGTTCCACTGGTATATGTGTCTGGTTTTGAACTAGTGCCATGCTGTTTTGGTTACTATAGCCCTGTT

TAAAATCAAATGGAGTGATGCCGCCACGTTGTATTTATTTTATTTTTTTATTATACTTTAAGTTCTGGGATACACATGCC

ATGGTGGTTTGCTGCACCCAACAATCCATTATCTATGTTGTTTTCTC

(c)在染色体3p25.3上

在3号染色体上发现了一个同源序列：

CCACCTTGGGCACCTTGGTGTCTTTCAAAAGTGCCAGGCTCCTTCCTGCCTCAGGGCCTTTGCACTTGCTGCTCCCTCCG

TTTGAAATACTGTATCCCAGAGAGTCCCATTTCTGGCTCCTAATTCAGACTGA

(d)在染色体XP21.1上

> ACO27722.00010

               Length：3,576

Minus Strand HSPs：

Score＝65(22.9bits)，Expect＝4.1e+02，Sum P(2)＝1.0

Identities＝11/90(37％)，Positives＝19/90(63％)，Frame＝-1

Query：159  RLDKIIHWPWLVVCVPLWI-LMSFLCLVVL 187

            R+   ++W  L  C+P+W+  +SF CL+ L

Sbjct：1848 RIMSSLNWDSLTSCLPIWMTFISFSCLIAL 1759

Score＝57(20.1bits)，Expect＝4.1e+02，SumP(2)＝1.0

Identities＝16/147(33％)，Positives＝24/147(49％)，Frame＝-2

Query：88   VGIHLLLLMFEVLVCDRIERG-SH-FWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF 134

            +G   L++ F   V D++  G  H FW L  +PLF VS      C + +

Sbjct：2507 IGCCFLIVCFVCFVEDQMYVGLQHYFWALYSVPLFCVSVFVPVPCSFSY 2361

对应于这些同源片段的核苷酸序列如下所示：

ATCATGTCATCTCTAAACTGGGATAGTTTGACTTCCTGTCTTCCTATTTGGATGACTTTTATTTCTTTCTCTTGCCTGAT

TGCTCTGG

和

ATAGGGTGTTGTTTCCTCATTGTTTGTTTTGTCTGCTTTGTGGAAGATCAGATGTATGTAGGTTTGCAGCATTATTTCTG

GGCTCTCTATTCTGTTCCTTTGTTCTGTGTGTCTGTGTTTCTACCAGTACCATGTTCTTTTAGTTACT

然而，缺失了共有序列DRI。

(e)选择性剪接产物ee3_1b_h和ee3-1c_h

人基因产物ee_1_h的选择性剪接产物命名为ee3_1b_h(见图 11B，序列号3B)。这个剪接产物是由外显子3的共有剪接供体位点 形成的，并且产生了含有修饰的C末端和翻译提前终止的修饰的开放 阅读框。该剪接产物所编码的蛋白(166个氨基酸，分子量：19.2kD) 在第4个TM域后终止(见图15B，序列号7B)。另外，还发现了一 个选择性剪接产物，命名为ee3_1c_h(见图11C，序列号3C)，它所 编码的蛋白质的序列如图15C所示(序列号7C)，该蛋白在第2个TM 域之后的部分被截去。根据Shepard等人的克隆方法(参见实施例1) 在克隆和测序的过程中鉴别出所述的剪接产物。

预测ee3_1b_h的TM区如下所示：

----->STRONGLY preferred model：N-terminus outside

4 strong transmembrane helices，total score：6315

# from to length score orientation

1    15    33(19)    2066 o-i(o：outside，i：inside)

2    40    56(17)    1143 i-o

3    83    102(20)   1765 o-i

4    112   134(23)   1341 i-o.

这种剪接产物对于调节全长受体，例如V2加压素受体的功能非 常重要(Zhu和Wess，1998，Biochemistry，37，15773-84；Schulz等人， 2000，J Biol Chem，275，2381-9)。由于GPCR蛋白容易发生同源二聚 反应或异源二聚反应(Bouvier，2001，Nat Rev Neurosci，2，274-86.)， 所以本发明序列的这种截短形式起显性的负调节作用。

本发明专门描述了本发明ee3蛋白的这种剪接体形式的用途(例 如，作为本发明表达载体中的裸DNA，或作为本发明的蛋白序列等)， 还描述了该剪接体的变体在制备治疗疾病的药物中的用途(如前述)。 本发明还包括剪接体用于研究本发明ee3家族受体的药理学作用的用 途。

实施例6

ee3家族蛋白质的拓扑学数据

应用TMPred程序筛选TM区(跨膜区)，结果得到如下特别有 用的模型：

(a)ee3_1

----->STRONGLY prcierred model：N-teminus outside

7 strong transmembrane helices，total score：11863

# from to length score orientation

1   15   33(19)   2066 o-i    FLIYACLLLFSVLLALRLD

2   40   56(17)   1143 i-o    YWAVFAPIWLWKLMVIV

3   83   102(20)  1765 o-i    AMLIAVGIHLLLLMFEVLVC

4   112  134(23)  1341 i-o    WLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF

5   168  191(24)  2978 o-i    WLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIV 

