一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物及其制备与应用
阅读：1022发布：2020-08-17
专利汇可以提供一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 治疗 阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物，所述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成；其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：远志6-12克，党参10-20克，甘草5-15克。本发明进行了试验：对双侧海 马 注射Aβ1-40所致类AD大鼠的作用；对东莨菪 碱 致记忆获得障碍类AD模型小鼠的作用等,结果说明能改善类AD模型大鼠的学习记忆能 力 ；提高脑内的 能量 代谢从而改善脑功能等。因此，本发明中药组合物可用于制备治疗阿尔茨海默型痴呆症药物。本发明口服片剂、胶囊剂、颗粒剂，提高了患者服用的 顺应性 ；制剂 稳定性 好，制备简单，宜于工业化生产。为临床提供了新的治疗阿尔茨海默型痴呆症药物，有较大的应用价值和社会效益。，下面是一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物及其制备与应用专利的具体信息内容。
1.一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物，其特征在于，所述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成；其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
远志6-12克，党参10-20克，甘草5-15克。
2.一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物，其特征在于，所述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成；其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
远志9克，党参10克，甘草10克。
3.根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，所述组合物为口服片剂、胶囊剂或颗粒剂。
4.制备如权利要求1或2所述一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
（1）水提：党参、甘草、远志三味药混合，加药量总量的10倍量w/w水浸泡1小时后，共煎煮3次，每次加药量总重量10～12倍量w/w的水，合并煎煮液；
（2）浓缩步骤1获得的提取液获得相对密度为1.10～1.1260℃的浓缩液；
（3）浓缩液中加入95%乙醇至含醇量达65～80%V/V，静置过夜，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20～1.2560℃测的浓缩液；
（4）将浓缩液加水稀释，生药量：水＝1450g：2000g，滤过得滤液；
（5）滤液上HpD600大孔树脂柱，生药量：树脂量＝1450g：500g；柱径高比＝1：5，上样-1 -1
吸附3次流速＝1BV·h ，用水洗脱，流速＝1BV·h 至菲林反应阴性后，用10％乙醇溶液-1 -1
洗脱，流速＝1BV·h 至无色，再用60％乙醇溶液洗脱流速＝1BV·h 至无色，收集60％乙醇的洗脱液；
（6）洗脱液减压浓缩，50～60℃真空干燥后粉碎成细粉，过筛60目；
（7）加入辅料，混匀，制成制剂。
5.如权利要求1所述一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物在制备治疗阿尔茨海默型痴呆症药物中的应用，其特征在于，所述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成；其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
远志6-12克，党参10-20克，甘草5-15克。
6.如权利要求2所述一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物在制备治疗阿尔茨海默型痴呆症药物中的应用，其特征在于，所述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成；其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
远志9克，党参10克，甘草10克。
一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物及其制备与应
用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药，具体涉及中药组合物，尤其涉及一种治疗阿尔茨海默型痴呆症（AD）的中药组合物及其制备与应用。
背景技术
[0002] 由于AD的发病原因和发病机理尚未完全阐明，至今尚无有效阻断其病情发展的药物问世。目前应用的AD治疗药物主要为胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸能神经递质（NMDA）受体拮抗剂，胆碱酯酶抑制剂上市的主要有经美国FDA批准的多奈哌齐、艾斯能和中国药批准的石杉碱甲，可有限缓解轻中度AD患者症状，对AD主要病理特征无明显改善作用，并且胆碱酯酶抑制剂容易导致椎体外束副反应，对心绞痛、心律失常、肾功能不全、支气管哮喘等患者禁用，适用范围受到限制。此外，美金刚是一种电压依赖性、中等程度亲和力的非竞争性NMDA受体拮抗剂。治疗中重度至重度阿尔茨海默型痴呆。肾功能损害患者、癫痫患者、有惊厥病史、或癫痫易感体质，以及心肌梗塞、失代偿性充血性心力衰竭和未有效控制的高血压患者的患者应用美金刚时应慎重。同时由于药物价格昂贵，患者的经济能力难以承受长期治疗。其中用药金额领先的品种包括与神经递质有关的药物如多奈哌齐、石杉碱甲，脑血管扩张药尼莫地平、氟桂利嗪，改善脑代谢药物阿尼西坦、吡拉西坦，吡硫醇，神经营养因子脑活素等，全部是西药。现有中药产品主要活性成分研究不充分，机理研究缺乏深度，临床效果不确定，因此市场反应平淡。20世纪80年代以来，国内外学者相继开展了中草药抗老年性痴呆药理研究，从文献报道来看，中医药治疗对促进智力衰退的逆转及改善临床症状行之有效，且副作用少。因此，研制有效、安全的AD治疗药物具有十分重要、迫切的意义。 发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物。
