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木豆素及其组合物在改善学习记忆方面的用途

阅读：598发布：2020-05-14

专利汇可以提供木豆素及其组合物在改善学习记忆方面的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了木豆素在改善学习记忆障碍方面的新用途。本发明通过动物实验首先证明并公开了木豆素及其组合物能够有效地改善模型动物的学习记忆障碍行为。本发明进一步公开了木豆素能够应用于制备改善学习记忆障碍的药物、保健品和食品的用途。，下面是木豆素及其组合物在改善学习记忆方面的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.木豆素及其组合物在制备改善学习记忆障碍药物、保健品或食品中的用途。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：木豆素(Cajaninstilbeneacid)的化学名称为2-羧基-3-羟基-4-异戊烯基-5-甲氧基芪，2-carboxyl-3-hydroxy-4-prenyl-5-methoxystilben)。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：木豆素可从木豆叶(Cajanus cajan(L.)Millsp.)中或者其他含有木豆素的植物中提取分离得到；也可以通过化学合成的方式合成。
4.按照权利要求1所述的一种改善学习记忆障碍的药物组合物，其特征在于：所述药物为由治疗上有效的木豆素与药学上可接受的载体组成，可以为木豆素加工成的胶囊(软胶囊)、颗粒剂(干悬混剂)、片剂(分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片)、溶液剂(糖浆)、丸剂(浓缩丸、滴丸、微丸)、或注射剂型等。
5.权利要求1-4所述的化合物木豆素及其组合物的改善学习记忆障碍活性，及其在制备改善学习记忆障碍药物中的应用。
6.权利要求1-4所述的化合物木豆素及其组合物在制备改善学习记忆障碍保健品和食品中的应用。

说明书全文

木豆素及其组合物在改善学习记忆方面的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及木豆素(Cajaninstilbene acid，CSA)(化学名：2-羧基-3-羟基-4-异戊烯基-5- 甲氧基芪，2-carboxyl-3-hydroxy-4-prenyl-5-methoxystilben)的一种新的药理用途，尤其涉及木豆素及其组合物在制备改善学习记忆障碍药物、保健品和食品中的用途，属于木豆素的功效用途领域。

背景技术

[0002] 学习记忆障碍是许多疾病可能出现的症状群。引起学习记忆障碍的原因多种多样，如包括阿尔茨海默病和帕金森病等在内的神经退行性病变、应激、衰老、脑缺血性损伤、脑外伤、高血压、糖尿病、更年期综合症和抑郁症等。其中阿尔茨海默病是最常见的一种学习记忆障碍性疾病，临床上的药物只能减轻症状，不能延缓或终止其进程，并且在不同患者身上产生的疗效不一致，有较多的不良反应。另外，目前人们的工作和生活节奏加快，竞争压力增加，长期处于慢性应激状态中，导致机体协调失衡、功能紊乱，尤其是影响大脑认知功能，导致学习记忆能力下降等。因此，现在迫切需要改善学习记忆障碍的药物。

[0003] 从植物中开发新的毒副作用小的益智药物一直以来都是研究的热点。木豆[Cajanus cajan (L.)Millsp.]是一种分布于热带和亚热带地区的豆科植物，为世界第六大食用豆类，也是唯一的木本食用豆类。并且木豆可以作为传统民族药物被广泛使用。其中，木豆叶可以止血、止痛、杀虫，用于肝炎、麻疹、痢疾、黄疸、腹泻、溃疡、咳嗽和支气管炎等。研究表明，木豆叶的水或乙醇提取物具有抗骨质疏松、降血脂、抗氧化、抗菌、抗疱疹病毒等作用。木豆叶的主要活性成分是芪类和黄酮类化合物，而木豆素(Cajaninstilbene acid)(见附图1)是其中含量较高且活性较强的一个芪类化合物。有研究表明，木豆素具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗疱疹病毒及降血糖的药理活性。课题组前期从木豆叶中利用现代先进的提取技术制备了木豆素，对其在学习记忆方面的作用进行了研究，我们采用β-淀粉样蛋白寡聚体脑内注射和睡眠干扰造成的学习记忆障碍模型，发现木豆素可以显著改善模型小鼠的学习记忆水平，表现在可显著提高小鼠对新位置物体的相对辨别指数，缩短水迷宫实验中的寻台潜伏期，提高穿台次数，降低避暗实验中的错误次数和暗室时间，表明木豆素能够较好地改善学习记忆障碍。