6   211  227(17)  1070 i-o    ITMALSWMTIVVPLLTF

7   240  258(19)  1500 o-i    AFSCIPIFVPLWLSLITLM

TM域之间的片段的间隔为15，7，27，10，34，20，13个氨基 酸，胞内残基长度为92个氨基酸。

(b)对于ee3_2得到同样的拓扑图谱

----->STRONGLY preferred model：N-terminus outside

7 stronq transmembrane helices，total score：12351

# from to length score orientation

1   15   36(22)    1811 o-i

2   32   50(19)    1219 i-o

3   83   102(20)   1733 o-i

4   112  134(23)   1330 i-o

5   168  191(24)   3068 o-i

6   211  227(17)   1239 i-o

7   243  260(18)   1951 o-i

TM域之间的片段的间隔为15，0，33，10，34，20，16个氨基 酸，所述残基长度为90个氨基酸。

(c)作为对比的对照实验是现有技术已知的CCR-5受体(同样属于 7TM受体家族)的拓扑学数据

1    51    76(26)    2895 o-i

2    89    108(20)   1155 i-o

3    124   145(22)   1163 o-i

4    163   187(25)   1415 i-o

5    220   239(20)   2183 o-i

6    260   281(22)   1782 i-o

7    298   325(28)   1325 o-i

TM域之间的片段的间隔为51，13，16，18，33，21，17个氨基 酸，胞外残基长度为46个氨基酸。

本发明的ee3_1与缓激肽-2，CXCR5，Galanine受体-2和过敏毒 素C5a等不太相关的7TM受体在普通拓扑学方面进行比较(列出了 每个蛋白非跨膜区的氨基酸残基数，如N末端、C末端以及环基序的 残基数)，结果如下：

receptor    N terminus  1     2     3     4     5     6rest

C5a            39       12    14    22    28    16    20    45

BK-2           63       13    14    20    27    26    24    56

galanin2       28       10    17    19    24    25    1     105

cxcr-5         55       11    14    21    30    18    23    46

mw             43.3     11.7  15.0  20.3  26.3  22.3  15.0  63.0

ee3_1          15       7     27    10    34    20    13    92

这些蛋白质的普通拓扑学非常相近。 

实施例7

ee3_1的信号序列与基序的确定

应用Prosite程序：

Matching pattern PS00001 ASN_GLYCOSYLATION

AS 294：NISY

Total matches：1

Matching pattern PS00006 CK2_PHOSPHO_SITE

AS 77：TCVE

Total matches：1

Matching pattern PS00008 MYRISTYL

AS 57： GASVGT

AS 263：GQKGGN

Total  matches：2

77位是CK2磷酸化作用位点，294位是天冬酰胺糖基化位点，57 位和263位是两个肉豆蔻基化位点(参见图7中的连续数字)。C末 端没有发现典型的磷酸化位点。

实施例8

单次施用促红细胞生成素对ee3的诱导作用

如图19所示，对大鼠单次腹腔注射促红细胞生成素(Janssen产 Erypo；5000U/kg体重)能够在转录水平诱导ee3_1。注射促红细胞 生成素后6h和24h，注射Rompun/Ketanest麻醉大鼠并处死，取脑 组织。对照组注射生理盐水。通过在LightCycler(Roche，Mannheim， Germany)上，用半定量RT-PCR技术测定大鼠ee3_1的信使RNA。 通过将样品的相对荧光值与亲环蛋白标准曲线比较而进行定量。

根据Chomczynski/Sacchi的方法(酸性酚抽提)，从大鼠前脑(不 包括小脑和嗅球)分离总RNA，然后按照产品说明书的指导，用RNeasy 抽提试剂盒纯化总RNA(Qiagen，Santa Clarita，CA，USA)。用分光 光度计测定RNA的浓度，通过琼脂糖凝胶电泳确定总RNA的质量。 RNA使用前保存于-80℃。

使用Superscript II进行逆转录(Invitrogen-Life Technologies， Carlsbad，CA，USA)，采用LightCycler技术通过实时在线PCR分别 对逆转录反应产物相对定量。为了实现定量的目的，使用了3只野生 型小鼠和3只转基因tg6小鼠的脑总RNA样品。亲环蛋白的特异性 寡核苷酸引物序列如下：正向引物 5′ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-3′，反向引物 5′CATTTGCCATGGACAAGATG-3′，结合温度60℃。大鼠ee3_1 的正向引物是5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′，反向引物5′- ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′。

扩增cDNA的系列稀释液以进行定量，稀释度分别是1∶3，1∶9， 1∶27，1∶81和1∶243。扩增步骤如下：94℃初始变性5min，扩增50 个循环，每个循环包括94℃变性5s，根据上述不同的特异性引物在55 ℃或60℃结合10s，72℃延伸30s。每个循环结束后测定每个样品的 荧光值，测定温度80℃，测定时间10s。根据琼脂糖凝胶电泳和熔解 曲线分析反应产物的特异性(结果未显示)。每个PCR反应只产生一 个反应产物。

利用所述PCR反应的对数期进行定量，这包括拟合一条渐进线。 由于血红蛋白PCR反应的对数期曲线实质上是平行的斜线，因此可 以用其斜率与亲环蛋白标准曲线的斜率进行比较。每种cDNA稀释液 的校准的PCR反应产物，以平均值±标准差的形式表示。以这种方 法检测出的数量差异对应于转基因动物和野生型动物RNA表达的相 对变化。所有反应都只产生唯一的反应产物。注射促红细胞生成素6h 后，ee3的平均诱导因子是1.35倍，注射24h后，ee3的平均诱导因 子是1.44倍。

实施例9

ee3_1 RNA在脑中的分布

使用带有放射标记的寡核苷酸探针通过原位杂交的方法研究小鼠 ee3_1转录子的定位。使用低温保持器在-20℃将脑组织切成15μm厚 的切片，放置在聚L-赖氨酸涂覆的载玻片上，用含4％多聚甲醛的PBS (pH 7.4)固定。使用末端转移酶(Roche Diagnostics，Mannheim) 将寡核苷酸用a-35S-dATP放射性标记。按照Wisden&Morris的方法 进行标记和随后的杂交反应(In situ-Hybridization Protocols for the Brain，Academic Press 1994)。