[0004] 本发明提供了一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物（参灵通片），所 述组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成。
[0005] 其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
[0006] 远志6-12克，党参10-20克，甘草5-15克。
[0007] 优选的，其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
[0008] 远志9克，党参10克，甘草10克。
[0009] 本发明的中药远志宁心安神、豁痰开窍为君；党参益气养心、安神增智为臣药；甘草益气解毒、调和诸药为佐使。
[0010] 甘草中主要含有皂苷、黄酮等成分，其指标性成分为甘草酸、甘草苷等；党参主要含有党参苷、烯醇类，苍术内酯类等。党参提取物对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力均有明显的改善作用；远志中含有皂苷类成分具有益智安神、镇咳祛痰之功效，还发现其具有降糖和免疫增强等活性。该属植物主要含有皂苷、口山酮及寡糖多酯等成分，其中皂苷是该属植物的主要活性成分之一，苷元均为齐墩果烷型三萜，糖的种类有葡萄糖、鼠李糖、木糖、芹糖、半乳糖等。因此本发明选择中药远志，党参，甘草作为活性成分。 [0011] 本发明的另一目的是提供了上述一种治疗阿尔茨海默型痴呆症的中药组合物的制备方法，该方法包括下列步骤：
[0012] （1）水提：党参、甘草、远志三味药混合，加药量总量的10倍量w/w水浸泡1小时后，共煎煮3次，每次加药量总重量10～12倍量w/w的水，合并煎煮液；
[0013] （2）浓缩步骤1获得的提取液获得相对密度为1.10～1.12（60℃）的浓缩液； [0014] （3）浓缩液中加入95%乙醇至含醇量达65～80%（V/V），静置过夜，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20～1.25（60℃）的浓缩液；
[0015] （4）将浓缩液加水稀释（生药量：水＝1450g：2000g），滤过得滤液； [0016] （5）滤液上HpD600大孔树脂柱（生药量：树脂量＝1450g：500g；柱径高比＝1：5）-1 -1上样吸附3次（流速＝1BV·h ），用水洗脱（流速＝1BV·h ）至菲林反应阴性后，用10％乙-1 -1
醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，再用60％乙醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，收集60％乙醇的洗脱液；
醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，再用60％乙醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，收集60％乙醇的洗脱液；
[0019] 本发明所述中药组合物为片剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0020] 本发明的又一目的是提供了上述中药组合物在制备治疗阿尔茨海默型痴呆症药物中的应用。
[0021] 本发明人将上述中药组合物进行了以下试验：
[0023] A.对双侧海马注射Aβ1-40所致类AD大鼠的学习记忆和脑内胆碱能系统的作用，（1）结果提示：本发明中药组合物能改善类AD模型大鼠的学习记忆能力。（2）结果提示：本发明中药组合物均对胆碱能系统由一定的改善作用，可提高海马的AchE、ChAT活性和皮层的AchE活性、M受体Rt值。本发明显示出对AchE的明显抑制作用。（3）结果提示：本发明中药组合物能改善类AD模型大鼠的学习记忆能力。
[0024] B．对Aβ1-40双侧海马注射大鼠大脑皮层部位APP（MPI）mRNA、APP（KPI）mRNA表达结果的影响：结果提示：本发明中药组合物能抑制大鼠皮层、海马部位APP（MPI）mRNA和APP（KPI）mRNA的表达，从而降低Aβ的沉积。
[0025] C.对Aβ1-40双侧海马注射大鼠大脑皮层部位bax mRNA、bcl-2mRNA表达结果的影响：结果提示：本发明中药组合物能明显下调海马和皮层bax mRNA、上调海马和皮层bcl-2mRNA，而抑制细胞凋亡。
[0026] D.对Aβ1-40双侧海马注射大鼠皮层Na-K-ATP酶的影响：结果提示：本发明中药组合物可提高被破坏的Na-K-ATP酶活性，提高脑内的能量代谢从而改善脑功能。 [0027] E.对Aβ1-40双侧海马注射大鼠海马NOS的影响：结果显示：本发明中药组合物可通过提高模型鼠脑海马中的cNOS含量来维持NOS正常的生理功能，但对iNOS无改善作用。
[0028] Ⅱ.本发明中药组合物对东莨菪碱致记忆获得障碍类AD模型小鼠的作用 [0029] 水迷宫测试结果表明，参灵通片对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠学习记忆功能有明显的改善作用。
[0030] Ⅲ.对H2O2、Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用,本发明中药组合物可以在一定程度上对PC12细胞起到保护作用。
[0031] 因此，本发明中药组合物可用于制备治疗阿尔茨海默型痴呆症药物。 [0032] 本发明所述药物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成的口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。
[0033] 其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比：
[0034] 远志6-12克，党参10-20克，甘草5-15克。
[0035] 优选的，其中制成活性成分的中药原料为下列重量配比的组分：
[0036] 远志9克，党参10克，甘草10克。
[0037] 本发明中药片剂，规格为每片0.25g～0.3g使用时，一次1片，一日二次60天为一疗程。
[0038] 本发明胶囊剂规格为每粒0.25g～0.3g使用时，一次一粒，一日二次，60天为一疗程。
[0039] 本发明颗粒剂规格为每袋0.3g～0.5g，使用时，一次一袋，一日二次，60天为一疗程。
[0040] 本发明由中药复方提取的有效部位作为活性成分，通过大孔树脂分离，纯化技术后制成了片剂、胶囊剂、颗粒剂，提高了患者服用的顺应性；制剂稳定性好，制备简单，宜于工业化生产。为临床提供了新的治疗阿尔茨海默型痴呆症药物，有较大的应用价值和社会效益。