[0004] 迄今为止，尚无木豆素改善学习记忆障碍的药理作用报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是将所述的化合物木豆素及其组合物应用于制备改善学习记忆障碍的药物、保健品或食品。

[0006] 本发明所述的上述目的通过以下技术方案来实现的：

[0007] 木豆素改善学习记忆障碍作用评价：本发明通过大量的实验发现，木豆素能够有效改善模型动物的学习记忆障碍样行为，从而可将木豆素制备成改善学习记忆的药物、保健品和食品。

[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种改善学习记忆障碍的药物组合物，该药物组合物由有效量的木豆素与药学上可接受的载体、赋型剂或稀释剂配合而成。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的木豆素。

[0009] 其中，可以向木豆素中加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂后，以常规的制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、口服制剂(片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸) 等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。

附图说明

[0010] 图1木豆素的化学结构

具体实施方式

[0011] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0012] 实验例1

[0013] 木豆素改善学习记忆障碍作用--对β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体所致小鼠学习记忆障碍的影响

[0014] 1、实验材料

[0015] 实验动物：ICR雄鼠，体重25-30g，72只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK(京)2016-0011。小鼠常规饲料，均由维通利华实验动物技术有限公司提供。ICR小鼠在SPF级环境中饲养，维持12h光照：12h黑暗昼夜节律，温度23-25℃，湿度45％-65％，各组均为6只/笼，自由饮水和饮食。

[0016] 药物及试剂：木豆素：由本实验室制备所得，HPLC纯度检查达98％。给药前药物用0.5％羧甲基纤维素钠分散配制。

[0017] 可溶性Aβ1-42寡聚体的制备：将Aβ1-42溶于冰冷的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，浓度为1mM，室温下密封放置2h，可去除其中预先存在的不同聚集态结构，使Aβ 单体化。将溶液分装，置于通风橱中室温下挥干HFIP，再用真空离心浓缩仪去除残余HFIP，形成无色透明薄膜状肽，它可在-80℃下保存6个月。使用前，用无水二甲基亚砜超声10min复溶，浓度为5mM，然后用无菌PBS(1×，0.01M)稀释到100μM，在4℃冰箱中孵育16h形成 Aβ1-42寡聚体。
手术前4℃，14000g离心10min，吸取上清液，然后用无菌PBS等体积稀释成50μM。

[0018] 2、实验方法

[0019] 分组：ICR雄鼠适应性饲养一周后，根据体重将动物随机分为6组，即空白对照组、假手术组、模型组、木豆素低剂量组(7.5mg/kg)、木豆素中剂量组(15mg/kg)和木豆素高剂量组(30mg/kg)，每组12只。

[0020] 造模：小鼠经水合氯醛(400mg/kg)麻醉后，剪去头顶部毛发，用75％酒精消毒皮肤。无菌PBS滴于双侧眼部，润湿眼球。沿正中线剪开皮肤5mm左右，推开皮下组织及骨膜，充分暴露颅骨。用棉签沾少许30％过氧化氢，擦拭颅骨表面，使骨缝完全暴露出来，找到前囟并标记，调整头颅在定位仪上的位置，使得前囟与后囟处在同一水平，颅骨正中线居中，且其两侧颅骨水平对称。按照小鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，在坐标为AP：-2.0mm， ML：±1.5mm处用记号笔标示出，再高速颅骨钻孔，清除孔内骨屑，并使用针头戳破硬脑膜，棉签止血。将微量进样器固定于脑立体定位仪的微量注射泵上，垂直进针1.5mm，左右两侧各缓慢注射(0.4μL/min)1μL Aβ1-42寡聚体溶液(即100pmol/只)。注射完后留针2min，再缓慢上调抽出微量进样器。缝合皮肤，青霉素粉消毒。小鼠在整个手术过程中用暖灯照射，以防其体温过低致休克，等小鼠苏醒后，再放回原鼠笼饲养。对应的假手术组注射部位相同，注射等量空白溶剂(含1％DMSO的PBS)。空白对照组不进行手术。

[0021] 给药：从手术后第1天开始，各给药组小鼠每天按剂量灌胃给药一次(i.g.20mL/kg)，空白对照组、假手术组和模型组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，一直持续到行为学检测结束。

