结合到抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架
阅读：21发布：2020-05-31
专利汇可以提供结合到抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的主题内容是结合到抗NMDAR1 抗体 的结合区的抗体或抗体 片段 或非Ig 支架 ，及其在 治疗 或诊断中的用途。，下面是结合到抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架专利的具体信息内容。
1.特异性结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗NMDAR1抗体的结合区被包含在一个或多个序列中，其中所述一个或多个序列选自下述序列：
SEQ ID NO:1(003-109-HC)
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并且其中用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的所述结合区包含一个或几个下面提到的序列或由一个或几个下面提到的序列构成：
2.权利要求1的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架是非IgG支架。
3.权利要求1或2的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架、纤连蛋白支架、基于脂钙蛋白的支架、泛素支架、转铁蛋白支架、蛋白A支架、基于锚蛋白重复序列的支架、微型蛋白支架、优选为形成半胱氨酸结的微型蛋白支架、基于Fyn SH3结构域的支架、基于EGFR-A结构域的支架和基于Kunitz结构域的支架以及适体。
4.权利要求3的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的非Ig支架，其中所述非Ig支架是寡核苷酸适体。
5.权利要求1至4任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架对所述抗NMDAR1抗体的结合区表现出亲和性，使-7 -8 -9
得对所述抗NMDAR1抗体的结合区的解离常数KD低于10 M，优选10 M，优选的KD低于10 M，最优选地低于10-10M。
6.权利要求1至5任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架中和所述抗NMDAR1抗体。
7.权利要求1至6任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是单特异性抗体或抗体片段或非Ig支架。
8.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关。
9.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中如果对象表现出在体液中存在抗NMDAR1抗体并表现出选自根据下述名单所述的临床症状/病症的至少一种临床症状或临床病症(括号中的ICD编号是指定义所述临床病症的WHO国际疾病分类)，则所述对象需要这种治疗：
-精神异常，包括抑郁(F32)、伴有精神病性症状的躁狂(F30.2)、焦虑(F06.4)、恐惧性焦虑(F40)、妄想(F22.0)、强迫症(F42)、器质性妄想症(F06.3)、紧张症(F06.1、F20.2)、急性多形性精神病(F23.0、F23.1)、解离症(F44)
-运动障碍，包括动作障碍/肌张力障碍(G24)、肌阵挛(G25.3)、震颤(G25.0、G25-1、G25-2)、抽搐(F95、G25.69)
-癫痫发作(G40)
-通气不足(R06.89)
-轻度认知损伤(F06.7)
-阿尔茨海默病性痴呆(F00)、血管性痴呆(F01)、其他疾病性痴呆(F02)
-妊娠。
10.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8或9的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被体内给药到有需要的所述对象。
11.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至10任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被静脉内给药到有需要的所述对象。
12.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至11任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被用于有需要的所述对象的离体治疗中。
13.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至12任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述对象在按照实施例1.2的方法测量时表现出存在抗NMDAR1抗体。
14.权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至13任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架与化学治疗剂或免疫抑制剂组合使用。
15.一种治疗或预防权利要求8至14任一项的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或医学病症的方法，其包括向有需要的对象给药有效量的权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架。
16.权利要求1至7任一项的化合物在制造用于治疗或预防权利要求8至14任一项的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或医学病症的药物中的用途。
17.用于血浆置换或CSF置换(脑脊液置换术)的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架。
18.权利要求17的用于血浆置换或CSF置换(脑脊液置换术)的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置是涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的柱。
19.权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架的用途，其用于在患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症的对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在。
20.一种在对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在以便确定所述对象是否需要治疗的方法，其中所述对象患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，并且所述方法包括：
●将从所述对象获得的体液样品与至少一种权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架相接触
●确定所述体液样品中所述抗NMDAR1抗体的存在
●其中在所述样品中存在抗NMDAR1抗体的情况下，所述对象可能患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症并可能需要治疗。
21.用于在可能需要治疗的对象的样品中确定抗体的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
1)固相支持物，其具有NMDAR1结合性抗体或NMDAR1结合性抗体片段或NMDAR1结合性非Ig支架的固定化混合物
2)用于确定标准曲线的重组人类NMDAR1抗体
3)与可定量标记物偶联的抗人类免疫球蛋白抗体。
结合到抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体的结合区的抗
[0002] 患有抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-1(抗NMDAR1)抗体脑炎的患者受到一种具有特征性临床多阶段特点、主要影响儿童和年轻女性的严重形式的脑炎的折磨。它从精神病性症状、记忆缺失和癫痫发作进展到意识丧失、自主神经功能障碍、动作障碍和通气不足的状态(Dalmau等，2011，Lancet Neurol.10(1):63-74；Prüss等，2010，Neurology.75(19):1735-9；Prüss等，2013，Neurology.78(22):1743-53)。所述疾病的标志是针对NMDAR1的NR1亚基的抗体。此外，患有非典型痴呆的患者亚组带有抗NMDAR1抗体，通过非特异性移除所有抗体来移除所述抗NMDAR1抗体在所选病例中引起临床改善(Prüss等，2010，Neurology.75(19):1735-9；Doss等，2014，Ann Clin Transl Neurol.1(10):822-32)。这深刻地改变了脑炎这种到目前为止尚没有病因治疗选项的疾病的治疗概念。到目前为止，抗体介导的疾病只能使用攻击性和非特异性的免疫疗法(包括血浆置换)来治疗，这意味着由免疫系统的广泛抑制引起的主要副作用，例如频繁的感染或脓毒症、对疫苗接种缺乏响应、过敏性反应和来自于中央导管的心血管并发症。迄今为止，迫切需要只靶向引起疾病的针对NMDAR1的自体抗体的特异性疗法，但这种疗法尚未获得。
[0003] 因此，本发明方法的目的是开发一种新的抗体特异性免疫疗法，其基本上只贫化抗NMDAR1抗体，留下基本上所有其他类型的“有益抗体”不受影响。
[0004] 本发明的主题内容是结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗NMDAR1抗体的结合区被包含在选自下述序列的序列中：
[0005] SEQ ID NO:1(003-109-HC)
[0006] VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYDFDAFDIWGQGTMVTVSS
[0007] SEQ ID NO:2(003-109-LC)
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[0011] SEQ ID NO:4(003-102-LC)
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[0027] SEQ ID NO:12(007-142-LC)
[0028] LTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTGVFGGGTKLTVL
[0029] SEQ ID NO:13(008-218-HC)
[0030] EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQVPGKGLEWVSGISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRASSWYAYGMDVWGQGTLVTV
