首页 / 专利库 / 心理学与精神病学 / 精神病学 / 精神障碍 / 新型VISTA-IG构建体和VISTA-IG用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途

新型VISTA-IG构建体和VISTA-IG用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途

阅读:625发布:2021-07-29

专利汇可以提供新型VISTA-IG构建体和VISTA-IG用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含调节性T细胞蛋白VISTA(T细胞活化的含V域免疫球蛋白 抑制剂 (PD-L3)和免疫球蛋白(Ig),优选还包含介于VISTA与Ig Fc多肽之间的柔性接头的融合蛋白。本发明还提供了VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA缀合物(例如,VISTA-Ig)和VISTA拮抗剂用于 治疗 自身免疫性、过敏性和炎性病症,尤其是狼疮、多发性硬化、 银 屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、炎性肠病和1型或2型糖尿病的用途。,下面是新型VISTA-IG构建体和VISTA-IG用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途专利的具体信息内容。

1.一种分离的或重组的VISTA-Ig融合蛋白,其包含(i)至少一个多肽,所述多肽包含至少80%的与人或鼠VISTA的胞外域或为至少50个基酸的其片段的序列同一性,(ii)至少一个包含至少5个氨基酸的接头肽,和(iii)至少一个Ig蛋白,优选地Ig Fc区或其片段或变体,其中所述肽接头介于VISTA多肽(i)与Ig蛋白之间,并且其中所得的VISTA-Ig融合蛋白相较于缺乏所述接头的另外的相同的融合蛋白在体内引发更强效的免疫抑制活性。
2.一种分离的VISTA融合蛋白,其包含至少一个多肽,所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、
16–25、36、37、68、69、72或73或75中的VISTA多肽序列的胞外域或包含至少50个氨基酸的其片段具有至少约80%序列同一性,和(ii)至少一个包含至少5个氨基酸的接头,和(iii)至少一个Ig Fc蛋白或其片段,其中所述接头介于VISTA多肽与Ig Fc蛋白之间,并且所得的VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在接头的另外的相同融合蛋白在体内引发更强效的免疫抑制活性。
3.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽(i)包含至少一个与人或鼠VISTA的胞外域或为至少50个氨基酸的其片段具有至少90%序列同一性的多肽。
4.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)包含至少95%的与人或鼠VISTA的胞外域或为至少50个氨基酸的其片段的序列同一性。
5.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少100个氨基酸的其片段具有至少
90%序列同一性。
6.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少50个氨基酸的其片段具有至少
90%序列同一性。
7.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少200个氨基酸的其片段具有至少
90%序列同一性。
8.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少250个氨基酸的其片段具有至少
90%序列同一性。
9.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少250-300个氨基酸的其片段具有至少90%序列同一性。
10.根据权利要求1或2所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述多肽包含至少一个多肽(i),所述多肽(i)与人或鼠VISTA的整个胞外域或为至少310或311个氨基酸的其片段具有至少90%序列同一性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区或其片段或变体。
12.根据权利要求11所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个IgG1Fc区或其片段或变体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个调节(增强或减弱)补体结合和/或FcR结合的修饰。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个减弱或消除FcR结合的修饰。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个增强FcR结合的修饰。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个减弱或消除补体结合的修饰。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个增强补体结合的修饰。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个调节(增加、减少或改变)糖基化或效应子功能、或减弱或消除FcR结合的修饰。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
4个甘氨酸残基的接头。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
5个甘氨酸残基的接头。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
6个甘氨酸残基的接头。
22.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
7个甘氨酸残基的接头。
23.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
8个甘氨酸残基的接头。
24.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
9个甘氨酸残基的接头。
25.根据权利要求1-18中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
10、11、12、13、14或15个甘氨酸残基的接头。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的VISTA-If融合蛋白,其含有至少一个Fc区,所述Fc区包含一个或多个减弱或消除FcR结合的修饰
27.根据权利要求1-26中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基的接头。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的接头。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其含有至少一个包含至少约25、30、35、40、45或50个氨基酸残基的接头。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少2、3或4个多肽,所述多肽各自与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或包含至少
50、100、150、200、250或300个基酸的其片段具有至少约80%序列同一性。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少2、3或4个多肽,所述多肽各自与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或包含至少
50、100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少约90%序列同一性。
32.根据权利要求1-29中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少2、3或4个多肽,所述多肽各自与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或包含至少
50、100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少约95%序列同一性。
33.根据权利要求1-29中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少2、3或4个多肽,所述多肽各自与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或包含至少
100个氨基酸的其片段具有至少约90%序列同一性。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少30%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少40%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少50%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
37.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少60%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
38.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少70%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
39.根据权利要求1-33中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个接头,其中至少90%的所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个人或鼠Fc区。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中包含至少一个人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区或鼠IgG2a或IgG2b恒定区。
42.根据权利要求1-40中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个人IgG1或IgG3Fc区。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其包含至少一个经突变以调节(增加或减少)或改变糖基化、FcR结合、补体结合或效应子功能的Fc区。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少30%的免疫抑制活性。
45.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少40%的免疫抑制活性。
46.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少50%的免疫抑制活性。
47.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少60%的免疫抑制活性。
48.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少70%的免疫抑制活性。
49.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少80%的免疫抑制活性。
50.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少100%的免疫抑制活性。
51.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少1.1-1.5倍的免疫抑制活性。
52.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少1.0-2.0倍的免疫抑制活性。
53.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少2.0-3.0倍的免疫抑制活性。
54.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少3.0-4.0倍的免疫抑制活性。
55.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少4.0-5.0倍的免疫抑制活性。
56.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少5.0-6.0倍的免疫抑制活性。
57.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少6.0-7.0倍的免疫抑制活性。
58.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少7.0-8.0倍的免疫抑制活性。
59.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少8.0-9.0倍的免疫抑制活性。
60.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少9.0-10.0倍的免疫抑制活性。
61.根据权利要求1-43中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同VISTA-Ig融合蛋白,在检测T细胞增殖的测定中显示强至少10倍的免疫抑制活性。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少一个VISTA多肽,所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列或包含至少50、75、100、125、
150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的片段具有至少约90-5%序列同一性。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少一个IgG、IgG1、IgG2、IgG2a、IgM、IgE或IgA。
64.根据权利要求1-62中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少一个包含人IgG1的恒定区和铰链区的Ig蛋白。
65.根据权利要求1-61中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少一个包含氨基酸残基32–190的VISTA的胞外域或包含氨基酸16–194的VISTA的胞外IgV结构域。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少2个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段以及至少2个拷贝的VISTA蛋白和IgG1Fc或非FcR结合IgG1。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少3、4、5、6、7、8或更多个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段以及至少一个IgG1或IgG2a。
68.根据权利要求1-66中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少3或4个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段以及至少一个Fc或非FcR结合IgG1。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含至少2个拷贝的VISTA蛋白或其片段,其各自与包含SEQ ID NO:2、4或25的多肽序列的胞外域或包含至少50、75、
100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段具有约90、95、96、97、98或
99%序列同一性。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的VISTA-Ig蛋白,其包含VISTA的连接于寡聚化结构域的N末端的至少一个胞外域或片段。
71.根据权利要求70所述的VISTA-Ig蛋白,其中所述寡聚化结构域为GCN4、COMP、SNARE、CMP、MAT、含1个NLRC的LLR、结合NOD2核苷酸的NLRC2、含1个NLRC的LRR、结合NOD2核苷酸的NLRC2、或PSORAS1。
72.一种重组细胞,其表达根据权利要求1-71中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白。
73.根据权利要求72所述的细胞,其为酵母、细菌、真菌、昆虫、禽类、爪蟾或哺乳动物细胞。
74.根据权利要求72所述的细胞,其额外地表达PD-1、PD-L1、PD-2、PD-L2蛋白或融合蛋白或特异性结合前述蛋白的任一种的抗体或抗体片段。
75.一种药学上可接受的组合物,其包含治疗有效量的根据权利要求1-74中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或细胞。
76.根据权利要求75所述的组合物,其被用于胃肠外、静脉内、皮下、经皮、口服、肌内、阴道内、颊内、肛或鼻腔施用。
77.一种抑制有此需要的受试者的T细胞和/或嗜中性粒细胞和/或单核细胞和/或白细胞增殖的方法,其包括施用根据权利要求1-71和75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
78.根据权利要求77所述的方法,其中所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞记忆细胞和/或效应细胞的一种或多种。
79.根据权利要求77所述的方法,其中所述T细胞是静止T细胞。
80.根据权利要求77所述的方法,其中所述T细胞是活化T细胞。
81.一种抑制有此需要的受试者的T细胞活化的方法,其包括施用根据权利要求1-71和75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
82.根据权利要求81所述的方法,其中所述施用抑制一个或多个活化标志物的表达。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述标志物包括CD69、CD44和CD62L。
84.一种在有此需要的受试者中诱导Foxp3在T细胞上的表达的方法,其包括施用根据权利要求1-71和75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
85.一种抑制有此需要的受试者的滤泡增生的方法,其包括施用根据权利要求1-71和
75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
86.一种抑制有此需要的受试者的髓细胞产生的方法,其包括施用根据权利要求1-71和75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
87.根据权利要求86所述的方法,其中所述受试者具有T细胞疾病例如白血病或淋巴瘤。
88.根据权利要求86所述的方法,其中所述受试者具有选自髓性白血病、血液淋巴肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病和幼年型骨髓单核细胞性白血病的白血病。
89.根据权利要求86所述的方法,其中所述受试者具有淋巴瘤或白血病,选自慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、也称为MALT淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、成熟T细胞和自然杀伤(NK)细胞肿瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、原始NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/赛扎里综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增殖性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、未指明的间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤,主要形式:霍奇金淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化型、混合细胞型、淋巴细胞富集型或淋巴细胞耗竭型或未耗竭型、结节性淋巴细胞占优型霍奇金淋巴瘤。
90.一种抑制有此需要的受试者的T细胞浸润和/或Th17细胞增殖的方法,其包括施用根据权利要求1-71和75-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白或组合物。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述受试者具有自身免疫性、炎性或过敏性疾病。
92.根据权利要求90所述的方法,其中所述受试者具有T细胞癌。
93.根据权利要求92所述的方法,其中所述受试者具有选自淋巴瘤或白血病的T细胞癌。
94.根据权利要求90所述的方法,其中所述受试者具有选自髓性白血病、血液淋巴肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病和幼年型骨髓单核细胞性白血病的白血病。
95.根据权利要求90所述的方法,其中所述受试者具有淋巴瘤或白血病,选自慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、也称为MALT淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、成熟T细胞和自然杀伤(NK)细胞肿瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、原始NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/赛扎里综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增殖性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、未指明的间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤,主要形式:霍奇金淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化型、混合细胞型、淋巴细胞富集型或淋巴细胞耗竭型或未耗竭型、结节性淋巴细胞占优型霍奇金淋巴瘤。
96.根据权利要求77-95中任一项所述的方法,其不显著增强细胞凋亡。
97.根据权利要求77-95中任一项所述的方法,其不显著抑制B细胞增殖。
98.一种方法,其使用根据权利要求1-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白、细胞或组合物抑制有此需要的受试者的T细胞免疫。
99.一种方法,其使用根据权利要求1-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白、细胞或组合物抑制有此需要的受试者的炎症
100.根据权利要求99所述的方法,其导致炎症标志物例如IL-6、CRP、TNF、IL-10、IL-17、IGN-γ、嗜酸细胞活化趋化因子、IP-10、MCP-1和MIG的减少。
101.一种方法,其使用根据权利要求1-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白、细胞或组合物抑制有此需要的受试者的自身免疫。
102.一种方法,其使用根据权利要求1-76中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白、细胞或组合物抑制有此需要的受试者的过敏反应。
103.根据权利要求77-102中任一项所述的方法,其还包括施用至少一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白或至少一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS融合蛋白或对于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的任一种是特异性的抗体或抗体片段,所述融合蛋白包含整个胞外域或为至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的所述胞外域的片段、或变体,所述变体与一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的胞外域的任一个或与为至少50、
100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少80-90或95%序列同一性。
104.一种包含根据权利要求1-74中任一项所述的VISTA-Ig或表达VISTA-Ig的细胞的组合物,其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或溶液。
105.根据权利要求104所述的组合物,其中所述组合物还包含至少一种其它免疫抑制剂
106.根据权利要求105所述的组合物,其中所述免疫抑制剂为一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白或至少一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS融合蛋白或对于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的任一种是特异性的抗体或抗体片段,或为抗IL6抗体或其它IL-6拮抗剂,所述融合蛋白包含整个胞外域或为至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的所述胞外域的片段、或变体,所述变体与一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的胞外域的任一个或与为至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少80-90或95%序列同一性。
107.一种治疗或预防有此需要的受试者的炎症或自身免疫或过敏症的方法,其包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
108.根据权利要求107所述的方法,其中所述多聚体VISTA蛋白包含至少2、3、4、5、
6、7或8个拷贝的人、非人灵长类动物或啮齿类动物VISTA蛋白的整个胞外域或为至少50、
75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段,或与人、非人灵长类动物或啮齿类动物VISTA蛋白的整个胞外域或与包含所述人、非人灵长类动物或啮齿类动物VISTA蛋白的所述胞外域的至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段具有至少80-90或95%序列同一性的变体。
109.根据权利要求107或108所述的方法,其中所述VISTA-Ig融合蛋白为根据权利要求1-71中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白。
110.根据权利要求107-109中任一项所述的方法,其中所述炎性、过敏性或自身免疫疾病选自反酸/胃灼热、粉刺、寻常痤疮、过敏和敏感性、阿尔茨海默病、哮喘、动脉粥样硬化和血管闭塞性疾病,任选地动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌梗死、中、周围性血管疾病或血管支架再狭窄、自身免疫疾病、支气管炎、癌症、心肌炎、白内障、脂泻病、慢性疼痛、慢性前列腺炎、肝硬化、结肠炎、结缔组织疾病,任选地系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎或干燥综合征、膜病、克罗恩病、结晶性关节病,任选地痛风、假痛风、焦磷酸沉积病、痴呆、皮炎、糖尿病、眼睛干涩、湿疹、肿、气肿、纤维肌痛、胃肠炎、牙龈炎、肾小球肾炎、心脏病、肝炎高血压、超敏反应、炎性肠病、包括外伤或缺血的后果炎性疾病、胰岛素抵抗、间质性膀胱炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、关节疼痛、关节炎、类风湿性关节炎、莱姆病、代谢综合征(X综合征)、多发性硬化症、肌炎、肾炎、肥胖症、包括葡萄膜炎的眼部疾病、骨质减少、骨质疏松症、帕金森病、盆腔炎、牙周病、多动脉炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、屑病、再灌注损伤、风湿性关节炎、风湿性疾病,任选地类风湿性关节炎、骨关节炎或银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、鼻窦炎、干燥综合症、痉挛性结肠、脊椎关节病,任选地强直性脊柱炎、反应性关节炎或赖特综合征、系统性念珠菌病、炎、移植排斥、UTI’s、阴道炎、血管疾病,包括动脉粥样硬化性血管疾病、血管炎病,任选地结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、丘-施综合征或血管炎。
111.一种治疗或预防自身免疫性、炎性或过敏性疾病的方法,其包括向有此需要的受试者施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
112.根据权利要求111所述的方法,其中所述VISTA-Ig融合蛋白为根据权利要求
1-71中任一项所述的VISTA-Ig融合蛋白。
113.有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白的用途,其用于制造用于治疗或预防自身免疫性、炎性或过敏性疾病的药物。
114.根据权利要求113所述的用途,其中所述VISTA-Ig为根据权利要求1-76中任一项所述的VISTA-Ig,或包含其的细胞、缀合物或组合物。
115.根据权利要求107-114中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述自身免疫疾病为细胞介导的或抗体介导的自身免疫疾病。
116.根据权利要求115所述的方法、组合物或用途,其中所述细胞介导的自身免疫疾病为多发性硬化、I型糖尿病、II型糖尿病、卵巢炎或甲状腺炎。
117.根据权利要求107-116中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述自身免疫疾病为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风关节炎、急性坏死性出血性白质脑炎、急性或慢性鼻窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其它中枢神经系统炎性病症)、急性严重炎症、阿狄森氏病、肾上腺炎、成年型糖尿病(II型糖尿病)、成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、丙种球蛋白缺乏血症、粒细胞缺乏症、血管炎病,包括血管炎,任选地大血管炎,任选地风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)关节炎、过敏性疾病、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、变应性肉芽肿血管炎、过敏性超敏反应紊乱、过敏性神经炎、过敏性反应、斑秃、全秃、Alport综合征、泡炎,任选地过敏性肺泡炎或纤维性肺泡炎、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症)、嗜酸性粒细胞相关疾病,任选地嗜酸性细胞增多症、过敏性症、强直性脊柱炎、脉管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、阿弗他口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性疾病、关节炎,任选地类风湿性关节炎例如急性关节炎、或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、蛔虫病、曲霉肿、含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉病、无精子形成、哮喘,任选地支气管哮喘、支气管哮喘或自身免疫性哮喘、共济失调毛细血管扩张症、共济失调硬化症、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性血管性水肿、自身免疫再生障碍性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性糖尿病、包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎的睾丸和卵巢的自身免疫疾病、与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、自身免疫性自主神经机能异常、自身免疫性部疾病,任选地自身免疫性内耳病(AGED)、自身免疫性内分泌障碍性疾病,包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肠病综合征、自身免疫性腺衰竭、自身免疫性听损失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性血液病、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病、自身免疫多腺体综合征I型、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫介导的胃肠疾病、神经元轴突神经病、巴娄病、白塞氏病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、良性淋巴细胞性脉管炎、伯格氏病(IgA肾病)、养人肺、失明、伯克氏病、闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP、支气管炎、支气管肺曲霉病、布鲁顿综合征、大疱性类疱疮、卡普兰综合征、心肌病、心血管缺血、Castleman综合征、脂泻病、口炎性腹泻(麸质性肠病)、小脑变性、脑缺血、以及伴随血管化的疾病、查加斯病、离子通道病,任选地癫痫、CNS的离子通道病、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎,一种自身免疫性血液疾病、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性过敏性肺炎、慢性炎性关节炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性顽固性炎症、慢性皮肤粘膜念珠菌病、慢性神经病变,任选地IgM多发性神经病或IgM介导的神经病变、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺部炎性疾病、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、丘-施综合征、疤痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、CNS炎性疾病、CNS血管炎、乳糜泻、耳蜗前庭综合征、冷凝集素疾病、息肉状结肠炎、结肠炎例如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症、先天性心脏传导阻滞、先天性风疹感染、库氏阳性贫血、冠状动脉疾病、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象)、克罗恩病、冷球蛋白血症、库欣综合征、睫状体炎,任选地慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退化性关节炎、脱髓鞘性疾病,任选地自身免疫性脱髓鞘性疾病、脱髓鞘性神经病、登革热、疱疹样皮炎和特应性皮炎、皮炎,包括接触性皮炎、皮肌炎、含急性炎症成分的皮肤病、德维克病(视神经脊髓炎)、糖尿病大动脉疾病、糖尿病性肾病、糖尿病视网膜病变、戴-布二氏贫血、弥漫性肺间质纤维化、扩张型心肌病、盘状狼疮、涉及白细胞渗出的疾病、心肌梗塞后综合征、杜普伊特伦挛缩、埃可病毒感染、包括过敏性或异位性湿疹的湿疹、脑炎例如拉斯森脑炎和边缘叶和/或脑干脑炎、脑脊髓炎,任选地过敏性脑脊髓炎或变应性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、子宫内膜增生、心内膜炎、内分泌性眼病、子宫内膜异位症、心内膜心肌纤维化、晶状体过敏性内眼球炎、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、嗜酸性筋膜炎、流行性角结膜炎、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、巩膜外层、表层巩膜炎、EB病毒感染、持久性隆起性红斑、多形性红斑、麻风结节性红斑、结节性红斑、胎儿成红细胞增多病、食管运动功能障碍、原发性混合性冷球蛋白血症、筛窦、埃文斯综合征、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏症、农民肺、风湿性发热、费尔提氏综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、丝虫病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、食物中毒、额窦、胃萎缩、巨细胞关节炎(颞动脉炎)、巨细胞肝炎、巨细胞性多肌痛、肾小球性肾炎、具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)例如慢性或急性肾小球肾炎(例如,原发性GN)、古德帕斯彻氏综合症、痛风性关节炎、粒细胞输注相关综合征、肉芽肿病,包括淋巴瘤样肉芽肿病、伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、滴状银屑病、血红素尿症发作、Hamman-Rich病、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本甲状腺炎、血色沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血,包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、溶血性贫血、甲型血友病、过敏性紫癜、妊娠疱疹、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低丙球蛋白血症、性腺机能减退、甲状旁腺功能减退症、特发性糖尿病性尿崩症、特发性面神经瘫痪、特发性甲状腺功能减退症、特发性IgA肾病、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、特发性肾病综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgE介导性疾病,任选地过敏性症和过敏性或异位性鼻炎、IgG-4相关性硬化性疾病、区域性回肠炎、免疫复合物性肾炎、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、免疫介导型GN、免疫调节性脂蛋白类,包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、包涵体肌炎、感染性关节炎、因抗精子抗体而引起的不育、全部或部分葡萄膜的炎症、炎性肠道疾病(IBD)、炎性增生性皮肤疾病、炎性肌病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、肺间质纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎、少年关节炎、幼年型皮肌炎、青少年糖尿病、幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、幼年型类风湿性关节炎、川崎综合征、干燥性角结膜炎、锥虫病、兰伯特-伊顿综合征、利什曼病、麻风病、白细胞减少、白细胞粘附缺陷病、白细胞分裂性血管炎、白细胞减少症、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA皮肤病、线性IgA病(LAD)、吕弗勒氏综合征、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎、莱姆病、淋巴细胞性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自身免疫性不育、上颌窦、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN),包括I型和II型以及快速进展性GN、膜性GN(膜性肾病)、梅尼埃病、脑膜炎、显微镜性结肠炎、显微镜下多血管炎、偏头痛、微小病变性肾病、混合性结缔组织病(MCTD)、传染性单核细胞增多症、莫伦氏溃疡、姆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病变、多发性内分泌失调、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)例如视神经脊髓型MS、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉疾病、重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力、重症肌无力、心肌病、肌炎、发作性睡病、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎以及自身免疫性炎性肠道疾病、坏死性、皮肤性、或过敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病、肾病综合征、神经性疾病、视神经脊髓炎(德维克氏)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、中性粒细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多症、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼睛和眼眶炎性疾病、眼疤痕性类天疱疮、卵巢炎、交感神经性眼炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全血细胞减少症、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征,包括神经病学副肿瘤综合征,任选地兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、寄生虫病例如利什曼虫病、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕-罗二氏综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳综合症、细小病毒感染、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮)、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(恶性贫血)、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺硬变、POEMS综合征、I、II和III型结节性多动脉炎、原发性慢性多发性关节炎、多软骨炎(例如,顽固性或复发性多软骨炎)、多内分泌自身免疫疾病、多内分泌衰竭、多腺体综合征,任选地自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、多发性神经病、急性多神经根炎、心脏切开后综合征、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性肝硬化、原发性甲状腺功能减退症、原发性特发性粘液水肿、原发性淋巴细胞增多,其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症,任选地良性单克隆丙球蛋白病和意义未定的单克隆球蛋白病、MGUS、原发性粘液性水肿、原发性进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕性皮炎、进行性系统性硬化症、增生性关节炎、银屑病如斑型银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、肺泡蛋白沉积症、肺嗜酸性细胞浸润症、纯红细胞性贫血和再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎、脓疱型银屑病和指甲银屑病、肾盂炎、坏疽性脓皮病、德奎尔万氏甲状腺炎、雷诺现象、反应性关节炎、复发性流产、血压反应降低、反射性交感神经营养不良、顽固性口炎性腹泻、赖特病或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、不宁腿综合征、视网膜自身免疫疾病、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、风疹病毒感染、Sampter综合征、结节病、血吸虫病、施密特综合征、SCID和EB病毒相关疾病、巩膜、巩膜炎、指端硬皮病、硬皮病,任选地系统性硬皮病、硬化性胆管炎、播散性硬化、硬化症例如系统性硬化症、感觉神经性听力损失、血清反应阴性的脊柱关节病、席汉氏综合征、舒尔曼综合征、矽肺、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫症、蝶窦炎、史帝文-强生综合征、僵人(或僵人)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤型红斑狼疮、突发性听力丧失、苏萨克综合征、西德纳姆舞蹈病、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮SLE、皮肤型SLE、系统性坏死性血管炎、ANCA相关性血管炎,任选地丘-施血管炎或综合征(CSS)、脊髓痨、高安动脉炎、毛细血管扩张症、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少,包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症例如特发性血小板减少性紫癜(ITP),包括慢性或急性ITP、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺毒症、组织损伤、托-亨二氏综合征、中毒性表皮坏死松解症、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横贯性脊髓炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹,任选地慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹,包括慢性自身免疫性荨麻疹、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、心瓣炎、血管功能障碍、血管炎、椎关节炎、大疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA))、Wiskott-Aldrich综合征、或x连高IgM综合征。
118.根据权利要求107-117中任一项所述的方法、组合物或用途,其还包括施用另一种免疫调节剂和/或抗原。
119.根据权利要求107-118中任一项所述的方法、组合物或用途,其还包括施用另一种免疫调节剂,所述免疫调节剂选自TLR激动剂(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11激动剂)、1型干扰素,任选地α干扰素或β干扰素、CD40激动剂、TNF拮抗剂或IL-6拮抗剂。
120.一种治疗炎性疾病的方法,其包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地
VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
121.根据权利要求120所述的方法,其中所述VISTA-Ig是根据权利要求1-75中任一项所述的蛋白。
122.根据权利要求107-121中任一项所述的方法,其中所述所治疗的疾病选自1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、风湿性疾病、过敏症、哮喘、过敏性鼻炎、皮肤病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植排斥、移植物抗宿主病、链球菌感染后和自身免疫性肾衰竭、败血性休克、全身炎症反应综合征(SIRS)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和毒液螯入;自身炎性疾病、骨关节炎、结晶性关节炎、囊炎、关节病、腱炎、韧带炎和创伤性关节损伤。
123.根据权利要求107-122中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所治疗的疾病为多发性硬化、狼疮或类风湿关节炎。
124.一种治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法,其包括施用有效量的有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
125.根据权利要求124所述的方法,其中所述VISTA融合蛋白是根据权利要求1-71中任一项所述的融合蛋白。
126.有效量的有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白的用途,其用于制造用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的药物。
127.根据权利要求126所述的用途,其中所述VISTA融合蛋白是根据权利要求1-71中任一项所述的融合蛋白。
128.根据权利要求124-127中任一项所述的方法或用途,其中所述移植物抗宿主病为急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病。
129.根据权利要求124-128中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述所治疗的患者具有移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,任选地其中所述患者表现出急性GVHD,包括但不限于腹痛、腹部绞痛、腹泻、发烧、黄疸、皮疹、呕吐和体重减轻。
130.根据权利要求124-129中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述所治疗的患者具有慢性移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,包括但不限于干眼、口干、脱发、肝炎、肺疾病、胃肠道紊乱、皮疹和皮肤增厚。
131.根据权利要求124-130中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述患者具有或将接受异体干细胞或骨髓移植。
132.根据权利要求124-131中任一项所述的方法、组合物或用途,其中所述患者具有或将接受自体干细胞或骨髓移植。
133.一种治疗过敏性疾病个体的方法,其包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
134.根据权利要求133所述的方法,其中所述VISTA融合蛋白是根据权利要求1-71中任一项所述的融合蛋白。
135.有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白的用途,其用于制造用于治疗过敏性、炎性或自身免疫疾病的药物。
136.根据权利要求133或135所述的方法或用途,其中所述VISTA融合蛋白是根据权利要求1-71中任一项所述的融合蛋白。
137.根据权利要求77-136中任一项所述的方法或用途,其中所述过敏性、炎性或自身免疫疾病选自银屑病、皮炎、特应性皮炎;系统性硬皮病、硬化症;克罗恩病、溃疡性结肠炎;呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征;ARDS);皮炎;脑膜炎;脑炎;葡萄膜炎;结肠炎;肾小球肾炎;湿疹、哮喘、动脉粥样硬化;白细胞粘附缺陷病;类风湿性关节炎;全身性红斑狼疮(SLE);糖尿病,任选地I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病;多发性硬化症;雷诺氏综合征;自身免疫性甲状腺炎;过敏性脑脊髓炎;干燥综合征;幼发型糖尿病;结核病、结节病、多发性肌炎、肉芽肿病和血管炎;恶性贫血(阿狄森氏病);移植排斥疾病、GVHD、中枢神经系统(CNS)炎性疾病;多器官损伤综合征;溶血性贫血、冷沉淀球蛋白血症或库氏阳性贫血;重症肌无力;抗原抗体复合物介导的疾病;抗肾小球基底膜疾病;抗磷脂综合征;
过敏性神经炎;格雷夫斯病;兰伯特-伊顿肌无力综合征;大疱性类天疱疮;天疱疮;自身免疫性多内分泌腺病;赖特病;僵人综合征;白塞氏病;巨细胞动脉炎;免疫复合物性肾炎;
IgA肾病;IgM多发性神经病;免疫性血小板减少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板减少。
138.根据权利要求77-136中任一项所述的方法或用途,其中所述疾病选自关节炎、类风湿性关节炎、急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风关节炎、慢性炎性关节炎、退化性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、椎关节炎和幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性增生性皮肤疾病、银屑病如斑块型银屑病、滴状银屑病、脓疱型银屑病和指甲银屑病、皮炎,包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎、x连锁高IgM综合征、荨麻疹例如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹,包括慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病、系统性硬皮病、硬化症、系统性硬化症、多发性硬化症(MS)、视神经脊髓型MS、原发性进展型MS(PPMS)、复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调硬化症、炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎、自身免疫性炎性肠道疾病、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、表层巩膜炎、呼吸窘迫综合征、成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液疾病、类风湿性脊柱炎、突发性听力丧失、IgE介导的疾病例如过敏反应和过敏性和特应性鼻炎、脑炎、拉斯马森脑炎、边缘叶和/或脑干脑炎、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜炎、肾小球肾炎(GN)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜性增生性GN(MPGN)、快速进展性GN、过敏性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷病、系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮例如皮肤型SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)、幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性糖尿病性尿崩症、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病、淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎病,包括血管炎、大血管炎、风湿性多肌痛、巨细胞(高安氏)动脉炎、中血管炎、川崎病、结节性多动脉炎、显微镜下多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎,例如丘-施血管炎或综合征(CSS)、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫再生障碍性贫血、库氏阳性贫血、戴-布二氏贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血,包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(恶性贫血)、阿狄森氏病、纯红细胞性贫血和再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏症、甲型血友病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎性疾病、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞氏或白塞病、Castleman综合征、古德帕斯彻氏综合症、雷诺氏综合征、干燥综合征、史帝文-强生综合征、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮,任选地寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、红斑型天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、赖特病或综合征、免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎、多发性神经病、慢性神经病变、IgM多发性神经病、IgM介导的神经病变、血小板减少、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退症、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎);亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯病、多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)、副肿瘤综合征,包括神经系统副肿瘤性综合征例如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人或僵人综合征、脑脊髓炎、过敏性脑脊髓炎、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力、胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、多灶性运动神经病变、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎、闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP、格林-巴利综合征、伯格氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线状IgA皮肤病、原发性胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征、脂泻病、乳糜泻、口炎性腹泻(麸质性肠病)、顽固性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳部疾病例如自身免疫性内耳病(AGED)、自身免疫性听力损失、眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎例如难治性或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、淀粉样变性、巩膜炎、非癌性原发性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症,其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症、任选地良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定的单克隆丙种球蛋白病、MGUS、周围神经病变、副肿瘤综合征、离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉疾病、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病、自闭症、炎性肌病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性血液病、纤维肌痛、多发性内分泌失调、施密特综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘性疾病例如自身免疫性脱髓鞘性疾病、糖尿病性肾病、心肌梗塞后综合征、圆形脱毛症、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬皮病)和毛细血管扩张症)、男性和女性自身免疫性不育、混合性结缔组织病、查加斯病、风湿热、复发性流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿血管炎、良性淋巴细胞性脉管炎、Alport综合征、肺泡炎例如过敏性肺泡炎及纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter综合征、卡普兰综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性肺间质纤维化、肺间质纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合征、费尔提氏综合征、丝虫病、睫状体炎例如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、过敏性紫癜、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、埃可病毒感染、心肌病、阿尔茨海默氏病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、埃文斯综合征、自身免疫性腺衰竭、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞性多肌痛、内分泌性眼病、慢性过敏性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变性肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自身免疫疾病、关节炎、支气管炎、慢性阻塞性气道疾病、矽肺、口疮、阿弗他口炎、动脉硬化性疾病、无精子形成、自身免疫性溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症、杜普伊特伦挛缩、晶状体过敏性内眼球炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面神经瘫痪、慢性疲劳综合征、风湿性发热、Hamman-Rich病、感觉神经性听力损失、血红素尿症发作、性腺机能减退、区域性回肠炎、白细胞减少、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感神经性眼炎、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮病、德奎尔万氏甲状腺炎、获得性脾萎缩、因抗精原细胞抗体导致的不育、非恶性胸腺瘤、白癜风、SCID和EB病毒相关疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病例如利什曼虫病、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病症、白细胞粘附缺陷、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性粘液性水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭、周围神经病变、自身免疫多腺体综合征I型、成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色沉着病、心肌病、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦、额窦、上颌窦、或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病例如嗜酸性细胞增多症、肺嗜酸性细胞浸润症、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏性症、血清反应阴性的脊柱关节病、多内分泌自身免疫疾病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病、布鲁顿综合征、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、风湿病、神经性疾病、缺血性再灌注障碍、血压反应降低、血管功能障碍、脉管扩张、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血、以及伴随血管化的疾病、过敏性超敏反应紊乱、肾小球性肾炎、再灌注损伤、心肌或其他组织再灌注损伤、含急性炎症成分的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病、眼睛和眼眶炎性疾病、粒细胞输注相关综合征、细胞因子诱导的毒性、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病视网膜病变、糖尿病大动脉疾病、子宫内膜增生、消化性溃疡、心瓣炎和子宫内膜异位症。
139.根据权利要求77-138中任一项所述的方法、组合物或用途,其还包括至少一种其它免疫抑制剂,任选地其中所述其它免疫抑制剂为PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白或至少一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS融合蛋白或对于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的任一种是特异性的抗体或抗体片段,所述融合蛋白包含人或非人灵长类动物或啮齿类动物PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白的整个胞外域,或为至少50、100、150、
200、250或300个氨基酸的PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白的所述胞外域的片段,或与一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的胞外域的任一个或与为至少50、100、150、
200、250或300个氨基酸的其片段具有至少80-90或95%序列同一性的变体。
140.一种治疗或预防有此需要的受试者的炎症或过敏症的方法,包括施用有效量的分离的VISTA拮抗剂,其中所述激动剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
141.一种治疗自身免疫或过敏性疾病的方法,包括施用有效量的分离的VISTA激动剂,其中所述拮抗剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
142.一种治疗炎性或过敏性疾病的方法,包括施用有效量的分离的VISTA激动剂,其中所述拮抗剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
143.一种治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法,包括施用有效量的有效量的分离的VISTA激动剂,其中所述拮抗剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
144.一种治疗具有过敏性、炎性或自身免疫疾病的个体的方法,包括施用有效量的分离的VISTA激动剂,其中所述激动剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
145.有效量的有效量的分离的VISTA激动剂用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途,其中所述激动剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
146.有效量的有效量的分离的VISTA激动剂用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途,其中所述激动剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
147.有效量的有效量的分离的VISTA激动剂用于制造用于治疗移植物抗宿主病
(GVHD)的药物的用途,其中所述拮抗剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
148.有效量的有效量的分离的VISTA激动剂用于制造用于治疗过敏性、炎性或自身免疫疾病的药物的用途,其中所述激动剂为抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
149.一种分离的siRNA分子,其靶向包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的VISTA。
150.一种分离的siRNA分子,其靶向由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的VISTA。
151.一种分离的siRNA分子,其靶向包含SEQ ID NO:38–47的任一个的氨基酸序列的VISTA的ORF或UTR区。
152.一种分离的siRNA分子,其靶向由包含SEQ ID NO:38–47的任一个的氨基酸序列组成的VISTA的ORF或UTR区。
153.一种分离的siRNA分子,其仅靶向包含SEQ ID NO:48–57的任一个的氨基酸序列的VISTA的UTR区。
154.一种分离的siRNA分子,其仅靶向由SEQ ID NO:48–57的任一个的氨基酸序列组成的VISTA的UTR区。
155.一种分离的siRNA分子,其仅靶向包含SEQ ID NO:58–67的任一个的氨基酸序列的VISTA的ORF区。
156.一种药物组合物,其包含根据权利要求149-155中任一项所述的至少一种siRNA分子。
157.一种用于治疗过敏性或炎性疾病的组合物,其包含根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子。
158.一种用于治疗自身免疫疾病的方法,其包括施用根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子。
159.一种用于治疗过敏性或炎性疾病的方法,其包括施用根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子。
160.一种用于治疗移植物抗宿主病的方法,其包括施用根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子。
161.根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途。
162.根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。
163.根据权利要求149-155中任一项所述的siRNA分子用于制造用于治疗移植物抗宿主病的药物的用途。
164.一种治疗或预防狼疮的方法,其包括施用治疗或预防有效量的VISTA-Ig蛋白。
165.根据权利要求164所述的方法,其中所述受试者具有狼疮的体征或在基因上对狼疮的发展易感。
166.一种治疗或预防与狼疮相关的脾肿大的方法,其包括施用治疗或预防有效量的VISTA-Ig蛋白。
167.一种治疗或预防与狼疮相关的蛋白尿的方法,其包括施用治疗或预防有效量的VISTA-Ig蛋白。
168.一种逆转与狼疮相关的肾损伤的方法,其包括施用治疗或预防有效量的
VISTA-Ig蛋白。
169.根据权利要求164-168中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig蛋白是根据权利要求1-75中任一项所述的VISTA-Ig蛋白。
170.根据权利要求164-169中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig蛋白是多聚体。
171.一种治疗或预防狼疮的一个或多个症状的方法,所述症状包括肾功能的丧失或巨噬细胞至肾中的浸润,所述方法包括施用治疗或预防有效量的VISTA-Ig蛋白。
172.根据权利要求171所述的方法,其中所述VISTA-Ig蛋白是根据权利要求1-75中任一项所述的VISTA-Ig蛋白。
173.根据权利要求171或172所述的方法,其中所述症状或副作用包括Ig在肾小球中的沉积、蛋白尿、增加的促炎细胞因子产量、体重减轻或受损的肾功能的一个或多个。
174.根据权利要求164-173中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig包含至少一种IgG1、VISTA-IgG2、VISTA-IgG3和VISTA-IgG4。
175.根据权利要求164-174中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig是嗜细胞的。
176.根据权利要求164-174中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig是非嗜细胞的。
177.根据权利要求164-176中任一项所述的方法,其中所述VISTA-Ig是多聚体。
178.根据权利要求140-144中任一项所述的方法,其还包括施用另一种用于治疗狼疮的药物。
179.根据权利要求178所述的方法,其中所述狼疮药物为非甾体抗炎药例如普生、布洛芬,抗疟药例如羟氯喹(Plaquenil)、皮质类固醇例如泼尼松、免疫抑制剂如环磷酰胺(Cytoxan)、硫唑嘌呤(Imuran,Azasan)、麦考酚酯(Cellcept)、来氟米特(Arava)、甲氨蝶呤(Trexall)。
180.根据权利要求168-179中任一项所述的方法,所述方法还包括施用另一种免疫抑制剂或改善肾功能的试剂
181.根据权利要求180所述的方法,其中所述其它免疫抑制性试剂为PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS蛋白或至少一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS融合蛋白或对于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的任一种是特异性的抗体或抗体片段,所述融合蛋白包含整个胞外域或为至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的所述胞外域的片段、或变体,所述变体与一种PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4或ICOS的胞外域的任一个或与为至少50、
100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少80-90或95%序列同一性。
182.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途,其用于治疗患有病症的人,所述病症选自关节炎,包括类风湿性关节炎、急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退化性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯蒂尔病、椎关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎;炎性增生性皮肤疾病;银屑病,例如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱型银屑病和指甲银屑病;特应性,包括特应性疾病例如花粉症和乔布综合征;皮炎,包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎和特应性皮炎;x连锁高IgM综合征;过敏性眼内炎性疾病;荨麻疹,例如慢性过敏性荨麻疹、慢性特发性荨麻疹和慢性自身免疫性荨麻疹;肌炎;多发性肌炎/皮肌炎;幼年型皮肌炎;中毒性表皮坏死松解症;硬皮病,包括系统性硬皮病;硬化症,例如系统性硬化症、多发性硬化症(MS)、视神经脊髓型MS、原发性进展型MS(PPMS)、复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调硬化症;视神经脊髓炎(NMO);炎性肠道疾病(IBD),包括克罗恩病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎和自身免疫性炎性肠道疾病;肠炎;坏疽性脓皮病;结节性红斑;原发性硬化性胆管炎;
呼吸窘迫综合征,包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS);脑膜炎;全部或部分葡萄膜的炎症;虹膜炎;脉络膜炎;自身免疫性血液疾病;类风湿性脊柱炎;类风湿性滑膜炎;遗传性血管性水肿;颅神经损伤,如在脑膜炎中;妊娠疱疹;妊娠性类天疱疮;阴囊瘙痒症;自身免疫性卵巢早衰;因自身免疫病症引起的突发性听力丧失;IgE介导性疾病,例如过敏性症以及过敏和过敏性鼻炎;脑炎,例如拉斯穆森脑炎以及边缘叶和/或脑干脑炎;葡萄膜炎,例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎;具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN),例如慢性或急性肾小球肾炎、原发性GN、免疫介导型GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜性增生性GN(MPGN),包括I型和II型以及快速进展性GN;增生性肾炎;自身免疫性多腺体内分泌衰竭;龟头炎,包括浆细胞性局限性龟头炎;
龟头包皮炎;红斑心性环状;持久性色素异常性红斑;多型性红斑症;环状肉芽肿;光泽性苔癣;硬化性苔藓等萎缩性;慢性单纯性苔藓;小棘苔癣;扁平苔藓;层状鱼鳞病;表皮松解角化过度;癌前病变角化;坏疽性脓皮病;过敏性疾病和反应;过敏性反应;湿疹,包括过敏性或异位性湿疹、干性湿疹、汗疱湿疹和水疱样掌跖湿疹;哮喘,例如支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘;涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症;针对外来抗原的免疫反应,如在怀孕期间胎儿的A-B-O血型;慢性肺部炎性疾病;自身免疫性心肌炎;白细胞粘附缺陷病;狼疮,包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非狼疮肾、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤型SLE、亚急性皮肤型SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮;幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性糖尿病性尿崩症、糖尿病视网膜病变、糖尿病性肾病和糖尿病大动脉疾病;与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答;结核病;结节病;肉芽肿病,包括淋巴瘤样肉芽肿病;韦格纳肉芽肿;粒细胞缺乏症;血管炎病,包括血管炎、大血管炎、风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎、中血管炎、川崎病、结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎、显微镜下多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤性血管炎、过敏性血管炎、坏死性血管炎、系统性坏死性血管炎、ANCA相关性血管炎、丘-施血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关性小血管炎;颞动脉炎;再生障碍性贫血;自身免疫再生障碍性贫血;库氏阳性贫血;戴-布二氏贫血;溶血性贫血或免疫性溶血性贫血,包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(恶性贫血);
阿狄森氏病;纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA);因子VIII缺乏症;甲型血友病;自身免疫性中性粒细胞减少症;全血细胞减少症;白细胞减少症;涉及白细胞渗出的疾病;CNS炎性疾病;多器官损伤综合征,例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征;抗原-抗体复合物介导的疾病;抗肾小球基底膜疾病;抗磷脂抗体综合征;过敏性神经炎;白塞氏病/综合征;Castleman综合征;古德帕斯彻氏综合症;雷诺氏综合征;干燥综合征;史帝文-强生综合征;类天疱疮,例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮和红斑型天疱疮;自身免疫性多内分泌腺病;赖特病或综合征;热损伤;先兆子痫;免疫复合物病症,例如免疫复合物性肾炎和抗体介导的肾炎;多发性神经病;慢性神经病变,例如IgM多发性神经病和IgM介导的神经病变;血小板减少(如例如由心肌梗死患者发展的),包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少、自身免疫性或原发性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜(ITP)以及慢性或急性ITP;巩膜炎,例如特发性角膜巩膜炎和表层巩膜炎;睾丸和卵巢的自身免疫疾病,包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎;原发性甲状腺功能减退症;甲状旁腺功能减退症;自身免疫性内分泌障碍性疾病,包括甲状腺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯病、多腺体综合征、自身免疫性多腺体综合征和腺体内分泌综合征;副肿瘤综合征,包括神经病学副肿瘤综合征;兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征;僵人或僵人综合征;脑脊髓炎,例如过敏性脑脊髓炎、变应性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE);重症肌无力,例如胸腺瘤相关重症肌无力;小脑变性;神经性肌强直;眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS);感觉神经病变;多灶性运动神经病变;席汉氏综合征;肝炎,包括自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎和自身免疫性慢性活动性肝炎;淋巴细胞性间质性肺炎(LIP);闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP;格林-巴利综合征;伯格氏病(IgA肾病);特发性IgA肾病;线状IgA皮肤病;急性发热性嗜中性粒细胞性皮肤病;角质层下脓疱性皮肤病;短暂性棘层松解性皮肤病;肝硬化,例如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变;自身免疫性肠病综合征;脂泻病或乳糜泻;口炎性腹泻(麸质性肠病);顽固性口炎性腹泻;特发性口炎性腹泻;冷球蛋白血症;
肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症);冠状动脉疾病;自身免疫性耳部疾病,例如自身免疫性内耳病(AIED);自身免疫性听力损失;多软骨炎,例如顽固性或再发性或复发性多软骨炎;肺泡蛋白沉积症;Cogan综合征/非梅毒性间质性角膜炎;贝尔麻痹;Sweet病/综合征;酒渣鼻自身免疫症;带状疱疹相关疼痛;淀粉样变性;非癌性原发性淋巴细胞增多症;原发性淋巴细胞增多症,包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如,良性单克隆丙球蛋白病和意义未定的单克隆球蛋白病、MGUS);周围神经病变;离子通道病,例如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉疾病、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病;自闭症;炎性肌病;
局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS);内分泌性眼病;葡萄膜视网膜炎;脉络膜视网膜炎;自身免疫性血液病;纤维肌痛;多发性内分泌失调;施密特综合征;肾上腺炎;胃萎缩;早老性痴呆;脱髓鞘性疾病,例如自身免疫性脱髓鞘性疾病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病;Dressler综合征;斑秃;全秃;CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬皮病和毛细血管扩张症);男性和女性自身免疫性不育(例如,因抗精子抗体引发的);混合性结缔组织病;查加斯病;风湿热;复发性流产;农民肺;多形性红斑;心脏切开后综合征;库欣综合征;养鸟人肺;变应性肉芽肿血管炎;良性淋巴细胞性脉管炎;Alport综合征;肺泡炎,例如过敏性肺泡炎及纤维化肺泡炎;间质性肺病;输血反应;麻风病;疟疾;Samter综合征;Caplan综合征;心内膜炎;心内膜心肌纤维化;弥漫性肺间质纤维化;肺间质纤维化;肺纤维化;特发性肺纤维化;囊性纤维化;眼内炎;持久性隆起性红斑;胎儿成红细胞增多病;嗜酸性筋膜炎;舒尔曼综合征;费尔提氏综合征;丝虫病;
