染料木素衍生物在制备治疗学习记忆障碍疾病药中的应用
阅读：206发布：2020-05-13
专利汇可以提供染料木素衍生物在制备治疗学习记忆障碍疾病药中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于化学制药技术领域，具体涉及染料木素衍 生物 4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙 氨 基)丁 氧 基]异黄 酮 在制备 治疗 学习记忆障碍药物中的应用。4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮有促进MCF-7 细胞增殖 的作用，作用效应呈钟罩型；缩短了 水 迷宫实验中，雌性去势小鼠（行卵巢 切除 术）的潜伏时间；在Y迷宫实验中，显著降低小鼠的错误次数。说明4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮能够有效改善学习记忆能 力 。这种学习记忆的改善是和CaMKII磷 酸化 的增强相一致的。4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮有很好的改善学习记忆的作用，可用于制备改善学习记忆的药物。，下面是染料木素衍生物在制备治疗学习记忆障碍疾病药中的应用专利的具体信息内容。
染料木素衍生物在制备治疗学习记忆障碍疾病药中的应用
一、技术领域
[0002] 随着人口的老龄化及精神压力的增大，学习认知障碍成为严重的社会问题。雌激素及植物雌激素在改善学习记忆方面有突出作用(Barbara BS.Estrogen and cognitive aging in women.TRENDS in Pharmacological Sciences.2002;23(11):527-534.;Craig MC and Murphy DG.Oestrogen,Cognition and the Maturing Female Brain.Journal of Neuroendocrinology 2006;19:1-6)。除绝经期及围绝经期女性外，有人曾给男性记忆障碍患者服用小剂量雌激素，成功地改善了其学习记忆功能（Sex steroids modify working memory.Janowsky JS,Chavez B,Orwoll E.J Cogn Neurosci.2000;12(3):407-14）。 因雌激素广泛作用于ER α和ER β，剂量控制不好会导致雌激素相关的肿瘤(Horwitz KB,Koseki Y,McGuire WL.Estrogen control of progesterone receptor in human breast cancer:role of estradiol and antiestrogen.Endocrinology.1978;103(5):1742-51)。为增加雌激素对靶点的专属性，尽最大可能降低不良反应，对植物雌激素染料木素进行结构改造，首次得到染料木素衍生物4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮（简称GS 14）。4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对ER β有更强的结合力，能更好地改善学习记忆降低不良反应，目前改善学习记忆方面的药物中尚无此类结构的报道。
三、发明内容
三、发明内容
[0003] 本发明需要解决的问题是研究植物雌激素染料木素衍生物4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮在制备改善学习记忆药物中的应用。
[0004] 本发明所述4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的结构式如下：
[0005]
[0006] 本发明发现，4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮可一定程度上促进依赖雌激素生长的人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖，该增殖可被雌激素受体的拮抗剂ICI182670所抑制，说明4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮依旧具有雌激素活性。当给予雌性去势小鼠（行卵巢切除术）4',5'二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮后，在水迷宫实验中，小鼠的潜伏时间显著缩短；Y迷宫实验中，小鼠的错误次数显著降低。说明4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮能够有效改善学习记忆能力。