[0031] SEQ ID NO:14(008-218-LC)
[0032] NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYDDNQRPSGVPNRFSGSIDSSSNSASLIISGLKTEDEADYYCQSTRVFGGGTKLTVL
[0033] 在特定实施方式中，本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗NMDAR1抗体的结合区被包含在选自下述序列的序列中：
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区可以包含一个或几个上面提到的序列。用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区可以包含一个或几个上面提到的序列，或由一个或几个上面提到的序列构成。在特定实施方式中，本发明的主题内容是特异性结合到如上所示出的抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架。在这种情形中，特异性结合意味着所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到表现出至少一个上述结合区的抗NMDAR1抗体，但不结合到不表现出至少一个上述结合区的抗体。
[0038] 当所述抗NMDAR1抗体由于抗体的折叠而表现出三维结构时，本发明的抗体或抗体片段或非Ig支架可能结合到超过一个上述序列。由于蛋白质的三维结构，本发明的抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区可能由与至少一个上述序列至少部分交叠的非线性表位构成。部分交叠意味着至少一个上述序列的至少1个或2个或3个或4个或5个氨基酸被所述抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区结合。
[0039] 在整个本说明书和权利要求书中，结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架分别与术语NMDAR1抗体抗体或NMDAR1抗体抗体片段或NMDAR1抗体非Ig支架同义，并且等同于结合到所述NMDAR1抗体的抗体或结合到所述NMDAR1抗体的抗体片段或结合到所述NMDAR1抗体的非Ig支架，并且是指抗NMDAR1抗体抗体或抗NMDAR1抗体抗体片段或抗NMDAR1抗体非Ig支架。
[0040] 在本发明的结合到所述抗NMDAR1抗体的抗体或结合到所述抗NMDAR1抗体的抗体片段或结合到所述抗NMDAR1抗体的非Ig支架的一个特定实施方式中，所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到所述结合区的序列内的优选地至少1个或至少2个或至少3个、或优选地至少4个或至少5个氨基酸的区域。
[0041] 在本发明的结合到所述抗NMDAR1抗体的抗体或结合到所述抗NMDAR1抗体的抗体片段或结合到所述抗NMDAR1抗体的非Ig支架的一个特定实施方式中，所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到与上述序列SEQ ID No:1至56内包含的至少3个、优选地至少4个、优选地至少5个氨基酸交叠或含有所述氨基酸的区域。正如上文概述的，用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区可以包含一个或几个上面提到的序列或一个或几个上面提到的序列的部分。这种部分包含至少1个或2个或3个或4个或5个氨基酸。
[0042] 在一个特定实施方式中，术语“抗NMDAR抗体”在整个本说明书和权利要求书中被理解为“抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-1抗体”。因此，在所述特定实施方式中，术语“NMDAR”被理解为“N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-1”。因此，在所述特定实施方式中，术语“结合到抗NMDAR抗体的抗体或抗体片段或非Ig支架”被理解为结合到所述N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-1的抗体或抗体片段或非Ig支架。本领域技术人员理解，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-1是NMDA受体的NR1亚基。
[0043] 本发明的抗体或片段是特异性结合抗原的包括基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链通常为约25kDa或长度为214个氨基酸。全长免疫球蛋白重链通常为约50kDa或长度为446个氨基酸。轻链由位于NH2端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和位于COOH端的κ或λ恒定区基因编码。重链同样由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其余恒定区基因之一编码。
[0044] 抗体的基本结构单元通常是由同样的两对免疫球蛋白链构成的四聚体，每对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区结合到抗原，并且恒定区介导效应物功能。免疫球蛋白也以各种不同的其他形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂合抗体和单链。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被三个超变区(也称为互补决定区(CDR))打断的构架区(参见E.Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services,1983)。正如上面指出的，CDR主要负责结合到抗原的表位。免疫复合物是与所述抗原特异性结合的抗体例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体或功能性抗体片段。
[0045] 嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，可以将来自于小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接到人类恒定区段例如κ和γ1或γ3。因此，在一个实例中，治疗性嵌合抗体是由来自于小鼠抗体的可变或抗原结合结构域与来自于人类抗体的恒定或效应物结构域构成的杂合蛋白质，但也可以使用其他哺乳动物物种，或者可变区可以通过分子技术产生。制造嵌合抗体的方法在本领域中是公知的，例如参见美国专利号5,807,715。“人源化”免疫球蛋白是包含人类构架区和来自于非人类(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，提供构架的人类免疫球蛋白被称为受体。在一个实施方式中，在人源化免疫球蛋白中，所有的CDR都来自于供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果它们存在的话，它们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上一致，即同一性为至少约85-90％，例如约95％或更高。因此，可能除了CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分基本上一致。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合到相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可能具有从供体构架获取的有限数目的氨基酸替换。人源化或其他单克隆抗体可以具有基本上不影响抗原结合或其他免疫球蛋白功能的其他保守氨基酸替换。示例性的保守替换是例如：gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；
asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程来构建(例如参见美国专利号5,585,089)。人类抗体是其中轻链和重链基因是人类来源的抗体。人类抗体可以使用本领域中已知的方法产生。人类抗体可以通过对分泌目标抗体的人类B细胞进行永生化来生产。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人类抗体也可以通过噬菌体展示方法(WO 91/17271，WO 92/001047)来生产，或者从人类组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网站)。人类抗体也可以通过使用携带人类免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见WO 93/
12227和WO 91/10741)。
asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程来构建(例如参见美国专利号5,585,089)。人类抗体是其中轻链和重链基因是人类来源的抗体。人类抗体可以使用本领域中已知的方法产生。人类抗体可以通过对分泌目标抗体的人类B细胞进行永生化来生产。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人类抗体也可以通过噬菌体展示方法(WO 91/17271，WO 92/001047)来生产，或者从人类组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网站)。人类抗体也可以通过使用携带人类免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见WO 93/
12227和WO 91/10741)。
[0046] 因此，本发明的抗体可以具有本领域中已知的格式。实例是人类抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在优选实施方式中，本发明的抗体是重组生产的抗体例如IgG，一种典型的全长免疫球蛋白，或至少含有重链和/或轻链的可变结构域的抗体片段，例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的二价Fab(微抗体)；二价Fab或多价Fab，例如通过在异源结构域的帮助下多聚化、例如通过dHLX结构域的二聚化形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab’)2片段，scFv片段，多聚化的多价和/或多特异性scFv片段，二价和/或双特异性双体抗体， (双特异性T-细胞衔接物)，三功能抗体，多价抗体，例如来自于G之外的不同类别的；单结构域抗体，例如源自于骆驼或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体，等等。
[0047] 在优选实施方式中，抗体格式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体格式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物利用度优化的偶联物，例如PEG化的片段。一种最优选的格式是scFab格式。对于抗体格式的说明，请参见图1a、1b和1c。