睫状体炎,例如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、或Fuch睫状体炎;过敏性紫癜;败血症;内毒素血症;胰腺炎;甲状腺机能亢进;埃文斯综合征;自身免疫性腺衰竭;西登哈姆舞蹈病;链球菌感染后肾炎;血栓闭塞性脉管炎;甲状腺毒症;脊髓痨;脉络膜炎;巨细胞多肌痛;慢性过敏性肺炎;干燥性角结膜炎;流行性角结膜炎;特发性肾病综合征;微小病变性肾病;良性家族性和缺血-再灌注损伤;移植器官再灌注;视网膜自身免疫疾病;关节炎;支气管炎;慢性阻塞性气道/肺疾病;矽肺;口疮;阿弗他口炎;
动脉硬化性疾病;无精子形成;自身免疫性溶血;伯克氏病;冷球蛋白血症;杜普伊特伦挛缩;晶状体过敏性内眼球炎;过敏性肠炎;麻风结节性红斑;特发性面神经瘫痪;风湿性发热;Hamman-Rich氏病;感觉神经性听力损失;血红素尿症发作;性腺机能减退;区域性回肠炎;白细胞减少;传染性单核细胞增多症;横贯性脊髓炎;原发性特发性粘液水肿;肾病;
交感神经性眼炎;肉芽肿性睾丸炎;胰腺炎;急性多神经根炎;坏疽性脓皮病;德奎尔万氏甲状腺炎;获得性脾萎缩;非恶性胸腺瘤;白癜风;中毒性休克综合征;食物中毒;涉及T细胞浸润的病症;白细胞粘附缺陷;与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答;涉及白细胞渗出的疾病;多器官损伤综合征;抗原-抗体复合物介导的疾病;抗肾小球基底膜疾病;过敏性神经炎;自身免疫性多内分泌腺病;卵巢炎;原发性粘液性水肿;自身免疫性萎缩性胃炎;交感性眼炎;风湿性疾病;混合性结缔组织病;肾病综合征;胰岛炎;多内分泌衰竭;自身免疫多腺体综合征I型;成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH);心肌病例如扩张型心肌病;获得性大疱性表皮松解症(EBA);血色沉着病;心肌病;
肾病综合征;原发性硬化性胆管炎;化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎;急性或慢性鼻窦炎;
筛窦、额窦、上颌窦、或蝶窦炎;嗜酸性粒细胞相关疾病例如嗜酸性细胞增多症、肺嗜酸性细胞浸润症、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿;过敏性症;血清反应阴性的脊柱关节病;多内分泌自身免疫疾病;硬化性胆管炎;慢性皮肤粘膜念珠菌病;布鲁顿综合征;婴儿短暂性低丙种球蛋白血症;Wiskott-Aldrich综合征;共济失调毛细血管扩张症综合征;血管扩张;与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、风湿病、神经性疾病、淋巴结炎、血压反应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血、以及伴随血管化的疾病;过敏性超敏反应紊乱;肾小球性肾炎;再灌注损伤;缺血性再灌注障碍;心肌或其他组织再灌注损伤;淋巴瘤气管支气管炎;炎性皮肤病;含急性炎症成分的皮肤病;多器官功能衰竭;大疱性疾病;肾脏皮质坏死;急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症疾病;眼睛和眼眶炎性疾病;粒细胞输注相关综合征;细胞因子诱导的毒性;发作性睡病;急性严重炎症;慢性顽固性炎症;肾盂炎;子宫内膜增生;消化性溃疡;
心瓣炎;和子宫内膜异位症。
183.根据权利要求182所述的方法,其中所述病症是糖尿病、狼疮、多发性硬化、银屑病、炎性肠病、克罗恩病、甲状腺炎、类风湿关节炎、多发性硬化或IV型超敏反应,包括牵涉过敏性现象和慢性炎性疾病的发病机理以及因病原体例如麻疯病、肺结核、利什曼病或李斯特菌病感染引发的IV型超敏反应。
184.根据权利要求1-71中任一项所述的VISTA融合蛋白,其包含至少一种与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域具有至少约90%序列同一性的多肽和免疫球蛋白(Ig)蛋白。
185.根据权利要求184所述的蛋白质,其中所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列具有至少约95%序列同一性。
186.根据权利要求184或185所述的融合蛋白,其中所述Ig蛋白为IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgM、IgE或IgA。
187.根据权利要求186所述的融合蛋白,其中所述Ig经突变减弱或消除补体结合和/或FcR结合。
188.根据权利要求186所述的融合蛋白,其中所述Ig经突变增强或改变补体结合和/或FcR结合。
189.根据权利要求186-188中任一项所述的融合蛋白,其中所述Ig蛋白包含人IgG1的恒定区和铰链区。
190.一种治疗或预防有此需要的受试者的多发性硬化的方法,包括施用预防或治疗有效量的VISTA-Ig融合蛋白。
191.根据权利要求190所述的方法,其中所述VISTA-Ig是多聚体和/或包含根据权利要求1-71中任一项所述的VISTA-Ig。
192.根据权利要求190所述的方法,其中所述受试者已被诊断为患有多发性硬化和/或在基因上处于发展多发性硬化的风险。
193.一种治疗或预防有此需要的受试者的过敏性呼吸系统疾病的方法,其包括施用预防或治疗有效量的VISTA-Ig融合蛋白。
194.根据权利要求193所述的方法,其中所述VISTA-Ig是多聚体和/或包含根据权利要求1-71中任一项所述的VISTA-Ig。
195.根据权利要求193所述的方法,其中所述受试者已被诊断为患有过敏性呼吸系统疾病和/或基于基因型和/或家族史在基因上处于发展多发性硬化的风险。
196.根据权利要求193-195中任一项所述的方法,其中所述呼吸系统疾病是哮喘。
197.根据权利要求193-196中任一项所述的方法,其中所治疗的受试者具有特应性疾病的历史例如特应性鼻炎或特应性湿疹,已用β阻断剂治疗,为吸烟者,或已暴露于与过敏性呼吸系统疾病和/或哮喘的发作相关的环境因子或病原体例如甲、烟吸入、RSV或鼻病毒感染、内毒素暴露或邻苯二甲酸盐暴露、或具有或先前已具有过花粉热、荨麻疹、脉管炎或丘-施综合征。
198.根据权利要求193-196中任一项所述的方法,其中所治疗的受试者具有与哮喘发作相关的基因或蛋白质表达谱。
199.根据权利要求198所述的方法,其中所述基因或蛋白质包括:GSTM1、IL10、CTLA-4、SPINK5、LTC4S、IL4R和ADAM33。
200.根据权利要求193-199中任一项所述的方法,其还包括施用另一种用于治疗或预防哮喘和/或减少哮喘发作的发生或严重度的药物。
201.根据权利要求200所述的方法,其中哮喘药物或治疗为吸入器或药物,其选自丙酸氟替卡松、皮质类固醇例如倍氯米松、长效β肾上腺素受体激动剂(LABA)例如沙美特罗或福莫特罗,任选地与吸入的皮质类固醇组合,白三烯拮抗剂例如任选地与LABA组合的孟鲁司特或扎鲁司特、肥大细胞稳定剂例如色甘酸钠或β-2-肾上腺素受体激动剂(SABA)例如柳丁氨醇、肾上腺素、抗胆碱能药例如异丙托溴铵。
202.一种诱导对自身抗原或外来抗原或过敏原的耐受性的方法,其包括施用有效量的VISTA多肽或融合蛋白。
203.根据权利要求202所述的方法,其中所述方法导致Foxp3+细胞的诱导。
204.根据权利要求202所述的方法,其用于诱导对吸入的过敏原的耐受性。
205.根据权利要求202所述的方法,其用于治疗过敏性或炎性呼吸系统疾病。
206.根据权利要求202所述的方法,其中通过注射、口服、经皮肤、鼻内或吸入,例如于喷雾器中或通过吸入器,施用所述VISTA多肽或融合蛋白。
207.根据权利要求202-206所述的方法,其用于治疗哮喘、RSV感染、流感病毒感染或另一种肺感染性病症。
208.一种VISTA-Ig融合蛋白,其与SEQ ID NO:68、69、72或73中的VISTA多肽具有至少90%序列同一性。
209.一种VISTA-Ig融合蛋白,其含有一种或多种与SEQ ID NO:68、69、72或73中的VISTA多肽具有至少95%序列同一性的多肽。
210.一种VISTA-Ig融合蛋白,其含有一个或多个与SEQ ID NO:68、69、72、73或75中的VISTA多肽具有至少95%序列同一性的多肽。
211.一种VISTA-Ig融合蛋白,其含有一个或多个与SEQ ID NO:68、69、72或73或75中的VISTA多肽具有至少98%序列同一性的多肽。
212.一种VISTA-Ig融合蛋白,其含有一个或多个与SEQ ID NO:68、69、72、73或75中的VISTA多肽具有至少98%序列同一性的多肽。
213.一种通过施用VISTA-Ig多肽特异性靶向有此需要的患者的T细胞、NK细胞和/或骨髓细胞的方法。
214.根据权利要求207-210中任一项所述的VISTA-Ig用于治疗过敏性、自身免疫性或炎性疾病的用途。
215.VISTA激动剂或拮抗剂调节ERK1/ERK2活化的用途。
216.根据权利要求215所述的用途,其包括另外的治疗剂,所述治疗剂为Raf激酶抑制剂或MEK、mTOR、HSP90、AKT、PI3K、CDK9、PAK、蛋白激酶C、MAP激酶、MAPK激酶或ERK的抑制剂。
217.根据权利要求215或216所述的用途,其被用于治疗通过蛋白激酶Erk1/2的活化介导的疾病。
218.根据权利要求217所述的用途,其中所述疾病为神经退行性疾病。
219.根据权利要求218所述的用途,其中所述疾病为选自阿尔茨海默病和相关痴呆、癫痫、帕金森病、亨廷顿病或中风的疾病。
220.根据前述权利要求中任一项所述的方法或组合物,其被用于治疗SLE、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、炎性肠病或1型或2型糖尿病。
221.根据前述权利要求中任一项所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其包括人IgG1Fc区,所述人IgG1Fc区被突变来引入E269R、E233P、D265A、K322A、P331G和P331/K322A突变的一个或两个或更多个。
222.根据权利要求221所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其中所述Fc区被突变以引入E269R和/或E233P突变。
223.根据权利要求221所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其中所述Fc区被突变以消除或显著降低Clq活性。
224.根据权利要求222所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其中所述Clq突变包括
K322A和/或P331G。
225.根据权利要求221所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其中所述Fc区被突变以引入一个或多个其它影响效应子功能或糖基化的突变。
226.根据前述权利要求中任一项所述的VISTA-Ig多肽或使用方法,其中所述Fc区被突变以消除或显著降低Clq活性。

说明书全文

新型VISTA-IG构建体和VISTA-IG用于治疗自身免疫性、过

敏性和炎性疾病的用途

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年6月22日提交的标题为“用于治疗自身免疫和炎性疾病的VISTA-Ig(VISTA-Ig for Treatment of Autoimmune and Inflammatory Disorders)”的美国临时申请No.61/663,431,2012年6月25日提交的标题为“用于治疗自身免疫
和炎性疾病的VISTA-Ig(VISTA-Ig for Treatment of Autoimmune and Inflammatory Disorders)”的美国临时申请No.61/663,969,2012年12月11日提交的标题为“用于
治疗自身免疫和炎性疾病的VISTA-Ig(VISTA-Ig for Treatment of Autoimmune and
Inflammatory Disorders)”的美国临时申请No.61/735,799,2013年3月11日提交的标题为“用于治疗自身免疫和炎性疾病的VISTA-Ig(VISTA-Ig for Treatment of Autoimmune and Inflammatory Disorders)”的美国临时申请No.61/776,234,以及2013年4月1日
提交的标题也为“用于治疗自体免疫和炎性疾病的VISTA-Ig(VISTA-Ig for Treatment of Autoimmune and Inflammatory Disorders)“的美国临时申请No.61/807,135的优先权,所有所述临时申请的内容通过引用以其整体并入。
发明领域
[0003] VISTA[T细胞活化的含V区免疫球蛋白抑制剂(VISTA)或PD-L3]是负调节免疫的分子。本发明涉及VISTA(例如,VISTA-Ig)的可溶性形式,包括VISTA-Ig的最优化形式,包括具有增强的效的包含接头多肽的多聚体形式(其可被全身性施用以治疗和/或预防有此需要的受试者的自身免疫性、过敏性和炎性疾患)的用途。示例性病症包括多发性硬化症、类湿关节炎、屑病性关节炎、狼疮疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、药物诱导的狼疮和新生儿狼疮,以及过敏性或炎性呼吸系统疾病例如哮喘、过敏性鼻炎、花粉症、荨麻疹、脉管炎和丘-施综合征以及其它如下文中公开的过敏性、炎性和自身免疫疾病。
[0004] 发明背景
[0005] 免疫系统受共刺激和共抑制配体以及受体严格控制。这些分子不仅提供针对T细胞活化的第二信号,而且还提供了正负信号的平衡网络,该网络使抗感染的免疫反应最大化的同时限制对自身的免疫。
[0006] 免疫反应的诱导需要T细胞扩增、分化、收缩以及T细胞记忆的建立。T细胞必须遇到抗原呈递细胞(APC),并通过APC上的T细胞受体(TCR)/主要组织相容性复合物(MHC)相互作用进行通信。一旦建立TCR/MHC相互作用,需要T细胞与APC之间其它组的受体-配体接触,即通过CD154/CD40和CD28/B7.1-B7.2的共刺激。这些接触之间的协同作用导致能够清除病原体和肿瘤的生产性免疫反应,并可能能够诱导自身免疫。
[0007] 已鉴定了另一控制平,即调节性T细胞(Treg)。T细胞的该特定亚群在胸腺中产生,递送至外周,并且能够在恒定地和可诱导地控制T细胞反应。Sakaguchi(2000)Cell 101(5):455–8;Shevach(2000)Annu.Rev.Immunol.18:423–49;Bluestone 和
Abbas(2003)Nat.Rev.Immunol.3(3):253–7。Treg由CD4+CD25+表型表示,还表达高水平的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、OX-40、4-1BB和糖皮质激素诱导型TNF受
体相关蛋白(GITR)。McHugh,等人(2002)Immunity16(2):311-23;Shimizu,等人(2002)Nat.Immun.3(2):135–42。通过5天新生儿胸腺切除术或使用抗CD25耗竭抗体而消除
Treg细胞,导致诱导自身免疫病变以及加剧T细胞对外源和自体抗原的反应,包括提高的抗肿瘤反应。Sakaguchi,等人(1985)J.Exp.Med.161(1):72–87;Sakaguchi,等人(1995)J.Immunol.155(3):1151-64;Jones,等人(2002)Cancer Immun.2:1。此外,Treg还已牵涉移植耐受的诱导和维持,因为用抗CD25单克隆抗体耗竭Treg导致移植耐受的消除以及快速移植排斥。Jarvinen,等人(2003)Transplantation 76:1375–9。在通过Treg表达的受体中,GITR似乎是一种重要的成分,因为用激动性单克隆抗体连接Treg表面上的GITR导致Treg活性的快速终止,这导致自身免疫病变和移植耐受的消除。
[0008] 共剌激和共抑制性配体与受体不仅提供T细胞活化的“第二信号”,还提供正负信号的平衡网络,从而最大化针对感染的免疫应答,同时限制自身免疫。得到最清楚表征的共剌激配体为B7.1和B7.2,它们由专职性APC表达,并且其受体为CD28和CTLA-4。Greenwald,等人(2005)Annu Rev Immunol 23,515–548;Sharpe和Freeman(2002)Nat Rev Immunol 2,116–126。CD28由首次接触试验的和活化的T细胞表达,且对最佳的T细胞活化起着关键作用。相比之下,CTLA-4在T细胞活化时诱导,并通过结合到B7.1/B7.2来抑制T细胞活化,从而损害CD28-介导的共剌激。CTLA-4还通过其胞质ITIM基序来转导负
信号。Teft,等人(2006).Annu Rev Immunol 24,65–97。B7.1/B7.2KO小鼠在适应性免疫反应中受损(Borriello,等人(1997)Immunity 6,303–313;Freeman,等人(1993)Science
262,907–909),然而CTLA-4KO小鼠无法充分控制炎症并发展了系统性自身免疫疾病。
Chambers,等人(1997)Immunity 7,885–895;Tivol,等人(1995)Immunity 3,541-547;
Waterhouse,等人(1995)Science 270,985–988。B7家族配体已扩展到包括共剌激性
B7-H2(ICOS配体)和B7-H3以及共抑制性B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1或
B7x)和B7-H6。参见Brandt,等人(2009)J Exp Med 206,1495–1503;Greenwald,等人(2005)Annu Rev Immunol 23:515–548。
[0009] 可诱导共剌激(ICOS)分子在活化的T细胞上表达并结合于B7-H2。参见Yoshinaga,等人(1999)Nature 402,827–832。ICOS对T细胞活化、分化及功能是非常重要的,以及对T-辅助细胞诱导的B细胞活化、Ig类别转换以及生发中心(GC)形成是必不可少。Dong,等人(2001)Nature 409,97–101;Tafuri,等人(2001)Nature 409,105–109;
Yoshinaga,等人(1999)Nature 402,827–832。在另一方面,程序性死亡1(PD-1)负调节T细胞反应。PD-1KO小鼠根据遗传背景发展了狼疮样自身免疫疾病或自身免疫扩张型心肌病。Nishimura,等人(1999)Immunity 11,141-151.Nishimura,等人(2001)Science
291:319–322。自身免疫最可能因PD-L1和PD-L2两种配体的信号传导丢失所致。最近,CD80已被确定为将抑制性信号转导进T细胞的PD-L1的第二受体。Butte,等人(2007)
Immunity 27:111-122。B7-H3和B7-H4的受体仍不得而知。
[0010] 得到最清楚表征的共刺激性配体为B7.1和B7.2,它们属于Ig超家族并且在专职性APC上表达,并且它们的受体为CD28和CTLA-4。Greenwald,等人(2005)Annu Rev.Immunol.23:515–548。CD28由首次接触试验的和活化的T细胞表达,并对最佳的T细胞活化起着关键作用。相比之下,CTLA-4在T细胞活化时诱导,并通过结合至B7.1/B7.2来抑制T细胞活化,从而损害CD28-介导的共刺激。B7.1和B7.2KO小鼠在适应性免疫反应中受损(Borriello,等人(1997)Immunity 6:303–313),而CTLA-4KO小鼠无法充分控制炎症并发展了系统性自身免疫疾病。Tivol,等人(1995)Immunity 3:541–547;Waterhouse,等人(1995)Science 270:985–988;Chambers,等人(1997)Immunity 7:885–895。
[0011] B7家族配体已扩展到包括共剌激性B7-H2(可诱导的T细胞共刺激[ICOS]配体)和B7-H3以及共抑制性B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1或B7x)和B7-H6。
Greenwald,等 人(2005)Annu Rev.Immunol.23:515–548;Brandt,等 人 (2009)J.Exp.Med.206:1495–1503。因此,已鉴定了另外的CD28家族受体。ICOS在活化的T细胞上表达并结合至B7-H2。ICOS是正共调节剂,其对于T细胞活化、分化和功能是非常重要的。
Yoshinaga,等人(1999)Nature 402:827–832;Dong,等人(2001)J.Mol.Med.81:281–
287。相比之下,PD-1(程序化死亡1)负调节T细胞反应。PD-1KO小鼠发展了狼疮样自身免疫疾病或自身免疫扩张型心肌病。Nishimura,等人(1999)Immunity 11,141-151.Nishimura,等人(2001)Science 291:319–322。自身免疫最可能因PD-L1和PD-L2两种配体的信号
传导丢失所致。最近,CD80已被确定为将抑制性信号转导进T细胞的PD-L1的第二受体。
Butte,等人(2007)Immunity 27:111-122。
[0012] 两种抑制性B7家族配体PD-L1和PD-L2具有不同的表达模式。PD-L2在DC和巨噬细胞上可诱导性表达,然而PD-L1广泛地在造血细胞和非造血细胞类型上表达。
Okazaki&Honjo(2006)Trends Immunol.27(4):195–201;Keir, 等 人 (2008)Ann Rev -/- -/-
Immunol.26:677–704。与PD-1受体的免疫抑制作用一致,使用PD-L1 和PD-L2 小鼠
的研究已表明,两种配体在抑制T细胞增殖和细胞因子产生方面具有重叠作用。Keir,等人(2006)J Immunol.175(11):7372–9。PD-L1缺乏在自身免疫性糖尿病的非肥胖型糖尿病模型以及多发性硬化(实验性自身免疫性脑脊髓炎[EAE])的小鼠模型中均会加速疾病进展。
Ansari,等人(2003)J.Exp.Med.198:63–69;Salama,等人(2003)J.Exp.Med.198:71–78;
-/-
Latchman,等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101:10691–10696。PD-L1 T细胞在两种疾病模型中均产生升高水平的促炎性细胞因子。此外,BM嵌合体实验已显示PD-L1的组织表达(即,在胰腺内)对其区域性控制炎症的能力有独特的贡献。Keir,等人(2006)J.Exp.Med.203:883–895;Keir,等人(2007)J.Immunol.179:5064–5070;Grabie,等人(2007)Circulation 116:2062–2071。PD-L1还在胎盘合体滋养细胞上高表达,所述细胞关键性地控制对同种异体胎儿的母体免疫反应。Guleria,等人(2005)J.Exp.Med.202:231–237。
[0013] 与其免疫抑制作用一致,PD-L1强效地抑制抗肿瘤免疫反应并且帮助肿瘤逃避+免疫监督。PD-L1可诱导浸润性细胞毒性CD8T细胞的细胞凋亡,所述细胞表达高水平的PD-1。Dong,等人(2002)Nat.Med.8:793–800;Dong和Chen(2003)J.Mol.Med.81:281–
287。与其它免疫疗法结合,阻断PD-L1-PD-1信号传导途径通过增强抗肿瘤CTL活性和细胞因子产生阻止肿瘤进展。Iwai,等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:12293–12297;
Blank,等 人(2004)Cancer Res.64:1140–1145;Blank,等人 (2005)Cancer Immunol. Immunother.54:307–314;Geng,等 人(2006)Int.J.Cancer 118:2657–2664。DC 上 的+ +
PD-L1表达促进适合的Foxp3CD4调节性T细胞(Treg细胞)的诱导,PD-L1为肿瘤微环境
内Treg细胞的强效诱导物。Wang,等人(2008)Proc Natl.Acad.Sci.USA 105:9331–9336。
靶向B7家族调节性分子的最近进展显示了治疗免疫相关疾病例如自身免疫和癌症的
希望。Keir,等 人(2008)Annu.Rev.Immunol.26:677–704;Zou和 Chen(2008)Nat.Rev.Immunol.8:467–477。
[0014] 自身免疫疾病
[0015] 自身免疫病症是一种发生在当免疫系统错误地攻击和破坏健康的身体组织是发生的疾患。存在超过80种不同类型的自身免疫疾病。正常情况下,免疫系统的白血细胞帮助保护人体免受有害的物质(称为抗原)的侵害。抗原的实例包括来自另一个人或物种的细菌、病毒、毒素、癌细胞和血液或组织。免疫系统产生了破坏这些有害物质的抗体。然而,在自身免疫疾病患者中,免疫系统无法区分自我与非自我(例如,健康组织和外来抗原)。其结果是破坏正常人体组织的免疫反应。该反应是类似在过敏性病症中的应答的过敏反应。在过敏症中,免疫系统对其通常会忽略的外部物质反应。对于自身免疫疾病,免疫系统对其正常情况下忽略的正常人体组织反应,其原因未知。
[0016] 自身免疫疾病可导致一个或多个类型的身体组织的破坏、器官的异常生长以及改变器官功能,并且可影响一个或多个器官或组织类型。通常受自身免疫疾病影响的器官和组织包括血管、结缔组织、内分泌腺(例如,甲状腺或胰腺)、关节、肌肉、红血细胞和皮肤。个人可同时具有超过一种自身免疫病症。
[0017] 自身免疫疾病的症状基于异常免疫反应的疾病和位置而变化。对于自身免疫疾病经常发生的常见症状包括疲劳、发烧和一般的恶感(全身乏力)。可进行以诊断自身免疫疾病的测试可以包括:抗核抗体的测试、自身抗体测试、CBC、C-反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)。
[0018] 药物通常被开具来控制或降低免疫系统的反应。它们通常被称为免疫抑制药物。这样的药物可包括糖皮质激素(例如强的松)和非甾体药物如硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、西罗莫司或他克莫司。
[0019] 并发症是常见的,并且取决于疾病。用于抑制免疫系统的用药的副作用可以是严重的,例如可以是难以控制的感染。“Autoimmune disorders.”MedlinePlus—
U.S.National Library of Medicine(2012年4月19日)。
[0020] 炎性疾患
[0021] 炎症是血管组织对有害刺激例如病原体、受损细胞或刺激物的复杂生物反应的一部分。炎症是生物体除去有害刺激以及启动愈合过程的保护性尝试。如果无炎症,则伤口、感染永远不会愈合。类似地,组织的进行性破坏会损害生物体的生存。同时,慢性炎症也可导致一系列疾病,如花粉症、牙周炎、动脉粥样硬化、类风湿关节炎,和甚至癌症(例如,胆囊癌)。
[0022] 炎症可分为急性或慢性的。急性炎症是身体对有害刺激的初始反应,并且通过血浆和白细胞(尤其是粒细胞)从血液至受伤组织的增加的移动来实现。生化事件的级联传播并使炎症反应发育成熟,从而涉及受伤组织内的局部血管系统,免疫系统以及各种细胞。长期炎症,称为慢性炎症,导致存在于发炎的部位的细胞类型的渐进转变,其特征在于来自炎症过程的组织的同时破坏和愈合。Kindt,等人(2006)Kuby Immunology[第6版]。
[0023] T细胞参与炎症的传播。首次接触实验的T细胞的分化导致T细胞亚群,每一个亚群具有不同的细胞因子表达谱以发挥不同免疫功能。通过单独的信号传导途径的激活,该过程导致分化的辅助T(Th)细胞(称为Th1细胞、Th2)和Th17,并诱导抑制Th细胞的调节性T细胞。这些不同的细胞对抵御感染性疾病和癌症是非常重要的;然而,当异常时,它们可负责慢性炎性疾病。一种这样的疾病是炎性肠病(IBD),其中每个T细胞亚群可在疾病中起作用。Zenewicz,等人(2009)Trends in Molecular Medicine 15(5):199–207。因此,T细胞参与了自身免疫疾病和炎性病症,在本领域存在对用于治疗自身免疫病症和炎性疾患的新型分子的需要,所述分子可调节T细胞的活性。
[0024] 发明概述
[0025] 本发明涉及VISTA(例如,VISTA-Ig)的可溶性形式,包括可全身性施用的具有增强的效力的VISTA-Ig的最优化形式(包括包含接头多肽的多聚体形式)用于治疗和/或预防有此需要的受试者的自身免疫性、过敏性和炎性疾患的用途。示例性病症包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、狼疮疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、药物诱导的狼疮和新生儿狼疮,以及过敏性或炎性呼吸病例如哮喘、过敏性鼻炎、花粉症、荨麻疹、血管炎和丘-施综合征以及其它如下文中公开的过敏性、炎性和自身免疫疾病。
[0026] 本发明还提供了改进的VISTA融合蛋白,其包含一个或多个(即,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)拷贝的多肽和一个或多个免疫球蛋白(Ig)以及任选地接头肽,所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多核苷酸序列的胞外域或为至少50、100、
150、200、250、275或300个基酸的其片段具有至少约90%序列同一性,所述接头肽介于融合多肽中的VISTA多肽与另一个多肽,优选Ig多肽例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区片段之间,所述Ig多肽任选地可经诱变以改变(增强、改变或减弱)补体结合和/或FcR结
合。
[0027] 在一个实施方案中,多肽可与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的其片段具有至少约95%序列同一性。
[0028] 在一个实施方案中,Ig蛋白可以为IgG、IgG1、IgG2、IgG2a、IgM、IgE或IgA,其任选地可经诱变以改变(增强、改变或减弱)补体结合和/或FcR结合。在一个实施方案中,Ig蛋白可以为人IgG1的恒定区和铰链区,其任选地可经诱变以改变(增强、改变或减弱)补体结合和/或FcR结合。
[0029] 在一个实施方案中,融合蛋白中的VISTA的胞外域包含与氨基酸残基32–190或与可包含氨基酸16–194的VISTA的胞外IgV结构域具有至少90、95、96、97、98、99或100%同一性的多肽。在一个实施方案中,融合蛋白包含至少2个拷贝的VISTA蛋白或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的其片段和IgG1或IgG2a。在另一个实施方案中,融合蛋白包含至少3或4个拷贝的VISTA蛋白和IgG1或IgG2a,任选地介入增强所得融合
多肽的效力的接头肽,例如包含丝氨酸和/或甘氨酸残基的接头。
[0030] 在一个实施方案中,融合蛋白包含至少2个拷贝的VISTA蛋白和IgG1Fc或非FcR结合IgG1。在一个实施方案中,融合蛋白包含至少4、5或6个拷贝的VISTA蛋白和IgG1或IgG2a。在一个实施方案中,融合蛋白包含至少4个拷贝的VISTA蛋白和IgG1Fc或非FcR结合IgG1。
[0031] 在一个实施方案中,分离的多聚体VISTA蛋白可包含至少2个拷贝的与可包含SEQ ID NO:2、4或25的多肽序列的胞外域或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的其片段具有至少约90%同一性的多肽。在另一个实施方案中,多肽可与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的其片段具有至少约95%序列同一性。在另一个实施方案中,多肽可与为至少50氨基酸长的所述VISTA多肽的胞外域的片段或为至少75、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段具有至少约90%序列同一性。
[0032] 在另一个实施方案中,所述VISTA多肽的胞外域的片段可以为至少约75个氨基酸长。在另一个实施方案中,所述VISTA多肽的胞外域的片段可以为至少约100个氨基酸长。在另一个实施方案中,所述VISTA多肽的胞外域的片段可以为至少约125个氨基酸长。
[0033] 在另一个实施方案中,多聚体VISTA蛋白包含至少3个拷贝的所述胞外域或其片段。在另一个实施方案中,多聚体VISTA蛋白包含至少4个拷贝的所述胞外域或其片段。在另一个实施方案中,多聚体VISTA蛋白包含至少5个拷贝的所述胞外域或其片段。在另一个实施方案中,多聚体VISTA蛋白包含至少6个拷贝的所述胞外域或其片段。
[0034] 在另一个实施方案中,可将VISTA的胞外域或片段连接于寡聚化结构域的N末端。在另一个实施方案中,寡聚化结构域可以为GCN4、COMP、SNARE、CMP、MAT、含1个NLRC的LLR、结合NOD2核苷酸的NLRC2、含1个NLRC的LRR、结合NOD2核苷酸的NLRC2或PSORAS1。
[0035] 在一个实施方案中,组合物可包含VISTA融合蛋白。在一个实施方案中,组合物可包含多聚体VISTA蛋白。在另一个实施方案中,组合物可以是药物组合物。在另一个实施方案中,药物组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或溶液。在另一个实施方案中,组合物还可包含至少一种其它免疫抑制剂。在另一个实施方案中,免疫抑制剂可以为PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、ICOS蛋白或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段或对于上述任一种是特异性的抗体。
[0036] 在一个实施方案中,治疗或预防有此需要的受试者的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0037] 在一个实施方案中,用于治疗或预防炎症的组合物可包含有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0038] 在另一个实施方案中,有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白用于制造用于治疗炎症的药物的用途。
[0039] 在另一个实施方案中,受试者可具有炎性疾患。
[0040] 在另一个实施方案中,炎性病症可为反酸/胃灼热、粉刺、寻常痤疮、过敏和敏感性、阿尔茨海默病、哮喘、动脉粥样硬化和血管闭塞性疾病,任选地动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌梗死、中风、周围性血管疾病或血管支架再狭窄、自身免疫疾病、支气管炎、癌症、心肌炎、白内障、脂泻病、慢性疼痛、慢性前列腺炎、肝硬化、结肠炎、结缔组织疾病,任选地系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎或干燥综合征、膜病、克罗恩病、结晶性关节病,任选地痛风、假痛风、焦磷酸沉积病、痴呆、皮炎、糖尿病、眼睛干涩、湿疹、水肿、气肿、纤维肌痛、胃肠炎、牙龈炎、肾小球肾炎、心脏病、肝炎高血压、超敏反应、炎性肠病、炎性疾病(包括外伤或缺血的后果)、胰岛素抵抗、间质性膀胱炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、关节疼痛、关节炎、类风湿性关节炎、莱姆病、代谢综合征(X综合征)、多发性硬化症、肌炎、肾炎、肥胖症、眼部疾病(包括葡萄膜炎)、骨质减少、骨质疏松症、帕金森病、盆腔炎、牙周病、多动脉炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、银屑病、再灌注损伤、风湿性关节炎、风湿性疾病,任选地类风湿性关节炎、骨关节炎或银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、鼻窦炎、干燥综合症、痉挛性结肠、脊椎关节病,任选地强直性脊柱炎、反应性关节炎或赖特综合征、系统性念珠菌病、炎、移植排斥、UTI’s、阴道炎、血管疾病,包括动脉粥样硬化性血管疾病、血管炎病,任选地结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、丘-施综合征或血管炎。
[0041] 在一个实施方案中,治疗自身免疫疾病的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0042] 在一个实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的组合物可包含有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0043] 在另一个实施方案中,有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白用于制备治疗自身免疫疾病的药物的用途。
[0044] 在另一个实施方案中,自身免疫疾病可以是细胞介导的自身免疫疾病。
[0045] 在另一个实施方案中,细胞介导的自身免疫疾病可以是多发性硬化、I型糖尿病、卵巢炎或甲状腺炎。
[0046] 在另一个实施方案中,自身免疫疾病可以是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风关节炎、急性坏死性出血性白质脑炎、急性或慢性鼻窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其它中枢神经系统炎性病症)、急性严重炎症、阿狄森氏病、肾上腺炎、成年型糖尿病(II型糖尿病)、成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、丙种球蛋白缺乏血症、粒细胞缺乏症、血管炎病,包括血管炎,任选地大血管炎,任选地风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)关节炎、过敏性疾病、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、变应性肉芽肿血管炎、过敏性超敏反应紊乱、过敏性神经炎、过敏性反应、斑秃、全秃、Alport综合征、泡炎,任选地过敏性肺泡炎或纤维性肺泡炎、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症)、嗜酸性粒细胞相关疾病,任选地嗜酸性细胞增多症、过敏性症、强直性脊柱炎、脉管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、阿弗他口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性疾病、关节炎,任选地类风湿性关节炎例如急性关节炎、或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、蛔虫病、曲霉肿、含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉病、无精子形成、哮喘,任选地支气管哮喘、支气管哮喘或自身免疫性哮喘、共济失调毛细血管扩张症、共济失调硬化症、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性血管性水肿、自身免疫再生障碍性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自身免疫疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、自身免疫性自主神经机能异常、自身免疫性部疾病,任选地自身免疫性内耳病(AGED)、自身免疫性内分泌障碍性疾病(包括甲状腺炎)例如自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肠病综合征、自身免疫性腺衰竭、自身免疫性听力损失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性血液病、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病、自身免疫多腺体综合征I型、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫介导的胃肠疾病、神经元轴突神经病、巴娄病、白塞氏病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、良性淋巴细胞性脉管炎、伯格氏病(IgA肾病)、养人肺、失明、伯克氏病、闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP、支气管炎、支气管肺曲霉病、布鲁顿综合征、大疱性类疱疮、卡普兰综合征、心肌病、心血管缺血、Castleman综合征、脂泻病、口炎性腹泻(麸质性肠病)、小脑变性、脑缺血、以及伴随血管化的疾病、查加斯病、离子通道病,任选地癫痫、CNS的离子通道病、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、一种自身免疫性血液疾病、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性过敏性肺炎、慢性炎性关节炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性顽固性炎症、慢性皮肤粘膜念珠菌病、慢性神经病变,任选地IgM多发性神经病或IgM介导的神经病变、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺部炎性疾病、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、丘-施综合征、疤痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、CNS炎性疾病、CNS血管炎、乳糜泻、耳蜗前庭综合征、冷凝集素疾病、息肉状结肠炎、结肠炎例如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症、先天性心脏传导阻滞、先天性风疹感染、库氏阳性贫血、冠状动脉疾病、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象)、克罗恩病、冷球蛋白血症、库欣综合征、睫状体炎,任选地慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退化性关节炎、脱髓鞘性疾病,任选地自身免疫性脱髓鞘性疾病、脱髓鞘性神经病、登革热、疱疹样皮炎和疱疹样皮炎、皮炎(包括接触性皮炎)、皮肌炎、含急性炎症成分的皮肤病、德维克病(视神经脊髓炎)、糖尿病大动脉疾病、糖尿病性肾病、糖尿病视网膜病变、戴-布二氏贫血、弥漫性肺间质纤维化、扩张型心肌病、盘状狼疮、涉及白细胞渗出的疾病、心肌梗塞后综合征、杜普伊特伦挛缩、埃可病毒感染、湿疹(包括过敏性或异位性湿疹)、脑炎例如拉斯森脑炎和边缘叶和/或脑干脑炎、脑脊髓炎,任选地过敏性脑脊髓炎或变应性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、子宫内膜增生、心内膜炎、内分泌性眼病、子宫内膜异位症心内膜心肌纤维化、晶状体过敏性内眼球炎、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、嗜酸性筋膜炎、流行性角结膜炎、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、巩膜外层、表层巩膜炎、EB病毒感染、持久性隆起性红斑、多形性红斑、麻风结节性红斑、结节性红斑、胎儿成红细胞增多病、食管运动功能障碍、原发性混合性冷球蛋白血症、筛窦、埃文斯综合征、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏症、农民肺、风湿性发热、费尔提氏综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、丝虫病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、食物中毒、额窦、胃萎缩、巨细胞关节炎(颞动脉炎)、巨细胞肝炎、巨细胞性多肌痛、肾小球性肾炎、具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)例如慢性或急性肾小球肾炎(例如,原发性GN)、古德帕斯彻氏综合症、痛风性关节炎、粒细胞输注相关综合征、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病)、伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、滴状银屑病、血红素尿症发作、Hamman-Rich病、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本甲状腺炎、血色沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、溶血性贫血、甲型血友病、过敏性紫癜、妊娠疱疹、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低丙球蛋白血症、性腺机能减退、甲状旁腺功能减退症、特发性糖尿病性尿崩症、特发性面神经瘫痪、特发性甲状腺功能减退症、特发性IgA肾病、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、特发性肾病综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgE介导性疾病,任选地过敏性症和过敏性或异位性鼻炎、ILgG4-相关性硬化性疾病、区域性回肠炎、免疫复合物性肾炎、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、免疫介导型GN、免疫调节性脂蛋白类,包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、包涵体肌炎、感染性关节炎、因抗精子抗体而引起的不育、全部或部分葡萄膜的炎症、炎性肠道疾病(IBD)、炎性增生性皮肤疾病、炎性肌病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、肺间质纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎、少年关节炎、幼年型皮肌炎、青少年糖尿病、幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、幼年型类风湿性关节炎、川崎综合征、干燥性角结膜炎、锥虫病、兰伯特-伊顿综合征、利什曼病、麻风病、白细胞减少、白细胞粘附缺陷病、白细胞分裂性血管炎、白细胞减少症、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA皮肤病、线性IgA病(LAD)、吕弗勒氏综合征、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎、莱姆病、淋巴细胞性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自身免疫性不育、上颌窦、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN),包括I型和II型以及快速进展性GN、膜性GN(膜性肾病)、梅尼埃病、脑膜炎、显微镜性结肠炎、显微镜下多血管炎、偏头痛、微小病变性肾病、混合性结缔组织病(MCTD)、传染性单核细胞增多症、莫伦氏溃疡、姆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病变、多发性内分泌失调、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)例如视神经脊髓型MS、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉疾病、重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力、重症肌无力、心肌病、肌炎、发作性睡病、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎以及自身免疫性炎性肠道疾病、坏死性、皮肤性、或过敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病、肾病综合征、神经性疾病、视神经脊髓炎(德维克氏)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、中性粒细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多症、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼睛和眼眶炎性疾病、眼疤痕性类天疱疮、卵巢炎、交感神经性眼炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全血细胞减少症、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征,包括神经病学副肿瘤综合征,任选地兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、寄生虫病例如利什曼虫病、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕-罗二氏综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳综合症、细小病毒感染、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮)、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(pernicious anemia)(恶性贫血(anemia perniciosa))、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺硬变、POEMS综合征、I、II和III型结节性多动脉炎、原发性慢性多发性关节炎、多软骨炎(例如,顽固性或复发性多软骨炎)、多内分泌自身免疫疾病、多内分泌衰竭、多腺体综合征,任选地自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、多发性神经病、急性多神经根炎、心脏切开后综合征、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性肝硬化、原发性甲状腺功能减退症、原发性特发性粘液水肿、原发性淋巴细胞增多,其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症,任选地良性单克隆丙球蛋白病和意义未定的单克隆球蛋白病、MGUS、原发性粘液性水肿、原发性进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕性皮炎、进行性系统性硬化症、增生性关节炎、银屑病如斑型银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、肺泡蛋白沉积症、肺嗜酸性细胞浸润症、纯红细胞性贫血和再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎、脓疱型银屑病和指甲银屑病、肾盂炎、坏疽性脓皮病、德奎尔万氏甲状腺炎、雷诺现象、反应性关节炎、复发性流产、血压反应降低、反射性交感神经营养不良、顽固性口炎性腹泻、赖特病或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、不宁腿综合征、视网膜自身免疫疾病、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、风疹病毒感染、Sampter综合征、结节病、血吸虫病、施密特综合征、SCID和EB病毒相关疾病、巩膜、巩膜炎、指端硬皮病、硬皮病,任选地系统性硬皮病、硬化性胆管炎、播散性硬化、硬化症例如系统性硬化症、感觉神经性听力损失、血清反应阴性的脊柱关节病、席汉氏综合征、舒尔曼综合征、矽肺、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫症、蝶窦炎、史帝文-强生综合征、僵人(或僵人)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤型红斑狼疮、突发性听力丧失、苏萨克综合征、西德纳姆舞蹈病、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮SLE、皮肤型SLE、系统性坏死性血管炎、ANCA相关性血管炎,任选地丘-施血管炎或综合征(CSS)、脊髓痨、高安动脉炎、毛细血管扩张症、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少,包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症例如特发性血小板减少性紫癜(ITP),包括慢性或急性ITP、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺毒症、组织损伤、托-亨二氏综合征、中毒性表皮坏死松解症、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横贯性脊髓炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹,任选地慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹,包括慢性自身免疫性荨麻疹、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、心瓣炎、血管功能障碍、血管炎、椎关节炎、大疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA))、Wiskott-Aldrich综合征、或x连高IgM综合征。
[0047] 在另一实施方案中,方法、用途或组合物还可包括施用另一种免疫调节剂和/或抗原。在另一个实施方案中,免疫调节剂可以是TLR激动剂(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11激动剂),可以是1型干扰素,任选地α干扰素或β干扰素、或CD40激动剂、或IL-6拮抗剂或TNF拮抗剂例如对于前述的任一种是特异性的抗体或抗体片段。
[0048] 在一个实施方案中,治疗炎性疾病的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0049] 在一个实施方案中,用于治疗炎性疾病的组合物可包含有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0050] 在一个实施方案中,有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。
[0051] 在一个实施方案中,治疗的所述疾病选自I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、风湿性疾病、过敏症、哮喘、过敏性鼻炎、皮肤病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植排斥、移植物抗宿主病、链球菌感染后和自身免疫性肾衰竭、败血性休克、全身炎症反应综合征(SIRS)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和毒液螯入;自身炎性疾病、骨关节炎、结晶性关节炎、囊炎、关节病、腱炎、韧带炎和创伤性关节损伤。
[0052] 在一个实施方案中,所治疗的疾病可以是多发性硬化、狼疮病症例如SLE、呼吸疾病例如哮喘、荨麻疹、血管炎、Chrurg-Strauss综合征、银屑病性关节炎、或类风湿性关节炎。
[0053] 在一个实施方案中,治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0054] 在一个实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的组合物可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0055] 在一个实施方案中,有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白用于制造用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的药物的用途。
[0056] 在一个实施方案中,移植物抗宿主病可以是急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病。
[0057] 在一个实施方案中,所治疗的患者可具有移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,任选地其中所述患者表现出急性GVHD,包括但不限于腹痛、腹部绞痛、腹泻、发烧、黄疸、皮疹、呕吐和体重减轻。在一个实施方案中,患者可具有慢性移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,包括但不限于干眼、口干、脱发、肝炎、肺疾病、胃肠道紊乱、皮疹和皮肤增厚。在一个实施方案中,患者具有或将要接受异体干细胞或骨髓移植。
[0058] 在一个实施方案中,患者可具有或将可接收自体干细胞或骨髓移植。
[0059] 在一个实施方案中,治疗具有过敏性、炎性或自身免疫疾病的个体的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0060] 在一个实施方案中,用于治疗具有过敏性、炎性或自身免疫疾病的个体的组合物可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白。
[0061] 在一个实施方案中,有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig或多聚体VISTA蛋白用于制造用于治疗过敏性、炎性或自身免疫疾病的药物的用途。
[0062] 在另一个实施方案中,过敏性、炎性或自身免疫疾病可选自银屑病、皮炎、疱疹样皮炎;系统性硬皮病、硬化症;克罗恩病、溃疡性结肠炎;呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征;ARDS);皮炎;脑膜炎;脑炎;葡萄膜炎;结肠炎;肾小球肾炎;湿疹、哮喘、动脉粥样硬化;白细胞粘附缺陷病;类风湿性关节炎;全身性红斑狼疮(SLE);糖尿病,任选地I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病;多发性硬化症;雷诺氏综合征;自身免疫性甲状腺炎;过敏性脑脊髓炎;干燥综合征;幼发型糖尿病;结核病、结节病、多发性肌炎、肉芽肿病和血管炎;恶性贫血(阿狄森氏病);移植排斥疾病、GVHD、中枢神经系统(CNS)炎性疾病;多器官损伤综合征;溶血性贫血、冷沉淀球蛋白血症或库氏阳性贫血;重症肌无力;抗原抗体复合物介导的疾病;抗肾小球基底膜疾病;抗磷脂综合征;过敏性神经炎;格雷夫斯病;兰伯特-伊顿肌无力综合征;大疱性类天疱疮;天疱疮;自身免疫性多内分泌腺病;赖特病;僵人综合征;白塞氏病;巨细胞动脉炎;免疫复合物性肾炎;IgA肾病;IgM多发性神经病;免疫性血小板减少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板减少。
[0063] 在另一个实施方案中,疾病可选自关节炎、类风湿性关节炎、急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风关节炎、慢性炎性关节炎、退化性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、椎关节炎和幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性增生性皮肤疾病、银屑病如斑块型银屑病、滴状银屑病、脓疱型银屑病和指甲银屑病、皮炎(包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎和疱疹样皮炎)、x连锁高IgM综合征、荨麻疹例如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹,包括慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病、系统性硬皮病、硬化症、系统性硬化症、多发性硬化症(MS)、视神经脊髓型MS、原发性进展型MS(PPMS)、复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调硬化症、炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎、自身免疫性炎性肠道疾病、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、表层巩膜炎、呼吸窘迫综合征、成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、一种自身免疫性血液疾病、类风湿性脊柱炎、突发性听力丧失、IgE介导的疾病例如过敏反应和过敏性和特应性鼻炎、脑炎、拉斯马森脑炎、边缘叶和/或脑干脑炎、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜炎、肾小球肾炎(GN)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜性增生性GN(MPGN)、快速进展性GN、过敏性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷病、系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮例如皮肤型SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)、幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性糖尿病性尿崩症、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病、淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎病,包括血管炎、大血管炎、风湿性多肌痛、巨细胞(高安氏)动脉炎、中血管炎、川崎病、结节性多动脉炎、显微镜下多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎,例如丘-施血管炎或综合征(CSS)、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫再生障碍性贫血、库氏阳性贫血、戴-布二氏贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、恶性贫血(恶性贫血)、阿狄森氏病、纯红细胞性贫血和再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏症、甲型血友病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统炎性疾病、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞氏或白塞病、Castleman综合征、古德帕斯彻氏综合症、雷诺氏综合征、干燥综合征、史帝文-强生综合征、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮,任选地寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、红斑型天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、赖特病或综合征、免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎、多发性神经病、慢性神经病变、IgM多发性神经病、IgM介导的神经病变、血小板减少、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退症、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎);亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯病、多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)、副肿瘤综合征,包括神经系统副肿瘤性综合征例如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人或僵人综合征、脑脊髓炎、过敏性脑脊髓炎、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力、胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、多灶性运动神经病变、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎、闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP、格林-巴利综合征、伯格氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线状IgA皮肤病、原发性胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征、脂泻病、乳糜泻、口炎性腹泻(麸质性肠病)、顽固性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳部疾病例如自身免疫性内耳病(AGED)、自身免疫性听力损失、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎例如难治性或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、淀粉样变性、巩膜炎、一种非癌性原发性淋巴细胞增多症、一种原发性淋巴细胞增多症,其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症、任选地良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定的单克隆丙种球蛋白病、MGUS、周围神经病变、副肿瘤综合征、离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉疾病、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病、自闭症、炎性肌病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性血液病、纤维肌痛、多发性内分泌失调、施密特综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘性疾病例如自身免疫性脱髓鞘性疾病、糖尿病性肾病、心肌梗塞后综合征、圆形脱毛症、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬皮病)和毛细血管扩张症)、男性和女性自身免疫性不育、混合性结缔组织病、查加斯病、风湿热、复发性流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿血管炎、良性淋巴细胞性脉管炎、Alport综合征、肺泡炎例如过敏性肺泡炎及纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter综合征、卡普兰综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性肺间质纤维化、肺间质纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合征、费尔提氏综合征、丝虫病、睫状体炎例如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、过敏性紫癜、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、埃可病毒感染、心肌病、阿尔茨海默氏病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、埃文斯综合征、自身免疫性腺衰竭、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞性多肌痛、内分泌性眼病、慢性过敏性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变性肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自身免疫疾病、关节炎、支气管炎、慢性阻塞性气道疾病、矽肺、口疮、阿弗他口炎、动脉硬化性疾病、无精子形成、自身免疫性溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症、杜普伊特伦挛缩、晶状体过敏性内眼球炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面神经瘫痪、慢性疲劳综合征、风湿性发热、Hamman-Rich病、感觉神经性听力损失、血红素尿症发作、性腺机能减退、区域性回肠炎、白细胞减少、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感神经性眼炎、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮病、德奎尔万氏甲状腺炎、获得性脾萎缩、因抗精原细胞抗体导致的不育、非恶性胸腺瘤、白癜风、SCID和EB病毒相关疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病例如利什曼虫病、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病症、白细胞粘附缺陷、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性粘液性水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭、周围神经病变、自身免疫多腺体综合征I型、成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色沉着病、心肌病、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦、额窦、上颌窦、或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病例如嗜酸性细胞增多症、肺嗜酸性细胞浸润症、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏性症、血清反应阴性的脊柱关节病、多内分泌自身免疫疾病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病、布鲁顿综合征、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、风湿病、神经性疾病、缺血性再灌注障碍、血压反应降低、血管功能障碍、脉管扩张、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血、以及伴随血管化的疾病、过敏性超敏反应紊乱、肾小球性肾炎、再灌注损伤、心肌或其他组织再灌注损伤、含急性炎症成分的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病、眼睛和眼眶炎性疾病、粒细胞输注相关综合征、细胞因子诱导的毒性、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病视网膜病变、糖尿病大动脉疾病、子宫内膜增生、消化性溃疡、心瓣炎和子宫内膜异位症。
[0064] 在一个实施方案中,制备抗体的方法可包括用VISTA表位免疫动物,取出所述动物的脾脏,制备单细胞悬浮液,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,在杂交瘤选择培养基中培养融合后细胞,培养所得的杂交瘤,筛选特异性抗体的产生,以及选择产生期望的抗体的杂交瘤。
[0065] 在另一个实施方案中,通过方法产生抗VISTA或其抗体片段,所述方法包括用VISTA表位免疫动物,取出所述动物的脾脏,制备单细胞悬浮液,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,在杂交瘤选择培养基中培养融合后细胞,培养所得的杂交瘤,筛选特异性抗体的产生,以及选择产生期望的抗体的杂交瘤。
[0066] 在另一个实施方案中,抗VISTA或其片段可以是人源化、嵌合或单链变体。
[0067] 在一个实施方案中,分离的VISTA拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0068] 在一个实施方案中,治疗或预防有此需要的受试者的炎症的方法可包括施用有效量的分离的VISTA拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0069] 在一个实施方案中,治疗自身免疫疾病的方法可包括施用有效量的分离的VISTA拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0070] 在一个实施方案中,治疗炎性疾病的方法可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0071] 在一个实施方案中,治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0072] 在一个实施方案中,治疗具有过敏性、炎性或自身免疫疾病的个体的方法可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0073] 在一个实施方案中,用于治疗或预防有此需要的受试者的组合物可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0074] 在一个实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的组合物可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0075] 在一个实施方案中,用于治疗炎性疾病的组合物可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0076] 在一个实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的组合物可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0077] 在一个实施方案中,治疗具有过敏性、炎性或自身免疫疾病的个体的组合物可包括施用有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0078] 在一个实施方案中,有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂用于制造用于治疗或预防炎症的药物的用途,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0079] 在一个实施方案中,有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0080] 在一个实施方案中,有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0081] 在一个实施方案中,有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂用于制造用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的药物的用途,其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0082] 在一个实施方案中,有效量的分离的VISTA激动剂或拮抗剂用于制造用于治疗过敏性、炎性或自身免疫疾病的药物的用途,其中所述拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0083] 在一个实施方案中,用于检测样品中的VISTA的方法可包括将样品与抗VISTA抗体或抗体片段接触和检测抗VISTA抗体-VISTA缀合物。在另一个实施方案中,样品可以是生物样品。在另一个实施方案中,抗VISTA抗体结合SEQ ID NO:2、3或5的氨基酸序列。
[0084] 在另一个实施方案中,用于治疗性、诊断性或免疫调节用途的组合物可包含分离的可溶性VISTA(PD-L3)蛋白或VISTA融合蛋白(例如,可溶性VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白)和药学上可接受的载体,所述融合蛋白可包含优选与SEQ ID NO:2、4或5所示的人或鼠VISTA(PD-L3)多肽或由与SEQ ID NO:1或3特异性杂交的基因编码的其直系同源物或片段具有至少70–90%同一性的氨基酸序列,所述氨基酸序列在体内调节VISTA。在一些实施方案中,可将可溶性或多聚体VISTA蛋白直接或间接连接于异源(非VISTA)蛋白或可通过病毒载体或包含其的细胞(例如,转染的免疫细胞例如T细胞)表达所述蛋白。
[0085] 在实施方案中,分离的或重组的VISTA(PD-L3)多肽(例如,蛋白质、多肽、肽或其片段或部分或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段,或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段)。在一个实施方案中,分离的VISTA(PD-L3)多肽或VISTA(PD-L3)融合蛋白包含以下结构域的至少一个:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、、跨膜结构域或胞质结构域。
[0086] 在实施方案中,VISTA(PD-L3)多肽包含以下结构域的至少一个:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、跨膜结构域或胞质结构域,并且还包含与SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列的至少约71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)多肽包含以下结构域的至少一个:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、跨膜结构域或胞质结构域,并且可具有VISTA(PD-L3)活性(如本文中所述)。
[0087] 在一个实施方案中,分离的VISTA蛋白可包含与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域具有至少约90%序列同一性的多肽。在另一实施方案中,多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列具有至少约95%序列同一性。
[0088] 在另一个实施方案中,VISTA多肽包含以下结构域的至少一个:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、跨膜结构域或胞质结构域,并且可由核酸分子编码,所述核酸分子具有在严格杂交条件下与可包含SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的核酸分子的互补序列杂交的核苷酸序列。
[0089] 在另一个实施方案中,多肽的片段或部分可包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列,其中片段包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少15个氨基酸(即,连续氨基酸)。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)多肽包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列或为至少
50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段或由所述序列或片段组成。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)多肽可由核酸分子编码,所述核酸分子可包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列或其互补序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%同一性的核苷酸序列。可由核酸分子编码的VISTA(PD-L3)多肽,所述核酸分子由在严格杂交条件下与可包含SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的核酸分子的互补序列杂交的核苷酸序列组成。
[0090] 在一个实施方案中,VISTA多肽可以是激动剂,其中它们诱导尤其是T细胞免疫的抑制。在另一个实施方案中,VISTA多肽可以是拮抗剂,其中它们干扰抑制。
[0091] 本发明的多肽或其部分,例如其生物活性部分可有效地连接至非VISTA(PD-L3)多肽(例如,异源氨基酸序列)以形成融合多肽。
[0092] 在一个实施方案中,表达载体可包含编码VISTA蛋白的分离的核酸,所述VISTA蛋白可与SEQ ID NO:2、4或5所示的人或鼠VISTA氨基酸序列或其片段或直系同源物或为至少50、100、150、200、250、275或300个氨基酸的片段具有至少约70–99%同一性,任选地将其融合至编码另一种蛋白例如Ig多肽(例如,Fc区)或报告分子的序列;和宿主细胞包含所述载体。
[0093] 在另一个实施方案中,分离的编码VISTA多肽,优选编码可溶性融合蛋白和多聚体VISTA蛋白的分离的核酸分子以及适合作为用于检测VISTA(PD-L3)编码核酸的引物或杂交探针的核酸片段。在一个实施方案中,本发明的VISTA(PD-L3)核酸分子可与SEQ ID NO:1或3中编码VISTA(PD-L3)的核苷酸序列(例如,与核苷酸序列的整个长度)或其互补序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%同一性。
[0094] 在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列具有特定百分比同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在实施方案中,VISTA(PD-L3)核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列,所述多肽具有与SEQ ID NO:2、4或
5的氨基酸序列的整个长度或与其胞外域具有至少约71%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
[0095] 在另一个实施方案中,分离的核酸分子编码人或鼠VISTA或其中的保守区域或功能性结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码可包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子在长度上可以为至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、
1000、1050、1100、1150个核苷酸。在另一实施方案中,核酸分子在长度上可以为至少约50、
100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、
1050、1100、1150个核苷酸并且编码具有VISTA(PD-L3)活性或调节VISTA(PD-L3)功能的多肽。
[0096] 另一个实施方案表征了核酸分子,优选VISTA(PD-L3)核酸分子,其相对于编码非VISTA(PD-L3)多肽的核酸分子特异性检测VISTA(PD-L3)核酸分子。例如,在一个实施方案中,核酸分子在长度上可以为至少约880、900、950、1000、1050、1100、1150个核苷酸,并且在严格条件下与编码SEQ ID NO:2、4或5中显示的多核苷酸的核酸分子或其互补序列杂交。在另一个实施方案中,核酸分子在长度上可以为至少20、30、40、50、100、150、200、250、300个核苷酸,并且在严格条件下与编码VISTA(PD-L3)的片段的核酸分子杂交,例如可在长度上包含至少约20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、
700、750、800、850、900、950个核苷酸,包含编码SEQ ID NO:2、4或5中的VISTA(PD-L3)多肽的SEQ ID NO:1和3中的公开的核酸序列或其互补序列的至少15个(即,15个连续的)
核苷酸,并且在严格条件下与可包含SEQ ID NO:1或3中显示的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子杂交。
[0097] 在一个实施方案中,核酸分子编码天然存在的多肽的等位变体,所述变体包含SEQ ID NO:2或4或5的氨基酸序列,其中核酸分子在严格条件下与可包含SEQ ID NO:1或3或其互补序列的核酸分子的互补序列杂交。
[0098] 本发明的另一个实施方案提供了针对VISTA(PD-L3)核酸分子的分离的反义核酸(例如,针对SEQ ID NO:1或3的VISTA(PD-L3)核酸分子的编码链的反义核酸)。
[0099] 本发明的另一个方面提供了可包含VISTA(PD-L3)核酸分子的载体。在某些实施方案中,载体可以是重组表达载体。
[0100] 在另一个实施方案中,宿主细胞包含本发明的载体。在另一个实施方案中,宿主细胞包含本发明的核酸分子。本发明还提供了用于通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞,例如哺乳动物宿主细胞例如非人哺乳动物细胞来产生多肽,优选VISTA(PD-L3)多肽的方法,所述细胞包含重组表达载体,以便可产生多肽。