具体实施方式
[0041] 以下实施例原料市售得到。
[0042] 实施例1制备中药提取物
[0043] 中药提取物制备：党参9公斤、甘草10公斤、远志10公斤三味药
[0044] （1）水提：上述党参、甘草、远志三味药混合，加水290公斤浸泡1小时后，煎煮3次，每次加水290公斤，滤过后合并煎煮液；
[0045] （2）浓缩，步骤1获得的提取液经过65℃减压浓缩获得相对密度为1.10～1.12（60℃）的浓缩液；
[0046] （3）浓缩液中加入95%乙醇至含醇量达75%，静置过夜，过滤，滤液经65℃ 减压浓缩至相对密度1.20～1.25（60℃）的浓缩液；
[0047] （4）将浓缩液按照生药量：水＝1450g：2000g的比例加水稀释，滤过得滤液； [0048] （5）滤液上HpD600大孔树脂柱（生药量：树脂量＝1450g：500g；柱径高比＝1：5），-1 -1上样吸附3次（流速＝1BV·h ），用水洗脱（流速＝1BV·h ）至菲林反应阴性后，用10％乙-1 -1
醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，再用60％乙醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，收集60％乙醇的洗脱液；
醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，再用60％乙醇溶液洗脱（流速＝1BV·h ）至无色，收集60％乙醇的洗脱液；
[0049] （6）60％乙醇的洗脱液经65℃减压浓缩后在60℃条件下真空干燥并粉碎成细粉（过筛60目），得到中药提取物细粉0.196公斤。
[0050] 中药片剂（参灵通片）的制备
[0051] 上述制得的药物细粉0.196公斤，加入淀粉0.164公斤、羧甲基淀粉钠0.032公斤、微晶纤维素0.074公斤、交联聚维酮0.02公斤、硬脂酸镁0.004公斤混匀后，以70%乙醇为粘合剂，加入量约为药物细粉量的15%，混合均匀后，在HS-2型摇摆制粒机以搅拌桨/制粒刀工作速度为110/1000rpm下进行湿法制粒，65℃～70℃干燥，压制成0.25～0.3克的片1930片。
[0052] 实施例2
[0053] 党参20公斤、甘草5公斤、远志6公斤三味药
[0054] 制备方法同实施例1，得到中药提取物细粉0.196公斤，按实施例1方法制备片剂。 [0055] 实施例3
[0056] 党参15公斤、甘草6公斤、远志9公斤三味药
[0057] 制备方法同实施例1，得到中药提取物细粉0.196公斤，按实施例1方法制备片剂。 [0058] 实施例4胶囊剂的制备
[0060] 实施例5
[0061] 颗粒剂的制备
[0062] 实施例1步骤（6）制得的药物细粉0.196公斤，加入糊精0.196公斤，乳糖0.098公斤，混合均匀，采用X-1型干法制粒机在螺旋转速35r/min，滚轮转速5r/min条件下进行干法制粒，制得颗粒为0.5公斤。
[0063] 实施例6工艺研究设计试验
[0064] 提取工艺路线的设计
[0065] 煎煮方式的筛选
[0066] 传统汤剂大多是采用群药合煎的方式进行提取，为了确定本方剂煎煮方式的合理性，采用小鼠水迷宫实验筛选合煎、分煎合理性。
[0067] 按照配方方比例，称取党参、甘草、远志。三味药加10倍量水浸泡1小时后，按照常规煎煮条件进行合并煎煮，滤过后浓缩至：上述三味药，按照常规煎煮条件分别煎煮、滤过浓缩至一定体积后合并，调整浓度使之与合煎组浓度相同。
[0068] 各组动物每天水迷宫中训练一次，连续5天。第6天测试，各组小鼠灌胃后40分钟，腹腔注射东莨菪碱，剂量为3mg/kg（正常组除外），30分钟后用程控水迷宫（SMG-2型水迷宫程序自动控制仪，中国医学科学院药物研究所产品）进行测试，用计算机打印记录小鼠到达安全区的潜伏期和错误次数。
[0069] 表1.参灵通片分煎合并与合煎工艺的筛选
[0070]
[0071] 与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05,##P<0.01。 [0072] 结果显示，合煎、分煎合并和安理申对照药能显著改善模型小鼠的潜伏期，说明对东莨菪碱模型小鼠的学习记忆有改善作用。且合煎组效果稍优于分煎组，提取工艺确定采用合煎法进行提取。
[0073] 提取工艺优化
[0074] 由于处方中远志、甘草所含有的特征性成分均为皂苷类，若仅测定提取液中 甘草酸或远志皂苷元单一成分均不能充分反映方中大多数成分量的多少，现筛选用比色法以皂苷类成分作为对照，测定所提取液中总皂苷成分的含量。
[0075] 比色方法条件的筛选
[0077] 结果：
[0078] 党参10％～95％（不包括10％）洗脱液在590nm处无明显吸收
[0079] 甘草10％～95％（不包括10％）洗脱液在590nm附近有吸收峰
[0080] 远志10％～95％（不包括10％）洗脱液在580nm附近有吸收峰
[0081] 合方20％～95％（不包括20％）洗脱液在590nm附近有吸收峰
[0082] 甘草酸铵对照品溶液在590nm处有峰值吸收
[0083] 远志皂苷元对照品溶液在580nm处有峰值吸收
[0084] 结果表明，党参在此条件下测定无干扰，全方与甘草、远志以及其对照品在580～590nm附近均有最大吸收，所以选定590nm为紫外测定波长。
[0085] 确定了评价代表类成分测定方法后，对影响提取的的主要因素进行筛选优化。 [0086] 浸泡时间的确定
[0087] 称取称党参、甘草、远志，加10倍量水，观察各药味加水浸泡软化情况，经观察冷浸1小时，可使药材浸透，故煎煮前冷浸1小时。
[0088] 提取工艺条件的优化
[0089] 为了综合评价各药味的提取效果，采用比色法，以甘草酸铵作为对照。 [0090] 表2.因素水平设计表
[0091]
[0092] 按配方组成，每组称党参、甘草、远志，共9组，按照正交表安排试验，煎液浓缩，75％浓度醇沉，静置过夜，滤过，滤液定容至500ml，即4贴/500ml， 分取10ml定容至50ml，取其中20ml上柱（HpD6002g），反复上样3次，再分别用水200ml，10％乙醇200ml，95％乙醇
200ml洗脱，将95％乙醇洗脱液浓缩至20ml。分取0.5ml，挥干溶剂，以甘草酸铵作为对照，用香草醛－冰醋酸－高氯酸法测定590nm处紫外吸收。
4
200ml洗脱，将95％乙醇洗脱液浓缩至20ml。分取0.5ml，挥干溶剂，以甘草酸铵作为对照，用香草醛－冰醋酸－高氯酸法测定590nm处紫外吸收。
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[0093] 表3.L9(3)正交实验表及实验结果
[0094]
[0095] 按照筛选的优化条件进行实验验证，结果表明了优化条件的可重复性和可行性。由此确定最佳提取工艺：10倍量水浸泡1小时后煎煮3次（10倍量水），每次1小时。 [0096] 纯化工艺