[0048] 除了抗体之外，其他生物聚合物支架在本领域中公知与靶分子复合，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、镜像异构适体(spiegelmer)、anticalin和芋螺毒素。
[0049] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中非Ig支架可以是蛋白质支架，并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合到配体或抗原。非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架(例如在US 2010/0028995中描述的)、纤连蛋白支架(例如在EP 1 266 025中描述的)、基于脂钙蛋白(lipocalin)的支架(例如在WO 2011/154420中描述的)、泛素支架(例如在WO 2011/073214中描述的)、转铁蛋白支架(例如在US 2004/0023334中描述的)、蛋白A支架(例如在EP 2 231 860中描述的)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中描述的)、微型蛋白(microprotein)(优选为形成半胱氨酸结的微型蛋白)支架(例如在EP 2 314 308中描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/023685中描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1 941 867中描述的)和Avimer(US 20050053973 A1)和基于CTLA4的支架(WO 00/60070)，以及Armadillo重复序列蛋白(US 20110224100 A1)。
[0050] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中非Ig支架可以是非蛋白质支架并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够结合到配体或抗原。这些非Ig支架可以选自寡核苷酸适体：RNA适体，DNA适体和L-RNA适体(镜像异构适体)。
[0051] 在本发明的特定实施方式中，本发明的主题内容是非IgG支架。在更特定的实施方式中，所述非IgG支架是非肽和非蛋白质非IgG支架。在更特定的实施方式中，所述非IgG支架是选自RNA适体、DNA适体和L-RNA适体(镜像异构适体)的寡核苷酸适体。
[0052] 为了使用SELEX系统产生适体(US 5,270,163)，将靶结构(人类单克隆NMDAR1抗体)与含有几乎任何三维结构的>1015个随机适体的文库温育。几轮的选择和扩增产生高特异性和亲和性的适体(图2)。机器人辅助的选择过程是高度标准化的，并包含下述步骤：适体文库和抗体温育，结合的适体的扩增和纯化，重复大约9轮SELEX，选择过程中适体的下一代测序，使用等离子体共振的亲和性控制。
[0053] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架对所述抗NMDAR1抗体的结合区表现出亲和性，使得对所述抗NMDAR1抗体的结合区的解离常数(KD)低于10-7M，优选10-8M，优选的KD低-9 -10于10 M，最优选地低于10 M。所述结合亲和性可以在实施例4的测定法中测定。实施例4描述了表面等离子体共振分析(Biacore)。
[0054] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架特异性结合到所述抗NMDAR1抗体。
[0055] 本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架在体内捕获抗NMDAR1抗体，或在溶液中离体捕获抗NMDAR1抗体和/或从体液中移除和/或贫化抗NMDAR1抗体。术语“在体内捕获抗NMDAR1抗体”可以被理解为抑制和/或阻断和/或妨碍和/或废除和/或阻遏抗NMDAR1抗体对NMDAR1的结合，或中和和/或清除和/或拦截抗NMDAR1抗体。具体来说，本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架可以从体液中捕获和/或移除抗NMDAR1自体抗体，而不捕获和/或移除>80％的非NMDAR1特异性Ig分子，特别是>90％的非NMDAR1特异性Ig分子，特别是>99％的非NMDAR1特异性Ig分子。所述百分率与下面示例的在450nm处的光度计测量值相关：
[0056] Ig分子的结合和/或移除可以使用ELISA，通过在使用结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架治疗之前和之后获取的患者样品的比较来确定。所述测定法利用包被在96孔板上的特异性针对人类Ig的抗体。将样品吸取到孔中，样品中存在的Ig被固定化的抗体结合到孔上。将孔洗涤，并添加生物素化的抗人类Ig抗体。在洗掉未结合的生物素化抗体之后，将HRP偶联的链亲和素吸取到孔中。将孔再次洗涤，向孔添加TMB底物溶液，产生的颜色(在450nm处通过光度计测量)与结合的Ig的量成比例。
[0057] 具体来说，本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架结合到抗NMDAR1自体抗体和/或从体液中移除抗NMDAR1自体抗体，并且不结合到或基本上不结合到特异性针对病原体、肿瘤抗原或已知具有保护性生理功能的其他Ig分子。
[0058] 一种通过构建携带AChR结构域的“免疫吸附”柱从患者的血浆中离体选择性贫化抗AChR自体抗体的方法已被描述在Tzartos等，2008.Ann N Y Acad Sci.1132:291-9中。同样的方法可以按照本发明用于从患者血浆中选择性贫化抗NMDAR1抗体。患者可以是人类或动物对象。
[0060] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架中和所述抗NMDAR1抗体或中和所述抗NMDAR1抗体的生物学效应。
[0061] 在一个实施方式中，本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的中和性抗体或抗体片段或非Ig支架，在体外抑制了纯化的抗NMDAR1抗体或体液中的患者自体抗体与重组表达的NMDAR1的结合。所述结合的抑制可以按照实施例5.1和/或实施例5.2，在抑制细胞和组织测定法中确定：
[0062] -适体抑制纯化的抗NMDAR1抗体与表达NMDAR1(GRIN1)的转染的HEK293细胞的结合(参见例如WO 2012076000A2中的实施例，实施例1；Euroimmune：Autoimmune-Enzephalitis Mosaik 1)；
[0063] -适体抑制来自于患者的血液/血清/CSF的抗NMDAR1抗体与表达NMDAR1(GRIN1)的转染的HEK293细胞的结合(WO 2012076000A2中的实施例)
[0064] 在一个实施方式中，本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的中和性抗体或抗体片段或非Ig支架按照实施例5.2抑制了纯化的抗NMDAR1抗体与表达NMDAR1的组织的结合：
[0065] -免疫组织化学：适体抑制抗NMDAR1抗体与表达NMDAR1的组织的结合。
[0066] 在一个实施方式中，本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的中和性抗体或抗体片段或非Ig支架抑制了抗NMDAR1抗体介导的NMDAR阳性突触簇的下调，如实施例5.4、图7中所示：
[0067] -适体抑制抗NMDAR1自体抗体介导的下调。
[0068] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是单特异性抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0069] 单特异性抗体或单特异性抗体片段或单特异性非Ig支架意味着所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到所述结合区的序列内优选地至少1个、优选地至少2个、优选地至少3个、优选地至少4个或至少5个氨基酸的一个特定区域。在本发明的一个特定实施方式中，所述单特异性抗体或单特异性抗体片段或单特异性非Ig支架结合到与上述具有SEQ ID No:1至56的序列内包含的至少1个、优选地至少2个、优选地至少3个、优选地至少4个、优选地至少5个氨基酸交叠或含有所述氨基酸的区域。正如上面概述的，用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的结合区可以包含一个或几个上面提到的序列。
[0070] 单特异性抗体或单特异性抗体片段或单特异性非Ig支架是都对同一抗原具有亲和性的抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0071] 本发明的单特异性抗体或片段或非Ig支架是都对同一抗原具有亲和性的抗体或片段或非Ig支架。单克隆抗体是单特异性的，但单特异性抗体也可以通过除了从共同种系细胞生产所述抗体之外的其他手段来生产。
[0072] 抗体可以按照下述程序，利用主动免疫接种来生产：
[0073] 将合成生产的肽序列(根据上面给出的单克隆重组NMDAR1抗体的NMDAR1结合序列)或单克隆人类NMDAR1抗体(在切掉Fc部分之后)用于主动免疫接种。对于每只小鼠，将20μg蛋白质用完全弗氏佐剂(CFA)乳化，并皮下注射200μl乳液。在4和8周后，通过腹膜内注射，对每只小鼠使用不完全弗氏佐剂(IFA)中的20μg蛋白质进行重复的加强免疫接种。按照标准流程，包括酵母表面展示与高通量荧光活化细胞分选的组合(例如Doerner等，2014.FEBS Lett.21；588(2):278-87)，从脾脏收获产生抗体的B细胞，筛选以足够的亲和性与所需表位反应的细胞克隆并分离它们，用于单克隆抗体产生。
[0074] 鼠类抗体的人源化可以按照下述程序进行：
[0075] 为了将鼠类来源的抗体人源化，分析抗体序列以调查带有互补决定区(CDR)的构架区(FR)与所述抗原的结构相互作用。在结构建模的基础上选择适合的人类来源的FR，并将鼠类CDR序列移植到所述人类FR中。可以在CDR或FR的氨基酸序列中引入变异，以重新获得被所述FR序列的物种转换所废除的结构相互作用。这种结构相互作用的恢复可以通过使用噬菌体展示文库的随机方法，或通过分子建模指导的定向方法来实现(Almagro等，2008.Front Biosci.13:1619-33)。
[0076] 在优选实施方式中，本发明的抗体格式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，所述抗体格式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物利用度优化的偶联物，例如PEG化的片段。一种最优选的格式是scFab格式。
[0077] 在另一个实施方式中，所述抗体、抗体片段或非Ig支架是全长抗体、抗体片段或非Ig支架。