[0101] 在一个实施方案中,靶向从VISTA DNA转录的VISTA mRNA的siRNA分子可包含SEQ ID NO:1或3的核酸序列。在另一个实施方案中,靶向从VISTA DNA转录的编码SEQ ID NO:2、4或5所示的氨基酸序列的VISTA mRNA的siRNA分子。在另一实施方案中,靶向VISTA的siRNA分子可包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列。在另一个实施方案
中,靶向VISTA的ORF或UTR区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:38–47的任一个的核酸序
列。在另一个实施方案中,仅靶向VISTA的UTR区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:48–57的任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中,仅靶向VISTA的ORF区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:58–67的任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中,靶向VISTA的siRNA分子可由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成。在一个实施方案中,靶向VISTA的ORF或UTR区的siRNA分子可由SEQ ID NO:38–47的任一个的氨基酸序列组成。在一个实施
方案中,仅靶向VISTA的UTR区的siRNA分子可由SEQ ID NO:48–57的任一个的氨基酸序列组成。在一个实施方案中,仅靶向VISTA的ORF区的siRNA分子可由SEQ ID NO:58–67的任一个的氨基酸序列组成。
[0102] 在另一实施方案中,组合物可包含含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在另一实施方案中,组合物可包含含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在另一实施方案中,组合物可以是药物组合物。
[0103] 在一个实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的方法可包括施用靶向VISTA的包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在一个实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的方法可包括施用靶向VISTA的由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的组合物可包含含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗自身免疫疾病的组合物可包含由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途。在另一实施方案中,由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途。
[0104] 在一个实施方案中,用于治疗炎性疾病的方法可包括施用靶向VISTA的包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在一个实施方案中,用于治疗炎性疾病的方法可包括施用靶向VISTA的由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗炎性疾病的组合物可包含含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗炎性疾病的组合物可包含由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。在另一实施方案中,由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子用于制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。
[0105] 在一个实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病的方法可包括施用靶向VISTA的包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在一个实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病的方法可包括施用靶向VISTA的由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病的组合物可包含含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子。在另一实施方案中,用于治疗移植物抗宿主病的组合物可包含由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子。在另一实施方案中,含有SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列的siRNA分子用于制造用于治疗移植物抗宿主病的药物的用途。在另一实施方案中,由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成的siRNA分子用于制造用于治疗自身免疫疾病的药物的用途。
[0106] 在一个实施方案中,拮抗剂可特异性结合至VISTA(PD-L3)蛋白,所述蛋白可包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列或其片段或直系同源物。在实施方案中,结合剂在体外或体内调节(激动或拮抗)VISTA活性。
[0107] 在一个实施方案中,VISTA拮抗剂可以是VISTA配体。在另一个实施方案中,VISTA配体可以是蛋白质。在另一个实施方案中,VISTA拮抗剂可以是抗体或其抗体片段、肽、糖生物碱、反义核酸、核酶、维甲酸、avemir、小分子或其任意组合。
[0108] 在一个实施方案中,VISTA拮抗剂可具有功能性质,包括但不限于调节VISTA(PD-L3)对免疫的特定作用,例如蛋白对TCR活化的抑制作用、蛋白对CD4T细胞响应抗CD3的增殖的抑制作用、同种CD4T细胞的抗原特异性增殖反应的抑制、VISTA(PD-L3)对特定细胞因子(例如,IL-2和γ干扰素)的表达的抑制作用。
[0109] 在一个实施方案中,拮抗剂,任选地蛋白质性质的拮抗剂,特异性结合至VISTA多肽、多聚体VISTA多肽拮抗剂或VISTA融合蛋白。在另一个实施方案中,拮抗剂,任选地蛋白质性质的拮抗剂,可表现出抗肿瘤或抗转移活性。在另一个实施方案中,拮抗剂,任选地蛋白质性质的拮抗剂可特异性结合包含残基1–20、20–40、30–50、60–80、70–90、80–100或90–110中包含的表位。在另一个实施方案中,拮抗剂,任选地蛋白质性质的拮抗剂可结合所述VISTA蛋白的IgV、茎区、胞质区或跨膜区中包含的表位。在另一个实施方案中,拮抗剂,任选地蛋白质性质的拮抗剂可引发以下活性的至少一个活性:(a)上调细胞因子;(b)诱导T细胞的扩增,(c)促进抗原特异性T细胞免疫;或(d)促进CD4+和/或CD8+T细胞活化。
[0110] 在另一个实施方案中,分离的结合剂,优选抗体或抗体片段,可特异性结合至VISTA(PD-L3)蛋白,所述蛋白可包含SEQ ID NO:2、4或5中所示的氨基酸序列或其变体、片段或直系同源物。在实施方案中,结合剂在体外或体内调节(激动或拮抗)VISTA活性。在一个实施方案中,结合剂可以是激动性或拮抗性抗VISTA抗体。
[0111] 在一个实施方案中,抗VISTA(PD-L3)抗体可具有功能性,包括但不限于调节VISTA(PD-L3)对免疫的特定作用,例如蛋白对TCR活化的抑制作用、蛋白对CD4T细胞响应抗CD3的增殖的抑制作用、同种CD4T细胞的抗原特异性增殖反应的抑制、VISTA(PD-L3)对特定细胞因子(例如,IL-2和γ干扰素)的表达的抑制作用。
[0112] 在另一实施方案中,抗体,任选地单克隆或多克隆抗体可特异性结合VISTA(PD-L3)多肽包括人VISTA多肽。
[0113] 在一个实施方案中,分离的抗体或其抗体片段特异性结合至VISTA多肽,多聚体VISTA多肽或VISTA融合蛋白。在另一个实施方案中,抗体或其抗体片段特可表现出抗肿瘤或抗转移活性。在另一个实施方案中,抗体或其抗体片段特可特异性结合残基1–20、20–40、30–50、60–80、70–90、80–100或90–110中包含的表位。在另一个实施方案中,抗体或其抗体片段可特异性结合所述VISTA蛋白的IgV、茎区、胞质区或跨膜区中包含的表位。在另一个实施方案中,抗体或其抗体片段可引发以下活性的至少一个活性:(a)上调细胞因子;(b)诱导T细胞的扩增,(c)促进抗原特异性T细胞免疫;或(d)促进CD4+和/或
CD8+T细胞活化。在另一个实施方案中,抗体或片段可以是重组的。在另一个实施方案中,抗体或其抗体片段特可具有抗肿瘤活性。在另一个实施方案中,抗体片段可以是能够结合抗原的抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、CDR、互补位或部分。在另一个实施方案中,抗体可以是嵌合的、人源化的、抗独特型的、单链的、双功能或共特异性的。在另一个实施方案中,可将抗体或片段直接或间接缀合于标记、细胞毒性剂、治疗剂或免疫抑制剂。在另一实施方案中,所述标记可以是化学发光标记、顺磁性标记、MRI对比剂、荧光剂、生物发光剂或放射性标记。
[0114] 在一个实施方案中,本发明提供了抗VISTA抗体及其抗体片段。在一个实施方案中,抗体片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv片段。在一个实施方案中,抗体及其抗体片段可包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变抗体(scFv)、IgNAR、SMIP、骆驼体(camelbody)或纳米抗体。在另一个实施方案中,重组蛋白可包含抗VISTA抗体的高变区并且选择性结合VISTA。在另一个实施方案中,抗体片段可选择性结合可包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列的VISTA。
[0115] 此外,可将VISTA(PD-L3)多肽(或其生物活性部分)或VISTA(PD-L3)分子的调节剂(例如,抗VISTA抗体)掺入药物组合物,所述组合物任选地可包含药学上可接受的载体。
[0116] 在另一个实施方案中,本发明提供了可包含抗原和调节(增强或抑制)VISTA(PD-L3)活性的试剂疫苗。在实施方案中,疫苗抑制VISTA(PD-L3)与其天然结
合伴侣之间的相互作用。在另一个实施方案中,疫苗可包含抗原和抑制VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的试剂。在另一个实施方案中,疫苗可包含抗原和促进VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的试剂。在一个实施方案中,疫苗可包含赋形剂、佐剂或载体。
[0117] 在一个实施方案中,所述试剂盒可包括VISTA融合蛋白。在另一个实施方案中,所述试剂盒可包括多聚体VISTA蛋白。在另一实施方案中,可将VISTA融合蛋白或多聚体VISTA蛋白直接或间接固定至固相载体。在另一实施方案中,固相载体可以是珠粒、试管、薄片、培养皿或测试条。在另一个实施方案中,固相载体可以是阵列。
[0118] 在另一个实施方案中,免疫细胞可被活化,可包括将免疫细胞与VISTA多肽、VISTA-Ig融合蛋白或抗VISTA抗体接触。在另一个实施方案中,免疫细胞可以为T细胞、B细胞或抗原呈递细胞。根据本发明方法活化的免疫细胞随后可离体扩增并用于治疗和预防多种疾病;例如,已克隆并体外扩增的人T细胞可维持其调节活性。在扩增前,从受试者(例如,哺乳动物例如人、狗、猫、小鼠、大鼠或其转基因物种)中获得T细胞源。T细胞可获自许多来源,包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织和来自感染部位的组织、脾脏组织、肿瘤或T细胞系。T细胞可获自使用本领域普通技术人员已知的多种技术(例如 分离)从受试者采集的一单位血。
[0119] 在另一个实施方案中,用于调节VISTA(PD-L3)活性的方法可包括将能够表达VISTA(PD-L3)的细胞与调节VISTA(PD-L3)活性的试剂,优选抗VISTA(PD-L3)抗体接触,以便细胞中VISTA(PD-L3)活性可被调节。在一个实施方案中,所述试剂抑制VISTA(PD-L3)活性。在另一个实施方案中,所述试剂刺激VISTA(PD-L3)活性。在另一实施方案中,所述试剂干扰或增强VISTA(PD-L3)多肽与其天然结合伴侣之间的相互作用。在一个实施方案中,所述试剂可以是特异性结合至VISTA(PD-L3)多肽的抗体。在另一个实施方案中,所述试剂可以是结合至VISTA(PD-L3)多肽的肽、拟肽或其它小分子。
[0120] 在另一个实施方案中,所述试剂通过调节VISTA(PD-L3)基因的转录、VISTA(PD-L3)mRNA的翻译或VISTA(PD-L3)多肽的翻译后修饰来调节VISTA(PD-L3)
的表达。在另一个实施方案中,可以是具有可以对于VISTA(PD-L3)mRNA的编码链或
VISTA(PD-L3)基因来说是反义的的核苷酸序列的核酸分子。在另一实施方案中,所述试剂可以是靶向VISTA(PD-L3)mRNA的siRNA分子。
[0121] 在一个实施方案中,用于治疗自身免疫疾病或炎性病症的方法可包括向受试者施用可以是VISTA(PD-L3)调节剂的试剂。在一个实施方案中,VISTA(PD-L3)调节剂可以是VISTA(PD-L3)多肽,优选本文中描述的可溶性融合蛋白或多聚体VISTA蛋白或抗VISTA抗体。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)调节剂可以是例如腺病毒载体中的VISTA(PD-L3)核酸分子。在另一个实施方案中,本发明还提供了用调节免疫反应的另外的试剂治疗受试者。
[0122] 在一个实施方案中,调节免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的方法,包括将表达VISTA(PD-L3)的抗原呈递细胞与选自由下列组成的组的试剂接触:一种形式的VISTA(PD-L3)、或调节VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的试剂,使得免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用得到调节,并且评估VISTA与其天然结合伴侣的相互作用。在实施方案中,调节VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的试剂可以为特异性结合至VISTA(PD-L3)的抗体。在一个实施方案中,VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用受到上调。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用受到下调。在一个实施方案中,该方法进一步包括将免疫细胞或抗原呈递细胞与调节免疫反应的另外试剂接触。在一个实施方案中,接触步骤可在体外进行。在另一个实施方案中,接触步骤可在体内进行。在一个实施方案中,免疫细胞选自T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和骨髓细胞。
[0123] 在一个实施方案中,用于抑制免疫细胞的活化的方法可包括抑制细胞中的VISTA(PD-L3)的活性或表达,以便免疫细胞活化可被抑制。在一个实施方案中,用于增强免疫细胞的活化的方法可包括增强细胞中的VISTA(PD-L3)的活性或表达,以便免疫细胞活化可被增强。
[0124] 在另一个实施方案中,用于上调免疫反应的方法可包括施用抑制免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用的试剂。在一个实施方案中,所述试剂包含结合至VISTA(PD-L3)并抑制VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间相互作用的阻断性抗体或小分子。在另一个实施方案中,所述方法进一步包括向受试者施用上调免疫应答的第二试剂。在另一方面,用于下调免疫反应的方法可包括施用刺激免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间相互作用的试剂。
[0125] 在一个实施方案中,用于治疗选自肿瘤、病原体感染、炎性免疫应答或病症,优选地为不太明显的炎性病症,或免疫抑制性疾病的病症的方法可包括施用有效量的VISTA多肽或VISTA-Ig融合蛋白。具体实例包括多发性硬化、甲状腺炎、类风湿性关节炎、II型和I型糖尿病和癌症(晚期和早期形式),包括转移癌(例如膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌),其中VISTA抑制有效抗肿瘤反应。可向受试者施用表达编码抗VISTA抗体或VISTA融合蛋白的核酸的细胞或病毒载体。
[0126] 在一个实施方案中,用于治疗选自移植、过敏、感染性疾病、癌症和炎性或自身免疫疾病(例如炎性免疫疾病)的病症的方法可包括施用有效量的VISTA(PD-L3)蛋白、结合剂或VISTA(PD-L3)拮抗剂或激动剂。在另一个实施方案中,I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、风湿性疾病、过敏症、哮喘、过敏性鼻炎、皮肤病、肠胃疾病例如克罗恩病和溃疡性结肠炎、移植排斥、链球菌感染后和自身免疫性肾衰竭、败血性休克、全身炎症反应综合征(SIRS)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和毒液螯入;自身炎性疾病以及退行性骨和关节疾病(包括骨关节炎、结晶性关节炎和囊炎以及其它关节病)可被治疗,包括施用有效量的VISTA(PD-L3)、结合剂或VISTA(PD-L3)拮抗剂或激动剂。另外,该方法和组合物可包括有效量的VISTA(PD-L3)、结合剂或VISTA(PD-L3)拮抗剂或激动剂,其可用于治疗腱炎、韧带炎和创伤性关节损伤。在一个实施方案中,所述试剂包括刺激VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间相互作用的抗体或小分子。在另一个实施方案中,该方法进一步包括向受试者施用下调免疫反应的第二试剂例如PD-L1、PD-L2或CTLA-4融合蛋白或对于其是特异性的抗体。
[0127] 在实施方案中,将主题VISTA(PD-L3)蛋白、核酸以及VISTA(PD-L3)特异性配体,优选地为对VISTA(PD-L3)的功能具有所需作用的抗体,用于治疗例如下述病症,包括但不限于:癌症、自身免疫疾病、过敏、炎性疾病或感染,更具体地免疫系统疾病,例如重症联合免疫缺陷、多发性硬化、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、淋巴增生综合征、炎性肠病、过敏、哮喘、移植物抗宿主病和移植排斥;对感染性病原体例如细菌和病毒的免疫应答;以及免疫系统癌症,例如淋巴瘤和白血病。在一个实施方案中,调节VISTA的活性试剂可解除T细胞耗尽并且增强对感染性疾病的免疫。
[0128] 在一个实施方案中,用于治疗有此需要的患者的癌症的方法可包括施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白和/或VISTA融合蛋白通过抑制由骨髓树突抑制细胞表达的VISTA的免疫抑制活性来增强抗肿瘤免疫。在另一实施方案中,可发现治疗前的患者在免疫细胞上表达升高的水平的VISTA蛋白。
[0129] 在一个实施方案中,增强放射疗法、化学疗法或抗癌生物制剂的方法可包括在治疗方案中施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白,包括施用放射疗法、化学疗法或抗癌生物制剂。在另一实施方案中,治疗前的患者可具有对所述放射疗法、化学疗法或抗癌生物制剂不起反应的癌症。
[0130] 在一个实施方案中,用于治疗膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤的方法可包括施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白,其中所述载体以早期(非转移)或转移性形式存在,并且VISTA-Ig阻断与其受体的相互作用。
[0131] 在一个实施方案中,用于调节免疫细胞反应的方法可包括在第一信号存在的情况下将免疫细胞与有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白接触,以便免疫细胞的反应被调节。
[0132] 在一个实施方案中,调节有此需要的受试者的Treg细胞的方法可包括施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白。
[0133] 在一个实施方案中,释放VISTA对免疫的抑制性作用的方法可包括施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白。在另一个实施方案中,可发现所治疗的患者在治疗前表达升高水平的VISTA。在另一个实施方案中,可在治疗后监测VISTA水平以评估免疫反应可能已被增强。
[0134] 在一个实施方案中,增强有此需要的受试者的细胞介导的免疫的方法可包括施用有效量的VISTA蛋白、多聚体VISTA蛋白、VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白。
[0135] 在一个实施方案中,用于调节免疫细胞反应的方法可包括在第一信号存在的情况下接触免疫细胞,包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白,以便免疫细胞的反应被调节。在另一个实施方案中,接触可在体外、体内或离体地进行。
[0136] 在一个实施方案中,在T细胞与骨髓源性APC之间的同种相互作用过程中调节T细胞反应的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白。
[0137] 在一个实施方案中,引发有此需要的个体的免疫抑制的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白。
[0138] 在另一个实施方案中,用于降低免疫细胞活化的方法可包括对受试者施用有效量的VISTA(PD-L3)多肽或VISTA-Ig融合蛋白,其中所述VISTA(PD-L3)多肽或VISTA-Ig融合蛋白用作降低免疫细胞活化的抑制信号。在一个实施方案中,免疫细胞活化被抑制。在另一个实施方案中,免疫细胞活化被显著降低。在一个实施方案中,该抑制性信号结合至免疫细胞上的抑制性受体(例如,CTLA-4或PD-1),从而拮抗结合至活化受体的初级信号(例如,通过TCR、CD3、BCR或Fc多肽)。在一个实施方案中,VISTA多肽或VISTA-Ig融合蛋白抑制第二信使产生;抑制免疫细胞增殖;抑制免疫细胞中的效应子功能(例如,减弱吞噬作用、减少抗体产生、降低细胞的细胞毒性、使免疫细胞无法产生介体(细胞因子(例如IL-2)和/或过敏反应介体);或发展无应答性。
[0139] 在一个实施方案中,初级信号可以为结合TCR并引发初级刺激信号的配体(例如,CD3或抗CD3)。TCR配体包括但不限于抗CD3抗体OKT3和抗CD3单克隆抗体G19-4。在一个实施方案中,初级信号可通过其它机制传递给T细胞,这些机制包括蛋白激酶C活化剂例如佛波酯(例如,佛波醇豆蔻酸酯乙酯)和钙离子载体(例如,离子霉素,其升高胞质钙浓度)等。使用此类试剂绕过TCR/CD3复合体但向T细胞递送刺激信号。其它作为初级信号的试剂可包括天然和合成的配体。天然配体可包括具有或不具有呈递的肽的MHC。其它配体可包括但不限于肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、促分裂原(例如PHA)或其它超抗原、肽-MHC四聚体和可溶性MHC二聚体。
[0140] 在另一个实施方案中,用于检测生物样品中的VISTA(PD-L3)核酸分子、蛋白质或多肽的存在性的方法包括将生物样品与能够检测VISTA(PD-L3)核酸分子、蛋白质或多肽的试剂接触,以便可在生物样品中检测出VISTA(PD-L3)核酸分子、蛋白质或多肽的存在可生物样品。该VISTA(PD-L3)表达可用于检测某些疾病部位例如炎症部位。
[0141] 在另一个实施方案中,用于检测生物样品中VISTA(PD-L3)活性的存在性的方法包括将生物样品与能够检测VISTA(PD-L3)活性的指标的试剂接触,以便可在生物样品中检测出VISTA(PD-L3)活性的存在性。在另一实施方案中,用于检测生物样品中可溶性VISTA的方法可包括将生物样品与能够检测VISTA(PD-L3)活性的指标的试剂接触,以便可在生物样品中检测出VISTA(PD-L3)活性的存在性。在另一个实施方案中,用于检测生物样品中的可溶性VISTA的方法可包括将生物样品与能够结合VISTA(PD-L3)的试剂,任选地抗VISTA抗体或抗体片段接触,和检测VISTA抗体复合物的存在性。在另一实施方案中,测量可以是定量的,任选地Western印迹光密度法、色度法或荧光测定法。
[0142] 在另一个实施方案中,用于鉴定VISTA基因中遗传变异存在与否的诊断性测定,包括获得可包含核酸的样品和分析样品,其中所述遗传变异的特征在于以下至少一者:(i)编码VISTA(PD-L3)多肽的基因的异常修饰或突变;(ii)基因的错误调节;以及(iii)VISTA(PD-L3)多肽的异常转录后修饰,其中基因的野生型形式编码具有VISTA(PD-L3)活性的多肽。在一个实施方案中,核酸可以是DNA或mRNA。
[0143] 在一个实施方案中,选择具有作为治疗或免疫调节剂的潜在用途的抗VISTA抗体的方法可包括:(a)用VISTA蛋白、其免疫原性片段或缀合物免疫细胞或宿主;(b)选择表达特异性结合VISTA的抗体的淋巴细胞;(c)选择抗VISTA抗体或其抗体片段;(d)筛选所述抗VISTA抗体或其抗体片段的抑制或增强VISTA(PD-L3)或VISTA的以下活性的至少一个活性的能力:(i)T细胞活化或分化的抑制;(ii)CD4+或CD8+T细胞增殖的抑制,或T细胞对细胞因子产生的抑制;(iii)其中具有(d)中的活性的至少一个活性的抗体或其抗体片段具有作为治疗或免疫调节试剂的潜在用途。
[0144] 在其它实施方案中,选择具有所需的功能性质的抗VISTA(PD-L3)抗体的方法可包括基于所需的功能性质筛选多组针对该蛋白或VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白产生的单克隆抗体和选择所需的抗体,所述性质包括调节VISTA(PD-L3)对免疫的特定作用,例如蛋白对TCR活化的抑制作用、蛋白对CD4T细胞响应抗CD3的增殖的抑制作用、同种CD4T细胞的抗原特异性增殖反应的抑制、VISTA(PD-L3)对特定细胞因子(例如,IL-2和γ干扰素)的表达的抑制作用。
[0145] 在另一个实施方案中,用于鉴定结合对VISTA(PD-L3)多肽或调节其活性的化合物的方法可包括:提供包含具有VISTA(PD-L3)活性的VISTA(PD-L3)多肽的指标组合物,使指标组合物与测试化合物接触,以及测定测试化合物对指标组合物中VISTA(PD-L3)活性的影响,从而鉴定调节VISTA(PD-L3)多肽的活性的化合物。
[0146] 在另一个实施方案中,用于筛选调节VISTA(PD-L3)的活性的化合物的基于细胞的测定可包括将表达VISTA(PD-L3)靶分子的细胞与测试化合物接触,和测定测试化合物调节VISTA(PD-L3)靶分子的活性的能力。
[0147] 在另一个实施方案中,本发明涉及筛选调节VISTA(PD-L3)与目标分子结合的化合物的无细胞的测定,可包括将VISTA(PD-L3)多肽或其生物活性部分与测试化合物接触,并测定测试化合物结合至VISTA(PD-L3)多肽或其生物活性部分的能力。
[0148] 在另一个实施方案中,鉴定在第一和第二抗原浓度下调节VISTA(PD-L3)对T细胞活化或细胞因子产生的影响的化合物,如抗VISTA(PD-L3)抗体的方法,可包括将表达VISTA(PD-L3)靶分子的T细胞与测试化合物在第一抗原浓度下接触,测定测试化合物在第一抗原浓度下调节T细胞增殖或细胞因子产生的能力,将表达VISTA(PD-L3)靶分子的T细胞与测试化合物在第二抗原浓度下接触,以及测定测试化合物在第二抗原浓度下调节T细胞增殖或细胞因子产生的能力,从而鉴定在第一和第二抗原浓度下调节T细胞活化或细胞因子产生的化合物。
[0149] 在其它实施方案中,基于哪种抗VISTA(PD-L3)抗体抑制或促进VISTA(PD-L3)对CD4+和CD+8T细胞分化、增殖和/或细胞因子产生来筛选和选择抗VISTA(PD-L3)抗体以及VISTA(PD-L3)蛋白的组。在另一实施方案中,已被工程化以表达人VISTA的小鼠可用于测试抗人VISTA抗体在调节免疫中的功能。
[0150] 在另一个实施方案中,治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白。在另一个实施方案中,用于治疗下列疾病的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白:移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病、或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病。
[0151] 在另一个实施方案中,本发明提供了分离的或重组VISTA-Ig融合蛋白或编码核酸,其包含(i)至少一个VISTA多肽,其包含与人或鼠VISTA的胞外域或与为至少50个氨基酸的其片段的至少80%序列同一性,(ii)至少一个包含至少5个氨基酸的接头肽,和(iii)至少一个Ig蛋白,优选Ig Fc区或其片段或变体,其中所述肽接头介于VISTA多肽与Ig蛋白之间,并且其中所得的VISTA-Ig融合蛋白相较于比不存在接头的另外的相同的融合蛋白在体内引发更强效的免疫抑制活性。在示例性实施方案中,分离的VISTA融合蛋白可包含至少一个多肽,所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或包含至少50个氨基酸的其片段具有至少约80%序列同一性,和(ii)至少一个包含至少5个氨基酸的接头,和(iii)至少一个Ig Fc蛋白或其片段,其中所述接头介于VISTA多肽与Ig Fc蛋白之间并且所得的VISTA-Ig融合蛋白相较于不存在接头的另外的相同的融合蛋白在体内引发更强效的免疫抑制活性。
[0152] 在另一个示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个多肽,其与人或鼠VISTA的胞外域或为至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少90或95%序列同一性。
[0153] 在另一个示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含任人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区或其片段或变体,其任选地包含至少一个包含一个或多个调节(增强、改变或减弱)补体结合和/或FcR结合或效应子功能的修饰的Fc区。
[0154] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50或更多个甘氨酸氨基酸残基,并且融合蛋白可包含至少2、3或4个各自与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列的胞外域或与包含至少50、100、150、200、250或300个氨基酸的其片段具有至少约80%序列同一性的多肽。
[0155] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中包含至少30、40、50、60、70、80、90、95%或全部的接头残基(包含至少30、40、50、60、70、80或90%的接头)由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成,优选包含至少一个人或鼠Fc区,例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区或鼠IgG2a或IgG2b恒定或Fc区,任选地将其突变以调节(增强或减弱)或改变糖基化、FcR结合、补体结合或效应子功能。
[0156] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少30%的免疫抑制活性。
[0157] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少40%的免疫抑制活性。
[0158] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少50%的免疫抑制活性。
[0159] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少60%的免疫抑制活性。
[0160] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少70%的免疫抑制活性。
[0161] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少30%的免疫抑制活性。
[0162] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少80%的免疫抑制活性。
[0163] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少90%的免疫抑制活性。
[0164] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少100%的免疫抑制活性。
[0165] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少1.1-2倍的免疫抑制活性。
[0166] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少2-3倍的免疫抑制活性。
[0167] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少3-4倍的免疫抑制活性。
[0168] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白可包含至少一个介于VISTA多肽与Ig多肽之间的接头,其中VISTA-Ig融合蛋白在检测T细胞增殖的测定中相较于不存在所述至少一个接头的另外的相同的VISTA-Ig融合蛋白显示强至少4-5、6-7、8-9、9-10或至少10倍的免疫抑制活性。
[0169] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白,包含至少一个VISTA多肽,所述多肽与SEQ ID NO:2、4、5、16–25、36或37的多肽序列或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的片段具有至少约90-95%序列同一性,任选地包含至少一个IgG、IgG1、IgG2、IgG2a、IgM、IgE或IgA多肽,例如至少一个包含人IgG1的恒定区和铰链区的Ig蛋白,和任选地包含至少一个含有氨基酸残基32–190的VISTA的胞外域或包含氨基酸16–194的VISTA的胞外IgV结构域。
[0170] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白包含至少2个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段,和至少2个拷贝的VISTA蛋白和IgG1Fc或非FcR结合IgG1。
[0171] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白包含至少3、4、5、6、7、8或更多个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段和至少一个IgG1或IgG2a。
[0172] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白包含至少3、4、5、6、7、8或更多个拷贝的VISTA蛋白或包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸的其片段以及至少一个IgG1或IgG2a。
[0173] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白包含连接于寡聚化结构域的N末端的VISTA的至少一个胞外域或片段,例如,其中寡聚化结构域为GCN4、COMP、SNARE、CMP、MAT、含1个NLRC的LLR、结合NOD2核苷酸的NLRC2、含1个NLRC的LRR、结合NOD2核苷酸的NLRC2或PSORAS1。
[0174] 在其它示例性实施方案中,前述VISTA-Ig融合蛋白在重组细胞例如酵母、细菌、真菌、昆虫、禽类、爪蟾或哺乳动物细胞中表达。
[0175] 在其它示例性实施方案中,将前述VISTA-Ig融合蛋白与PD-1、PD-L1、PD-2、PD-L2蛋白或融合蛋白或特异性结合前述任一种的抗体或抗体片段组合或与其共施用。
[0176] 在其它示例性实施方案中,将前述VISTA-Ig融合蛋白包含在药学上可接受的组合物中,所述组合物包含治疗有效量的根据本发明的VISTA-Ig融合蛋白或细胞,所述组合物可被采用于胃肠外、静脉内、皮下、经皮肤、口服、肌内、阴道内、口内、肛或鼻腔施用。
[0177] 在示例性实施方案中,这些组合物用于治疗或预防不同的过敏性、炎性或自身免疫疾病(例如先前鉴定的)。优选实例包括GVHD、狼疮病症例如SLE、药物引起的狼疮、银屑病类风湿关节炎和多发性硬化、过敏性呼吸和炎性病症例如哮喘、鼻炎、血管炎和丘-施综合征。
[0178] 在一个实施方案中,移植物抗宿主病(GVHD)可以是移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病、或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病。在另一个实施方案中,所治疗的患者具有移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,任选地其中所述患者表现出GVHD,包括但不限于:腹痛、腹部绞痛、腹泻、发烧、黄疸、皮疹、呕吐和体重减轻。在另一个实施方案中,所治疗的患者具有慢性移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,包括但不限于干眼,口干,脱发,肝炎,肺疾病,胃肠道紊乱,皮疹和皮肤增厚。在另一个实施方案中,患者具有或将要接收异体干细胞或骨髓移植。在另一个实施方案中,患者具有或将接收自体干细胞或骨髓移植。
[0179] 附图详述
[0180] 图1A、B、C、D和E描述序列分析。(A)鼠VISTA(PD-L3)的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。(B)鼠VISTA(PD-L3)(SEQ ID NO:25)与所选B7家族配体之间的胞外Ig结构域的氨基酸序列比对,所述配体包括B7-H1(PD-L1)(SEQ ID NO:26)、B7-DC(PD-L2)
(SEQ ID NO:27)、B7-H3(CD276)(SEQ ID NO:28) 和 B7-H4(B7S1)(SEQ ID NO:29)。(C)VISTA(PD-L3)(SEQ ID NO:30)Ig结构域与B7家族受体的比对,所述受体包括PD-1(SEQ ID NO:31)、CTLA-4(SEQ ID NO:32)、CD28(SEQ ID NO:33)、BTLA(SEQ ID NO:34) 和 IC OS(SEQ ID NO:35)。Ig-v结构域、“.;”Ig-c结构域,“_。”比对使用M USCLE算法(通过Log-Expectation的多序列比较)进行。(D)VISTA(P D-L3)与其它B7家族配体和受体之
间的Ig-V结构域的序列百分比同一性(%)使用ClustalW2程序来计算。(E)显示人(SEQ ID NO:37)与鼠VISTA(PD-L3)(SEQ ID NO:36)之间的序列同源性的序列比对。相同的残基以黑色阴影表示。高度保守和半保守残基分别以深和浅灰色阴影表示。
[0181] 图2描述小鼠VISTA(PD-L3)与其它免疫球蛋白(Ig)超家族成员的系统发生分析。小鼠VISTA(PD-L3)和其它Ig超家族成员(包括CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、PD-1、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-1、B7-2、BTNL2、BTN3A3、BTN2A2和BTN1A1)的全长序列使用PhyML算法(系统发育最大可能性)进行了分析。分支距离在树
分支接合处示出。
[0182] 图3A、B、C、D、E、F和G描述VISTA(PD-L3)的组织表达和造血细胞表达模式。A.小鼠组织的全长VISTA(PD-L3)的RT-PCR。泳道:(1)肌肉(2)心脏(3)眼睛(4)胸腺(5)脾脏(6)小肠(7)肾脏(8)肝脏(9)脑(10)乳腺(11)肺(12)卵巢(13)骨髓。B.经纯化的
造血细胞类型的全长VISTA(PD-L3)的RT-PCR。泳道(1)腹腔巨噬细胞(2)脾CD11b+单
核细胞(3)脾CD11c+DC(4)脾CD4+T细胞(5)脾CD8+T细胞(6)脾B细胞。C-E.对来自
胸腺和脾脏的脾的CD4+和CD8+T细胞上(C)、CD11b+单核细胞上(D)以及脾脏和腹腔的
CD11c+DC亚群上(E)的VISTA(PD-L3)表达的流式细胞分析。(F)还分析了脾B细胞、NK细胞和粒细胞。(G)来自不同组织部位的造血细胞上VISTA(PD-L3)的差异表达,所述部位包括肠系膜淋巴结、外周淋巴结、脾脏、血液和腹腔。显示了来自至少3个独立实验的代表性数据。
[0183] 图4描述了VISTA,一种新型的且结构不同的Ig超家族抑制性配体,其胞外域具有与抗原呈递细胞上展示的B7家族配体PD-L1连同其它CD和B7家族成员的最高同源性。VISTA具有无明显信号传导基序的93aa胞质结构域,除可能的蛋白激酶C结合位点外。
[0184] 图5描述了VISTA(PD-L3)仓鼠单克隆抗体的特异性。过表达融合到RFP的PD-L1或VISTA(PD-L3)的小鼠EL4细胞系使用杂交瘤培养物的上清液进行了染色,并通过流式细胞术进行了分析。示出了两个代表性阳性克隆8D8和6E7。
[0185] 图6描述了在体外培养的脾细胞上VISTA(PD-L3)表达与其他B7家族配体的比较。比较了在造血细胞类型(包括CD4+T细胞、CD11bhi单核细胞和CD11c+DC)上
VISTA(PD-L3)和其他B7家族配体(即PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4)的表达。细胞为新分离的或在体外培养了24小时,被活化以及未活化。CD4+T细胞用结合平板的αCD3(5μg/ml)活化,CD11bhi单核细胞和CD11c+DC用IFNα(20ng/ml)和LPS(200ng/ml)活化。显示了来自三个独立实验的代表性结果。
[0186] 图7A和7B描述了在免疫过程中VISTA(PD-L3)和其他B7家族配体的体内表达模式的比较。在DO11.10TCR转基因小鼠侧腹用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的鸡卵清白蛋白(OVA)免疫。在免疫后24小时采集了引流区和非引流区淋巴结细胞,通过流式细胞术分析了VISTA(PD-L3)、PD-L1和PD-L2的表达。显示了来自至少四个独立实验的代表性结果。
(A)在引流区淋巴结用CFA/OVA而不是用单独的CFA免疫后24小时用诱导了表达高水平
VISTA(PD-L3)的CD11b+细胞群。这些细胞具有F4/80+巨噬细胞和CD11C+树突细胞的混
合表型。(B)在免疫后24小时分析了VISTA(PD-L3)、PD-L1和PD-L2在CD11bhi单核细胞、CD11c+DC和CD4+T细胞上的表达。
[0187] 图8描述了VISTA(PD-L3)在活化CD4+T细胞、CD11b+和CD11c+细胞上的表达响应免疫而丧失。DO11.10小鼠侧腹用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的鸡卵清蛋白(OVA)
免疫。在免疫后48小时采集了引流区和非引流区淋巴结细胞,通过流式细胞术分析了
VISTA(PD-L3)表达。显示了来自2个独立实验的代表性结果。
[0188] 图9A、B、C和D描述了固定的VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白抑制了CD4+和CD8+T细胞增殖。(A)CFSE标记的CD4+和CD8+T细胞通过结合平板的αCD3(具有或不具有共吸收的VISTA(PD-L3)-Ig)刺激。对低CFSE细胞的百分比进行了定量,并示于(B)中。(C)PD-1ko小鼠中CD4+T细胞也被VISTA(PD-L3)-Ig抑制。(D)VISTA(PD-L3)-Ig介导的抑制具有持久性,并可晚发。CD4+T细胞在VISTA(PD-L3)-Ig或对照Ig存在的情况下活化72小时(i)或24小时(ii、iii和iv)。收获24小时预活化的细胞,在规定的条件下再刺激另外48小时。
在72小时培养结束时分析了细胞增殖。(ii)用VISTA(PD-L3)-Ig预活化并用抗CD3再刺
激;(iii)用抗CD3预活化并用VISTA(PD-L3)-Ig再刺激。(iv)用VISTA(PD-L3)-Ig预活
化并用VISTA(PD-L3)-Ig再刺激。对于所有条件分析了平行孔。显示了来自至少四个实验的代表性结果。
[0189] 图10描述了PD-L1-Ig和VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白对CD4+T细胞增殖具有类似的抑制作用。将粗纯化的CD4+T细胞用CFSE标记,用结合平板的αCD3与滴定量的
PD-L1-Ig或VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白一起进行刺激。在72小时时分析了CFSE稀释度,并对低CFSE的细胞的百分比进行了定量。对于所有条件分析了平行孔。显示了来自2个独立实验的代表性结果。
[0190] 图11A和11B描述了VISTA(PD-L3)-Ig对首次接触试验的和记忆CD4+T细胞增殖的抑制性作用。(A)对首次接触试验的(CD25-CD44低CD62Lhi)和记忆(CD25-CD44hiCD62L低)CD4+T细胞亚群进行分选、CFSE标记以及用结合平板的抗CD3(2.5μg/ml)与
VISTA(PD-L3)-Ig或对照Ig一起以指定的比率进行刺激。通过研究CFSE分割特征在72
小时时分析了细胞增殖。计算了通过低CFSE细胞的百分比确定的增殖细胞百分比,并示于(B)中。对于所有条件分析了平行孔。显示了来自两个独立实验的代表性结果。
[0191] 图12A和12B描述了VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白抑制了早期TCR活化和细胞增殖,但不直接诱导细胞凋亡。将粗纯化的CD4+T细胞用结合平板的抗CD3与VISTA(PD-L3)-Ig或者对照Ig一起以1:2的比率(分别为2.5μg/ml和5μg/ml)进行刺激。在24小时和48小时时通过流式细胞术分析了细胞的CD69、CD62L和CD44表达。还针对早期细胞凋亡标志物膜联蛋白V和细胞死亡标志物7-氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞进行了染色。显示了来自两个独立实验的代表性结果。
[0192] 图13A、B、C、D和E描述了VISTA-Ig抑制了CD4+和CD8+T细胞产生细胞因子。(A)和(B)将粗纯化的CD4+T细胞用结合平板的抗CD3和VISTA-Ig或者对照Ig一起以规
定的比率进行刺激。24小时和48小时后采集了培养物上清液。通过ELISA分析了IL-2和I FNγ的水平。(C-D)将CD4+T细胞分选成首次接触试验的(CD25-CD44低CD62Lhi)和记
忆(CD25-CD44hiCD62L低)细胞群。将细胞用结合平板的αCD3和VISTA(PD-L3)-Ig或者
对照Ig以1:2的比率进行刺激。在48小时时收集了培养物上清液,并通过ELISA分析了
IL-2和IFNγ水平。(E)将粗纯化的CD8+T细胞用结合平板的αCD3和V ISTA(PD-L3)-Ig
或者对照Ig以指定的比率进行刺激。通过ELISA分析了培养物上清液中的IFNγ。对于所有条件,合并了6个平行孔的上清液进行ELISA分析。显示了来自至少三个实验的代表性结果。
[0193] 图14A、B、C和D描述了VISTA-Ig介导的抑制可克服被由CD28提供的中等水平的共刺激,但被高水平的共刺激完全逆转,以及通过外源性IL-2部分补救((A)和(B))。小鼠CD4+T细胞通过结合平板的αCD3与VISTA(PD-L3)-Ig或者对照Ig一起以1:1和1:2的比率活化。对于细胞因子补救,将可溶性mIL-2、mIL7、mIL15和mIL-23(均为40ng/ml)加到细胞培养物中(A)。为了研究共刺激作用,将αCD28(1μg/ml)用αCD3和Ig蛋白以指定的比率一起固定(B)。通过研究CFSE分割特征,在72小时时分析了细胞增殖。C-D.为了研究在存在较低水平的共刺激下VISTA(PD-L3)的抑制活性,将滴定量的αCD28用抗CD3(2.5μg/ml)和VISTA-Ig融合蛋白或者对照Ig融合蛋白(10μg/ml)一起包被,以刺激小鼠CD4+T细胞增殖。在72小时时分析了细胞增殖。对增殖的低CFSE细胞的百分比进行了定量,并示于D图中。对于所有条件分析了平行孔。显示了来自三个独立实验的代表性CFSE曲线。
[0194] 图15A、B、C和D描述了在抗原呈递细胞上表达的VISTA(PD-L3)抑制了CD4T细胞增殖((A)、(B)和(C)。将稳定表达MHC II分子I-Ad和共刺激分子B7-2的CHO细胞系
用作亲本细胞系。将细胞用表达VISTA-RFP或RFP对照分子的逆转录病毒转导。分选转导的细胞以实现均一的表达水平。为了测试它们作为抗原呈递细胞的能力,将CHO-VISTA或CHO-RFP细胞用丝裂霉素C处理,并与OVA特异性转基因CD4+T细胞D011.10在滴定量OVA
肽存在的情况下混合。在72小时时通过CFSE分割特征(A-B)或通过氚掺入(C)分析了
DO11细胞的增殖。(D)将骨髓源性树突细胞在10天的培养期中用RFP或B7B-H5-RFP逆转
录病毒转导。对转导的CD11c+RFP+DC和非转导的CD11c+RFP-DC进行分选,并用于在滴定量的OVA肽存在的情况下刺激OVA特异性转基因CD4+T细胞OTII。通过研究CFSE分割在
第3天时分析了细胞增殖。对于所有实验,针对所有条件分析了平行孔,并示出了来自三个独立实验的代表性结果。
[0195] 图16描述了逆转录病毒转导的骨髓源性DC中VISTA(PD-L3)的表面表达水平。将骨髓源性DC(BMDC)在GM-CSF(20ng/mml)存在的情况下培养,并用RFP或者VISTA-RFP逆转录病毒转导,如本文中所述。在第10天,对培养的BMDC分析了VISTA的表面表达水平,并与新分离的腹腔巨噬细胞进行了比较。
[0196] 图17A和B显示了抗PDL3单克隆抗体在被动转移EAE模型中表现出疗效。在此过继转移EAE模型中,将供体SJL小鼠用CFA和PLP肽免疫。在第10天,分离了引流区淋
巴结的总淋巴细胞,在体外用PLP肽、IL-23(20ng/ml)和抗IFNg(10μg/ml)培养了4天。
然后纯化扩增后的CD4T细胞,过继转移至首次接触试验的受体小鼠。监测疾病进展,并按以下评分:0:无疾病;0.5:丧失尾调;1:尾无力;2:尾无力+后肢麻痹;2.5:单后肢瘫痪;
3:双后肢瘫痪;3.5:前肢虚弱;4:后肢瘫痪+单侧前肢瘫痪。当疾病评分达到4时将小鼠处死。*,表示小鼠被处死。
[0197] 图18显示抗原呈递细胞上表达的VISTA抑制CD4+T细胞增殖。
[0198] 图19显示抗VISTA抗体抑制利用MB49肿瘤细胞移植的小鼠中抑制肿瘤生长。
[0199] 图20A、B、C、D和E显示VISTA单克隆抗体在4个不同的小鼠抗肿瘤模型(A、B、C和-D)中的抗肿瘤效果。图21E显示VISTA在ID8模型中的不同细胞上的表达。不同解剖学位置中的骨髓树突细胞上的极高表达。如可看到的,腹水(其中肿瘤生长和白细胞浸润的部位)细胞中的骨髓树突细胞上存在极高水平。
[0200] 图21显示VISTA单克隆抗体对CD40/TLR激动性疫苗(由使用激动性αCD40mab、TLR激动剂和OVA肽组成)的功效的增强作用。
[0201] 图22显示在健康小鼠或发展EAE的小鼠的CNS细胞上的VISTA表达。
[0202] 图23A、B和C,描述了VISTA的序列和结构分析。(A)小鼠VISTA的一级氨基酸序列,Ig-V结构域、茎区和跨膜区分别以粗体、斜体和新罗马字体加以突显。胞外域区域中的半胱氨酸加以下划线表示。(B)使用PD-L1作为模板的小鼠VISTA的比较蛋白质结构模型(蛋白质数据库登录号3BIS)。Ig-V结构域中的5个半胱氨酸残基显示为条。基于该模型,VISTA Ig-V结构域具有B与F链之间的规范二硫键,以及三个额外的半胱氨酸,其中一些可以潜在地形成分子间和分子内二硫键。一个另外的不变的半胱氨酸存在于G链之后的茎区(未描绘)。β链(A-G)被表现为平坦的箭头。C”-D环由箭头标示。(C)几个B7家
族成员与VISTA的Ig-V结构域的多序列比对。在比对上方标记预测的二级结构(分别使
用箭头、弹簧和“T”代表链、螺旋和β转角),其基于VISTA结构模型。VISTA(SEQ ID NO:
15)、PD1L1(SEQ ID NO:11)、PD1L2(SEQ ID NO:12)、B7H4(SEQ ID NO:13)和B7H3(SEQ ID NO:14)。(D)VISTA直系同源物的多序列比对。不变的残基加以红色背景表示,而物理化学保守位置通过红色字母表示。保守氨基酸通过蓝色框标示。基于36个VISTA直系同源蛋白计算保守,但仅显示9个代表。在几乎所有Ig超家族成员中是保守的该规范半胱氨酸对(B和F链)是通过红圈突出显示,然而对于VISTA是特异性的半胱氨酸通过蓝框标显。独特的VISTA半胱氨酸模式在来自鼠(SEQ ID NO:17)、人(SEQ ID NO:16)、袋鼠(SEQ ID NO:
18)、海豚(SEQ ID NO:19)、鸡(SEQ ID NO:20)、爪蟾(SEQ ID NO:21)、斑胸草雀(SEQ ID NO:22)、斑马鱼和河豚(SEQ ID NO:23)的所有直系同源物中是保守的。
[0203] 图24A和B描述了VISTA在肿瘤细胞上过表达克服保护性抗肿瘤免疫。过表达VISTA或RFP对照蛋白的MCA105肿瘤细胞通过逆转录病毒转导产生,并被分选至均匀。为了产生保护性免疫,用经历辐照的MCA105肿瘤细胞,在左胁腹皮下接种首次接触实验的小鼠。(A)14天后,利用活MCA105VISTA或MCA105RFP肿瘤细胞在右胁腹皮下攻击已接种的小鼠。每隔2天监测肿瘤生长。肿瘤尺寸显示为平均值±SEM。显示的是来自3个单独重复
+
的代表性结果。(B)在活肿瘤攻击之前不处理已接种的小鼠,或通过单克隆抗体耗竭其CD4+
和CD8T细胞。如A中一样监测肿瘤尺寸,将其显示为平均值±SEM。显示的是来自2个单
独重复的代表性结果。对于所有实验,比率显示每组小鼠的总数中的荷瘤小鼠的数目。利用不成对Mann-Whitney检验评估统计差异(p-值)。
[0204] 图25A、B、C和D描述了使用特定单克隆抗体的VISTA阻断在体外和体内增强CD4+T细胞反应。(A)单克隆抗体克隆13F3中和VISTA介导的体外抑制。在同种OVA肽存在的+
情况下将A20-RFP和A20-VISTA细胞用于刺激CFSE标记的DO11.10CD4T细胞。如所指定
的,添加20μg/ml VISTA特异性单克隆抗体13F3或对照-Ig。在72小时后分析CFSE稀

释,CFSE 细胞的百分比显示为平均值±SEM。对于所有条件分析平行孔。将(B和C)总
hi - hi +
CD11b 骨髓细胞(B)或CD11b-CD11c 单核细胞(C)和CD11b CD11c骨髓DC(D)(从首次
接触实验的脾细胞分选的)进行辐照,随后用于在OVA肽存在的情况下刺激CFSE标记的
+
OT-II转基因CD4T细胞。通过在72小时培养期的最后8小时过程中掺入滴定的胸苷来测
量细胞增殖,所述细胞增殖显示为平均值±SEM。在所有条件下分析一式三份的孔。
[0205] 图26描述了VISTA-IgG2a减缓实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(多发性硬化的模型)进展。利用175μg MOG/CFA和百日咳毒素(PT)300ng(第0、2天)免疫小鼠以诱导活性EAE。在第14、17和20天,施用150μg VISTA-IgG 2a(n=8)或150μg对照IgG2a(n
=8)。数据显示为平均值±SEM。
[0206] 图27描述了VISTA-IgG1和VISTA-IgG2a对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)进展的治疗效果。利用175μg MOG/CFA和百日咳毒素(PT)300ng(第0、2天)免疫小鼠以诱导活性EAE。在第6天,每周用3个剂量的150μg对照IgG1(n=3)、150μg对照IgG2a(n
=6)、150μg mVISTA-IgG1(n=3)或150μg mVISTA IgG2a(n=6)处理小鼠(总共进行
2周)。数据显示为平均值±SEM。
[0207] 图28描述了VISTA-IgG2a融合蛋白对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)进展的治疗效果。利用175μg MOG/CFA和百日咳毒素(PT)300ng(第0、2天)免疫小鼠以诱导活性EAE。在第14天,每周用3个剂量的PBS(n=6)、100μg对照IgG2a(n=6)、300μg对
照IgG2a(n=6)、100μgVISTA-IgG2a(n=6)或300μg mVISTA IgG2a(n=6)处理小鼠
(总共进行2周)。数据显示为平均值±SEM。
[0208] 图29A和B描述了通过cDNA组织小组的实时PCR分析(Origene)研究VISTA在健康人组织中的表达。(A)VISTA主要在造血组织或包含大量造血组织的组织中表达。这与VISTA在免疫相关功能中的重要性一致。(B)发现表达的表达模式遵照与VISTA的最接近的同源物PD-L1的表达模式相似的趋势。
[0209] 图30描述了单核细胞、树突细胞和约20%的CD4和CD8T细胞中的VISTA蛋白的dim + + +/-
表达。在血液单核细胞的‘巡察’(CD14 CD16)和‘炎性’(CD14CD16 )亚组内和树突细胞的淋巴样和骨髓亚组内观察到VISTA表达。
[0210] 图31A、B、C和D描述了粗纯化的CD4(图31A)和CD8(图31B)T细胞的CFSE稀释的抑制。产生Ig融合蛋白,其由VISTA的胞外域和包含突变以减弱Fc受体结合的人IgG
的Fc区组成。将10μg/ml的VISTA-Ig或对照Ig与2.5μg/ml的抗CD3(OKT3)一起固定
在板上,随后通过CFSE稀释测量增殖。
[0211] 图32A和32B描述了在不同OKT3浓度下进行的人VISTA-Ig和VISTA-Ig的滴定,显示了更高浓度的OKT3可被更高浓度的VISTA克服。
[0212] 图33A、B、C和D描述了在VISTA-Ig存在或不存在的情况下在活化后研究细胞的状态。在2天的培养中,抗CD3对早期活化标志CD25和CD69的上调被VISTA-Ig阻断(图33A和33B)。类似地,在5天的培养后,阻止了表示抗原-经历(antigen-experience)的从CD45RA至CD45RO的表达的偏移(图33C)。VISTA对细胞活力没有影响。图34D显示
VISTA-Ig增加FoxP3的转换。
[0213] 图34A和B描述了由VISTA诱导的抑制,其中将细胞培养在抗CD3和VISTA-Ig上进行2天,随后移至单独的抗CD3上,进行3天。该进一步刺激不能补救抑制(图34A和
34B)。
[0214] 图35A和B显示VISTA-Ig显著减少CD4(图35A)和CD8(图35B)T细胞的IL-10、TNFα和IFNγ的产生,并且存在朝向IL-17产生的适度减少的趋势。
[0215] 图36A、B和C显示抗CD28激动性抗体提供了对T细胞的强效共刺激,从而滴定至培养物中以挑战VISTA抑制。
[0216] 图37显示下文中实施例32中使用的流动门控测定。
[0217] 图38显示了下文中实施例32中使用的体外T细胞增殖测定的结果
[0218] 图39A、B和C显示接头柔性对CFSE标记的人T细胞上的VISTA-Ig活性的影响,所述细胞在2.5ug/ml结合平板的抗CD3和对照Ig或VISTA-Ig存在的情况下培养了5天。
a)来自序列1的huVISTA-Ig。b)来自序列2的不存在柔性接头的huVISTA-Ig。c)来自序
列3的具有丝氨酸/甘氨酸接头的huVISTA-Ig。
[0219] 图40A、B、C和D包括预防性研究:从8周龄开始每隔一日用PBS、150ug对照-IgG2a或mVISTA-IgG2a处理NZBWF1雌性小鼠。对于治疗性研究处理始于第24周。每
周根据体重减轻和蛋白尿监测疾病严重度。数据显示为平均值±SEM。测定对照-IgG2a相对mVISTA-IgG2a之间的统计显著性;p=0.0027(预防)和p=0.0156(治疗),利用不成
对Mann Whitney检验。
[0220] 图41A、B、C和D包括来自以下的单个肾小球的肾的代表性H&E染色的高分辨率切片:A.历史正常的BW肾小球。B.具有中度肾小球炎症的VISTA-Ig处理的小鼠;C.具有严重炎症和充血的对照Ig处理的小鼠;D.具有几乎完全消除的肾小球的另一个对照Ig处理的小鼠。
[0221] 图42包括EAE动物模型中进行的实验的结果,所述结果显示VISTA-IgG2a在活性EAE中的治疗效果。
[0222] 图43A和B包括SLE动物模型中进行的实验的结果,所述结果显示mVISTA-IgG2a在预防SLE发作中的预防性效果。
[0223] 图44A和B包括在SLE动物模型中进行的实验的结果,所述结果显示mVISTA-IgG2a的预防性施用减少蛋白尿并增加存活率。
[0224] 图45包括显示TCR Tg/VISTA-/-小鼠的对EAE的提高的易感性的数据。
[0225] 图46包括显示雌性VISTA KO小鼠中提高的IgG自身抗体的数据。
[0226] 图47包括显示RAG-/-VISTA-/-小鼠中增加的髓细胞产生的实验数据。
[0227] 图48包括显示VISTA-/-小鼠的炎症表型的实验数据。
[0228] 图49显示对OVA的耐受性和致敏均增加靶组织中的Foxp3+Treg,并且活化引流淋巴结中的Treg。用OVA/明矾佐剂对小鼠进行致敏,给其提供单独的OVA(耐受化)或用PBS进行处理。在第7、10、11和12天,利用50μg OVA或PBS进行鼻内给药。在第13天对肺和引流淋巴结细胞的核内Foxp3或表面GARP进行染色,n=5。
[0229] 图50显示肺Treg对过敏原无反应。用OVA/明矾佐剂(致敏)、单独的OVA(耐受化)免疫小鼠或用PBS处理小鼠,完全如图49中一样。在第13天,用CFSE标记肺和引流
淋巴结,将其在过敏原存在的情况下培养4天,随后对核内Foxp3进行染色。在数个独立实验中获得相似的数据。
[0230] 图51显示Foxp3+Treg中Helios的表达在炎症组织中下降,但在引流淋巴结中未下降。对图2中的肺和引流淋巴结细胞的核内Helios进行染色
[0231] 图52显示VISTA在耐受性诱导和过敏原致敏过程中在肺泡巨噬细胞上高度表达。对小鼠施用4个i.n.剂量的单独的过敏原(OVA,耐受化)或过敏原+粘膜佐剂
(OVA+TNF-α)以诱导肺炎。在最后一次攻击后24小时,用单克隆VISTA Ab对BAL或肺组+ + + +
织细胞的巨噬细胞/DC(I-AbCD11c)或淋巴细胞(CD3/B220)的标志物进行染色。在2个
独立实验中获得相似的数据。
[0232] 图53显示固定的VISTA-Ig融合蛋白在体外促进TGF-β介导的表达Foxp3的Treg的诱导。如所指定的,将来自Foxp3受体小鼠的分选的Foxp3GFP-CD25首次接
触实验的CD4+T细胞与结合平板的抗CD3(5μg/ml)±TGF-β(1ng/ml)和对照Ig或
VISTA-Ig(2.5μg/mL)一起培养。在针对诱导表达Foxp3的细胞72小时后研究细胞。
[0233] 图54示意性描述了用于测定VISTA对不同信号传导途径的效应的磷印迹(phosphoblot)测定。
[0234] 图55包括在CD3刺激后不同时间点上的pERK活性的磷印迹。
[0235] 图56包含在与图55中相同的时间点上的上样对照。
[0236] 图57包括表明VISTA选择性抑制ERK1/2活化的数据。
[0237] 图58包括表明VISTA不抑制JNK活化的数据。
[0238] 图59包括表明人和小鼠VISTA-Ig均抑制人和小鼠MLR反应的的人和小鼠MLR实验的结果。
[0239] 图60包括表明NZBWF1小鼠中VISTA-IgG2a的施用不改变炎性单核细胞和T细胞的细胞频率的数据。
[0240] 图61包括显示利用VISTA-IgG2a处理的20周龄NZBWF1小鼠中的Il-17水平的数据。
[0241] 图62和63包含SLE治疗研究中的24周龄NZBWF1小鼠的细胞因子谱。
[0242] 发明详述
[0243] 为了使本文中描述的本发明可以被充分地理解,提供了以下的详细描述。本发明的各种实施例进行了详细说明,并且可以通过所提供的实施例进一步说明。
[0244] 定义
[0245] 除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明或测试本发明,但本文中描述了合适的方法和材料。材料,方法和实施例仅是说明性的,并且无意是限制性的。
[0246] 如本文中的说明书中和下列的整个权利要求中所用的,除非上下文另外明确地指出,否则“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”的含义包括复数所指物。
[0247] 如本文中所用,“活化受体”广义上指结合抗原、复合抗原(例如,在MHC分子的背景下)、Ig融合蛋白、配体或抗体的免疫细胞受体。活化受体包括但不限于T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、细胞因子受体、LPS受体、互补序列受体和Fc受体。例如,T细胞受体存在于T细胞上并与CD3分子相关。T细胞受体在MHC分子的背景下受抗原刺激(以及受多克隆T细胞活化试剂刺激)。通过TCR发生的T细胞活化导致许多变化,如蛋白磷酸化、膜脂质变化、离子流、环核苷酸改变、RNA转录变化、蛋白合成变化以及细胞容积变化。
[0248] 如本文中所用,“抗原呈递细胞”在广义上指专职性抗原呈递细胞(例如,B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞)以及其它抗原呈递细胞(例如,角质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞)。
[0249] “氨基酸”,如本文所用在广义上指天然存在的和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸,以及后来被修饰的氨基酸(例如,羟基脯氨酸、γ羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即,结合至氢、羧基、氨基的)和R基团的化合物(例如,高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。类似物可以具有修饰的R基(例如,正亮氨酸)或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
[0250] 如本文中所用,“无能”或“耐受”在广义上指对活化受体介导的刺激的折射性。这种折射性通常为抗原特异性的,并在停止暴露于耐受抗原后仍然存在。
[0251] 如本文中所用,“抗体”在广义上指抗体的“抗原结合部分”(也可与“抗体部分”、“抗原结合片段”、“抗体片段”互换使用)以及整个抗体分子。如本文中所用,术语“抗原结合部分”是指保留特异性结合至抗原(例如,VISTA(PD-L3))的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(a)Fab片段,其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(b)F(ab’)2片段,其为包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段;(c)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(d)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(e)dAb
片段(Ward,等人(1989)Nature 341:544–546),其由VH结构域组成;以及(f)分离的互补决定区(CDR)。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码,但是它们可通过合成接头使用重组方法而接合,所述合成接头使得它们能够制备成单条蛋白链,其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等人(1988)Science
242:423-426;Huston等人(1988)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85:5879–5883;和Osbourn,等人(1998)Nat.Biotechnol.16:778)。单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”的范围内。特定scFv的任何VH和VL序列均可连接至人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组
序列,以便产生编码完整IgG分子或其它同种型的表达载体。VH和Vl也可使用蛋白化学或重组DNA技术用于产生Fab、Fv或免疫球蛋白的其它片段。其它形式的单链抗体,例如双链抗体也包括在内。双链抗体是二价双特异性抗体,其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达,但使用太短而不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头,从而迫使这两个结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。参见例如Holliger,等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:6444–6448;Poljak,等人(1994)Structure 2:1121–1123。
[0252] 更进一步地,抗体或其抗原结合部分(抗原结合片段、抗体片段、抗体部分)可以是通过抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白或肽的共价或非共价结合而形成的更大免疫粘附分子的一部分。免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区制备四聚scFv分子(Kipriyanov,等人(1995)Hum.Antibodies Hybridomas 6:93–101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov,等人(1994)Mol Immunol.31:1047–1058)。抗体部分,例如Fab和F(ab’)2片段的抗体部分,可由整个抗体使用常规技术(例如分别通过整个抗体的木瓜酶或胃蛋白酶消化而制得。此外,抗体、抗体部分和免疫粘附分子可使用标准重组DNA技术获得,如本文所述。
[0253] 抗体可以是多克隆的、单克隆的、异种的、同种异体的、同基因的;或其修饰形式,例如人源化的、嵌合的。优选地,本发明的抗体特异性结合或大体上特异性结合至VISTA(PD-L3)分子。如本文中所用,术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指这样一群抗体分子,其只含一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点,然而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指这样一群抗体分子,其含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点。单克隆抗体组合物通常显示出对与其发生免疫反应的特定抗原的单一结合亲和力。
[0254] 如本文中所用,“抗原”在广义上指能够被抗体结合的分子或分子的部分,其额外地能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个表位或具有超过一个表位。本文中提及的特异性反应表示,抗原将以高度选择性的方式与其相应抗体反应,但不与可被其它抗原激起的众多其它抗体反应。在期望的对特定目标抗原的增强免疫反应的情况下,抗原包括但不限于示例性的,可对其引起保护性免疫反应的感染性疾病抗原。
[0255] 如本文中所用,“过敏性疾病”在广义上指涉及过敏反应的疾病。更具体地,“过敏性疾病”定义为鉴定了其过敏原的疾病,其中在暴露于该过敏原与发生病理变化之间存在强相关性,并且其中已证实该病理变化具有免疫学机制。在本文中,免疫学机制是指白细胞对免疫原刺激表现出免疫反应。
[0256] 如本文中所用,“反义核酸分子”在广义上指与编码蛋白的“有义”核酸互补(例如,与双链cDNA分子的编码链互补)、与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因此,反义核酸分子可通过氢键结合至有义核酸分子。
[0257] 如本文中所用,“哮喘”是指特征在于炎症、呼吸道变窄以及呼吸道对吸入物的反应性增加的呼吸系统疾病。哮喘较为常见,但不仅仅与特应性或过敏性症状相关。
[0258] 如本文中所用,“细胞凋亡”在广义上指可使用本领域已知的技术表征的程序性细胞死亡。凋亡细胞死亡可例如通过细胞萎缩、膜起泡以及以细胞片段化而终结的染色质凝聚来表征。发生细胞凋亡的细胞还显示出核内核小体DNA断裂的特征性模式。
[0259] 如本文中所用,“自身免疫”或“自身免疫疾病或疾患”在广义上指由个体自身组织或其共分离(co-segregate)或表现引起或针对它们的疾病或病症,或由它们产生的疾患。
[0260] 如本文中所用,“B细胞受体”(BCR)在文义上指在B细胞上发现的膜Ig(mIg)与其它跨膜多肽(例如,Igα和Igβ)之间的复合物。mIg的信号转导功能通过寡聚抗原或多聚抗原由受体分子的交联触发。B细胞也可通过抗免疫球蛋白抗体活化。在BCR活化时,在B细胞中将发生许多变化,包括酪氨酸磷酸化。
[0261] 如本文中所用,术语“癌症”在广义上指特征在于异常的不受调控的细胞分裂,从而引起恶性生长或肿瘤(例如,不受控制的细胞生长)的任何瘤形成疾病(无论是侵袭性的还是转移性的)。
[0262] 如本文中所用,“嵌合抗体”在广义上指其中其恒定区或部分被改变、替换或交换,以便抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的种类的恒定区、效应子功能和/或物种、或赋予嵌合抗体新的性质的完全不同的分子,例如酶、毒素、激素、生长因子、药物,其可变区或部分用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区进行改变、替换或交换。
[0263] 如本文中所用,“编码区”在广义上指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域,而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列区域(例如,5’和3'非翻译区)。
[0264] 如本文中所用,“保守修饰变体”用于氨基酸和核酸序列,并对于特定核酸序列,在广义上指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸的保守修饰变体,或其中核酸不编码氨基酸序列,指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性,许多功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。“沉默变异”是一种保守修饰的核酸变异。本文中的每一个编码多肽的核酸序列也描述了每一个可能的核酸的沉默变异。本领域技术人员将认识到,核酸中的密码子(除AUG(其通常为甲硫氨基酸的唯一密码子)和TGG(其通常为色氨酸的唯一密码子)外)可被修饰来产生功能上相同的分子。
[0265] 如本文中所用,“互补决定区”、“高变区”或“CDR”在广义上指存在于抗体的轻链或重链的可变区中的一个或多个高可变或互补决定区(CDR)。参见Kabat,等人(1987)“Sequences of Proteins of Immunological Interest”National Institutes of Health,Bethesda,MD。这些表达包括由Kabat,等人(1983)“Sequences of Proteins of Immunological Interest”美国卫生和人类服务部中定义的高变区或抗体的三维结构中的高可变环。Chothia和Lesk(1987)J Mol.Biol.196:901–917。每一条链中的CDR通过构架区保持紧密邻近,来自另一条链的CDR促成抗原结合位点的形成。在CDR内,存在已被描述为代表在抗体-抗原相互作用中由CDR使用的关键接触残基的选择性决定区(SDR)的选择性氨基酸。Kashmiri(2005)Methods 36:25–34。
[0266] 如本文中所用,“对照量”在广义上指标志物可以为与标志物的测试量相比较的任何量或量的范围。例如,标志物的对照量可以具有特定疾病或症状的患者或不具有这样的疾病或病症的人中的标志物的量。对照量可以是绝对量(例如,微克/ml)或相对量(例如,相对信号强度)。
[0267] 如本文中所用,“共刺激受体”在广义上指将共刺激信号传递给免疫细胞的受体,如CD28或ICOS。如本文中所用,术语“抑制性受体”包括将负信号传递给免疫细胞的受体。
[0268] 如本文中所用,“共刺激”在广义上指共刺激分子提供第二、非活化、受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力,所述信号诱导增殖或效应子功能。例如,共刺激信号可导致细胞因子分泌(例如,在已接收T细胞受体介导的信号的T细胞中)。已接收细胞受体介导的信号(例如,通过活化受体)的免疫细胞在本文中称为“活化的免疫细胞”。
[0269] 如本文所用,术语“胞质结构域”在广义上指延伸至细胞的细胞质中的蛋白质的部分。
[0270] 如本文中所用,“诊断”在广义上指鉴定病理病症的存在或性质。诊断方法在它们的灵敏度和特异性方面不同。诊断测定的“灵敏度”是测试为阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。未被测定检测到的患病个体为“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的受试者称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率,其中“假阳性”率被定义为测试为阳性的无疾病的人的比例。虽然特定诊断法可能不提供疾患的确定的诊断,但如果该方法提供帮助诊断的明确指示就可以了。
[0271] 如本文中所用,“诊断”在广义上指对疾病或症状分类,确定疾病的严重度,监测疾病进展,预测疾病的结果和/或恢复的前景。术语“检测”还可任选地包括任何前述项。根据本发明的疾病的诊断在一些实施方案中可通过测定获自受试者的生物样品中本发明的多核苷酸或多肽的水平来实现,其中可将测定的水平与对疾病的易感性或疾病的存在或不存在发生关系。应当指出,“获自受试者的生物样品”还可任选地包括未从受试者物理上去除的样品。
[0272] 如本文中所用,“有效量”在广义上指当向患者施用以治疗疾病时足以实现疾病的该治疗的化合物、抗体、抗原或细胞的量。有效量可以是对于预防有效的量和/或对于防止有效的量。有效量可以是对于体征/症状的减轻是有效的量,对于预防体征/症状的发生,减轻体征/症状的发生的严重度,消除体征/症状的发生,减缓体征/症状的发生的发展,阻止体征/症状的发生的发展和/或实现体征/症状的发生的预防是有效的量。“有效量”可随疾病及其严重度以及待治疗的患者的年龄、体重、医疗史、易感性和预先存在的疾患而变化。为了本发明的目的,术语“有效量”与“治疗有效量”同义。
[0273] 如本文中所用,“胞外域”在广义上指从细胞表面延伸的蛋白质的部分。
[0274] 如本文中所用,“表达载体”在广义上指用于在体外或体内、组成型或诱导型地在任何细胞,包括原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持附加型或整合进宿主细胞基因组的表达系统。表达系统可具有在细胞中自我复制或不能自我复制,即在细胞中仅驱动瞬时表达的能力。该术语包括仅包含重组核酸的转录所需的最小元件的重组表达盒。
[0275] 如本文中所用,“家族”当涉及本发明的多肽和核酸分子时旨在表示具有共同结构域或基序并具有如本文所定义的充分的氨基酸或核苷酸序列同一性的两种或更多种多肽或核酸分子。家族成员可以是天然或非天然存在的,并可来自相同的或不同的物种。例如,一个家族可包含第一种人源多肽以及其它不同的人源多肽,或者作为另外一种选择可包含非人源同系物(例如猴多肽)。家族成员还可以具有共同的功能特性。
[0276] 如本文中所用,“Fc受体”(FcR)在广义上指免疫球蛋白分子(Ig)的Fc部分的细胞表面受体。Fc受体存在于许多参与免疫应答的细胞上。在迄今为止已鉴定的人FcR中,为识别IgG(命名为FcγR)、IgE(FcεR1)、IgA(FcαR)和多聚IgM/A(FcμαR)的那些。FcR存在于以下细胞类型中:FcεRI(肥大细胞)、FcεRII(许多白细胞)、FcαR(中性粒细胞)和FcμαR(腺上皮、肝细胞)。Hogg(1988)Immunol.Today 9:185–86。得到广泛研究的FcγR在细胞免疫防御中处于核心地位,并负责刺激自身免疫疾病发病中涉及到的炎症和水解酶的介体的释放。Unkeless(1988)Annu.Rev.Immunol.6:251–87。FcγR在效应细胞与分泌Ig的淋巴细胞之间提供重要的联系,因为巨噬细胞/单核细胞、多形核白细胞以及自然杀伤(NK)细胞FcγR赋予IgG介导的特异性识别的元件。人白细胞具有IgG的
至少三个不同的受体:hFcγRI(存在于单核细胞/巨噬细胞上)、hFcγRII(存在于单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、可能地B细胞和K562细胞系上)以及FcγIII(存在于NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞上)。
[0277] 关于T细胞,共刺激信号向T细胞的传递涉及不受环孢菌素A抑制的信号通路。此外,共刺激信号可在T细胞中诱导细胞因子分泌(例如,IL-2和/或IL-10)和/或可在T细胞中防止诱导对抗原的无应答性、诱导无能或诱导细胞死亡。
[0278] 如本文中所用,“构架区”或“FR”在广义上指抗体的轻链和重链的可变区内的构架区的一个或多个。参见Kabat,等人(1987)“Sequences of Proteins of Immunological Interest”National Institutes of Health,Bethesda,MD。这些表达包括介于抗体的轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区域。
[0279] 如本文中所用,“异源的”在广义上指这样的核酸的部分,所述核酸的部分表示核酸包含不存在与彼此在自然界中的关系相同的关系的两个或更多个子序列。例如,通常通过重组产生核酸,使来自无关基因的两个或更多个序列排列来产生新的功能核酸(例如,来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区)。类似地,异源蛋白质表示蛋白质包含不存在与彼此在自然界中的关系相同的关系的两个或更多个序列(例如,融合蛋白)。
[0280] 如本文中所用,“高亲和力”在广义上指抗体对于靶抗原具有至少10–8M,更优选至–9 –10少10 M,最优选至少10 M的KD。然而,对于其它抗体同种型,“高亲和力”结合可变化。
–7 –8
例如,针对IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有至少10 M,更优选至少10 M的KD。
[0281] 如本文中所用,“同源性”在广义上指核酸序列与参考核酸序列之间或多肽序列与参考多肽序列之间的相似性程度。同源性可以是部分的或完全的。完全同源性表示核酸或氨基酸序列完全相同。部分同源的核酸或氨基酸序列是与参考核酸或氨基酸序列不完全相同的核酸或氨基酸序列。同源性的程度可通过序列比较来测定。术语“序列同一性”可与“同源性”互换使用。
[0282] 如本文中所用,术语“宿主细胞”在广义上指已向其中引入了本发明的核酸分子例如本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如,大肠杆菌)或真核细胞例如酵母、昆虫(例如,SF9)、两栖动物或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa、HEK-293例如培养细胞、外植体和体内细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可在本文互换使用。应当理解,这样的术语不仅指代特定的受试者细胞,还指代这样的细胞的子代或潜在子代。由于某些修饰可能会因突变或环境影响而在后代中发生,因此这种子代事实上可以不与亲代细胞相同,但仍包括在如本文所用的术语的范围内。
[0283] 如本文中所用,术语“人源化抗体”在广义上意指包括通过具有可变区和恒定区的非人细胞制成的抗体,所述可变区和恒定区已发生改变从而与将通过人细胞制备的抗体更加高度相似。例如,通过改变非人抗体氨基酸序列以整合在于人种系免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变),例如在CDR中。如本文中所用,术语“人源化抗体”还包括这样的抗体,其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列移植至人构架序列上。
[0284] 如本文中所用,“杂交”在广义上指当链彼此反向平行排列时,互补(包括部分互补)多核苷酸链通过互补核苷酸之间的氢键形成产生的物理相互作用。
[0285] 如本文中所用,“IgV结构域”和“IgC结构域”,在广义上指Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有不同折叠模式(称为Ig折叠)的结构单元。Ig折叠由两个β片层
的夹心结构构成,每个片层由5-10个氨基酸的反平行β链与大多数但非全部结构域中的两个片层之间的保守二硫键组成。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共有相同类型的序列模式并称为Ig超家族内的C1组。其它IgC结构域落在其它组内。IgV结构域也共有序列
模式并称为V组结构域。IgV结构域长于C结构域并形成另外一对β链。