所使用的带有放射性标记的探针是ee3_1.3as AACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCAT AGATGAGG。该探针使得ee3_1在小脑(ce)、海马(hc)、齿状回(dg)、 皮层(co)，特别是内嗅皮层(ent)以及嗅球(olf)等处的表达可以被观察 到。相应的有义对照探针(ee3_1.3s， CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCC CTTCGTT)没有产生特异信号(未显示)(图20)。

实施例10

ee3_1在小鼠组织中分布的免疫组织化学研究

切取2μm厚的石蜡包埋组织，放置在预先处理的载玻片上 DAKO，Glostrup，Denmark)，空气干燥过夜，然后用二甲苯和递 减的乙醇脱蜡。在柠檬酸盐缓冲液中用500W的微波处理10min后， 将切片与1∶500稀释的抗ee3_1血清(AS4163)在室温和潮湿条件下 共培养1h。按照产品的使用说明(DAKO，Glostrup，Denmark)，用 DAB作为显色剂，使用ABC技术观察免疫反应。用同样的方法处理 组织切片，但不加入第一抗体以及用相应的免疫前血清代替第一抗体 作为阴性对照。

免疫组织化学染色结果如图22所示，揭示了ee3在神经元的特异 性分布，而在肠和肺的一些组织中没有分布。ee3在具有整合功能的 神经元细胞中频繁的表达。这种神经元细胞包括皮层V的大锥体细 胞，嗅球的僧帽细胞，小脑的浦肯野细胞细胞。图A-C显示了ee3在 皮层V中的分布，同时神经元细胞也被清楚的染色。图C显示了在 内溴皮层的更加清晰的免疫染色效果。从生理学角度说，负责学习和 记忆的信息从内嗅皮层传递到海马。

在患有中风、阿尔茨海默症或头部、脑部损伤的患者中，经常能 观察到内嗅皮层的变化。内嗅皮层的疾病可能导致行为变化，例如知 觉、感官的衰退和学习障碍(David等人，Nurs Res 50(2)77-85 (2001))。图D-F显示了ee3在海马中的分布方式。ee3在CA3区域表 达，而在CA2和CA1区域不表达，两者之间的界限在图中表现的非 常明显。CA1区的神经元对于非坏死型和非炎症型的生理性细胞死亡 (凋亡)特别敏感，对于伴随有中枢神经损伤的细胞死亡尤其敏感， 而CA4区神经元的敏感程度较低(例如，Hara等人，Stroke，31，236- 8，(2000))。与之相对照，齿状回似乎更容易受到坏死型损伤的影响。 齿状回与病态刺激导致的新神经元形成相关联(Takagi等人，Brain Res， 831，283-7，(1999))(Parent等人，J Neurosci，17，3727-38，(1997))。在 新皮层形成区之外的区域也发现了ee3，这些区域包括：作为整合神 经元的小脑浦肯野细胞(G，H)，嗅球的僧帽细胞(I，J)。ee3在神 经节细胞和视网膜感觉细胞中的表达更为强烈(K，L)。

最近报道了促红细胞生成素在视网膜中的神经保护作用(Junk等 人，Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemia-reperfusion injury.Proc Natl Acad Sci USA.2002 Aug 6； 99(16)：10659-64.；Grimm等人，HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration.Net Med.2002 Jul；8(7)：718-24.)。这些发现暗示EPO的诱导作用与ee3 的表达之间存在联系。同样的，ee3在属于运动系统的神经元细胞中 也有较高表达。所以在脊髓前角的运动神经元中(图22M)，以及在 三叉神经核的运动核中具有类似功能的神经元细胞中(图22N)，都 能观察到ee3的特异性表达。

所述的ee3在脊髓中的分布情况可能用于治疗和诊断肌萎缩性侧 索硬化。肌萎缩性侧索硬化(ALS，又称为Lou Gehrig氏病，Charcot 氏病)是一种神经变性疾病，每年发病率可达0.4-1.76/100000人(Adams 等人，Principles of neurology，6th ed.，New York，pp 1090-1095)。它 是一种最常见的运动神经元疾病，主要症状有：肌肉自发性震颤，骨 骼肌系统进行性萎缩和无力，痉挛，阳性锥体束症，构音障碍，吞咽 困难以及呼吸困难。其致病机制主要是由于前角脊髓和下脑干运动神 经核中神经细胞的损失而造成的，也可能影响皮层的第一级运动神经 元。虽然人们已经十分清楚的知道在家族性疾病中超氧化物歧化酶突 变反应的作用，但是肌萎缩性侧索硬化的致病机制仍有大部分是未知 的。到目前，已经发现了超过90种能够引起ALS的SOD1突变蛋白 (Cleveland和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19.)。神经 微丝似乎也参与这种疾病。由过多的谷氨酸盐所引发的兴奋性中毒， 是肌萎缩性侧索硬化的另一个致病因子。利鲁唑(Riluzole)对患者 的作用也证明了这一点。半胱氨酸酶和凋亡的激活可能共同构成了 ALS的最终发病途径(Ishigaki等人，(2002)，J Neurochem，82，576-84.， Li等人(2000).Science，288，335-9.)。ee3蛋白在患ALS的神经元中的 分布明确的指出了ee3激动剂或拮抗剂对这种疾病潜在的治疗功能和 诊断应用。