[0078] 在更优选实施方式中，所述抗体或抗体片段或非Ig支架针对所述结合区中包含的长度为至少1个、优选地至少2个、优选地至少3或4或5个氨基酸的表位，并且可以结合到所述表位。
[0079] 在整个本说明书和权利要求书中，术语NMDAR1抗体抗体或NMDAR1抗体抗体片段或NMDAR1抗体非Ig支架等同于结合到所述NMDAR1抗体的抗体或结合到所述NMDAR1抗体的抗体片段或结合到所述NMDAR1抗体的非Ig支架，并且是指抗NMDAR1抗体抗体或抗NMDAR1抗体抗体片段或抗NMDAR1抗体非Ig支架。
[0080] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1亚基抗体相关，并且在特定实施方式中，还另外具有选自根据下述名单所述的临床症状/病症的至少一种临床症状或临床病症(括号中的ICD编号是指定义所述临床病症的WHO国际疾病分类)：
[0081] -精神异常，包括抑郁(F32)、伴有精神病性症状的躁狂(F30.2)、焦虑(F06.4)、恐惧性焦虑(F40)、妄想(F22.0)、强迫症(F42)、器质性妄想症(F06.3)、紧张症(F06.1、F20.2)、急性多形性精神病(F23.0、F23.1)、解离症(F44)
[0083] -癫痫发作(G40)
[0084] -通气不足(R06.89)
[0085] -轻度认知损伤(F06.7)
[0086] -阿尔茨海默病性痴呆(dementia in Alzheimer’s disease)(F00)、血管性痴呆(F01)、其他疾病性痴呆(dementia in other diseases)(F02)
[0087] -妊娠。
[0088] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症如上所定义与抗NMDAR1亚基抗体相关，其中治疗效果是基于本发明的所述NMDAR1抗体的结合和/或阻断和/或从所述患者的体液中移除。
[0089] 与根据现有技术疗法的自体免疫障碍的治疗例如使用静脉内免疫球蛋白(IVIG)或无选择性血浆置换的治疗相反，本发明的疗法是基于针对所述NMDAR1抗体的特异性效应。众所周知并因此形成了神经学中的常规指导方针的基础的是：与NMDAR抗体相关的自体免疫脑炎的临床改善与治疗后抗体滴度的降低强烈相关(Gresa-Arribas等，2014,Lancet Neurol 13(2):167-77；Dogan Onugoren等，2016,Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm.26；3(2):e207)。
[0090] IVIG在自体免疫障碍中的有益效果不是通过用抗独特型抗体结合和/或中和和/或阻断致病抗体来实现的。相反，在关于IVIG疗法的机制的许多开放性问题中，广泛接受的是IVIG主要通过经抑制性Fc-γ受体FcγIIB对抗体产生细胞的负反馈，通过T细胞活化的调节，经Fc部分对化学吸引物的外周耐受和释放的调控而起作用(Nimmerjahn&Ravetch 2008,Nature Review Immunology 8(1):34-47)。来自于人类临床试验的数据证实，Fc片段含有大多数抗炎活性(Schwab,Lux,Nimmerjahn 2015,Cell Rep 20；13(3):610-20)。沿着这条途径，IVIG不仅下调疾病特异性致病抗体，而且下调(这是不想要的并且可以使用本发明的方法来克服)人体中的所有有益抗体。因此，本发明的疗法提供了与现有技术方法相比具有较少副作用但具有相同或更好功效的疗法。
[0091] 本发明的令人吃惊的发现是本发明的结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架可以结合到患有所述与抗NMDAR1亚基抗体相关的疾病或病症和/或另外具有如上所述的至少一种临床症状或临床病症的患者中的大多数自体抗体。事实上，从不同患者分离的所述自体抗体的结合区表现出令人吃惊的相似性程度。例如，所有分离到的自体抗体的轻链的CDR2仅由3个氨基酸构成，并且在5/6序列以酸性氨基酸(D/E)为主。此外，重链的CDR 1以及CDR3也显示出令人吃惊的类似性：
[0092]
[0093]
[0094] 来自于许多不同患者的抗NMDAR1亚基自体抗体仍然可以被本发明的结合到抗体的结合区的同一抗体或抗体片段或非Ig支架结合。这是基于下述实验发现：来自于不同患者的单克隆抗体都结合到NMDA受体的氨基端结构域上的非常小的表位。事实上，仅仅一个氨基酸的突变将引起与NMDA受体的抗体结合完全丧失，并且预期这个氨基酸变化(N到Q)引起非常局部的结构变化而不是受体的三维结构的变化。因此，本发明的一种结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架或者所述抗体或抗体片段或非Ig支架的相对小的合并物可能能够阻断来自于不同患者的自体抗体。另一条证据是我们可以鉴定到针对所述NMDAR的未突变的人类抗体这一事实(Kreye等，2016,Brain)。这些抗体包含所谓的种系构型(也被称为“天然存在的抗体”)，即它们不仅在患者中，而且在每个人中由身体连续产生，并且因此也随机地存在于以前健康的人中。这些天然存在的抗体据认为主要是正面参与体内平衡、死细胞的移除，但是在NMDAR抗体的情况下，也可能对神经细胞有害，正如最近所显示的(Kreye等，2016,Brain)。由于正常(健康)遗传库(genetic repertoire)中天然存在的NMDAR抗体的序列码，数据表明对于有限数目的序列来说存在进化限制。这与上面提到的事实完全相符，即到目前为止从不同患者鉴定到的所有单克隆NMDAR抗体都依赖于受体的氨基端结构域中的这种小的表位。
[0095] 在特定实施方式中，患有与抗NMDAR1亚基抗体相关的疾病或病症并且在特定实施方式中还另外具有如上所述的至少一种临床症状或临床病症的患者或对象，按照在体液中具有带有结合区的抗NMDAR1抗体进行分层，其中所述抗NMDAR1抗体的结合区被包含在选自下述序列的序列中或由选自下述序列的序列构成：
[0096]
[0097]
[0098] 因此，需要使用本发明的结合到抗NMDAR1亚基抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架治疗的患者，可以通过在对象的体液样品中确定如上所定义的抗NMDR1抗体的存在，以便确定所述对象是否需要这种治疗来选择，其中所述对象患有如上所定义的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症。
[0099] 一个典型实例是抗NMDAR脑炎，这是一种主要影响年轻女性，但是也影响儿童和所有年龄的男性的严重脑炎(Dalmau等，2008.Lancet Neurol.7(12):1091-8)。高滴度NMDAR1抗体是该疾病的标志。症状通常包括上述名单中的几种(例如精神异常、运动障碍、癫痫发作、通气不足和需要重症监护室治疗)，但具有单独的癫痫发作、认知损伤或精神病的形式也可能出现。
[0100] 上面鉴定到的对象可能需要治疗，其中将本发明的所述抗体或抗体片段或非Ig支架给药到所述对象。在整个本说明书中，所述对象可以是人类或动物对象。
[0101] 因此，可能需要本发明的治疗的对象是在体液中具有NMDAR1抗体的对象。在另一个实施方式中，可能需要本发明的治疗的对象是在体液中具有NMDAR1抗体并且另外具有选自根据下述名单所述的临床症状/病症的至少一种临床症状或临床病症(括号中的ICD编号是指定义所述临床病症的WHO国际疾病分类)的对象：
[0102] -精神异常，包括抑郁(F32)、伴有精神病性症状的躁狂(F30.2)、焦虑(F06.4)、恐惧性焦虑(F40)、妄想(F22.0)、强迫症(F42)、器质性妄想症(F06.3)、紧张症(F06.1、F20.2)、急性多形性精神病(F23.0、F23.1)、解离症(F44)
[0103] -运动障碍，包括动作障碍/肌张力障碍(G24)、肌阵挛(G25.3)、震颤(G25.0、G25-1、G25-2)、抽搐(F95、G25.69)
[0104] -癫痫发作(G40)
[0105] -通气不足(R06.89)
[0106] -轻度认知损伤(F06.7)
[0107] -阿尔茨海默病性痴呆(F00)、血管性痴呆(F01)、其他疾病性痴呆(F02)[0108] -妊娠。
[0109] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗本发明的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被体内给药到需要这种治疗的所述对象。
[0110] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗本发明的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被静脉内给药到需要这种治疗的所述对象或直接给药到所述对象的CSF中。
[0111] 在本发明的另一个实施方式中，需要所述治疗的对象可以通过离体疗法来治疗。
[0112] 因此，本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被用于所述患者的离体疗法中。所述患者可以是人类或动物对象。
[0113] 因此，本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述对象在按照下文所述的方法测量时表现出存在抗NMDAR1抗体。具体来说，抗NMDAR1抗体的存在可以使用实施例1.2的测定法来确定。
[0114] 本发明的另一个主题是包含本发明的抗体或片段或支架的药物制剂。所述药物制剂可以包含一种或多种本发明的抗体或片段或支架。
[0115] 本发明的另一个主题是包含本发明的抗体或片段或非IgG支架的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选为即用型溶液。
[0116] 所述药物制剂可以血管内给药。所述药物制剂可以通过输注给药。
[0117] 在另一个实施方式中，本发明的另一个主题是本发明的药物制剂，其中所述药物制剂处于干燥状态或被冷冻干燥，以在使用之前重构。
[0118] 应该强调的是，本发明的药物制剂可以被全身性给药到患者，优选地通过输注或血管内给药来实现。在整个本说明书中，患者可以是人类或动物对象。
[0119] 本发明的主题内容是本发明的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在患者中治疗疾病，所述疾病与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架与另一种药剂例如化学治疗剂或免疫抑制剂组合使用。所述药剂可以选自硫唑嘌呤、环磷酰胺、利妥昔单抗、甲氨蝶呤、硼替佐米、皮质类固醇和吗替霉酚酸酯(mycophenolat mofetil)。
[0120] 本发明的主题内容是用于血浆置换(血浆置换术(plasmapheresis))或CSF置换(脑脊液置换术(liquorpheresis))的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是本发明的抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0121] 用于血液分离置换术(apheresis)(即从个体抽出血液，从所述血液移除组分，并将所述血液或贫化了一种或多种组分的血液返回到所述个体的过程)的方法和体外系统在本领域中是已知的(参见例如美国专利号4,708,713、5,258,503、5,386,734、6,409,696；和Hendrickson等，2015.J Clin Apher.doi:10.1002/jca.21407.[提前公布的电子版])。