[0286] 如本文中所用,“免疫细胞”在广义上指具有造血起源并在免疫应答中发挥作用的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞,例如B细胞和T细胞;自然杀伤细胞;以及骨髓细胞,例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0287] 如本文中所用,“免疫测定”在广义上指使用特异性结合抗原的抗体的测定。可通过使用特定抗体的特异性结合性质分离、靶向和/或纯化抗原来表征免疫测定。
[0288] 如本文中所用,术语“免疫反应”在广义上指受T细胞共刺激的调节影响的T细胞介导的和/或免疫B细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括B细胞反应(例如抗体产生)、T细胞反应(例如,细胞因子产生和细胞毒性)以及细胞因子反应细胞(例如巨噬细胞)的活化。如本文中所用,关于免疫反应的术语“下调”包括任何一种或多种免疫反应的降低,而关于免疫反应的术语“上调”则包括任何一种或多种免疫反应的升高。应当理解,一种类型的免疫反应的上调可导致另一种类型的免疫反应的相应下调。例如,产生某些细胞因子(例如,IL-10)的上调可导致细胞免疫反应的下调。
[0289] 如本文中所用,“炎性病症或炎性疾病”在广义上指慢性或急性炎性疾病。
[0290] 如本文中所用,术语“抑制性信号”在广义上指通过免疫细胞上的抑制性受体分子传递的信号。这样的信号通过活化受体(例如,通过TCR、CD3、BCR或Fc分子)拮抗信号并可导致例如以下方面的抑制:第二信使产生;增殖;或免疫细胞中的效应子功能,如减弱吞噬作用、减少抗体产生、降低细胞毒性或使免疫细胞无法产生介体(例如细胞因子(例如,IL-2)和/或过敏反应介体);或发展无能。
[0291] 如本文中所用,“分离的”在广义上指从其天然存在于其中的其原始环境取出,从而通过人工从其天然环境改变的材料。分离的材料可以是例如包含在载体系统中的外源核酸、包含在宿主细胞中的外源核酸,或已从其原始环境去除,从而通过人工改变的任何材料(例如,“分离的抗体”)。例如,如本文中所用,“分离的”或“纯化的”在广义上指大体上不含生物物质所源自的细胞或组织源中的细胞物质或其它污染蛋白,或大体上不含化学前体或其它化学物质(当通过化学方法合成时)的蛋白、DNA、抗体、RNA或其生物活性部分。用语“大体上不含细胞物质”包括这样的VISTA(PD-L3)蛋白制品,其中该蛋白与其从中分离的细胞的细胞成分相分离或通过重组法产生。
[0292] 如本文中所用,“K-assoc”或“Ka”在广义上指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率,而术语“Kdiss”或“Kd”,如本文中所用,是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”,如本文中所用,意指解离常数,其获自Kd对Ka的比率(即,Kd/Ka),表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域既定方法来测定。
[0293] 如本文中所用,“标记”或“可检测部分”在广义上指可通过分光光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方法来检测的组合物。
[0294] “接头”在本文中通常指介于VISTA多肽与另一个部分(通常Ig蛋白,最常见地Fc区,例如人或鼠Ig的Fc区,优选其为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区)之间的肽序列,其任选地可被修饰以减弱或增强FcR结合和/或补体结合和/或其它效应子功能。在示例性实施方案中,接头使VISTA融合蛋白的免疫抑制活性相对于其中VISTA直接连接至Ig多肽的VISTA融合蛋白增强。接头的大小可在至少约5个氨基酸,更常见地至少10-12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸的范围内。示例性实施方案中的接头包含甘氨酸和丝氨酸残基,这样的甘氨酸/丝氨酸残基的数目可包含至少30、40、50、
60、70、80或90%的构成接头的残基。示例性接头序列公开于下文中。
[0295] 如本文中所用,“低严格度”、“中严格度”、“高严格度”或“极高严格条件”在广义上指用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导方针可见于Ausubel,等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology(第5版)John Wiley&Sons,NY中。示例性特异性杂交条件包括但不限于:(1)低严格杂交条件,在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中,随后在0.2XSSC,0.1%SDS中于至少50℃(对于低严格条件,洗涤温度可升高至55℃)洗涤2次;(2)中严格杂交条件,在约45℃于6XSSC中,随后在0.2XSSC,0.1%SDS中于60℃洗涤1或2次;(3)高严格杂交条件,在约45℃于6XSSC中,随后在0.2XSSC,0.1%SDS中于65℃洗涤1或2次;和(4)极高严格杂交条件为0.5M磷酸钠,7%SDS,于65℃,随后在0.2XSSC,1%SDS中于65℃洗涤1或2次。
[0296] 如本文中所用,“哺乳动物”在广义上指哺乳动物纲的任何和所有温血脊椎动物,包括人,其特征在于皮肤上覆盖毛发,在雌性中具有用于滋养幼小动物的产奶乳腺。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼,犰狳,水豚,猫,骆驼,黑猩猩,栗鼠,,狗,山羊,大猩猩,仓鼠,马,人,狐猴,美洲驼,小鼠,非人灵长类动物,猪,大鼠,绵羊,鼯,松鼠,貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛,犬,马,猫,鼠,羊,猪,灵长类动物和啮齿类动物种类。哺乳动物还包括由在Washington DC的国家自然历史博物馆,史密森学会维护的世界哺乳动物物种上所列的任何和所有哺乳动物。
[0297] 如本文中所用,“天然存在的核酸分子”在广义上指具有存在于自然界中的核苷酸序列(例如,编码天然蛋白)的RNA或DNA分子。
[0298] 如本文中所用,“核酸”或“核酸序列”在广义上指以单链或双链形式存在的脱核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。术语包括核酸,即,寡核苷酸,包含已知的天然核苷酸的类似物。术语还包括具有合成主链的核酸样结构。除非另有所指,否则特定核酸序列也无疑包括其保守修饰变体(例如,简并密码子置换)和互补序列,以及明确标明的序列。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
[0299] 如本文中所用,“寡聚化结构域”在广义上指当联接于VISTA胞外域或其片段时有利于寡聚化的结构域。所述寡聚化结构域包含自缔合α-螺旋,例如亮氨酸拉链结构,其可通过另外的二硫键进一步稳定。所述结构域设计为与跨膜的矢量折叠(vectorial folding)相容,这一过程被认为有利于多肽体内折叠成功能性结合蛋白。其实例在本领域中是已知的,并以举例的方式包括卷曲GCN4以及COMP。
[0300] α-螺旋型卷曲螺旋可能是蛋白质中发现的最广泛的亚单位寡聚化。因此,卷曲螺旋发挥许多不同的功能。在转录活化因子的几个家族中,例如,短链亮氨酸拉链结构在DNA上布置DNA结合区中发挥着重要作用。Ellenberger,等人(1992)Cell 71:1223–1237。卷曲螺旋还用于形成中间丝蛋白的寡聚物。卷曲螺旋蛋白此外似乎还在囊泡和病毒膜融合两者中发挥着重要作用。Skehel和Wiley(1998)Cell 95:871–874。在两种情况中,嵌入待融合的膜中的疏水序列位于由一束长α螺旋构成的杆状复合体的同一端。该分子排列据信会在组装复合体以进行膜融合时导致紧密的膜并列。卷曲螺旋通常用于控制寡聚化。其存在于许多类型的蛋白中,包括转录因子,包括但不限于GCN4、病毒融合肽、SNARE复合体以及某些tRNA合成酶等等。许多长的卷曲螺旋存在于蛋白例如原肌球蛋白、中间丝蛋白和纺锤极体成分中。卷曲螺旋涉及许多α-螺旋,它们彼此围绕以高度组织化形式(以平行或反平行取向缔合)形成超螺旋。但二聚体和三聚体是最常见的。螺旋可以来自相同的或来自不同的蛋白。卷曲螺旋由汇合在一起以包埋它们的疏水缝的组成螺旋形成。由于疏水缝围绕每个螺旋扭曲,因此螺旋也绕彼此扭曲成圈,从而包埋疏水缝并形成超螺旋。它是相邻螺旋之间侧链的特征性交错接合,称为结节入洞堆积(knobs-into-holes packing),其将结构限定为卷曲螺旋。对于发生这种类型的相互作用,螺旋不必以相同的方向行进,但平行构象是最常见的。反平行构象在三聚体中非常罕见,在五聚体中未知,但在分子内二聚体中更常见,其中两个螺旋通常通过短环连接。在胞外间隙中,异源三聚卷曲螺旋蛋白层粘蛋白在基底膜的形成中起着重要作用。其它实例为血小板反应素和软骨寡聚基质蛋白(COMP),其中连接了三条(血小板反应素1和2)或五条(血小板反应素3、4和COMP)链。分子具有花束样外观,并且它们的寡聚结构的原因可能是C端结构域与细胞受体的多价相互作用。酵母转录活化因子GCN4是超过30种已鉴定的含碱性区亮氨酸拉链结构
(bZIP)DNA结合基序的真核蛋白中的1种。Ellenberger,等人(1992)Cell 71:1223–1237。
bZIP二聚体是一对连续的α螺旋,它们在其羧基末端34个残基上方形成平行的卷曲螺旋并朝其氨基末端逐渐分开以通过DNA结合位点的大沟。卷曲螺旋二聚化接口几乎垂直于DNA轴线取向,从而使复合体具有字母T外观。bZIP包含疏水非极性残基的4-3七肽重复序列,这些残基以平行的α螺旋型卷曲螺旋堆叠在一起。Ellenberger,等人(1992)Cell
71:1223–1237。二聚体的稳定性由以下方面产生:亮氨酸以及七肽重复序列a和d位的非极性残基的并列型堆积(side-by-side packing)以及有限数量的螺旋内和螺旋间盐桥,如在GCN4亮氨酸拉链肽的晶体结构中所示。Ellenberger,等人(1992)Cell 71:1223–1237。
另一个实例为从牛气管软骨中作为Mr 52,000亚单位的同源三聚体而分离的CMP(母系
蛋白-1)(Paulsson&Heinegard(1981)Biochem J.197:367–375),其中每一个亚单位由一个vWFA1模块、单个EGF结构域、一个vWFA2模块以及跨五个七肽的卷曲螺旋结构域组成。Kiss,等人(1989)J.Biol.Chem.264:8126–8134;Hauser和Paulsson(1994)J.Biol.Chem.269:25747–25753。经纯化的CMP的电子显微镜分析显示出花束样三聚体结构,其中每个亚单位形成从对应于卷曲螺旋的共同点显露出的椭圆体。Hauser和Paulsson(1994)J.Biol.Chem.269:25747–25753。母系蛋白-1中的卷曲螺旋结构域已得到了广泛的研究。
三聚体结构在非变性条件下完全还原链间二硫键后得以保持。Hauser和Paulsson(1994)J.Biol.Chem.269:25747–25753。另一个实例为软骨寡聚基质蛋白(COMP)。非胶原性糖蛋白COMP最初在胶原中鉴定出。Hedbom,等人(1992)J.Biol.Chem.267:6132–6136。该蛋白为524kDa的五个亚单位的同源五聚体,其由一个N端七肽重复区(cc)、接着四个表皮生长因子(EGF)样结构域(EF)、七个钙结合结构域(T3)和一个C端球状结构域(TC)组成。
根据此结构域的组织化,COMP属于血小板反应素家族。在位置a和d具有优先疏水性残基的七肽重复序列(abcdefg)n形成螺旋型卷曲螺旋结构域。Cohen和Parry(1994)Science
263:488–489。近来,得到了COMP的重组五链卷曲螺旋结构域(COMPcc)的晶体,并以0.2nm的解析度对其结构进行了解析。Malashkevich,等人(1996)Science 274:761–765。
[0301] 如本文中所用,“有效连接的”在广义上指当将两个DNA连接时,使由两个DNA编码的氨基酸序列仍然保持在框内。
[0302] 如本文中所用,“互补位”在广义上指抗体的识别抗原的部分(例如,抗体的抗原结合位点)。互补位可以是抗体的Fv区的小的区域(例如,15–22个氨基酸),可包含抗体的重链和轻链的部分。参见,Goldsby,等人Antigens(第3章)Immunology(第5版)New York:W.H.Freeman and Company,第57–75页。
[0303] 如本文中所用,“患者”或“受试者”在广义上指需要治疗以缓和疾病状态或防止疾病状态的发生或复发的任何动物。同样地,如本文中所用,“患者”在广义上指先前已被诊断的具有风险因子、疾病史、易感性、症状、体征,存在发生疾病的风险,或为患者群体的成员的任何动物。患者可以是临床患者例如人或兽医学患者例如伴侣动物、家养动物、家畜类动物、外来动物或动物园动物。术语“受试者”可与术语“患者”互换使用。
[0304] “多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且在广义上指氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。多肽可以例如通过添加糖残基以形成糖蛋白来进行修饰。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白,以及非糖蛋白。
[0305] 如本文中所用,“启动子”在广义上指一系列指导核酸的转录的核酸序列。如本文中所用,启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列,例如在聚合酶II型启动子的情况下,TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏元件,其可距离转录起始位点多至数千碱基对。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是处于环境或发育调控下的启动子。
[0306] 如本文中所用,“预防有效量”在广义上指当向患者施用以预防疾病或防止疾病复发时足以实现这样的疾病或复发的预防的化合物的量。预防有效量可以是对于预防体征和/或症状的发生是有效的量。“预防有效量”可随疾病及其严重度和待治疗的患者的年龄、体重、医疗史、对病症的易感性、现有病症而变化。
[0307] 如本文中所用,“预防”在广义上指其中体征和/或症状在患者中不存在,在缓解中,或先前存在于患者中的治疗过程。预防包括防止疾病在患者的疾病治疗后发生。此外,预防包括治疗可潜在地发展疾病的患者,尤其是对疾病易感的患者(例如,患者群体的成员,具有风险因子或存在发展疾病的风险的那些患者)。
[0308] 如本文中所用,“重组体”在广义上指产物,例如指细胞或核酸、蛋白质或载体,所述产物表明所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰,或细胞来源于所修饰的细胞。因此,例如,重组细胞表达不存在于细胞的天然(非重组)形式中的基因,或表达另外地异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
[0309] 如本文所用,“信号序列”或“信号肽”在广义上指这样的肽,其包含约15个或更多个出现在分泌性和膜结合多肽N端的氨基酸并且包含大量的疏水性氨基酸残基。例如,信号序列包含至少约10-30个氨基酸残基,优选地约15-25个氨基酸残基,更优选地约18-20个氨基酸残基,甚至更优选地约19个氨基酸残基,并具有至少约35-65%,优选地约
38-50%,更优选地约40-45%的疏水性氨基酸残基(例如,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。“信号序列”在本领域中也称为“信号肽”,其作用是指导包含这样的序列的多肽形成脂质双层,并在分泌性和膜结合多肽中裂解。
[0310] 如本文中所用,对抗体的“特异性(或选择性)结合”或“特异性地(或选择性地)与.......免疫反应”或“特异性地与......相互作用或结合”在广义上指蛋白质或肽(或其它表位),在一些实施方案中指确定蛋白质在蛋白质的异源群体和其它生物制品中的存在的结合反应。例如,在指定的免疫测定条件下,指定的抗体对特定蛋白质的结合至少为本底(非特异性信号)的至少2倍,并且大体上不以显著量结合存在于样品中的其它蛋白质。通常地特异性或选择性反应为本底信号或噪声的至少2倍,更常见地为本底的约10至100倍。
[0311] 如本文中所用,“可特异性杂交的”和“互补的”在广义上指核酸可按照常规沃尔森克里克法则或非常规类型法则与另一个核酸序列形成氢键。核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能进行,例如,RNAi活性。核酸分子的结合自由能的测定在本领域是公知的。参见,例如,Turner,等人(1987)CSH Symp.Quant.Biol.LII:123–33;Frier,等人(1986)PNAS 83:9373–77;Turner,等人(1987)J.Am.Chem.Soc.109:3783–
85。百分比互补性表示可与第二核酸序列形成氢键(例如,沃尔森克里克碱基配对)的核酸分子中的连续残基的百分比(例如,10个中有约至少5、6、7、8、9、10个配对为约至少50%、
60%、70%、80%、90%和100%的互补,包括在界线内)。“完全互补”或100%的互补性在广义上指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键合。“大体上互补”是指显示约至少90%的互补性的多核苷酸链,不包括被选择来作为非互补的多核苷酸链的区域,例如悬突。特异性结合需要足够程度的互补性来避免寡聚化合物在其中需要特异性结合的条件下,即在体内测定或治疗性治疗的情况下在生理条件下,或在体外测定的情况下在其中进行测定的条件下对非靶序列的非特异性结合。非靶序列通常可相异至少5个核苷酸。
[0312] 如本文中所用,疾病的“体征”在广义上指可在患者的诊查中发现的指示疾病的任何异常;疾病的客观指征,与症状(其为疾病的主观指征)相反。
[0313] 如本文中所用,“固体载体”、“载体”和“基质”在广义上指提供另一种材料可籍以附着的固体或半固体结构,包括但不限于光滑载体(例如,金属、玻璃、塑料、和陶瓷表面)以及有织纹的和多孔的材料。
[0314] 如本文中所用,“受试者”在广义上指适合于本发明治疗的任何动物,包括但不限于禽类和哺乳动物受试者,优选为哺乳动物。需要根据本发明进行治疗的任何哺乳动物受试者是合适的。两种性别和处于任何发育阶段(即,新生儿、婴儿、幼儿、青少年、成人)的人受试者可根据本发明进行治疗。为了兽医学目的和为了药物筛选和药物开发目的,也可对动物受试者,尤其是哺乳动物受试者例如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊、马进行本发明。“受试者”可与“患者”互换使用。
[0315] 如本文中所用,“大体上不含化学前体或其它化学物质”在广义上指其中将蛋白与蛋白合成中所涉及的化学前体或其它化学物质相分离的VISTA蛋白制品。在一个实施方案中,用语“大体上不含化学前体或其它化学物质”包括具有低于约30%(按干重计)的化学前体或非VISTA化学物质,更优选地低于约20%的化学前体或非VISTA化学物质,还更优选地低于约10%的化学前体或非VISTA化学物质以及最优选地低于约5%的化学前体或非VISTA(PD-L3)化学物质的VISTA蛋白制剂。
[0316] 如本文中所用,疾病的“症状”在广义上指由患者经历的并且指示疾病的任何病态现象或对结构、功能或感觉的正常的背离。
[0317] 如本文中所用,“T细胞”在广义上指CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。
[0318] 如本文中所用,“治疗”、“治疗的”、“医治”或“疗法”在广义上指治疗疾病、阻止或减缓疾病的发展或其临床症状和/或缓解疾病、使疾病或其临床症状消退。治疗包括预防、治疗、补救、减轻、缓解和/或提供疾病、疾病的体征和/或症状的解除。治疗包括减轻具有正在进行的疾病体征和/或症状(例如,炎症、疼痛)的患者的体征和/或症状。治疗还包括“预防”。为了治疗目的,术语“减轻”在广义上指体征和/或症状的临床显著减轻。治疗包括治疗复发或再发生的体征和/或症状(例如,炎症、疼痛)。治疗包括但不限于在任何时候阻止体征和/或症状的出现以及减轻现有体征和/或症状和消除现有体征和/或症状。治疗包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如,治疗包括治疗或预防体征和/或症状(例如,炎症、疼痛)的复发或再发生。
[0319] 如本文中所用,“跨膜结构域”在广义上指长度为约15个氨基酸残基的氨基酸序列,其横跨质膜。更优选地,跨膜结构域包含约20、25、30、35、40或45个氨基酸残基并跨越质膜。跨膜结构域富含疏水性残基,并通常具有α-螺旋结构。在实施方案中,跨膜结构域的氨基酸中的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多为疏水性的,如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域在例如Zagotta,等人(1996)Annu.Rev.Neurosci.19:235–263中有所描述。
[0320] 如本文中所用,“转基因动物”在广义上指其中动物细胞的一个或多个包含“转基因”的非人动物,优选地为哺乳动物,更优选地为小鼠。术语“转基因”是指整合进转基因动物从其发育的细胞的基因组中并保留在成熟动物基因组中的外源DNA,例如在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中指导所编码基因产物的表达。
[0321] 如本文中所用,“肿瘤”在广义上指至少一个细胞或组织赘生物形式的细胞团块,尤其是内源性组织的自发、自主和不可逆的或多或少脱抑制的过度生长形式,所述生长通常与或多或少的特定细胞和组织功能明显丧失相关。该细胞或细胞团块通过自身或通过宿主生物(例如,黑素瘤或淋巴瘤)的调节机制在其生长方面无有效抑制。肿瘤抗原不仅包括存在于恶性肿瘤细胞本身中或其上的抗原,还包括存在于肿瘤的基质支持组织(包括内皮细胞和其它血管成分)上的抗原。
[0322] 如本文中所用,“无应答性”在广义上指免疫细胞对刺激(例如,通过活化受体或细胞因子的刺激)的折射性。无应答性可例如由于暴露于免疫抑制剂或高剂量的抗原来发生。
[0323] 如本文中所用,“可变区”或“VR”在广义上指抗体中每一对轻链和重链内的结构域,该结构域直接参与抗体对抗原的结合。每一条重链在一个末端具有可变结构域(VH),紧接着数个恒定结构域。每一条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)并在另一个末端具有恒定结构域;轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准,并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。
[0324] 如本文中所用,“载体”在广义上指能够转运其所连接到的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”,其是指可向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体,其中可将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时被整合进宿主细胞的基因组,并因而随宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。载体在本文称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。一般来讲,在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒形式存在。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明旨在包括此类发挥等同功能的其它形式的表达载体,例如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。通常按照本领域公知的和各种一般和更专门的参考资料(在整个本说明书中引用和论述的)中描述的常规方法进行技术和方法。参见,例如,Sambrook,等人(2001)Molec.Cloning:Lab.Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如,电穿孔、脂转染)。可按照制造商的说明书或如本领域中通常实现的或如本文中描述的,进行酶促反应和纯化技术。
[0325] 与本文中描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名法以及所述领域的实验室方法和技术在本领域中是公知的并且通常本领域中使用。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送,以及患者的治疗。
[0326] VISTA或PD-L3
[0327] 本申请涉及被称为T细胞活化的 V区含免疫球蛋白抑制剂(VISTA)或PD-L3的新型、结构不同的Ig超家族抑制性配体,其选择性地在造血细胞上表达。胞外域具有与B7家族配体PD-L1的同源性,并且像PD-L1一样,VISTA对免疫具有深刻的影响。然而,与PD-L1不同,VISTA选择性地在造血室内表达。表达最常见于骨髓抗原呈递细胞(APC),尽+ +
管在CD4T细胞、CD8T细胞上和Foxp3+调节性T细胞(Treg)亚群上的表达也具有重要
意义。可溶性VISTA-Ig融合蛋白或APC上的VISTA表达强效抑制体外T细胞增殖、细胞
因子产生并诱导T细胞中的Foxp3表达。相反,新开发的抗VISTA单克隆抗体在体外通过VISTA+APC干扰T细胞反应的VISTA诱导型免疫抑制。此外,体内抗VISTA加强了T细胞
介导的自身免疫疾病实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)的发展,并促进保护性肿瘤特异性免疫反应的发展,继而缓解肿瘤。VISTA-/-小鼠的初步研究正在揭示自发性炎性疾病的早期征象,展现特征例如在于升高的水平的TNFα、IFNγ、IL-17F、嗜酸细胞活化趋化因子、IP-10、MCP-1和MIG,以及CD4+和CD8+T细胞的炎症表型,它们展现是高的对自身免疫例如EAE的易感性、增加的IgG抗体的表达、增加的髓细胞产生。同样地,VISTA敲除显示肺、肝和胰腺中淋巴细胞性浸润的增加、肺和脾中的滤泡增生、胃中嗜中性粒细胞浸润,对于肾、肾上腺、食管、小肠和结肠未显示任何可觉察的差异。
[0328] 不同于所有其它PD配体相关分子(例如,B7-H3、H4、H6),VISTA在造血细胞中选择性表达,与其充分的抑制活性和独特的结构特征一起表明VISTA是一种新型、功能非冗余的核心的免疫负调节因子,其表达主要限制在T细胞和骨髓。参见WO 2011/120013。
[0329] 得到最清楚表征的共刺激性配体为B7.1和B7.2,并且它们属于由许多关键性免疫调节因子(例如B7家族配体和受体)组成的Ig超家族。Ig超家族成员在专职抗原呈递细胞(APC)上表达,并且它们的受体为CD28和CTLA-4。CD28由首次接触试验的和活化的T细胞表达,并对最佳的T细胞活化起着关键作用。相比之下,CTLA-4在T细胞活化时诱导,并通过结合至B7.1/B7.2而抑制T细胞活化,从而损害CD28-介导的共刺激。B7.1和B7.2敲除(KO)小鼠在适应性免疫反应中受损,而CTLA-4KO小鼠无法充分控制炎症并发展了系统性自身免疫疾病。随着时间推移,B7家族配体已扩展至包括共刺激配体例如B7-H2(ICOS配体)和B7-H3以及共抑制性配体例如B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1或B7x)和B7-H6。因此,已鉴定了另外的CD28家族受体。ICOS在活化的T细胞上表达,并结合至B7-H2。ICOS为正共调节因子,对T-细胞活化、分化和功能起着重要作用。在另一方面,程序性死亡1(PD-1)负调节T细胞反应。PD-1KO小鼠发展了狼疮样自身免疫疾病或T扩张型心肌病。与VISTA相比,PD-L1和PD-L2这两种抑制性B7家族配体具有不同的表达模式。
PD-L2在DC和巨噬细胞上诱导性表达,而PD-L1在造血细胞和非造血细胞类型上均泛表达。
与PD-1受体的免疫抑制作用一致,使用PD-L1-/-和PD-L2-/-小鼠的研究已表明,两种配体在抑制T细胞增殖和细胞因子产生方面具有重叠作用。PD-L1缺乏在自身免疫性糖尿病的非肥胖型糖尿病(NOD)模型以及多发性硬化症(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))的
鼠模型中均会加速疾病进展。PD-L1-/-T细胞在两种疾病模型中均产生升高水平的促炎性细胞因子。此外,在NOD小鼠中的研究已表明,PD-L1的组织表达(即,在胰腺内)对其区域性控制炎症的能力有独特的贡献。PD-L1还在胎盘合体滋养细胞上高表达,这些细胞关键性地控制对同种异体胎儿的母体免疫反应。
[0330] 抗CTLA-4抗体显示在鼠模型和黑素瘤临床试验中的增强的治疗有益效果。用B16-GM-CSF(Gvax)接种疫苗的小鼠当与CTLA-4的抗体阻断相结合时促进B16黑素瘤的排斥。针对PD-1以及PD-L1的抗体也在多种鼠肿瘤模型中证实了增强的抗肿瘤免疫和宿主存活。最后,虽然CTLA-4和PD-1属于同一共抑制性分子家族,但是有证据表明,它们使用不同的非冗余机制来抑制T细胞活化,并且在抗CTLA-4和抗PD-1/L1结合使用时在鼠黑素瘤中增强宿主存活的能力方面存在协同作用。
[0331] 免疫球蛋白(Ig)超家族由许多关键性免疫调节因子(包括B7家族配体和受体)组成。VISTA是新型、结构不同的Ig超家族抑制性配体,其胞外域具有与B7家族配体PD-L1的同源性。该分子称为T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。VISTA主要在造血细
胞上表达,VISTA表达在骨髓抗原呈递细胞(APC)和T细胞上受到高度调节。APC上可溶
性VISTA-Ig融合蛋白或VISTA表达在体外抑制T细胞增殖和细胞因子产生。VISTA特异
性单克隆抗体在体外干扰通过表达VISTA的APC进行的VISTA诱导的T细胞反应的抑制。
此外,抗VISTA处理加重小鼠的T细胞介导的自身免疫疾病实验性自身免疫性脑脊髓炎的发展。最后,VISTA在肿瘤细胞上的过表达在小鼠体内干扰保护性抗肿瘤免疫。这些发现显示VISTA(新型免疫调节分子)具有对其它Ig超家族成员是非冗余的功能活性,并且
在自身免疫和癌症的免疫监督的发展中起作用。参见,Wang,等人(2011)The Journal of Experimental Medicine 208(3):577–92。
[0332] 人VISTA(PD-L3)或VISTA在T细胞转录谱筛选中被鉴定为上调的分子。我们对+
从鼠CD4T细胞cDNA文库中回收的相同的930bp基因产物的表征确认了大小和序列。电子延伸序列和结构分析预测出成熟时309个氨基酸的I型跨膜蛋白。其胞外域包含136个氨基酸的单个胞外Ig-V结构域,其连接至23个氨基酸的茎区、21个残基的跨膜片段以及97氨基酸的胞质结构域。VISTA的胞质尾部不含任何信号传导结构域。通过VISTA Ig-V结构域的BLAST序列检索鉴定出B7家族的PD-L1为最接近的进化相关蛋白,其具有边缘显著性e值得分。VISTA与B7家族成员PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4基于结构的序列比对突
出了在所有Ig-V结构域蛋白中系统性保守的若干氨基酸。
[0333] VISTA的表达似乎选择性在造血室内表达,且这种蛋白在成熟骨髓细胞bright + reg +
(CD11b )上高表达,在CD4T细胞、T 和CD8 T细胞上的表达水平较低。可溶性VISTA
+ +
蛋白,如可溶性VISTA-Ig融合蛋白,或APC上的VISTA表达在体外抑制CD4和CD8 T细胞
增殖以及细胞因子产生。还观察到,抗VISTA抗体,如抗VISTA单克隆抗体(13F3)在体外通+
过VISTAAPC阻断T细胞反应的VISTA诱导型抑制。另外,已发现,抗VISTA单克隆抗体加重了EAE并在体内增加了致脑炎Th17的频率。再者,本发明人已令人惊讶地发现,抗VISTA单克隆抗体在多种鼠肿瘤模型中诱导肿瘤缓解。在这些模型中的髓源性抑制细胞(MDSC)+
上的VISTA表达极其高,表明VISTAMDSC抑制肿瘤特异性免疫。VISTA在小鼠体内和体外以及人(仅体外)中对T细胞有免疫抑制活性,是控制自身免疫发展以及对癌症免疫反应的重要介体。具体地,数据表明:VISTA是Ig超家族的新成员,并包含具有与PD-L1遥远的序列相似性的Ig-V结构域。VISTA-Ig融合蛋白或当在人工APC上过表达时,VISTA抑制小鼠和人两者的CD4+和CD8+T细胞增殖及细胞因子产生。另外,VISTA在骨髓APC上的表达在体外对T细胞反应具有抑制性。
[0334] 在肿瘤微环境中VISTA在MDSC上的表达极高。许多细胞表面分子的表型和功能分析之前已表明它们牵涉在MDSC介导的T细胞抑制中:CD115、CD124、CD80、PD-L1和PD-L2由MDSC表达,但是在MDSC与缺乏免疫抑制活性的无肿瘤小鼠的细胞之间,未发现它们表达水平或阳性细胞比例的差异。因此,我们预测,VISTA将是MDSC上的主要B7负调节因子。
[0335] 抗体介导的VISTA阻断诱导对自体肿瘤的保护性免疫。
[0336] VISTA是MDSC上的一种主要的、负免疫调节分子,其干扰保护性抗肿瘤免疫的发展。因此,通过抗VISTA抗体阻断此分子的活性可用于在哺乳动物(例如,人)中诱导保护性抗肿瘤免疫。
[0337] 使用可溶性VISTA蛋白,例如融合蛋白和包含VISTA胞外域或其片段的多个拷贝的多聚体VISTA蛋白,以及结合或调节(激动或拮抗)VISTA的活性的VISTA结合剂,例如小分子和抗体或其片段,作为免疫调节剂以及用于治疗不同的癌症,例如膀胱癌、卵巢癌和淋巴瘤、自身免疫疾病、过敏、感染和炎性病症,列如多发性硬化和关节炎的方法。
[0338] VISTA是一种新型的抑制性配体,其胞外Ig-V结构域具有与两种已知的B7家族配体即程序性死亡配体1和2(PD-L1和PD-L2)的同源性,并表现出独特的序列特征以及在APC和T细胞亚群上在体外体内与众不同的表达模式(这将PD-L3或VISTA与其它B7
+ + +
家族配体区别开来)。VISTA对CD4和CD8 T细胞增殖与分化具有功能影响(抑制CD4和
+
CD8T细胞增殖以及细胞因子产生)。基于其表达模式以及对T细胞的抑制性影响,PD-L3或VISTA显然作为调节性配体发挥作用,其在T细胞与髓源性APC之间的同种相互作用期间负调节T细胞反应。
[0339] 虽然VISTA(PD-L3)似乎为配体B7家族的成员,但不同于其它B7家族配体,该分子仅含有Ig-V结构域而无Ig-C结构域,并在系统发生上更接近B7家族受体程序性死
亡-1(PD-1)。基于上文所述,VISTA(PD-L3)及其特异性激动剂或拮抗剂可用于调节T细胞活化和分化,并更广泛地用于调节控制免疫反应的调控网络。具体地,VISTA(PD-L3)蛋白以及VISTA(PD-L3)激动剂或拮抗剂,优选地为VISTA(PD-L3)的特异性抗体,可用于调节自身免疫、炎性反应和疾病、过敏、癌症、感染性疾病和移植中的免疫反应。
[0340] T细胞中的无能(与无应答性相对)的特征在于缺乏细胞因子的产生,如IL-2。T细胞无能在T细胞暴露于抗原并在第二信号(共刺激信号)不存在的情况下收到第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时发生。在这些条件下,再次将细胞暴露于相同的抗原(即便再次暴露在共刺激分子存在的情况下发生)将导致不能产生细胞因子,并因此不能增殖。然而,无能T细胞可发生对不相关抗原的反应,并可在用细胞因子(例如,IL-2)培养时增殖。例如,T细胞无能也可通过T淋巴细胞缺乏IL-2的产生而观察到,如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定测量。或者,可使用报告基因构建体。例如,无能T细胞不能引发通过异源启动子在5’IL-2基因增强子控制下或通过可存在于增强子内的AP1序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等人(1992)Science 257:1134)。
[0341] 本发明的VISTA(PD-L3)分子基于多肽或相应核酸分子中“胞外域”的存在而鉴定。本发明的VISTA(PD-L3)分子基于多肽或相应核酸分子中“胞质结构域”的存在而鉴定。
[0342] 本文中“用于调节免疫细胞反应的方法”意指在初级信号存在的情况下将免疫细胞在体外或体内与VISTA蛋白或对于其是特异性的结合剂接触,以便调节免疫细
胞的反应。(VISTA或其调节剂的相互作用将信号传递给免疫细胞,从而调节免疫反应。
VISTA(PD-L3)蛋白在骨髓抗原呈递细胞(包括骨髓树突状细胞(DC)以及巨噬细胞)上以
高水平表达,而在CD4+和CD8+T细胞上以低密度表达。当免疫活化时,VISTA(PD-L3)表达在骨髓APC上被上调,但在CD4+T细胞上被下调)。因此,本发明的VISTA(PD-L3)核酸和多肽以及其激动剂或拮抗剂用于例如调节免疫反应。
[0343] 如在本文中可互换使用的,“VISTA(PD-L3)活性”、“VISTA(PD-L3)的生物活性”或“VISTA(PD-L3)的功能活性”是指VISTA(PD-L3)蛋白、多肽或核酸分子对VISTA(PD-L3)应答细胞或组织或对VISTA(PD-L3)多肽结合伴侣发挥的活性,如根据标准技术在体内或体外测定。这些活性包括调节CD4+和CD8+T细胞增殖以及细胞因子产生。在另一个实施方案中,VISTA(PD-L3)活性为直接活性,例如与VISTA(PD-L3)结合伴侣的缔合。如本文中所用,“目标分子”或“结合伴侣”是VISTA(PD-L3)多肽所天然地(即,在T细胞上表达的)结合或相互作用,以便实现VISTA(PD-L3)介导的功能的分子。或者,VISTA(PD-L3)活性为间接活性,例如VISTA(PD-L3)多肽介导的细胞信号传导活性。VISTA(PD-L3)的生物活性在本文有所描述。例如,本发明的VISTA(PD-L3)多肽以及VISTA(PD-L3)激动剂或拮抗剂可具有以下活性中的一种或多种:(1)抑制或促进CD4+和CD8+T细胞增殖以及记忆和效应细胞,(2)抑制或促进细胞因子产生,尤其是抑制炎性细胞因子例如IL-6、TNF-α、γ干扰素、MCP-1、嗜酸细胞活化趋化因子、IP-10、MIG、IL-17等,和(3)用作调节性配体,其负调节T细胞与骨髓源性APC之间的同种相互作用期间的T细胞反应,(4)通过抑制早期TCR活化并阻止细胞分裂来负调节CD4+T细胞反应,但对细胞凋亡具有微弱的直接影响,(5)抑制或促进APC与T细胞之间的同种相互作用期间的抗原特异性T细胞活化,和/或(6)抑制或促进T细胞介导的免疫反应;(7)调节(增强或减弱)免疫细胞(例如,T淋巴细胞)的活化,(8)调节(增强或减弱)免疫反应,例如生物体(例如,小鼠或人生物体)的炎性或自身免疫反应或过敏性免疫反应,(9)增加或减少T细胞例如CD44上的活化标志物的表达;(10)增加或减少髓细胞产生,和(11)抑制或增加T细胞或中性白细胞浸润和Th17,(11)诱导或抑制Foxp3+细胞,(12)抑制或增加滤泡增生。相反地,VISTA激动剂例如VISTA-Ig不影响B细胞增殖。
[0344] “调节一种或多种VISTA(PD-L3)活性的分离的VISTA(PD-L3)蛋白和多肽”。这些多肽将包括具有以下结构域的一个或多个的VISTA(PD-L3)多肽:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、跨膜域和胞质域,和优选地VISTA(PD-L3)活性。
[0345] 共刺激信号的调节可导致免疫细胞的效应子功能的调节。因此,术语“VISTA活性”包括VISTA多肽结合其天然结合伴侣的能力、调节免疫细胞共刺激或抑制性信号的能力以及调节免疫反应的能力。
[0346] 哺乳动物中抑制性信号的调节导致哺乳动物细胞的增殖和/或细胞因子分泌的调节。例如,本发明的VISTA(PD-L3)多肽的家族优选地包含至少一个“信号肽结构域”。如下文中所述,信号序列在天然人VISTA(PD-L3)的氨基酸序列中被鉴定,也在天然小鼠VISTA(PD-L3)的氨基酸序列中被鉴定。
[0347] VISTA(PD-L3)活性的刺激在其中VISTA(PD-L3)异常下调和/或其中增强的VISTA(PD-L3)活性可能具有有益效果的情形中是所需的。同样地,VISTA(PD-L3)活性的抑制在其中VISTA(PD-L3)异常上调和/或其中降低的VISTA(PD-L3)活性可能具有有益效果的情形中是所需的。用于下调VISTA(PD-L3)的示例性试剂(即,VISTA(PD-L3)拮抗剂)包括例如反义核酸分子、识别和阻断VISTA(PD-L3)的抗体、识别和阻断VISTA(PD-L3)的抗体与识别和阻断VISTA(PD-L3)反受体的抗体的组合、以及阻断免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间相互作用的化合物(例如,可溶性、单价VISTA(PD-L3)分子;不结合抗原呈递细胞上Fc受体的可溶形式的VISTA(PD-L3)分子;可溶形式的VISTA(PD-L3)
结合伴侣;以及受试者筛选测定中鉴定的化合物)。用于上调VISTA(PD-L3)的示例性试剂(即,VISTA(PD-L3)激动剂)包括例如编码VISTA(PD-L3)多肽的核酸分子、多价形式的VISTA(PD-L3)、增加VISTA(PD-L3)表达的化合物、增强VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的化合物以及表达VISTA(PD-L3)的细胞。
[0348] 取决于结合至受体的VISTA(PD-L3)分子的形式,信号可以被传递(例如,通过导致受体交联的多价形式的VISTA(PD-L3)分子,或通过结合至抗原呈递细胞上的Fc受体的可溶形式的VISTA(PD-L3))或抑制(例如,通过可溶、单价形式的VISTA(PD-L3)分子,或使用本领域已知的方法改变以使得不结合至抗原呈递细胞上的Fc受体的可溶形式的
VISTA(PD-L3)),例如通过与活化形式的VISTA(PD-L3)分子竞争与受体的结合。然而,存在其中可溶性分子能起刺激作用的情况。各种调节剂的作用可使用本文所述的常规筛选测定容易地证实。
[0349] 免疫反应的下调
[0350] 上调VISTA(PD-L3)多肽的抑制性功能可用于下调免疫反应。下调可以是抑制或阻断已在进行中的免疫反应的形式,或者可以涉及防止免疫反应的诱导。活化的免疫细胞的功能可通过下调免疫细胞反应或通过诱导免疫细胞中的特异性无能或这两者来抑制。例如,VISTA(PD-L3)可结合至抑制性受体,结合至抑制性受体的VISTA(PD-L3)的形式,例如细胞表面上的多价VISTA(PD-L3),可用于下调免疫反应。可用于刺激VISTA(PD-L3)活性的活化抗体为双特异性抗体。例如,这样的抗体可以包含VISTA(PD-L3)结合位点和靶向免疫细胞(例如,T细胞、B细胞或骨髓细胞)上的细胞表面受体的另一结合位点。除了包含VISTA(PD-L3)结合位点外,这样的抗体可进一步包含结合至B细胞抗原受体、T细胞抗原受体或Fc受体的结合位点,以便将分子靶向特定的细胞群。选择双特异性抗体的该第二抗原可提供选择待靶向以进行抑制的细胞群的灵活性。促进VISTA(PD-L3)活性或增强VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣(例如,VISTA(PD-L3)活化抗体或VISTA(PD-L3)活化小分子)之间的相互作用的试剂可通过它们抑制免疫细胞增殖和/或效应子功能或当添加至体外测定中时诱导无能的能力来鉴定。例如,细胞可在刺激通过活化受体发生的信号转导的试剂存在下而培养。多种本领域公认的细胞活化的“读出”可用于在活化剂存在的情况下测量例如细胞增殖或效应子功能(例如,抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。测试试剂阻断此活化的能力可容易地通过测量该试剂实现所测量的增殖或效应子功能降低的能力而测定。在一个实施方案中,在低抗原浓度下,VISTA(PD-L3)免疫细胞相互作用抑制强B7-CD28信号。在另一个实施方案中,在高抗原浓度下VISTA(PD-L3)免疫细胞相互作用可减少细胞因子的产生但不抑制T细胞增殖。因此,测试化合物阻断活化的能力可通过在不同抗原浓度下测量细胞因子产生和/或增殖来测定。
[0351] 通过与VISTA(PD-L3)激动剂共施用抗原来诱导对特异性抗原的耐受性。例如,可诱导对特异性多肽的耐受。若对过敏原或外源性多肽的免疫反应是不可取的,则可抑制对该过敏原或外源性多肽的免疫反应。例如,接受因子VIII的患者经常产生针对此凝血因子的抗体。与重组因子VIII共施用刺激VISTA(PD-L3)活性或与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂(或将VISTA(PD-L3)物理连接至因子VIII,如通过交联)可导致免疫反应下调。
[0352] VISTA(PD-L3)激动剂和可阻断免疫细胞上共刺激受体活性的另一种试剂可用于下调免疫反应。示例性分子包括:激动剂形式的其它PD配体、可溶形式的CTLA-4、抗B7-1抗体、抗B7-2抗体或其组合。或者,两种单独的肽(例如,VISTA(PD-L3)多肽与阻断形式的B7-2和/或B7-1多肽)或抗体的组合(例如,针对VISTA(PD-L3)多肽的活化抗体与阻断性抗B7-2和/或抗B7-1单克隆抗体)可联合用作单一组合物或单独施用(同时地或顺
序地)以下调受试者中免疫细胞介导的免疫反应。此外,治疗有效量的具有VISTA(PD-L3)多肽活性的一种或多种肽与具有B7-1和/或B7-1活性的一种或多种多肽一起可联合其它下调试剂用于影响免疫反应。其它免疫调节试剂的实例包括阻断共刺激信号(例如,针对CD28或ICOS)的抗体、通过CTLA4活化抑制性信号的抗体和/或针对其它免疫细胞标志物(例如,针对CD40、CD40配体或细胞因子)的抗体、融合蛋白(例如,CTLA4-Fc或PD-1-Fc)以及免疫抑制药物(例如,雷帕霉素、环孢霉素A或FK506)。VISTA(PD-L3)多肽也可用于构造通过破坏细胞而阻断免疫细胞功能的治疗剂。例如,VISTA(PD-L3)多肽的一些部分可连接至毒素,以制备能够触发其结合的细胞发生破坏的细胞毒性剂。
[0353] 此类细胞毒性剂(例如,VISTA(PD-L3)蓖麻毒素(单独地或与PD-L1蓖麻毒素相结合))之一或组合融合进患者可导致免疫细胞死亡,尤其是鉴于表达较高VISTA(PD-L3)结合伴侣量的活化免疫细胞这一事实。例如,由于PD-1在活化的淋巴细胞表面上诱导,因此VISTA(PD-L3)多肽可用于通过Fc-R依赖性机制或通过将细胞毒性药物(例如,蓖麻毒素、肥皂草素或卡奇霉素)偶联到VISTA(PD-L3)多肽的消除(以杀死表达VISTA的受体的细胞)来靶向这些特定细胞的去除。可将毒素偶联至抗VISTA(PD-L3)抗体以便靶向表达VISTA(PD-L3)的抗原呈递细胞死亡。在又一个实施方案中,VISTA(PD-L3)抗体-毒素可以是双特异性抗体。此类双特异性抗体可用于靶向特定细胞群,例如,使用只存在于某些类型细胞上的标志物,例如B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞或朗格汉斯细胞。通过活化VISTA(PD-L3)活性或VISTA(PD-L3)与免疫细胞的相互作用(并因而刺激VISTA(PD-L3)的负信号传导功能)来下调免疫反应可用于下调例如组织、皮肤和器官移植情形中、移植物抗宿主病(GVHD)或过敏症中或例如系统性红斑狼疮和多发性硬化的自身免疫疾病中的免疫反应。例如,阻断免疫细胞功能导致组织移植中减少的组织破坏。通常地,在组织移植物中,移植物的排斥通过免疫细胞将其识别为外源物而引发,然后发生破坏移植物的免疫反应。在移植前或移植时单独地或结合另一种下调剂而施用促进免疫细胞上的VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的分子(例如,可溶性、多聚物形式的VISTA(PD-L3)多肽)可抑制协同刺激信号的产生。此外,促进VISTA(PD-L3)活性还可足以使免疫细胞无能,从而诱导受试者中的耐受性。
[0354] 为了在受试者中实现足够的免疫抑制或耐受性,还可能所需的是阻断其它分子的共刺激功能。例如,可能所需的是阻断B7-1和B7-2的功能,方式是在移植前或移植时施用可溶形式的具有这些抗原每一者的活性的肽的组合或针对这些抗原的阻断性抗体(单独地或合在单一组合物中)。或者,可能所需的是促进VISTA(PD-L3)的抑制活性并抑制B7-1和/或B7-2的共刺激活性。可结合本发明的下调方法使用的其它下调剂包括例如:通过CTLA4传递抑制信号的试剂、可溶形式的CTLA4、通过CTLA4活化抑制信号的抗体、针对其它免疫细胞标志物的阻断性抗体、或可溶形式的其它受体配体对(例如,破坏CD40与CD40配体之间相互作用的试剂(例如,抗CD40配体抗体))、针对细胞因子的抗体或免疫抑制药物。例如,活化VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用可用于治疗自身免疫疾病。许多自身免疫疾病是不当的免疫细胞活化的结果,这些免疫细胞对自体组织具有反应性,并促进疾病病理学中涉及到的细胞因子和自身抗体的产生。防止自体反应性免疫细胞的活化可减轻或消除疾病症状。施用促进VISTA(PD-L3)(PD-L3)的活性或VISTA与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂可诱导能导致疾病长期缓解的自体反应性免疫细胞的抗原特异性耐受性。另外,共施用通过破坏B7分子与共刺激受体的受体-配体相互作用来阻断免疫细胞共刺激的试剂可用于抑制免疫细胞活化,从而防止疾病过程中可能涉及到的自身抗体或细胞因子的产生。试剂在预防或缓解自身免疫疾病方面的疗效可使用人自身免疫疾病的多种良好表征的动物模型来测定。实例包括鼠实验性自身免疫性脑炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB杂交小鼠中的系统性红斑狼疮、鼠自身免疫胶原性关节炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病以及鼠实验性重症肌无力。参见Paul编著,Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989,第840-856页。
[0355] 抑制免疫细胞活化可用于在治疗学上治疗过敏症和过敏反应,例如通过抑制IgE的产生。促进VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂可施用给过敏受试者,以抑制受试者中免疫细胞介导的过敏反应。刺激VISTA(PD-L3)活性或与其天然结合伴侣间的相互作用可伴随暴露于结合合适的MHC分子的过敏原。过敏反应在本质上可以是全身性的或局部的,具体取决于过敏原的进入途径以及IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的沉积模式。因此,免疫细胞介导的过敏反应可通过施用促进VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与免疫细胞相互作用的试剂来局部地或全身性地抑制。
[0356] 通过刺激VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用来下调免疫应答还可用于治疗对自体组织的自身免疫攻击。因此,因自身免疫攻击而导致的或加重的病症(例如,心脏病、心肌梗塞或动脉粥样硬化)可通过增强VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣的结合而缓解或改善。因此,通过刺激
VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其反受体间的相互作用而调节自身免疫攻击所加重的病症,例如自身免疫疾病(以及例如心脏病、心肌梗塞和动脉粥样硬化的病症),也在本发明的范围内。
[0357] 免疫应答的上调
[0358] 抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用作为上调免疫反应的手段也可用于治疗。上调免疫应答可以是增强现有免疫反应或引发初始免疫反应的形式。例如,通过抑制VISTA(PD-L3)活性来增强免疫反应可用于微生物(例如,细菌、病毒或寄生虫)感染的情况或用于免疫抑制的情况。例如,抑制VISTA(PD-L3)活性的试剂,例如针对VISTA(PD-L3)的非活化抗体(即,阻断性抗体)或可溶形式的VISTA(PD-L3),可在治疗学上用于其中下调抗体和细胞介导的反应(从而导致更快的或彻底的病毒、细菌或寄生虫清除)将是有益的情形。这些病症包括病毒性皮肤疾病,例如疱疹或带状疱疹,在该情况下,这样的试剂可在皮肤上外用。此外,全身性病毒疾病,例如流感、普通感冒和脑炎可通过全身性施用此类试剂而得到缓解。在某些情况下,可能所需的是进一步施用上调免疫反应的其它试剂,例如通过共刺激受体转导信号的B7家族成员的形式,以便进一步增强免疫反应。
[0359] 可在受感染的患者中通过以下方式增强免疫反应:从患者体内去除免疫细胞,将免疫细胞在体外与抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂接触,以及将体外刺激的免疫细胞重新引入患者体内。在另一个实施方案中,增强免疫反应的方法涉及:从患者体内分离受感染的细胞(例如,病毒感染的细胞),将它们用编码无法结合其天然结合伴侣的VISTA(PD-L3)形式的核酸分子转染使得细胞在其表面表达VISTA(PD-L3)分子的全部或一部分,以及将转染后的细胞重新引入患者体内。转染的细胞可能在体内能防止向免疫细胞传递抑制信号,从而活化免疫细胞。
[0360] 抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂可在预防学上用于针对各种多肽(例如,衍生自病原体的多肽)的疫苗。针对病原体(例如病毒)的免疫力可通过用合适佐剂中的病毒多肽连同抑制VISTA(PD-L3)活性的试
剂进行疫苗接种来诱导。或者,包含下述基因的载体可用于疫苗接种,所述基因编码病原性抗原以及阻断VISTA(PD-L3)与免疫细胞间相互作用的VISTA(PD-L3)形式这两者。核酸疫苗可通过多种方式施用,例如通过注射(例如,肌内注射、皮内注射,或通过使用粒子加速器或压缩气体将粒子注入皮肤的基因枪将DNA包被的金微粒生物弹射(biolistic)进表皮(Haynes等(1996)J.Biotechnol.44:37))。或者,核酸疫苗可通过非侵入性方式施用。例如,可将纯的或脂质配制的DNA递送到呼吸系统或靶向别的地方,例如,经口递送DNA到派伊尔结(Peyers patches)。Schubbert(1997)Proc Natl.Acad.Sci.USA 94:961。减毒微生物可用于递送到粘膜表面。Sizemore等人(1995)Science270:29。
[0361] 疫苗中的抗原为自体抗原。这样的疫苗可用于调节生物体中的耐受性。用自体抗原和阻断VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂进行免疫可破坏耐受性(即,干扰自体抗原的耐受性)。这样的疫苗还可以包含佐剂,例如明矾或细胞因子(例如,GM-CSF、IL-12、B7-1或B7-2)。在一个实施方案中,抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂可与I类MHC多肽一起施用,例如通过经转染以共表达VISTA(PD-L3)多肽或阻断性抗体的细胞以及MHC I类α链多肽和β2微球蛋白,从而导致T细胞活化并提供对感染的免疫。例如,疫苗可用的病毒性病原体包括:乙肝、丙肝、EB病毒、巨细胞病毒、HIV-1、HIV-2、结核、疟疾和血吸虫病。
[0362] 抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其结合伴侣间的相互作用可用于治疗肿瘤免疫。肿瘤细胞(例如,肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、成神经细胞瘤或淋巴瘤)可用抑制VISTA(PD-L3)活性的核酸分子转染。这些分子可以为例如VISTA(PD-L3)的反义核酸分子或可编码非活化抗VISTA(PD-L3)抗体。这些分子还可以为抗VISTA(PD-L3)抗体的可变区。如果需要,肿瘤细胞也可用活化共刺激的其它多肽(例如,B7-1或B7-2)转染。将转化的肿瘤细胞返回患者,其导致VISTA(PD-L3)活性受到抑制(例如,局部抑制)。或者,基因治疗技术可用于靶向用于体内转染的肿瘤细胞。
[0363] 刺激对肿瘤细胞的免疫应答还可通过以下方式实现:通过用抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂治疗受试者,从而抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用。此类试剂的
优选实例包括例如反义核酸分子、识别并阻断VISTA(PD-L3)的抗体、以及阻断免疫细胞上VISTA(PD-L3)与其天然存在的结合伴侣间的相互作用的化合物(例如,可溶性、单价VISTA(PD-L3)分子;不结合到抗原呈递细胞上Fc受体的可溶形式的VISTA(PD-L3)分子;
可溶形式的VISTA(PD-L3)结合伴侣;以及受试者筛选测定中鉴定的化合物)。此外,不含MHC I类或MHC II类分子的或不能表达足量MHC I类或MHC II类分子的肿瘤细胞可用编
码MHC I类α链多肽和β2微球蛋白多肽或MHC II类α链多肽和MHC II类.β.链多
肽的全部或一部分(例如,胞质结构域截短部分)的核酸转染,从而在细胞表面上表达MHC I类或MHC II类多肽。结合VISTA(PD-L3)抑制性多肽或反义核酸而表达合适的I类或II
类MHC可诱导针对转染肿瘤细胞的T细胞介导的免疫反应。任选地,编码阻断MHC II类相关多肽(例如恒定链)表达的反义构建体的基因,也可用编码VISTA(PD-L3)抑制性多肽或反义核酸的DNA共转染,以促进肿瘤相关抗原呈递并诱导肿瘤特异性免疫。通过B7阴性鼠肿瘤细胞表达B7-1可诱导T细胞介导的特异性免疫,其伴随肿瘤排斥以及对小鼠肿瘤攻击的延长保护。Chen,等人(1992)Cell 71:1093–1102;Townsend&Allison(1993)Science
259:368–370;Baskar,等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.90:5687–5690。因此,诱导人体受试者中免疫细胞介导的免疫反应可足以克服受试者中的肿瘤特异性耐受性。在另一个实施方案中,免疫反应可通过抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用来刺激,以便克服预先存在的耐受性。例如,针对受试者无法对其发生显著免疫反应的抗原(例如,肿瘤特异性抗原)的免疫反应可通过以下方式诱导:施用抑制VISTA(PD-L3)的活性或者VISTA(PD-L3)结合到其天然结合伴侣的能力的试剂,可用作佐剂以在主动免疫过程中加强对外源性抗原的反应。
[0364] 从受试者获取免疫细胞,并在抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂存在的情况下进行离体培养,以扩大免疫细胞群。在另外的实施方案中,随后将免疫细胞施用给受试者。可通过例如为免疫细胞提供初级活化信号和共刺激信号来刺激免疫细胞体外增殖,如本领域所已知的。各种形式的抑制
VISTA(PD-L3)活性的VISTA(PD-L3)多肽或试剂均可用于共刺激免疫细胞增殖。在一个实施方案中,将免疫细胞根据WO 94/29436中所述的方法离体培养。共刺激分子可以为可溶性的,连接到细胞膜或连接到固体表面,例如微珠。
[0365] 在执行本文所述的任何方法时,通过施用一种或多种另外的试剂来上调免疫反应也在本发明的范围内。例如,使用已知可刺激免疫反应的其它试剂,例如细胞因子、佐剂或刺激性形式的共刺激分子或其配体可联合抑制VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂使用。
[0366] 因T细胞上VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其反受体间相互作用的调节而受到调节的细胞因子的鉴定
[0367] 本文中所述的VISTA(PD-L3)分子可用于鉴定下述细胞因子,其通过免疫细胞产生或其产生情况在免疫细胞响应VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的调节中得到增强或受到抑制。免疫细胞可在体外通过初级活化信号非最优地刺激,例如,T细胞可通过佛波酯、抗CD3抗体或优选地抗原与MHC II类分子联合进行刺激,以及给予共刺激信号,例如通过刺激形式的B7家族抗原,例如通过用编码B7多肽的核酸分子转染并在其表面上表达肽的细胞,或通过可溶性、刺激形式的肽。随后可将细胞与表达VISTA(PD-L3)的细胞接触(例如,针对VISTA(PD-L3)的抗体)。已知的释
放进培养基的细胞因子可通过ELISA或通过阻断细胞因子来抑制免疫细胞增殖或抑制细胞因子诱导的其它细胞类型增殖的抗体的能力来鉴定。例如,IL-4ELISA试剂盒可获自Genzyme(Cambridge,MA.),IL-7阻断性抗体同样地获自Genzyme(Cambridge,MA.)。针对IL-9和IL-12的阻断性抗体可获自GeneticsInstitute(Cambridge,MA)。随后可确定刺激或阻断VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其结合伴侣间的相互作用对细胞因子谱的作用。如上文所述并如实施例中所示,VISTA(PD-L3)明显抑制免疫细胞的IL-2和γ干扰素表达。
[0368] 如上所述的体外免疫细胞共刺激测定还可用在鉴定新型细胞因子的方法中,所述新型细胞因子可通过调节VISTA(PD-L3)活性而受到调节。例如,其中CD28/CTLA4途径的刺激似乎增强IL-2分泌,ICOS途径的刺激似乎增强IL-10分泌。Hutloff,等人(1999)Nature397:263。如果在共刺激时诱导的特定活性(例如,免疫细胞增殖)无法通过添加已知细胞因子的阻断性抗体而得到抑制,则活性可能由未知细胞因子的作用产生。在共刺激后,此细胞因子可通过常规方法从培养基中纯化,以及其活性可通过其诱导免疫细胞增殖的能力来测量。
[0369] 要鉴定可能在耐受性的诱导中发挥作用的细胞因子,可使用如上所述的体外T细胞共刺激测定。在该情况下,将向T细胞给予初级活化信号,并将其与所选的细胞因子接触,但不给予共刺激信号。在洗涤并静息免疫细胞后,将细胞用初级活化信号和共刺激信号这两者进行再次攻击。如果免疫细胞不响应(例如,增殖或产生细胞因子),则它们已变得耐受,细胞因子未阻止耐受性的诱导。然而,如果免疫细胞作出响应,则细胞因子阻止了耐受性的诱导。可使那些能够阻止耐受性诱导的细胞因子在体内联合阻断B淋巴细胞抗原的试剂而靶向阻断,以之作为更有效的手段诱导移植受体或自身免疫疾病受试者中的耐受性。例如,可以与促进VISTA(PD-L3)活性或者VISTA(PD-L3)与其结合伴侣间的相互作用的试剂一起向受试者施用细胞因子阻断性抗体。
[0370] 因此,总而言之,现在已鉴定了通过Treg细胞表达的程序性死亡配体(PDL)家族的新成员。该新型蛋白已被命名为VISTA(PD-L3)。此PD-L家族的受体为包含单个IgV结构域的I型跨膜蛋白,而配体为表达IgV和IgC胞外域两者的I型跨膜蛋白。与其它PDL家族成员一样,VISTA(PD-L3)也在体外共刺激T细胞的αCD3增殖。此外,VISTA(PD-L3)的表达在αCD3活化的Treg中升高,在αGITR存在的情况下降低。
[0371] 还已鉴定了在αCD3/αGITR刺激时发生上调的第二种TNF样蛋白。该蛋白已被命名为Treg-sTNF。这些蛋白可能牵涉免疫的接触依赖性和旁分泌抑制,因而可用于调节(例如,抑制或刺激)免疫反应以及治疗涉及Treg信号传导的疾病和病症。例如,VISTA(PD-L3)蛋白可用作共刺激信号以刺激或增强免疫细胞活化。VISTA(PD-L3)蛋白和VISTA(PD-L3)结合剂和VISTA(PD-L3)激动剂及拮抗剂特别地可用于治疗免疫病症,其中T细胞免疫的调节是所需的,例如,调节T细胞活化、分化和增殖,尤其是调节CD4+和CD8+T细胞增殖、细胞因子产生以及在T细胞与骨髓源性APC之间的同种相互作用期间的T细胞反应。
[0372] VISTA和VISTA缀合物多肽
[0373] 本发明提供了VISTA和VISTA缀合物多肽。本发明人令人惊讶地发现VISTA和VISTA缀合物多肽用作负免疫调节剂。示例性VISTA多肽提供于SEQ ID NO:2、4和5中。
本发明的VISTA(PD-L3)分子包括一个或多个以下结构域:信号肽结构域、IgV结构域、胞外域、跨膜结构域或胞质结构域。本发明的分离的多肽,优选VISTA(PD-L3)多肽,可包含与SEQ ID NO:2或4或5的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:1或3或其
片段或互补序列充分相同的核苷酸序列编码。如本文中所用,术语“充分相同的”是指包含与第二氨基酸或核苷酸序列充分或最少数量的相同或等同(例如,具有相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基或核苷酸以使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列享有共同的结构域或基序和/或共同的功能活性的第一氨基酸或核苷酸残基。例如,享有共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在该结构域的整个氨基酸序列上具有至少30%、40%或50%的同源性,优选地60%的同源性,更优选地70-80%,甚至更优选地90-95%的同源性,并包含至少一个、优选两个结构域或基序,则在本文中定义为充分相同。此外,享有至少30%、40%或50%,优选地60%,更优选地70-80%或90-95%的同源性并享有共同功能活性的氨基酸或核苷酸序列在本文中定义为充分相同。VISTA多肽的胞外域可包含IgV结构域和可包含信号肽结构域。参见图A-E1和23A-C。
[0374] VISTA(PD-L3)多肽可具有至少一个胞外域以及信号肽结构域、IgV结构域、跨膜结构域和胞质结构域的一个或多个,并优选地由下述核酸分子编码,所述核酸分子具有的核苷酸序列在严格杂交条件下与包含本文SEQ ID NO:1或3核苷酸序列的互补序列的核酸分子杂交。示例性分离的人和鼠VISTA(PD-L3)cDNA的核苷酸和氨基酸序列以及预测的人VISTA(PD-L3)多肽的氨基酸序列包含在本文的序列表中。
[0375] 本发明的VISTA(PD-L3)多肽可基于“跨膜结构域”的存在来鉴定。本文中鉴定了PDL3的跨膜结构域区。参见,例如,图1A-E和23A-C。可基于多肽或相应核酸分子中“IgC结构域”的不存在和“IgV结构域”的存在来鉴定本发明的VISTA(PD-L3)分子。构成IgV结构域的天然人和鼠VISTA(PD-L3)多肽的氨基酸残基可见于图1A-E和23A-C。IgV结构域的存在可能是VISTA(PD-L3)结合至其天然结合伴侣所需的。
[0376] 编码VISTA多肽可使用标准的分子生物学技术来修饰,这导致变异多肽,所述变异多肽包括至少一个VISTA和VISTA缀合物(其包含但不限于氨基酸序列的缺失、添加和替换),保留了VISTA和VISTA缀合物的特异性抗原性(例如,VISTA多肽被抗VISTA抗体结合)。此外,变异多肽包括至少一个VISTA多肽,还可保留VISTA多肽的抗原性(例如,在于受试者中进行免疫后,分别产生针对VISTA多肽和变异VISTA多肽的特异性免疫反应)。
可将VISTA和VISTA缀合物多肽与药用载体一起配制来制造用作“癌症疫苗”的抗原组合物(例如,引发抗VISTA和VISTA缀合物的特异性免疫反应,在受试者中免疫后产生抗肿瘤抗体的药物组合物)。本文中描述的VISTA多肽和VISTA缀合物可用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病。
[0377] 多肽衍生物和类似物
[0378] 应理解,本文中描述的多肽可以是降解产物、合成肽或重组肽以及拟肽、合成肽、类肽以及半类肽(例如,肽类似物,其可具有例如使肽在体内时更稳定或更加能够穿透进细胞的修饰)。本文中描述的VISTA和VISTA缀合物多肽的修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(例如,CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主链修饰和残基修饰。制备拟肽化合物的方法在本领域是公知的。Martin,(2010)Quantitative Drug Design:A Critical Introduction[第2版]CRC Press。
[0379] 肽中的肽键(-CO-NH-)可被例如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)替代,其中
R是任意烷基,例如甲基、卡巴键(-CH2-NH-)、羟乙烯基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH=CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-),其中R是“正常”侧链,天然呈现在碳原子上。这些修饰可在沿着肽链的任何键上和甚至同时在数个(2–3)键上发生。
[0380] 天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可被合成的非天然酸例如苯基甘氨酸、TIC、基丙氨酸(Nol)、苯丙氨酸的环-甲基化衍生物、苯丙氨酸的卤化衍生物或邻-甲基-酪氨酸替代。除了上述氨基酸以外,本发明的多肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或1或多个非氨基酸单体(例如,脂肪酸、复合碳水化合物),例如,羟脯氨酸,磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸;和其它罕见氨基酸,包括但不限于:2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外,术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
[0381] 由于本发明的多肽优选用于需要肽以可溶形式存在的治疗剂,因此本发明的多肽可包含一个或多个非天然或天然极性氨基酸,包括但不限于丝氨酸和苏氨酸,它们因它们的含羟基侧链而能够提高肽的溶解度
[0382] 本发明的多肽可以以线性形式存在,尽管应当理解在一些情况下也可使用环状形式。
[0383] 本文中描述的VISTA和VISTA缀合物多肽可从已被改变以表达其的细胞(例如,重组体)纯化。可将编码VISTA和VISTA缀合物多肽的DNA序列插入表达载体,随后转化(或转染)进适当的宿主细胞和/或在转基因动物中表达。随后可通过本领域已知的方法分离所表达的VISTA和VISTA缀合物多肽。参见,例如,Maniatis,等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0384] 本发明的的多肽可以例如通过使用标准固相技术来生物化学合成。这些方法包括专属固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。当肽是相对短
的(即,10kDa)和/或当它不能通过重组技术(即,不由核酸序列编码)来产生,从而
牵涉不同化学试剂时,优选使用这些方法。固相肽合成法在本领域中是公知的并且由
Stewart(1984)Solid Phase Peptide Syntheses[第2版]Pierce Chemical Company and Benoiton(2005)Chemistry of Peptide Synthesis CRC Press进一步描述。合成肽可通过制备型高效液相色谱来纯化,其组成可通过氨基酸测序来确认。参见,Creighton(1992)[第2版]Proteins,Structures and Molecular Principles W.H.Freeman和Company;
Aguilar(2004)[编辑]HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols Humana Press;Simpson(2002)Protein Sequencing Protocols[第2版]Humana Press。
[0385] 在其中需要大量本发明的多肽的情况下,可使用重组技术例如由Invitrogen(2002)“Guide to Baculovirus Expression Vector Systems(BEVs)and
Insect Culture Techniques”Instruction Manual;Hatti-Kaul和Mattiasson(2003)[编辑]Isolation and Purification of Proteins;Ahmed(2004)Principles and Reactions of Protein Extraction,Purification and Characterization CRC Press描述的重组技术来产生本发明的多肽。其它重组技术例如由例如Bitter,等人(1987)Methods in Enzymol.153:516–544,Studier,等人(1990)Methods in Enzymol.185:60–89,Brisson,等人(1984)Nature 310:511–514,Takamatsu,等人(1987)EMBO J.6:307–311,Coruzzi,等人(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli,等人(1984)Science 224:838–843,Gurley,等 人 (1986)Mol.Cell.Biol.6:559–565 和 Weissbach&Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,第VIII节,第421–463页描述。
[0386] 肽序列变体
[0387] 对于本文中描述的任何VISTA和VISTA缀合物序列,可通过系统地添加或移除氨基酸残基以产生更长或更短的肽,随后测试这些序列和通过从该点沿着抗原向上或向下步行具有更长或更短的大小的窗口生产的序列,来实现进一步表征或最优化。如本领域中已知的或如本文中描述的,在免疫原性测定中将该产生新的候选靶的方法与基于那些序列的抗原性分子的功效的测试结合,可导致对抗原的进一步操作。更进一步地,这样最优化的序列可以通过例如添加、缺失或如本领域已知的和/或本文所讨论的其它突变来调整,以进一步最优化VISTA和VISTA缀合物(例如,提高血清稳定性或循环半衰期、提高热稳定性、增强递送、增强免疫原性、增加溶解度、靶向特定的体内位置或细胞类型)。
[0388] 本文中描述的VISTA和VISTA缀合物多肽可包含保守置换突变(即,一个或多个氨基酸被相似氨基酸置换)。例如,保守置换是指用相同大类中的另一种氨基酸对氨基酸的置换,例如另一种酸性氨基酸对一种酸性氨基酸的置换,另一种碱性氨基酸对一种碱性氨基酸的置换或另一种中性氨基酸对一种中性氨基酸的置换。
[0389] VISTA和VISTA缀合物多肽序列可与SEQ ID NO:2、4或5的多肽序列的任一个或多个具有至少约60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99或100%序列同一性。更优选,本发明涉及与SEQ ID NO:2、4或5的VISTA和VISTA缀合物多肽序列的任一个或多个多肽序列具有至少约95%序列同源性,更优选至少约98%序列同源性,更优选选至少约99%序列同源性的多肽序列。用于测定氨基酸序列以及核酸序列之间的同源性的方法对于本领域普通技术人员来说是公知的。参见,例如,Nedelkov&Nelson(2006)New and Emerging Proteomic Techniques Humana Press。
[0390] 因此,VISTA和VISTA缀合物多肽可与多肽序列具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%序列同源性。例如,VISTA和VISTA缀合物多肽可与SEQ ID NO:2、4或
5具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同源性。
[0391] 术语同源性或同一性理解为意指以百分比表示的与另一个蛋白质相同的氨基酸(同一性)的数目。同一性优选通过借助于计算机程序将给定的序列与其它蛋白质相比较来测定。如果彼此比较的序列在长度上不同,则将以这样的方式测定同一性:更短的序列与更长的序列共有的氨基酸的数目决定百分比同一性。同一性可常规地通过已知的计算程序来测定,所述程序可公共地获得,例如ClustalW.Thompso n,等人(1994)Nucleic Acids Research 22:4673–4680。ClustalW可从欧洲分子生物学实验室公共地获得,并且可从各种因特网网页,除了别的以外,IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculai re et Cellulaire)和EBI以及所有镜像EBI因特网网页(欧洲生物信息学研究所)下载。如果ClustalW计算机程序1.8版用于测定例如本申请的参考蛋白质与其它蛋白质之间的同一性,则将设置下列参数:K TUPLE=1,TOPDIAG=5,WINDOW=5,PAIRGAP=3,GAPOPEN=10,GAPEXTEND=0.05,GAPDIST=8,MAXDIV=40,MATRIX=G ONNET,ENDGAPS(OFF),NOPGAP,NOHGAP。也参见可在线获得的欧洲生物信息学研究所(EBI)工具盒和Smith(2002)Protein Sequ encing Protocols[第2版]Humana Press。
[0392] 发现相似序列的一个可能是进行序列数据库搜索。此处,可输入一个或多个序列作为称为查询的内容。随后使用统计计算机程序将该查询序列与存在于选择的数据库中的序列相比较。这样的数据库查询(blast搜索)对于本领域普通技术人员来说是已知的,并且可在不同的提供商进行。如果,例如,这样的数据查询在NCBI(美国国家生物技术信息中心)进行,则应当使用用于各自比较查询的标准设置。对于蛋白质序列比较(blastp),这些设置为:Limit entrez=未激活的;过滤=低的激活的复杂度;期望值=10;字长=3;矩阵=BLOSUM62;空位罚分:存在=11,延伸=1。这样的查询的结果,除其它参数以外,是查询序列与数据库中发现的相似序列之间的同一性的程度。
[0393] VISTA和VISTA缀合物包括所述多肽的功能性片段。所述多肽的“功能性片段”包括编码所述VISTA和VISTA缀合物的基因或cDNA的片段,所述片段能够引发免疫反应(例如,体液或细胞免疫反应)。因此,例如,根据本发明的VISTA和VISTA缀合物的片段(其对应于促成抗原的免疫原性的氨基酸残基)可用于充当引发免疫反应(例如,体液或细胞免疫反应)的抗原。本发明的该方面还包括根据本发明的多肽的差异剪接的同种型和转录起始。根据本发明揿肽还可包含VISTA和VISTA缀合物的片段、衍生物和等位变体。用于产生VISTA和VISTA缀合物多肽的片段的方法和材料在本领域是公知的。参见,例如,Maniatis,等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第3版](Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
[0394] 变异VISTA和VISTA缀合物多肽可保留它们的结合它们各自的抗体的抗原特异性(例如,变异VISTA多肽被抗VISTA抗体结合)。完全抗原性变体可仅在非关键残基
或非关键区域中包含保守变异或变异。抗原性变体还可包含相似氨基酸的置换,这不导致抗原性的变化或显著变化。或者,这样的置换可在一定程度上正面或负面影响抗原性。
非抗原性变体通常在表位的关键残基或关键区域中包含一个或多个非保守氨基酸置换、缺失、插入、倒位或截短或置换、插入、倒位或缺失。用于修饰VISTA和VISTA缀合物多肽的同时保持多肽对于它们各自的抗体的特异性抗原性的分子生物学和生物化学技术在本领域中是公知的。参见,例如,Ho,等人(1989)Gene 77(1):51–59;Landt,等人(1990)Gene 96(1):125–128;Hopp&Woods(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(6):3824–3828;
Kolaskar&Tongaonkar(1990)FEBS Letters 276(1–2):172–174;和 Welling,等 人(1985)FEBS Letters188(2):215–218。
[0395] “用作VISTA激动剂(模拟物)或VISTA拮抗剂的VISTA多肽的变体”
[0396] VISTA多肽的变体可通过诱变例如VISTA多肽的不连续点突变或截短来产生。VISTA多肽的激动剂可大体上保留VISTA多肽的天然存在的形式的相同的或一个亚组的生物活性。VISTA多肽的拮抗剂可通过例如竞争性调节VISTA多肽的VISTA介导的活性抑制VISTA多肽的天然存在的形式的一种或多种活性。因此,特定生物效应可通过用具有有限功能的变体处理来引发。例如,受试者可用具有多肽的天然存在的形式的一个亚组的活性的变体来治疗,所述变体相对于利用VISTA多肽的天然存在的形式的治疗在受试者中具有更少的副作用。
[0397] 可通过筛选VISTA多肽的突变体例如截短突变体的组合文库来鉴定用作VISTA激动剂(模拟物)或VISTA拮抗剂的VISTA多肽的变体的VISTA多肽激动剂或拮抗性活性。可用主题VISTA(PD-L3)结合剂治疗的疾病先前已被鉴定,包括各自炎性、自身免疫性、癌症、过敏性和感染性疾病。特别优选的适应症是多发性硬化。
[0398] 肽模拟物
[0399] 除了只由天然存在的氨基酸组成的VISTA多肽外,还提供了VISTA拟肽。肽类似物通常用于制药行业,作为具有与模板肽相似性质的非肽类药物。这些类型的非肽类化合物称为“肽模拟物”或“拟肽”(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.15:29;Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics(第2卷)Andrew Abell(编辑)(1999)JAI Press,Inc.和Evans等人(1987)J.Med.Chem 30:1229)并通常在计算机分子建模的辅助下开发。与
治疗学上有用的肽结构相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗或预防作用。一般来讲,拟肽与范式多肽(即,具有生物学或药理学活性的多肽)例如人或小鼠VISTA在结构上相
似,但具有一个或多个任选地被选自由下列组成的组的键联代替的肽键:—CH2NH—、—CH2S—、—CH2—CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2—、—CH(OH)CH2—和—
CH2SO—,其中通过本领域已知的并在以下参考文献中进一步描述的方法进行:Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins Weinstein,B.,编辑,Marcel Dekker,New York,第267页(1983);Spatola,Vega Data(1983年3月),第 1 卷,Issue 3,“Peptide Backbone Modifications”;Morley(1980)Trends.Pharm.Sci.第463–468页;Hudson,等人(1979)Int.J.Pept.Prot.Res.14:177–185(—CH2NH—、CH2CH2—);Spatola, 等 人 (1986)Life.Sci.38:1243–1249(—CH2—S);Hann,(1982)J.Chem.SoC Perkin.Trans.I 307–314(—CH—CH—,顺式和反式);Almquist,等人
(1980)J.Med.Chem.23:1392-1398(—COCH2—);Jennings-White,等人(1982)Tetrahedron Lett.23:2533(—COCH2—);(—CH(OH)CH2—);Holladay, 等 人 (1983)Tetrahedron.Lett.24:4401–4404(—C(OH)CH2—); 和 Hruby(1982)Life Sci.31:189–199(—CH2—S—)。尤其优选的非肽键联为—CH2NH—。此类肽模拟物可具有明显优于多肽实施方案的优势,包括例如:更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收、效能、功效等)、改变的特异性(例如广谱生物活性)、降低的抗原性等等。标记拟肽通常涉及将一个或多个标签直接地或通过间隔物(例如,酰胺基)共价连接到通过定量结构-活性数据和/或分子建模而预测的拟肽上的非干扰位置。此类非干扰位置通常为与拟肽所结合的以产生治疗效果的大分子不形成直接接触的位置。拟肽的衍生化(例如,标记)应基本上不干扰拟肽的所需生物学或药理学活性。
[0400] VISTA氨基酸序列的一个或多个氨基酸用相同类型的D-氨基酸进行系统性取代(例如,D-赖氨酸取代L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。此外,包含VISTA氨基
酸序列或基本上相同的序列变异性的限制性肽可通过本领域已知的方法产生(Rizo和
Gierasch(1992)Annu.Rev.Biochem.61:387);例如,通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。本文鉴定的VISTA多肽的氨基酸序列将使得本领域普通技术人员能够产生对应于VISTA肽序列及其序列变体的多肽。此类多肽可在原核或真核宿主细胞中通过表达编码VISTA肽序列(通常为较大多肽的一部分)的多核苷酸而产生。或者,此类多肽可通过化学方法合成。在重组宿主中表达异源多肽、化学合成多肽以及体外翻译的方法在本领域中是熟知的。某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或肽延伸至核心序列可提供有利的物理、化学、生物化学和药理学特性,例如:增强的稳定性、增强的效能和/或疗效、血清蛋白酶抗性、所需的药动学特性等等。肽可在治疗学上用于治疗疾病,例如通过改变患者中的共刺激。
[0401] 对于功能是必需的氨基酸可通过本领域已知的方法来鉴定,例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变。Cunningham,等人(1989)Sci.244:1081–85。后一种方法在分子的每一个残基上引入单个丙氨酸突变。随后测试所得突变体分子的生物活性例如表位结合或体外ADCC活性。对于配体-受体结合是至关重要的位点还可通过结构分析例如晶体学、核磁共振或光亲和标记确定。Smith,等人(1992)J.Mol.Biol.224:899–904;de Vos,等人(1992)Sci.255:306–12。