ee3在中脑黑质中的分布使对帕金森氏病的治疗和诊断成为可能 (图22O，P)。帕金森氏病也是一种最常见的运动失调性疾病，在北 美约有一百万患者，超过65岁的人当中约有1％的人受到影响。帕金 森氏病的主要症状是：僵直，震颤，运动失能(Adams等人，Principles of neurology，6th ed.，New York，pp 1090-1095)。这种疾病的发病机 理并不清楚。但是对尸检组织和动物模型的分析表明在黑质中存在持 续的氧化应激，这会导致多巴胺能神经变性。通过施用神经毒素，例 如6-羟多巴胺、MPTP(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢嘧啶)，对动物模 型施加氧化应激，从而研究神经变性过程。虽然已经有一种能改善症 状的疗法(例如，L-DOPA联合脱羧酶抑制剂；溴麦角环肽，多巴胺 激动剂pergolide和抗胆碱能物质如三己芬迪((安坦))，仍然非常需 要开发一种能够阻断发病过程的、针对病因的疗法，例如神经保护疗 法。在动物模型和人体中都发现凋亡机制确实参与了发病过程 (Mochizuki等人，(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10918-23.， Xu等人，(2002)，Nat.Med.，8，600-6.，Viswanath等人(2001)，J. Neurosci.，21，9519-28，Hartmann等人(2002)，Neurology，58，308- 10)。

ee3在神经系统的分布充分证明了该蛋白的表达与神经细胞死亡、 神经变性和神经塑性之间存在联系。

在肺部，ee3分布在不同组织中(图22Q-V)。在末端支气管发现 了表达ee3的基底细胞，该细胞可能具有神经内分泌的活性。这种分 布情况说明了ee3对于支气管疾病的重要治疗作用。小动脉内皮细胞 和平滑肌细胞中也有ee3的表达(12U，V)。与之相反，在venoles 中没有显示任何可记录的ee3免疫组织化学表达迹象(图22Q和R)。 内皮细胞所表达的特殊受体具有重要的药理学价值，因为药物与血液 中的这层细胞是直接接触的。作用于循环系统的有价值药物，其作用 靶点是小动脉，特别是内皮细胞和平滑肌细胞。因此，ee3是影响循 环性疾病，如动脉高血压，十分重要的靶蛋白。

在小肠，ee3基本分布在隐窝(图22W，X)和属于肠丛的神经 细胞中(图22Y)。在多数进行组织学研究的器官中，并没有对器官 特异性细胞专门染色，而是在多数情况下，只对神经细胞进行了明显 染色(例如，心肌，图22AA，或结缔组织，图22Z)。ee3在轴突的 清楚分布使其可以用于外周神经疾病(神经病)的诊断和治疗，这种 疾病包括糖尿病人中普遍的多发性神经病。同样，普通的外周神经系 统遗传性疾病，如HMSN(遗传性运动传感神经病)也能由此受益。

最后，ee3在骨骼肌的表达与其在运动神经终极的分布十分吻合 (图22BB)。这有利于研究神经末梢疾病，如重症肌无力。

实施例11

EPO过量表达小鼠中，ee3在蛋白水平上调

免疫组织化学试验(抗血清AS4163)也证明了促红细胞生成素对 ee3蛋白显著的上调(图23)。平行处理的CNS部分表现出明显增强 的ee3信号。每组试验共有各3只小鼠(野生型和EPO过量表达tg6 小鼠)，根据基因型的不同，采用盲法试验进行染色和评价。

实施例12

ee3和map1b的共同分布以及在map1b缺陷小鼠中ee3表达的消失

以ee3_1的C末端进行的酵母双-杂交试验证明Map1a和Map1b 的轻链是相互作用蛋白(参见前面的实施例，实施例4)。图24显示 了小鼠ee3_1和map1b的双免疫荧光，并且证明了未预见到的，ee3_1 和map1b在小鼠中表达的重叠。

为了实现双免疫荧光染色，将脱蜡组织用微波处理后(柠檬酸盐 缓冲液，500W，10min)，与兔ee3_1抗体(AS4163)和羊抗map1a 抗体(MAP-1B(C20)：sc-8971；Santa Cruz；Santa Cruz，USA)一 起在潮湿的室中于室温条件下培养一小时。经过适当洗涤后，将组织 与FITC抗兔第二抗体和TRITC抗羊第二抗体的混合物共培养30min (两种抗体均用PBS稀释到1∶30，抗体来自Dianova，Hamburg， Germany)。再次以PBS洗涤组织后，用Histosafe密封制备产物，使 用合适的滤片用荧光显微镜进行分析(Olympus IX81，Olympus， Germany)。用分析软件画出信号覆盖图(软件绘图系统，Stuttgart， Germany)。在单色平行荧光染色中，每次其他色道的信号都会消失， 这就排除了每次信号发射到其他色道的现象(例如应用不适当的过滤 器)。用互换发色团对第二抗体进行双染色产生同样的结果(未显示)。

图24显示了令人惊讶的两种蛋白在CNS的共同分布。绿色代表 ee3_1；红色是Map1b；黄色代表两种信号的电子叠加。图24显示了 来自脊髓(sc)和小脑(cb)的样品。