[0022] 小鼠行为学检测：手术造模后第4天开始进行行为学检测，包括：物体位置识别、水迷宫和避暗实验。行为学测试期间，每只小鼠于检测前1h给药。

[0023] (1)物体位置识别实验：手术造模后第4天开始进行物体位置识别实验，实验分为3个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期为3天，每天将动物依次放入黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱(长×宽×高：60cm×40cm×80cm)内熟悉环境10min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内相邻的磁铁处固定(位置对称，距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10cm)。记录小鼠5min内对两物体的探索总时间。间隔20min 后，进入测试期。测试期内，将其中一个物体改变位置，移动至与另一物体成对角线的磁铁处固定，记录5min内小鼠对新位置物体和旧位置物体的探索时间。用相对辨别指数 (discrimination index，DI)来评价动物的学习记忆能力，计算公式为DI＝(N-F)/(N+F)，其中N(new)为新位置物体探索时间，F(familiar)为旧位置物体探索时间。每只小鼠测试完后及时对物体和试验箱进行清理以去除上只小鼠留下的气味。实验前准备好摄像机监控小鼠的运动路径，实验结束后人工计时，记录小鼠对新位置物体和旧位置物体的探索时间，小鼠头朝向物体周围2cm的范围内或者直接接触到物体都认为是对该物体的探索。

[0024] (2)水迷宫实验：手术造模后第9天开始进行水迷宫实验，分为：定位航行实验、空间探索实验和工作记忆实验。圆形迷宫直径为65cm、高45cm，池中水深25.5cm左右，内置平台直径6cm、高24cm，水温维持在(23±1)℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个实验周期内保持环境信息固定不变(包括实验室中的物品和人员及其位置)。水池中加入墨汁，使平台不可见，将白色摄像背景(水面颜色)调整为黑色以简化实验操作和保证目标的准确识别。迷宫被均分为4个象限NE、SE、 SW、NW，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径。

[0025] 定位航行实验时保持平台位置固定不变，选择未放平台的其余3个象限作为动物的入水点，将动物面向池壁轻放入水中，每天训练3次，每次变换入水点位置(使动物可分别从3 个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致(顺时针)。每次训练前适应10s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为90s后，将动物放入水中，若动物在90s内找到平台并在平台上停留超过2s视为寻台成功，并记录其潜伏期。若动物90s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为90s，测试完毕后使其在平台上停留10s后适应。每两只动物交替训练，待其全部训练3次后，进行下两只动物，准备干毛巾用于擦拭小鼠，以免其体温降低受凉。每天每只动物3次训练潜伏期的平均值作为评价动物这一天学习能力的指标。

[0026] 经过5天的定位航行学习后，次日撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在90s内在原平台象限的游程比、时间比和穿过原平台所在位置的次数等作为评价空间记忆能力的指标。

[0027] 空间探索实验后，进行3天的工作记忆实验，每天变换平台所在的象限，每只小鼠每天连续分别从除平台所在象限外的其余三个象限落水，不进行前适应，每次训练完成后进行10 s后适应。统计每只动物第一次、第二次和第三次训练潜伏期的3天平均值来评价动物的工作记忆水平。

[0028] (3)避暗实验：手术造模后第18天开始进行避暗实验，分为适应期、获得期和巩固期，历时3天。被动回避条件反射箱的大小为20cm×12cm×60cm，分明暗两间，两室之间有一洞口，暗室底部安装铜栅可以通电，软件控制实验流程，并对摄像头采集的实验动物活动图像信息进行分析处理，得到系列行为学指标。适应期时，断开电源，将小鼠背朝洞口放入明室，适应环境4min，让小鼠能在明暗室自由穿梭(如果小鼠不穿梭，人为干预使其穿梭于两室内)。所有小鼠适应后，重复上述操作，再适应一次。获得期时，断开电源，将小鼠背朝洞口放入明室，适应环境3min，期间小鼠能在明暗室自由穿梭。适应3min后，由于小鼠的趋暗习性，其可自动进入暗室，当其四足全部进入暗室时(若小鼠没在暗室，则人为干预使其到暗室)，点击开始，暗室底部铜栅自动通电(电压40V，电流2mA，电击延时3s)，小鼠受电击可逃回明室安全区。计算机实时在线分析系统可自动记录小鼠在5min之内由明室进入暗室的错误次数及在暗室所待时间长短。每只小鼠结束后应立即取出，防止干扰其对暗室有电的记忆。次日进行避暗巩固实验。将小鼠背朝洞口放入明室，立即点击开始进行实验，观察小鼠在5min之内进入暗室前在明室停留的时间(入暗潜伏期)及进入暗室的错误次数、暗室时间等，比较各组小鼠记忆保持情况，若小鼠在5min之内没有进入暗室，则小鼠入暗潜伏期为300s。