[0122] 本发明的主题内容是本发明的用于血浆置换或CSF置换(脑脊液置换术)的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置是涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的柱。这些装置被描述在例如Fresenius Medical Care，“蛋白A吸附剂 (Protein-A-Adsorber )或对于IgE特异性血液分离置换术来说EP 2696895A1中。
[0123] 本发明的主题内容是本发明的抗体或抗体片段或非Ig支架的用途，其用于在患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病的患者的体液样品中或女性妊娠对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在。
[0124] 本发明的主题内容是一种在对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在以便确定所述对象是否需要本发明的治疗的方法，其中所述对象患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，并且所述方法包括：
[0125] -将从所述对象获得的体液样品与本发明的至少一种抗体或抗体片段或非Ig支架相接触
[0126] -确定所述样品中所述抗NMDAR1抗体的存在
[0127] -其中在所述样品中存在抗NMDAR1抗体的情况下，所述对象可能患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症并可能需要本发明的治疗。
[0128] 本发明的主题内容是一种在对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在以便确定所述对象是否需要本发明的治疗的方法，其中所述对象患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，并且所述方法包括：
[0129] -将从所述对象获得的体液样品与本发明的至少两种抗体或抗体片段或非Ig支架相接触
[0130] -确定所述样品中所述抗NMDAR1抗体的存在
[0131] -其中在所述样品中存在抗NMDAR1抗体的情况下，所述对象可能患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症并可能需要本发明的治疗。
[0132] 具体来说，体液样品中的NMDAR1抗体的特征在于具有结合区，所述结合区被包含在一个或多个序列中，其中所述一个或多个序列选自下述序列：
[0133] SEQ ID NO:1(003-109-HC)
[0134] VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYDFDAFDIWGQGTMVTVSS
[0135] SEQ ID NO:2(003-109-LC)
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[0155] SEQ ID NO:12(007-142-LC)
[0156] LTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTGVFGGGTKLTVL
[0157] SEQ ID NO:13(008-218-HC)
[0158] EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQVPGKGLEWVSGISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRASSWYAYGMDVWGQGTLVTV
[0159] SEQ ID NO:14(008-218-LC)
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[0161] 并且其中用于抗体或抗体片段或非Ig支架的所述结合区包含一个或几个下面提到的序列或由一个或几个下面提到的序列构成：
[0162]
[0163]
[0164] 作为测定法，ELISA(酶联免疫吸附测定法)可用于体液中人类NMDAR1自体抗体的定量测量。所述测定法利用包被在96孔板上的特异性针对人类NMDAR1自体抗体的抗体或抗体片段或非Ig支架。通过将包被的96孔板与阻断溶液(具有例如牛血清白蛋白和低浓度去污剂例如Tween 20的洗涤缓冲液)预温育，防止来自于所述样品的蛋白质与所述板的非特异性结合。将100μl标准品和样品吸取到孔中，样品中存在的NMDAR1抗体在温育期间(在室温下2.5小时或在4℃下过夜)通过固定化的抗体或抗体片段或非Ig支架被结合到所述孔。将所述孔用洗涤缓冲液(例如用磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤，添加稀释的生物素化的抗人类IgG抗体并在室温下温育1小时。在用洗涤缓冲液洗掉未结合的生物素化的抗体后，将稀释的HRP偶联的链亲和素吸取到所述孔并在室温下温育1小时。将所述孔再次用洗涤缓冲液洗涤，向所述孔添加底物溶液(例如四甲基-联苯胺)，产生的颜色与结合到所述抗体或抗体片段或非Ig支架的NMDAR1-IgG的量成比例。直接地或在添加终止化学产色反应的终止溶液后，在适合的波长下通过光度计测量颜色产生。
[0165] 体液样品可以选自全血、血浆、血清、脑脊液(CSF)、尿液、唾液和羊水。
[0166] 在特定实施方式中，体液样品可以选自血清和CSF。
[0168] 1)固相支持物，其具有NMDAR1结合性抗体或NMDAR1结合性抗体片段或NMDAR1结合性非Ig支架的固定化混合物
[0169] 2)洗涤缓冲液(瓶子或用于制备的粉剂)和稀释缓冲液
[0170] 3)用于确定标准曲线的重组人类NMDAR1抗体
[0171] 4)与标记物偶联的抗人类免疫球蛋白抗体
[0172] 5)在酶标记物的情况下：染色溶液和终止溶液。
[0173] 所述固相支持物可以根据用于测量的装置来选择。常规使用ELISA板例如96孔NUNC免疫吸附板。或者可以选自粒子例如珠子或小型化的板格式例如微流体芯片。
[0174] 用于ELISA的洗涤缓冲液和阻断溶液在本领域中是已知的。它们由含有低去污剂浓度和/或阻断ELISA板的非特异性位点的饱和蛋白质的缓冲盐水溶液构成。所述缓冲液可以选自磷酸盐缓冲盐水或TRIS缓冲盐水。常用去污剂是0.5％至10％范围内的Tween20。饱和蛋白质可以选自脱脂奶、牛血清白蛋白、血清或明胶。
[0175] 稀释缓冲液可以与洗涤缓冲液相同或仅由盐水缓冲溶液构成。
[0176] 所述抗人类免疫球蛋白抗体可以选自抗免疫球蛋白G、抗免疫球蛋白A、抗免疫球蛋白M、抗免疫球蛋白D和抗免疫球蛋白E，例如多克隆山羊抗人IgG、IgM、IgA(H+L)第二抗体(Life Technologies,Cat.#31128)。
[0177] 所述标记物可以是允许定量的报告物或与连接到报告物的高亲和性配偶体相互作用的小分子。实例是生物素-链亲和素系统。本领域中已知的报告物是酶例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶、荧光团或放射性同位素。
[0178] 使用所述酶作为标记物的标准ELISA试剂盒也将包含含有发色底物的染色溶液。对于酶HRP来说，底物可以选自TMB、DAB和ABTS。可以使用酸性终止溶液来终止酶活性，然后对标准品和样品中的光密度进行光度计测量，以便确定目标蛋白质或抗体的浓度。
[0179] 在本发明的范围内的其他实施方式如下所述：
[0180] 1)特异性结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗NMDAR1抗体的结合区被包含在一个或多个序列中，其中所述一个或多个序列选自下述序列：
[0181] SEQ ID NO:1(003-109-HC)
[0182] VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYDFDAFDIWGQGTMVTVSS
[0183] SEQ ID NO:2(003-109-LC)
[0184] QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTKVTVL
[0185] SEQ ID NO:3(003-102-HC)
[0186] QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGNTNYNPSLKSRVTVSVDKSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARDVSGGVNWFDPWGQGTLVTVSS
[0187] SEQ ID NO:4(003-102-LC)
[0188] NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVL
[0189] SEQ ID NO:5(007-168-HC)
[0190] VQLVQSGAEAKKPGESLKISCKASGYSFTTFWIGWVRQMPGSGLEWIGIIYPGDSDTRYSPSFQGHVTISADRSTSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSAVFDYWGQGTLVTVSS
[0191] SEQ ID NO:6(007-168-LC)
[0192] EIVMTQSPATLSVSPGGRATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPVRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPTSWTFGQGTKVEIK
[0193] SEQ ID NO:7(007-169-HC)
[0194] EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDYGDYYFDYWGQGTLVTVSS
[0195] SEQ ID NO:8(007-169-LC)
[0196] QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTGVFGEGTKLTVL
[0197] SEQ ID NO:9(007-124-HC)
[0198] EVQLVESGGGVGRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQVPGKGLEWVSGINWSGADTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTALYHCAREVGIAVTGYWFDPWGQGTLVTV
[0199] SEQ ID NO:10(007-124-LC)
[0200] SYELTQPPSVSVAPGQTARISCGGNHSESVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISRVEGGDEAEYYCQVWDSSSDHPGVVFGGGTKLTVL
[0201] SEQ ID NO:11(007-142-HC)