Map1b是一种重要的神经元蛋白。它是一种在哺乳动物中枢神经 系统发育过程中表达的第一微管伴随蛋白(maps)，并且参与神经元的 轴突起源过程(Gonzalez-Billault等人(2001)，Mol Biol Cell，12，2087- 98，Gonzalez-Billault等人(2002)，Brain Res，943，56-67.)。最近的研究 证明了在神经元细胞的相互作用中，map1b的重要功能。Map1b参 与脆性X染色体综合症的致病过程。脆性X染色体综合症是一种常 见的遗传性智力低能疾病。Map1b的mRNA受FMRP控制，而脆性 X染色体的mRNA又直接调节FMRP蛋白。对果蝇的研究表明，map1b (果蝇的futsch)对于脆性X染色体综合症类似表型的显现起主要作 用(Sohn(2001)，Science，294，1809，Zhang等人，(2001)，cell，107， 591-603.)。map1b也与gigaxonin结合，gigaxonin蛋白的基因突变会 导致巨轴突神经病(GAN)这种隐性遗传疾病(Ding等人(2002)，J Cell Bol，158，427-33.)。外周神经受到损伤后，有髓鞘的神经产生的神经 元中，map1b被诱导增加并可能参与轴突的萌生(Soares等人(2002)， EurJ Neurosci，16，593-606.)。最后，map1b还能将GABA-C受体定 位到它的突触位点(Pattnaik等人(2000)，J Neurosci，20，6789-96)。

小鼠的map1b基因是失活的(敲除)。Meixner等人描述了一种 最优的敲除小鼠(Meixner，Haverkamp，Wassle，Fuhrer，Thaihammer， Kropf，Bittner，Lassmann，Wiche and Propst(2000)，J Cell Biol，151， 1169-78.)。对携带纯和失活map1b基因的小鼠进行ee3表达的免疫组 织化学研究，发现ee3_1的染色性大大降低(图25)，这说明ee3_1 蛋白的表达或稳定性依赖于它与map1b的相互作用。因此，该相互 作用的抑制剂能导致ee3表达的明显减弱。

实施例13

检测ee3_1的抗血清的制备

用DNAStar程序包(Lasergene)中的部分程序Protean分析人 ee3_1的蛋白序列。根据推测的二级结构、蛋白表面的可能构象以及 推测的强抗原性，选择出对应于氨基酸299-315位的表位： LHHEDNEETEETPVPEP，该表位位于胞内C末端。合成所述肽， 并且在N末端添加一个半胱氨酸(CLHHEDNEETEETPVPEP)，使 它能够与载体蛋白KLH(keyhole limpet hemocyanine)发生可控的、 特异性偶联。根据最优选方法，用肽-KLH结合体免疫两只兔子。肽 的合成以及随后与KLH的偶联以及免疫兔子都是从BioTrend Chemikalien GmbH定制的。在初次免疫之前，化验这些兔子的免疫 前血清，以检查假转染细胞与脑组织提取物在Western印迹分析中的 交叉反应性。初次免疫后3周，背景忽略不计的2只兔子进行第1次 加强免疫，再过4周后，进行第2次加强免疫。一周后，取兔血20ml， 用western印迹分析免疫血清，对瞬时转染细胞(HEK293，CHO-dhfr-) 进行免疫细胞化学染色。第3次或第4次加强免疫之后，将兔子放血 处死。

2只兔子的血清都是阳性的。特别是AS4163抗血清能够非常专一 性的识别在各种细胞中瞬时表达的人ee3_1蛋白。并且，将AS4163 抗血清稀释到1∶12000，可用于western印迹分析。AS4163抗血清也 适用于ee3_1蛋白的免疫沉淀反应，因此可用于转染细胞或天然组织 来源的ee3_1及其相互作用蛋白的沉淀。AS4163抗血清尤其能够识 别鼠ee3_1序列中相应的表位，该表位与人表位的序列只相差一个氨 基酸，即N304突变为丝氨酸。所以AS4163抗血清非常适用于对野 生型、转基因和敲除小鼠中ee3_1蛋白的表达进行免疫组织化学分析， 如图22-24所示。

实施例14

神经干细胞表达的ee3

根据上文所述的方法(Ray等人，1993)，从4-6周龄的雄性Wistar 大鼠的海马中分离神经干细胞。该操作符合德国的法律。用1％(V/V) isoflurane，70％N2O和29％氧麻醉动物，断头处死。取脑组织，并 用50ml冰冷的含4.5g/l葡萄糖的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液洗涤 (DPBS/Glc)。从6只大鼠中提取海马，以10ml DPBS/Glc洗涤，在 4℃、1600g离心5min。弃去上清夜，用剪刀和解剖刀将组织匀浆。 组织块用DPBS/Glc洗涤，在800g离心5min，用含0.01％(W/V) 木瓜蛋白酶，0.1％(W/V)dipase II(中性蛋白酶)，0.01％(W/V) DNase I和12.4mM硫酸锰的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)重悬沉淀。 用吸液管的管尖研磨组织，室温下培养40min并间歇进行混合(每 10min)。将混悬液在4℃、800g离心5min，将沉淀用10ml含2mML- 谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM Ham’s F-12 溶液洗涤3次。然后用1ml含B27(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、 2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20ng/ml EGF、 20ng/ml FGF-2和2μg/ml肝素的神经基底培养基重悬细胞。无菌条件 下，在6孔培养板中加入25000-100000细胞/ml浓度的细胞液。培 养板在37℃、5％CO2条件下培养，每周更换约2/3的培养液(参考： Ray J，Peterson DA，Schinstine M，Gage FH(1993)Proliferation， differentitation and long-term culture of primary hippocampal neurons.Proc Natl Acad Sci USA 90：3602-6)。