[0029] 数据分析：采用SPSS 16.0统计软件进行分析，所有数据均采用Mean±SEM表示。行为学数据先采用Shapiro-Wilk法检验正态性，如若满足正态分布，再进行方差齐性检验。如果数据同时满足正态分布，且各组数据方差齐，则采用单因素方差分析，选用LSD方法进行多组间均数的两两比较。如果数据不满足正态分布，或各组数据方差不齐，则采用非参数检验。水迷宫的定位航行实验中的数据选用重复测量数据的方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

[0030] 3、实验结果

[0031] (1)对物体位置识别实验中相对辨别指数的影响

[0032] 结果(见表1)显示，假手术组与空白对照组的相对辨别指数接近，没有统计学差异。与假手术组相比，模型组的相对辨别指数显著降低(P＜0.05)。与模型组相比，各给药组的相对辨别指数升高，且木豆素中剂量组和高剂量组与模型组比有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。

[0033] 表1.木豆素对Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍模型相对辨别指数的影响 (Mean±SEM，n＝10-12)

[0034]

[0035] 与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；

[0036] 模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

[0037] (2)对水迷宫成绩的影响

[0038] 定位航行实验：结果(见表2)显示，随着训练天数的增加，各组小鼠的寻台潜伏期逐渐减少。假手术组在定位航行阶段潜伏期与空白对照组接近，没有统计学差异。与假手术组比较，模型组在第3天的潜伏期明显增加，有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，木豆素低、中、高三个剂量组在第3天的潜伏期降低，高剂量组在第3天有统计学差异(P＜0.01)。

[0039] 空间探索实验：结果(见表3)显示，与空白对照组比较，假手术组的目标象限穿台次数、目标象限游程比率和时间比率没有统计学差异。与假手术组比较，模型组的目标象限穿台次数、目标象限游程比率和时间比率没有统计学差异。与模型组比较，木豆素高剂量组的目标象限穿台次数明显增加，木豆素低、中、高三个剂量组的目标象限游程比率和时间比率升高，但都没有统计学差异。

[0040] 工作记忆实验：结果(见表4)显示，假手术组与正常对照组比较，三次训练的潜伏期没有统计学差异。与假手术组比较，模型组三次训练的潜伏期均高于假手术组，其中第二次训练的潜伏期有统计学差异(P＜0.05)。与模型组比较，给药组的潜伏期明显缩短，呈剂量依赖性，其中木豆素中、高剂量组的第一次和第二次训练潜伏期均有统计学差异。

[0041] 表2.木豆素对Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍模型定位航行潜伏期(s)的影响 (Mean±SEM，n＝11)

[0042]

[0043] 与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0044] 表3.木豆素对Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍模型水迷宫空间探索的影响 (Mean±SEM，n＝11)

[0045]

[0046] 与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0047] 表4.木豆素对Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍模型工作记忆潜伏期(s)的影响 (Mean±SEM，n＝9-11)

[0048]

[0049] 与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0050] (3)对避暗成绩的影响

[0051] 结果(见表5)显示，在避暗实验的获得期，假手术组与空白对照组比较，模型组与假手术组比较，入暗潜伏期、错误次数和暗室时间没有统计学差异。与模型组比较，木豆素低、中、高三个剂量组的错误次数和暗室时间降低，中剂量组降低程度最大，有统计学差异 (P＜0.05，P＜0.01)。在避暗实验的巩固期，与假手术组比较，模型组的错误次数明显增加 (P＜0.05)。与模型组比较，木豆素低、中、高三个剂量组的错误次数显著减少(P＜0.01)。模型组的入暗潜伏期最短，暗室时间最长，但与假手术组和给药组比较没有统计学差异。

[0052] 表5.木豆素对Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍模型避暗成绩的影响(Mean±SEM，n＝10-12)

[0053]