[0097] 在保证疗效的前提下，依次采用乙醇沉淀法和大孔吸附树脂法进行纯化，以尽可能保留有效成分，去除杂质，减少服用量。
[0098] 1.乙醇沉淀法：
[0099] 称取甘草、党参、远志，按最佳提取工艺提取，合并煎液，浓缩，分别加入乙醇使含醇量达到55%、65%、75%、80％，静置过夜，滤液回收乙醇后，分别定容至500ml。分取溶液0.5ml，按照香草醛－冰醋酸－高氯酸法，分别测定各醇沉浓度样品中590nm处的吸收值；
并采用小鼠水迷宫法筛选乙醇沉淀的浓度。结果如下：
并采用小鼠水迷宫法筛选乙醇沉淀的浓度。结果如下：
[0100] 表4.醇沉浓度的考察
[0101]
[0102] 结果表明55％浓度的醇沉溶液的吸收明显较低，65％、75％、80％三个醇沉浓度无明显差异，选择75％作为乙醇沉淀法的沉淀浓度。
[0103] 2.大孔吸附树脂法：
[0104] 经过上述75%乙醇沉淀后，得膏率为10%左右。由于老年性痴呆患者服药时会出现吞咽困难，为了尽量减少服用量，使患者更容易接受药物，采用大孔吸附树脂法进一步除去杂质。
[0105] 目前常规使用的大孔吸附树脂种类和型号比较多，常用的有极性、中等极性和弱极性。现分别从几种树脂中选拥有代表性的进行筛选。
[0106] 2.1静态吸附
[0107] 称取已处理好的树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD600、D101各1g，置50ml量瓶中，加样品液（正交试验3号未过柱，浓度为116g生药/500ml）20ml，每隔5min震摇10s，持续2h，静置过夜，滤过，取滤液1ml，定容至10ml；原液（正交试验3号未过柱）1ml定容至10ml。
分取0.1ml样品液，挥干，残渣用香草醛－冰醋酸－高氯酸法测定590nm处紫外吸收。 [0108] 表5.大孔吸附树脂种类的筛选
分取0.1ml样品液，挥干，残渣用香草醛－冰醋酸－高氯酸法测定590nm处紫外吸收。 [0108] 表5.大孔吸附树脂种类的筛选
[0109]
[0110] 从上述吸附的吸收度情况评价，以HPD600的静态吸附最好。
[0111] 2.2大孔树脂吸附条件的选择
[0112] 2.2.1上样液浓度的选择
[0113] 由于样品上样后是先用水洗脱，故上样液的浓度范围可以适量加大，以不堵塞树脂柱为准，同时结合实际生产考虑，选定为上样液浓度为：
[0114] 药量∶水＝725g∶1000g。
[0115] 2.2.2树脂柱径高比的选择
[0116] 结合实际生产考虑，树脂柱径高比1：5。
[0117] 2.3.1配方及制粒预试验
[0118] 表6.压片预实验结果
[0119]
[0120] 实施例7产品检测：
[0121] 采用薄层色谱法分别对制剂中党参、远志进行了鉴别，采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸进行了含量测定。
[0122] 1．仪器与试药
[0123] 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司
[0124] 6890N气相色谱仪 美国Agilent公司
[0125] 7694E顶空进样器 美国Agilent公司
[0126] 样品：参灵通片实施例1、实施例2、实施例3
[0127] 硅胶G薄层板：HSG由山东烟台芝罘黄务硅胶试验厂出品
[0128] 党参对照药材：购于中国药品生物制品检定所 批号121057-200302 [0129] 远志对照药材：购于中国药品生物制品检定所 批号989-200103
[0130] 甘草酸单铵盐对照品购于中国药品生物制品检定所含量测定用批号110731-200510
[0131] 甲醇为色谱纯（Sigma试剂），其余试剂均为分析纯（中国医药（集团）上海化学试剂公司）。
[0132] 2.实验内容和结果
[0133] 2.1党参、远志鉴别
[0134] ①取本品7片，研细，加乙醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径1cm）上，用40%甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取党参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。按薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VI B）试验,吸取供试品溶液、对照药材溶液5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙醇-水（15：3：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
[0135] ②取本品10片,研细，称取0.1g，加甲醇10ml超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取远志对照药材2g，加水提取二次，每次50ml，合并提取液浓缩至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。按薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VI B）试验, 吸取供试品溶液5μl,对照药材溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-水-冰醋酸(5:4:1)的上层溶液为展开剂，展开剂预先饱和20分钟,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在
[0136] 与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
[0137] 2.2重量差异、崩解时限检查
[0138] 参照中国药典2005年版片剂项下常规检查项目规定进行片重差异、崩解时限检查，结果如下：
[0139] 表7.重量差异、崩解时限测定结果
[0140]
[0141] 结果表明，三批制剂均符合中国药典2005年版的要求。
[0142] 2.3甘草含量测定
[0143] 2.3.1色谱条件与系统适用性试验
[0144] Hypersil ODS-2（5μm，4.6×150mm）色谱柱，柱温30℃；甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67：33：1）为流动相；检测波长为250nm。理论塔板数按甘草酸计算为4100，现暂订为不得低于3000。
[0145] 供试品色谱图中具与甘草酸单铵盐对照品峰保留时间一致的色谱峰，且与其他成分的色谱峰分离良好。
[0146] 2.3.2参灵通片制剂含量测定
