一种NAD在制备帕金森病药物中的应用
阅读：762发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种NAD在制备帕金森病药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种NAD在制备 帕金森病 药物中的应用，本发明发现NAD体内可减轻帕金森病小鼠的运动功能障碍和黑质纹状体的多巴胺能神经元损伤，在体外可减轻6-OHDA对PC12细胞造成的损伤、 氧 化应激反应和线粒体功能障碍，为制备 预防 和/或 治疗 帕金森病的药物提供分子靶点和研发方向。，下面是一种NAD在制备帕金森病药物中的应用专利的具体信息内容。
一种NAD在制备帕金森病药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大常见的神经退行性疾病，是一种由基因和环境等多因素共同导致的复杂疾病，平均发病年龄为60岁左右，我国65岁以上人群PD 患病率约为1.7％。PD临床表现包括一系列运动功能障碍和非运动症状，运动功能障碍主要表现为运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势步态异常，是PD最典型的症状；近些年其非运动症状也逐渐被重视，主要包括认知障碍、嗅觉功能障碍、睡眠障碍和自主神经功能障碍等，这些症状常远远早于运动障碍发生且严重影响患者的生活质量。药物治疗虽然是目前PD 最主要的治疗手段，但只能部分缓解PD患者的运动症状，不能阻止疾病的发生发展，且长期使用左旋多巴治疗还可能导致症状波动和异动症，因此探索PD防治的新方案将为PD的治疗提供新的方向。
[0003] NAD是由磷酸基团连接的两个核苷酸构成的二核苷酸，以氧化态NAD+和还原态 NADH两种形式存在。既往NAD都被认为只具有在氧化还原反应传递电子的功能，后来发现它可以作为NAD消耗酶的辅因子，包括去乙酰化酶(Sirtuins,Sirt)、多聚腺嘌呤核苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerases，PARPs)和CD38/157胞外酶等，NAD可以与上述这些酶一起协同调控线粒体功能、生物钟节律和重要生物活性衍生物的合成等过程。相关研究表明通过给予NAD的关键中间产物/前体，例如烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)和烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)，或者通过调控NAD合成和消耗关键酶活性可显著改善某些神经退行性疾病的功能障碍。
[0004] 但是，目前还缺乏关于NAD应用于帕金森病的相关研究报道。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种NAD在制备帕金森病药物中的应用，在此之前并没有NAD用于制备预防和/或治疗帕金森病药物的相关研究。
[0006] 本发明提供了一种NAD在制备帕金森病药物中的应用。
[0007] 进一步的，所述药物以NAD为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
[0008] 进一步的，所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
[0009] NAD预干预可改善6-OHDA损伤小鼠双侧上肢使用的不平衡以及增加6-OHDA损伤小鼠可承受的转棒速度和在棒时间，但对其在开放场中的自主运动减少没有明显改善。NAD 预干预还可减少右侧黑质和纹状体多巴胺能神经元和纤维的丢失、增加右侧纹状体TH蛋白表达。在体外NAD预干预可减轻6-OHDA造成的PC12细胞活性下降、细胞形态损伤、 ROS释放增加和SOD水平降低，增加线粒体数目、维持正常线粒体膜电位和细胞ATP水平。NAD在体内体外均可增加Sirt3的蛋白表达，揭示了NAD的相关药物可以成为治疗帕金森病药物的一种有效手段。
[0010] 有益效果
[0011] 本发明发现NAD体内可减轻帕金森病小鼠的运动功能障碍和黑质纹状体的多巴胺能神经元损伤，在体外可减轻6-OHDA对PC12细胞造成的损伤、氧化应激反应和线粒体功能障碍，为制备预防和/或治疗帕金森病的药物提供分子靶点和研发方向。附图说明
[0012] 图1为NAD预干预改善PD小鼠的运动功能障碍的示意图；其中，A为开放场实验中PD小鼠运动距离，B为开放场实验中PD小鼠站立次数，C为圆筒中PD小鼠左侧前肢使用频率， D为转棒实验中PD小鼠能承受的转棒速度，E为转棒实验中PD小鼠在转棒上的时间；