[0402] 例如,一类置换为保守氨基酸置换。这样的置换是用具有相似特征的另一种氨基酸替换VISTA和VISTA缀合物多肽中的给定的氨基酸。通常看作保守置换的是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的一种氨基酸对另一种氨基酸的替换;羟基残基Ser与Thr之间的互换,酸性残基Asp与Glu的互换,酰胺残基Asn与Gln之间的置换,碱性残基Lys与Arg之间的互换,芳香族残基Phe、Tyr之间的替换。氨基酸变化可能是表型沉默的指导方针见于例如Bowie,等人(1990)Sci.247:1306–10中。因此,本领域普通技术人员理解,本发明人具有无所有特定变体的描述的肽变体。关于氨基酸序列,本领域普通技术人员将承认,在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、缺失或添加是其中所述改变导致化学上相似的氨基酸对氨基酸的置换的“保守修饰变体”。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表在本领域是公知的。此外,这样的保守修饰变体不排除多态性变体、种间同源物和本发明的等位基因。参见,例如,Creighton(1992),Proteins:Structures and Molecular Properties[第2版]W.H.Freeman。
[0403] 此外,多肽常常含有除20种“天然存在的”氨基酸外的氨基酸。此外,许多氨基酸,包括末端氨基酸,可通过天然过程,例如加工和其它翻译后修饰,或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰。已知的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联的、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、g-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加、如精氨酰化和泛素化。参见Creighton(1992)Proteins:Structure and Molecular Properties[第2版]和Lundblad(1995)Techniques in Protein Modification[第1版]。关于该主题的许多详细综述是可获得的。参见,例如,Wold(1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins Acad.Press,NY;
Seifter,等人(1990)Meth.Enzymol.182:626–46;和Rattan,等人(1992)Ann.NY Acad.Sci.663:48–62.。
[0404] 片段
[0405] VISTA多肽的“生物活性部分”包括参与VISTA分子与非VISTA分子(例如,VISTA的天然配体)之间的相互作用的VISTA多肽片段。VISTA多肽的生物活性部分包括含有以下氨基酸序列的肽,所述序列与VISTA多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2、4或5所示的氨基酸序列)充分相同或由其衍生而来,所述肽包含比全长VISTA多肽更少的氨基酸并表现出VISTA多肽的至少一种活性。通常地,生物活性部分包括具有VISTA多肽的至少一种活性的结构域或基序,这些活性例如为调节(抑制)CD4T细胞对抗CD3的增殖反应,以抗原特异性方式抑制同种CD4T细胞的增殖反应,作用于特定细胞因子的表达。VISTA多肽的生物活性部分可以是长度例如为25、50、75、100、125、150、175、200、225或更多个氨基酸的多肽。VISTA多肽的生物活性部分可用作开发调节VISTA介导的活性(例如,免疫细胞活化)的试剂的靶标。
[0406] VISTA多肽的生物活性部分包含胞外域的至少一部分。VISTA多肽的生物活性部分可包含胞外域的至少一部分(例如包含IgV)以及以下结构域中的一种或多种:信号肽结构域、跨膜结构域和胞质结构域。此外,其中多肽的其它区域发生缺失的其它生物活性部分可通过重组技术制备,并对其评估天然VISTA多肽的一种或多种功能活性。
[0407] VISTA多肽具有SEQ ID NO:2、4或5中所示的氨基酸序列。VISTA多肽基本上与SEQ ID NO:2、4或5相同,并保留SEQ ID NO:2、4或5多肽的功能活性,但在氨基酸序列中因天然等位变异或诱变而不同,如本文中所述。
[0408] 融合蛋白
[0409] 包含VISTA和VISTA缀合物多肽的融合蛋白也在本发明的范围内。例如,可将融合蛋白连接至GST,其中将VISTA和VISTA缀合物多肽序列已被融合至GST序列的C端。这样的融合蛋白可有利于重组VISTA和VISTA缀合物多肽的纯化。或者,可将VISTA和VISTA缀合物多肽与结合B细胞的蛋白融合,从而起始体液免疫反应和T细胞的活化。Berney,等人(1999)J.Exp.Med.190:851–60。或者,例如,可将VISTA和VISTA缀合物多肽与抗树突细胞抗体在基因上偶联以将抗原递送至免疫系统和刺激细胞免疫反应。He,等人(2004)Clin.Cancer Res.10:1920–27。本发明的嵌合或融合蛋白可通过标准重组DNA技术来产生。例如,按照常规技术,例如,通过使用平端或交错末端进行连接,限制性内切酶消化以提供适当的末端,适当时填充粘性末端,碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接以及酶促连接来将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起。融合基因可通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)来合成。
[0410] 融合蛋白可包括C末端或N末端易位序列。此外,融合蛋白可包含额外元件,例如用于蛋白质检测、纯化或其它应用。方便检测和纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽例如多组氨酸域、组氨酸-色氨酸模块或允许在固定的材料上纯化的其它结构域;麦芽糖结合蛋白;允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域;或用于FLAG延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle WA.)的结构域。
[0411] 融合蛋白可通过与包含免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白的部分融合来从本发明的蛋白质制备。更具体地,免疫球蛋白的部分包含任选地和更优选地为人重链恒定区的重链恒定区。重链恒定区是最优选IgG重链恒定区,任选地和最优选地为Fc链,最优选地包含CH2和CH3结构域的IgG Fc片段。尽管可任选地使用任何IgG亚型,但IgG1亚型是优选的。Fc链可任选地是已知的或“野生型”Fc链,或可选择地可被突变。参见,例如,美国专利申请公开No.2006/0034852。术语“Fc链”还任选地包含任何类型的Fc片段。已鉴定了数个参与抗体恒定区介导的IgG亚类的活性的特定氨基酸残基。这些特定氨基酸的包含、置换或排除从而允许特定免疫球蛋白恒定区介导的活性的包含或排除。此外,特定变化可导致对Fc链的例如糖基化和/或其它所变化。任何选地可产生至少一些变化来阻断被认为是不需要的Fc的功能,例如不需要的免疫系统作用。参见,McCafferty,等人(2002)Antibody Engineering:A Practical Approach(编)Oxford University Press。
[0412] 在新翻译的多肽的易位域(用于高效质膜表达)与其余部分之间包含可切割接头序列例如因子Xa(参见,例如,Ottavi,(1998)Biochimie80:289–93)、枯草杆菌蛋白酶识别基序(参见,例如,Polyak(1997)Protein Eng.10:615–19);肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA.)可用于帮助纯化。例如,一个构建体可包括编码连接于6个组氨酸残基的多肽,随后紧接硫氧还蛋白,肠激酶可切割位点(参见,例如,Williams(1995)Biochemistry34:1787–97)和C末端易位域的核酸序列。组氨酸残基有助于检测和纯化,而肠激酶可切割位点为将所需蛋白从融合蛋白的其余部分纯化出来提供了手段。涉及编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用的技术详尽地描述于科学和专利文献中。参见,例如,Kroll(1993)DNA Cell.Biol.12:441–53。
[0413] 融合蛋白为GST-VISTA融合蛋白,其中VISTA序列融合至GST序列的C端。这样的融合蛋白可有利于重组VISTA的纯化。在另一个实施方案中,融合蛋白为在其N端包含异源信号序列的VISTA多肽。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中,VISTA的表达和/或分泌可通过使用异源信号序列来增强。在实施方案中,融合蛋白为Ig-VISTA融合蛋白,其中VISTA序列融合至Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包含免疫球蛋白恒定区,例如人Cγ1结构域或人Cγ4结构域(例如人IgCγ1或人IgCγ4的铰链、CH2和CH3
区(参见例如美国专利No.5,116,964、5,580,756、5,844,095)。所得的融合蛋白可以具有改变的VISTA溶解性、结合亲和力、稳定性和/或价态(即,每个分子的结合位点数)并可提高蛋白纯化的效率。
[0414] 特别优选的VISTA Ig融合蛋白包括偶联至免疫球蛋白恒定区(例如,Fc区)的VISTA的胞外域。免疫球蛋白恒定区可包含遗传修饰,其可降低或消除免疫球蛋白结构所固有的效应子活性。例如,可将编码VISTA多肽的胞外部分的DNA联接至通过定点诱变修饰的编码人IgGγ1和/或IgGγ4的铰链、CH2和CH3区的DNA,例如,如WO97/28267中教导
的。可将本发明的VISTA融合蛋白掺入药物组合物,将其在体内向受试者施用。VISTA融合蛋白可用于影响VISTA结合伴侣的生物利用度。VISTA融合蛋白的使用对于可从免疫反应的调节受益的病症或疾病的治疗是治疗上有用的。此外,本发明的VISTA融合蛋白可用作免疫原来在受试者中产生抗VISTA抗体,纯化VISTA结合蛋白,用于在筛选测定中鉴定抑制VISTA与其天然结合伴侣的相互作用的分子。
[0415] 缀合物
[0416] 可将VISTA和VISTA缀合物、结合VISTA和VISTA缀合物的抗体及其片段缀合至其它部分。这样的缀合物通常用于疫苗的制备。可将VISTA和VISTA缀合物多肽缀合至糖类(例如,甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、GlcNA、麦芽糖),所述糖可被存在于树突细胞和巨噬细胞上的甘露糖受体识别。紧跟着发生的结合、聚集和受体介导的胞吞和吞噬功能提供了增强的先天性和获得性免疫。参见,Mahnke,等人(2000)J.Cell Biol.151:673–84;Dong,等人(1999)J.Immonol.163:5427–34。
[0417] 适用于缀合以引发免疫反应的其它部分包括但不限于钥孔血蓝蛋白(KLH)、白喉类毒素、霍乱毒素、假单胞菌属(Pseudomonas)胞外蛋白A以及微生物外膜蛋白(OMPS)。
[0418] 多肽分离
[0419] 本发明还提供了用于分离VISTA和VISTA缀合物多肽的方法。例如,可从癌症患者获得相关细胞系或肿瘤样品。在匀浆和于去垢剂中溶解后,通过层析纯化抗原。尺寸排阻或亲和层析可用于该纯化,并且可与抗VISTA和抗VISTA-Ig缀合抗体结合使用。例如,可将抗VISTA或抗VISTA-Ig缀合抗体固定在固体载体(例如,偶联至树脂磁珠)上,以进行简单抗原吸附,随后洗涤,从固体载体洗脱。随后进一步研究洗脱的蛋白质的抗原存在性、表征和鉴定。参见,Walker(2002)Protein Protocols Handbook[第2版]Humana Press and Culture(2003)[编辑]Protein Purification Protocols Humana Press。
[0420] 可使用常规药用赋形剂和载体物质,将以该方式分离的抗原用于制备药物。例如,体内施用生理NaCl溶液中的纯化的抗原。
[0421] 此外,根据本发明的VISTA和VISTA缀合物多肽可在活性的鉴定中用作抗原,作为高通量筛选的部分。高通量筛选法对于本领域普通技术人员来说是已知的。Wells(2002)High Throughout Bioanalytical Sample Preparation Elsevier Health Sciences。
[0422] 编码VISTA和VISTA缀合物的多核苷酸
[0423] 本发明还提供了编码VISTA和VISTA缀合物的核苷酸。本发明还提供了包含SEQ ID NO:1和3的核酸序列的多核苷酸,其编码VISTA多肽。本发明还提供了可与本文中描述的多核苷酸序列杂交的片段、序列,和与本文中描述的多核苷酸序列同源的序列,同源性为至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
[0424] 本发明还提供了包含至少一个VISTA和VISTA缀合物序列的多核苷酸,其编码具有不同密码子选择的相似多肽,特征在于一个或多个核苷酸的缺失、插入或置换(天然发生的或人工诱导的,随机地或以靶向方式进行的)的改变的序列。本发明还包括同源核酸序列(例如,其形成本发明的多核苷酸序列的一部分),其包括对于本发明的多核苷酸是独特的序列区域。
[0425] 本发明还包括编码VISTA和VISTA缀合物多肽的同源物的核酸,这样的同源物可以为与本文中所示的氨基酸序列具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、
87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的同源物,这可使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件,使用默认参数来测定。本发明还包括上述多核苷酸和多肽的片段,所述片段具有突变,例如一个或多个核苷酸的缺失、插入或置换(天然发生的或人工诱导的,随机地或以靶向方式进行的)。
[0426] 核酸分子可编码VISTA和VISTA缀合物或所述核酸分子的功能性片段。所述核酸的“功能性片段”包括编码所述VISTA和VISTA缀合物的基因或cDNA的片段,该片段能够被表达以产生能够引发免疫反应(例如,选择性结合VISTA和VISTA缀合抗体)的VISTA和VISTA缀合物。因此,例如,对应于促成抗原的免疫原性的氨基酸残基的根据本发明的VISTA和VISTA缀合物的片段可用作引发免疫反应(例如,体液或细胞免疫反应)的抗原。
本发明的该方面还包括根据本发明的核酸的差异剪接同种型和转录起始。根据本发明的核酸分子还包含上述核酸分子的片段、衍生物和等位变体,其编码根据本发明的VISTA和VISTA缀合物。用于制备编码VISTA和VISTA缀合物的片段的核酸的方法和材料在本领域是公知的。参见,例如,Maniatis,等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第
3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0427] 涵盖SEQ ID NO:1、3的全部或一部分的核酸分子,或直系同源体或变体可使用基于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列而设计的合成寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)分离。
[0428] 本发明的核酸分子可使用cDNA、mRNA或可选择地基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物,按照标准PCR扩增技术来扩增。可将如此扩增的核酸分子克隆进合适的载体并通过DNA序列分析而表征。此外,对应于VISTA(PD-L3)核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术来制备,例如使用自动化DNA合成仪。
[0429] 在实施方案中,本发明的分离的编码VISTA的核酸分子包含SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列,或其片段。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子包括作为SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列的互补序列或任何这些核苷酸序列的一部分的核酸分子。与SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列互补的核酸分子为这样的核酸分子,其与SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列充分互补,以便其可分别与SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列杂交,从而形成稳定的双链体。
[0430] 在另一个实施方案中,本发明的分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列的整个长度具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性的核苷酸序列,或任何这些核苷酸序列的一部分。
[0431] 此外,本发明的核酸分子可只包含SEQ ID NO:1或3的核酸序列的一部分,例如可用作探针或引物的片段或编码VISTA多肽的一部分(例如VISTA多肽的生物活性部分)的片段。通过克隆人PD-L2基因确定的核苷酸序列允许产生设计用于鉴定和/或克隆其它PD-L2家族成员以及获自其它物种的VISTA同系物的探针和引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或3的有义序列;SEQ ID NO:1、3的反义序列;或SEQ ID NO:1或3的天然存在的等位变体或突变体的至少约12或15个,优选约20或25个,更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。
[0432] 在一个实施方案中,本发明的核酸分子包含长度大于约50–100、100–150、150–200、200–250、250–300、300–350、350–400、400–450、450–500、500–550、550–600、
600–650、650–700、700–750、750–800、800–850、850–900、900–950或更多个核苷酸的核苷酸序列,并在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或3或其互补序列的核酸分子杂交。
在另一个实施方案中,本发明的核酸分子包含长度大于约880–900、900–950、950–1000、
1000–1050、1050–1100、1100–1150或更多个核苷酸的核苷酸序列,并在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或3或其互补序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子包含长度大于约50–100、100–150、150–200、200–250、250–300或更多个核苷酸的核苷酸序列,并在严格杂交条件下包含SEQ ID NO:1或3或其互补序列中的编码区的核酸分子杂交。在另外的实施方案中,本发明的核酸分子包含长度大于约50–100、100–150、
150–200、200–250、250–300、300–350、350–400、400–450、450–500、500–550、550–
600、600–650、650–700、700–750、750–800、850–900、900–950或更多个核苷酸的核苷酸序列,包含构成SEQ ID NO:1或3的编码区的序列或其互补序列的至少约15个(即,15个连续的)核苷酸,并在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子杂交。
[0433] 基于VISTA核苷酸序列的探针可用于检测转录物或编码相同或同源多肽的基因组序列。在实施方案中,探针还包含连接至其上的标签组,例如,标签组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作诊断测试试剂盒的一部分,以鉴定误表达VISTA多肽的细胞或组织,例如通过测量受试者细胞样品中编码VISTA的核酸的水平,如检测VISTA mRNA水平或确定基因组VISTA基因是否已突变或缺失。
[0434] 除了SEQ ID NO:1和3所示的VISTA核苷酸序列外,本领域的技术人员将会认识到,导致VISTA多肽的氨基酸序列发生变化的DNA序列多态性也可存在于种群(例如人种群)中。VISTA基因中的这种遗传多态性可因天然等位变异而存在于种群的个体之中。如本文中所用,术语“基因”和“重组基因”是指包含编码VISTA多肽,优选哺乳动物VISTA多肽的开放阅读框的核酸分子,并可进一步包含非编码调控性序列和内含子。
[0435] 人或小鼠VISTA的等位变体包括功能性和非功能性VISTA多肽两者。功能性等位变体是人或小鼠VISTA多肽的天然存在的氨基酸序列变体,其维持结合天然VISTA结合伴侣和/或调节CD4+和CD8+T细胞增殖和细胞因子产生以及淋巴细胞活化的能力。功能性等位变体将通常只含SEQ ID NO:2、4或5的一个或多个氨基酸的保守取代,或多肽非关键区中非关键残基的取代、缺失或插入。
[0436] 非功能性等位变体是人或小鼠VISTA多肽的天然存在的氨基酸序列变体,其不具有结合天然VISTA结合伴侣和/或调节本文所述的任何VISTA活性的能力。非功能性等位变体将通常包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入或提前截短,或多肽的关键残基或关键区(例如,IgV结构域中)的取代、插入或缺失。
[0437] 本发明还提供人或小鼠VISTA多肽的非人、非小鼠直系同源体。人或小鼠VISTA多肽的直系同源体是从非人、非小鼠生物体中分离而得并具有与本文所公开的人和鼠VISTA多肽相同的结合活性和/或淋巴细胞活化-调节活性以及调节CD4+和CD8+T细胞增殖和细胞因子产生的能力的多肽。人或小鼠PD-L3多肽的直系同源体可作为包含与SEQ ID NO:2、4或5基本上相同的氨基酸序列而容易地鉴定。
[0438] 可测定突变体VISTA多肽结合至天然VISTA结合伴侣和/或调节其活性,调节细胞内或细胞间信号传导,调节T淋巴细胞活化和/或调节生物体免疫反应的能力。
[0439] 编码VISTA或VISTA融合蛋白的分离的核酸分子。此类包含至少有效连接至编码非VISTA蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列的编码VISTA或VISTA蛋白、多肽或肽的第一核苷酸序列的核酸分子可通过标准重组DNA技术制备。
[0440] 此外,同一性在广义上指所关注的核酸分子或由其编码的蛋白质之间存在的功能和/或结构平衡。与上述分子同源并构成这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异,其构成修饰,执行相同的生物功能。同时,变异可天然发生,例如它们是来自其它物种的序列,或它们可以是突变体,其中这些突变体可以以天然方式发生或已通过目标诱变引入。变异还可以是合成制造的序列。等位变体可以是天然存在的变体,也可以是合成制造的变体或通过重组DNA技术产生的变体。因遗传密码的简并性而偏离根据本发明的核酸分子的核酸分子构成衍生物的特殊形式。
[0441] 还包括在本发明的范围内的是编码VISTA和其VISTA缀合物的氨基酸序列的任何核苷酸序列。因为遗传密码是简并的,因此可使用超过一个密码子来编码特定氨基酸。使用遗传密码,可鉴定一个或多个不同的核苷酸,其每一个能够编码氨基酸。特定核苷酸事实上可构成编码序列的实际密码子的概率可通过考虑异常碱基配对关系和在表达VISTA和其VISTA缀合物的真核或原核细胞中实际使用特定密码子(以编码特定氨基酸)的频率来估计。这样的“密码选择法则”由Lathe,等人(1985)J.Molec.Biol.183:1–12公开。
[0442] 修饰的VISTA和VISTA缀合物多核苷酸
[0443] 本发明的核苷酸可以修饰多核苷酸。未修饰的核苷酸在一些应用中通常不是最佳的,例如易于被细胞核酸酶降解。对寡核苷酸的一个或多个亚单位的化学修饰可赋予改善的性质,例如,可使多核苷酸对核酸酶更稳定。常见寡核苷酸修饰在本领域中是公知的,可包括以下修饰的一项或多项:(i)磷酸二酯糖间连接的非连接磷酸氧的一个或两个和/或连接磷酸氧的一个或多个的改变,例如替代;(ii)核糖糖的组分的改变,例如替代,核糖糖上的2’羟基的修饰或替代,(iii)磷酸部分的完整替代;(iv)利用非天然碱基对天然存在的碱基的修饰或替代;(v)利用例如肽核酸(PNA)对核糖-磷酸主链的替代或修饰;(vi)寡核苷酸的3’末端或5’末端的修饰;和(vii)糖例如6元环的修饰。根据本发明
使用的多核苷酸可通过本领域中公知的,购自许多商业提供商(LC Sciences,Houston,TX;
Promega,Madison,WI;Invitrogen,Carlsbad,CA)的许多方法来合成。
[0444] 反义
[0445] 除了上述编码VISTA多肽的核酸分子外,本发明的另一个实施方案涉及与其反义的分离的核酸分子。“反义”核酸分子包含与编码多肽的“有义”核酸互补的核苷酸序列,例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。因此,反义核酸可通过氢键结合至有义核酸。反义核酸可与整个VISTA编码链互补或只与其一部分互补。在一个实施方案中,反义核酸分子与编码VISTA的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一个实施方案中,反义核酸分子与编码PD-L的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的位于编码区侧翼的5’和3’序列(也称为5’和3'非翻译区)。给定编码本文所公开的人或小鼠VISTA或VISTA的编码链序列,可根据沃尔森克里克碱基配对法则设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可与VISTA mRNA的整个编码区互补,但更优选地为寡核苷酸,其只与VISTA mRNA的编码或非编码区的一部分反义。例如,反义寡核苷酸可与围绕VISTA或VISTA mRNA的反义起始位点的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸分子可使用化学合成和酶促连接反应使用本领域已知的步骤构建。例如,反义核酸分子(例如,反义寡核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或各种经设计以增强分子生物稳定性或增强反义与有义核酸间形成的双链体物理稳定性的修饰核苷酸,通过化学方法合成,例如,可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧、5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosyl queosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、
2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基脲嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。或者,反义核酸可使用已按反义取向(即,从插入的核酸转录的RNA将具有与目标靶核酸的反义取向,这将在下面的小节中进一步描述)将核酸亚克隆进其中的表达载体通过生物学方法产生。
[0446] 本发明的反义核酸分子通常被施用给受试者或原位产生,使得它们与编码VISTA或VISTA多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合,从而抑制多肽的表达,例如通过抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规核苷酸互补性以形成稳定双链体,或例如,在结合至DNA双链体的反义核酸分子的情况下,通过双螺旋的大沟中的特定相互作用。施用本发明的反义核酸分子的途径的实例包括在组织部位直接注射。或者,可对反义核酸分子进行修饰以靶向所选的细胞,然后进行全身性施用。例如,对于全身施用,可对反义分子进行修饰,使得它们特异性结合至在所选细胞表面表达的受体或抗原,例如通过将反义核酸分子连接至结合于细胞表面受体或抗原的肽或抗体。反义核酸分子还可使用本文所述的载体递送至细胞。为了实现反义分子足够的细胞内浓度,其中在强pol II或pol III启动子的控制下放置核酸分子的载体构建体是优选的。
[0447] VISTA反义核酸分子为α-异头物核酸分子。α-异头物核酸分子与互补的RNA形成特异性双链杂交体,其中与通常的β单元相反,链的走向彼此平行。Gaultier,等人(1987)Nucleic Acids Res.15:6625–6641。反义核酸分子还可包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue,等人(1987)Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue,等人(1987)FEBS Lett.215:327–330)。
[0448] VISTA反义核酸为核糖酶。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子,其能够裂解与其具有互补区的单链核酸,例如mRNA。因此,核糖酶(例如,锤头核糖酶(在Haseloff和Gerlach(1988)Nature334:585-591中有所描述的))可用于催化裂解VISTAmRNA转录物从而抑制VISTA mRNA的翻译。具有针对编码VISTA的核酸的特异性的核糖
酶可基于本文所公开的VISTA cDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1或3)而设计。例如,
可构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物,其中活性位点的核苷酸序列与编码VISTA的mRNA中待裂解的核苷酸序列互补。参见,例如,美国专利No.4,987,071和美国专利No.5,116,742。或者,VISTA mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel和Szostak(1993)Science 261:1411–1418。
[0449] 或者,VISTA基因表达可通过以下方法抑制:靶向与VISTA的调节区互补的核苷酸序列(例如VISTA启动子和/或增强子);以形成防止靶细胞中PD-L3基因转录的三螺旋结构。通常参见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6):569–84;Helene,等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27–36;和Maher,L.J.(1992)Bioessays 14(12):807–15。
[0450] 肽核酸
[0451] 在另一个实施方案中,本发明的VISTA核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸主链中修饰,以改善例如分子的稳定性、杂交或可溶性。例如,可对核酸分子的脱氧核糖磷酸主链进行修饰以产生肽核酸。参见Hyrup和Nielsen(1996)Bioorg.Med.Chem.4(1):5–23。如本文中所用,术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物,如DNA模拟物,其中脱氧核糖磷酸主链被伪肽主链替换,并且只有四个天然核碱基得以保留。已表明,PNA的中性主链允许在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。PNA寡聚物的合成可使用标准固相肽合成方案进行,如在Hyrup和Nielsen(1996)同上和Perry-O’Keefe等人(1996)Proc Natl.Acad.Sci.USA 93:14670–675中所述。
[0452] VISTA核酸分子的PNA可用于治疗和诊断应用。例如,PNA可用作反义或有义剂用于序列特异性调节基因表达,例如通过诱导转录或翻译阻止或通过抑制复制。VISTA核酸分子的PNA还可用于基因中单一碱基对突变的分析(例如,通过PNA指导的PCR发夹技术);作为与其它酶联合使用时的“人工限制酶”(例如,S1核酸酶(Hyrup和Nielsen(1996)同上));或作为探针或引物用于DNA测序或杂交(Hyrup和Nielsen(1996)同上;
Perry-O’Keefe等人(1996)同上)。
[0453] 可对VISTA的PNA进行修饰(例如以增强它们的稳定性或细胞摄取),方式是通过将亲脂性或其它辅助基团连接至PNA,通过形成PNA-DNA嵌合体或通过使用脂质体或本领域已知的其它药物递送技术。例如,能产生可结合PNA和DNA的有利特性的VISTA核酸分子的PNA-DNA嵌合体。此类嵌合体允许DNA识别酶(例如,RNA酶H和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用,同时PNA部分将提供高结合亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可使用根据碱基堆积、核碱基之间的键数以及取向选择的合适长度的接头连接(Hyrup和Nielsen(1996)同上)。PNA-DNA嵌合体的合成可如Hyrup和Nielsen(1996)同上和Finn P.J.等人(1996)
Nucleic Acids Res.24(17):3357–63中所述进行。例如,DNA链可在固相载体上使用标准亚磷酰胺偶联化学来合成,而修饰核苷类似物,如5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脱氧胸苷亚磷酰胺,可用作PNA与DNA的5’末端之间的桥(Mag,M.等人(1989)Nucleic Acids Res.17:5973–88)。PNA单体然后按逐步方式偶联,以与5’PNA片段和3’DNA片段产生嵌合分子(Finn P.J.等人(1996)同上)。或者,嵌合分子可用5’DNA片段和3’PNA片段合成(Peterser,等人(1975)Bioorganic Med.Chem.Lett.5:1119–11124)。
[0454] 寡核苷酸
[0455] 寡核苷酸可以包含其它附加基团,例如肽(例如,用于体内靶向宿主细胞受体)或利于跨细胞膜(参见例如Letsinger等人(1989)Proc Natl.Acad.Sci.USA 86:6553–6556;Lemaitre 等 人 (1987)Proc Natl.Acad.Sci.USA 84:648–652;PCT 公 开 No.WO
88/09810)或血脑屏障(参见例如PCT公开No.WO 89/10134)转运的试剂。此外,寡核苷
酸可用杂交触发裂解剂(参见例如Krol等人(1988)Biotechniques6:958-976)或嵌入剂
(参见例如Zon(1988)Pharm.Res.5:539-549)进行修饰。为此,可将寡核苷酸偶联到另一分子(例如,肽、杂交触发交联剂、转运剂或杂交触发裂解剂)。
[0456] siRNA
[0457] 小干扰RNA(siRNA)是一类长度通常为约20–25个核苷酸的双链RNA分子,其结合特定mRNA并将其导向mRNA降解,从而抑制基因的转录(例如,表达)。参见
Hamilton&Baulcombe(1999)Science286(5441):950–2和Elbashir,等人 (2001)Nature
411(6836):494–8。还可能的是利用核酶或RNA干扰(siRNA)技术,所述技术通过破坏信使RNA阻止基因产生功能性蛋白。siRNA分子可结合从VISTA DNA转录的包含SEQ ID NO:1或3的核酸序列的VISTA mRNA。siRNA分子可结合从VISTA DNA转录的编码SEQ ID NO:2、
4或5所示的氨基酸序列的VISTA mRNA。
[0458] 靶向从VISTA DNA转录的VISTA mRNA的siRNA分子可包含SEQ ID NO:1或3的核酸序列。siRNA分子靶向从VISTA DNA转录的编码SEQ ID NO:2、4或5所示的氨基酸序列的VISTA mRNA。靶向VISTA的siRNA分子可包含SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序
列。靶向VISTA的ORF或UTR区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:38–67的任一个的氨基酸
序列。仅靶向VISTA的UTR区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:48–57的任一个的氨基酸
序列。仅靶向VISTA的ORF区的siRNA分子可包含SEQ ID NO:58–67的任一个的氨基酸
序列。靶向VISTA的siRNA分子可由SEQ ID NO:38–67的任一个的核酸序列组成。靶向
VISTA的ORF或UTR区的siRNA分子可由SEQ ID NO:38-47的任一个的氨基酸序列组成。
仅靶向VISTA的UTR区的siRNA分子可由SEQ ID NO:48-57的任一个的氨基酸序列组成。
仅靶向VISTA的ORF区的siRNA分子可由SEQ ID NO:58-67的任一个的氨基酸序列组成。
[0459] 表1:针对人VISTA的siRNA
[0460]siRNA序列 VISTA的靶区域 SEQ ID NO:
GGGCACGATGTGACCTTCTACAAGA ORF 38
CAGATGCCAAATGACTTACATCTTA UTR3 39
GAGATGGATTGTAAGAGCCAGTTTA UTR3 40
GGGCTTTGAGGAGAGGGTAAACATA UTR3 41
CCTATCTCCTGACATTCACAGTTTA UTR3 42
CAGTTTAATAGAGACTTCCTGCCTT UTR3 43
CAGGGAGAGGCTGAAGGAATGGAAT UTR3 44
GGAATGTGTTGAGAGGGATTCTGAA UTR3 45
GAGAGGGATTCTGAATGATCAATAT UTR3 46
CACAGAGGGCAATAGAGGTTCTGAA UTR3 47

CAGATGCCAAATGACTTACATCTTA UTR3 48
GAGATGGATTGTAAGAGCCAGTTTA UTR3 49
GGTGAGTCCTCTGTGGAATTGTGAT UTR3 50
GGGCTTTGAGCAGAGGGTAAACATA UTR3 51
CCTATCTCCTGACATTCACAGTTTA UTR3 52
CAGTTTAATAGAGACTTCCTGCCTT UTR3 53
CAGGGAGAGGCTGAAGGAATGGAAT UTR3 54
GGAATGTGTTGAGAGGGATTCTGAA UTR3 55
GAGAGGGATTCTGAATGATCAATAT UTR3 56
CACAGAGGGCAATAGAGGTTCTGAA UTR3 57

ACAAAGGGCACGATGTGACCTTCTA ORF 58
GGGCACGATGTGACCTTCTACAAGA ORF 59
GACCACCATGGCAACTTCTCCATCA ORF 60
CAGACAGGCAAAGATGCACCATCCA ORF 61
GGCAAAGATGCACCATCCAACTGTG ORF 62
CCATCCAACTGTGTGGTGTACCCAT ORF 63
GGATGGACAGCAACATTCAAGGGAT ORF 64
GACAGCAACATTCAAGGGATTGAAA ORF 65
CCCTGTCCCTGACTCTCCAAACTTT ORF 66
CCTGACTCTCCAAACTTTGAGGTCA ORF 67
[0461] 表达
[0462] 本发明的VISTA和VISTA缀合物的分离和表达可通过既定克隆方法,使用基于本申请中公开的VISTA和VISTA缀合物核酸序列构建的探针或引物来实现。还可使用本文中公开的序列和已知的基于计算机的搜索技术例如BLAST序列搜索从人或其它物种基因组数据库鉴定相关VISTA和VISTA缀合物序列。本文中公开的假基因可用于鉴定功能等位或相关基因。
[0463] 随后可将表达载体用于感染或转染宿主细胞以进行这些序列的功能性表达。可产生这些基因和载体,并在体外或体内表达它们。本领域普通技术人员将承认,可通过调节本发明的载体内的基因和核酸(例如,启动子、增强子)的表达或活性来获得用于改变和控制核酸表达的所需表型。可使用针对增加或减少表达或活性描述的任何已知方法。
[0464] 在另一个实施方案中,重组哺乳动物表达载体能够指导优先在特定细胞类型中的核酸表达(例如,组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性;Pinkert等(1987)Genes Dev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)
Adv.Immunol.43:235–275)、T细胞受体的特定启动子(Winoto和Baltimore(1989)
EMBO J.8:729–733)和免疫球蛋白(Baneiji等人(1983)Cell33:729–740;Queen和
Baltimore(1983)Cell 33:741–748)、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle(1989)Proc Natl.Acad.Sci.USA 86:5473–5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等人(1985)Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利No.4,873,316和欧洲专利公布No.264,166)。发育调节的启动子也包括在内,例如通过鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(Campes
和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。
[0465] 本文提供的多核苷酸序列可根据本领域中已知的任何寡核苷酸合成法,例如酶促合成或固相合成来产生。用于执行固相合成的设备和试剂可从例如Applied Biosystems商购获得。也可使用用于此类合成的任何其它装置;多核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的能力范围内。参见,例如,Maniatis,等人(2001)MolecularCloni ng:A Laboratory Manual[ 第3 版 ]Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss;Swamy(2008)Laboratory Manual on Biotechnology Rastogi Publi cations;Herdewijn(2005)[编 辑]Methods in Molecular Biolog:Oligo nucleotide Synthesis:Methods and
Applications第288卷 Humana P ress;和Rapley(2000)[编 辑] The Nucleic Acid
Protocols Handbook Humana Press。随后可通过合成互补链并在适当条件下使链退火在一起,或通过添加互补链,使用DNA聚合酶和适当的引物序列来获得双链DNA片段。
[0466] 用于操作核酸例如以在序列中产生突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交的技术详尽地描述于科学和专利文献中。参见,例如,Sambrook,等人(2001)(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory;Ausubel,等人(2011)编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York;Tijssen(1993)[编辑]Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:Hybridization With Nucleic Acid Probes,第I部分,Theory and Nucleic Acid Preparation,Elsevier,NY。
[0467] 杂交和杂交的强度(例如,多核苷酸之间的缔合的强度)受本领域公知的许多因素影响,包括多核苷酸之间的互补性程度和牵涉的条件的严格度,所述严格度受这样的条件如盐浓度、其它组分的存在(例如,聚乙二醇的存在或不存在)、杂交链的摩尔浓度和多核苷酸链的G+C含量影响,所有这些因素导致形成的杂交体的特征性解链温度(Tm)。核酸杂交的技术由Sambrook,等人(2001)(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory和由Hayrnes,等人(1985)在NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION,A PRACTICAL APPROACH(IRL Press,DC)中公开。杂交洗涤条件可包括0.2x SSC/0.1%SDS的洗涤溶液和在室温(低严格度洗涤)旋转温育10分钟,预热的(42℃)0.2x SSC/0.1%SDS的洗涤溶液和在42℃(中等严格度洗涤)旋转温育15分钟,以及预热的(68℃)0.1x SSC/0.1%
SDS的洗涤溶液和在68℃(高严格度洗涤)旋转温育15分钟。参见Ausubel,等人(2011)
[编辑]Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons,Inc。
[0468] 寡核苷酸引物可用于扩增编码VISTA和VISTA缀合物的核酸。本文中描述的核酸还可使用扩增技术来进行克隆或测量。扩增法在本领域中也是公知的,包括例如
聚合酶链式反应(PCR)(Innis(1990)[编辑]PCR Protocols,a Guide to Methods and
Applications,Academic Press,NY.;Innis(1995)[ 编 辑 ]PCR Strategies,Academic Press,Inc.,NY.);连接酶链式反应(LCR)(Wu(1989)Genomics 4:560;Landegren(1988)Science 241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117);转 录 扩 增 (Kwoh(1989)PNAS
86:1173);自主序列复制(Guatelli(1990)PNAS 87:1874);Qβ复制酶扩增(Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-91));自动化Q-β复制酶扩增测定(Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10:257-71);和其它RNA聚合酶介导的技术(例如,NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)。也参见,Berger(1987)Methods Enzymol.152:307–16;Sambrook,等人(2001)(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory;
Ausubel, 等 人 (2011)[ 编 辑 ]Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York;Maniatis,等人 (2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press;美国专利No.4,683,195和
4,683,202;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:563–64。
[0469] 设计简并引物对的范例在本领域是公知的。例如,COnsensus-DEgenerate杂交寡核苷酸引物(CODEHOP)策略计算机程序可容易地获得,并且直接从BlockMaker多序列比对位点链接,以进行始于一组相关蛋白质序列例如本文中提供的VISTA和VISTA缀合物序列的杂交引物预测。参见,例如,Rose(1998)Nucleic Acids Res.26:1628–35;Singh(1998)Biotechniques 24:318–19。
[0470] 大体上与本文中公开的VISTA和VISTA缀合物相同的多态性变体、等位基因和种间同源物可使用上述核酸探针来分离。或者,可使用表达文库克隆VISTA和VISTA缀合物和其多态性变体、等位基因和种间同源物,通过用针对VISTA和VISTA缀合物制造的抗血清或纯化抗体免疫检测表达的同源物,所述抗血清或抗体也识别VISTA或VISTA缀合物同源物并选择性与其结合。
[0471] 可通过使用适当的(完全匹配的或简并的)引物对扩增(例如,PCR)适当的核酸序列产生编码VISTA和VISTA缀合物的核酸。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或来源于表达VISTA或VISTA缀合物的细胞的mRNA或cDNA。用于在宿主细胞
中表达异源序列的方法在本领域是公知的。参见,例如,Maniatis,等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0472] 包含VISTA和VISTA缀合物的融合蛋白
[0473] 可构建包含编码融合至易位序列的VISTA和VISTA缀合物的核酸的杂交蛋白编码序列。还提供了包含基序和抗原性区域的杂交VISTA和VISTA缀合物。可将这些核酸序列有效地连接至转录或翻译控制元件,例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列以及用于将DNA转录成RNA的其它序列。在重组表达盒、载体以及转基因的构建中,可将启动子片段用于指导所需核酸在所有所需细胞或组织中表达。
[0474] 融合蛋白可包含C端或N端易位序列。此外,融合蛋白可包括另外的元件,例如用于蛋白质检测、纯化或其他应用。方便检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽例如多组氨酸域、组氨酸-色氨酸组件或允许在固定的材料上纯化的其它结构域;麦芽糖结合蛋白;允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域;或用于FLAG延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle WA.)的结构域。
[0475] 在新翻译的多肽的易位域(用于高效质膜表达)与其余部分之间包含可切割接头序列例如因子Xa(参见,例如,Ottavi,(1998)Biochimie80:289–93)、枯草杆菌蛋白酶识别基序(参见,例如,Polyak(1997)Protein Eng.10:615–19);肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA.)可用于帮助纯化。例如,一个构建体可包括编码连接于6个组氨酸残基的多肽,随后紧接硫氧还蛋白,肠激酶可切割位点(参见,例如,Williams(1995)Biochemistry34:1787–97)和C末端易位域的核酸序列。组氨酸残基有助于检测和纯化,而肠激酶可切割位点为将所需蛋白从融合蛋白的其余部分纯化出来提供了手段。涉及编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用的技术详尽地描述于科学和专利文献中。参见,例如,Kroll(1993)DNA Cell.Biol.12:441–53。
[0476] 用于VISTA和VISTA缀合物的重组表达的系统
[0477] 可将包含配体结合区编码序列的表达载体(无论是作为单个表达载体还是作为表达载体文库)引入细胞的基因组或细胞质或细胞核,并通过科学和专利文献中详尽描述的多种常规技术表达。参见,例如,Sambrook,等人(2001)[编辑]Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory;Ausubel,等人(2011)[编辑]Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons,Inc。
[0478] 可将核酸在于细胞中稳定地或瞬时表达的表达盒、载体或病毒中表达(例如,附加型表达系统)。可将选择标记整合进表达盒和载体以赋予转化细胞和序列可选择的表型。例如,选择标记可以编码附加型维持和复制,以便无需整合进宿主基因组。例如,标志物可编码抗生素抗性(例如,氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如,氯磺隆或巴斯达)来允许选择用所需DNA序列转化的那些细胞。参见,例如,Ausubel,等人(2011)[编辑]Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons,Inc.;和Walker&Papley(2009)Molecular Biology and Biotechnology[第5版]Royal Society of Chemistry。因为仅可在组织培养中使用赋予对底物如新霉素或潮霉素的抗性的选择标记基因,因此也将化学抗性基因用作体外和体内选择标记。
[0479] 为了使得能够进行本发明的多核苷酸的细胞表达,可使用根据本发明的核酸构建体,其包括至少一个上述核酸序列之一的编码区,并且还包括至少一个顺式调控元件。优选地,本发明的核酸构建体使用的启动子在特定转化细胞群中是活跃的。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例在本领域中是公知的。参见Bernardi(2003)[编辑]Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells第38卷Elsevier Science B.V.。本发明的核酸构建体还可包括增强子,其可与启动子序列相邻或与之远离,并且可在上调从其的转录方面起作用。
[0480] 本发明的核酸构建体优选地还包括合适的选择标记和/或复制起点。优选地,所用的核酸构建体是穿梭载体,其可在大肠杆菌(其中构建体包含合适的选择标记和复制起点)中扩增并且对于细胞的扩增,或基因中的融合和选择的组织是相容的。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
[0481] 合适的构建体的实例包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto,其各自可从Invitrogen Co.(Carlsbad,CA)商购获得。逆转录病毒载体和包装系统的例子是那些由Clontech(San Diego,CA)销售的载体和包装系统,包括Retro-X载体pLNCX和pLXSN,其允许克隆至多克隆位点中,并且从CMV启动子转录转基因。还可包括从Mo-MuLV衍生的载体例如pBabe,其中从5'LTR启动子转录转基因。
[0482] 本发明的重组表达载体包含本发明的核酸,其形式适于核酸在宿主细胞中的表达,这意味着该重组表达载体包含一个或多个基于将用于表达的宿主细胞而选择的调控序列,其有效连接到待表达的核酸序列。在重组表达载体内,“有效连接”旨在表示目标核苷酸序列连接至调节序列,其方式允许该核苷酸序列的表达(例如,在体外转录/翻译系统中或将载体引入宿主细胞时则在宿主细胞中)。
[0483] 术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如,聚腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA中有所描述。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些序列以及只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域普通技术人员将会认识到,表达载体的设计可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白表达水平的因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞,从而产生通过如本文所述的核酸编码的蛋白或肽,包括融合蛋白或肽。
[0484] 可设计本发明的重组表达载体以在原核或真核细胞中产生变体蛋白。例如,本发明的蛋白可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如,使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞Goeddel(1990)Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA中有进一步讨论。或者,可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。
[0485] 最常见地利用包含组成型或诱导型启动子(指导融合或非融合蛋白的表达)在大肠杆菌中进行蛋白质在原核生物中的表达。融合载体将许多氨基酸添加至其中编码的蛋白质,添加至重组蛋白的氨基或C末端。这样的融合载体通常用于3个目的:(i)增加重组蛋白的表达;(ii)增加重组蛋白的稳定性;和(iii)通过在亲和纯化中用作配体帮助重组蛋白的纯化。通常地,在融合表达载体中,将蛋白水解切割位点引入融合部分与重组蛋白的接合处,以使得能够在融合蛋白纯化后将重组蛋白与融合部分分离。这样的酶及其同种识别序列,包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋
白的pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith和Johnson(1988)Gene67:31–40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)。
[0486] 重组哺乳动物表达载体能够指导优先在特定细胞类型中的核酸表达(例如,组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。为高效产生蛋白质,优选地将编码本发明的蛋白质的核苷酸序列置于针对在所需宿主中的表达最优化的表达控制序列的控制下。例如,序列可包括最优化的转录和/或翻译调控序列(例如,改变的Kozak序列)。
[0487] 在大肠杆菌细胞中最大化重组蛋白表达的一个策略是在具体受损的蛋白水解切割重组蛋白的能力的宿主细菌中表达蛋白质。参见,例如,Gottesman(1990)
Gene Expression Technology:Methods in Enzymology Academic Press,San
Diego,CA.185:119–128。另一个策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列,以便每一个氨基酸的单个密码子是优先在大肠杆菌中利用的那些密码子。参见,例如,Wada,等人(1992)Nucl.Acids Res.20:2111–2118。通过标准DNA合成技术进行本发明的核酸
序列的这类改变。解决密码子偏爱性的另一个策略是通过使用BL21-密码子+细菌菌株
(Invitrogen)或Rosetta细菌菌株(Novagen),这些菌株包含额外拷贝的罕见大肠杆菌
tRNA基因。
[0488] 编码本发明的蛋白的表达载体可以是酵母表达载体。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldar i,等人(1987)EMBO J.6:229–234)、pMFa(Kurjan 和 Herskowitz(1982)Cell 30:933–943)、pJRY88(Schultz, 等人 (1987)Gene 54:113–123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA.) 和
picZ(Invitr ogen Corp,San Diego,CA.)。
[0489] 或者,本发明的多肽可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如,SF9细胞)中表达多肽的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith,
等 人 (1983)Mol.Cell.Biol.3:2156–2165) 和 pVL 系 列 (Lucklow 和 Summers(1989)Virology 170:31–39)。在另一个实施方案中,本发明的核酸使用哺乳动物表达载
体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature
329:840)和pMT2PC(Kaufman,等人(1987)EMBO J.6:187–195)、pIRESpuro(Clontech)、pUB6(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)。当用于哺乳动物细胞时,表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如,常用的启动子衍生自多瘤病毒、2型腺病毒、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于适合原核和真核细胞两者的其它表达系统,参见,例如,Sambrook,等人(2001)(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spr ing Harbor Laboratory。
[0490] 宿主细胞可以是任意原核或真核细胞。例如本发明的蛋白质可在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞(例如,中国仓鼠鸟巢细胞(CHO)、COS、HEK293细胞)中产生。其它适当的宿主细胞对于本领域普通技术人员来说是已知的。
[0491] 载体DNA可通过常规转化或转染技术引入原核或真核细胞。如本文中所用,术语“转化”和“转染”意指多种本领域公认的用于将外源核酸(例如,DNA)引入宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可见于Sambrook,等人(2001)[编辑]Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory and other laboratory manuals中。
[0492] 可使用用于向宿主细胞中引入外源核苷酸序列的任何公知的方法。这些方法包括磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体以及用于向宿主细胞中引入克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质
的任何其它公知的方法的使用。参见,例如,Sambrook,等人(2001)(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory以及Walker
和Papley(2009)Molecular Biology and Biotechnology[ 第5 版 ]Royal Society of Chemistry。唯一所需要的是所使用的特定基因工程法能够成功地将至少一个核酸分子引入能够表达目标VISTA和VISTA缀合物、片段或变体的宿主细胞。
[0493] 对于哺乳动物细胞的稳定转染,已知取决于所用的表达载体和转染技术,仅一小部分细胞可将外源DNA整合进入其基因组。为了鉴定和选择这些整合体,通常将编码选择性标记(例如,抗生素抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞。各种选择性标记包括赋予对药物例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素和甲氨蝶呤的抗性的那些标记。可将编码选择性标记的核酸在与编码本发明的蛋白质的载体相同的载体上引入宿主细胞,或将其引入分开的载体。用引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如,已整合了选择性标记基因的细胞将可存活,然而其它细胞将死亡)。
[0494] 本发明的宿主细胞,例如培养中的原核或真核宿主细胞,可用于产生(即,表达)本发明的蛋白质。因此,本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生本发明的蛋白质的方法。在一个实施方案中,该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(已向其中引入了编码本发明的蛋白质的重组表达载体),以便产生本发明的蛋白质。在另一个实施方案中,该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离本发明的蛋白质。
[0495] 在将表达载体引入细胞后,在有利于目标受体、片段或变体表达的条件下培养转染的细胞,随后使用标准技术从培养物回收所述细胞。这样的技术的实例在本领域中是公知的。参见,例如,WO00/06593。
[0496] 结合VISTA或VISTA缀合物的抗体
[0497] 本发明还提供了选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体,包括但不限于单克隆和人源化单克隆抗体。可将选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体与具有药用载体和另外抗体(例如,抗PD-L1、PD-L2或CTLA-4抗体)的组合物混合。
[0498] 可使用用于多克隆和单克隆抗体制备的标准技术,将分离的VISTA多肽或其部分或片段用作免疫原来产生结合VISTA的抗体。可使用全长VISTA多肽,或可选择地,本发明提供了用作免疫原的VISTA的抗原性肽片段。在一个实施方案中,VISTA的抗原性肽包含SEQ ID NO:2、4或5中显示的氨基酸序列的至少8个氨基酸残基,并且包括VISTA的表位,以便针对肽产生的抗体与VISTA多肽形成特定免疫复合物。优选地,抗原性肽包含至少10个氨基酸残基,更优选至少15个氨基酸残基,更优选至少20个氨基酸残基,最优选至少30个氨基酸残基。由抗原性肽包含的优选表位为位于多肽的胞外域的VISTA的区域,例如亲水性区域以及具有高抗原性的区域。
[0499] VISTA免疫原通常用于制备抗体,通过用免疫原免疫合适的受试者(例如,兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)。适当的免疫原性制剂可包含例如重组表达的VISTA多肽或化学合成的VISTA多肽。制剂还可包含佐剂,例如弗氏完全或不完全佐剂,或相似的免疫刺激试剂。利用免疫原性VISTA制剂对适当受试者的免疫诱导多克隆抗VISTA抗体反应。
[0500] 抗体可由两个相同的分子量为约23,000道尔顿(“轻链”)的多肽轻链和两个相同的分子量为53,000–70,000(“重链”)的重链组成。参见Edelman(1971)Ann.NY.Acad.Sci.190:5。4条链通过“Y”构型中的二硫键连接,其中轻链把始于“Y”构型的口的重链括在一起。“Y”构型的“分枝”部分被称为Fab区;“Y”构型的茎部分称为FC区。氨基酸序列取向为从“Y”构型顶部的N末端至每一条链的底部的C末端。N末端具有拥有针对引发其的抗原的特异性并且长度为约100个氨基酸的可变区,抗体之间在轻链和重链之间存在微小的变异。
[0501] 可变区在每一条链中连接至恒定区,所述恒定区延伸链的剩余长度并且在特定种类的抗体中不随抗体的特异性变化而变化(即,引发其的抗原)。存在5个已知大类的决定免疫球蛋白分子的种类恒定区(例如,对应于γ、μ、α、δ和ε重链恒定区的IgG、IgM、IgA、IgD,和IgE)。恒定区或种类决定抗体的随后效应子功能,包括补体的活化(Kabat(1976)Structural Concepts in Immunology and Immunochem istry[第2版]第
413–436页;Holt,Rinehart,Winston)和其它细胞反应(Andrews,等人(1980)Clinical Immunobiology1–18;Kohl,等人(1983)Immunology 48:187),而可变区决定与其反应的抗原。轻链分类为κ(卡巴)或λ(兰姆达)。每一个重链种类可利用κ或λ轻链来制
备。可将轻链与重链彼此键合,当通过杂交瘤或B细胞产生免疫球蛋白时,通过共价二硫链将两个重链的“尾”部分处彼此键合。
[0502] 在这样的条件下对抗体的特异性结合可能需要针对其对于特定蛋白的特异性选择的抗体。例如,针对来自特定物种例如大鼠、小鼠或人的精液基本蛋白产生的多克隆抗体可被选择来仅获得与精液基本蛋白特异性免疫反应并且不与除多态性变体和精液基本蛋白的等位变体外的其它蛋白质免疫反应的抗体。该选择可通过扣除与来自其它物种的精液基本蛋白分子交叉反应的抗体来实现。可将多种免疫测定形式用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如,将固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性反应的抗体。关于可用于决定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述,参见,例如,Harlow&Lane(1998)USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory。通常地,特异性或选择性反应为本底信号或噪声的至少2倍,更常见地为本底的约10至100倍。
[0503] 可筛选抗体以鉴定结合VISTA的特定表位(例如在IgV结构域或其它特定结构域中)的那些抗体和/或选择对于VISTA蛋白具有高亲和力和亲合力的抗体。此外,筛选这些抗体以鉴定其中在体外和体内调节VISTA对免疫和免疫细胞的特异性功能和作用的那些抗体。例如,可进行测定来确定特定抗VISTA抗体对受V|ISTA负调节的免疫功能的调节作用(例如有的话),所述免疫功能包括通过CD4+或CD8+T细胞产生细胞因子、CD28共刺激、CD4+T细胞增殖和首次接触实验的记忆CD4+T细胞的增殖等。在实施方案中,进行测定来鉴定潜在治疗性抗VISTA抗体,当VISTA-Ig存在时,所述抗体在体外增强VISTA-Ig的抑制作用,因为这些抗VISTA抗体在体内行为相反,即它们是免疫抑制性的。本发明包括特异性结合136个氨基酸的胞外域,例如特异性结合氨基酸1–50、50–100、100–136的抗VISTA抗体、特异性结合IgV的抗体、特异性结合茎区的抗体、特异性结合跨膜区的抗体以及特异性结合VISTA的胞质区的抗体及其用途。在本申请中鉴定了这些特定区域。
[0504] 在另一个实施方案中,重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如,组织特异性调控元件用于表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中是已知的。适当的组织特异性启动子的实例包括白蛋白启动子(肝特异性的;Pinkert等人(1987)Genes Dev.1:268–277)、淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton(1988)
Adv.Immunol.43:235–275)、T细胞受体的特定启动子(Winoto和Baltimore(1989)
EMBO J.8:729–733)和免疫球蛋白(Banerji等人(1983)Cell33:729–740;Queen和
Baltimore(1983)Cell 33:741–748)、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle(1989)Proc Natl.Acad.Sci.USA 86:5473–5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等人(1985)Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如,牛乳清蛋白启动子;美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开No.264,166)。还包括受发育调控的启动子,例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249:374–379)和α-甲胎蛋白启动子(Campes
和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537–546)。
[0505] 多克隆抗体
[0506] 多克隆抗体是来源于用抗原免疫的动物的血清的抗体分子的不均一群体。选择性结合VISTA和VISTA缀合物的多克隆抗体可通过本领域中公知的方法来产生。参见,例如,Howard&Kaser(2007)Making and Using Antibodies:A Practical Handbook CRC Press。
[0507] 单克隆抗体
[0508] 单克隆抗体包含大体上均一的对于抗原是特异性的抗体群体,该群体包含大体上相似的表位结合位点。单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法来获得。参见,例如,Kohler和Milstein(1975)Nature256:495–497;美国专利No.4,376,110;Ausubel,等人[编辑](2011)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,NY.;和Harlow和Lane(1998)USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory;Colligan,等 人 (2005)[ 编 辑 ]Current Protocols in Immunology Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,NY。这样的抗体可属于任何免疫球蛋白种类,包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任意亚类。可在体外、原位或体内培养产生本发明的抗体的杂交瘤。
[0509] 嵌合抗体
[0510] 嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子,例如具有来源于鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子,其主要用于在应用中降低免疫原性和在生产中增加产率,例如,其中鼠单克隆抗体具有来自杂交瘤的更高产率,但在人中具有更高的免疫原性,以便可使用人鼠嵌合单克隆抗体。嵌合抗体及用于其产生的方法在本领域中是已知的。参见Cabilly,等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273–3277;
Morrison,等 人 (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851–6855,Boulianne,等 人(1984)Nature 312:643–646;Neuberger,等人(1985)Nature 314:268–270;欧洲 专利申请173494(1986);WO86/01533(1986);欧洲专利申请184187(1986);欧洲专利申
请73494(1986);Sahagan,等 人(1986)J.Immunol.137:1066–1074;Liu,等 人 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439–3443;Sun,等 人 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:214–218;Better,等 人 (1988)Science 240:1041–1043;和 Harlow&Lane(1998)USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory;美国专利No.5,624,659。
[0511] 人源化抗体
[0512] 人源化抗体经工程化包含甚至更加人样的免疫球蛋白结构域,并且仅整合动物来源的抗体的互补决定区。这可通过检查单克隆抗体的可变区的高变环的序列和将它们拟合人抗体链的结构来实现。参见,例如,美国专利No.6,187,287。同样地,产生人源化抗体的其它方法现在本领域中是公知的。参见,例如,美国专利No.5,225,539;5,530,101;5,585,089;5,693,762;6,054,297;6,180,370;6,407,213;6,548,640;6,632,927和 6,639,055;Jones,等 人 (1986)Nature 321:522–525;Reichmann,等 人 (1988)Nature 332:323–327;Verhoeyen,等 人(1988)Science 239:1534–36以 及 Zhiqiang An(2009)[编 辑 ]Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic John Wiley&Sons,Inc。
[0513] 抗体片段
[0514] 除了完整免疫球蛋白(或它们的重组对应物)以外,可合成包含表位结合位点(例如,Fab’、F(ab’)2或其它片段)的免疫球蛋白片段。“片段”或最小免疫球蛋白可使用重组免疫球蛋白技术来设计。例如用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可通过合成融合的可变轻链区和可变重链区来产生。抗体的组合也很吸引人,例如双链抗体,其包含两个不同的Fv特异性。免疫球蛋白的抗原结合片段包括但不限于SMIP(小分子免疫药物制剂)、骆驼体、纳米抗体和IgNAR。
[0515] 抗独特型抗体
[0516] 抗独特型(抗Id)抗体为识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。Id抗体可通过用将针对其制备抗Id的抗体免疫具有与抗体的来源相同的物种和基因型(例如,小鼠品系)的动物来制备。经免疫的动物将识别免疫抗体的独特型抗原决定簇并通过产生针对这些独特型抗原决定簇的抗体的抗体(抗Id抗体)来对其作出的。参见,例如,美国专利No.4,699,880。抗Id抗体还可用作“免疫原”来在另一动物中诱导免疫反应,从而产生所谓的抗抗Id抗体。抗抗Id可在表位上与诱导抗Id的原始抗体相同。因此,通过使用针对抗体的独特型抗原决定簇的抗体,有可能鉴定表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。
[0517] 工程化和修饰抗体
[0518] 本发明的抗体还可使用具有一个或多个来源于抗体起始材料的VH和/或VL序列的抗体工程化修饰抗体来制备,所述修饰抗体可具有改变的来自起始抗体的性质。抗体可通过修饰一个或两个可变区(即,VH和/或VL)内,例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来进行工程化。另外地或可选择地,可通过修饰恒定区内的残基例如以改变抗体的效应子功能来工程化抗体。
[0519] 可进行的一个类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此,在个体抗体之间,CDR内的氨基酸序列比CDR外部的序列更加多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相
互作用,因此有可能通过构建包含被移植至来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然存在的抗体的CDR序列,来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体。参见,例如,Riechmann,等人(1998)Nature 332:323–327;Jones,等人(1986)Nature
321:522–525;Queen,等人(1989)Proc.Natl.Acad.U.S.A.86:10029–10033;美国专利No.5,225,539;5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370。
[0520] 适当的构架序列可获自公共DNA数据库或公开的参照资料,所述构架序列包括种系抗体基因序列。例如,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(可在因特网上获得)中以及Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences
of Proteins of Immunological Interest[第 5 版 ]U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开No.91–3242;Tomlinson,等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776–798和Cox,等人(1994)Eur.J Immunol.24:827–836中。
[0521] 另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR 1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基,从而改善目标抗体的一个或多个结合性质(例如,亲和力)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以诱导突变,可在适当的体外或体内测定中评价对抗体结合或其它目标功能性质的作用。优选地,可引入保守修饰(如本文中论述的)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失,但优选地是置换。此外,通常改变不超过1、2、3、4或5个CDR内的残基。
[0522] 本发明的工程抗体包括其中已对VH和/或VL内的构架残基进行修饰例如以改善抗体的性质的那些抗体。通常地进行这样的构架修饰,以降低抗体的免疫原性。例如,一个方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成对应的种系序列。更具体地,已经历体细胞突变的抗体可包含与抗体所源自的种系序列不同的构架残基。这样的残基可通过将抗体构架序列与抗体所源自的种系序列相比较来鉴定。
[0523] 此外或作为对构架或CDR区内的修饰的替代,可对本发明的抗体进行工程化以在Fc区内包含修饰,通常地以改变抗体的一个或多个功能性质,例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外,可对本发明的抗体进行化学修饰(例如,可将一个或多个化学部分连接至抗体)或进行修饰以改变其糖基化,再次地改变抗体的一个或多个功能性质。在下文中进一步描述这样的实施方案。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
[0524] 可修饰CH1的铰链区以便铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变,例如增加或减少。参见美国专利No.5,677,425。可改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数,以例如促进轻链和重链的装配或增强或减弱抗体的稳定性。
[0525] 可突变抗体的Fc铰链区以缩短抗体的生物半衰期。更具体地,可将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区,以便抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合受损的葡萄球菌属(Staphylococcyl)蛋白A(SpA)结合。参见,例如,美国专利No.6,165,745。
[0526] 可修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如,可引入下列突变的一个或多个突变:T252L、T254S、T256F。参见美国专利No.6,277,375。或者,为了增加生物半衰期,可在CH1或CL区内改变抗体以包含获自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。参见美国专利No.5,869,046和6,121,022。
[0527] 可通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如,可用不同氨基酸替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸,以便抗体具有改变的针对效应子配体的亲和力,但保留亲代抗体的抗原结合能力。可改变针对其的亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。参见,例如美国专利No.5,624,821和5,648,260。
[0528] 可修饰抗体的糖基化。例如,可产生无糖化抗体(即,抗体不存在糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这样的糖修饰可通过例如以下方式来实现:改变抗体序列内的糖基化的一个或多个位点。例如,可产生一个或多个氨基酸置换,所述置换导致一个或多个可变区构建糖基化位点消除,从而消除该位点上的糖基化。这样的无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。参见,例如,美国专利No.5,714,350和6,350,861。
[0529] 此外或可选择地,可产生抗体,所述抗体具有改变的类型的糖基化,例如具有减少量的岩藻糖残基的岩藻糖残基不足的抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已显示这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这样的糖修饰可通过例如在具有
改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机器的细胞在本
领域已进行了描述,并且可用作其中表达本发明的重组抗体,从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。参见美国专利申请公开No.2004/0110704和Yamane-Ohnuki,等
人 (2004)Biotechnol Bioeng.87:614–22;EP 1,176,195;WO 2003/035835;Shields,等 人 (2002)J.Biol.Chem.277:26733–26740;WO 99/54342;Umana,等 人 (1999)Nat.Biotech.17:176–180;和Tarentino,等人(1975)Biochem.14:5516–23.