海马干细胞培养3周后，进行冻融，然后按照标准操作步骤(Qiagen 的RNeasy试剂盒)分离RNA。用oligodT引物和Superscript II逆 转录酶(Gibco)按照标准操作步骤合成cDNA并进行PCR，PCR反 应参数如下：94℃变性10min，随后共进行30个循环，每个循环包 括94℃30s，55℃50s，72℃60s。循环完成后再在72℃延伸5min， 4℃保存。使用了下述引物对：

ee3_plus  5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′

和ee3 minus  5′-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′。

最近，人们认识到了神经性疾病发病过程中，新的神经细胞形成 (神经发生)的重要性。与其它许多组织不同，成熟的脑组织只具有 有限的再生能力。并且由于细胞通常具有高度特异性，使得健康组织 不可能替代损伤组织的功能。而由成年脑组织前体细胞发育出的神经 细胞，在理论上可以替代损伤组织的功能。

神经发生过程出现在成熟脑组织的个别区域，如侧脑室的吻端室 下区(SVZ)和齿状回(DG)的亚粒状区(SGZ)。很多试验证明神 经的损伤能够诱导神经发生(例如，脑萎缩症(Jin等人(2001)，Proc.Nati。 Acad.Sci.USA，98，4710-5；Jiang等人(2001)，Stroke，32，1201-7； Kee等人(2001)，Exp.Brain.Res.，136，313-20；Perfilieva等人(2001)， J.Cereb.Blood flow Metab.，21，211-7))。人体中也有神经发生现象 (Eriksson等人(1998)，Nat Med，4，1313-7.)，并确实产生了有功能的 神经元(van Praag等人(2002)，Nature，415，1030-4)。在成人的一生 中，齿状回的亚粒状区和门区可能产生新的神经元(Gage等人(1998)， J Neurobiol，36，249-66)。在海马的神经干细胞中能够很明显的观察 到ee3(图25)，这说明了ee3对于神经发生的重要性。ee3在神经发 生中的重要性是ee3对任何神经变性疾病普遍有效的进一步证明。

与ee3作用于脑组织内源性干细胞不同，在治疗方法中，ee3是在 体外处理干细胞(例如，体外的分化和增殖)。目前，干细胞由于其 有效性应用于很多种神经变性疾病，特别是帕金森氏病和中风。人们 希望，在体外分化细胞，再移植到帕金森氏病患者体内，以此来补偿 注射后的多巴胺能缺乏(替代疗法)(Arenas(2002)，Brain Res.Bull， 57，795-808；Barker(2002)，Mov.Disord.，17，233-41)。另一种导入 干细胞的可能方式是，例如对中风或脑损伤患者进行动脉或静脉注射 (Mahmood等人(2001)，Neurosurgery，49，1196-203；Discussion 1203- 4，Lu等人(2001)，J Neurotrauma，18，813-9；Lu等人(2002)，Cell Transplant，11，275-81；Li等人(2002)，Neurology，59，514-23)。干细胞 疗法中ee3的另一个可能的用途是制备持续分泌ee3激动剂或拮抗剂 的细胞。

实施例15

从非洲爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Dario rerio)克隆其它 ee3受体家族相关受体

根据本发明序列的同源标准可以克隆ee3蛋白家族的其它成员。 应用TBLASTN，以人ee3_1的蛋白序列在EST数据库中检索，得到 了爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Dario rerio)的EST序列。用 标准方法对所述EST序列测序，结果如下：

x1_ee3(非洲爪蟾)的全长序列：

CCCGGGCACGTTACCGTATTGATGTTACTAGTAGCGCACAGAAACATCCTGGTCTAAGCAGTTGCAGCAGGTACTGCGTT

GTAGTGGCGGTAGTTACGACTCTGTAGGTTAGAGCGGAGGCTTTGCTGGAGCAATGTCCGCCTAGTGAAGCTCGGAGAGG

TGCTCGCACCATGAATCTTAGGGGCCTCTTCCAGGATTTTAACCCCAGTAAATTTCTCATCTACGCATGTTTGTTGCTCT

TTTCTGTTCTCCTTTCCCTGCGACTGGATAATATTATTCAGTGGAGTTACTGGGCGGTGTTTGCTCCAATATGGTTGTGG

AAACTAATGGTTATTGTGGGAGCCTCAGTTGGTACAGGTGTATGGGCACGTAACCCTCAATACAGGGCAGAAGGTGAAAC

ATGTGTGGAGTTCAAGGCCATGCTAATTGCAGTGGGAATTCATTTGCTGCTTCTTATGTTTGAAGTTCTTGTTTGCGATC

GTATTGAAAGAGGAAACCACTACTTCTGGTTGCTAGTCTTTATGCCTTTATTCTTTGTGTCCCCAGTATCCGTTGCAGCT

TGCGTTTGGGGCTTTCGGCATGATCGATCATTGGAATTGGAAATCTTGTGCTCCGTCAATATTCTGCAGTTTATATTCAT

TGCCCTAAGACTTGACAGCATCATCACTTGGCCTTGGCTTGTGGTATGTGTCCCGCTGTGGATCCTTATGTCCTTCCTGT

GCCTAGTAGTTCTGTATTATATTGTGTGGTCAGTTCTGTTCCTGCGTTCAATGGATGTTATTGCAGAACAAAGGAGAACT

CATATTACTATGGCAGTCAGTTGGATGGCTATAGTTGTACCGCTTCTGACATTCGAGATATTACTTGTTCATCGACTTGA

TGGGCACAATCCATTATCGAATATCCCTATATTTGTTCCGCTTTGGCTTTCCTTAATAACGTTGATGGCAACAACCTTTG

GACAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGGATTCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTGTTGGAGATTTTCCCTTTTCTT