[0147] 取参灵通片，按照正文测定含量方法进行处理并测试，结果见表8。 [0148] 表8.参灵通片中甘草酸含量测定结果
[0149]
[0150]
[0151] 含量限度：本品每1片含甘草以甘草酸（C42H62O16）计，不得少于2.65mg。 [0152] 三、制剂稳定性研究
[0153] 1.实验方法
[0154] 供试品批号：实施例1，实施例2，实施例3
[0155] 检测内容和要求：《中国药典》2005年版二部“药物稳定性试验指导原则”和《中药新药质量稳定性研究的技术要求》，进行性状、鉴别、崩解时限、含量测定及卫生学检查等项指标的检测。
[0156] 方法：加速稳定性试验法：取本品3批（实施例1-3），在温度40℃±2℃，相对湿度75±5%的条件下放置2个月。试验期间分别于第0、1、2个月取样一次，按稳定性试验考察项目检验。检测结果表明参灵通片在2个月内稳定。
[0157] 实施例8、本发明与功能主治有关的主要药效学试验
[0158] 1.参灵通片对双侧海马注射Aβ1-40所致类AD大鼠的作用
[0159] AD的主要病理学特征是老年斑（senile plague,SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）、海马锥体细胞颗粒空泡变性和神经元丢失。其中SP的核心成分为β－淀粉样蛋白（β－amyloid，Aβ），由39～43个氨基酸组成。Aβ在AD致病分子机制中的作用越来越受到重视，Aβ来源于体内淀粉样前体蛋白（β－Amyloid Precursor protein，APP），在AD的发生过程中Aβ从可溶的单体变成不溶的纤维，目前普遍认为聚集状的Aβ具有神经毒性，越来越多的证据证明Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化。
[0160] 为此我们采用向SD大鼠双侧海马内微量注射Aβ1-40造成类AD模型。并以目前国际上公认的经美国FDA批准的AD治疗药安理申为对照，观察参灵通片的药效学作用。 [0161] 1.1实验材料
[0162] 1.1.1实验动物
[0163] 雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠，SPF级，体重200±20g，由上海中医药大学实验动物中心提供。自由饮水摄食，室温20-25℃，日光辅助照明，维持每 日光照12小时，饮水、饲养及其它管理均符合上海市SPF级动物管理标准。
[0164] 1.1.2主要药品
[0165] 参灵通片（实施例1）：0.25mg/片
[0166] 安理申：卫材（中国）药业有限公司制造，5mg/片
[0167] 1.2实验方法
[0168] 1.2.1实验动物分组、用药及造模
[0169] 1.2.1.1动物分组
[0170] 132只大鼠于造模前经环境适应性饲养，按随机数字表随机分为6组：正常组、类AD模型组、参灵通片小剂量组、参灵通片中剂量组、参灵通片大剂量组、安理申组，每组22只，造模后实验在SPF级实验室，饲养过程中各组均死亡1只，水迷宫实验前一天转入普通级动物行为学实验室。水迷宫第3天实验后模型组死亡1只。
[0171] 1.2.1.2药物与用药
[0172] 小、中、大剂量参灵通片分别为1.2mg/100克体重（相当于60㎏体重成人用药量3.5倍）、2.4mg/100克体重（相当于60㎏体重成人用药量7倍）、4.8mg/100克体重（相当于60㎏体重成人用药量14倍）灌胃。安理申组：以过滤水制成混悬液，每只大鼠给药0.083mg/100g体重（相当于60㎏体重成人用药量14倍）。造模后第2天开始给药，每天灌胃一次，连续四周。
[0173] 1.2.1.3Aβ1-40双侧海马注射类AD大鼠模型的建立
[0174] Aβ1-40注射用水配置成浓度为2.5μg/μl的溶液，37℃恒温孵育1周，使其老化成聚集态，除正常组外，其余各组均将经孵育的Aβ1-40片段注入大鼠双侧海马，通过Aβ的神经毒性作用，制作类AD模型。大鼠以氯胺酮（0.2ml/100g体重）腹腔麻醉，将大鼠以前齿与双耳水平面固定于大鼠脑立体定位仪上，颅顶切口区去毛，作颅顶正中切口，以前脑基底核（nucleus basalis of Meynert,NBM）水平标准位，前囟中心为零点，前囟后3mm,双侧旁开1.5mm，深3.2mm注射Aβ1-40，缓慢进针，每侧注射2μl，注射每侧注射时间5min，留针5min后缓慢退出，局部消毒，缝合皮肤，肌肉注射青霉素。
[0175] 1.3统计学处理
[0176] 计量资料用 表示，用计算机统计软件SPSS11.5中的ANOVA程序进行 单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异具有显著统计学意义，方差不齐时用Tamhane检验。
[0177] 1.4实验结果
[0178] 1.4.1参灵通片对双侧海马注射Aβ1-40大鼠空间学习记忆的影响： [0179] 表9.实验各组大鼠空间学习记忆（潜伏期）的变化（ 秒）
[0180]
[0181] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01； [0182] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射可造成大鼠学习记忆能力障碍，参灵通片和安理申均能改善类AD模型大鼠的学习记忆能力。
[0183] 1.4.2参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠胆碱能系统的影响：
[0184] 表10.实验各组大鼠胆碱能系统AchE活性变化
[0185]
[0186] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0187] 表11.实验各组大鼠胆碱能系统ChAT活性的变化
[0188]
[0189] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0190] 表12.实验各组大鼠皮层胆碱能系统M受体结合容量的变化
[0191]
[0192] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0193] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射造成模型大鼠海马部位胆碱能系统的损害，AchE活性、ChAT活性和M受体Rt值的均会下降。三个剂量的参灵通片均对胆碱能系统由一定的改善作用，可提高海马的AchE、ChAT活性和皮层的AchE活性、M受体Rt值。而作为胆碱酯酶抑制剂，安理申显示出对AchE的明显抑制作用。
[0194] 1.4.3参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠脑内Aβ沉积的影响：