[0008] 本发明的有益效果是本发明所述染料木素衍生物4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮有很好的改善学习记忆的作用，可用于制备改善学习记忆的药物。目前上市的改善学习记忆的药物中，尚未见此结构的报道，故该结构开发为改善学习记忆药物将有重要的意义及深远的影响。本发明提供了一种疗效好、工艺简单、成本低廉的新药，填补了此类治疗药物的空白。
四、附图说明
四、附图说明
[0009] 图1.4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮(GS14)增加了小鼠大脑皮层CaMKII和pCaMKII的表达。Sham:假手术组；OVX:卵巢切除术组；GSL:GS 14##低剂量（1mg/kg）；GSH:GS 14高剂量（5mg/kg）。X=Mean±SD，n=10。 P<0.01vs Sham；
* **
P<0.05, P<0.01vs OVX。
五、具体实施方式
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P<0.05, P<0.01vs OVX。
五、具体实施方式
[0010] 1.4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的合成及鉴定
[0011] 见专利（申请号：201010573851.7谭仁祥、史大华、吴俊华、宴志强、张丽娜、王玉蓉。名称：“4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮及其制备方法和应用。”申请日期：2010年12月6日）。
[0012] 实施例1：4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮及其制备
[0013] 制备染料木素衍生物4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮，包括以下步骤：
[0014] ①4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的制备
[0015] 染料木素（0.27g，1mmol），1,4-二溴丁烷（5.4g，25mmol），K2CO3（0.07g，0.5mmol）溶解在60ml的无水DMF中，40℃下超声反应1.5h。反应完成后，将混合物冷却到室温。滤除不溶物后，滤液减压蒸馏得到淡黄色固体，丙酮中重结晶得到浅黄色针状晶体，产率86%，熔点130-131℃。
[0016] 1H NMR(DMSO-d6):1.83（m，2H），1.94（m，2H），3.60（t，J=6.2Hz，2H），4.12（t，J=6.4Hz，2H），6.40（d，J=2.0Hz，1H），6.65（d，J=2.0Hz，1H），6.80（d，J=8.5Hz，1H），7.38+（d，J=8.5Hz，2H），8.4（s，1H），9.65（s，1H),12.95(s,1H).ESI-MSC19H17BrO5[M+H]405.Calcd forC19H17BrO5:C,56.31;H,4.23.Found:C,56.28;H,4.27.
[0017] ②4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的制备
[0018] 将化合物4',5'-二羟基-7-4-溴丁氧基）异黄酮（0.40g，1mmol）溶于5ml无水DMF中，慢慢滴加二乙胺（0.37g，5mmol）,80℃-90℃下搅拌1h，反应产物慢慢倾入100ml冰水混合物中，静置过夜，滤出固体，丙酮重结晶，产物为4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮，产率82%，熔点170-171℃。
[0019] 1H NMR(DMSO-d6):0.94（t，J=7.2Hz,6H），1.52（m，2H），1.72（m，2H），2.4（m，2H），3.33（t，J=7.0Hz，4H），4.1（t，J=6.5Hz，2H），6.39（d，J=2.0Hz，1H），6.64（d，J=2.0Hz，
1H），6.82（d，J=8.5Hz，2H），7.39（d，J=8.5Hz,2H），8.40(s,1H)，9.60(s,1H),12.93(s,1H).+
ESI-MS C23H27NO5[M+H]398.Anal.Calc.for C23H27NO5:C, 69.50;H,6.85;N,3.52.Found:C,69.60;H,6.79;N,3.58.
1H），6.82（d，J=8.5Hz，2H），7.39（d，J=8.5Hz,2H），8.40(s,1H)，9.60(s,1H),12.93(s,1H).+
ESI-MS C23H27NO5[M+H]398.Anal.Calc.for C23H27NO5:C, 69.50;H,6.85;N,3.52.Found:C,69.60;H,6.79;N,3.58.