CGAGAATATGGCAATATCTCATATGATATTCATCATGAAGACAGTGAAGATGCTGAAGAAACACCTGTACCGGAGCCCCC

CAAAATCGCACCAATGTTTCGAAAGAAGACTGGCGTTGTCATTACCCAGAGCCCAGGGAAATATATTGTTCCTCCTGCTA

AACTTAACATCGACATGCCGGATTAAGGTGAAATTTGGTGGCTTGAGGGCACTTTTTTCTGTTTTAACTAATCCTGTTAG

TAGTACACTATCAGGTGTCATGGACTGAAGGGAAAAAAAGACTACTGACCTCATTCCTTTTTTGTATTCATTTGTAATTT

TTTTTGTTCCTGCAATGGTATGTGTTTTCCCATTCCTAATTCATGTCATCATGTTACTCAAGATCAGGGAAGCTTCTTAA

GGGCAAAGAATGCTGGAATTTGTAGTTTATAATTTGTGGATGACTATAAATTTTCACATCTGTTGTCTTGGTAATGACTG

CAGTCTTGCATTCTAGTTTCTAGTAACACAGAGATAGACCAGCTGTGGCCCTCCAGATACTGAGCTAACAAGCTTTGGGA

GACATCCTGGGAATCTTAGCAGCTCTGGGGCCACAGGTTGGACTTCTCAGCAGTAAAATTAAGTATAATGTTTATCTTAA

GTAAATGTCTTTGTGTGTGTTGTTATGCAATGCAGCTATTGTTTGATATCTTTAcagcagaacttgtgcatagaattgaa

ttcaagttgtgagctgttttataccactataaaaatacttttAAAAAAAAATCTGTTTAAGGGTCAAGCATTACCTTGGA

GAAGTGATATTTGAGCAGAGGGCTTATGGGATATATCTAATATACACCTTCCCTTAGGAGTTACTACTCCTTGCTCACTT

GTATAGTATTTATAAGAACATTTTATCAATGTAATATATTGTGTTCAAAATTATTCTTATGTACAGTATAAATGGATAAA

TACAAAGTATTTTTTTAAATAAAAGATGTAAAATACATATAAGTTGTCAAAATTTTGTTTGTAATTTACATTTTAAAATG

ATCTATGTGAATTCTACAATGAAAAAAGATCTATACAATTTCAAAAGCCAGTATGTCATTTTTATATACTGACCATGTAC

ATATTATGTAAGATGTAAAGCCAAACACCAATGACATGAATGTTAAGTTATTAGACTATGAATAAAACATTGATTTTATT

TTATGTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

x1_ee3的开放阅读框：

ATGAATCTTAGGGGCCTCTTCCAGGATTTTAACCCCAGTAAATTTCTCATCTACGCATGTTTGTTGCTCTTTTCTGTTCT

CCTTTCCCTGCGACTGGATAATATTATTCAGTGGAGTTACTGGGCGGTGTTTGCTCCAATATGGTTGTGGAAACTAATGG

TTATTGTGGGAGCCTCAGTTGGTACAGGTGTATGGGCACGTAACCCTCAATACAGGGCAGAAGGTGAAACATGTGTGGAG

TTCAAGGCCATGCTAATTGCAGTGGGAATTCATTTGCTGCTTCTTATGTTTGAAGTTCTTGTTTGCGATCGTATTGAAAG

AGGAAACCACTACTTCTGGTTGCTAGTCTTTATCCCTTTATTCTTTGTGTCCCCAGTATCCCTTGCAGCTTGCGTTTGGG

GCTTTCGGCATGATCGATCATTGGAATTGGAAATCTTGTGCTCCGTCAATATTCTGCAGTTTATATTCATTGCCCTAAGA

CTTGACAGCATCATCACTTGGCCTTGGCTTGTGGTATGTGTCCCGCTGTGGATCCTTATGTCCTTCCTGTGCCTAGTAGT

TCTGTATTATATTGTGTGGTCAGTTCTGTTCCTGCGTTCAATGGATGTTATTGCAGAACAAAGGAGAACTCATATTACTA

TGGCAGTCAGTTGGATGGCTATAGTTGTACcGCTTCTGACATTCGAGATATTACTTGTTCATCGACTTGATGGGCACAAT

CCATTATCGAATATCCCTATATTTGTTCCGCTTTGGCTTTCCTTAATAACGTTGATGGCAACAACCTTTGGACAGAAAGG

AGGCAATCACTGGTGGTTTGGGATTCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTGTTGGAGATTTTCCCTTTTCTTCGAGAATATG

GCAATATCTCATATGATATTCATCATGAAGACAGTGAAGATGCTGAAGAAACACCTGTACCGGAGCCCCCCAAAATCGCA

CCAATGTTTCGAAAGAAGACTGGCGTTGTCATTACCCAGAGCCCAGGGAAATATATTGTTCCTCCTGCTAAACTTAACAT

CGACATGCCGGATTAA

xl_ee3的蛋白质序列

MNLRGLFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLSLRLDNIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIVGASVGTGVWARNPQYRAEGETCVE

FKAMLIAVGIHLLLLMFEVLVCDRIERGNHYFWLLVFNPLFFVSPVSVAACVWGFRBDRSLELEILCSVNILQFIFIALR

LDSIITWPWLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMAVSWMAIVVPLLTFEILLVHRLDGHN

PLSNIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIREDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDIHHEDSEDAEETPVPEPPKIA