[0530] 可将抗体PEG化以例如增加抗体的生物(例如,血清)半衰期。为了PEG化抗体,通常在其中使一个或多个PEG基团能够连接至抗体或抗体片段的条件下,将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或衍生物反应。优选地,通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行PEG化。
[0531] 本发明还提供了与本文中所示的抗体、抗体片段、双链抗体、SMIP、骆驼体、纳米抗体、IgNAR、多肽、可变区和CDR大体上同源的变体和等同物。这些可包含例如保守置换突变(即,相似氨基酸对一个或多个氨基酸的置换)。例如,保守置换是指用相同大类中的另一个氨基酸对氨基酸的置换,例如用另一个酸性氨基酸对一个酸性氨基酸的置换,用另一个碱性氨基酸对一个碱性氨基酸的置换,或用另一个中性氨基酸对一个中性氨基酸的置换。
[0532] 抗体缀合物
[0533] 此外,可将抗体(或其片段)偶联至治疗性部分例如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如,甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如,氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合钼(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如,柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素类(例如,放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)),以及抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春碱)。
[0534] 工程化抗体的方法
[0535] 具有本文中公开的VH和VL序列的抗体可用于通过修饰VH和/或VL序列或连接至其的恒定区来产生新的变异抗体。因此,本发明的变异抗体的结构特征用于产生结构上相关的变异抗体,其保留本发明的抗体的至少一种功能性质,例如结合VISTA和VISTA缀合物。例如,可将一个抗VISTA变异抗体或抗VISTA缀合物变异抗体或其突变的一个或多个CDR区,与已知的构架区和/或其它CDR重组地组合来产生本发明的另外的重组工程化抗VISTA或抗VISTA缀合抗体(例如,结合VISTA和VISTA缀合物的抗体)。用于工程法的起
始材料可以是本文中提供的VH和/或VK序列的一个或多个,或其一个或多个CDR区。为了产生工程抗体,不一定实现制备(即,表达为蛋白质)具有一个或多个本文中提供的VH和/或VK序列或一个或多个其CDR区的抗体。相反地,将包含在序列中的信息用作起始材料来产生来源于原始序列的“第二代”序列,随后制备“第二代”序列,将其表达为蛋白质。可将标准分子生物学用于制备和表达改变的抗体序列。
[0536] 由改变的抗体序列编码的抗体可保留通过方法产生的具有本文中提供的序列的抗VISTA或抗VISTA缀合抗体的一个、一些或全部功能性质,所述功能性质包括以特定KD水平或更低水平对变异VISTA或变异VISTA缀合物的结合和/或调节免疫细胞活性,和/或选择性结合至所需靶细胞例如结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌和肝癌。改变的抗体的功能性质可使用可在本领域获得的和/或本文中描述的标准测定来进行评估。
[0537] 可沿着抗VISTA或抗VISTA缀合抗体编码序列的全部或部分随机或选择性地引入突变,可筛选所得的修饰抗VISTA或抗VISTA缀合抗体的结合活性和/或期望所需的功能性质。参见WO 2011/120013。
[0538] 编码选择性结合VISTA或VISTA缀合物的抗体的核酸
[0539] 本发明的另一个实施方案涉及编码本发明的结合VISTA和VISTA缀合物的抗体的核酸分子。核酸可存在于完整细胞中,细胞裂解物中,或以部分纯化的或大体上纯化的形式存在。可通过使用标准技术从其它细胞组分或其它污染物(例如,其它细胞核酸或蛋白质)纯化出来而分离核酸,所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术。参见,Ausubel,等人(2011)Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons,Inc。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA,并且可以包含或可以不包含内含子序列。核酸可以是cDNA分子。
[0540] 可使用分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤(例如,从具有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤,如下文中进一步描述的)表达的抗体,可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如,使用噬菌体展示技术)获得的抗体,可从文库回收编码抗体的核酸。
[0541] 具体地,可通过产生例如其中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换一个或多个选择的密码子的第三位置的序列来实现简并密码子置换。Batzer,等人(1991)Nucleic Acid Res.19:5081;Ohtsuka,等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605–08;Rossolini,等人(1994)Mol.Cell.Probes 8:91–98。
[0542] 一旦获得编码VH和VL的DNA片段,还可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段例如以将可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中,可将编码VL的或编码VH的DNA片段有效地连接至编码另一种蛋白例如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段。
[0543] 通过将编码VH的DNA有效地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子来将分离的编码VH基因的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的
序列在本领域中是已知的(参见,例如,Kabat,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生与公共服务部,NIH公开No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因,可将VH编码DNA有效地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。
[0544] 可通过将编码VL的DNA有效地连接至编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子来将分离的编码VL区的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因
的序列在本领域中是已知的(参见,例如,Kabat,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版,美国卫生与公共服务部,NIH公开No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,但最
优选是κ恒定区。
[0545] 为了产生scFv基因,将编码VH和VL的DNA片段有效地连接至编码柔性接头,例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段,以便VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白质,通过柔性接头连接VL与VH区。参见,例如,Bird,等人(1988)Science 242:423–426;Huston,等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879–5883;McCafferty,等人(1990)Nature 348:552–554。
[0546] 产生抗体及其片段的方法
[0547] 本发明还提供了用于产生抗体及其片段的方法。产生抗体的方法对于本领域技术人员来说是公知的。例如,产生嵌合抗体的方法在本领域是公知的。参见,例如,美国专利No.4,816,567;Morrison,等人(1984)PNAS USA 81:8651–55;Neuberger,等人(1985)Nature 314:268–270;Boulianne,等人(1984)Nature 312:643–46.
[0548] 例如,可通过基因工程产生抗体或抗原结合片段。在该技术中,与其它方法一样,使抗体产生细胞对所需抗原或免疫原敏化。使用PCR扩增,将从抗体产生细胞分离的信使RNA用作模板来产生cDNA。通过将扩增的免疫球蛋白cDNA的适当区段插入表达载体来产生载体文库,每一个载体包含一个重链基因和一个轻链基因,保留初始抗原特异性。通过将重链基因文库与轻链基因文库组合来构建组合文库。这导致共表达重链和轻链(重新装配抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆的文库。将具有这些基因的载体共转染进宿主细胞。当在转染的宿主中诱导抗体基因合成时,重链与轻链蛋白自组装以产生可通过利用抗原或免疫原的筛选检测的活性抗体。
[0549] 还可通过使用本领域普通技术人员公知的常规技术构建表达载体来产生本发明的抗体及其片段,所述表达载体包含操纵子和编码抗体重链的DNA序列,其中编码抗体特异性所需的CDR的DNA序列来源于非人细胞来源,而编码抗体的其余部分的DNA序列来源于人细胞来源。此外,本发明还涉及载体,尤其是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、和基因工程中常用的其它载体,所述载体包含上述本发明的核酸分子。可将载体中包含的核酸分子有效地连接至调控元件,所述调控元件确保在原核和真核细胞中转录。
[0550] 载体包含有利于用于在靶宿主细胞中表达外源基因的操作的元件。方便地,首先在细菌宿主(例如,大肠杆菌)中进行用于转化的DNA的序列操作和产生,通常地载体将包括有利于这样的操作的序列,包括细菌复制起始点和适当的细菌选择标记。选择标记编码在选择培养基上生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。常见选择基因编码赋予对抗生素或其它毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或提供不可从复合培养基获得的至关重要的营养物的蛋白质。用于转化酶母的示例性载体和方法如本领域中描述的。参见,例如,Burke,等人(2000)Methods in Yeast Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0551] 可将目标多肽编码序列有效地连接至提供多肽在酵母细胞中表达的转录和翻译调控序列。这些载体组分可包括但不限于以下元件的一个或多个:增强子元件、启动子和转录终止序列。还可包含用于多肽分泌的序列(例如,信号序列)。
[0552] 当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时,核酸被“有效地连接”。例如,如果信号序列的DNA表达为参与多肽的分泌的前蛋白时其被有效地连接至多肽的DNA;启动子或增强子有效地连接至编码序列,如果其影响序列的转录的话。一般而言,“有效连接的”在广义上指连续连接的DNA序列,并且在分泌前导序列的情况下,连续的且在框内。然而,增强子不必是连续的。
[0553] 启动子是位于结构基因的起始密码子的上游(5’)的非翻译序列(通常在约100至1000bp内),其控制与它们有效连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子落入几个种类:诱导型、组成型和阻抑型启动子(例如,响应阻遏物的不存在而升高转录水平)。诱导型启动子可响应培养条件的一些变化(例如,营养物的存在或不存在或温度的变化)而启动升高的水平的从DNA在它们控制下的转录。
[0554] 使用本领域普通技术人员公知的相同的常规方法产生第二表达载体,所述表达载体包含操纵子和编码抗体轻链的DNA序列,其中编码抗体特异性所需的CDR的DNA序列来源于非人细胞来源,优选地兔B细胞来源,然而编码抗体链的其余部分的DNA序列来源于人细胞来源。
[0555] 通过本领域普通技术人员公知的常规方法将表达载体转染进宿主细胞以产生转染的宿主细胞,通过本领域普通技术人员公知的常规技术培养的所述转染的宿主细胞以产生所述抗体多肽。
[0556] 可用两种上述表达载体共转染宿主细胞,第一表达载体包含编码操纵子和轻链来源的多肽的DNA,第二载体包含编码操纵子和重链来源的多肽的DNA。两个载体包含不同的选择标记,但优选实现大体上相等的重链和轻链多肽的表达。或者,可使用单个载体,载体包含编码重链和轻链多肽两者的DNA。重链和轻链的编码序列可包含cDNA、基因组DNA或两者。
[0557] 用于表达抗体及其片段的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌或真核细胞。可使用用于该目的既定类型的哺乳动物细胞例如骨髓瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO或HEK293细胞系。
[0558] 可籍以构建载体的一般方法、产生宿主细胞所需的转染方法和从所述宿主细胞产生抗体及其片段所需的培养方法均包括常规技术。尽管优选地用于产生抗体的细胞系是哺乳动物细胞系,但可使用任何其它适合的细胞系,例如细菌细胞系例如大肠杆菌来源的细菌菌株或酵母细胞系。
[0559] 类似地,一旦产生,可按照本领域中的标准方法,例如交叉流过滤、硫酸铵沉淀和亲和柱层析纯化抗体。
[0560] 使用动物产生结合VISTA或VISTA缀合物的抗体
[0561] 选择性结合VISTA和VISTA缀合物的本发明的抗体可以是人单克隆抗体。这样的针对VISTA和VISTA缀合物的人单克隆抗体可使用具有部分人免疫系统而非小鼠
系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分
别称为HuMAb 和KM 的小鼠,在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb
(Medarex,Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白
序列和使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变一起的人免疫球蛋白微型基因座。参
见,例如,Lonberg,等人(1994)Nature 368(6474):856–859。因此,小鼠显示减少的小鼠IgM或κ表达,并且响应免疫,引入的人重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体。Lonberg(1994)Handbook of Experimental
Pharmacology 113:49–101;Lonberg 和 Huszar(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65–93,以 及 Harding 和 Lonberg(1995)Ann.NY.Acad.Sci.764:536–546。HuMab 的
制备和用途以及由这样的小鼠具有的基因组修饰在Taylor,等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287–6295;Chen,等人 (1993)International Immunology 5:647–656;
Tuaillon,等 人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720–3724;Choi,等 人 (1993)Nature Genetics 4:117–123;Chen,等 人 (1993)EMBO J.12:821–830;Tuaillon,等人(1994)J.Immunol.152:2912–2920;Taylor,等人 (1994)International Immunology
6:579–591;和Fishwild,等人(1996)Nature Biotechnology 14:845–851中作了进
一步描述。进一步参见,美国专利No.5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;
5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;5,770,429;and 5,545,807;
WO 92/03918,WO 93/12227,WO 94/25585;WO 97/13852;WO 98/24884;WO 99/45962;和WO
01/14424。
[0562] 本发明的人抗VISTA和抗VISTA-Ig缀合抗体(例如,选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体)可使用在转基因和转染色体上具有人免疫球蛋白序列的小鼠,例如具有人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生。这样的小鼠,在本文中称为“KM ”,详细地描述于WO 02/43478中。
[0563] 此外,表达人免疫球蛋白基因的可选择的转基因动物系统在本领域中是可获得的,并且可用于产生本发明的抗VISTA和抗VISTA-Ig缀合抗体。例如,可使用
称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的可选择转基因系统;这样的小鼠在例如美国专利
No.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963中进行了描述。
[0564] 此外,表达人免疫球蛋白基因的可选择转染色体动物系统在本领域中是可获得的,并且可用于产生本发明的抗VISTA和抗VISTA-Ig缀合抗体。例如,可使用称为“TC小鼠”的具有人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠。参见Tomizuka,等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722–727。此外,具有人重链和轻链转染色体的牛已在本领域进行了描述(Kuroiwa,等人(2002)Nature Biotechnology 20:889–894),并且可用于产生发明的抗VISTA和抗VISTA-Ig缀合抗体。
[0565] 本发明的人单克隆抗体还可使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。在本领域中建立用于分离人抗体的这样的噬菌体展示法。参见,例如,美国专利 No.5,223,409;5,403,484;5,571,698;5,427,9085,580,717;5,969,108;6,172,197;5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081。
[0566] 本发明的人单克隆抗体还可使用已在其中重建了人免疫细胞以便可在免疫后产生人抗体反应的SCID小鼠来制备。参见,例如,美国专利No.5,476,996和5,698,767。
[0567] 当将人Ig小鼠用于产生本发明的人抗体时,可用纯化的或富集的VISTA和VISTA缀合多肽的制剂免疫此类小鼠,如由Lonberg,等人(1994)Nature 368(6474):856–859;Fishwild,等人(1996)Nature Biotechnology 14:845–851;WO 98/24884和WO 01/14424描述的。优选地,当第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如,VISTA和VISTA缀合物的纯化的或重组制剂(5–50μg)VISTA和VISTA缀合物可用于腹膜内免疫人Ig小鼠。
[0568] 先前其他人关于各自抗原的经验已显示当最初用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内免疫,随后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫(达到总共6次)时,转基因小鼠起反应。然而,还发现除弗氏佐剂外的佐剂是有效的。此外,还发现在佐剂不存在的情况下完整细胞具有高度免疫原性。可在利用通过眶后放血获得的血浆样品的免疫方案的过程监测免疫反应。可通过ELISA(如下文中描述的)筛选血浆,将具有足够滴度的抗VISTA或抗VISTA-Ig人免疫球蛋白的小鼠用于融合。可在处死前3天用抗原静脉内加强小鼠,取出脾脏。预期对于每一次免疫可能需要进行2-3个融合。对于每一种抗原,通常免疫6至24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12品系。此外,可将HCo7和HCo12转基因一起培育进具有两个不同重链转基因(HCo7/HCo12)的单个小鼠中。可选择地或另外地,可使用KM
品系。
[0569] 生成本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
[0570] 为了产生生成本发明的单克隆抗体的杂交瘤,可分离来自已免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞,将其融合至适当的永生化细胞系,例如小鼠骨髓瘤细胞系。筛选所得的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。例如,可使用50%PEG将来自已免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮物与1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL –51580)融合。将细胞以约2X 10 个涂板在平底微量滴定板中,随后在包含20%胚胎克隆血清、18%“653”条件培养基、5%三甲氧唑辛(origen)(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM的HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1XHAT(Sigma;在融合后24小时添加HAT)的选择培养基中温育2周。约两周后,可在其中HAT用HT代替的培养基中培养细胞。随后通过ELISA筛选单个孔的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长,则通常在10-14天后观察培养基。可将抗体分泌性杂交瘤重新涂板,再次筛选,并且如果仍然人IgG阳性的,则可通过至少两次有限稀释来亚克隆单克隆抗体。随后可体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体,以进行表征。
[0571] 为了纯化人单克隆抗体,可在2升旋瓶中生长选择的杂交瘤以用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩,随后用蛋白A琼脂糖凝胶(Sepharose)
(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换至PBS中,并且可使用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并贮存在-80℃。
[0572] 转基因动物
[0573] 本发明的宿主细胞还可用于产生非人转基因动物。例如,在一个实施方案中,本发明的宿主细胞为已向其中引入了VISTA编码序列的受精卵或胚胎干细胞。这样的宿主细胞随后可用于产生非人转基因动物,其中已将外源VISTA序列引入它们的基因组或同源重组动物,其中已改变了内源VISTA序列。这样的动物可用于研究VISTA的功能和/或活性以及用于鉴定和/或评价VISTA活性的调节因子。如本文中所用,“转基因动物”是非人动物,优选地为哺乳动物,更优选地为啮齿动物例如大鼠或小鼠,其中动物细胞的一个或多个包含转基因。转基因动物的其它实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等等。转基因是整合进转基因动物发育细胞的基因组中并保留在成熟动物基因组中的外源DNA,从而指导转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中编码基因产物的表达。如本文所用,“同源重组动物”是非人动物,优选地为哺乳动物,更优选地为小鼠,其中内源性VISTA基因已通过内源性基因与在动物发育前引入动物细胞(例如动物胚胎细胞)中的外源性DNA分子之间的同源重组来改变。本发明的转基因动物可通过以下方式产生:将编码VISTA的核酸引入受精卵的精核,例如通过显微注射、逆转录病毒感染,随后让受精卵在假孕雌性暂养动物中发育。SEQ ID NO:1或4的VISTA cDNA序列可作为转基因引入非人动物的基因组。或者,人VISTA基因的非人同系物,例如猴或大鼠VISTA基因,可用作转基因。或者,VISTA基因同源物,例如另一种VISTA家族成员,可基于与SEQ ID NO:1或3的VISTA cDNA序列的杂交来分离并用作转基因。内含子序列和聚腺苷酸化信号也可包含在转基因中以提高转基因表达的效率。组织特异性调节序列可有效连接至VISTA转基因以指导VISTA多肽在特定细胞中的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(尤其是例如小鼠的动物)的方法已成为本领域的常规方法,并例如在Leder等人的美国专利No.4,736,866和4,870,009、Wagner等人的美国专利No.4,873,191中以及在Hogan,B.,Manipulating the Mouse
Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)中有所描述。类似的方法用于产生其它转基因动物。转基因创始动物可基于VISTA转基因在其基因组中的存在性和/或VISTA mRNA在动物组织或细胞中的表达来鉴定。转基因创始动物随后可用于繁殖携带转基因的另外动物。此外,携带编码VISTA多肽的转基因的转基因动物可被进一步繁殖成携带其它转基因的其它转基因动物。
[0574] 为了产生同源重组动物,制备包含VISTA基因至少一部分的载体,已向所述基因中引入了缺失、添加或置换,从而改变例如在功能破坏上VISTA基因。VISTA基因可以是人或鼠基因(例如,SEQ ID NO:1或3的cDNA)
[0575] 在另一个实施方案中,可产生这样的转基因非人动物,其包含允许转基因的调节性表达的所选系统。这样的系统的一个实例为P1噬菌体的cre/loxP重组酶系统。有关cre/loxP重组酶的描述,参见例如Lakso等人(1992)Proc Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236。重组酶系统的另一个实例为酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gorman等人(1991)Science
251:1351–1355。如果将cre/loxP重组酶系统用于调节转基因的表达,则需要包含编码Cre重组酶和所选多肽两者的转基因的动物。这样的动物可通过构建“双”转基因动物来提供,例如,通过交配两个转基因动物,一个含有编码所选多肽的转基因,另一个包含编码重组酶的转基因。
[0576] 本文所述的非人转基因动物的克隆也可根据Wilmut,等人(1997)Nature385:810–813;WO 97/07668和WO 97/07669中所述的方法产生。简而言之,可分离来自转基因动物的细胞(例如体细胞),然后进行诱导以退出生长周期并进入G0期。随后可例如通过使用电脉冲将静止细胞融合至来自与分离静止细胞相同物种的动物的去核卵母细胞。
随后培养重构的卵母细胞,以便发育至桑椹胚期或胚泡期,随后转移到假孕雌性暂养动物中。该雌性暂养动物产生的子代将是分离细胞(例如,体细胞)的动物的克隆。
[0577] 标记
[0578] 可对本文中描述的多肽、缀合物和抗体进行翻译后修饰以添加效应子部分,例如化学接头、可检测部分例如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分、细胞毒性剂、放射性物质或官能部分。
[0579] 可将多种实体例如配体偶联至本领域已知的寡核苷酸。配体可包括天然存在的分子,或重组或合成的分子。示例性配体包括但不限于抗生物素蛋白、生物素、肽、拟肽、聚赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)、mPEG、阳离子基团、精胺、亚精胺、聚胺、促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化的聚氨基酸、转蛋白、适体、免疫球蛋白(例如、抗体)、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、糖、亲脂性分子(例如,类固醇、胆汁酸、胆甾醇、胆酸和脂肪酸)、维生素A、维生素E、维生素K、维生素B、叶酸、维生素B12、核黄素、生物素、吡哆醛、维生素辅因子、脂多糖、激素和激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物、放射性标志物、荧光染料及其衍生物。参见,例如,美国专利No.6,153,737、6,172,208、6,300,319、6,335,434、6,335,437、6,395,437、6,444,806、6,486,308、6,525,031、
6,528,631和6,559,279。
[0580] 此外,可将部分添加至抗原或表位,以增加体内半衰期(例如,通过延长从血流清除的时间)。这样的技术包括例如添加PEG部分(也称为PEG化),并且在本领域中是是公知。参见美国专利申请公开No.2003/0031671。
[0581] 当本文中描述的抗原、抗体或抗原结合片段通过非随机化学或物理相互作用与固体标记缔合时,其被“附接”至基底。附接可通过共价键。然而,附接不必是共价的或永久性的。可通过“间隔基分子”或“连接基团”将材料附接至标记。这样的间隔基分子是具有可附接到所述生物材料的第一部分和附接至标记的第二部分的分子。因此,当附接至标记时,间隔基分子分离标记与生物材料,但附接至两者。将生物材料(例如,标记)附接至标记的方法在本领域是公知的,并且包括但不限于化学偶联。
[0582] 可检测标记
[0583] 可对本文中描述的VISTA和VISTA缀合物进行翻译后修饰以添加效应子标记,例如化学接头、可检测标记例如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料和化学发光标记、或官能标记例如链霉抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性材料。另外的示例性酶包括但不限于辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和荧光素酶。另外的示例性荧光材料包括但不限于罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三吖嗪基胺、藻红蛋白和丹磺酰氯。进一步示例性的化学发光标志物包括、但不限于、鲁米诺。另外的示例性生物发光材料包括但不限于荧光素、荧光素酶
213 14
和水母发光蛋白。另外的示例性放射性物质包括但不限于铋-213( Bs)、碳-14( C)、
11 18 51 57 60 64 67
碳-11( C)、氯18(Cl )、铬-51( Cr)、钴-57( Co)、钴60( 钴)、-64( Cu)、铜-67( Cu)、
165 169 18 67 68 68
镝-165( Dy)、铒 -169( Er)、氟-18( F)、镓-67( Ga)、镓-68( Ga)、锗 -68( Ge)、
166 111 125 124 124 131
钬-166( Ho)、铟-111( I n)、碘-125( I)、碘-123( I)、碘-124( I)、碘-131( I)、
192 59 81 212 177 99
铱-192( Ir)、铁-59( Fe)、氪81( Kr)、铅-212( Pb)、镥-177( Lu)、钼-99( Mo)、氮
13 15 103 32 42 186 188
13( N)、氧-15( O)、钯-103( Pd)、磷-32( P)、-42( K)、铼-186( Re)、铼-188( Re)、
81 82 153 75 24 82
铷-81( Rb)、铷-82( Rb)、钐 -153( Sm)、硒-75( Se)、钠 -24( Na)、锶 -82( Sr)、
89 35 99 201 3 133
锶 -89( Sr)、硫 35( S)、锝 -99m( Tc)、铊 -201( Tl)、氚 (H)、氙 -133( Xe)、
169 177 90
镱-169( Yb)、镱-177( Yb)和钇-90( Y)。
[0584] 细胞毒性剂
[0585] 为了产生细胞毒性剂,可使用本领域已知的技术将本发明的多肽的VISTA和VISTA缀合物连接或有效地附接至毒素。已知可缀合至本发明的多肽或抗体的各种各样的毒素。实例包括:许多有用的植物、真菌或甚至细菌来源的毒素,其通过示例的方式包括:
各种A链毒素,特别是蓖麻毒素A链;核糖体失活蛋白质如皂草素或白树毒素;α-帚曲霉素;黄曲霉素;局限曲菌素;和核糖核酸酶例如胎盘核糖核酸酶,血管产生、白喉毒素或绿脓杆菌外毒素。用于与本发明结合使用的优选毒素部分是毒素A链已被处理,以修饰或删除糖残基,去糖基化A链。美国专利No.5,776,427。
[0586] 可将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物缀合于细胞毒性剂,包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪;烷化剂例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺合钼(II)(DDP)顺钼和卡铂(paraplatin);蒽环类包括柔红菌素(以前称为道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群;抗生素类包括更生霉素(放线菌素D)、博来霉素、卡奇霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC);以及抗有丝分裂剂例如长春新碱和长春碱)。其它细胞毒性剂包括紫杉醇( )、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇,米托坦(mytotane)(O,P'-(DDD)),干扰素和这些细胞毒性剂的混合物。
[0587] 另外的细胞毒性剂包括但不限于,化疗剂例如卡铂、顺铂、紫杉醇、吉西他滨、加利车霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、铂类、紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲酰四氢叶酸、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春花生物碱(例如,长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)、氮芥(mustine)、酪氨酸激酶抑制剂、放射治疗、性激素拮抗剂、选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1的拮抗剂、白细胞介素(例如,IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、毒素缀合的单克隆抗体、肿瘤抗原特异性的单克隆抗体、 帕妥珠单抗、抗CD20抗体、 奥瑞珠单抗、奥法木单抗、DXL625、 或其任意组合。可将来自植物和细菌的毒性酶例如蓖麻毒蛋白、白喉毒
素和假单胞菌属(Pseudomonas)毒素缀合至人源化抗体或其结合片段,以产生细胞-类型特异性杀伤试剂。Youle,等人(1980)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77:5483;Gilliland,等人(1980)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77:4539;Krolick,等人(1980)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77:5419。其它细胞毒性试剂包括细胞毒性核糖核酸酶。参见美国专利No.6,653,104。
[0588] 可将本文所描述的VISTA蛋白偶联至放射性核素,其发射α或β粒子(例如,放射免疫缀合物)。这样的放射性同位素包括但不限于β-发射体例如磷-32(32P)、钪 -47(47Sc)、铜 -67(67Cu)、镓 -67(67Ga)、钇 -88(88Y)、钇 -90(90Y)、碘 -125(125I)、碘-131(131I)、钐-153(153Sm)、镥-177(177Lu)、铼-186(186Re)、铼-188(188Re)、以及α发射体例如砹-211(211At)、铅-212(212Pb)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)或锕-225(225Ac)。
[0589] 用于将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物缀合至标记的方法在本领域中是已知的,例如由Hunter,等人(1962)Nature 144:945;David,等人(1974)Biochemistry
13:1014;Pain,等 人(1981)J.Immunol.Meth.40:219;和 Nygren(1982)Histochem and Cytochem,30:407描述的那些方法。
[0590] 基底
[0591] 可将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物附接至基底上。许多本领域中已知的基底(例如,固相载体)适合于与本文中描述的VISTA和VISTA缀合物一起使用。基底可
被修饰来包含通道或其它配置。参见Fung(2004)[编辑]Protein Arrays:Methods and Protocols Humana Press和Kambhampati(2004)[编辑]Protein Microarray Technology John Wiley&Sons。
[0592] 基底材料包括但不限于:丙烯酸树脂、琼脂糖、硅玻璃、碳(例如,碳纳米纤维片材或丸粒)、醋酸纤维素、纤维素、陶瓷、凝胶、玻璃(例如,无机的、可控孔度的、改性的、碱石灰的或官能化的玻璃)、胶乳、磁珠、膜、金属、类金属、硝化纤维素、 光纤束、有机聚合物、纸、塑料、聚丙烯酰吗啉(polyacryloylmorpholide)、聚(4-甲基丁烯)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸乙烯酯)、聚丙烯酰胺、聚丁烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚乙二醇对苯二甲酸酯、多聚甲醛、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚乙烯吡咯烷酮、人造丝、树脂、橡胶半导体材料、 二氧化硅、硅、苯乙烯共聚物、 和多种其它聚
合物。
[0593] 基底不必是平的,其可包括任何类型的形状,包括球形(例如,珠粒)或圆柱形(例如,纤维)。可将附接至固体载体的材料附接于固体载体的任何部分(例如,可附接至多孔固体载体材料的内部部分)。
[0594] 基底主体可以是如下形式:珠、盒子、柱、筒、盘、皿(例如,玻璃皿、皮氏皿)、纤维、薄膜过滤器、微量滴定板(例如,96孔微量滴定板)、多叶棒、网、丸、片、环、棒、辊、片材、载片、条、盘、管或管形瓶。所述基底可以是单个离散主体(例如,单管、单珠)、任何数量的多个基底主体(例如,一架10个管、几个珠粒)或其组合(例如,托盘包括多个微量滴定板,填充有珠粒的柱子,载有珠粒的微量滴定板)。
[0595] 当本文中描述的VISTA和VISTA缀合物通过非随机化学或物理相互作用与固体基底缔合时,其被“附接”至基底。附接可通过共价键。然而,附接不必是共价的或永久性的。可通过“间隔基分子”或“连接基团”将材料附接至基底。这样的间隔基分子是具有附接至生物材料的第一部分和附接至基底的第二部分的分子。因此,当附接至基底时,间隔基分子分离基底与生物材料,但附接至两者。将生物材料(例如,标记)附接至基底的方法在本领域是公知的,并且包括但不限于化学偶联。
[0596] 可使用支持和含有用于固相合成反应的固相的板,如微量滴定板。微量滴定板可以容纳被用作固相的珠粒。本文中的“颗粒”或“微粒”或“纳米颗粒”或“珠粒”或“微珠”或“微球体”是指具有各种形状或尺寸的任一种的微粒物质。形状可以是大致球形,但不必是球形,例如为圆柱形或多面体。如由本领域技术人员所认识到的,取决于它们的用途,颗粒可包括各种各样的材料,包括但不限于交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物,包括苯乙烯聚合物例如聚苯乙烯和甲基苯乙烯以及其它苯乙烯共聚合物、塑料、玻璃、陶瓷、丙烯酸类聚合物、磁性响应材料、胶体、梭立亚索(thoriasol)、碳石墨、二氧化、尼龙、乳胶和 参见,例如,“Microsphere Detection Guide”from BangsLaboratories,Fishers,IN。
[0597] 可将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物附接于本文所述的任何形式的基底(例如,珠粒、盒、柱、筒、盘、皿(例如、玻璃皿、皮氏皿)、纤维、薄膜、过滤器、微量滴定板(例如,96孔微量滴定板)、多叶棒、网、丸、片、环、棒、辊、片材、载片、条、盘、管或管形瓶)。具体地,颗粒或珠粒可以是凝胶材料的组分或可以是单独的组件例如由多种合成塑料(例如,聚苯乙烯)制造的胶乳珠。可将标记(例如,链霉抗生物素蛋白)结合至基底(例如,珠粒)。
[0598] 药物组合物
[0599] “药物组合物”是指适合施用于哺乳动物的化学或生物组合物。这样的组合物可被专门配制来用于通过许多途径的一个或多个途径施用,包括但不限于经颊、表皮、硬膜外、吸入、动脉内、心脏内、脑室内、皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、肠胃外、经直肠(通过灌肠剂或栓剂)、皮下、真皮下、舌下、经皮和经粘膜。此外,施用可以通过注射、粉末、液体、凝胶、滴剂或其它施用装置来进行。
[0600] “药用赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”是在其中配制活性治疗剂的载体,通常地为液体。在本发明的一个实施方案中,活性治疗剂是本文所描述的人源化抗体或其一个或多个片段。赋形剂通常不为制剂提供任何药理活性,尽管它可提供化学和/或生物稳定性,和释放特性。示例性制剂可见于例如Grennaro(2005)[编辑]Remington:The Science and Practice of Pharmacy[第21版]中。
[0601] 药物组合物在制造和贮存的条件下通常必须是无菌和稳定的。本发明考虑了药物组合物以冻干形式存在。可将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。本发明还设想在药物组合物中包含稳定剂。
[0602] 可将本文中描述的多肽、缀合物和抗体配制成各种剂型的药物组合物。为了制备本发明的药物组合物,按照药物制剂领域内的普通技术人员公知的技术最终将至
少一种VISTA和VISTA缀合物作为活性成分与适当的载体和添加剂紧密混合。参见
Grennaro(2005)[编辑]Remington:The Science and Practice of Pharmacy[第21版]。
例如,可将本文描述的抗体配制在磷酸盐缓冲溶液pH 7.2中,并作为5.0mg/mL清澈的无色液体溶液提供。
[0603] 类似地,用于液体制剂的组合物包括溶液、乳液、分散体、悬浮液、糖浆和酏剂,合适的载体和添加剂包括但不限于水、醇类、油类、二醇类、防腐剂调味剂着色剂以及悬浮剂。用于胃肠外施用的典型制剂包含活性成分与载体例如无菌水或肠胃外可接受的油,包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油,还可包含用于帮助溶解或保存的其它添加剂。在溶液的情况下,它可以被冻干成粉剂,然后在即将使用前重构。对于分散体和悬浮液,适当的载体和添加剂包括含水树胶、纤维素、硅酸盐或油。
[0604] 对于每一个引述的实施方案中,可以通过各种剂型施用VISTA和VISTA缀合物。本领域普通技术人员已知的任何生物学上可接受的剂型及其组合是可预期的。此类剂型包括但不限于可重构的粉末、酏剂、液体、溶液、悬浮液、乳剂、粉末、颗粒、粒子、微粒、可分散颗粒剂、扁囊剂、吸入剂、气溶胶吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入物、贮库植入物、注射剂(包括皮下、肌内、静脉内和皮内),输注及其组合。
[0605] 在许多情况下,优选地在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇例如甘露醇,山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。此外,可将本文中所述的化合物在延时释放制剂中例如在包含缓释聚合物的组合物进行配制。可用保护化合物免于快速释放的载体例如受控释放制剂(包括植入物和微囊化递送系统)制备VISTA和VISTA缀合物。可使用生物可降解的生物相容性聚合物例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸的共聚物(PLG)。用于制备这样的制剂的许多方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。
[0606] 还可将补充活性化合物掺入组合物。
[0607] 例如,组合物还可包含所需的抗原(例如,肿瘤抗原)或另一种免疫调节化合物例如Toll样受体激动剂、1型干扰素例如α和β干扰素以及CD40激动剂例如激动性CD40抗体和抗体片段,优选地为抗人CD40激动性抗体和抗体片段或其它免疫增强剂或抑制剂例如PD-L1、PD-L2、CTLA4融合蛋白及其特异性抗体。
[0608] 包含VSTA的组合物还可包含抗原或其它免疫激动剂。抗原可按与组合的其它组分组合时能有效产生对抗原的免疫应答的量施用。例如,抗原可按约100μg/kg至约
100mg/kg的量施用。在一些实施方案中,抗原可按约10μg/kg至约10mg/kg的量施用。在一些实施方案中,抗原可按约1mg/kg至约5mg/kg的量施用。然而,构成产生免疫应答有效量的抗原的特定量在一定程度上取决于例如以下的某些因素,例如所施用的特定抗原;所施用的特定激动剂及其量;所施用的特定激动剂及其量;免疫系统状态;施用激动剂和抗原的方法及顺序;制剂施用给的物种;以及所需的治疗结果。因此,一般而言,阐述构成抗原有效量的量是不实际的。然而,本领域普通技术人员可通过考虑此类因素来容易地确定合适的量。
[0609] 抗原可以是能够提高Th1免疫反应的任何物质,所述反应可以包括例如CD8+T细胞反应、NK T细胞反应、γ/δT细胞反应或Th1抗体反应中的一种或多种。合适的抗原包括但不限于肽、多肽、脂质、糖脂、多糖、碳水化合物、多核苷酸、朊病毒、活或灭活细菌、病毒或真菌,以及细菌、病毒、真菌、原生动物、肿瘤源性或生物体源性抗原、毒素或类毒素。
[0610] 此外,某些目前实验性的不提高强免疫反应的抗原,特别是例如重组蛋白、糖蛋白和肽的物质,可结合本发明的佐剂组合来使用。示例性实验性亚单位抗原包括与病毒性疾病相关的那些亚单位抗原,例如腺病毒、AIDS、水痘、巨细胞病毒、登革热、猫白血病、禽类瘟疫、甲肝、乙肝、HSV-1、HSV-2、猪瘟、甲型流感、乙型流感、日本脑炎、麻疹、副流感病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、疣和黄热病。
[0611] 抗原可以是癌抗原或肿瘤抗原。术语癌抗原和肿瘤抗原可互换使用并指由癌细胞差异表达的抗原。因此,癌抗原可用于差异靶向针对癌细胞的免疫反应。癌抗原可因此潜在地刺激肿瘤特异性免疫反应。某些癌抗原由正常细胞编码,但不一定由正常细胞表达。其中一些这样的抗原可表征为在正常细胞中通常沉默(即,不表达)、只在分化的某些阶段表达的那些以及暂时表达的那些(例如,胚胎和胎儿抗原)。其它癌抗原可通过突变细胞基因编码,例如例如癌基因(例如,活化的ras癌基因)、抑制基因(例如,突变体p53)或通过内部缺失或染色体易位而产生的融合蛋白。另外的其它癌抗原可通过病毒基因编码,例如RNA和DNA肿瘤病毒携带的那些基因。
[0612] 肿瘤抗原的实例包括:MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPUV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素b、结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其抗原表位C AP-1和CAP-2、etv6、am11、前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原MAGE家族(例如,MAGE-A1、MAGE-A2、M AGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-X p2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原GAGE家族(例如,GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、G AGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-甲胎蛋白、ε-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn、gp10.sup.Pmel117、PR AME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉癌蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节甘脂、病毒产物例如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原Smad家族、Imp-1、PI A、EBV编码核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(H OM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7以及c-erbB-2。
[0613] 癌或肿瘤以及与此类肿瘤相关(但不排他)的特异性肿瘤抗原包括:急性淋巴母细胞性白血病(etv6、aml1、亲环素b)、B细胞淋巴瘤(Ig独特型)、胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结直肠癌(结直肠相关抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环素b)、胃癌(H ER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴细胞性白血病(亲环素b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HE R2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物,例如人乳头状瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和T细胞白血病(HTL V-1表位)。
[0614] 本领域普通技术人员能够通过常规实验,例如通过本文中的公开内容和如下参考资料中的教导指导确定施用的有效剂量和频率:Goodman,等人(2011)Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics[ 第 12 版 ];Howland,等 人 (2005)Lippincott’s Illustrated Reviews:Pharmacology[ 第 2 版 ]; 和 Golan,(2008)Principles of Pharmacology:The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy[第2版]。也参见,Grennaro(2005)[编辑]Remington:The Science and Practice of Pharmacy[第
21版]。
[0615] 施用途径
[0616] 可以以以下途径的任一途径施用本文中所述的组合物:经颊、经表皮、硬膜外、输注、吸入、动脉内、心脏内、脑室内、皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、胃肠外、肺部、经直肠(通过灌肠剂或栓剂)、皮下、真皮下、舌下、经皮和经粘膜。优选施用途径是静脉内注射或输注。施用可以是局部的,其中直接靠近疾病例如肿瘤的部位、在该部位所在的位置、该部位附近、在该部位上、在该部位周围或在该部位邻近施用组合物,或是全身性的,其中给患者施用组合物,组合物被广泛地传递至全身,从而到达疾病部位。局部施用(例如,注射)可通过对细胞、组织、器官和/或器官系统的施用(所述系统包括疾病和/或受该疾病影响,和/或其中疾病的体征和/或症状是活跃的或有可能发生(例如,肿瘤部位))来实现。施用可以是局部的(具有局部效果),可将组合物直接施用于需要其作用的部位(例如,肿瘤部位)。
[0617] 对于每一个所列举的实施方案中,化合物可以通过多种本领域已知的剂型施用。本领域普通技术人员已知的任何生物学上可接受的剂型以及其组合是预期的。此类剂型包括但不限于可咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、酏剂、液体、溶液、悬浮液、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片、锭剂、可咀嚼锭剂、珠粒、粉剂、树胶、颗粒、粒子、微粒、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏、局部剂、吸入剂、气溶胶吸入剂、贴剂、粒子吸入剂、植入物、储库植入物、可摄入剂(ingestibles)、可注射剂(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)、输注及其组合。
[0618] 可包含在混合物中的其它化合物例如医学上的惰性成分(例如,固体和液体稀释剂),例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、淀粉或磷酸钙(对于片剂或胶囊剂),橄榄油或油酸乙酯(对于软胶囊剂)和水或植物油(对于混悬剂或乳剂);润滑剂例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇;胶凝剂例如胶态粘土;增稠剂例如黄蓍胶或藻酸钠,结合剂例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮;崩解剂例如淀粉、藻酸、藻酸盐或淀粉羟乙酸钠;泡腾混合物;染料;甜味剂;润湿剂,例如卵磷脂、聚山梨醇酯或十二烷基硫酸盐;与其它治疗上可接受的辅助成分,如保湿剂,防腐剂,缓冲剂和抗氧化剂,这些成分是已知的用于这样的制剂的添加剂。
[0619] 用于口服施用的液体分散体可以是糖浆剂、乳剂、溶液或悬浮液。糖浆可包含例如蔗糖或与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇一起的蔗糖作为载体。悬浮液和乳剂可以包含载体,例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。
[0620] 在另外的实施方案中,本发明提供包含一个或多个容器的试剂盒,所述容器包含有药物剂量单位,所述药物剂量单位含有有效量的一种或多种本发明的抗体及其片段。试剂盒包括说明书、指导、标签、市场营销信息、警告或信息小册子。
[0621] 剂量
[0622] 根据本发明的任何实施方案的治疗性组合物中的VISTA或VISTA缀合物的量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别、体重、患者病史、危险因素、对疾病的易感性、施用途径、预先存在的治疗方案(例如,与其它药剂的可能相互作用)以及体重而变化。可调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如,可施用单次推注,可在一段时间内施用几个分份剂量,或可根据治疗情况的紧急程度所指示的,以按比例减少或增加剂量。
[0623] 特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和使剂量均匀。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上离散的单位;每一个单位含有预定量的抗体及其片段,该预定量经计算产生与所需的药用载体相关的所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的说明由如下因素规定和直接取决于所述因素:抗体及其片段的独特的特点,以及待实现的特定治疗效果,配制这样的抗体及其片段的领域中固有的限制,个体对治疗的敏感性。在治疗性用途中,对于本发明的抗体及其片段或其适当的药物组合物对于其是有用的哺乳动物(例如,人)的治疗,可以以有效量施用本发明的抗体及其片段。适合于本发明的剂量也可以是一种组合物,药物组合物或本文所述的任何其它组合物。
[0624] 剂量可以以单份剂量、双份剂量、三份剂量、四份剂量和/或五份组剂量施用。可单独地、同时地和依次地施用剂量。
[0625] 剂型可以是本领域中普通技术人员已知的任何释放形式。本发明的组合物可被配制来提供活性成分的即时释放或持续或受控释放。在持续释放或受控释放制剂中,活性成分的释放可以这样的速率释放,以便在延长的时间(例如,4至24小时)期间将血液水平维持在治疗范围内但低于毒性水平。优选剂型包括即时释放、延长释放、脉冲释放、可变释放、受控释放、定时释放、持续释放、延迟释放、长效及其组合,并且是本领域是已知的。
[0626] 如本文所定义,蛋白或多肽的治疗有效量(即,有效剂量)在约0.001至30mg/kg体重,优选约0.01至25mg/kg体重,更优选约0.1至20mg/kg体重,甚至更优选约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重的范围内。本领域普通技术人员将认识到,某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量,包括但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、受试者的整体健康情况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外,用治疗有效量的蛋白、多肽或抗体治疗受试者可包括单次治疗,或优选地可包括一系列治疗。
[0627] 在优选实例中,将受试者用约0.1至20mg/kg体重范围内的抗体、蛋白或多肽治疗,每周一次,持续约1至10周,优选地2至8周,更优选地约3至7周,甚至更优选地约4、5或6周。还将认识到,用于治疗的抗体、蛋白或多肽的有效剂量可随着特定治疗的过程而提高或降低。剂量变化可以产生,并通过本文所述的诊断测定的结果而变得明显。
[0628] 应理解,可使用本领域已知的标准药理学模型来监测组合物的药理活性。此外,应理解,可将包含VISTA和VISTA缀合物、抗体或其抗原结合片段的组合物掺入或封装在合适的聚合物基质或膜中以用于位点特异性递送,或可用能够实现位点特异性递送的特异性靶向试剂对其进行官能化。这些技术以及其他药物递送技术在本领域是公知的。用于特定情况的最佳剂量的确定在本领域普通技术人员的能力之内。参见,例如,Grennaro(2005)[编辑]Remington:The Science and Practice of Pharmacy[第21版]。
[0629] 治疗方法
[0630] 可将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病,抑制+ + + +CD4T细胞增殖,抑制CD8T细胞的增殖,抑制CD4T细胞的细胞因子产生和抑制CD8T细胞
的细胞因子产生的方法,包括向有些需要的受试者施用有效量的VISTA和VISTA缀合物。
此外,可将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物用于制造药物,所述药物用于治疗自身免疫+ + +
疾病,抑制CD4T细胞增殖,抑制CD8T细胞的增殖,抑制CD4T细胞的细胞因子产生和抑制+
CD8T细胞的细胞因子产生,并且包含有效量的本文中描述的VISTA和VISTA缀合物。可
将本文中描述的VISTA和VISTA缀合物与药学上可接受的载体混合来制备组合物,所述组+ + +
合物用于治疗自身免疫疾病,抑制CD4T细胞增殖,抑制CD8T细胞增殖,抑制CD4T细胞的+
细胞因子产生,并抑制的CD8T的细胞因子产生,并且包含有效量的本文中描述的VISTA或VISTA缀合物。
[0631] 本文中的治疗方法包括施用PD-L3或VISTA,其为结构不同的Ig超家族抑制性配体,其胞外域具有与B7家族配体PD-L1的同源性。该分子在本文中可互换地称为PD-L3或VISTA或T细胞活化的V域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)。VISTA主要在造血室内表达,并在骨髓APC和T细胞上受高度调节。VISTA抑制性途径的治疗性干预提出了一种调节T细胞介导的免疫以治疗多种癌症的新方法。VISTA多肽、其缀合物、核酸、配体和调节剂可用于调节免疫,特别地T细胞免疫,以治疗自身免疫疾病和炎性疾病。
[0632] 使用VISTA、VISTA-缀合物(例如,VISTA-Ig)和抗VISTA抗体治疗癌症,包括但不限于膀胱癌、卵巢癌和黑素瘤、自身免疫疾病和炎性疾病。此外,本发明特别涉及VISTA蛋白的用途,特别是多聚体VISTA蛋白以及表达其的病毒载体(例如,腺病毒)的用途,以治疗其中在治疗学上需要免疫抑制的疾患,例如过敏、自身免疫疾病和炎性疾患。
[0633] 患者可表达自身免疫疾病的症状或患者无症状。可将本文中描述的方法在体外或离体地用于细胞,例如人细胞。或者,可作为体内(例如,治疗)方案的部分对存在于受试者中的细胞进行所述方法。
[0634] 本发明提供治疗受试者的预防性和诊断性方法,所述受试者存在(或疑似有)特征在于VISTA(PD-L3)蛋白的产生不足或过量或者产生的VISTA(PD-L3)蛋白形式
与VISTA(PD-L3)野生型相比具有降低或异常的活性的病症的风险。此外,本发明的抗
VISTA(PD-L3)抗体可用于检测和分离VISTA(PD-L3)蛋白,调节VISTA(PD-L3)蛋白的生物利用率以及调节VISTA(PD-L3)活性,例如通过调节VISTA(PD-L3)与其反受体之间的相互作用。
[0635] 本发明的用途和方法
[0636] 本文中所述的VISTA分子,如VISTA核酸分子、多肽、多肽同系物和抗体及抗体片段可用于以下方法中的一种或多种:a)筛选测定;b)预测医学(例如,诊断测定、预后测定和临床试验监测);以及c)治疗方法(例如,治疗和预防,如通过上调或下调免疫反应)。如本文中所述,本发明的VISTA(PD-L3)多肽具有以下活性中的一种或多种:1)结合至其天然结合伴侣和/或调节其天然结合伴侣的活性,2)调节细胞内或细胞间信号传导,3)调节T淋巴细胞的活化,4)调节生物体的免疫反应,如哺乳动物生物体,例如小鼠或人。本发明的分离的核酸分子可用于例如表达VISTA(PD-L3)多肽(例如,在基因疗法应用中通过宿主细胞中的重组表达载体)、检测VISTA(PD-L3)mRNA(例如,在生物样品中)或VISTA(PD-L3)基因中的遗传变化以及调节VISTA(PD-L3)活性,如下文进一步所述。VISTA(PD-L3)多肽可用于治疗特征在于VISTA(PD-L3)多肽的产生或VISTA(PD-L3)抑制剂的产生不足或过
量的病症或疾病。此外,VISTA(PD-L3)多肽可用于筛选天然存在的VISTA(PD-L3)结合
伴侣,筛选调节VISTA(PD-L3)活性的药物或化合物,以及治疗特征在于VISTA(PD-L3)多肽的产生或下述VISTA(PD-L3)多肽形式的产生不足或过量的病症或疾病,所述多肽形式与VISTA(PD-L3)野生型多肽相比具有降低的、异常的或不需要的活性(例如,免疫系统疾病例如重症联合免疫缺陷、多发性硬化、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、淋巴增生综合征、炎性肠病、过敏、哮喘、移植物抗宿主病和移植排斥;对感染性病原体例如细菌和病毒的免疫应答;以及免疫系统癌症例如淋巴瘤和白血病)。此外,本发明的抗VISTA(PD-L3)抗体可用于检测和分离VISTA(PD-L3)多肽,调节VISTA(PD-L3)多肽的生物利用率以及调节
VISTA(PD-L3)活性,例如通过调节VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣之间的相互作用。
[0637] 可基于在可溶性VISTA(PD-L3)蛋白(例如,VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白)存在的情况下,抗VISTA抗体增强VISTA(PD-L3)对VISTA(PD-L3)相关免疫功能的抑制作用的事实,选择用作治疗剂的抗VISTA(PD-L3)抗体。这是相当出人意料的,因为这些抗-VISTA抗体在体内的表现与预期它们在体外对免疫的作用相反(即,这些抗-VISTA单克隆抗体为免疫抑制性的)。
[0638] 本发明的一个重要方面涉及调节VISTA(PD-L3)表达或活性或与其天然结合伴侣的相互作用的方法。关于治疗,已证明VISTA(PD-L3)可抑制CD28共刺激、抑制免
疫细胞的TCR活化、抑制活化免疫细胞(CD4+和CD8+T细胞)的增殖、抑制T细胞产生
细胞因子(IL-2,γ干扰素)以及向免疫细胞传递抑制信号。因此,可调节T细胞上
VISTA(PD-L3)的活性和/或表达以及VISTA(PD-L3)与其结合伴侣之间的相互作用以调
节免疫应答。由于VISTA(PD-L3)结合至抑制性受体(T细胞上),因此上调VISTA(PD-L3)活性应导致免疫应答的下调,而下调VISTA(PD-L3)活性应导致免疫应答的上调。在实
施方案中,VISTA(PD-L3)结合至抑制性受体。如之前所述,由申请人产生的在体外(在VISTA(PD-L3)-Ig存在的情况下)增强VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白抑制活性(即,这些抗体增强VISTA(PD-L3)相关活性的抑制,例如VISTA(PD-L3)对细胞因子产生、T细胞增殖、分化或活化以及之前所述的其它功能的影响)的VISTA(PD-L3)抗体与体内预计情况表现相反,即,已发现这些抗体在体内为免疫抑制性的。
[0639] 本发明的调节性方法涉及将细胞与VISTA(PD-L3)多肽或调节与细胞相关的VISTA(PD-L3)多肽活性中的一种或多种的试剂相接触,例如,调节VISTA(PD-L3)的表达或活性和/或调节VISTA(PD-L3)与其天然结合伴侣间的相互作用的试剂。调节VISTA(PD-L3)多肽活性的试剂可以是如本文所述的试剂,例如核酸或多肽、VISTA(PD-L3)多肽的天然存在的结合伴侣、VISTA(PD-L3)抗体、VISTA(PD-L3)激动剂或拮抗剂、VISTA(PD-L3)激动剂或拮抗剂的拟肽、VISTA(PD-L3)拟肽、或其它小分子。VISTA(PD-L3)的可溶形式还可用于干扰VISTA(PD-L3)与其任何天然结合伴侣或配体任一者的结合。
[0640] 调节VISTA(PD-L3)表达的试剂为例如反义核酸分子、三链寡核苷酸、核酶或表达VISTA(PD-L3)多肽的重组载体。例如,可以合成与VISTA(PD-L3)多肽翻译起始位点周围的区域互补的寡核苷酸。可将一种或多种反义寡核苷酸添加至细胞培养基中,通常为200μg/ml,或施用给患者以防止VISTA(PD-L3)多肽的合成。反义寡核苷酸被细胞摄取并与VISTA(PD-L3)mRNA杂交以防止翻译。或者,可以使用结合双链DNA以形成三链构建体从而防止DNA解旋和转录的寡核苷酸。作为任一种情况的结果,VISTA(PD-L3)多肽的合成均被阻断。当调节VISTA(PD-L3)表达时,优选地,这种调节通过敲除VISTA(PD-L3)基因之外的方法进行。
[0641] 基于它们控制细胞中VISTA(PD-L3)的量这一事实而调节表达的试剂也调节细胞中VISTA(PD-L3)活性的总量。在一个实施方案中,调节VISTA(PD-L3)的试剂刺激一种或多种VISTA(PD-L3)活性。此类刺激剂的实例包括活性VISTA(PD-L3)多肽以及已被引入细胞中的编码VISTA(PD-L3)的核酸分子。在另一个实施方案中,该试剂抑制一种或多种VISTA(PD-L3)活性。此类抑制剂的实例包括反义VISTA(PD-L3)核酸分子、抗VISTA(PD-L3)抗体、VISTA(PD-L3)抑制剂以及在受试者筛选测定中鉴定的化合物。在另外的实施方案中,抑制剂为抗VISTA(PD-L3)抗体与抗PD-L1或抗PD-L2抗体的组合。这些调节性方法
可在体外进行(例如,通过将细胞与试剂接触),或者可选地,通过将试剂与细胞接触而在体内进行(例如,通过将试剂施用给受试者)。这样,本发明提供治疗患有将会受益于VISTA(PD-L3)多肽上调或下调的病症或疾病的个体的方法,例如,特征在于不想要的、不足的或异常的VISTA(PD-L3)多肽或核酸分子表达或活性的疾病。在一个实施方案中,该方法涉及施用一种试剂(例如,通过本文所述的筛选测定鉴定的试剂)或调节(例如,上调或下调)VISTA(PD-L3)表达或活性的试剂的组合。在另一个实施方案中,该方法涉及施用VISTA(PD-L3)多肽或核酸分子作为疗法以补偿降低的、异常的或不想要的VISTA(PD-L3)表达或活性。
[0642] 本发明提供预防受试者的与异常的或不需要的VISTA(PD-L3)表达或活性相关的疾病或病症的方法,方式是向受试者施用调节VISTA(PD-L3)表达或至少一种
VISTA(PD-L3)活性的VISTA(PD-L3)多肽或试剂。存在由异常的或不需要的VISTA(PD-L3)表达或活性所致的或促成的疾病或病症风险的受试者可通过例如如本文所述的诊断或预后测定的任何一种或组合来鉴定。施用预防剂可在VISTA(PD-L3)异常所特有的症状显现前进行,以便疾病或病症得到预防或可选地,延迟其进展。取决于VISTA(PD-L3)异常的类型,例如,VISTA(PD-L3)多肽、VISTA(PD-L3)激动剂或VISTA(PD-L3)拮抗剂(例如,抗VISTA(PD-L3)抗体)可用于治疗受试者。合适的试剂可基于本文所述的筛选测定来确定。
[0643] 可将VISTA和VISTA缀合物与另外的如下物质混合:化学治疗剂、细胞毒性剂、抗体(例如,抗PD-L1、PD-L2或CTLA-4抗体)、淋巴因子或造血生长因子。还可将VISTA和VISTA缀合物与另一种抗体、淋巴因子、细胞毒性剂(例如,抑制DNA、RNA或蛋白质合成的212 131 188 90
部分、放射性核素或抑制核糖体的蛋白质,例如,Bi、 I、Re、Y、长春地辛、氨甲喋呤、阿霉素、顺铂、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌属外毒素A、蓖麻毒素、白喉毒素、蓖麻毒素A链或细胞毒性磷脂酶)、免疫抑制剂(例如,环孢霉素、来氟米特、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤、更生霉素、他克莫司或西罗莫司)或造血生长因子组合施用。可用如下标志物来标记VISTA和VISTA缀合物:化学发光标记、顺磁标记(例如,、锰、铂、氧、镧、镥、钪、钇或镓)、MRI造影剂、荧光标记、生物发光标记或放射性标记。在本文中描述的方法中,可将第二试剂与抗体同时或依次施用。例如,第二试剂可以是下调免疫反应的试剂(例如,PD-L1、PD-L2或CTLA-4融合蛋白或其特异性抗体)。