[0020] 2、4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的雌激素样作用
[0021] MCF-7以4500个细胞/孔的密度接种96孔板，24h后换成无雌激素的培养基（无酚红的DMEM,含10%经过葡聚糖/活性碳过滤的胎牛血清）。继续培养48h，完全消耗掉细胞-10 -5中的雌激素。更换培养基后，分别加入10 ～10 M的4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨-9 -10
基)丁氧基]异黄酮，或加入10 M的雌激素受体抑制剂ICI182680后，再分别加入10 ～-5
10 M的4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮。培养6d后，弃去培养基，每孔加入0.1ml MTT(5mg/ml，溶于PBS)。培养4h后，吸去孔中的培养液,每孔加入100μl的二甲基亚砜，用酶标仪在550nm波长测吸光度,检测细胞活性。雌二醇对MCF-7活性的影响如表1所示。17β-雌二醇能促进MCF-7细胞的增殖，若将和17β-雌二醇共孵育的MCF-7细胞的增殖率设定为100%，给予雌激素受体抑制剂ICI182680后，MCF-7细胞的增殖率下降到35%±6%。
基)丁氧基]异黄酮，或加入10 M的雌激素受体抑制剂ICI182680后，再分别加入10 ～-5
10 M的4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮。培养6d后，弃去培养基，每孔加入0.1ml MTT(5mg/ml，溶于PBS)。培养4h后，吸去孔中的培养液,每孔加入100μl的二甲基亚砜，用酶标仪在550nm波长测吸光度,检测细胞活性。雌二醇对MCF-7活性的影响如表1所示。17β-雌二醇能促进MCF-7细胞的增殖，若将和17β-雌二醇共孵育的MCF-7细胞的增殖率设定为100%，给予雌激素受体抑制剂ICI182680后，MCF-7细胞的增殖率下降到35%±6%。
[0022] 表1.MCF-7细胞的相对增殖率（%，n=6）
[0023]
[0024] 随后，考察了4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮(GS14)及-9 -9 -5ICI182670（10 M）对MCF-7细胞增殖率的影响，结果见表2。10 M~10 M的GS14均能增加MCF-7细胞的增殖，且GS14对MCF-7细胞的增殖呈钟罩型，说明GS14是具有雌激素样作用-9 -9
的。在GS14浓度为10 M时，对MCF-7细胞的增殖率最大，为109%±14%。若预先给予10 M的ICI182670，细胞增殖率显著降低，进一步验证了GS14的雌激素样作用。
的。在GS14浓度为10 M时，对MCF-7细胞的增殖率最大，为109%±14%。若预先给予10 M的ICI182670，细胞增殖率显著降低，进一步验证了GS14的雌激素样作用。
[0025] 表2.梯度浓度的4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮(GS14)-9及ICI182670（10 M）对MCF-7细胞增殖率的影响（%）
[0026]
[0027] 3、4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对学习记忆的改善作用[0028] ①雌激素缺乏小鼠学习记忆障碍模型的建立
[0029] 取6~8周龄的ICR小鼠，随机分成阴性对照组、卵巢切除组、17β雌二醇组、4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮（1mg/kg和5mg/kg）组，每组10只。
腹腔麻醉后，行卵巢切除术。假手术组仅做切开缝合手术，不摘除卵巢。术后一周后分别皮下给予17β雌二醇（0.1mg/kg）、4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮（1mg/kg和5mg/kg）组。给予化合物6周。6周后，待小鼠进行完水迷宫和Y迷宫等行为学实验后，取血，检测小鼠血清中雌二醇含量；取子宫，测子宫体重比。
腹腔麻醉后，行卵巢切除术。假手术组仅做切开缝合手术，不摘除卵巢。术后一周后分别皮下给予17β雌二醇（0.1mg/kg）、4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮（1mg/kg和5mg/kg）组。给予化合物6周。6周后，待小鼠进行完水迷宫和Y迷宫等行为学实验后，取血，检测小鼠血清中雌二醇含量；取子宫，测子宫体重比。
[0030] 从表3中可见，行卵巢切除术后的小鼠子宫重量显著减少，血清中雌二醇含量也从假手术组的(412±26)pg/ml下降到（289±38）pg/ml。可见，卵巢切除术导致小鼠体内雌激素水平显著降低。
[0031] 表3.行卵巢切除术后小鼠的子宫/体重比（%）及血清中雌二醇含量（pg/ml）[0032]
[0033] ②水迷宫实验观察4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对空间记忆的改善