PMFRKKTGVVITQSPGKYIVPPAKLNIDMPD

斑马鱼(D.Rerio)的序列如下(dr_ee3)：

CTCGAGCACTGTTGGCCTACTGGGATGTGAGTGCCAGTCAGCTAGCCAGCCTCTCCTTTTCAGTTCATGTAACTATGGTC

TGAAGAGGAAACCATGAATCTCCGAGGCGTTTTCCAAGATTTCAACCCCAGTAAGTTCCTGATCTACGCATGTCTGCTGC

TCTTCTCTGTGCTGCTGTCACTGAGGCTGGATGGCATCATCCAGTGGAGCTACTGGGCCGTGTTTGCGCCCATCTGGCTC

TGGAAGCTCATGGTCATCATCGGGGCGTCTGTGGGCACTGGAGTGTGGGCTCACAACCCGCAGTACAGGGCTGAAGGGGA

GACGTGTGTGGAGTTTAAGGCCATGCTGATCGCAGTGGGAATCCACCTGCTCCTGCTCACCTTCGAGGTGCTGGTCTGCG

AGCGCGTGGAACGGGCTTCCATCCCCTACTGGCTCCTGGTGTTCATGCCGCTCTTCTTCGTCTCTCCGGTGTCAGTGGCA

GCGTGTGTGTGGGGATTCAGACACGACCGCTCGCTGGAGCTGGAGATTCTGTGCTCTGTAAATATTCTTCAGTTTATCTT

CATCGCTCTGAAACTGGACGGGATCATCAGCTGGCCGTGGCTGGTGGTGTGTGTGCCGCTCTGGATCCTCATGTCCTTCT

TGTGTCTGGTGGTcctctattatatcgtgtggtctgTGCTGTTTCTGCGCTCCATGGATGTGATCGCGGAGCAGCGGCGC

ACACACATCACCATGGCCATCAGCTGGATGACTATAGTCGTGCCCCTGCTCACTTTTGAGATTCTCCTCGTCCACAAGCT

gGATAATCATTATAGCCCCAACTACGTcCCGGTGTTTGTTCCTCTCTGGGTTTCTTTAGTGACTCTAATGGTGACCACAT

TTGGCCAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGCATCCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTgCTGGAGCTCTTCCCGTTC

CTCAGGGAATATGGCAACATCTACTATGACCTGCATCACGAGGACTCAGACATGTcCGAGGAGTTGCCCATTCACGAGGT

GCCCAAAATCCCTACCATGTTTAgCAAGAAGACGGGGGTGGTGATCACCCAAAGCCCTGGGAAATACTTTGTGCCCCCAC

CCAAACTGTGCATCGACATGCCAGACTAACATTGGAGCTCTCGTATACAGTATAGCACTATGCAATGGAATTCGCTTTGT

TACGTgCTGTTGAAGACGGcAACAACAATCCCATTAAACTCGGCTCTTGTTTCCTAAAAAAAATAGCTGCGCAAACGGAC

CTGTTGACATCA

dr_ee3的开放阅读框：

ATGAATCTCCGAGGCGTTTTCCAAGATTTCAACCCCAGTAAGTTCCTGATCTACGCATGTCTGCTGCTCTTCTCTGTGCT

GCTGTCACTGAGGCTGGATGGCATCATCCAGTGGAGCTACTGGGCCGTGTTTGCGCCCATCTGGCTCTGGAAGCTCATGG

TCATCATCGGGGCGTCTGTGGGCACTGGAGTGTGGGCTCACAACCCGCAGTACAGGGCTGAAGGGGAGACGTGTGTGGAG

TTTAAGGCCATGCTGATCGCAGTGGGAATCCACCTGCTCCTGCTCACCTTCGAGGTGCTGGTCTGCGAGCGCGTGGAACG

GGCTTCGATCCCCTACTGGCTCCTGGTGTTCATGCCGCTCTTCTTCGTCTCTCCGGTGTCAGTGGCAGCGTGTGTGTGGG

GATTCAGACACGACCGCTCGCTGGAGCTGGAGATTCTGTGCTCTGTAAATATTCTTCAGTTTATCTTCATCGCTCTGAAA

CTGGACGGGATCATCAGCTGGCCGTGGCTGGTGGTGTGTGTGCCGCTCTGGATCCTCATGTCCTTCTTGTGTCTGGTGGT

cctctattatatcgtgtggtctgTGCTGTTTCTGCGCTCCATGGATGTGATCGCGGAGCAGCGGCGCACACACATCACCA

TGGCCATCAGCTGGATGACTATAGTCGTGCCCCTGCTCACTTTTGAGATTCTCCTCGTCCACAAGCTgGATAATCATTAT

AGCCCCAACTACGTcCCGGTGTTTGTTCCTCTCTGGGTTTCTTTAGTGACTCTAATGGTGACCACATTTGGCCAGAAAGG

AGGCAATCACTGGTGGTTTGGCATCCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTgCTGGAGCTCTTCCCGTTCCTCAGGGAATATG

GCAACATCTACTATGACCTGCATcACGAGGACTCAGACATGTcCGAGGAGTTGCCCATTCACGAGGTGCCCAAAATCCCT

ACCATGTTTAgCAAGAAGACGGGGGTGGTGATCACCCAAAGCCCTGGGAAATACTTTGTGCCCCCACCCAAACTGTGCAT

CGACATGCCAGACTAA

和dr_ee3的蛋白序列：

MNLRGVFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLSLRLDGIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIIGASVGTGVWAHNPQYRAEGETCVE

FKAMLIAVGIHLLLLTFEVLVCERVERASIPYWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGFRHDRSLELEILCSVNILQFIFIALK

LDGIISWPWLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMAISWMTIVVPLLTFEILLVHKLDNHY

SPNYVPVFVPLWVSLVTLMVTTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLLELFPFLREYGNIYYDLHHEDSDMSEELPIHEVPKIP

TMFSKKTGVVITQSPGKYFVPPPKLCIDMPD

图27通过例举非洲爪蟾和斑马鱼蛋白序列，再次说明了ee3家族 的高度进化保守性。

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