[0202] EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDYGDYYFDYWGQGTLVTVSS
[0203] SEQ ID NO:12(007-142-LC)
[0204] LTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTGVFGGGTKLTVL
[0205] SEQ ID NO:13(008-218-HC)
[0206] EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQVPGKGLEWVSGISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRASSWYAYGMDVWGQGTLVTV
[0207] SEQ ID NO:14(008-218-LC)
[0208] NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYDDNQRPSGVPNRFSGSIDSSSNSASLIISGLKTEDEADYYCQSTRVFGGGTKLTVL
[0209] 并且其中用于所述抗体或抗体片段或非Ig支架的所述结合区包含一个或几个下面提到的序列或由一个或几个下面提到的序列构成：
[0210]
[0211]
[0212] 2)权利要求1的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架是非IgG支架。
[0213] 3)权利要求1或2的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架、纤连蛋白支架、基于脂钙蛋白的支架、泛素支架、转铁蛋白支架、蛋白A支架、基于锚蛋白重复序列的支架、微型蛋白支架、优选为形成半胱氨酸结的微型蛋白支架、基于Fyn SH3结构域的支架、基于EGFR-A结构域的支架和基于Kunitz结构域的支架以及适体。
[0214] 4)权利要求3的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的非Ig支架，其中所述非Ig支架是寡核苷酸适体。
[0215] 5)权利要求1至4任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架对所述抗NMDAR1抗体的结合区表现出亲和性，使得与所述抗NMDAR1抗体的结合区的解离常数KD低于10-7M，优选10-8M，优选的KD低于-9 -1010 M，最优选地低于10 M。
[0216] 6)权利要求1至5任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架中和所述抗NMDAR1抗体。
[0217] 7)权利要求1至6任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是单特异性抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0218] 8)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关。
[0219] 9)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在需要治疗的对象中治疗疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关或由抗NMDAR1抗体引起，如果所述对象表现出在体液中存在抗NMDAR1抗体并表现出选自根据下述名单所述的临床症状/病症的至少一种临床症状或临床病症(括号中的ICD编号是指定义所述临床病症的WHO国际疾病分类)：
[0220] -精神异常，包括抑郁(F32)、伴有精神病性症状的躁狂(F30.2)、焦虑(F06.4)、恐惧性焦虑(F40)、妄想(F22.0)、强迫症(F42)、器质性妄想症(F06.3)、紧张症(F06.1、F20.2)、急性多形性精神病(F23.0、F23.1)、解离症(F44)
[0221] -运动障碍，包括动作障碍/肌张力障碍(G24)、肌阵挛(G25.3)、震颤(G25.0、G25-1、G25-2)、抽搐(F95、G25.69)
[0222] -癫痫发作(G40)
[0223] -通气不足(R06.89)
[0224] -轻度认知损伤(F06.7)
[0225] -阿尔茨海默病性痴呆(F00)、血管性痴呆(F01)、其他疾病性痴呆(F02)[0226] -妊娠。
[0227] 10)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8或9的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被体内给药到有需要的所述对象。
[0228] 11)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至10任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被静脉内给药到有需要的所述对象。
[0229] 12)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至11任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架被用于有需要的所述对象的离体治疗中。
[0230] 13)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至12任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述对象在按照实施例1.2的方法测量时表现出存在抗NMDAR1抗体。
[0231] 14)权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架，其用于在对象中治疗权利要求8至13任一项的疾病或病症，所述疾病或病症与抗NMDAR1抗体相关，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架与化学治疗剂或免疫抑制剂组合使用。
[0232] 15)一种治疗或预防权利要求8至14任一项的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或医学病症的方法，其包括向有需要的对象给药有效量的权利要求1至7任一项的结合到抗NMDAR1抗体的结合区的抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0233] 16)权利要求1至7任一项的化合物在制造用于治疗或预防权利要求8至14任一项的与抗NMDAR1抗体相关的疾病或医学病症的药物中的用途。
[0234] 17)用于血浆置换或CSF置换(脑脊液置换术)的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架。
[0235] 18)权利要求17的用于血浆置换或CSF置换(脑脊液置换术)的涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置，其中所述涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的装置是涂覆有抗体或抗体片段或非Ig支架的柱。
[0236] 19)权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架的用途，其用于在患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症的对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在。
[0237] 20)一种在对象的体液样品中确定抗NMDAR1抗体的存在以便确定所述对象是否需要治疗的方法，其中所述对象患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症，并且所述方法包括：
[0238] ●将从所述对象获得的体液样品与至少一种权利要求1至7任一项的抗体或抗体片段或非Ig支架相接触
[0239] ●确定所述体液样品中所述抗NMDAR1抗体的存在
[0240] ●其中在所述样品中存在抗NMDAR1抗体的情况下，所述对象可能患有与抗NMDAR1抗体相关的疾病或病症并可能需要治疗。
[0241] 21)用于在可能需要治疗的对象的样品中确定抗NMDAR1抗体的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0242] 1)固相支持物，其具有NMDAR1结合性抗体或NMDAR1结合性抗体片段或NMDAR1结合性非Ig支架的固定化混合物
[0243] 2)用于确定标准曲线的重组人类NMDAR抗体
[0244] 3)与可定量标记物偶联的抗人类免疫球蛋白抗体。实施例
[0245] 实施例1
[0246] 1.1单克隆人类重组NMDAR1抗体的产生
[0247] (基于Tiller等，2009,J Immunol Methods 350(1-2):183-93的技术程序)[0248] 从脑脊液样品分离单个人血浆细胞和记忆性B细胞(图3-4)
[0249] 在签署符合Charité伦理委员会批准的知情同意书后，在一般常规检查的情形下收集脑脊液样品(CSF)。将CSF样品以400x g离心10分钟。然后倾析掉上清液，将细胞悬浮在500μl冷冻介质(45％RPMI，45％FCS，10％DMSO)中，储存在-80℃直至进一步使用。对于荧光活化细胞分选(FACS)来说，将冷冻的细胞融化，稀释，并在冰上用抗体染色，如图3-4中所示。细胞分选在FACSAria II(BD Biosciences)上，在含有4μl/孔的冰冷裂解溶液的96孔PCR板(VWR)中进行，所述裂解溶液为含有10mM DTT(Invitrogen)、8U RNAsin(Promega)的
0.5x磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在分选后，将板用密封箔(VWR)直接密封并在干冰上立即冷冻，然后储存在-80℃。
0.5x磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在分选后，将板用密封箔(VWR)直接密封并在干冰上立即冷冻，然后储存在-80℃。
[0250] 单细胞反转录PCR和Ig基因的扩增
[0251] 反转录(RT)在原始的96孔分选板中，以每个样品14μl的总体积进行。向来自于每种单细胞的总RNA，向每个孔添加150ng随机六聚体引物p(dN)6(Roche)、0.5μl的25mM每种核苷酸dNTP的混合物(Invitrogen)、1μl 0.1M DTT(Invitrogen)、0.5μl 10％Igepal CA-630(Sigma)、14U RNAsin(Promega)和50U III反转录酶(Invitrogen)。热循环条件是42℃10min，25℃10min，50℃60min和94℃5min。将cDNA储存在-20℃。