[0644] 在一个实施方案中,治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法包括给受试者施用VISTA和VISTA缀合物,所述受试者可接受第二治疗。第二疗法的实例包括化疗、放射疗法、免疫疗法、光疗、冷冻疗法、毒素疗法、激素疗法或外科手术。因此,本发明考虑使用与标准抗癌症疗法结合的方法和组合物。待治疗的患者可以是任何年龄。本领域普通技术人员将认清与VISTA或VISTA缀合物结合使用的其它抗癌疗法的存在和发展。
[0645] 剂量的确定在本领域普通技术人员的能力之内。可在1周或更短的时间中,通常1至3天的一段时间中施用VISTA和VISTA缀合物用于急性治疗,或可将其在数月或数年中施用用于慢性治疗。一般而言,治疗有效量的VISTA和VISTA缀合物是足以产生自身免疫疾病的显著临床变化的量。
[0646] 即使在没有共刺激受体(例如,CD28或ICOS)存在于免疫细胞上,通过抑制性受体转导的抑制性信号亦可发生,因此这不仅仅是抑制性受体与共刺激受体之间对共刺激分子的结合的竞争的作用(Fallarino,等人(1998)J.Exp.Med.188:205)。抑制性信号至免疫细胞的传递可导致免疫细胞的无反应、无能或程序化细胞死亡。优选地,抑制性信号的传递通过不涉及细胞凋亡的机制来进行。
[0647] 自身免疫疾病
[0648] 本文中描述的VISTA多肽,多聚体VISTA多肽,VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)和抗VISTA抗体可用于用于治疗自身免疫疾病的组合物、用途和方法。
[0649] T细胞活化的含 V域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)为与免疫球蛋白(Ig)超家族相关的家族的成员,其对免疫系统产生深远影响。Ig超家族由许多关键的免疫调节剂例如B7家族配体和受体组成。得到最清楚表征的共刺激性配体为B7.1和B7.2,它们属于Ig超家族并且在专职APC上表达,其受体为CD28和CTLA-4。
[0650] B7家族配体已扩展到包括共刺激配体例如B7-H2(ICOS配体)和B7-H3以及共抑制性配体例如B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1或B7x)和B7-H6。Brandt,等人(2009)J Exp Med 206,1495–1503;Greenwald,等人(2005)Annu Rev Immunol 23:515–
548。因此,已鉴定了另外的CD28家族受体。ICOS在活化的T细胞上表达,并结合至B7-H2。
ICOS为正共调节因子,对T-细胞活化、分化和功能起着重要作用。Dong,等人(2001)Nature –/–
409,97–101。在另一方面,程序性死亡1(PD-1)负调节T细胞反应。PD-1 小鼠发展了
狼疮样自身免疫疾病或扩张型心肌病。Nishimura,等人(2001)Science291:319–322。最近,CD80被鉴定为PD-L1的第二受体,其将抑制信号传导至T细胞中。Butte等人(2007)Immunity 27,111–122。两种抑制性B7家族配体PD-L1和PD-L2具有不同的表达模式。
PD-L2在DC和巨噬细胞上诱导性表达,而PD-L1在造血细胞和非造血细胞类型上均泛表达。
–/– –/–
与PD-1受体的免疫抑制作用一致,使用PD-L1 和PD-L2 小鼠的研究已表明,两种配
体在抑制T细胞增殖和细胞因子产生方面具有重叠作用。此时,VISTA似乎在造血细胞中选择性表达,这使其与PD-L1在分布上有区别,并且可能在负调节自身免疫疾病的发展中起着关键作用。
[0651] 一种新型和结构不同的Ig超家族抑制性配体,其胞外域具有与B7家族配体PD-L1最高的同源性。虽然其在系统发育上最近亲为PD-L1,但由于其适度的相似性水平(20%)而未赋予其PD-L的名称。其具有除可能的蛋白激酶C结合位点外的无明显信号转导基序的93aa胞质结构域。参见图4。基于下列事实VISTA是负调节配体和是基于以下事实:
[0652] 可溶性VISTA-Ig融合蛋白在体外抑制CD4+和CD8+T细胞增殖和细胞因子产生。-/-
对于PD-1 T细胞观察到抑制,表明PD-1不是VISTA受体。
[0653] VISTA对APC的过表达在体外抑制CD4+和CD8+T细胞增殖。
[0654] 肿瘤细胞上VISTA的过表达损害接种了肿瘤的宿主的保护性抗肿瘤免疫。
[0655] VISTA-/-小鼠发展了炎症表型,从而确定VISTA具有免疫抑制功能。VISTA-/-DC比WT DC更加能刺激T细胞增殖。
[0656] 抗VISTA单克隆抗体(13F3)通过VISTA+APC在体外增强T细胞活化来阻断VISTA诱导的T细胞反应的抑制。
[0657] 抗VISTA单克隆抗体加重EAE并且在体内增加了致脑炎Th17s的频率。
[0658] 抗VISTA单克隆抗体在多个(6)鼠肿瘤模型中诱导肿瘤消退,在这些模型中VISTA+在骨髓来源的抑制细胞(MDSC)上的表达极高,表明VISTAMDSC抑制肿瘤特异性免疫。
[0659] 可将本文中描述的VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)、由核酸序列SEQ ID NO:38–67的任一个组成的siRNA分子和抗VISTA抗体用于用以治疗自身免疫疾病或病症的组合物、用途和方法中。自身免疫疾病或病症的实例包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风关节炎、急性坏死性出血性白质脑炎、急性或慢性鼻窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其它中枢神经系统炎性病症)、急性严重炎症、阿狄森氏病、肾上腺炎、成年型糖尿病(II型糖尿病)、成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、丙种球蛋白缺乏血症、粒细胞缺乏症、血管炎病,包括血管炎(包括大血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)关节炎)、过敏性疾病、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、变应性肉芽肿血管炎、过敏性超敏反应紊乱、过敏性神经炎、过敏性反应、斑秃、全秃、Alport综合征、肺泡炎),例如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化症(ALS;葛雷克氏症)、嗜酸性粒细胞相关疾病,例如,嗜酸性细胞增多症、过敏性症、强直性脊柱炎、脉管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、阿弗他口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性疾病、关节炎(例如,类风湿性关节炎例如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎)、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、蛔虫病、曲霉肿(或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿)、曲霉病、无精子形成、哮喘(例如,支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘)、共济失调毛细血管扩张症、共济失调硬化症、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性血管性水肿、自身免疫再生障碍性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自身免疫疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、与胶原性疾病相关的自身免疫紊乱、自身免疫性自主神经机能异常、自身免疫性耳部疾病,(例如,自身免疫性内耳病(AGED))、自身免疫性内分泌障碍性疾病(包括甲状腺炎)例如自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肠病综合征、自身免疫性腺衰竭、自身免疫性听力损失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性血液病、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病、自身免疫多腺体综合征I型、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫介导的胃肠疾病、神经元轴突神经病、巴娄病、白塞氏病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、良性淋巴细胞性脉管炎、伯格氏病(IgA肾病)、养鸟人肺、失明、伯克氏病、闭塞性细支气管炎(非移植型)对NSIP、支气管炎、支气管肺曲霉病、布鲁顿综合征、大疱性类疱疮、卡普兰综合征、心肌病、心血管缺血、Castleman综合征、脂泻病、口炎性腹泻(麸质性肠病)、小脑变性、脑缺血、以及伴随血管化的疾病、查加斯病、离子通道病,(例如,癫痫)、CNS的离子通道病、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、一种自身免疫性血液疾病、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性过敏性肺炎、慢性炎性关节炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性顽固性炎症、慢性皮肤粘膜念珠菌病、慢性神经病变,(例如,IgM多发性神经病或IgM介导的神经病变)、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺部炎性疾病、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、丘-施综合征、疤痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、CNS炎性疾病、CNS血管炎、乳糜泻、耳蜗前庭综合征、冷凝集素疾病、息肉状结肠炎、结肠炎例如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症、先天性心脏传导阻滞、先天性风疹感染、库氏阳性贫血、冠状动脉疾病、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象)、克罗恩病、冷球蛋白血症、库欣综合征、睫状体炎,(例如,慢性睫状体炎)、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退化性关节炎、脱髓鞘性疾病,(例如,自身免疫性脱髓鞘性疾病)、脱髓鞘性神经病、登革热、疱疹样皮炎和疱疹样皮炎、皮炎(包括接触性皮炎)、皮肌炎、含急性炎症成分的皮肤病、德维克病(视神经脊髓炎)、糖尿病大动脉疾病、糖尿病性肾病、糖尿病视网膜病变、戴-布二氏贫血、弥漫性肺间质纤维化、扩张型心肌病、盘状狼疮、涉及白细胞渗出的疾病、心肌梗塞后综合征、杜普伊特伦挛缩、埃可病毒感染、湿疹(包括过敏性或异位性湿疹)、脑炎例如拉斯马森脑炎和边缘叶和/或脑干脑炎、脑脊髓炎,(例如,过敏性脑脊髓炎或变应性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE))、子宫内膜增生、心内膜炎、内分泌性眼病、子宫内膜异位症心内膜心肌纤维化、晶状体过敏性内眼球炎、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、嗜酸性筋膜炎、流行性角结膜炎、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、巩膜外层、表层巩膜炎、EB病毒感染、持久性隆起性红斑、多形性红斑、麻风结节性红斑、结节性红斑、胎儿成红细胞增多病、食管运动功能障碍、原发性混合性冷球蛋白血症、筛窦、埃文斯综合征、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏症、农民肺、风湿性发热、费尔提氏综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、丝虫病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、食物中毒、额窦、胃萎缩、巨细胞关节炎(颞动脉炎)、巨细胞肝炎、巨细胞性多肌痛、肾小球性肾炎、具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)例如慢性或急性肾小球肾炎(例如,原发性GN)、古德帕斯彻氏综合症、痛风性关节炎、粒细胞输注相关综合征、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病)、伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、滴状银屑病、血红素尿症发作、Hamman-Rich病、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本甲状腺炎、血色沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、溶血性贫血、甲型血友病、过敏性紫癜、妊娠疱疹、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低丙球蛋白血症、性腺机能减退、甲状旁腺功能减退症、特发性糖尿病性尿崩症、特发性面神经瘫痪、特发性甲状腺功能减退症、特发性IgA肾病、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、特发性肾病综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgE介导性疾病(例如,过敏性症和过敏性和异位性鼻炎)、IgG4-相关性硬化性疾病、区域性回肠炎、免疫复合物性肾炎、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、免疫介导型GN、免疫调节性脂蛋白类,包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、包涵体肌炎、感染性关节炎、因抗精子抗体而引起的不育、全部或部分葡萄膜的炎症、炎性肠道疾病(IBD)、炎性增生性皮肤疾病、炎性肌病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、肺间质纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎、少年关节炎、幼年型皮肌炎、青少年糖尿病、幼年型(I型)糖尿病,包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、幼年型类风湿性关节炎、川崎综合征、干燥性角结膜炎、锥虫病、兰伯特-伊顿综合征、利什曼病、麻风病、白细胞减少、白细胞粘附缺陷病、白细胞分裂性血管炎、白细胞减少症、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA皮肤病、线性IgA病(LAD)、吕弗勒氏综合征、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎、莱姆病、淋巴细胞性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自身免疫性不育、上颌窦、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN),包括I型和II型以及快速进展性GN、膜性GN(膜性肾病)、梅尼埃病、脑膜炎、显微镜性结肠炎、显微镜下多血管炎、偏头痛、微小病变性肾病、混合性结缔组织病(MCTD)、传染性单核细胞增多症、莫伦氏溃疡、姆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病变、多发性内分泌失调、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)例如视神经脊髓型MS、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉疾病、重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力、重症肌无力、心肌病、肌炎、发作性睡病、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎以及自身免疫性炎性肠道疾病、坏死性、皮肤性、或过敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病、肾病综合征、神经性疾病、视神经脊髓炎(德维克氏)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、中性粒细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多症、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼睛和眼眶炎性疾病、眼疤痕性类天疱疮、卵巢炎、交感神经性眼炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全血细胞减少症、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征,包括神经病学副肿瘤综合征,(例如,兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征)、寄生虫病例如利什曼虫病、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕-罗二氏综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳综合症、细小病毒感染、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮)、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(anemia perniciosa)、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺硬变、POEMS综合征、I、II和III型结节性多动脉炎、原发性慢性多发性关节炎、多软骨炎(例如,顽固性或复发性多软骨炎)、多内分泌自身免疫疾病、多内分泌衰竭、多腺体综合征(例如,自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征))、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、多发性神经病、急性多神经根炎、心脏切开后综合征、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性肝硬化、原发性甲状腺功能减退症、原发性特发性粘液水肿、原发性淋巴细胞增多,其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如,良性单克隆丙球蛋白病和意义未定的单克隆球蛋白病、MGUS)、原发性粘液性水肿、原发性进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、进行性系统性硬化症、增生性关节炎、银屑病如斑块型银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、肺泡蛋白沉积症、肺嗜酸性细胞浸润症、纯红细胞性贫血和再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、化脓性鼻窦炎或非化脓性鼻窦炎、脓疱型银屑病和指甲银屑病、肾盂炎、坏疽性脓皮病、德奎尔万氏甲状腺炎、雷诺现象、反应性关节炎、复发性流产、血压反应降低、反射性交感神经营养不良、顽固性口炎性腹泻、赖特病或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、不宁腿综合征、视网膜自身免疫疾病、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、风疹病毒感染、Sampter综合征、结节病、血吸虫病、施密特综合征、SCID和EB病毒相关疾病、巩膜、巩膜炎、指端硬皮病、硬皮病(包括,系统性硬皮病)、硬化性胆管炎、播散性硬化、硬化症例如系统性硬化症、感觉神经性听力损失、血清反应阴性的脊柱关节病、席汉氏综合征、舒尔曼综合征、矽肺、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫症、蝶窦炎、史帝文-强生综合征、僵人(或僵人)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤型红斑狼疮、突发性听力丧失、苏萨克综合征、西德纳姆舞蹈病、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮(例如,皮肤型SLE)、系统性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎,例如丘-施血管炎或综合征(CSS))、脊髓痨、高安动脉炎、毛细血管扩张症、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少(如例如由心肌梗死患者发展的),包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺毒症、组织损伤、托-亨二氏综合征、中毒性表皮坏死松解症、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横贯性脊髓炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹(例如,慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹,包括慢性自身免疫性荨麻疹)、葡萄膜炎(例如,前葡萄膜炎)、葡萄膜视网膜炎、心瓣炎、血管功能障碍、血管炎、椎关节炎、大疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(目前称为伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA))、Wiskott-Aldrich综合征和X连锁高IgM综合征。
[0660] 癌症的治疗
[0661] 本文中描述的VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)、siRNA分子(由SEQ ID NO:38–67的核酸序列的任一个组成)和抗VISTA抗体可用于用于治疗癌症(例如,肿瘤)的组合物、用途和方法。
[0662] 癌症的实例包括但不限于恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝恶性肿瘤和各种类型的头颈癌以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴细胞性(SL)NHL;中级/滤泡NHL;中级弥散性NHL;高级免疫母细胞NHL;高级淋巴母细胞NHL;高级小无裂细胞NHL;肿块性NHL;套细胞淋巴瘤;AIDS相关淋巴瘤;和瓦氏巨球蛋白血症);慢性淋巴细胞白血病(CLL);急性淋巴母细胞性白血病(ALL);毛细胞白血病;慢性髓性白血病;多发性骨髓瘤和移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)。
[0663] 术语易于通过本发明治疗的癌症包括但不限于恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝恶性肿瘤和各种类型的头颈癌以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴细胞性(SL)NHL;中级/滤泡NHL;中级弥散性NHL;高级免疫母细胞NHL;高级淋巴母细胞NHL;高级小无裂细胞NHL;肿块性NHL;套细胞淋巴瘤;AIDS相关淋巴瘤;和瓦氏巨球蛋白血症);慢性淋巴细胞白血病(CLL);急性淋巴母细胞性白血病(ALL);毛细胞白血病;慢性髓性白血病;和移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)以及与瘢痣病相关的异常血管增殖、浮肿(例如与脑瘤相关)和梅格斯综合征。优选地,癌症选自乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、良性肿瘤、恶性肿瘤、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。癌症为早晚期(包括转移性)膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤。癌症可为结直肠癌。适合由本发明治疗的癌性病症包括转移癌,其中通过髓源性抑制细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤反应和抗侵袭免疫反应。本发明的方法尤其适合用于治疗血管化肿瘤。
[0664] 本发明还适于与化疗或放疗或其它生物疗法相结合来治疗癌症以及增强其活性,即,在其中髓源性抑制细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤反应以及化疗或放疗或生物疗法疗效的个体中。根据本发明可使用任何表现出抗癌活性的化疗剂。优选地,化疗剂选自烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物及相关抑制剂、长春花生物碱、表鬼白毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、钼配位复合物、蒽二酮取代的脲、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质激素、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺素释放激素类似物。更优选地,化疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸(LV)、伊立替康、奥沙利钼、卡培他滨、紫杉醇和多西紫杉醇。可与抗VEGF抗体的施用相结合,以混合物(cocktail)方式使用两种或更多种化疗剂。一种优选的联合化疗基于氟尿嘧啶,包括5-FU和一种或多种其它化疗剂。联合化疗的合适的给药方案在本领域中是已知的,并在例如Saltz,等人(1999)Proc ASCO 18:233a和Douillard等人(2000)Lancet 355:1041-7中进行了描述。生物制品可以是另一种免疫增强剂,例如抗PD-L1、PD-L2、CTLA-4和PD-L1、PD-L2、CTLA-4融合蛋白以及细胞因子、生长因子拮抗剂和激动剂、激素以及抗细胞因子抗体。
[0665] 过敏
[0666] 本文中描述的VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)和抗VISTA抗体可用于用于治疗过敏(例如,对过敏原的过敏反应)的组合物、用途和方法。
[0667] 过敏原的实例包括螨抗原和花粉抗原。
[0668] 代表性过敏性疾病包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎以及花粉和昆虫过敏。过敏体质是会由过敏父母的孩子继承的遗传因素。家族过敏性疾病也称为特应性疾病,而致病的遗传传递因素为特应性体质。“特应性皮炎”是特应性疾病,特别是伴有皮炎症状的疾病的一般性术语。优选的实例包括选自湿疹、过敏性鼻炎、枯草热、荨麻疹和食物过敏的过敏病症。过敏病症包括湿疹、过敏性鼻炎或鼻粘膜炎、花粉热、支气管哮喘、荨麻疹(urticaria)(荨麻疹(hives))和食物过敏以及其它特应性病症。
[0669] 炎性病症和炎性疾病
[0670] 本文中描述的VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)、由SEQ ID NO:38–67的核酸序列的任一个组成的siRNA分子和抗VISTA抗体可用于用于治疗炎性病症和炎性疾病的组合物、用途和方法。
[0671] 炎性病症或炎性疾病包括但不限于风湿性疾病(例如,类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、脊椎关节病(例如,强直性脊柱炎、反应性关节炎、赖特综合征)、结晶性关节病(例如,痛风、假痛风、焦磷酸钙沉着症)、多发性硬化、莱姆病、风湿性多肌痛;结缔组织疾病(例如,系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多肌炎、皮肌炎、干燥综合征);血管炎病(例如,结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、丘-施综合征);炎性病症(包括创伤或局部缺血的结果、结节病);血管疾病(包括粥样硬化血管疾病、动脉硬化和血管阻塞性疾病(例如,动脉硬化、缺血性心脏病、心肌梗塞、中风、外周血管疾病)以及血管支架再狭窄;
眼病(包括葡萄膜炎、角膜疾病、虹膜炎、虹膜睫状体炎和白内障)。
[0672] 炎性病症包括但不限于反酸/胃灼热、粉刺、寻常痤疮、过敏和敏感性、阿尔茨海默病、哮喘、动脉粥样硬化和血管闭塞性疾病(例如,动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌梗死、中风、周围性血管疾病)和血管支架内再狭窄、自身免疫疾病、支气管炎、癌症、心肌炎、白内障、脂泻病、慢性疼痛、慢性前列腺炎、肝硬化、结肠炎、结缔组织疾病(例如,系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎或干燥综合征)、角膜病、克罗恩病、结晶性关节病(任选地痛风、假痛风、焦磷酸钙沉积病)、痴呆、皮炎、糖尿病、眼睛干涩、湿疹、水肿、气肿、纤维肌痛、胃肠炎、牙龈炎、肾小球肾炎、心脏病、肝炎、高血压、超敏反应、炎性肠病、炎性疾病(包括外伤或缺血的后果)、胰岛素抵抗、间质性膀胱炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、关节疼痛/关节炎/类风湿性关节炎、莱姆病、代谢综合征(X综合征)、多发性硬化症、肌炎、肾炎、肥胖症、眼部疾病(包括葡萄膜炎)、骨质减少、骨质疏松症、帕金森病、盆腔炎、牙周病、多动脉炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、银屑病、再灌注损伤、风湿性关节炎、风湿性疾病(例如,类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、鼻窦炎、干燥综合症、痉挛性结肠、脊椎关节病(例如,强直性脊柱炎、反应性关节炎或赖特综合征)、系统性念珠菌病、腱炎、移植排斥、UTI’s、阴道炎、血管疾病(包括动脉粥样硬化性血管疾病)、血管炎病(例如,结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、丘-施综合征)或血管炎。
[0673] 移植物抗宿主病
[0674] 本文中描述的VISTA多肽、多聚体VISTA多肽、VISTA融合蛋白(例如,VISTA-Ig)、siRNA分子(由SEQ ID NO:38–67的核酸序列的任一个组成)和抗VISTA抗体可用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的组合物、用途和方法。
[0675] 本发明还提供了治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法,其包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白。用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病的方法可包括施用有效量的VISTA融合蛋白,任选地VISTA-Ig融合蛋白或多聚体VISTA蛋白。
[0676] 移植物抗宿主病(GVHD)可以是移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的急性移植物抗宿主病、与干细胞移植相关的慢性移植物抗宿主病、与骨髓移植相关的急性移植物抗宿主病、与异体造血干细胞移植(HSCT)相关的急性移植物抗宿主病或与骨髓移植相关的慢性移植物抗宿主病。待治疗的患者可具有移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,任选地其中患者表现急性GVHD,包括但不限于腹痛、腹部绞痛、腹泻、发烧、黄疸、皮疹、呕吐和体重减轻。患者可具有慢性移植物抗宿主病(GVHD)的至少一个症状,包括但不限于干眼、口干、脱发、肝炎、肺疾病、胃肠道紊乱、皮疹和皮肤增厚。患者可具有或可将接受异体干细胞或骨髓移植。患者可具有或可接受自体干细胞或骨髓移植。
[0677] 诊断方法
[0678] 选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗VISTA和抗VISTA缀合物的抗体,由SEQID NO:38-67的核酸序列的任一个组成的siRNA分子及其抗原结合片段,可用于检测VISTA和VISTA缀合物的存在或不存在的诊断方法。抗VISTA和抗VISTA缀合抗体可用于方法,包括:(a)使测试样品与结合VISTA或VISTA缀合物的抗体或其片段接触,和(b)测定抗
体-表位复合物。所述抗体-表位复合物可通过Western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定、免疫组织化学测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定来检测。所述样品可以是这样的样品,其为组织活检样品、淋巴液、尿液、脑脊液羊水、炎性渗出物、血液、血清、粪便或从结肠直肠道收集的液体。
[0679] 选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体可以是重组体。选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体可以是Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、CDR、互补位或能够结合抗原的抗体的部分。选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体可以是嵌合的、人源化的、抗独特型的、单链的、双功能的或共特异性的。可将选择性结合VISTA和VISTA缀合物的抗体或片段缀合于标记,包括但不限于化学发光标记、顺磁性标记(例如,铝、锰、铂、氧、镧、镥、钪、钇或镓)、MRI造影剂、荧光标记、生物发光标记或放射性标记。
[0680] 此外,可将VISTA和VISTA缀合物、选择性地结合VISTA和VISTA缀合物的抗体及其抗原结合片段附接至固体载体(例如,珠粒、试管、板、培养皿或测试条)例如阵列。
[0681] 该方法可以包括利用下列技术使VISTA多肽或VISTA缀合物成像:正电子发射断层扫描(PET)、CCD低照度监控系统、x射线、CT扫描、闪烁显像、光声成像、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、磁共振成像(MRI)、超声、顺磁性成像和内窥镜光学相干断层扫描
[0682] 筛选测定
[0683] 本发明提供用于鉴定下述调节剂,即候选或测试化合物或试剂(例如,肽、拟肽、小分子或其它药物)的方法(在本文中也称为“筛选测定”),所述调节剂结合至VISTA多肽,对例如VISTA表达或VISTA活性具有刺激或抑制作用,或对VISTA与其天然结合伴侣之间的相互作用具有刺激或抑制作用。
[0684] 用于筛选候选或测试化合物(所述化合物结合至VISTA多肽或其生物活性部分,例如调节VISTA多肽与其天然结合伴侣之间的相互作用的能力)的测定可包括,将候选化合物与VISTA多肽接触并测试对VISTA多肽与其天然结合伴侣相互作用的能力的调节。用于筛选候选或测试化合物(所述化合物结合至VISTA蛋白或多肽或其生物活性部分或调节其活性)的测定可包括,接触VISTA多肽并测试VISTA多肽与候选试剂之间的结合。用于筛选候选或测试化合物的测定,所述化合物对由例如本文所鉴定的VISTA负调节的免疫功能具有刺激或抑制作用,或基于其对VISTA与其天然结合伴侣之间相互作用的影响。这些VISTA相关功能以举例方式包括抑制细胞因子产生(例如,T细胞产生的IL-2,γ干扰素,抑制适度的CD28共刺激、抑制CD4+和CD8+T细胞增殖,抑制首次接触试验的和记忆CD4+T细胞增殖以及抑制TCR活化而不诱导细胞凋亡)。本发明的测试化合物可使用本领域已知的组合文库方法中的任何多种途径而获得,包括:生物学文库;空间可寻址平行固相或液相文库;需要去卷积的合成文库方法;“一珠一化合物”文库方法;以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库途径限定于肽文库,而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库。Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145。
[0685] 测定为基于细胞的测定,其中细胞表达VISTA多肽或其生物活性部分,所述测定包括将表达VISTA多肽或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触,然后确定测试化合物调节VISTA活性的能力。测定测试化合物调节VISTA活性的能力可通过监测例如VISTA结合其天然结合伴侣和调节免疫细胞活性的能力来实现。免疫细胞可以是例如T细胞、B细胞或骨髓细胞。测定测试化合物调节VISTA结合其反受体的能力可例如通过以下方式实现:将VISTA与放射性同位素或酶标签偶联,以监测测试化合物调节VISTA结合至表达VISTA反受体的T细胞的能力。测定测试化合物结合VISTA的能力可例如通过以下方式实现:将化合物与放射性同位素或酶标签偶联,以便化合物与VISTA的结合可通过检测复合物中被标签的VISTA化合物来确定。
[0686] 测定可用于在不用任何作用物标记的情况下测定化合物与VISTA相互作用的能力。例如,微生理记录仪可用于在不标记化合物或VISTA的情况下检测化合物与VISTA的相互作用。McConnell,H.M.等人(1992)Science 257:1906–1912。微生理记录仪(例如,Cytosensor)是一种分析仪器,其使用光寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化其环境的速率。该酸化速率的变化可用作化合物与VISTA之间相互作用的指标。
[0687] 测定是基于细胞的测定,其包括将表达VISTA结合伴侣的T细胞与测试化合物接触,并测定测试化合物调节(例如,刺激或抑制)VISTA结合伴侣活性的能力。测定测试化合物调节VISTA结合伴侣活性的能力可例如通过以下方式实现:测定VISTA多肽结合至VISTA结合伴侣或与其相互作用的能力。
[0688] 测定VISTA多肽或其生物活性部分结合至VISTA结合伴侣或与其相互作用的能力可通过上文所述用于测定直接结合的方法之一来实现。在实施方案中,测定VISTA多肽结合至VISTA结合伴侣或与其相互作用的能力可通过测定结合伴侣的活性而实现。例如,结合伴侣的活性可通过以下方法测定:检测细胞第二信使(例如,酪氨酸激酶或磷酸酶活性)的诱导,检测合适底物的催化/酶促活性,检测报告基因(包括有效连接到编码可检测标记的核酸的靶应答调节元件)的诱导或检测靶调节型细胞反应。例如,测定VISTA多肽结合至天然VISTA结合伴侣或与其相互作用的能力可通过以下方式实现:通过在增殖测定中测量化合物调节免疫细胞共刺激或抑制的能力,或通过干扰VISTA多肽结合至识别VISTA多肽一部分的抗体的能力。在一个实施方案中,调节T细胞活化的化合物可通过测定化合物调节T细胞增殖或细胞因子产生的能力来鉴定。在实施方案中,调节T细胞活化的化合物可通过在不止一种抗原浓度下测定化合物调节T细胞增殖或细胞因子产生的能力来鉴定。
[0689] 测定为无细胞测定,其中将VISTA多肽或其生物活性部分与测试化合物接触,然后确定测试化合物结合至VISTA多肽或其生物活性部分的能力。待用于本发明测定中的VISTA多肽的优选生物活性部分包括参与与非VISTA分子的相互作用的片段,例如,结合至VISTA结合伴侣的胞外域的至少一部分。测试化合物与VISTA多肽的结合可如上所述直接或间接地测定。
[0690] 测定为无细胞的测定,其中将VISTA多肽或其生物活性部分与测试化合物接触,然后测定测试化合物调节(例如,刺激或抑制)VISTA多肽或其生物活性部分的活性的能力。测定测试化合物调节VISTA多肽活性的能力可例如通过以下方式实现:通过上文所述的用于测定直接结合的方法之一测定VISTA多肽结合至VISTA结合伴侣的能力。本发明的无细胞测定适用于多肽(例如,VISTA多肽或其生物活性部分,或VISTA所结合的结合伴侣)的可溶和/或膜结合形式。在其中使用膜结合形式的多肽(例如,细胞表面
VISTA)的无细胞测定的情况下,可能有利的是利用增溶剂,以便将膜结合形式的多肽维持在溶液中。此类增溶剂的实例包括非离子洗涤剂,例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡萄糖胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖胺、
X-100、 X-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲
氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐
(CHAPSO)或N-十二烷基.dbd.N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸盐。
[0691] 在测定方法中,可能期望固定VISTA或其结合伴侣以利于所述多肽之一或两者的复合形式与未复合形式的分离,以及适应测定的自动化。在候选化合物存在和不存在的情况下,测试化合物结合至VISTA多肽或者VISTA多肽与其结合伴侣的相互作用可在适于容纳反应物的任何容器中进行。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中,可提供增添了以下结构域的融合蛋白,所述结构域允许多肽之一或两者结合至基质。例如,谷胱甘肽-S-转移酶/VISTA融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/结合伴侣融合蛋白可被吸附到谷胱甘肽 珠粒(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板,其随后与测试化合物或测试化合物和未吸附的结合伴侣多肽或VISTA多肽相结合,再将混合物在有利于形成复合物的条件下温育(例如,在盐和pH的生理条件下)。在温育后,将珠粒或微量滴定板孔进行洗涤,以移除任何未结合的组分,在珠粒的情况下将基质固定,然后直接或间接地测定复合物形成,例如,如上所述。或者,可将复合物与基质解离,并使用标准技术测定VISTA结合或活性的水平。用于在基质上固定多肽的其它技术也可用于本发明的筛选测定。测定测试化合物调节VISTA多肽活性的能力可通过以下方法实现:测定测试化合物调节在VISTA下游起作用的分子的活性的能力,例如,通过与VISTA结合伴侣的胞质结构域相互作用。例如,第二信使的水平、相互作用分子对合适靶标的活性或相互作用子与合适靶标的结合可如之前所述而测定。
[0692] 在一种方法中鉴定VISTA表达的调节剂,其中将细胞与候选化合物接触,并测定细胞中VISTA mRNA或多肽的表达。在候选化合物存在的情况下将VISTAmRNA或多肽的表达水平与候选化合物不存在的情况下VISTAmRNA或多肽的表达水平进行比较。然后,基于该比较,如果变化具有统计学显著性,则可将候选化合物确定为VISTA表达的调节剂。
[0693] VISTA多肽可在双杂交测定或三杂交测定中用作“诱饵蛋白”(参见例如美国专利No.5,283,317;Zervos,等人(1993)Cell 72:223–232;Madura,等人(1993)J.Biol.Chem.268:12046–12054;Bartel,等人(1993)Biotechniques 14:920–924;Iwabuchi,等人(1993)Oncog ene 8:1693–1696和WO 94/10300),以鉴定结合至VISTA或与其相互作用的并牵涉VISTA活性的其它多肽(“VISTA结合蛋白、”“VISTA结合伴侣”或“VISTA-bp”)。这样的VISTA结合蛋白还可能通过VIST A多肽或者VISTA靶标牵涉信号的传播,作为例
如VISTA介导的信号通路的下游元件。或者,这样的VISTA结合多肽可以为VISTA抑制剂。
双杂交系统基于大多数转录因子的模块化性质,所述转录因子由可分离的DNA结合和活化结构域组成。简而言之,测定采用两个不同的DNA构建体。在一个构建体中,将编码VISTA多肽的基因融合至编码已知转录因子(例如,GAL-4)的DNA结合结构域的基因。在另一个构建体中,将编码未鉴定的多肽(“猎物(prey)”或“样品”)的获自DNA序列文库的DNA序列融合至编码已知转录因子的活化结构域的基因。如果“诱饵”和“猎物”多肽能够在体内相互作用,从而形成VISTA依赖性复合物,则使转录因子的DNA结合和活化结构域靠近。
该靠近允许有效连接到转录调节位点的报告基因(例如,LacZ)响应转录因子而进行转录。
可检测报告基因的表达,并可分离包含功能性转录因子的细胞集落并将其用于获得编码与VISTA多肽相互作用的多肽的克隆基因。
[0694] 本发明描述的两种或更多种测定的组合。例如,可使用基于细胞的或无细胞的测定鉴定调节剂,以及在体内(例如动物中,例如细胞转化和/或肿瘤发生的动物模型中)确认试剂调节VISTA多肽活性的能力。
[0695] 本发明还涉及通过上文所述的筛选测定鉴定的新型试剂。如在合适的动物模型中在本中描述的方法中鉴定的试剂。例如,如本文所述鉴定的试剂(例如,VISTA调节剂、反义VISTA核酸分子、VISTA特异性抗体或VISTA结合伴侣)可在动物模型中用于测定用这种试剂进行治疗的疗效、毒性或副作用。或者,如本文所述鉴定的试剂可用在动物模型中以确定这种试剂的作用机理。此外,本发明涉及通过上述筛选测定鉴定的新型试剂用于如本文所述的治疗的用途。
[0696] 检测测定
[0697] 本文鉴定的cDNA序列的部分或片段(以及相应的完整基因序列)可按多种方式用作多核苷酸试剂。例如,这些序列可用于:(i)在染色体上绘制其各自的基因;并因此定位与遗传疾病相关的基因区域;(ii)通过微量的生物样品鉴定个体(组织分型);以及(iii)帮助生物样品的法医学鉴定。这些应用将在下面的小节中描述。
[0698] 染色体作图
[0699] 分离基因序列(或序列的一部分)后,可将该序列用于绘制基因在染色体上的位置。该过程称为染色体作图。因此,本文所述的VISTA核苷酸序列的部分或片段可用于绘制VISTA基因在染色体上的位置。VISTA序列对染色体的作图是将这些序列与疾病相关基因相联系的重要的第一步。简而言之,可通过由VISTA核苷酸序列制备PCR引物(优选长度为15-25bp)来将VISTA基因对染色体作图。VISTA序列的计算机分析可用于预测在基因组DNA中跨度不超过一个外显子从而使扩增过程复杂化的引物。这些引物随后可用于含有单独人染色体的体细胞杂种的PCR筛选。只有含有对应于VISTA序列的人基因的那些杂种才会产生扩增片段。体细胞杂种通过融合来自不同哺乳动物的体细胞(例如,人和小鼠细胞)来制备。随着人和小鼠细胞杂种的生长和分裂,它们逐渐以随机顺序丢失人染色体,但保留小鼠染色体。通过使用小鼠细胞无法生长(由于它们缺乏特定的酶)但人细胞可以生长的培养基,将保留一个含有编码所需酶的基因的人染色体。通过使用各种培养基,可建立起多组杂种细胞系。一组中的每个细胞系含有单个人染色体或少数的人染色体以及全套小鼠染色体,从而允许容易地将各个基因对特定的人染色体作图。D’Eustachio,等人(1983)Science 220:919–924。只含人染色体片段的体细胞杂种还可通过使用具有易位和缺失的人染色体来产生。
[0700] 体细胞杂种的PCR作图是将特定序列分配至特定染色体的快速过程。使用单台热循环仪每天可以分配三个或更多个序列。使用VISTA核苷酸序列设计寡核苷酸引物时,通过来自特定染色体的多组片段可以实现亚定位。可类似地用于将VISTA序列对其染色体作图的其它作图策略包括原位杂交(描述于Fan,等人(1990)Proc Natl.Acad.Sci.USA87:6223–27)、利用被标记的流式分选染色体进行预筛选以及通过与染色体特异性cDNA文库杂交来预选。
[0701] DNA序列与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可进一步用于以一步方式提供精确的染色体位置。染色体涂片可使用其分裂已在中期通过破坏有丝分裂纺锤体的化学试剂例如秋水仙碱来阻断的细胞制备。染色体可通过胰蛋白酶简单处理,随后用吉姆萨(Giemsa)染色。浅暗条带的图案在每个染色体上显现,以便可单独地鉴定染色体。FISH技术可用在短至500或600个碱基的DNA序列。然而,大于1,000个碱基的克隆具有较高的结合至独特染色体位置的可能性,并具有足够的信号强度,可容易地检测。优选地1,000个碱基,更优选地2,000个碱基将足够以合理的时长获得良好的结果。对于该技术的综述,参见Verma,等人Human Chromosomes:A Manual of basic Techniques(Pergamon Press,New York 1988)。染色体作图的试剂可单独使用以标记单一染色体或该染色体上的单个位点,或者多组试剂可用于标记多个位点和/或多个染色体。实际上,对应于基因非编码区的试剂对作图目的是优选的。编码序列在基因家族内更可能是保守的,从而增加染色体作图过程中交叉杂交的机会。
[0702] 对序列作图到精确的染色体位置后,可将染色体上序列的物理位置与遗传图谱数据相关联。最终,可执行获自若干个体的基因的完整测序,以确认突变的存在性以及区分突变与多态性。
[0703] 组织分型
[0704] 本发明的VISTA序列还可用于从微量的生物样品鉴定个体。此外,本发明的序列可用于提供确定个体基因组中所选部分的实际碱基并碱基(base-by-base)DNA序列的替代技术。因此,本文所述的VISTA核苷酸序列可用于从序列的5’和3’末端制备两个PCR引物。这些引物随后可用于扩增个体DNA,并随后对其测序。
[0705] 以该方式制备的获自个体的多组相应的DNA序列可提供唯一的个体识别,因为每一个个体将由于等位差异而具有一组唯一的此类DNA序列。本发明的序列可用于从个体以及从组织获得此类识别序列。本发明的VISTA核苷酸序列唯一地代表人基因组的部分。等位变异在这些序列的编码区一定程度上发生,而在非编码区的发生程度较高。据估计,各个人之间的等位变异以每500个碱基大约1次的频率发生。本文所述的序列的每一个可在一定程度上用作标准,而获自个体的DNA可与之比较以用于识别目的。由于在非编码区存在较大数量的多态性,因此需要较少的序列来区分个体。SEQ ID NO:1或4的非编码区可容易地通过一组可能为10至1,000个的引物来提供阳性个体识别,所述每个引物产生100个碱基的非编码扩增序列。若使用预测的编码序列,例如SEQ ID NO:3或6中的那些,则对于阳性个体识别更合适的引物数量将为500-2000个。
[0706] 如果将来自本文所述的VISTA核苷酸序列的一组试剂用于产生个体的唯一识别数据库,则那些相同的试剂随后可用于识别该个体的组织。使用该唯一识别数据库,活或死亡个体的阳性识别可通过极小的组织样品量来实现。
[0707] VISTA序列在法医生物学中的应用
[0708] 基于DNA的鉴定技术还可用在法医生物学中。本发明的序列可用于提供靶向人基因组中特定基因座的多核苷酸试剂,如PCR引物,其可通过例如提供另一“鉴定标记”(即,对特定个体唯一的另一DNA序列)来提高基于DNA的法医学鉴定的可靠性。如上所述,实际的碱基序列信息可用于鉴定,作为限制性酶产生的片段所形成的模式的准确替代。靶向SEQ ID NO:1或3非编码区的序列尤其适合该用途,因为在非编码区存在较大数量的多态性,使得更易于使用该技术来区分个体。多核苷酸试剂的实例包括VISTA核苷酸序列或其部分,例如,衍生自SEQ ID NO:1或3的非编码区的长度为至少20个碱基,优选至少30个碱基的片段。本文所述的VISTA核苷酸序列还可用于提供多核苷酸试剂,例如可用于例如原位杂交技术的标记探针或可加标记探针,以鉴定特定的组织,如淋巴细胞。这在法医病理学家面临未知来源的组织时会非常有用。多组此类VISTA探针可用于按物种和/或按器官类型鉴定组织。以类似的方式,这些试剂,如VISTA引物或探针可用于筛选组织培养物的污染情况(即,筛选培养物中不同类型细胞的混合物的存在性)。
[0709] 诊断测定
[0710] 检测生物样品中VISTA多肽或核酸存在与否的示例性方法包括:从测试受试者中获得生物样品,将生物样品与能够检测VISTA多肽或编码VISTA多肽的核酸(例如,mRNA或基因组DNA)的化合物或试剂接触,以便检测该生物样品中VISTA多肽或核酸的存在性。检测VISTA mRNA或基因组DNA的优选试剂为能够与VISTA mRNA或基因组DNA杂交的标记
的核酸探针。核酸探针可以为例如SEQ ID NO:1或3所示的VISTA核酸或其部分,例如长度为至少15、30、50、100、250或500个核苷酸并足以在严格条件下与VISTA mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。其它适用于本发明的诊断测定的探针在本文进行了描述。检测VISTA多肽的优选试剂为能够结合至VISTA多肽的抗体,优选地为带有可检测的标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体,或更优选地为单克隆抗体。可以使用完整的抗体或其片段(例如,Fab或F(ab’)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测的物质偶联(即,物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体,以及通过与直接标记的另一试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗以及用生物素末端标记DNA探针,以便其可通过荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者中分离的组织、细胞和生物流体,以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。也就是说,本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的VISTA mRNA、多肽或基因组DNA。例如,体外检测PD-L2mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。体外检测VISTA多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。体外检测VISTA基因组DNA的技术包括Southern杂交。此外,体内检测VISTA多肽的技术包括向受试者引入标记的抗VISTA抗体。例如,抗体可用放射性标志物进行标记,其在受试者中的存在及位置可通过标准成像技术检测。在一个实施方案中,生物样品包含来自测试受试者的多肽分子。或者,生物样品可包含来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。优选的生物样品为通过常规方法从受试者中分离的血清样品。在另一个实施方案中,所述方法还涉及:从对照受试者获取对照生物样品,将对照样品与能够检测VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触,以便检测生物样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的存在性,以及将对照样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的存在性与测试样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的存在性进行比较。
[0711] 本发明还涵盖用于检测生物样品中VISTA存在性的试剂盒。例如,该试剂盒可包含:能够检测生物样品中VISTA多肽或mRNA的标记化合物或试剂;测定样品中VISTA的量的装置;以及比较样品与标准品中VISTA的量的装置。该化合物或试剂可包装在合适的容器中。试剂盒可进一步包含使用试剂盒来检测VISTA多肽或核酸的说明书。
[0712] 预后测定
[0713] 本文所述的诊断方法另外可用于鉴定这样的受试者,其患有与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的疾病或病症或存在发展所述疾病或病症的风险。如本文中所用,术语“异常的”包括偏离野生型VISTA表达或活性的VISTA表达或活性。异常的表达或活性包括升高或降低的表达或活性,以及不遵循表达的野生型发展模式或表达的亚细胞模式的表达或活性。例如,异常的VISTA表达或活性旨在包括:其中VISTA基因的突变导致VISTA基因表达不足或过表达的情况,以及其中这样的突变导致非功能性VISTA多肽或不以野生型方式发挥功能的多肽的情形,例如,不与VISTA结合伴侣相互作用的多肽,或与非VISTA结合伴侣相互作用的多肽。如本文中所用,术语“不需要的”包括生物反应例如免疫细胞活化中涉及到的不需要的现象。例如,术语不需要的包括受试者中不想要的VISTA表达或活性。
[0714] 本文中所述的测定,例如前述诊断测定或以下测定,可用于鉴定这样的受试者,其患有与VISTA多肽活性或核酸表达误调节相关的疾病或存在发展所述疾病的风险,例如自身免疫疾病、免疫缺乏症、免疫系统疾病例如自身免疫、过敏或炎性疾病或癌症。因此,本发明提供鉴定与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的疾病或病症的方法,其中从受试者获得试样,并检测VISTA多肽或核酸(例如,mRNA或基因组DNA),其中VISTA多肽或核酸的存在对于受试者患有与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的疾病或病症或存在发展所述疾病或病症的风险为诊断性的。如本文中所用,“试样”是指从所关注的受试者获得的生物样品。例如,试样可以为生物流体(例如,脑脊髓液或血清)、细胞样品或组织。
[0715] 此外,本文所述的预后测定可用于确定是否可向受试者施用试剂(例如,激动剂、拮抗剂、拟肽、多肽、肽、核酸、小分子或其它候选药物)以治疗与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的疾病或病症。例如,这样的方法可用于确定用试剂是否能有效治疗受试者的自身免疫疾病、免疫缺乏症、免疫系统癌症或过敏性或炎性疾病。因此,本发明提供确定用试剂是否能有效治疗受试者的与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的障碍的方法,其中获得试样,并检测VISTA多肽或核酸表达或活性(例如,其中VISTA多肽或核酸表达或活性的丰度对于可被施用试剂以治疗与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关的障碍的受试者为诊断性的)。本发明的方法还可用于检测VISTA基因中的遗传改变,从而确定具有改变的基因的受试者是否存在特征在于VISTA多肽活性或核酸表达误调节的疾病的风险,例如自身免疫疾病、免疫缺乏症、免疫系统癌症、过敏性疾病或炎性疾病。本文所述的方法可例如通过利用预先包装好的诊断试剂盒来进行,所述试剂盒包含本文所述的至少一种探针核酸或抗体试剂,其可例如在临床环境中便利地使用,以诊断表现出VISTA基因相关疾病或病情的症状或家族史的患者。此外,其中表达VISTA的任何细胞类型或组织均可用于本文所述的预后测定。
[0716] 免疫测定
[0717] VISTA和VISTA缀合物、结合VISTA和VISTA缀合物的抗体和抗原结合片段可在免疫测定中用于定性或定量检测和分析样品中的标志物。该方法包括提供特异性结合VISTA或VISTA缀合物的抗体;将样品与所述抗体接触;和检测样品中结合至标志物的抗体的复合物的存在。
[0718] 使用许多公认的免疫结合测定的任一种来检测和/或定量VISTA和VISTA缀合物。有用的测定包括例如酶免疫测定(EIA)例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免
疫测定(RIA)、Western印迹测定或狭缝杂交测定。参见,例如,美国专利No.4,366,241;
4,376,110;4,517,288和4,837,168。一般而言,可将获自受试者的样品与特异性结合VISTA或VISTA缀合物的抗体接触。
[0719] 任选地,可将抗体固定至载体以利于复合物的洗涤和随后分离,随后将抗体与样品接触。固体载体的实例包括但不限于以例如微量滴定板、条、珠粒或微珠的形式存在的玻璃或塑料。
[0720] 在将样品与抗体一起温育后,洗涤混合物,随后可检测形成的抗体-标记复合物。这可通过将洗涤的混合物与检测试剂一起温育来实现。或者,可使用其中例如将第二标记抗体用于检测结合的标记特异性抗体的间接测定,和/或其中将例如结合标记的不同表位的单克隆抗体与混合物同时温育的竞争性或抑制性测定,来检测样品中的标记。
[0721] 在整个测定中,在每一次试剂组合后可能需要温育和/或洗涤步骤。温育步骤可从约5秒变化至数小时,优选从约5分钟变化至约24小时。然而,温育时间将取决于测定形式、标记、溶液体积、浓度。通常地在环境温度下进行测定,尽管它们可在一定范围的温度(例如,10℃–40℃)上进行。
[0722] 免疫测定可用于测定受试者的样品中的测试量的标记。首先,可使用上述免疫测定法来检测样品中的测试量的标记。如果标记存在于样品中,则其将与在上述合适的温育条件下特异性结合标记的抗体形成抗体-标记复合物。任选地可通过与标准比较来测定抗体-标记复合物的量。如上所指出的,不必以绝对单位来测量标记的测试量,只要可将测量的单位与对照量和/或信号比较即可。几个免疫测定在本领域中是已知的,可这样的免疫测定(包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、磁性免疫测定、免疫印迹、Western印迹、免疫沉淀测定、免疫组织化学分析和荧光激活细胞分选(FACS))中使用本文中描述的VISTA多肽或VISTA缀合物。参见,Wild,(2008)[编辑]The Immunoassay Handbook[第3版]Elsevier。
[0723] 放射成像
[0724] VISTA和VISTA缀合物可用于放射成像法以诊断癌症,包括胰腺癌和结直肠癌,或监测肿瘤的进展。这些方法包括但不限于正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。这两种技术都是非侵入性的,并可用于检测和/或测量多种组织事件和/或功能,例如检测癌细胞。SPECT可任选地与两种标记同时使用。参见美国专利No.6,696,686。
[0725] 商业应用和方法
[0726] 本发明还提供了达到商业数量的VISTA和VISTA缀合物的生产。VISTA和VISTA缀合物可以产生大规模,必要时将其贮存,和提供给医院、临床医生或其它医疗机构。
[0727] VISTA和VISTA缀合物的生产、贮存和分配的方法可通过本文中公开的方法产生。生产后,可收获VISTA和VISTA缀合物,将其进行纯化,任选地在进行患者的治疗之前将其贮存。例如,一旦患者呈现适应症例如癌症、自身免疫疾病或炎性疾病,则可订购VISTA和VISTA缀合物并以及时的方式提供。因此,本发明涉及生产VISTA和VISTA缀合物以在商业规模上获得抗体的方法、包含选择性结合至VISTA和VISTA缀合物的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,以及给医院和临床医生提供(即,生产,任选地贮存和销售)VISTA和VISTA缀合物的方法。VISTA和VISTA缀合物的生产可按比例放大用于商业用途。
[0728] 本发明还提供了用于进行药物商业的方法,包括建立分配系统用于分配制剂进行出售,或可包括建立销售药物制剂的销售小组。
[0729] 核酸文库
[0730] VISTA(PD-L3)变体的多样化文库(variegated library)通过核酸水平的组合诱变产生并通过多样化基因文库编码。VISTA(PD-L3)变体的多样化文库可通过以下方式产生,例如将合成寡核苷酸的混合物通过酶法连接至基因序列中,以便潜在VISTA(PD-L3)序列的简并组可作为单独的多肽表达,或可选择地作为在其中包含VISTA(PD-L3)序列的组的较大融合蛋白组(例如对于噬菌体展示而言)表达。有多种方法可用于由简并寡核苷酸序列产生潜在VISTA(PD-L3)变体的文库。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行,且合成基因随后连接到合适的表达载体中。使用基因的简并组允许在一种混合物中提供编码所需的潜在VISTA(PD-L3)序列组的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域中是已知的。参见例如,Narang(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura,等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura,等人(1984)Science 198:1056;Ike,等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477。
[0731] 此外,VISTA(PD-L3)多肽编码序列的片段的文库可用于产生VISTA(PD-L3)片段的多样化群体,以筛选及随后选择VISTA(PD-L3)多肽的变体。编码序列片段的文
库可通过以下方法产生:用核酸酶在其中每个分子只出现大约一次切口的条件下处理
VISTA(PD-L3)编码序列的双链PCR片段,使双链DNA变性,使DNA复性以形成可包含来自不同的带切口产物的有义/反义对的双链DNA,通过S1核酸酶处理从重新形成的双链体
中移除单链部分,以及将所得的片段文库连接至表达载体中。通过此方法,可衍生出编码VISTA(PD-L3)多肽的各种大小的N端、C端和内部片段的表达文库。
[0732] 用于筛选通过点突变或截短制得的组合文库的基因产物以及用于筛选cDNA文库中具有所选特性的基因产物的若干技术在本领域中是已知的。此类技术适于快速筛选通过VISTA(PD-L3)多肽的组合诱变产生的基因文库。适于高通量分析的用于筛选大型基因文库的最广泛使用的技术通常包括:将基因文库克隆进可复制的表达载体,将合适的细胞用所得的载体文库转化,以及在下述条件下表达组合基因,其中检测所需的活性有利于分离编码检测其产物的基因的载体。递归总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis,REM)是一种提高文库中功能性突变体频率的新技术,可与筛选测定联合使用以鉴定VISTA(PD-L3)突变体。Arkin和Youvan(1992)Proc Natl.Acad.Sci.USA 89:7811–7815;Delagrave等人(1993)Protein Eng.6(3):327–331。
[0733] 预测医学
[0734] 本发明还涉及预测医学领域,其中诊断测定、预后测定以及临床试验监测用于预后(预测)目的从而预防性地治疗个体。因此,本发明的一个方面涉及用于在生物样品(例如,血液、血清、细胞或组织)背景下测定VISTA多肽和/或核酸表达以及VISTA活性的诊断检测分析,从而确定个体是否患有疾病或病症,或是否存在发展疾病的风险,所述疾病或病症与异常的或不需要的VISTA表达或活性相关。本发明还提供预后(或预测)测定以确定个体是否有发展与VISTA多肽、核酸表达或活性相关的疾病的风险。例如,可测定生物样品中VISTA基因的突变。此类测定可用于预后或预测目的,从而在特征在于VISTA多肽、核酸表达或活性或与之相关的疾病发生之前预防性地治疗个体。
[0735] 本发明的另一实施方案涉及在临床试验中监测试剂(例如,药物、化合物)对VISTA表达或活性的影响。这些试剂及其它试剂在下面的小节中将进一步详细描述。
[0736] 临床试验过程中效果的监测
[0737] 监测试剂(例如,药物)对VISTA多肽表达或活性的影响(例如,调节细胞增殖和/或迁移)不仅可适用于基本药物筛选,也适用于临床试验。例如,对于通过如本文所述的筛选测定确定的试剂增强VISTA基因表达、多肽水平或上调VISTA活性的效果,可在表现出降低的VISTA基因表达、多肽水平或下调的VISTA活性的受试者的临床试验中进行监测。或者,对于通过筛选测定确定的试剂降低VISTA基因表达、多肽水平或下调VISTA活性的效果,可在表现出提高的VISTA基因表达、多肽水平或VISTA活性的受试者的临床试验中进行监测。如所述,VISTA在许多造血细胞类型(包括APC(巨噬细胞和骨髓树突细胞)+ + -
以及CD4+T细胞)上表达,更具体地在CD11cDC、CD4T细胞(包括Foxp3效应T细胞以及
+ + +
Foxp3nTreg两者)、CD8T细胞和Gr1粒细胞上表达,以及在B细胞和NK细胞上低水平表
达。在这样的临床试验中,VISTA基因,更优选地为在例如VISTA相关疾病中牵涉的其它基因的表达或活性可用作特定细胞表型的“读出(read out)”或标志物。
[0738] 例如但非限制性地,可鉴定在细胞中通过用调节VISTA活性(例如,在本文所述的筛选检测分析中鉴定的)的试剂(例如,化合物、药物或小分子)治疗而调节的基因,包括VISTA。因此,为了例如在临床试验中研究试剂对VISTA相关疾病的作用,可分离细胞,制备RNA并分别分析VISTA相关疾病中涉及的VISTA以及其它基因的表达水平。基因表达水平(例如,基因表达模式)可通过如本文所述的Northern印迹分析或RT-PCR来定量,或者可选地,通过本文所述的方法之一测量所产生的多肽的量或通过测量VISTA或其它基因的活性水平来定量。这样,基因表达模式可用作标志物,指示细胞对试剂的生理反应。因此,该反应状态可在用试剂治疗个体前以及在治疗中的各个时间点进行确定。在实施方案中,本发明提供监测用试剂(例如,通过本文所述的筛选测定鉴定的激动剂、拮抗剂、拟肽、多肽、肽、核酸、小分子或其它候选药物)治疗受试者的效果的方法,包括以下步骤:(i)在施用试剂前从受试者获得施用前样品;(ii)检测施用前样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平;(iii)从受试者获得一个或多个施用后样品;(iv)检测施用后样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平;(v)将施用前样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA与施用后一个或多个样品中VISTA多肽、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平进行比较;以及(vi)相应地改变向受试者的试剂施用。例如,增加试剂施用可能是所需的,以将VISTA的表达或活性提高到比所测水平更高的水平,即,增强试剂的效果。或者,减少试剂施用可能是所需的,以将VISTA的表达或活性降低到比所检测水平更低的水平,即减弱试剂的效果。根据这样的实施方案,VISTA表达或活性可以用作试剂效果的指标,即使在可观察的表型反应不存在的情况下。
[0739] 本说明书中提及的所有出版物(例如,非专利文献)、专利、专利申请出版物和专利表示本发明所属的本领域内的普通技术人员的水平。所有这些出版物(例如,非专利文献)、专利、专利申请出版物和专利申请都通过引用并入本文,其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请出版物或专利申请被具体地和单独地通过引用并入本文。实施例
[0740] 现在正进行一般性描述的本发明,通过参考下列实施例将更容易被理解,所述实施例仅被包括用于举例说明本发明的某些方面和实施方案,并且无意限定本发明。