[0197] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0198] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射类AD模型大鼠大脑皮质、海马Aβ阳性细胞和间质中Aβ含量显著增加；参灵通片中、大剂量可显著减轻模型大鼠脑海马Aβ的沉积，大剂量能减少皮层Aβ阳性细胞数，而安理申的作用不明显。
[0199] 1.4.5参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠脑内APP mRNA表达的影响： [0200] 表14.实验各组大鼠大脑海马、皮层部位APP（MPI）mRNA、APP（KPI）mRNA表达的变化（ target gene/β-actin）
[0201]
[0202] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0203] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射类AD模型大鼠脑皮质、海马APP（MPI）mRNA和APP（KPI）mRNA的表达增加，可能是造成脑内Aβ大量沉积的主要原因。参灵通片能抑制大鼠皮层、海马部位APP（MPI）mRNA和APP（KPI）mRNA的表达， 从而降低Aβ的沉积；安理申无此方面的抑制作用。
[0205] 表15.实验各组大鼠海马异常磷酸化tau蛋白阳性细胞数和信号积分光密度表达的变化（ IOD）
[0206]
[0207] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0208] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射类AD模型大鼠脑海马的异常磷酸化tau蛋白阳性细胞表达明显增多表明Aβ的神经细胞毒性作用在tau蛋白的异常磷酸化及NFT形成中起了十分重要的作用。三组剂量的参灵通片和安理申改善异常磷酸化tau蛋白表达作用均不明显。
[0209] 1.4.6参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠大脑皮层、海马部位AD凋亡相关基因bax mRNA、bcl-2mRNA表达结果的影响：
[0210] 表16.实验各组大鼠大脑海马、皮层部位bax mRNA、bcl-2mRNA表达结果的变化（ target gene/β-actin）：
[0211]
[0212]
[0213] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0214] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射类AD模型大鼠脑皮质、海马部位bax mRNA表达升高，bcl-2mRNA表达下降；参灵通片组能明显下调海马和皮层bax mRNA、上调海马和皮层bcl-2mRNA，而抑制细胞凋亡。安理申作用不明显。
[0215] 1.4.7参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠皮层Na-K-ATP酶的影响： [0216] 表17.实验各组大鼠皮层Na-K-ATP酶活性的变化
[0217]
[0218] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0219] 结果提示：Aβ1-40双侧海马注射可造成类AD模型大鼠脑内Na-K-ATP酶活性降低，从而出现能量代谢低下。参灵通片和安理申均可提高被破坏的Na-K-ATP酶活性，提高脑内的能量代谢从而改善脑功能。
[0220] 1.4.8参灵通片对Aβ1-40双侧海马注射大鼠海马NOS的影响：
[0221] 表18.实验各组大鼠皮层总NOS、cNOS和iNOS活性的变化
[0222]
[0223]
[0224] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0225] 结果显示：Aβ1-40双侧海马注射可造成类AD模型大鼠脑内cNOS含量降低，iNOS含量显著增加，造成NO代谢障碍,出现病理性变化。参灵通片和安理申均可通过提高模型鼠脑海马中的cNOS含量来维持NOS正常的生理功能，但对iNOS无改善作用。
[0226] 2.参灵通片对东莨菪碱致记忆获得障碍类AD模型小鼠的作用
[0227] 东莨菪碱为M受体阻断剂可用于建立学习记忆障碍模型。本实验以安理申为对照组观察参灵通片对东莨菪碱小鼠模型空间学习记忆障碍的影响。
[0228] 2.1实验材料
[0229] 2.1.1实验动物
[0230] 昆明种小鼠，雌雄各半，清洁级，体重20±2g，由上海中医药大学实验动物中心提供。自由饮水摄食，室温20-25℃，日光辅助照明，维持每日光照24小时，饮水、饲养及其它管理均符合上海市清洁级动物管理标准。
[0231] 2.1.2主要试剂与药品
[0232] 参灵通片（实施例1）0.25mg/片
[0233] 安理申：卫材（中国）药业有限公司制造，5mg/片
[0234] 氢溴酸东莨菪碱：上海禾丰制药公司
[0235] 2.1.3主要仪器
[0236] Morris水迷宫及摄像分析系统：上海吉量科技有限公司
[0237] 2.2实验方法
[0238] 2.2.1实验动物分组
[0239] 60只昆明种小鼠于造模前经环境适应性饲养，随机分为6组：正常组、类AD模型组、参灵通片小剂量组、参灵通片中剂量组、参灵通片大剂量组、安理申组，每组10只。 [0240] 2.2.2药物与用药
[0241] 小、中、大剂量参桂健脑口服液剂量分别为1.7mg/100克体重（相当于临床成人用量5倍）、3.3mg/100克体重（相当于临床用药10倍）、6.7mg/100克体重（相当于临床用药20倍）。安理申组：以过滤水制成混悬液，每只大鼠给药 0.083mg/100体重（相当于60㎏体重成人用药量的10倍）。
[0242] 2.2.3东莨菪碱致记忆获得障碍类AD模型小鼠的建立
[0243] 按照《药理实验方法学》中有关建立记忆障碍动物模型的步骤进行操作。训练当天灌胃给药，1h后，各模型组予东莨菪碱3mg/kg，腹腔注射，10min后开始水迷宫训练；空白对照组腹腔注射等容量的生理盐水。24小时后，先灌胃给药，1h后，进行水迷宫测试。 [0244] 2.3统计学处理
[0245] 计量资料用 表示，用计算机统计软件SPSS11.5中的ANOVA程序进行单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异具有显著统计学意义。 [0246] 2.4实验结果
[0247] 表19.参灵通片对东莨菪碱小鼠学习记忆的影响（Morris水迷宫法 ） [0248]