[0252] 对于Ig V基因扩增来说，分别对于IgH、Igκ和Igλ，将分两步进行的巢式PCR策略用于每种单细胞cDNA。所有PCR反应在96孔板(VWR)中，以每孔40μl的总体积进行，每个孔含有320nM总引物或引物混合物、250nM每种dNTP(Invitrogen)和0.9U Taq DNA聚合酶(Qiagen)。作为模板，对于第一轮PCR来说使用2.0μl cDNA，对于巢式反应来说使用3.5μl未纯化的第一轮PCR产物。每轮PCR如下进行：一开始94℃15min，随后是94℃30秒、58℃(IgH/Igκ)或60℃(Igλ)30秒和72℃55秒(第一轮PCR)或45秒(第二轮PCR)共50个循环，最后是72℃10min。
[0253] Ig基因序列分析
[0254] 如Tiller等，2009.J Immunol Methods 350(1-2):183-93中所概述的，使用用于IgH、Igκbzw.、Igλ的相应反向引物对第二轮PCR产物进行测序。通过与GenBank的IgBLAST比较(Ye J等，2013.Nucleic Acids Res.41)分析序列，以鉴定具有最高同一性的种系V(D)J基因区段。如IgBLAST中指示的，通过对位于构架区(FWR)3之后直至所有JH区段中的保守色氨酸-甘氨酸基序或直至JL区段中的保守苯丙氨酸-甘氨酸基序的氨基酸残基进行计数，来确定IgH互补决定区(CDR)3的长度。与来自于克隆的Ig基因的序列相反，第二轮PCR产物的序列不太可能显示出由Taq聚合酶引入的突变，并且只有在PCR期间早期就引入突变的情况下才会如此。来自于没有体细胞突变的未接触过抗原的B细胞的Ig基因序列的分析，允许通过与公布的种系序列进行比较来检测Taq介导的错误掺入的核苷酸。
[0255] 表达载体克隆
[0256] 在克隆之前，将所有PCR产物使用Qia-Quick 96PCR纯化试剂盒(Qiagen)和QIAvac96进行纯化。将样品用50μl无核酸酶的水(Eppendorf)洗脱到96孔板中。在同一块板中，在35–40μl的总体积中用相应的限制性酶AgeI、SalI和XhoI(都来自于NEB)进行消化，将消化的PCR产物纯化，然后连接到人类Igγ1、Igκ和Igλ表达载体中，所述人类Igγ1、Igκ和Igλ表达载体含有Ig基因信号肽序列(GenBank登记号DQ407610)和在人类Igγ1、Igκ或Igλ恒定区上游的多克隆位点。转录在人类巨细胞病毒(HCMV)启动子的影响之下，并且可以基于对氨苄青霉素的抗性来选择克隆。在10μl的总体积中，使用1U T4连接酶(Invitrogen)、7.5μl消化并纯化的PCR产物和25ng线性化载体来进行连接。在96孔板中，在42℃下，用3μl连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH10B细菌的感受态细胞(Clontech)。使用5′Absense作为正向引物并分别使用3′IgGinternal、3′Cκ494或3′Cλ作为反向引物，通过PCR来筛选菌落。
对预期大小(对于Igγ1来说650bp，对于Igκ来说700bp，对于Igλ来说590bp)的PCR产物进行测序，以确认与原始PCR产物的一致性。(Tiller等，2009,J Immunol Methods 350(1-2):
183-93)。由于使用了易错Taq聚合酶，使用QIAprep Spin柱(Qiagen)，从在含有75μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的Terrific Broth(Difco Laboratories)中在37℃生长16h的3ml细菌培养物近似质粒DNA。在用75μl EB洗脱缓冲液(Qiagen)洗脱后，从1.5ml细菌培养物回收到平均35μg质粒DNA。
对预期大小(对于Igγ1来说650bp，对于Igκ来说700bp，对于Igλ来说590bp)的PCR产物进行测序，以确认与原始PCR产物的一致性。(Tiller等，2009,J Immunol Methods 350(1-2):
183-93)。由于使用了易错Taq聚合酶，使用QIAprep Spin柱(Qiagen)，从在含有75μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的Terrific Broth(Difco Laboratories)中在37℃生长16h的3ml细菌培养物近似质粒DNA。在用75μl EB洗脱缓冲液(Qiagen)洗脱后，从1.5ml细菌培养物回收到平均35μg质粒DNA。
[0257] 重组抗体生产
[0258] 将人胚肾(HEK)293(ATCC，No.CRL-1573)或293T(ATCC，No.CRL-11268)细胞在标准条件下培养在150mm板(Falcon，Becton Dickinson)中增补有10％热失活的超低IgG胎牛血清(FCS)(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素G和0.25μg两性霉素(都来自于GibcoBRL)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；GibcoBRL)中。
[0259] 指数生长的HEK293细胞的瞬时转染在80％细胞汇合时通过磷酸钙沉淀来进行。将等量(各12.5–20μg)的IgH和对应的IgL链表达载体DNA和0.7mM氯喹(Sigma)在1ml无菌水中混合，并逐滴添加2.5M CaCl2至浓度为250mM。将等量的2×HEPES缓冲盐水(50mM HEPES，10mM KCl，12mM右旋糖，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4-7H2O，pH 7.05)与所述钙-DNA溶液在缓慢的涡旋振荡下混合，并在室温温育10min，以允许沉淀物形成。将沉淀混合物均匀分配到培养皿。8–12h后，将细胞用10ml无血清DMEM洗涤，并在25ml增补有1％Nutridoma-SP(Roche)的DMEM中培养6d，然后收获上清液并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组抗体的生产。
[0260] 重组抗体纯化
[0261] 通过以800×g离心10min除去细胞碎片，向培养上清液添加0.05％叠氮钠并储存在4℃。使用蛋白G珠子(GE Healthcare)，按照制造商的说明书纯化重组抗体。简单来说，将25ml细胞培养上清液与25μl蛋白G珠子在4℃和旋转下温育至少14h。在以800×g离心10min后除去上清液，并将珠子转移到用PBS平衡的层析旋转柱(BioRad)。在用1ml PBS洗涤两轮后，将抗体用0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱在3-4个级分(各200μl)中。洗脱物被收集在含有20μl 1M Tris(pH 8.0)和0.5％叠氮钠的管中。通过ELISA确定重组抗体浓度，所有步骤在环境温度下进行。
[0262] 1.2.抗体与人类NMDAR1蛋白的结合和致病效应的验证
[0263] 转染的HEK293细胞(图5)
[0264] 人类促离子型谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸1受体(GRIN1)的cDNA由Prof.Dr.Wanker(MDC，Berlin)友情提供并被克隆在pBudCE4.1(Life Technologies)中。将NR1DNA(1μg)与3μg PEI和100μl 150mM NaCl混合，涡旋振荡并温育10min，瞬时转染HEK293细胞。两天后，将HEK293细胞在盖玻片上用甲醇在-20℃固定4min。此外，使用用不同NMDAR克隆、富含亮氨酸胶质瘤失活基因1(LGI1)、接触蛋白相关蛋白2(Caspr2)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异 唑丙酸(AMPA)受体和γ-氨基丁酸b(GABAb)受体转染的HEK293细胞(Autoimmune-Enzephalitis-Mosaik 1,Euroimmun,Lübeck,Germany)。对于使用单克隆抗体和对照抗体的染色来说，将细胞在PBS中洗涤，与含有2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的5％正常山羊血清预温育，并从细胞培养上清液的1:2稀释液开始在4℃下与抗体温育过夜。使用荧光标记的抗人IgG第二抗体进行可视化。将切片在PBS中洗涤，并将盖玻片用Immu-Mount(ThermoScientific)固定。转染的细胞的双重标记使用商品化抗体单克隆小鼠和多克隆兔抗NR1抗体(1:100，Synaptic Systems)来进行(图5)，并鉴定反应性克隆。
[0265] 鉴定到下述反应性克隆(HC＝重链；LC＝轻链；粗体＝相应链的抗原结合区(CDR1-3))：Seq.-ID 1–14。
[0266] 脑切片(图6)
[0267] 使用聚甲醛固定的小鼠和大鼠脑切片。将组织在含有0.1％TritonX-100的PBS中通透化20min，并在10％正常山羊血清中阻断30min。将含有单克隆人类重组抗体或对照抗体的转染的HEK293细胞的培养上清液1:2至1:200稀释，并将切片在4℃温育过夜。使用荧光标记的抗人IgG第二抗体进行可视化。将切片在PBS中洗涤，并将盖玻片用Immu-Mount(ThermoScientific)固定。NR1反应性克隆的染色模式与小鼠海马中NMDAR的已知解剖学分布一致(图6)。
[0268] NMDAR阳性突触簇的下调
[0269] 将原代海马神经元在从小鼠脑切下后进行培养。将处于胚胎第16天的海马在增补有10％胎牛血清、100IE胰岛素/l、0.5mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素、44mM葡萄糖和10mM HEPES的MEM中解离。在离心后，将细胞重悬浮在增补有B27、0.5mM谷氨酰胺、100U/ml
4
青霉素/链霉素和25μM谷氨酸的无血清神经基础培养基中，并将8x10 个细胞/孔铺在用聚L-赖氨酸/胶原蛋白(所有成分都来自于Gibco/BRL)预包被的盖玻片上。细胞在第14天在体外用于免疫细胞化学，以允许功能性突触的完全成熟。
4
青霉素/链霉素和25μM谷氨酸的无血清神经基础培养基中，并将8x10 个细胞/孔铺在用聚L-赖氨酸/胶原蛋白(所有成分都来自于Gibco/BRL)预包被的盖玻片上。细胞在第14天在体外用于免疫细胞化学，以允许功能性突触的完全成熟。
[0270] 对于NMDAR阳性突触簇的定量来说，将原代神经元用单克隆人类重组抗NMDAR1抗体或对照抗体处理18小时(图7)。在与致病和对照抗体温育后，将细胞固定并使用商品化NMDAR抗体(Synaptic Systems)染色NMDAR1的非内化级分。在每个单独实验中，使用每种条件40张100μm近端树突长度的40x放大倍数的图像来确定簇。将图像转变成灰度级。颜色倒转的和阈值化的图像通过Scion Image软件(Scion，现在的http://en.bio-soft.net/)，根据强度和尺寸判据进行分析。对于涉及相似细胞数目的区域的处理组之间的精确比较来说，对细胞进行计数。NMDAR簇被单克隆人类NMDAR抗体的下调(图7)与文献中使用NMDAR脑炎患者的全CSF的数据可比。
[0271] 表位分析
[0272] 如前所述，使用Stratagene QuikChange诱变试剂盒，按照制造商的说明书将点突变N368Q引入到NR1构建物中，并将所述突变体瞬时转染到HEK293细胞中(Doss等，2014)。如上所述进行表达天然和突变的NR1构建物的HEK293细胞的染色。对于所有单克隆人类NMDAR1抗体来说，与所述突变体的结合被消除(图8)。
[0273] 实施例2