[0034] 在直径1.5m，高0.5m的圆形游泳池（内有放置水下1.5cm的黑色平台）中，训练小鼠寻找黑色平台。通过小鼠顺利登台的时间，考察化合物对学习记忆的改善。摄像机记录小鼠的运动轨迹。第一天：首先让小鼠进行30s自由泳后，放在平台上休息10s。随后，让小鼠自由泳。若小鼠在60s内没有找到平台，则将其放在平台上休息10s后，让其离开平台。每天上、下午各训练一次，连续训练4天。每次训练间隔15min，记录潜伏时间，若60s内找不到。第5天正式测试。测试3次，取平均值，结果见表4。
[0035] 水迷宫实验是观察小鼠空间记忆能力的经典实验。假手术的ICR小鼠经训练后，能较快地找到水中的平台。而小鼠行卵巢切除术后，登台时间明显延长，平均潜伏时间为44±17s，有的甚至在规定时间内找不到平台。可见雌激素的减少会导致小鼠空间记忆能力降低。给予雌激素治疗后，能明显缩短找到平台的时间。4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮(GS14)的治疗也能剂量依赖性地减少卵巢切除小鼠找到平台的时间（见表4）。说明4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮能提高行卵巢切除术后小鼠的空间认知能力。
[0036] 表4.水迷宫实验中小鼠的潜伏时间（s）
[0037]
[0038] ③Y迷宫实验观察4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对短期记忆的改善
[0039] 由等长的I、Ⅱ、III臂和三者的交界区组成Y迷宫的箱底。每条臂长30cm，宽5cm，高12cm。每臂底部铺设直径0.2cm，长14cm，间距1cm的可导电的薄层铜片，顶端各装一盏15w的刺激信号灯。当相应臂的信号灯亮时，该臂不通电为安全区，另外无灯光的两臂及交界区均通电而成为非安全区(电击区)。实验开始时，让大鼠在起步区(大鼠开始所在的臂)适应3min，然后随机转换按钮开关以变换安全区与电击区的位置，观察动物学会逃离电击区而进如安全区的反应能力。小鼠在电刺激尚未开始时即逃到安全区为正确。小鼠经过训练后，通过学习记住信号灯亮即为安全区。第1d训练小鼠，上下午各1次。第2d共刺激10次，记录正确的百分比，以此判断化合物对学习记忆的改善。
[0040] 如表5所示，给予1mg/kg或5mg/kg的4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮后，正确率分别从21%±8%上升到63%±10%和73%±13%。可见，4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮有很好的改善短期记忆的作用。
[0041] 表5.Y迷宫考查小鼠的判断正确率（%,n=10）
[0042]
[0043]
[0044] ④4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对学习记忆相关蛋白CaMKII和pCaMKII的影响
[0045] 做完行为学测试的小鼠处死，取脑，脑组织用冰冷的PBS洗过后，用裂解 液 [ 含 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50mmol/L KCl,5mmol/L DTT,1mmol/L
EDTA,0.1%SDS,0.5%Triton X-100和蛋白酶抑制剂cocktail(Roche,Indianapolis,Indiana)]匀浆裂解。置冰上30min后，12000rpm离心10min。上清液用BCA法订蛋白，总蛋白被
12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后，转移到PVDF膜。5%脱脂奶封闭，抗小鼠的CaMKII和pCaMKII一抗4℃孵育过夜。膜用含0.1%Tween20的PBS清洗后，室温孵育HRP标记的二抗
2h。PBS清洗后用ECL发光液显色，X胶片曝光。结果见附图1。
EDTA,0.1%SDS,0.5%Triton X-100和蛋白酶抑制剂cocktail(Roche,Indianapolis,Indiana)]匀浆裂解。置冰上30min后，12000rpm离心10min。上清液用BCA法订蛋白，总蛋白被
12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后，转移到PVDF膜。5%脱脂奶封闭，抗小鼠的CaMKII和pCaMKII一抗4℃孵育过夜。膜用含0.1%Tween20的PBS清洗后，室温孵育HRP标记的二抗
2h。PBS清洗后用ECL发光液显色，X胶片曝光。结果见附图1。
[0046] CaMKII和CaMKII的磷酸化水平（pCaMKII）在学习记忆中起关键作用。小鼠行卵巢切除术后，CaMKII和CaMKII的磷酸化水平显著降低，17β雌二醇和4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮能显著增加CaMKII和CaMKII的磷酸化水平（图1）,进一步说明4',5'-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮有学习记忆的改善作用。
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