[0249] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0250] 水迷宫测试结果表明，参灵通片对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠学习记忆功能有明显的改善作用。
[0251] 3.参灵通片对H2O2、Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用
[0252] PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，可分化为交感神经样细胞，在形态、生理、生化功能方面接近于神经元细胞，目前已被广泛应用于神经细胞死亡方式及神经毒方面的研究。H2O2、Aβ25-35可以诱导细胞凋亡，使细胞合成DNA的含量明显减少，在培养基中加入MTT（四甲基偶氮唑盐），利用活细胞内线粒体可将MTT由黄色还原为蓝色甲肷，甲肷含量与细胞活性成正比，并能溶于有机溶剂， 可用酶标仪测定其光密度值，了解受试药物对PC12细胞凋亡的保护作用。
[0253] 3.1实验材料
[0254] 3.1.1主要试剂与药品
[0255] 参灵通片（实施例1）0.25mg/片
[0256] 试验前用含10%胎牛血清的细胞培养基稀释至所需浓度后使用。
[0257] PC12细胞株：中科院细胞所提供
[0258] H2O2、Aβ25-35：美国sigma公司
[0259] 胎牛血清：gibco公司
[0260] 细胞培养基：RPMI1640
[0261] 3.1.2主要仪器
[0262] 酶标仪：BIO-RAD550
[0263] 3.2实验方法
[0264] 取培养24小时的PC12细胞，加入不同剂量的参灵通片溶液预处理24小时，分别再加入10umol/L的H2O2或25umol/L的Aβ25-35继续培养24小时。采用MTT法检测参灵通片对H2O2、Aβ25-35诱导凋亡的PC12细胞的保护作用。
[0265] 3.3实验结果
[0266] 表20.参灵通片对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的作用
[0267]
[0268]
[0269] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0270] 表21.参灵通片对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用
[0271]
[0272] 注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。 [0273] 实验结果显示：H2O2、Aβ25-35可诱导PC12细胞的凋亡，测试浓度范围内的参灵通片可以在一定程度上对PC12细胞起到保护作用。
[0274] 实施例9本发明的动物急性毒性试验
[0275] 1.试验材料
[0276] 1.1试验药物
[0277] 参灵通片（实施例1）0.25mg/片
[0278] 以蒸馏水配制。
[0279] 1.2试验动物
[0280] 昆明品系小白鼠，II级，雌雄各半，体重18～22g，质量合格证“SCXK（军）2002-005号”，由第四军医大学实验动物中心提供。动物按性别分笼饲养，食固体饲料，食水自由，饲料由西安交通大学医学院实验动物中心提供。室温18～20℃，相对湿度60%～70%。 [0281] 2.试验方法及结果
[0282] 2.1灌胃给药急性毒性试验
[0283] 取小鼠每4只为一组进行预试，观察小鼠的急性中毒反应，摸索死亡率为0%的剂量和死亡率为100%的剂量。结果测得参灵通片灌胃给药死亡率为100%的剂量(LD100)为3g/kg左右，死亡率为0%的剂量(LD0)为1.5g/kg，组间剂量比定为1∶0.85。 [0284] 另取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，各组灌胃给等容积参灵通片
0.2ml/10g，浓度依次为8.62、10.14、11.93、14.035、16.5g%，剂量依次为1.724、2.028、
2.386、2.806、3.3g/kg，观察七日内小鼠一般状况、急性毒性反应及死亡情况。结果表明，给参灵通片后小鼠表现为活动减少或蜷缩不动，不食不饮，直至最后死亡。死亡均发生在给药后3天内。未死亡者给药第三日后逐渐恢复正常，其它未见特殊表现。对死亡小鼠逐只做尸检，结果肉眼未见心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、胸腔、腹腔等主要脏器及体腔有颜色和形态异常，结果见表。
0.2ml/10g，浓度依次为8.62、10.14、11.93、14.035、16.5g%，剂量依次为1.724、2.028、
2.386、2.806、3.3g/kg，观察七日内小鼠一般状况、急性毒性反应及死亡情况。结果表明，给参灵通片后小鼠表现为活动减少或蜷缩不动，不食不饮，直至最后死亡。死亡均发生在给药后3天内。未死亡者给药第三日后逐渐恢复正常，其它未见特殊表现。对死亡小鼠逐只做尸检，结果肉眼未见心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、胸腔、腹腔等主要脏器及体腔有颜色和形态异常，结果见表。
[0285] 表22.参灵通片灌胃给药急性毒性试验结果
[0286]
[0287] 按Bliss`s法计算LD50，参灵通片小鼠灌胃给药LD50为2.35g/kg，95%可信限为2.16～2.55g/kg。
[0288] 2.2腹腔注射急性毒性试验
[0289] 取小鼠每4只为一组进行预试，观察小鼠的急性中毒反应，摸索死亡率为0%的剂量和死亡率为100%的剂量。结果测得参灵通片腹腔注射给药死亡率为100%的剂量(LD100)为125～250mg/kg，死亡率为0%的剂量(LD0)为62.5mg/kg，组间剂量比定为1∶0.8。 [0290] 另取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，各组腹腔注射等容积参灵通片0.2ml/10g，浓度依次为327.7、409.6、512、640、800mg%，剂量依次为65.536、 81.92、
102.4、128、160mg/kg，观察七日内小鼠一般状况、急性毒性反应及死亡情况。结果表明，给参灵通片后小鼠表现为活动减少或蜷缩不动，不食不饮，直至最后死亡。死亡均发生在给药后2天内。未死亡者给药第三日后逐渐恢复正常，其它未见特殊表现。对死亡小鼠逐只做尸检，结果肉眼未见心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、胸腔、腹腔等主要脏器及体腔有颜色和形态异常，结果见表。