[0274] 针对单克隆人类重组NMDAR1抗体的抗体的产生
[0275] 如Frenzel等，2014.Methods Mol Biol.1060:215-43中所述，从患者的PBMC构建scFv文库。如Hust等，2014Methods Mol Biol.1101:305-20中所述，在固定化的人类单克隆抗NMDAR1抗体上进行超过三轮淘选，并通过在固定化抗原上的ELISA和myc标签检测进行筛选。
[0276] 实施例3
[0277] 针对单克隆人类重组NMDAR1抗体的适体的产生
[0278] 适体的产生按照Jones等，2006.Antimicrob.Agents Chemother.50(9):3019-3027来进行。使用SELEX(Ellington和Szostak 1990.Nature.346(6287):818-22；Tuerk和Gold 1990.Science.249(4968):505-10)来选择识别人类单克隆抗NMDAR1抗体的适体，所述人类单克隆抗NMDAR1抗体通过N-端连接物或通过蛋白A-琼脂糖凝胶附连到溴化氰(CNBr)活化的琼脂糖凝胶。对多样性为1014的包含侧翼带有两个引物结合位点的40-nt随机区域的DNA文库进行体外转录，得到相应的RNA文库。将RNA与选择基质温育，并在通过用结合缓冲液洗涤以除去未结合的序列之后，将剩余的物质洗脱，反转录，并作为输入DNA用于下一个转录和新的选择循环。在6个选择循环后富集结合的物质，反转录，克隆并测序。与来自于第6个循环的富集合并物相比，在柱测定法中对抗NMDAR1抗体-琼脂糖凝胶表现出更好的结合性能的单克隆，被选择用于亲和性确定。
[0279] 实施例4
[0280] 用于确定所述抗体和适体对单克隆人类重组NMDAR1抗体的结合亲和性的测定法[0281] 所选的抗体或适体的亲和性通过表面等离子体共振(SPR)分析来测量(Jones等，2006.Antimicrob.Agents Chemother.50(9):3019-3027)。
[0282] 更详细来说，使用BiacoreTM X平台(GE Healthcare)进行所选适体的结合分析。因此，如前所述(Schütze T等，2011,PLoS ONE 6(12):e29604)利用胺偶联将单克隆NMDAR抗体固定化在蛋白A传感器芯片(GE Healthcare)上。结合分析在25℃下使用结合缓冲液以
30μl/min的流速来进行。在注射之前，将合成的寡核苷酸在94℃变性3min，并在结合缓冲液中重新折叠。将30μl的在0.1至2.0μM范围内的适体溶液注射到流动池中。在每次适体注射后，通过注射2x10μl 0.5mM NaCl/0.5mM MgCl2使芯片表面再生。适体-链亲和素复合物的结合和解离速率和常数使用BIAevaluation软件(Biacore)来确定。
30μl/min的流速来进行。在注射之前，将合成的寡核苷酸在94℃变性3min，并在结合缓冲液中重新折叠。将30μl的在0.1至2.0μM范围内的适体溶液注射到流动池中。在每次适体注射后，通过注射2x10μl 0.5mM NaCl/0.5mM MgCl2使芯片表面再生。适体-链亲和素复合物的结合和解离速率和常数使用BIAevaluation软件(Biacore)来确定。
[0283] 实施例5
[0284] 5.1.单克隆人类重组NMDAR1抗体与表达NMDAR1的HEK293细胞的结合的抑制(“中和”)
[0285] 如上所述将HEK293细胞用人类促离子型谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸1受体(Gene ID：GRIN1)的cDNA瞬时转染，并在盖玻片上生长用于免疫细胞化学。将特异性适体或Ig或非Ig支架与单克隆抗NMDAR1抗体以适体相对于抗NMDR1抗体2-20倍的摩尔过量在室温下预温育30min。对照仅含有单克隆抗体、非抗NMDAR1对照抗体或适体。将细胞在PBS中洗涤，与含有2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的5％正常山羊血清预温育，并与适体-抗体混合物或对照抗体在4℃下温育过夜。使用荧光标记的抗人IgG第二抗体进行可视化。将盖玻片在PBS中洗涤并用Immu-Mount(ThermoScientific)固定。通过荧光信号降低到基线水平，即与非NMDAR结合性对照抗体温育的细胞的荧光强度，来确定抗体结合的中和。
[0286] 5.2.单克隆人类重组NMDAR1抗体与表达NMDAR1的脑切片的结合的抑制[0287] 使用聚甲醛固定的小鼠和大鼠脑切片。将组织在含有0.1％Triton X-100的PBS中通透化20min，并在10％正常山羊血清中阻断30min。将特异性适体或阻断性Ig或非Ig支架与抗NMDAR1单克隆抗体以适体相对于抗NMDR1抗体2-20倍的摩尔过量在室温下预温育30min。对照仅含有单克隆抗体、非NMDAR对照抗体或适体。将切片在4℃温育过夜。使用荧光标记的抗人IgG第二抗体进行可视化。将切片在PBS中洗涤并将盖玻片用Immu-Mount(ThermoScientific)固定。将染色模式与小鼠海马中NMDAR的已知解剖学分布进行比较。通过荧光信号降低到基线水平，即与非NMDAR结合性对照抗体温育的切片的荧光强度，来确定抗体结合的中和(图11)。抗NMDAR单克隆抗体与适体的预温育显著降低了抗NMDAR单克隆抗体与海马的齿状回内的NMDAR的结合。
[0288] 5.3.自体抗体介导的NMDAR阳性突触后簇的下调的抑制
[0289] 如上所述对原代海马神经元进行培养并制备用于免疫细胞化学。在第14天在体外使用细胞，以允许功能性突触的完全成熟。原代神经元上的NMDAR阳性突触簇如前所述进行定量，比较由单克隆人类重组抗NMDAR1抗体与预温育的适体-抗体混合物(摩尔比为20:1)产生的染色。
[0290] 5.4.NMDAR1阳性患者血清抗体与表达NMDAR1的HEK293细胞的结合的抑制[0291] 如上所述将HEK293细胞用人类促离子型谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸1受体(Gene ID：GRIN1)的cDNA瞬时转染，并在盖玻片上生长用于免疫细胞化学。将特异性适体与患者血清在室温下预温育30min。对照仅含有对照抗体或患者血清。将细胞在PBS中洗涤，与含有2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的5％正常山羊血清预温育，并与样品混合物或对照在4℃下温育过夜。使用荧光标记的抗人IgG或IgA第二抗体进行可视化。将盖玻片在PBS中洗涤并将盖玻片用Immu-Mount(ThermoScientific)固定。记录细胞的荧光强度。通过含有适体的样品与仅含患者血清的样品相比显著的信号降低，来确定抑制。
[0292] 实施例6：患者来源的NMDAR自体抗体的序列分析
[0293] 如实施例1中所述分离患者来源的NMDAR自体抗体。通过与GenBank的IgBLAST比较来分析序列(Ye J等，2013.Nucleic Acids Res.41)。鉴定CDR，将其比对，并分析CDR长度、CDR残基的性质和序列同源性(图9)。CDR序列比对揭示出源自于不同患者的人类NMDAR抗体的功能同源性。
[0294] 实施例7：未突变的人类NMDAR自体抗体的鉴定(Kreye等，2016，Brain)[0295] 对于每个IgG序列来说，与注释的种系序列以及互补决定区的长度(Kabat和Wu，1991；Kabat等，1983)进行比较，来计数免疫球蛋白基因中体细胞超变的数目。鉴定到针对NMDAR的未突变的人类抗体(图10)。这些抗体包含所谓的种系构型(也被称为“天然存在的抗体”)，即它们不仅在患者中，而且在每个人中由身体连续产生，并且因此也随机地存在于以前健康的人中。由于在正常(健康)遗传库中天然存在的NMDAR抗体的序列码，数据表明对于有限数目的序列来说存在进化限制，这可能与较大的人数相关。
附图说明
附图说明
[0296] 图1a：
[0297] 抗体格式的图示说明——Fv和scFv变体
[0298] 图1b：
[0299] 抗体格式的图示说明——异源融合和双功能抗体
[0300] 图1c：
[0301] 抗体格式的图示说明——二价抗体和双特异性抗体
[0302] 图2：
[0303] 几轮的选择和扩增产生高度特异性和亲和性的适体
[0304] 图3：
[0305] 第一单克隆重组NMDAR1自体抗体
[0306] 技术概述
[0307] 图4：
[0308] 第一单克隆重组NMDAR1自体抗体
[0309] FACS分选策略
[0310] 图5：
[0311] 第一单克隆重组NMDA1R自体抗体
[0312] NR1转染的HEK293细胞的染色(诊断性常规测定法)确认了NMDAR特异性结合。(A)hNR1＝人类单克隆抗NR1抗体，(B)msNR1＝商品化小鼠抗NR1抗体，(C)合并的图像证实了完全的染色重叠。
[0313] 图6：
[0314] 第一单克隆重组NMDAR自体抗体
[0315] 小鼠脑切片上海马的特异性染色。
[0316] 图7：
[0317] 第一单克隆重组NMDAR自体抗体
[0318] 海马原代神经元中的NMDAR簇下调。
[0319] 图8：
[0320] 单克隆人类NMDAR1抗体的表位分析
[0321] 将HEK293细胞用野生型NR1或带有突变N368Q的构建物转染。正如对克隆007-168所示例性显示的，所有人类单克隆NMDAR1抗体强烈地识别野生型NR1(A)，但突变体的染色被消除(B)。
[0322] 图9：
[0323] 人类单克隆NMDAR1抗体的CDR序列比较
[0324] 来自于不同患者的人类NMDAR抗体的CDR序列比对揭示出功能同源性。序列注释：*在6/6序列中一致；+在5/6序列中一致或功能相似(A)。交叉序列相似性。L CDR2(右)：仅仅3个残基，短＝低空间自由度(在6/6中)；主要为酸性残基(用粗体标注(D，E)，在5/6中)。H CDR1(左)：相近的长度＝8或9个残基(在6/6中)；主要为芳香族残基(用粗体标注(F，Y，W；在5/6中)；按照同源性分组(B)。源自于不同患者的NMDAR抗体显示出高度同源性。003-109与
007-169的CDR序列的比较。在L CDR1中一致；在L CDR2、L CDR3和H CDR1中同源；在H CDR2和H CDR3中具有相似的酸性特点(C)。
007-169的CDR序列的比较。在L CDR1中一致；在L CDR2、L CDR3和H CDR1中同源；在H CDR2和H CDR3中具有相似的酸性特点(C)。
[0325] 图10:
[0326] 重组人类单克隆NMDAR抗体中的体细胞超变的数目
[0327] 对来自于脑炎患者的脑脊液中的抗体分泌细胞的每种产生的抗体来说，将Ig重链(IGH)以及相应的Igκ(IGK)或λ(IGL)轻链中的V基因区段的体细胞超变(SHM)的数目作图。NR1反应性抗体(暗点)显示出在IGHV基因区段中平均4.9个SHM并且在IGKV/IGLV基因区段中平均4.1个SHM，这在其他(非NR1)抗体中少得多。重要的是，一些NR1抗体不具有单个超变，因此反映出天然存在的抗体。
[0328] 图11：
[0329] 适体降低单克隆人类NMDAR抗体与小鼠脑切片的结合。
[0330] 单克隆NMDAR抗体强烈结合到鼠类海马中表达NMDAR的区域(星号标出了海马的齿状回，其显示出最高的NMDAR蛋白表达)(A)。同一抗体与富集的适体合并物的预温育导致抗体与小鼠脑的结合的显著降低(B)。
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