[0054] 与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0055] 实验例2

[0056] 木豆素改善学习记忆障碍作用--对睡眠干扰所致小鼠学习记忆障碍的影响[0057] 1、实验材料

[0058] 实验动物：ICR雄鼠，体重25-30g，60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK(京)2012-0001。小鼠常规饲料，均由维通利华实验动物技术有限公司提供。ICR小鼠在SPF级环境中饲养，维持12h光照：12h黑暗昼夜节律，温度23-25℃，湿度45％-65％，自由饮水和饮食。

[0059] 药物及试剂：木豆素：由本实验制备所得，HPLC纯度检查达98％。给药前药物用0.5％羧甲基纤维素钠分散配制。

[0060] 2、实验方法

[0061] 分组：ICR雄鼠适应性饲养一周后，根据体重将动物随机分为5组，即空白对照组、模型组、木豆素低剂量组(7.5mg/kg)、木豆素中剂量组(15mg/kg)和木豆素高剂量组(30mg/kg)，每组12只。

[0062] 造模：将模型组和各给药组小鼠放入滚筒内，连续适应3天，每天3h，滚筒转动参数(转速为1r/min，转1min，休息2min，滚筒每次旋转方向随机)。滚筒适应结束后，将模型组和各给药组小鼠放入滚筒内，滚动参数同上。连续进行睡眠干扰15天后，取出小鼠，同空白对照组一起进行行为学检测，包括：物体位置识别、水迷宫和避暗实验。每天行为学检测结束后，将各组动物分别放回滚筒继续干扰，直至行为学检测结束。空白对照组小鼠饲养于正常鼠笼内。

[0063] 给药：滚筒适应结束后，开始进行睡眠干扰时，每天各给药组小鼠按剂量灌胃给药一次 (i.g.20mL/kg)，空白对照组和模型组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，一直持续到行为学检测结束。行为学测试期间，每只小鼠于检测前1h给药。

[0064] 小鼠行为学检测：

[0065] (1)物体位置识别实验：进行睡眠干扰后第17天开始物体位置识别实验，实验分为3个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期为3天，每天将动物依次放入黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱(长×宽×高：60cm×40cm×80cm)内熟悉环境10min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内相邻的磁铁处固定(位置对称，距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10cm)。记录小鼠5min内对两物体的探索总时间。间隔
20min 后，进入测试期。测试期内，将其中一个物体改变位置，移动至与另一物体成对角线的磁铁处固定，记录5min内小鼠对新位置物体和旧位置物体的探索时间。用相对辨别指数 (discrimination index，DI)来评价动物的学习记忆能力，计算公式为DI＝(N-F)/(N+F)，其中N(new)为新位置物体探索时间，F(familiar)为旧位置物体探索时间。每只小鼠测试完后及时对物体和试验箱进行清理以去除上只小鼠留下的气味。实验前准备好摄像机监控小鼠的运动路径，实验结束后人工计时，记录小鼠对新位置物体和旧位置物体的探索时间，小鼠头朝向物体周围2cm的范围内或者直接接触到物体都认为是对该物体的探索。

[0066] (2)水迷宫实验：进行睡眠干扰后第21天开始水迷宫实验，分为：定位航行实验和空间探索实验。圆形迷宫直径为65cm、高45cm，池中水深25.5cm左右，内置平台直径6cm、高24cm，水温维持在(23±1)℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个实验周期内保持环境信息固定不变(包括实验室中的物品和人员及其位置)。水池中加入墨汁，使平台不可见，将白色摄像背景(水面颜色)调整为黑色以简化实验操作和保证目标的准确识别。迷宫被均分为4个象限NE、SE、SW、NW，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径。

[0067] 定位航行实验时保持平台位置固定不变，选择未放平台的其余3个象限作为动物的入水点，将动物面向池壁轻放入水中，每天训练3次，每次变换入水点位置(使动物可分别从3 个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致(顺时针)。每次训练前适应10s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为90s后，将动物放入水中，若动物在90s内找到平台并在平台上停留超过2s视为寻台成功，并记录其潜伏期。若动物90s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为90s，测试完毕后使其在平台上停留10s后适应。每两只动物交替训练，待其全部训练3次后，进行下两只动物，准备干毛巾用于擦拭小鼠，以免其体温降低受凉。每天每只动物3次训练潜伏期的平均值作为评价动物这一天学习能力的指标。经过5天的定位航行学习后，次日撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在90s内在原平台象限的游程比、时间比和穿过原平台所在位置的次数等作为评价空间记忆能力的指标。