102.4、128、160mg/kg，观察七日内小鼠一般状况、急性毒性反应及死亡情况。结果表明，给参灵通片后小鼠表现为活动减少或蜷缩不动，不食不饮，直至最后死亡。死亡均发生在给药后2天内。未死亡者给药第三日后逐渐恢复正常，其它未见特殊表现。对死亡小鼠逐只做尸检，结果肉眼未见心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、胸腔、腹腔等主要脏器及体腔有颜色和形态异常，结果见表。
[0291] 表23.参灵通片腹腔注射给药急性毒性试验结果
[0292]
[0293] 按Bliss`s法计算LD50，参灵通片小鼠腹腔注射给药LD50为94.02mg/kg，95%可信限为84.17～105.03mg/kg。
[0294] 3.试验结论
[0295] 参灵通片小鼠灌胃给药LD50为2.35g/kg，95%可信限为2.16～2.55g/kg；参灵通片小鼠腹腔注射给药LD50为94.02mg/kg，95%可信限为84.17～105.03mg/kg。 [0296] 实施例9本发明的动物长期毒性试验
[0297] 1.大鼠六个月灌胃给药的长期毒性试验结果表明，参灵通片（实施例1）对大鼠的一般状况、食量、饮水量、体重、尿常规、心电图、系统解剖、脏器系数均无明显影响，组织病理学检查未发现对大鼠心、肝、脾、肺、肾等组织有病理性损伤作用。给药过程中（3个月）及连续给药6个月后，部分血液学和血液生化指标与空白对照组比较虽有统计学差异,但无剂量依赖关系,且均在正常生理值范围内；停药2周后，这些指标基本恢复正常；结合病理学检查结果分析，说明该药对大鼠血液学和血液生化指标（肝肾功能等）无明显影响。大鼠恢复期未见其他延迟性毒性反应。说明该药在大鼠长期毒性试验中未见明显毒性反应，提供大鼠无毒性反应剂量为253.36mg/kg/日。
[0298] 2.犬长期毒性试验：参灵通片犬九个月口服给药的长期毒性试验结果表明，参灵通片对犬的一般状况、食量、饮水量、尿常规、心电图、系统解剖、脏器系数均无明显影响，组织病理学检查未发现对大鼠心、肝、脾、肺、肾等组织有病理性损伤作用。较大剂量参灵通片长期给药，犬体重增长轻度减慢，以雌性犬较明显。给药过程中（3个月和6个月）及连续给药9个月后，部分血液学和血液生化指标与空白对照组比较虽有统计学差异,但无剂量依赖关系,且均在正常生理值范围内；停药3周后，这些指标基本恢复正常；结合病理学检查结果分析，说明该药对大鼠血液学和血液生化指标（肝肾功能等）无明显影响。犬恢复期未见其他延迟性毒性反应。说明该药在犬长期毒性试验中未见明显毒性反应，提供犬无毒性反应剂量为190mg/kg/日。
[0299] 实施例10、本发明的一般药理研究试验
[0300] 1.试验目的
[0301] 观察参灵通片对动物的一般药理作用。
[0302] 2.试验材料
[0303] 2.1试验药物
[0304] 参灵通片（实施例1）0.25mg/片
[0305] 以蒸馏水配成所需浓度的溶液。
[0306] 2.2试验器材
[0307] YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪，山东省医学科学院设备站生产；BL-420生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司生产。
[0308] 2.3试验动物
[0309] 昆明品系小白鼠，II级，雌雄各半，体重18～22g，质量许可证“SCXK（军）2002-2006号”，由第四军医大学实验动物中心提供；健康成年Beagle犬,Ⅰ级，雌雄各半，体重10～14kg，质量许可证“SCXK（陕）2006-001号”，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供。
[0310] 3.试验方法及结果
[0311] 3.1对犬呼吸系统和心血管系统的影响
[0312] 健康Beagle犬，雌雄各半，随机分为4组，每组6只。第一组为阴性对照组，给等量生理盐水；第二、三、四组为参灵通片小、中、大组，分别给参灵通片22.17、 44.34、88.68mg/kg。十二指肠给药，2ml/kg。静脉注射戊巴比妥钠25mg/kg使动物处于浅麻醉状态，仰卧固定于手术台，用电烧灼器切开颈部皮肤，分离气管并插管，连接呼吸换能器测量呼吸频率和幅度；分离右颈总动脉并插管，测量动脉血压；连接心电图肢体导联，记录标准II导联心电图，测量P-P间期、P-R间期、QRS波群的幅度和宽度、P波和T波的高度，并计算心率。手术结束后停留30min，待观察指标稳定后记录各项指标正常值(给药前值)，然后给药。给药后、30、60、90、120、180min分别记录各项指标(给药后值)，按下式计算变化率。以变化率进行组间比较的统计学处理，观察参灵通片对犬呼吸系统和心血管系统功能的影响。
[0313] 变化率(%)=(给药后值—给药前值)/给药前值×100
[0314] 结果表明，参灵通片对犬血压、心率、心电图（P-P间期、P-R间期、QRS波群的宽度和幅度、T波和P波的高度）和呼吸频率及幅度无明显影响(P>0.05)；观察期间心律整齐，未见心律失常发生。结果说明，参灵通片对犬呼吸系统和心血
[0315] 管系统功能无明显影响。
[0316] 3.2对小鼠精神神经系统的影响
[0317] 3.2.1对小鼠一般状况和自发活动的影响
[0318] 小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。第一组为阴性对照组，给等量生理盐水；第二、三、四组为参灵通片小、中、大组，分别给参灵通片按107.1、214.2、428.4mg/kg。灌胃给药，0.2ml/10g。给药后观察2h内小鼠一般行为变化和反应、活动、步态、姿势、有无肌肉震颤、肌肉松弛、中枢兴奋或抑制现象，给药后1h用小鼠自主活动记录仪记录10min内小鼠自发活动次数。结果见表24。
[0319] 表24参灵通片对小鼠自发活动的影响
[0320]
[0321] 结果表明，给药后小鼠一般行为变化和反应正常，活动自如，步态及姿势正常，未见肌肉震颤及行动困难，亦未见翘尾、跳跃、尖叫、抽搐等中枢兴奋表现， 口鼻无分泌物，肉眼未见呼吸有明显变化，其他未见异常表现。给药组小鼠自发活动次数与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。提示参灵通片对小鼠一般状况和自发活动无明显影响。 [0322] 3.2.2对小鼠协调运动的影响
[0323] 小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。第一组为阴性对照组，给等量生理盐水；第二、三、四组为参灵通片小、中、大组，分别给参灵通片按107.1、214.2、428.4mg/kg。灌胃给药，0.2ml/10g。给药后60min，将小鼠放置一高76.2cm、直径1.27cm、垂直竖立
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