[0013] 图2为NAD预干预改善PD小鼠黑质纹状体的多巴胺能神经元丢失的示意图；其中，A-D 为PD小鼠右侧黑质和纹状体TH阳性染色面积比例，E为PD小鼠右侧纹状体TH蛋白表达；
[0014] 图3为6-OHDA干预浓度(A)以及NAD预干预减轻6-OHDA造成的PC12细胞活性损伤(B)和氧化应激反应(C-F)的示意图；
[0015] 图4A-F为NAD预干预减轻6-OHDA造成的PC12细胞形态损伤的示意图；
[0016] 图5A-B为NAD预干预减轻6-OHDA造成的PC12细胞线粒体数量减少的示意图；
[0017] 图6A-B为NAD预干预改善6-OHDA造成的PC12细胞线粒体膜电位下降的示意图；
[0018] 图7A-E为NAD预干预改善6-OHDA造成的PC12细胞线粒体能量合成障碍的示意图；
[0019] 图8A-J为NAD调控PC12细胞的Sirt3表达的示意图。
具体实施方式
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0021] 本实施例采用25-30g雄性C57BL/6小鼠，购买自上海斯莱克实验动物有限公司)。
[0022] 实施例1
[0023] (1)NAD干预
[0024] 采用右侧纹状体单点注射10ug 6-OHDA构建PD小鼠模型，并在注射6-OHDA前4h 同点注射20ug NAD进行干预。
[0025] 造模4周后依次进行开放场、圆筒和转棒实验检测小鼠运动功能；行为学检测完成后取材，石蜡切片免疫组化染双侧黑质和纹状体酪氨酸羟化酶(TH)，Western Blot检测双侧纹状体TH和Sirt3相关蛋白表达。体外采用6-OHDA损伤PC12细胞构建PD细胞模型，并提前2h给予NAD干预，检测PC12细胞活性、形态、氧化应激和线粒体功能变化以及Sirt 相关蛋白表达。
[0026] (2)实验结果
[0027] ①NAD预干预可改善PD小鼠模型的运动功能障碍
[0028] 开放场、圆筒及转棒实验的结果显示，6-OHDA组小鼠5min内在开放场中的运动距离较Control组有减少的趋势(F(3,49)＝5.175,P＝0.0038,post hoc:Control vs 6-OHDA,P＝ 0.157)、站立次数相对于Control组小鼠明显减少(F(3,49)＝10.99,P<0.001,post hoc:Control vs 6-OHDA,P<0.001)，而NAD预干预对小鼠在开放场中的运动距离和站立次数无明显影响，无论是Control组还是6-OHDA组小鼠(P>0.05,图1A,B)；在圆筒实验中，Control组以及Control+NAD组小鼠双侧上肢使用频率基本一致，而6-OHDA组小鼠左侧上肢使用频率明显减少(F(3,49)＝14.82,P<0.001,post hoc:Control vs 6-OHDA,P<0.001)，NAD预干预后帕金森病小鼠左侧上肢使用频率明显增加(P<0.001,图1C)；转棒实验反映小鼠的运动协调能力，6-OHDA损伤小鼠较Control组小鼠在棒时间(F(3,49)＝5.411,P＝0.0027,post hoc: Control vs 6-OHDA,P＝0.002)和能承受的转棒速度(F(3,49)＝6.409,P<0.001,post hoc:
Control vs 6-OHDA,P<0.001)明显降低，而NAD预干预能明显增加帕金森病小鼠的在棒时间和能承受的转棒速度(P<0.05，图1D；P＝0.05，图1E)。
Control vs 6-OHDA,P<0.001)明显降低，而NAD预干预能明显增加帕金森病小鼠的在棒时间和能承受的转棒速度(P<0.05，图1D；P＝0.05，图1E)。
[0029] 可以看出，20ug NAD预干预可增加PD小鼠左侧上肢的使用频率、降低双侧上肢使用频率的差异，而在转棒实验中提前注射20ug NAD可明显增加PD小鼠的在棒时间和能承受的转棒速度，这两个实验均表明NAD预处理可以减轻PD小鼠的运动不协调性。
[0030] ②NAD可预防PD小鼠模型黑质纹状体的多巴胺能神经元丢失
[0031] 如图2所示，相对于Control组，6-OHDA组小鼠右侧黑质TH阳性染色面积比例较左侧减少约45％(F(3,17)＝15.02,P<0.001,post hoc:Control vs 6-OHDA＝1.000±0.100vs 0.550 ±0.035,n＝6vs 5,P<0.001)，而提前给予NAD干预可显著增加帕金森病小鼠右侧黑质TH 阳性染色面积比例(6-OHDA vs 6-OHDA+NAD＝0.550±0.035vs 0.777±0.023,n＝