[0068] (3)避暗实验：进行睡眠干扰后第27天开始避暗实验，分为适应期、获得期和巩固期，历时3天。被动回避条件反射箱的大小为20cm×12cm×60cm，分明暗两间，两室之间有一洞口，暗室底部安装铜栅可以通电，软件控制实验流程，并对摄像头采集的实验动物活动图像信息进行分析处理，得到系列行为学指标。适应期时，断开电源，将小鼠背朝洞口放入明室，适应环境3min，让小鼠能在明暗室自由穿梭(如果小鼠不穿梭，人为干预使其穿梭于两室内)。所有小鼠适应后，重复上述操作，再适应一次。获得期时，断开电源，将小鼠背朝洞口放入明室，适应环境3min，期间小鼠能在明暗室自由穿梭。适应3min后，由于小鼠的趋暗习性，其可自动进入暗室，当其四足全部进入暗室时(若小鼠没在暗室，则人为干预使其到暗室)，点击开始，暗室底部铜栅自动通电(电压40V，电流2mA)，小鼠受电击可逃回明室安全区。计算机实时在线分析系统可自动记录小鼠在5min之内由明室进入暗室的错误次数及在暗室所待时间长短。每只小鼠结束后应立即取出，防止干扰其对暗室有电的记忆。次日进行避暗巩固实验。将小鼠背朝洞口放入明室，立即点击开始进行实验，观察小鼠在5min 之内进入暗室前在明室停留的时间(入暗潜伏期)及进入暗室的错误次数、暗室时间等，比较各组小鼠记忆保持情况，若小鼠在5min之内没有进入暗室，则小鼠入暗潜伏期为300s。

[0069] 数据分析：同实验案例1

[0070] 3、实验结果

[0071] (1)对物体位置识别实验中相对辨别指数的影响

[0072] 结果(见表6)显示，与空白对照组比较，模型组的相对辨别指数降低，但无统计学差异。与模型组比较，木豆素低、中、高剂量组均可显著增加睡眠干扰小鼠的相对辨别指数(P ＜0.05)。

[0073] 表6.木豆素对睡眠干扰小鼠相对辨别指数的影响(Mean±SEM，n＝11)

[0074]

[0075] 与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；

[0076] 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

[0077] (2)对水迷宫成绩的影响

[0078] 定位航行实验：结果(见表7)显示，随着训练天数的增加，各组小鼠的寻台潜伏期逐渐减少。与空白对照组比较，模型组在定位航行实验第2-5天潜伏期明显增加，其中第5天的差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，木豆素低、中、高剂量组在第4-5天的潜伏期明显缩短，有统计学差异(P＜0.05)。

[0079] 空间探索实验：结果(见表8)显示，与空白对照组比较，模型组穿台次数显著较少，有统计学差异(P＜0.05)；与模型组比较，木豆素低、中、高剂量组的穿台次数增加，其中木豆素低剂量组和高剂量组与模型组比较有统计学差异(P＜0.01，P＜0.05)。各组的目标象限游程比率和时间比率没有统计学差异。

[0080] 表7.木豆素对睡眠干扰小鼠定位航行潜伏期(s)的影响(Mean±SEM，n＝10-11)[0081]

[0082] 与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0083] 表8.木豆素对睡眠干扰小鼠水迷宫空间探索的影响(Mean±SEM，n＝10-11)[0084]

[0085] 与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01[0086] (3)对避暗成绩的影响

[0087] 结果(见表9)显示，在避暗实验的获得期，与空白对照组比较，模型组的入暗潜伏期缩短(P＜0.01)，错误次数增加，暗室时间延长(P＜0.05)。与模型组比较，木豆素低、中、高剂量组的错误次数和暗室时间减少，其中木豆素中、高剂量组的暗室时间与模型组比较有统计学差异(P＜0.01)。在避暗实验的巩固期，与空白对照组比较，模型组的错误次数明显增加(P＜0.05)，暗室时间虽然延长但没有统计学差异。与模型组比较，木豆素低、中、高剂量组的错误次数和暗室时间减少，其中木豆素高剂量组的错误次数与模型组比较有统计学差异 (P＜0.05)。

[0088] 表9.木豆素对睡眠干扰小鼠避暗成绩的影响(Mean±SEM，n＝10-12)

[0089]

[0090] 与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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