5vs 4,P ＝0.0318,图2A,B)；纹状体组化染色也观察到了相似结果，相对于Control组，6-OHDA组小鼠右侧纹状体TH阳性染色面积比例较左侧减少约47.2％(F(3,17)＝11.28,P＝
0.003,post hoc:Control vs 6-OHDA＝1.000±0.106vs 0.528±0.025,n＝6vs 5,P＝
0.0041)，提前给予 NAD干预可显著增加帕金森病小鼠右侧纹状体的TH阳性染色面积比例(6-OHDA vs 6- OHDA+NAD＝0.528±0.025vs 0.836±0.020,n＝5vs 4,P＝0.0422,图2C,D)。右侧纹状体 Western Blot也证实了上述结果，6-OHDA组小鼠右侧纹状体TH蛋白表达量较左侧明显减少，而NAD提前干预后可增加右侧纹状体的TH蛋白表达量(图2E)。
5vs 4,P ＝0.0318,图2A,B)；纹状体组化染色也观察到了相似结果，相对于Control组，6-OHDA组小鼠右侧纹状体TH阳性染色面积比例较左侧减少约47.2％(F(3,17)＝11.28,P＝
0.003,post hoc:Control vs 6-OHDA＝1.000±0.106vs 0.528±0.025,n＝6vs 5,P＝
0.0041)，提前给予 NAD干预可显著增加帕金森病小鼠右侧纹状体的TH阳性染色面积比例(6-OHDA vs 6- OHDA+NAD＝0.528±0.025vs 0.836±0.020,n＝5vs 4,P＝0.0422,图2C,D)。右侧纹状体 Western Blot也证实了上述结果，6-OHDA组小鼠右侧纹状体TH蛋白表达量较左侧明显减少，而NAD提前干预后可增加右侧纹状体的TH蛋白表达量(图2E)。
[0032] 可以看出，6-OHDA可导致线粒体数量的下降、正常膜电位的破坏以及ATP生成能力的下降，线粒体marker的明显代偿性表达增加也反映线粒体的损伤，而NAD预处理可以有效减轻线粒体损伤、增加线粒体数量、提高线粒体膜电位至接近正常以及增加ATP产生。
[0033] ③NAD可减轻6-OHDA造成的PC12细胞活性、细胞形态损伤和氧化应激反应[0034] 由于6-OHDA是多巴胺衍生物，可被多巴胺能神经元摄取后损伤其线粒体，因此不同浓度6-OHDA(1uM、10uM、25uM、50uM、100uM、200uM、250uM)干预24h可成剂量依赖性降低PC12细胞活性(F(6,14)＝616.1,P<0.001)，其中200uM能损伤最接近50％的细胞活性(P<0.001)，因此200uM被选作后续细胞实验中6-OHDA干预浓度(图3A)； 200uM NAD预干预2h可明显改善6-OHDA造成的细胞活性损伤((F(6,14)＝81.46,P< 0.001,post hoc:6-OHDA vs 6-OHDA+200μM NAD,P＝0.0042,图3B)。为了避免NAD可直接与6-OHDA反应从而显现出假性的保护作用，我们共孵育了6-OHDA和NAD以观察 NAD是否可直接影响6-OHDA的氧化过程，这主要是利用6-OHDA的氧化产物在490nm 处有特殊吸光度；结果显示，6-OHDA在观察的6min内逐渐氧化，颜色变深、氧化产物吸光度逐渐增加，而加入NAD并未改变这一变化趋势，表明NAD并不直接影响6-OHDA的自身氧化(图3C)。
[0035] 此外，200uM 6-OHDA孵育24h会导致PC12细胞内NAD水平的耗竭(F(5,12)＝52.99, P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P＝0.0032)，而在培养基中提前2h添加50uM和200uM NAD可有效防止6-OHDA造成的这种NAD耗竭(P＝0.0081and P＝0.0039respectively, 图3D)；200uM 6-OHDA孵育24h还会导致明显的SOD活性下降(F(5,12)＝4.22,P＝0.019) 和ROS产生增加(F(5,12)＝224.3,P<0.001)，而提前用NAD干预可减弱这种变化，尤其是 200uM NAD(P<0.05,图3E,F)。
[0036] 从细胞形态上来看，正常状态下的PC12胞体光滑圆润、有很多细长分枝(图4A)，而6-OHDA干预24h后细胞明显挛缩、贴壁性明显变差、大片细胞脱落(图4C)，而提前加入NAD干预可改善这一形态变化，且有一定剂量依赖作用(图4D,E,F)，而NAD对正常PC12形态并无明显影响(图4B)。
[0037] ④NAD预干预可减轻6-OHDA造成的PC12细胞线粒体功能障碍
[0038] 采用Mito-tracker Green对线粒体进行荧光染色并定量，以明确NAD和6-OHDA对线粒体数量的影响。结果显示，6-OHDA孵育2h即可导致PC12细胞内线粒体数量的显著下降(F(5,30)＝23.48,P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P<0.001)，而NAD提前2h孵育可明显改善这种线粒体数量的下降，且存在一定剂量依赖性(P<0.05,图5A,B)。
[0039] 为进一步观察6-OHDA和NAD是否会影响细胞的MMP，采用JC-1染色来反映细胞的MMP变化。结果显示，正常PC12细胞以红色荧光为主，红/绿荧光强度比约为1.908； 6-OHDA孵育2h导致绿色荧光强度明显增加，该比值显著下降至0.915左右(F(5,30)＝ 11.24,P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P＝0.001)；200uM NAD提前2h孵育可明显增加红色荧光强度，提高此比值至1.868左右(post hoc:6-OHDA vs 6-OHDA+200uM NAD,P＝ 0.001,图
6A,B)。
6A,B)。
[0040] 此外，还评估了线粒体的能量合成功能。相对于Ctr组，6-OHDA干预2h会造成ATP 含量的显著下降(F(5,12)＝141.8,P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P<0.001)，而200uM NAD提前2h干预可明显增加PC12细胞内的ATP含量(post hoc:6-OHDA vs 6-OHDA+ 200uM NAD,P<0.001,图7A)；从qPCR和Western Blot结果来看，6-OHDA损伤造成了线粒体能量合成marker的代偿性增加，包括ATP6、ND1和COX2。相对于Ctr组， 200uM 6-OHDA孵育2h造成ATP6表达增加约145.4倍(F(5,12)＝64.46,P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P<0.001，图7B)，ND1增加约187.2倍(F(5,12)＝35.61,P<0.001,post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P＝0.0152，图7C)，COX2增加约2.906倍(F(5,12)＝6.944,P＝0.0029, post hoc:Ctr vs 6-OHDA,P＝0.0104,图7D)，而NAD提前2h孵育可明显减轻线粒体 marker的表达量，无论是10uM、50uM还是200uM，但并没有发现剂量依赖效应(P<0.05, 图7B,C,D)。Western Blot结果与上述qPCR结果一致(图7E)。
[0041] ⑤NAD可调控PC12细胞的Sirt3表达
[0042] 不同浓度的6-OHDA孵育PC12细胞24h会造成Sirt3蛋白表达下降(F(5,12)＝6.273, P＝0.004)，在200uM达到统计学差异(post hoc:Ctr vs 200uM 6-OHDA,P＝0.002，图8A, B)，而未发现6-OHDA会对Sirt1和Sirt2表达产生显著影响；从干预时间来看，200uM 6-OHDA会造成时间依赖性地Sirt3表达下降(F(5,12)＝17.247,P<0.001)，而对Sirt1和 Sirt2表达无明显影响(P>0.05,图8C,D)。
[0043] 无论在细胞总蛋白(F(5,18)＝8.256,P<0.001,图8E,F)中还是在线粒体蛋白(F(5,18)＝ 9.751,P<0.001,图8G,H)中，6-OHDA干预24h都会造成Sirt3表达下降，而不同浓度 NAD提前孵育2h可显著增加Sirt3的表达，无论是10uM、50uM还是200uM.我们也在体内验证了这一现象，结果显示10ug 6-OHDA注射造成了右侧纹状体Sirt3表达量较左侧下降了18.1％左右(P＝0.048)，而20ug NAD的提前注射可以增加右侧纹状体Sirt3表达，但未达到统计学差异(P＝0.071,图8I,J)。P53和SOD2是被报道的Sirt3经典下游靶分子，未发现NAD干预可以对P53和SOD2的乙酰化产生影响(图8E,G,I)。
[0044] 本实施例采用6-OHDA损伤C57小鼠和PC12细胞的PD体内体外模型，通过NAD 预干预，首次阐明了NAD对PD小鼠模型的保护作用。发现NAD体内可减轻帕金森病小鼠的运动功能障碍和黑质纹状体的多巴胺能神经元损伤，在体外可减轻6-OHDA对PC12 细胞造成的损伤、氧化应激反应和线粒体功能障碍，为理解帕金森病和骨质疏松症这两个常见老年疾病的共同发病机制提供分子靶点和方向。
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