[0741] 实施例1
[0742] VISTA(PD-L3)的克隆的序列分析
[0743] 通过静息Treg、αCD3活化的Treg以及αCD3/αGITR活化的Treg的整体转录谱分析鉴定了VISTA(PD-L3)和Treg-sTNF。选择了αGITR用于此分析,因为已表明
Treg上GITR的触发可压制它们的接触依赖性抑制活性(Shimizu,等人(2002)同上)。在DNA阵列上基于VISTA(PD-L3)和Treg-sTNF的独特表达模式对它们进
行了鉴定(表2)。VISTA(PD-L3)在αCD3活化的Treg中表现出表达增强,在αGITR存在
的情况下表达降低;以及Treg-sTNF表现出表达的αCD3/αGITR依赖性增强。
[0744] 通过无、αCD3或αCD3/αGITR在过夜培养中刺激了纯化的CD4+CD25+T细胞,并分离了RNA用于实时PCR分析。列出的表达以肌动蛋白为比较。
[0745] 表2
[0746]
[0747] 活化的与静息的CD25+CD4+nTreg的 分析表明,基因产物(RIKEN cDNA 4632428N05或4632428N05Rik)的表达具有未知的功能,但与Ig超家族具有序列同源性。
[0748] 更具体地讲,从CD4+T细胞cDNA文库克隆了930bp的基因产物,其与预测的大小和序列相符。电子延伸序列和结构分析预测成熟时309个氨基酸的跨膜蛋白,其具有159个氨基酸的胞外域、22个氨基酸的跨膜域以及95个氨基酸的胞质尾区(图1A)。氨基酸序列比对揭示了与B7家族配体例如PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4以及B7家族受体(即,PD-1、CTLA-4、CD28、BTLA、ICOS)同源的胞外免疫球蛋白(Ig)-V样结构域(图1B-C)。虽然B7家族配体与受体之间Ig-V结构域的序列同一性通常不是非常高(<40%),但是4632428N05Rik的Ig-V结构域具有与B7家族配体PD-L1和PD-L2的最高同源性。序列比对还揭示了若干高度保守的半胱氨酸(图1B),它们对于链内二硫键的形成具有重要意义,而链内二硫键形成为B7家族配体所特有。也参见图23A-C;Sica,等人(2003)Immunity 18:849–861。
[0749] 4632428N05Rik的胞外域只含Ig-V结构域而无Ig-C结构域(图1B-C)。此独特特征为B7家族受体所特有,并将4632428N05Rik与所有其它B7家族配体区分开来,后者包含Ig-V和Ig-C结构域。Free man(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105:10275–
10276;Lazar-Mol nar,等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105:10483–10488;Lin,等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105:3011–3016;Schwartz,等人(2001)Nature
410:604–608;Stamper,等人(2001)Nature 410:608–61。一致地,使用PhyML算法(系统发育最大可能性)的系统发生分析将4632428N05Rik放置于与B7家族受体、尤其是
与PD-1比与B7家族配体更近的进化距离(图2)。Guindon&Gascuel(2003)Syst B iol
52:696–704。然而,VISTA(PD-L3)的胞质尾区不含任何信号传导结构域(例如,ITIM、ITAM或ITSM),其为B7家族受体的身份结构域(signature domain)。Sharpe&Freeman(2002)Nat Rev Immunol.2:116–126。因此尽管存在其与抑制性受体PD-1的亲密进化关系,但
4632428N05Rik代表了B7配体家族的新成员。基于这些结构及系统发生特性,将此分子命名为PD-1-eXpressed as Ligand(VISTA(PD-L3))。VISTA(PD-L3)在小鼠与人直向同源体之间也高度保守,共有77%序列同一性(图1D)。
[0750] 编码小鼠VISTA(PD-L3)的核酸序列在本文中如SEQ ID NO:1所示,小鼠VISTA(PD-L3)蛋白序列如SEQ ID N O:2所示。
[0751] VISTA(PD-L3)的人同源物位于10号染色体上(72.9Mb),并由6个外显子构成,从而产生编码311个残基的蛋白质的长度为4689个碱基的转录物。人同源物mRNA编码序列以GENBANK登录号NM_022153提供,蛋白序列作为NP_071436给出。编码人VISTA(PD-L3)的核酸序列在本文如SEQ ID NO:3所示,人VISTA(PD-L3)蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。小鼠和人基因共有74%同源性并且在蛋白水平上具有68%同一性。还在褐家鼠第20号染色体(27.7Mb;GENBANK登录号BC098723)以及红鳍东方豚和斑马鱼中鉴定了同源物。在一个实施方案中,本发明的VISTA(PD-L3)蛋白共有如SEQ ID NO:5所示的共同氨基酸序列。VISTA的另外的直向同源物已被鉴定并示于图23C,例如(SEQ ID NO:17)、人(SEQ ID NO:16)、袋鼠(SEQ ID NO:18)、海豚(SEQ ID NO:19)、鸡(SEQ ID NO:20)、爪蟾(SEQ ID NO:21)、斑马鱼(SEQ ID NO:22)、斑马鱼和河豚(SEQ ID NO:23)。
[0752] 实施例2
[0753] 通过RT-PCR分析和流式细胞术进行的VISTA(PD-L3)表达研究
[0754] RT-PCR分析用于确定小鼠组织中VISTA(PD-L3)的mRNA表达模式(图3A)。VISTA(PD-L3)主要在造血组织(脾脏、胸腺、骨髓)或具有丰富淋巴细胞浸润的组织(即,肺)上表达。在非造血组织(即,心脏、肾脏、脑和卵巢)中也检测到了弱表达。若干造血细胞类型的分析揭示了VISTA(PD-L3)在腹腔巨噬细胞、脾CD11b+单核细胞、CD11c+DC、CD4+T细胞和CD8+T细胞上表达,但在B细胞上表达水平较低(图3B)。此表达模式还与
GNF(Genomics Institute of Novartis Research Foundation)基因阵列数据库以及NCBI GEO(基因表达综合数据库)数据库高度一致(图3A-D)。参见Su,等人(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99:4465–4470。
[0755] 为了研究蛋白表达,产生了VISTA(PD-L3)特异性仓鼠8D8和6E7单克隆抗体。通过在过表达VISTA(PD-L3)的鼠EL4T细胞上的阳性染色但在过表达PD-L1的EL4细胞上的负性染色证实了特异性(图5)。
[0756] 针对VISTA(PD-L3)的多克隆和单克隆抗体均得到提高。使用兔抗VISTA(PD-L3)抗体,将VISTA(PD-L3)蛋白定位至淋巴器官并显著存在于脑组织中。在这些鉴定的单克隆抗体中,进一步评价了αVISTA(PD-L3)克隆8D8的特异性。在该分析中,测试了克隆8D8针对一组PD-L样Ig融合蛋白分子(包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、VISTA(PD-L3和hlg)的结合。此分析的结果表明,8D8αPDL-3对VISTA(PD-L3)具有高度特异性。
[0757] 具体地讲,使用抗VISTA(PD-L3)单克隆抗体克隆8D8,通过流式细胞术分析了造血细胞上的VISTA(PD-L3)表达。Foxp3GFP敲入报告小鼠用于区分CD4+nTreg。在外周淋巴器官(脾脏和淋巴结)中,在所有CD4+T细胞亚群中均观察到了显著的表达(参见总CD4+T细胞、或Foxp3首次接触试验的T细胞和Foxp3+nTreg细胞,以及记忆CD4+T细胞),而CD8+T细胞表达显著低的表面VISTA(PD-L3)量(图3C)。在胸腺中,VISTA(PD-L3)表达在CD4+CD8+双阳性胸腺细胞上为阴性,在CD4单阳性细胞上较低,在CD8单阳性细胞上可检测。接下来,对于脾和腹膜细胞(包括F4/80巨噬细胞和骨髓CD11c+DC两者)均可观察到高VISTA(PD-L3)表达与CD11b标志物的强关联(图3D-E)。在另一方面,B细胞和NK细
胞对VISTA(PD-L3)表达主要为阴性。小百分比的Gr-1+粒细胞也表达VISTA(PD-L3)(图
3F)。
[0758] 在来自不同淋巴器官的相同细胞谱系上显示出差异表达模式(图3G)。对于CD4+T细胞和CD11b中间单核细胞,表达水平遵循肠系膜淋巴结>外周淋巴结和脾脏>腹腔和血液的模式。此模式对于CD11bhi细胞不太明显。该数据表明,某些细胞上VISTA(PD-L3)表达可能受细胞成熟度和/或组织微环境的调节。
[0759] 除了新分离的细胞外,还在进行活化以及无活化的体外培养后分析了脾CD4+T细胞、CD11bhi单核细胞和CD11c+DC细胞上的VISTA(PD-L3)表达(图6)。将脾细胞用培养基或用抗CD3(用于活化T细胞)或用IFNγ和LPS(用于活化单核细胞和DC)培养24小
时后,分析VISTA(PD-L3)以及其它B7家族配体(例如,PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4)的表达。该比较揭示了这些分子之间差别性的表达模式。VISTA(PD-L3)表达在体外培养时在所有细胞上均迅速丧失,而无论活化状态如何。相比之下,PD-L1表达在刺激时在CD4+T细胞上、在仅培养基中培养时在CD11bhi单核细胞和CD11c+DC上被上调,并在面对刺激时被进一步增强。PD-L2、B7-H3和B7-H4的表达在所用培养条件下不突出。VISTA(PD-L3)表达在体外的丧失与其它B7家族配体相比是独有的,但可能反映了未能模拟组织微环境的非最佳培养条件。
[0760] 为了弄清可如何在体内调节VISTA(PD-L3)表达,将CD4TCR转基因小鼠DO11.10用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的同种抗原鸡卵清蛋白(OVA)免疫。免疫后24小时时,分析引流淋巴结中的细胞的VISTA(PD-L3)表达(图7A)。仅用抗原(CFA/OVA)而无佐剂免疫显著增加了CD11b+VISTA(PD-L3)+骨髓细胞群,其包含F4/80+巨噬细胞与CD11c+DC的混合细胞群。与PD-L1和PD-L2的进一步比较揭示出,虽然PD-L1具有最高的组成型表达水平,但VISTA(PD-L3)在这样的炎症免疫反应期间受到了最高的上调(图7B)。总而言之,这些数据强烈表明,骨髓APC上VISTA(PD-L3)的表达由免疫系统严格调节,其可能有助于在控制免疫反应和调节T细胞免疫中的作用。
[0761] 与其在APC上升高的表达相比,VISTA(PD-L3)表达在活化的DO11.10CD4+T细胞上在免疫后较晚的时间点降低(即,在48小时而非24小时时)(图8)。此结果表明,体内CD4T细胞上的VISTA(PD-L3)表达可受其活化状态以及活性免疫反应期间的细胞因子微环境调节。
[0762] 实施例3
[0763] VISTA(PD-L3)信号传导对CD4+和CD8+T细胞应答的功能性影响
[0764] 产生了VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白以研究VISTA(PD-L3)对CD4+T细胞应答的调节作用。VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白包含融合至人IgG1Fc区的VISTA(PD-L3)的胞外域。
当固定在微量滴定板上时,VISTA(PD-L3)-Ig而非对照Ig抑制了粗纯化CD4+和CD8+T细胞响应结合平板的抗CD3刺激而发生的增殖,如通过受抑制的细胞分裂而测定的(图9A-B)。
VISTA(PD-L3)Ig融合蛋白不影响抗CD3抗体吸收到塑料孔,如通过ELISA测定的,从而排除了非特异性抑制作用的可能性。PD-1KO CD4+T细胞也受到抑制(图9C,D),从而表明PD-1不是VISTA(PD-L3)的受体。还直接比较了PD-L1-Ig和VISTA(PD-L3)-Ig的抑制作用(图
10)。当使滴定量的Ig融合蛋白与αCD3一起被吸收到微量滴定板以刺激CD4+T细胞时,VISTA(PD-L3)-Ig表现出与PD-L1-Ig融合蛋白相似的抑制效果。
[0765] 由于粗纯化的CD4+T细胞包含各种亚群,因此评价VISTA(PD-L3)-Ig对分选的首次接触试验的(CD25-CD44低CD62Lhi)以及记忆(CD25-CD44hiCD62L低)CD4+T细胞亚群的影响(图11A和11B)。VISTA(PD-L3)可抑制两种亚群的增殖,虽然对记忆细胞的效果要弱得多。
[0766] 为了进一步理解VISTA(PD-L3)介导的抑制的机制,在存在或不存在VISTA(PD-L3)-Ig的情况下在T细胞活化后测量了早期TCR活化标志物的表达以及细胞凋亡。与对细胞增殖的负影响一致,存在对早期活化标志物CD69、CD44和CD62L表达的全局性抑制(补充图12A)。在另一方面,VISTA(PD-L3)-Ig融合蛋白未诱导细胞凋亡。相反,在存在VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig的情况下,在TCR活化的早期(24小时)和晚期(48小时)
均观察到了比对照Ig低的细胞凋亡(通过膜联蛋白V+7AAD-细胞的百分比测定的)(图
12B)。例如,在24小时时间点,在总“非分类”细胞群中,约27%的细胞在存在VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig的情况下凋亡,而对照细胞则有约39%的凋亡。当在活细胞R1分类中研究细胞时,明显的是,VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig强烈抑制了活化诱导的细胞死亡(ACID),因为当用VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig处理时约72.6%的对照细胞变为凋亡,而试验细胞只有43.5%凋亡。对于48小时时间点也观察到了相似的结果。因此,看来VISTA(PD-L3)或VISTA通过抑制早期TCR活化以及抑制细胞分裂来负调节CD4+T细胞应答,但对细胞凋亡的直接影响极低。此抑制机制与B7-H4的类似。Sica,等人(2003)Immunity18:849–861。
[0767] 开发了两步测定法,以确定VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig能否抑制预活化的CD4T细胞以及其抑制作用的持久性如何。据显示,VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig融合蛋白的抑制作用在其于活化24小时移除后持续(图9D)。此外,首次接触试验的和预活化CD4+T细胞均能被VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig抑制。参见图9D(i)、9D(iii)和9D(iv)。
[0768] 接下来,分析了VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig对CD4+T细胞细胞因子产生的影响。VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig抑制了从粗纯化的CD4+T细胞培养物产生Th1细胞因
子IL-2以及IFNα(图13A-B)。VISTA(PD-L3)或者VISTA的影响在单独的首次接触试
验的(CD25-CD44低CD62Lhi)和记忆(CD25-CD44hiCD62L低)CD4+T细胞群中进行了进
一步测试。据显示,记忆CD4+T细胞是CD4+T细胞小室内细胞因子产生的主要来源,而
VISTA(PD-L3)或者VISTA可抑制这种产生(图13C-D)。还显示了VISTA(PD-L3)或者VISTA对CD8+T细胞中IFNα产生具有类似的抑制作用(图13E)。VISTA(PD-L3)或VISTA对CD4+
和CD8+T细胞产生细胞因子的这种抑制作用与VISTA(PD-L3)或VISTA是下调免疫应答的
抑制性配体的假设一致。
[0769] 接下来,研究被设计来确定能够克服VISTA(PD-L3)或VISTA的抑制作用的因子。鉴于VISTA(PD-L3)或者VISTA抑制了IL-2产生,并且IL-2对T细胞存活和增殖至关重要,我们假设IL-2可能避开VISTA(PD-L3)或VISTA的抑制活性。如在图14A中所示,外源性
IL-2但非IL-15、IL-7或IL-23部分逆转了VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig对细胞增殖的抑
制作用。通过高水平IL-2的不完全补救表明,VISTA(PD-L3)或VISTA信号传导比单纯的IL-2产生靶向了更宽的T细胞活化途径。在另一方面,通过抗CD28激动性抗体提供的强效共刺激完全逆转了VISTA(PD-L3)或者VISTA-Ig介导的抑制(图14B),而中等水平的共刺激仍受到VISTA(PD-L3)或VISTA信号传导的抑制(图14C)。此结果表明,VISTA(PD-L3)
或者VISTA介导的免疫抑制将在较弱的炎症条件下更有效,但必然会被强烈的正共刺激信号推翻。就这一点而言,VISTA(PD-L3)或VISTA与其它抑制性B7家族配体例如PD-L1和
B7-H4都共有这一特征。Sica,等人(2003)Immunity18:849–861;Carter,等人(2002)Eur J Immunol.32:634–643。
[0770] 除了VISTA(PD-L3)或VISTA-Ig融合蛋白外,还有必要确认在APC上表达的VISTA(PD-L3)或VISTA能否抑制APC与T细胞之间同种相互作用期间的抗原特异性T细
胞活化。为此,通过在稳定表达MHCII和B7-2分子的人工抗原呈递细胞系(CHO-APC)中的逆转录病毒转导过表达了VISTA(PD-L3)或VISTA-RFP或RFP对照蛋白。Latchman,等人
(2001),Nat Immunol 2:261–268。在CHO中表达VISTA(PD-L3)或VISTA的一个问题在
于,大部分VISTA(PD-L3)或VISTA未能定位到细胞表面,这可能是由于对VISTA(PD-L3)或VISTA表面定位缺乏支持的陌生环境所致。虽然在VISTA(PD-L3)或VISTA的胞质尾部上不存在表明调节模式的明确基序,但该尾部可能在其细胞内定位中发挥作用。因此,设计了无尾的VISTA(PD-L3)或VISTA突变体,并发现其成功定位到CHO细胞表面。
[0771] 为了刺激T细胞反应,在抗原性OVA肽存在的情况下,将CHO-VISTA(PD-L3)或VISTA或CHO-RFP细胞与DO11.10CD4+T细胞一起温育。如图15A-D所示,CHO-VISTA(PD-L3)或VISTA比CHO-RFP细胞诱导了较少的DO11.10细胞增殖。该抑制作用在较低的肽浓度下更加显著,与较强的刺激信号将会克服VISTA(PD-L3)或VISTA的抑制影响的想法一致。
[0772] 此外,确认了全长VISTA(PD-L3)或VISTA对天然APC的抑制作用。体外培养的骨髓源性树突状细胞(BMDC)不表达高水平的VISTA(PD-L3)或VISTA(图16)。通过在10天培养期中的逆转录病毒转导在BMDC中表达了VISTA(PD-L3)或VISTA-RFP或RFP。将转导
的细胞基于RFP表达分选均匀。VISTA(PD-L3)或VISTA在转导DC上的表达水平通过用抗
VISTA(PD-L3)或VISTA单克隆抗体染色而进行了估计,并发现与新分离的腹腔巨噬细胞上的水平相似,因此在生理表达范围内(图16)。随后将分选的BMDC在OVA肽存在的情况下用于刺激OVA特异性转基因CD4+T细胞(OTII)(图15D)。VISTA(PD-L3)或VISTA在BMDC
上的表达抑制了同种CD4+T细胞增殖反应。该结果与之前使用VISTA(PD-L3)或VISTA-Ig融合蛋白以及CHO-APC细胞的数据一致,从而表明VISTA(PD-L3)或VISTA可抑制T细胞介导的免疫反应。
[0773] 实施例4
[0774] 在多发性硬化动物模型(EAE)中评价抗VISTA(PD-L3)或VISTA抗体
[0775] 由于αVISTA(PD-L3)或VISTA单克隆抗体在体内似乎会抑制T细胞应答,因此测试了αVISTA(PD-L3)或VISTA以评价其是否能抑制T细胞介导的自身免疫疾病。使用实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)模型,测定αPDL-L3单克隆抗体对炎性疾病的功能影响。EAE是广泛使用的人自身免疫疾病多发性硬化的鼠模型。EAE可通过佐剂中的髓鞘抗原免疫或通过髓鞘特异性T细胞过继转移而诱导,其导致各种效应T细胞和B细胞以及巨噬细胞的炎性浸润以及中枢神经系统的髓鞘脱失。
[0776] 在被动EAE模型中对αPDL-L3单克隆抗体进行测试以避免诱导因注射大量作为外源抗原的单克隆抗体的过敏反应。在该过继转移EAE模型中,将供体SJL小鼠用CFA和PLP肽免疫。在第10天,分离了引流淋巴结中的总淋巴细胞,并用PLP肽、IL-23(20ng/ml)和抗IFNγ(10μg/ml)体外培养4天。随后纯化扩增后的CD4T细胞,过继转移至首次接触试验的受体小鼠。该分析表明,αPDL-L3单克隆抗体延迟了疾病发作,以及减轻了疾病严重性,从而大大偏移了疾病进展曲线(A,Bure 17)。此外,其在大百分比的小鼠中降低了严重性,并大大提高了存活率,从约22%至超过75%。这证实了αPDL-L3单克隆抗体在EAE中的活性与体外数据一致,并证实了使用该试剂在各种炎性疾病中作为新型免疫调节试剂的用途。
[0777] 实施例5
[0778] VISTA-IGG2A在活性EAE小鼠中的疗效
[0779] 评价如先前实施例中所述产生的具有活性EAE的小鼠,以评估VISTA融合多肽用于治疗多发性硬化的假定功效。在这些用PBS(对照)、100微克对照IgG2a多肽、300微克对照IgG2a多肽、100微克mVISTA IgG2a多肽、300微克mVISTA IgG2a多肽处理的6只EAE小鼠的实验组(如图42中评分所示的)中,mVISTA-Ig处理的小鼠在两个测试剂量(p=0.0051和0.0043,在更低和更高的剂量上)上均具显著的和统计学上显著的疗效。
[0780] 我们还进行了实验,分析VISTA在EAE中对T细胞命运和功能的作用。我们想评价VISTA是否会改变病原性致脑炎T细胞的发育、克隆性T细胞扩增、T细胞极性、寿命以及Teff向Treg的转化。我们研究了VISTA阻断在EAE中对T细胞命运的影响。与较高的疾病评分一致,在病程结束时对CNS的分析确认了在13F3(αVISTA)处理组中明显更多的产生IL17A的CD4+T细胞浸润(从0.66%至11%)。
[0781] 实施例6
[0782] VISTA-IG用于狼疮的预防的评价
[0783] 对于预防研究,从8周龄,每隔一日利用PBS、150微克对照-IgG2a或mVISTA-IgG2a处理NZBWF1雌性小鼠。每周就体重减轻和蛋白尿监测疾病严重度。如图43A和B中显示的,数据显示为+/_SEM的平均值。测定对照IgG2a与mVISTA-IhGg2a之间的统计显著性。P值经测定为0.0027(通过不成对Mann Whitney检验),这表明VISTA融合蛋
白相对于对照防止SLE的发作。
[0784] 实施例7
[0785] VISTA-IG促进狼疮的存活
[0786] 如图44A和B中进一步显示的,当8周时,每隔一日向NZBWF1雌性小鼠施用PBS、150微克对照-IgG2a或mVISTA-IgG2a,VISTA-Ig处理的小鼠具有更轻的疾病严重度,如通过减少的蛋白尿证明的。数据再次显示为平均水平+/-SEM,并且代表一个实验。利用不成对的MannWhitnety检验,通过p值测定的统计显著性显示为0.0009。$$b中的存活曲线的结果和44A中的蛋白尿数据表明VISTA-Ig多肽可增强狼疮患者的存活,以及减轻或防止其中的肾损伤。
[0787] 实施例8
[0788] VISTA在EAE模型中的作用的评价
[0789] 因为αVISTA(PD-L3)或VISTA单克隆在体内表现抑制T细胞反应,因此测试αVISTA(PD-L3)或VISTA以评价其是否可抑制T细胞介导的自身免疫疾病。使用实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)模型,测定αPDL-L3单克隆抗体对炎性疾病的功能影响。EAE是广泛使用的人自身免疫疾病多发性硬化的鼠模型。可通过利用佐剂中的髓磷脂抗原的免疫或通过髓灰脂特异性T细胞的过继转移诱发EAE,其导致各种效应T细胞和B细胞以及巨噬细胞的炎性浸润和中枢神经系统的髓鞘脱失。
[0790] 实施例9
[0791] VISTA在CNS中的表达
[0792] 还实现了VISTA在CNS中的表达。这些测定揭示了,在患病小鼠中,VISTA表达在CD11b+细胞(图22)上显著降低(从76%至33%),与VISTA丧失可能会增强炎症的假设一致。当我们将本文中的炎症骨髓细胞与表达极高水平VISTA的肿瘤中的MDSC进行对比时,这一现象引人关注并可能在功能上具有重要意义。据报道,EAE小鼠在脾脏中具有提高数量的髓源性抑制细胞(CD11b+Ly-6Chigh MDSC),其对T细胞活化具有强抑制性并可缓和疾病32。我们的数据强烈支持VISTA可在EAE的骨髓介导的抑制中发挥作用。
[0793] 实施例10
[0794] VISTA在EAE中对T细胞的命运和功能的影响
[0795] 我们还进行了实验,分析VISTA在EAE中对T细胞命运和功能的作用。我们想评价VISTA是否会改变病原性致脑炎T细胞的发育、克隆性T细胞扩增、T细胞极性、寿命以及Teff向Treg的转化。我们研究了VISTA阻断在EAE中对T细胞命运的影响。与较高的疾病评分一致,在病程结束时对CNS的分析确认了在13F3(αVISTA)处理组中明显更多的产生IL17A的CD4+T细胞浸润(从0.66%至11%)。
[0796] 实施例11
[0797] VISTA(PD-L3)或VISTA转基因和敲除小鼠
[0798] 使用胚胎的慢病毒感染,产生了四只泛表达VISTA(PD-L3)或VISTA的转基因小鼠。这些小鼠在人延伸因子1启动子的控制下表达全长VISTA(PD-L3)或VISTA。这
些小鼠使用慢病毒载体pWPT来产生。与其它PD-L1家族成员相似(Appay,等人(2002)
J.Immunol.168:5954–8),预期VISTA(PD-L3)或VISTA在体内将作为负调控因子发挥作用而在体外则起着共刺激αCD3T细胞增殖的功能。在这一方面,预计这些小鼠会自然发生自身免疫,并评价了在VISTA(PD-L3)或VISTA转基因小鼠中的体内免疫反应(即,体液免疫应答、T细胞启动等)以评估系统性自身免疫疾病发展。
[0799] 对于敲除小鼠,将VISTA(PD-L3)或VISTA通过同源重组而灭活。含全长VISTA(PD-L3)或VISTA序列 的BAC克隆购 自 (Carlsbad,CA)。
VISTA(PD-L3)或VISTA靶向载体通过将位于VISTA(PD-L3)或VISTA基因的第二外显子
5’侧的1.6kb片段插入新霉素基因上游,以及将位于VISTA(PD-L3)或VISTA基因的第
三外显子3’侧的5kb片段插入新霉素基因下游而产生。将B6源性胚胎干(ES)细胞用
VISTA(PD-L3)或VISTA靶向载体进行电穿孔,并选择重组克隆。然后将所选的克隆注射进C57BL/6胚泡,将所得的嵌合雄性子代与FLP剔除小鼠交配以移除新霉素盒。通过基因组DNA的PCR确定靶向的等位基因在子代中的传递。第二和第三外显子包含VISTA(PD-L3)或VISTA结构域,因此,所得的小鼠只具有灭活形式的VISTA(PD-L3)或VISTA分子。
[0800] VISTA(PD-L3)或VISTA缺陷小鼠的总体免疫能力像其它PD-L-/-小鼠一样进行测定,包括评价T细胞对抗原的反应、体液免疫原反应、明显的自身免疫(例如,系统性红斑狼疮、炎性肠病)以及对诱导的自身免疫疾病(实验性自身免疫性脑脊髓炎)增加的易感性(Chen(2004)同上)。
[0801] 获得大体上如上所述产生的VISTA-/-小鼠,评估它们的表型和免疫功能。在表型上,观察到这些小鼠在肺、肝和胰腺中具有淋巴细胞性浸润的增加。同样地这些小鼠在它们的肺和脾中具有滤泡增生。此外,它们还在它们的胃中具有嗜中性粒细胞浸润。相反地,它们的肾、肾上腺、食管、小肠和结肠未显示与正常动物的可觉察的差异。
[0802] 在免疫学上,这些小鼠具有增强的对EAE的易感性,以及在雌性中增加的IgG自身抗体产量(图45和图46)。同样地,这些小鼠还显示了相对于对照动物增加的髓细胞产生(图47)。这些小鼠还显示炎症表型和具有增加的CD4+和CD8+T细胞数量,并且表达升高的或改变的水平的细胞因子和其它多肽例如嗜酸细胞活化趋化因子、IP-10、MCP-1、M1G、γ干扰素、IL-17F和TNFα(图48)。
[0803] 实施例12
[0804] VISTA(PD-L3)或VISTA特异性抗体在胶原诱导型关节炎动物模型
[0805] 中测试
[0806] 将雄性DBA/1J小鼠用100μl在CFA中含100μg鸡II型胶原(C-II)的乳液(结核分枝杆菌3.5mg/ml)在尾根部进行免疫,并在免疫后21天用100μg水性C-II经IP进
行加强。各治疗组的小鼠(n=6)如所示分别为未处理(NT-黑色圆形)、注射300μg仓鼠IgG(Ham Ig-黑色方形)或注射300μg单克隆抗体“7c9”(红色三角形)或“13F3”(绿色三角形)。每2天进行一次注射。在指定的天数以0-4的量表对每只小鼠各爪子的关节肿胀情况进行评分。所示的关节评分为各处理组中小鼠所有爪子的总分除以该组中的小鼠只数。
[0807] 实施例13
[0808] 特异性VISTA单克隆抗体阻断VISTA在体外增强T细胞反应
[0809] 鉴定了中和VISTA介导的抑制的VISTA特异性单克隆抗体(13F3)(图18)。从首hi
次接触试验的小鼠中纯化了CD11b 骨髓APC以在13F3存在或不存在的情况下刺激OT-II
+ hi
转基因CD4T细胞。与其中和作用一致,13F3增强了CD11b 骨髓细胞刺激的T细胞增殖,所述骨髓细胞显示出表达高水平的VISTA。
[0810] 实施例14
[0811] 抗VISTA增强抗肿瘤免疫
[0812] 由于抗VISTA增强T细胞活化的能力,评估了抗VISTA是否会增强对免疫原性肿瘤的保护性免疫反应。我们具有丰富经验的模型为膀胱肿瘤MB49。MB49表达雄性抗原,因此其在雌性小鼠中的免疫原性温和,然而,如果无免疫干预其将生长并杀死雌性小鼠。为了测试αVISTA治疗的疗效,向雌性小鼠皮下(sq)施用MB49肿瘤细胞并用αVISTA处理。在之后的数天内,测量肿瘤大小直到必须对小鼠实施无痛致死。图19显示,抗VISTA治疗大大减慢了肿瘤生长。这是由于抗VISTA增强细胞介导的免疫(CMI)反应的能力所致。
[0813] 实施例15
[0814] 在4个小鼠肿瘤模型中抗VISTA对肿瘤退缩的影响
[0815] 在免疫原性膀胱癌肿瘤MB49中的实验已表明使用单克隆抗体13F3中和VISTA可避免宿主的肿瘤生长。数据表明,VISTA在肿瘤微环境中具有相当强的负免疫调节作用,因为其极高的MDSC表达。调查抗小鼠VISTA对免疫原性(MB49)以及高非免疫原性(B16)肿瘤模型生长的影响的研究将进一步确认αVISTA治疗的疗效、阐明作用机制以及提供选择最佳剂量和时间的基础。每个肿瘤模型的基本原理在下面详述。
[0816] 表3
[0817]
[0818] 雌性小鼠中的MB49:我们已经在该鼠模型中展示了功效。该模型中的MDSC还表达提高水平的VISTA。在该模型中,由于存在H-Y抗原,因此MB49肿瘤的免疫原性温和。由于我们知道抗VISTA治疗是有效的,因此将该模型用作“阳性”对照以确定抗VISTA治疗的剂量(1-100μg/小鼠;和时间(肿瘤接种的天数,或肿瘤后4、7、10天;治疗性干预)。
[0819] 雄性小鼠中的MB49:使用在雌性小鼠中有效的剂量和时间,确定雄性小鼠(其中肿瘤的免疫原性较弱)中抗VISTA治疗的疗效。
[0820] B16黑素瘤:抗CTLA-4单克隆抗体在该模型中显示出高度有效,并代表非免疫原性肿瘤,其中小鼠模型可用于预测在人体中的成功。剂量方案和时间将类似于在MB49模型中表现得有效的那些。
[0821] ID8卵巢癌:在该模型中,已表明VISTA表达在MDSC上极高。将具有ID8肿瘤的小鼠用αVISTA在肿瘤接种开始时或在接种后第5、15、25天时进行处理。
[0822] 方法:将B6WT小鼠用于确定抗VISTA治疗以缓解所述的所有鼠肿瘤模型的最佳剂量和时间。将使用的模型列于表3中。
[0823] 该剂量和时间测定的读出为肿瘤生长动力学。对于MB49和B16研究,通过皮内(i.d.)接种完成了所有肿瘤研究,并因此可容易地测量肿瘤大小。使用游标卡尺每2-3天获取肿瘤测量值。在这些模型的每一个中,将测试抗VISTA或对照抗体对其减缓肿瘤生长或利于肿瘤退缩的能力的影响。使用荧光素酶转导的ID8以及采用IVIS工作站的全身成像监测了ID8的生长。此外,还将测定宿主存活。
[0824] 将关于肿瘤生长的数据表示为平均肿瘤体积±SEM,将通过双尾ANOVA分析组间差异。低于0.05的概率(p)值被视为具有统计意义上的显著性。使用Kaplan-Meier方法分析存活数据,并将Wilcoxon秩检验和对数秩检验用于确认组间存活差异的显著性。在B16模型中,测定发展白癜风的小鼠的频率。
[0825] 使用这些方法,在多个非免疫原性肿瘤模型中,与用对照ab处理的小鼠相比,在用抗VISTA单克隆抗体处理的小鼠中获得了减缓的肿瘤生长和/或肿瘤退缩。已表明,抗VISTA治疗在免疫原性肿瘤模型中延迟了肿瘤生长。由于这些肿瘤模型的每一个都具有其自身特定的生长动力学,以及在使肿瘤生长及抑制免疫方面对VISTA的预期依赖性,将在肿瘤接种开始时或之后的多个时间向小鼠施用单克隆抗体。另外,测试至少3种不同浓度的抗VISTA单克隆抗体以确定对治疗有益的最佳剂量。
[0826] 如图20A-E中所述,VISTA单克隆抗体治疗在所有这4种肿瘤模型中都减缓了肿瘤生长,其中将小鼠用(A)MB49、(B)MCA105、(C)EG7肿瘤细胞皮下(sq)接种或(D)利用ID8-荧光素酶肿瘤细胞的腹膜内注射(ip)接种,并从第+1天开始每隔一天用VISTA单克隆抗体13F3治疗(300μg)。监测了皮下肿瘤生长。对于ID8荧光素酶肿瘤,在第30天用Xenogen IVIS对小鼠成像。(E)还测定了具有肿瘤的小鼠中骨髓白细胞上的VISTA表
达。分析了引流淋巴结和肿瘤组织(腹水)的VISTA表达。这些发现表明在MDSC上表达
的VISTA是干扰保护性抗肿瘤免疫发展的主要抑制分子,并且αVISTA可减弱此抑制活性,从而允许免疫干预以及减缓肿瘤生长。这些发现还支持自身免性疫疾病中骨髓细胞上的VISTA在调节炎症程度方面发挥着关键功能的结论。
[0827] 实施例16
[0828] 可用于治疗自身免疫的寡聚VISTA和VISTA融合蛋白的合成
[0829] 可溶性VISTA-Ig在体外不具抑制性,其与细胞的结合也不能容易地检测。相比之下,结合到塑料的该分子具有强抑制性。此外,使用VISTA-Ig的体内研究未表现出明显的活性。对于这些研究,产生的VISTA-Ig在CH2-CH3结构域具有突变从而阻止FcR结合,并因此在体内不嗜细胞。最近的研究已表明,四聚PD-L1的结合力是单体PD-L126至PD-1的-8100倍(Kd 6X10 M),以及表明可容易地检测与细胞的结合。未对四聚PD-L1进行体内测试,但体外测试表明其通过天然PD-L1阻断功能性抑制。使用相似的方法,制备了将靶向VISTA途径并在体外和体内引起强效免疫抑制活性的寡聚物。
[0830] 使用VISTA的单体胞外域或其片段(例如,长度为至少50、75、100、125、150、175或200个氨基酸)构建了此类寡聚物,将其胞外域或片段用作寡聚物的构件块。在这些方法中,本发明人利用研究成熟的MHC四聚体技术。在这些方法中,将VISTA胞外域构建体或片段连接至多种寡聚结构域(本文中所鉴定的)的N端,以便产生一系列价态从二价到七价的VISTA复合物。
[0831] 因此,基于指导二聚、三聚、四聚、五聚和七聚组装分子的稳定形成的高亲和力卷曲螺旋结构域,产生了一系列非共价的寡聚物。这些寡聚物构建体在宿主细胞(例如,大肠杆菌(E.coli))中表达。当在大肠杆菌中实现表达时,然后使用标准实验室方案将表达的寡聚物再折叠以及从包涵体中纯化。该方法已常规地产生了用于生物学和结构分析的高质量材料,包括MHC肽复合物以及三聚GITRL66。分离的寡聚蛋白然后通过SDS-PAGE、分析型凝胶过滤、分析型超速离心以及质谱技术进行评估。这些质量控制措施确保获得均匀的充分表征的材料,以用于体外和体内研究。这些构建体的平行组织产生价态等于寡聚状态的分子,因为每个单独的VISTA复合物都被定为有成效地与结合细胞表面的VISTA受体相互作用。上述构建体具有极高的稳定性和寡聚状态的同质性。(非共价卷曲螺旋寡聚化结构域通常表现出超过100℃的熔融温度,表现出95℃熔融温度的七聚体序列除外。
[0832] 此外,将嗜细胞或不嗜细胞的二聚VISTA-Ig四聚化。将框内VISTA与IgG1Fc(野生型IgG1以及现有的非FcR结合型IgG1两者)的Fc融合构建体用N端BirA位点修饰以用于酶生物素化,并克隆进pIRES2-EGFP载体。酶生物素化将允许特定的单残基修饰以及在生物素多聚化时取向。此方法已用于产生多种Ig融合蛋白,包括B7-1、PD-L1、PD-L2和TIM-3。然后将表达的蛋白在体外酶生物素化、通过体积排阻HPLC纯化并使用PE-亲和素四聚化。在体内评估嗜细胞或不嗜细胞的所得四聚体。
[0833] 这些工程化多聚体VISTA肽可用于治疗自身免疫性和其它病症,其中在治疗学上保证对VISTA途径和免疫抑制的干预。
[0834] 实施例17
[0835] 用于诱导免疫抑制的VISTA腺病毒载体
[0836] 使用重组腺相关病毒(AAV)的基因转移在基因疗法领域取得了巨大的技术进展。具体地,PD-L1基因或者CTLA4-Ig和CD40-Ig的AAV介导的基因送递已在狼疮ENREF_69
和心脏移植的自身免疫疾病模型中取得了疗效。这些模型将用于递送全长VISTA或寡聚VISTA胞外域,并在EAE模型中评价它们的疗效。使用Adeno-XTM表达系统(Clontech)按照厂商说明产生表达全长鼠VISTA或寡聚VISTA胞外域的重组腺病毒载体。简而言之,在人巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下将VISTA克隆到删除E1和E3的、基于pAdDEST的表
达载体。随后从细胞裂解物中纯化表达VISTA和对照lacZ的腺病毒。对于VISTA的全身
性过表达,在通过免疫诱导疾病前或诱导后短时间内或在疾病发作后,将腺病毒通过尾静
9
脉注射(1x10个噬斑形成单位[Pfu])来给小鼠施用。对照小鼠将接受100μl PBS。在
SJL小鼠和C57BL/6小鼠两者中监测疾病发展和变化,其表现出不同的疾病进展模式,并且其代表了两种不同形式的人MS患者的临床表现。
[0837] 实施例18
[0838] 使用工程化蛋白和腺病毒载体的功能性研究
[0839] 还向小鼠施用(5-100μg蛋白/小鼠x每周3次)工程化VISTA和/或腺病毒载体。施用后,测定T细胞扩增、分化以及EAE发展。
[0840] 实施例19
[0841] 关于VISTA的结构研究以及测定VISTA功能的分子决定子
[0842] 组织化信号传导复合体的亲和力、特异性、寡聚状态以及形成和定位是促进免疫功能的关键因素。所有这些特征都将影响信号传导和免疫调节,因为受体-配体胞外域的组织化直接控制非共价相关胞质信号传导和支架分子的募集、组织和功能。使用包括细菌、昆虫和哺乳动物表达系统的技术以及高通量结晶和结构测定方法测定VISTA的高分辨率晶体结构。为了验证晶体学观察到的二硫键模式,我们将采用高分辨率质谱,其使用的方法已成功支持我们已公开的TIM-3和人DcR359研究。基于这些结构结果,设计了一系列具有改变的寡聚物特性的突变体,以及在VISTA IgV结构域的任何扰动区附近的突变体。这些突变体蛋白将提供研究VISTA功能的另外直接机制,并且应当可用于治疗学,其中免疫抑制是所需的,例如本文鉴定的自身免疫、过敏性和炎性疾病。这些突变体,尤其是寡聚物在体外系统中进行测试,并在动物自身免疫和炎性疾病模型中进行评估,以评估对疾病进展、疾病缓解或在避免动物发展自身免疫或炎性病症中的免疫抑制作用。
[0843] 这些寡聚VISTA蛋白将活化VISTA途径并用作自身免疫中免疫干预的靶标。该干预将抑制免疫,并对自身免疫疾病以及其中需要自身免疫抑制的其它病症发挥治疗有益效果。这通过在不同的自身免疫和炎症模型(例如EAE和胶原诱导型关节炎动物模型)中施用寡聚化VISTA蛋白来实现。此外,如上所述,构建了过表达全长VISTA或VISTA寡聚物的腺病毒载体,并在体内进行了测试。这些研究将确认VISTA寡聚物的免疫抑制作用。
[0844] 实施例20
[0845] 使用条件性过表达VISTA转基因小鼠品系(VISTA转基因小鼠品系:R26STOPFLVISTA(VISTA))的实验
[0846] 已使在loxP侧翼STOP盒之后包含VISTA的全长cDNA的靶向构建体靶向了泛表达的ROSA26基因座。生出多只被正确靶向的R26StopFL/-VISTA幼崽,并繁殖为CMV-Cre剔除品系60。VISTA x CMV-cre中的初步数据确认了GFP和提高的VISTA表达。关于这些小鼠免疫状态(T细胞对抗原的反应、抗体滴度等)的研究将确认受抑制的表型。将VISTA品系与CD4-cre、CD11c-cre和Lys-Cre杂交以确定VISTA表达的谱系位置是否会影响抑制。还确定了T细胞的表型和功能,以及确定VISTA的过表达是否会导致Treg的产生。在这些研究中,将获自OVA免疫cre x VISTA品系的Treg过继转移到WT宿主,以确定在过表达的VISTA存在时抗原免疫是否诱导抗原特异性Treg。这应当确认VISTA是否影响Treg分化。
[0847] 此外,在EAE模型中进行了研究,借此评价在疾病发展方面VISTA蛋白对不同谱系(通过与CD4-、CD11c-、Lys-cre杂交)的影响。假设疾病可通过VISTA突变体的谱系限制性表达而抑制,或在CMV x VISTA突变体中,疾病发展的暂时控制还使用Cre-ERT2x VISTAη。通过施用他莫昔芬,我们可在疾病开始前、疾病开始时或疾病最严重时诱导VISTA的表达,以确定VISTA是否会影响免疫的诱导和/或效应期。使用BM嵌合体小鼠,可将VISTA的临时限制性过表达限制到造血室。为了认识对过表达VISTA的时间窗口的控制,从遗传学上打开VISTA,然后通过施用抗VISTA单克隆抗体从血清学上关闭。这些研究将确定VISTA必须发挥控制自身免疫疾病发展和进展之作用的位置和时间。
[0848] 实施例21
[0849] 抗VISTA抗体对CD40/TLR激动剂疫苗的作用
[0850] 如图21中所示,进行了实验,测定抗VISTA抗体对疫苗疗效的作用。这些结果表明抗VISTA增强了CD40/TLR疫苗的疗效。将C57BL/6小鼠用1X105个转移性B16.F10黑素瘤细胞皮下攻击。四天后,将小鼠用100μg的肿瘤相关抗原ΔV,100μgαCD40FGK45(CD40激动性抗体)以及100μg S-27609(TLR7激动剂)在有或无抗VISTA(200μg x 3/周)的
情况下进行疫苗接种。通过游标卡尺测量而监测肿瘤生长。
[0851] 实施例22
[0852] 表达谱分析
[0853] 为了方便与已建立的Treg细胞表达谱进行比较,采用了标准生长和活化条件(McHugh,等人(2002)同上)。简而言之,将新分离的Treg细胞(约96%阳性)以106个
/mL接种到24孔板中补充了10%胎牛血清和100单位IL-2的完整RPMI培养基中,所述平
板用含或不含抗GITR(DTA-1)的抗CD3预包被(Shimizu,等人(2002)同上)。将细胞在
37℃培养0和12小时,纯化RNA,随后使用 小鼠基因组A430寡核苷酸芯
片进行了分析。
[0854] 通过比较获自静息或活化CD4+CD25+T细胞组的数据,发现基因表达模式与本领域中已建立的那些相似(Gavin,等人(2002)同上;McHugh,等人(2002)同上)。为了鉴定通过GIRT信号传导调节的基因,在具有或不具有抗GITR处理的不同细胞群之间行了比较。编译了已知以及未知基因的列表,包括以前未表征的VISTA和Treg-sTNF。
[0855] 实施例23
[0856] VISTA的分子克隆、逆转录病毒的产生以及细胞的逆转录病毒转导
[0857] 从纯化的鼠CD4+T细胞克隆全长VISTA。使用Qiagen RNAmini试剂盒从CD4+T细胞分离总RNA。使用Bio-Rad iScriptTM cDNA合成试剂盒产生cDNA。扩增全长VISTA,将其克隆逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP的ECorI–XhoI位点(在所述载体中IRES-GFP片段被RFP替代)(Zhang&Ren(1998)Blood 92:3829–3840),从而导致VISTA融合蛋白融合至RFP的N-末端。通过VISTA-RFP逆转录病毒载体与嗜性逆转录病毒载体pCL-Eco(IMGENEX Corp.)一起的瞬时转染,在HEK293T细胞中产生无辅助因子的逆转录病毒。在8μg/ml聚凝胺(Sigma)存在的情况下,在RT以2000rpm通过离心感染45分钟,进行鼠T细胞系EL4
细胞或骨髓源性DC的逆转录病毒转导。
[0858] 实施例24
[0859] VISTA-Ig融合蛋白的产生
[0860] 扩增VISTA的胞外域(氨基酸32-190)并克隆进亲本载体CDM7B的SpeI-BamHI位点。Hollenbaugh,等人(1995)J Immunol Methods 188:1–7。此载体包含人IgG1的恒定区和铰链区的突变形式,其与Fc受体的结合大大降低。将所得的载体CDM7B-VISTA用DHFR表达载体pSV-dhfr(McIvor&Simonsen(1990)Nucleic Acids Res 18:7025–7032)共转染进CHO(dhfr-)细胞系(ATCC#CRL-9096)。在无核苷酸的MEM-α培养基( )
中选择稳定的表达VISTA-Ig的CHO细胞克隆。用0.5–1μM甲氨蝶呤( M9929)
进一步扩增产生了表达高水平的可溶性VISTA-Ig融合蛋白的克隆。将融合蛋白从培养物上清液中用标准蛋白G柱亲和层析进一步纯化。
[0861] 实施例25
[0862] VISTA单克隆抗体的产生
[0863] 将亚美尼亚仓鼠用过表达VISTA-RFP的EL4细胞每周免疫4次,随后用在CFA中乳化的VISTA-Ig融合蛋白加强。加强后四周,将仓鼠再次用可溶性VISTA-Ig融合蛋白加强。最后一次加强后四天,收获仓鼠脾细胞,并使用标准杂交瘤融合技术融合至骨髓瘤细胞系SP2/0–Ag14(ATCC#CRL-1581)。Shulman,等人(1978)Nature 276:269–270。在有限稀释后选择分泌VISTA特异性抗体的杂交瘤克隆,并通过ELISA和流式细胞术两种方法进行筛选。
[0864] 实施例26
[0865] VISTA的抑制活性
[0866] 通过使用体外过表达PD-L1的抗原呈递细胞与CD4+和CD8+T细胞抗原受体转基因T细胞和抗原刺激揭示了PD-L1的抑制活性(Carter,等人(2002)Eur.
J.Immunol.32:634–43)。类似地,将本文公开的表达全长VISTA的慢病毒载体转导进表达II类主要组织相容性复合体(MHC)和I类MHC的细胞系。根据已建立的方法测定TEa Tg
或2C转基因T细胞对空白载体转导的或VISTA转导的抗原呈递细胞所呈递的抗原的反应。
[0867] 实施例27
[0868] 单克隆抗体产生
[0869] VISTA在鼠B细胞系A20中过表达,并将重组细胞系用于免疫亚美尼亚仓鼠。在5次细胞免疫后,用在CFA中乳化的纯化VISTA-Ig融合蛋白对仓鼠进行加强。4周后,用可溶性VISTA-Ig提供最终加强。随后,在第4天,进行仓鼠脾细胞与SP2/0细胞的融合。通过ELISA鉴定了识别VISTA-Ig融合蛋白的16个不同的克隆,以及对在鼠T细胞系EL4上过表达的VISTA但非PD-L1进行染色。其中11个克隆被成功亚克隆和制备,用于评价它们染色细胞和组织上内源性VISTA以及阻断VISTA功能的能力。
[0870] 实施例28
[0871] VISTA-IG缀合物负调节T细胞反应
[0872] 材料和方法
[0873] 小鼠。C57BL/6小鼠、OT-II CD4转基因小鼠和SJL/J小鼠购自JacksonLaboratory。FoxP3-GFP 报 告 小 鼠 如 之 前 所 述 (Fontenot 等 人,2005) 并 由A.Rudensky(University of Washington School of Medicine,Seattle,WA)提供。PD-1KO小鼠由T.Honjo(Kyoto University,Kyoto,Japan;Nishimura,等人1999,2001)提供。
所有动物都养在Dartmouth Medical School的无病原体的笼舍中。所有动物方案都由
Dartmouth College的机构动物护理和使用委员会批准。
[0874] 抗体、细胞系和试剂。抗体α-CD3(2C11)、α-CD28(PV-1)、α-C D4(GK1.5)、α-CD8(53-6.7)、α-CD11b(M1/70)、α-F4/80(BM8)、α-C D11c(N418)、α-NK1.1(PK136)、α-Gr1(RB6-8C5)、α-PD-L1(MIN5)、α-PD-L2(TY25)、α-B7-H3(M3.2D7)和α-B7-H4(188)购自eBioscience。LPS(Sigma-Aldrich)、重组鼠IFN-γ(PeproTech)、人IL-2(PeproTech)和可溶性PD-L1-Ig融合蛋白(R&D Systems)以指定的浓度使用。CF A和鸡卵清蛋白(OVA)购自Sigma-Aldrich。B细胞淋巴瘤细胞系A20(BALB/c来源)获自美国典型培养物保藏中心。
[0875] VISTA的分子克隆、逆转录病毒的产生以及细胞的逆转录病毒转导。从纯化的鼠+ +CD4T细胞克隆全长VISTA。使用RNAmini试剂盒(QIAGEN)从CD4T细胞中分离总RNA。
使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories)产生cDNA。扩增全长VISTA并
克隆进逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP的ECORI-XhoI位点(Zhang和Ren,1998),其中将IRES-GFP片段用RFP替换,从而产生融合到RFP的N端的VISTA的融合蛋白。在HEK293T
细胞中通过VISTA-RFP逆转录病毒载体与亲嗜性包装载体pCL-Eco(Imgenex Corp.)一起的瞬时转染产生无辅助因子的逆转录病毒。通过在8μg/ml凝聚胺(Sigma-Aldrich)存在的情况下在室温以2,000rpm离心感染(spininfection)45分钟,来进行鼠T细胞系EL4细胞或BMDC的逆转录病毒转导。
[0876] VISTA的生物信息学分析。通过BLAST算法(Altschul,等人1990)鉴定在进化上与VISTA Ig-V序列相关的蛋白质。利用mGenTHREADER算法(Lobley,等人2009)鉴定来自蛋白质数据库(Berman,等人2000)的最适合的结构模板。PD-L1(蛋白质数据库登录号
3BIS),最高评分命中之一被选择作为用于比较蛋白质结构建模的模板。使用两个比对法MUSCLE和HHalign(Rai和Fiser,2006;Rai,等人2006),利用MMM服务器构建VISTA的结构模型。从ENSEMBL数据库(Flicek,等人2008)收集36个VISTA直系同源蛋白。分别利
用DALI(Holm和Park,2000)和Clustalw(Larkin,等人2007)计算结构和序列比对,使用ESPript 2.2服务器(Gouet,等人1999)提供所述结构和序列比对。如先前所述(Atkinson,等人2009)构建BLAST配对比较网络,使用Cytoscape(Shannon,等人2003)分析所述BLAST配对比较网络。
[0877] VISTA-Ig融合蛋白的产生。扩增VISTA的胞外域(氨基酸32-190)并克隆进亲本载体CDM7B的SpeI-BamHI位点(Hollenbaugh,等人1995)。此载体包含人IgG1的恒定区和铰链区的突变形式,其与Fc受体的结合大大降低。将所得的载体CDM7B-VISTA用二氢叶-
酸还原酶表达载体pSV-dhfr(McIvor和Simonsen,1990)共转染进中国仓鼠卵巢(dhfr)细胞系(#CRL-9096;美国典型培养物保藏中心)。在无核苷酸的MEM-α培养基(Invitrogen)中选择稳定的表达VISTA-Ig的中国仓鼠卵巢细胞克隆。用0.5–1μM甲氨蝶呤(M9929;
Sigma-Aldrich)进一步扩增产生了表达高水平的可溶性VISTA-Ig融合蛋白的克隆。将融合蛋白从培养物上清液中用标准蛋白G柱亲和层析进一步纯化。
[0878] VISTA单克隆抗体(mAb)的产生。将亚美尼亚仓鼠用过表达VISTA-RFP的EL4细胞,随后用在CFA中乳化的VISTA-Ig融合蛋白加强。加强后4周,将仓鼠再次用可溶性
VISTA-Ig融合蛋白加强。最后一次加强后4天,收获仓鼠脾细胞,并使用标准杂交瘤融合技术(Shulman,等人1978)融合至骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14(#CRL-1581;美国典型培养物保藏中心)。在有限稀释后选择分泌VISTA特异性抗体的杂交瘤克隆,并通过ELISA和流式细胞术两种方法进行筛选。
[0879] RNA和RT-PCR。通过按照厂商说明书,使用 (Invitr ogen)从各种小鼠组织样品或纯化的造血细胞类型收集总RNA。cDN A通过使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories)来制备。使用等量的组织cDNA(10ng)进行RT-PCR反应以扩增全长VISTA。在通过1%琼脂糖凝胶运行后观察PCR产物。
[0880] 流式细胞术和分析。在使用CellQuest软件的FACScan(BD)上进行了流式细胞分析。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)分析了数据。为了定量细胞增殖,分析CFSE分割低的直方图分布,使用Prism 4(Gr aphPad Software,Inc.)将增殖的CFSE 细胞的百分比作图。
[0881] 细胞制备。使用总CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从首次接触试验的+ +小鼠中分离了总CD4T细胞。当指定时,将富集的CD4T细胞流式分选成首次接触试验的
低 – hi hi – 低 +
(CD44 CD25 CD62L )和记忆(CD44 CD25 CD62L )细胞群。对于体外增殖测定,将CD4T
细胞用5μM CFSE(Invitrogen)在37℃标记10分钟,在刺激前洗涤两次。
[0882] 对于A20测定,用100μg/ml丝裂霉素C(1h)预处理A20-RFP或A20-PD-XL细胞+
(20,000),随后将其在OVA肽存在的情况下与CFSE-标记的DO11.10CD4T细胞(100,000)
一起温育。如所指定的,添加对照Ig或13F3单克隆抗体。在72h通过CFSE稀释分析细胞hi
增殖。为了分选CD11b 骨髓APC,使用CD11b磁珠(Miltenyi Biotec)从首次接触实验的+ hi hi –
脾细胞富集CD11b单核细胞。分选、辐射(2,500rad)总CD11b 骨髓APC或CD11b CD11c
hi +
单核细胞和CD11b CD11c骨髓样DC,在OVA肽存在的情况下将其用于刺激OT-II转基因
+
CD4T细胞。如所指定的,添加对照-Ig或13F3单克隆抗体。在72小时测定的最后8小时
过程中通过氚的掺入测量细胞增殖。
[0883] 体外结合平板的T细胞活化测定。在指定的浓度比率下,在抗CD3(克隆2C11)以+及VISTA-Ig或者对照Ig以指定的浓度比率存在的情况下,将纯化的CD4T细胞(100,000
个细胞/孔)在96孔平底板中培养。例如,对于全程滴定,将96孔板用在PBS中与1.25μg/ml(比率2:1)、2.5μg/ml(比率1:1)、5μg/ml(比率1:2)或10μg/ml(比率1:4)VISTA-Ig或对照Ig蛋白一起混合的2.5μg/ml的α-CD3在4℃过夜包被。将孔用PBS洗涤3次,随
+
后添加CD4T细胞。在补充了10%FBS、10mM Hepes、50μMβ-ME和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的完全RPMI 1640培养基中平行培养。当指定时,将100U/ml的人IL-2(PeproTech)或滴定量的α-CD28(克隆PV-1;Bio X Cell)与α-CD3一起包被,以补救VISTA-Ig的抑制性作用。在第3天时分析培养物的CFSE谱,或根据指定的时间过程进行。
[0884] BMDC的培养、逆转录病毒转导以及转基因CD4+T细胞的刺激。如先前所述(Lutz,等人1999;Son,等人2002)产生了BMDC,但作了一些改进。简而言之,在第0天,通过用6
27规针头冲洗从胫骨和股骨分离了BM细胞。红细胞裂解后,将1-2x 10个BM细胞重悬
在1ml含20ng/ml GM-CSF(PeproTech)的完全RPMI 1640培养基中。在8μg/ml凝聚胺
(Sigma-Aldrich)存在的情况下用RFP或者VISTA-RFP逆转录病毒感染细胞。通过在室温下将平板以2,000rpm离心45分钟进行感染。随后,将细胞再培养2小时,之后添加新鲜培养+
基。在第1、3和5天重复类似的感染操作。在第10天收集松散贴壁细胞(90%为CD11c),+ + +
分选CD11cRFP双阳性细胞并用于刺激转基因OT-II转基因CD4 T细胞。对于OT-II T细
胞增殖测定,在滴定量的合成OVA323-339肽(AnaSpec)存在的情况下,将100,000个CFSE-标+ + +
记的OT-II CD4T细胞在具有30,000个分选的RFP或者VISTA-RFP BMDC的96孔圆底板
中进行培养。通过研究CFSE谱在72小时时分析了OT-II T细胞的增殖。
[0885] 肿瘤实验。利用VISTA-RFP或RFP对照对亲代MCA105肿瘤细胞进行逆转录病毒转导,随后基于RFP表达分选所述细胞。对于肿瘤接种,利用1,000,000个受辐照的
MCA105(10,000rad)细胞免疫首次接触实验的C57BL/6小鼠,将所述细胞皮下接种至左胁腹。在第14天,用活MCA105肿瘤细胞攻击接种的小鼠,将所述肿瘤细胞皮下接种至右胁腹
2
中。每2天一次监测肿瘤生长。当肿瘤尺寸达到150mm时,无痛致死小鼠。对于T细胞耗竭,+ +
在活肿瘤细胞攻击前2天,用对于CD4T细胞(克隆GK1.5)和CD8T细胞(克隆53.6.72)
是特异性的单克隆抗体腹膜内(250μg)预处理接种的小鼠,每3-4天重复所述处理,直至
2
实验结束。当肿瘤尺寸达到160mm时,无痛致死小鼠。
[0886] EAE的被动诱导和中枢神经系统浸润CD4+T细胞的表征。对于被动转移EAE,用200μl的包含400μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra和100μg PLP肽的乳液皮下免疫雌性SJL小鼠(6周龄)。在第10天收获引流淋巴结细胞以用于体外刺
激。裂解红细胞。将单细胞悬浮物(10,000,000个/微升)培养于含有10%FBS、50μM2-ME、
1mM谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、1mM非必需氨基酸、20ng/ml IL-23、10ng/ml IL-6、
10ng/ml IL-1β、20μg/ml抗IFN-γ和20μg/ml PLP肽的完全IMDM培养基中。在第4天,收获细胞,使用CD4磁珠(Miltenyi Biotec)纯化活CD4T细胞。将1,500,000–2,000,000个纯化的活CD4T细胞过继转移至首次接触实验的SJL小鼠中以诱导EAE。每3天用非特异性仓鼠对照Ig或400μg VISTA特异性单克隆抗体处理小鼠一次。如下对疾病进行评分:
0,无疾病;1,尾无力或丧失尾调;2,尾无力+后肢麻痹;2.5,单后肢瘫痪;3,双后肢瘫痪;
4,前肢虚弱;5,垂死的。评分达到4时将小鼠无痛致死。
[0887] VISTA的克隆以及序列和结构分析+ +
[0888] 对活化的与静息的鼠CD25CD4天然Treg细胞(nTreg细胞)的 分析表明,基因产物(RIKEN cDNA 4632428N05或4632428N05Rik)的表达具有未知的功能,但与+
Ig超家族具有序列同源性。从CD4T细胞cDNA文库克隆了930bp的基因产物,其与预测的大小和序列相符。电子延伸序列和结构分析预测成熟时309aa的1型跨膜蛋白。其胞外域包含136aa的胞外Ig-V结构域,其连接至23-aa的茎区、21个残基的跨膜片段以及97-aa的胞质结构域(图23A)。4632428N05Rik的胞质尾部不含任何信号传导结构域。基于Ig-V结构域的结构特性及其在本文中显示的免疫抑制功能,将该分子命名为VISTA。
[0889] 通过VISTA Ig-V结构域的BLAST(Altschul,等人1990)序列检索鉴定出B7家族–4的PD-L1为最接近的进化相关蛋白,其具有为10 的边缘显著性e值得分和24%序列同一性。
[0890] VISTA与B7家族成员PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4基于结构的序列比对突出了已知在所有Ig-V结构域蛋白中系统性保守的,并且被认为对于Ig-V折叠的稳定性是非常重要的若干氨基酸(图23C)。实例包括B和Fβ链中形成两个β折叠之间的二硫键的2个半胱氨酸,其为Ig超家族蛋白的标志性特征(图23C)。该多序列比对还揭示了对于VISTA是独特的另外的序列特征。
[0891] 通过RT-PCR分析和流式细胞术进行的VISTA表达实验。将RT-PCR分析用于确定小鼠组织中VISTA的信使RNA表达模式(图3A)。VISTA主要在造血组织(脾脏、胸腺和BM)或具有丰富白细胞浸润的组织(即,肺)上表达。在非造血组织(即,心脏、肾脏、脑和卵巢)中也检测到了弱表达。若干造血细胞类型的分析揭示了VISTA在腹腔巨噬细胞、脾+ + + +
CD11b单核细胞、CD11c DC、CD4T细胞和CD8T细胞上表达,但在B细胞上表达水平较低(图
3B)。此表达模式还与美国国家生物技术信息GNF(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation)基因阵列数据库(符号4632428N05Rik;Su,等人2002)以及美国国家生物技术信息GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(登录号GDS868)高度一致。
[0892] 为了研究蛋白质表达,产生VISTA特异性仓鼠单克隆抗体。特异性通过对过表达VISTA的小鼠EL4T细胞的阳性染色但对过表达PD-L1的EL4细胞的阴性染色来证实。
[0893] 使用α-VISTA单克隆抗体克隆8D8,通过流式细胞术分析造血细胞上的VISTA表+达。Foxp3-GFP敲入报告小鼠用于区分CD4nTreg细胞(Fontenot,等人2005)。在外周淋巴+ +
器官(脾脏和淋巴结)中,在所有CD4T细胞亚群中均观察到了显著的表达(参见总CD4T
- + + +
细胞或Foxp3首次接触试验的T细胞和Foxp3 nTreg细胞,以及记忆CD4 T细胞),而CD8T+ +
细胞表达明显低的表面VISTA量(图3C)。在胸腺中,VISTA表达在CD4CD8双阳性胸腺细
胞上为阴性,在CD4单阳性细胞上较低,在CD8单阳性细胞上可检测。随后,对于脾和腹膜+
细胞(包括F4/80巨噬细胞和骨髓CD11cDC两者)均可观察到高VISTA表达与CD11b标
志物的强关联(图3D和3E)。相反地,B细胞和NK细胞对VISTA表达主要为阴性。小百分
+
比的Gr-1粒细胞也表达VISTA(图3F)。
[0894] 在来自不同淋巴样器官的相同细胞谱系上显示出差异表达模式(图3G)。对于+ 中间
CD4T细胞和CD11b 单核细胞,表达水平遵循肠系膜淋巴结>外周淋巴结和脾脏>腹腔和
hi
血液的模式。此模式对于CD11b 细胞不太明显。该数据表明,某些细胞类型上的VISTA表达可能受细胞成熟度和/或组织微环境的调节。
[0895] 除了新分离的细胞外,还在进行活化以及无活化的体外培养后分析了脾CD4+T细hi +胞、CD11b 单核细胞和CD11c DC细胞上的VISTA表达(图6)。将脾细胞用培养基或用
α-CD3(用于活化T细胞)或用IFN-γ和LPS(用于活化单核细胞和DC)培养24小时后,
分析VISTA以及其它B7家族配体(例如,PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4)的表达。该比较揭示了这些分子之间差别性的表达模式。VISTA表达在体外培养时在所有细胞上均迅速丧+
失,而无论活化状态如何。相反地,PD-L1表达在刺激时在CD4T细胞上、在仅培养基中培养hi +
时在CD11b 单核细胞和CD11c DC上上调,并在面对刺激时进一步增强。PD-L2、B7-H3和B7-H4的表达在所用培养条件下不突出。VISTA表达在体外的丧失与其它B7家族配体相比是独有的,但可能反映了未能模拟组织微环境的非最佳培养条件。
[0896] 为了弄清可如何在体内调节VISTA表达,将CD4TCR转基因小鼠DO11.10用在CFA中乳化的同种抗原鸡卵清蛋白(OVA)免疫。免疫后24小时时,分析引流淋巴结中的细胞的+ +VISTA表达(图7A)。仅用抗原(CFA/OVA)而无佐剂免疫显著增加了CD11bVISTA骨髓细胞
+ +
群,其包含F4/80巨噬细胞与CD11c DC的混合细胞群。与PD-L1和PD-L2的进一步比较揭示出,虽然PD-L1具有最高的组成型表达水平,但VISTA在这样的炎症免疫反应期间受到了最高的上调(图7B)。总而言之,这些数据强烈表明,骨髓APC上VISTA的表达由免疫系统严格调节,其可能有助于在控制免疫反应中的作用。与其在APC上增加的表达相反,VISTA+
表达在免疫后更后的时间点(即,在第48h而非在第24h)上在活化DO11.10CD4T细胞上
减少。
[0897] VISTA信号传导在体外对CD4+和CD8+T细胞反应的功能性影响。产生了VISTA Ig+融合蛋白(VISTA-Ig)以研究VISTA对CD4T细胞反应的调节作用。VISTA-Ig融合蛋白包含融合至人IgG1Fc区的VISTA的胞外域。当固定在微量滴定板上时,VISTA-Ig而非对照Ig抑+ +
制了粗纯化的CD4和CD8 T细胞响应α-CD3刺激而发生的增殖(图9A和9B)。VISTA-Ig
融合蛋白不影响抗CD3抗体吸收至塑料孔,如通过ELISA测定,从而排除了非特异性抑制作用的可能性。直接比较了PD-L1-Ig与VISTA-Ig的抑制作用。当使滴定量的Ig融合蛋白
+
与α-CD3一起吸收至微量滴定板以刺激CD4T细胞时,VISTA-Ig表现出与PD-L1-Ig融合
+
蛋白相似的有效抑制效果。PD-1KO CD4T细胞也被抑制(图9C),从而表明PD-1不是VISTA的受体。
[0898] 由于粗纯化的CD4+T细胞包含各种亚群,因此评价了VISTA-Ig对分选的首次接触- 低 hi - hi 低 +试验的(CD25CD44 CD62L )以及记忆(CD25CD44 CD62L )CD4T细胞亚群的影响。VISTA
抑制两种亚群的增殖,虽然对记忆细胞的效果要弱得多。
[0899] 为了进一步理解VISTA介导的抑制的机制,在T细胞活化后测量了早期TCR活化标志物的表达以及细胞凋亡。与对细胞增殖的负影响一致,存在对早期活化标志物CD69、CD44和CD62L表达的全局性抑制(图12A)。在另一方面,VISTA-Ig融合蛋白未诱导细胞凋亡。在VISTA-Ig存在的情况下,在TCR活化的早期(24小时)和晚期(48小时)均观察
+ -
到了比对照Ig低的细胞凋亡(通过膜联蛋白V7AAD细胞的百分比测定)(图12B)。例如,
在24小时时间点,在总非分类细胞群中,约27%的细胞在VISTA-Ig存在的情况下凋亡,而在对照Ig存在的情况下则有约39%的细胞凋亡。类似地,在活细胞R1分类中的细胞中,在对照Ig存在的情况下约72.6%的细胞变为凋亡,而在VISTA-Ig存在的情况下试验细胞只有约43.5%凋亡。对于48小时时间点也观察到了相似的结果。因此,看来VISTA通过抑制+
早期TCR活化以及抑制细胞分裂而负调节CD4T细胞应答,但对细胞凋亡的直接影响极低。
此抑制机制与B7-H4的类似(Sica,等人2003)。
[0900] 开发了两步测定,以确定VISTA-Ig能否抑制预活化的CD4T细胞以及其抑制作用的持久性如何。VISTA-Ig融合蛋白的抑制作用在其在活化后24小时移除后持续(图
+
9D,ii)。此外,首次接触试验的和预活化的CD4T细胞均能被VISTA-Ig抑制(图9D、i、iii和iv)。
[0901] 随后,分析了VISTA-Ig对CD4+T细胞细胞因子产生的影响。VISTA-Ig抑制了从粗+纯化的CD4T细胞培养物产生Th1细胞因子IL-2以及IFN-γ(图13A和13B)。VISTA的影
– 低 – hi 低 +
响在单独的首次接触试验的(CD25 CD44 CD62Lhi)和记忆(CD25 CD44 CD62L )CD4T细
+ +
胞群中进行了进一步测试。记忆CD4T细胞是CD4T细胞小室内细胞因子产生的主要来源,+
而VISTA可抑制这种产生(图13C和13D)。还显示了VISTA-Ig对CD8T细胞中IFN-γ产
+ +
生具有类似的抑制作用(图13E)。VISTA对CD4和CD8 T细胞产生细胞因子的这种抑制作
用与VISTA是下调T细胞介导的免疫反应的抑制性配体的假设相符。
[0902] 设计了另外的实验以确定能够克服VISTA的抑制作用的因子。鉴于VISTA抑制了IL-2产生,并且IL-2对T细胞存活和增殖至关重要,我们假设IL-2可能避开VISTA的抑制活性。如在图14A中所示,外源性IL-2但非IL-15、IL-7或IL-23部分逆转了VISTA-Ig对细胞增殖的抑制作用。通过高水平IL-2的不完全补救表明,VISTA信号传导比单纯的IL-2产生靶向了更宽的T细胞活化途径。相反地,通过α-CD28激动性抗体提供的强效共刺激完全逆转了VISTA-Ig介导的抑制(图14B),而中等水平的共刺激仍受到VISTA信号传导的抑制(图14C)。就这一点而言,VISTA与其它抑制性B7家族配体例如PD-L1和B7-H4都具有这一特征(Carter,等人2002;Sica,等人2003)。
[0903] 除了VISTA-Ig融合蛋白外,还有必要确认在APC上表达的VISTA能否抑制APC与T细胞同种相互作用期间的抗原特异性T细胞活化。我们已使用两个独立的细胞系统来阐明该问题。首先,通过逆转录病毒转导在B细胞系A20中过表达VISTA-RFP或RFP对照蛋白。通过荧光显微镜术确认VISTA-RFP融合蛋白的正确细胞表面定位。为了刺激T细胞反+
应,将A20-VISTA或A20-RFP细胞与DO11.10CD4T细胞在抗原性OVA肽存在的情况下一起
温育。如图15A和C中所示,A20-VISTA比A20-RFP细胞诱导了较少的DO11.10细胞增殖。
该抑制作用在较低的肽浓度下更加显著,这与较强的刺激信号将会克服VISTA的抑制影响的想法一致。
[0904] 其次,确认了全长VISTA对天然APC的抑制作用。体外培养的BM源性DC(BMDC)不表达高水平的VISTA(图16)。通过在10天培养期中的逆转录病毒转导在BMDC中表达了VISTA-RFP或RFP。将转导的细胞基于RFP表达分选均匀。VISTA在转导DC上的表达水平
通过用抗α-VISTA单克隆抗体染色来进行了估计,并发现与新分离的腹腔巨噬细胞上的水平相似,因此在生理表达范围内(图16)。随后将分选的BMDC在OVA肽存在的情况下用+ +
于刺激OVA特异性转基因CD4T细胞(OT-II)。VISTA在BMDC上的表达抑制了同种CD4T
细胞增殖(图15D)。此结果与之前使用VISTA-Ig融合蛋白或表达VISTA的A20细胞的数
据(图5)一致,从而表明APC上表达的VISTA可抑制T细胞介导的免疫应答。
[0905] 为了验证VISTA表达的体内影响,研究肿瘤细胞上VISTA过表达是否可损害抗肿瘤免疫反应。MCA105(甲基胆蒽105)纤维肉瘤不表达VISTA。通过用VISTA-RFP或RFP对照病毒进行逆转录病毒转导来建立两个MCA105肿瘤品系。因为MCA105肿瘤具有免疫原性,并且在利用经辐照的MCA105细胞预免疫的宿主中可被容易地控制(Mackey,等人1997),所以我们研究肿瘤VISTA表达对这样的保护性免疫的作用。如图24A中显示的,表达VISTA的MCA105在接种的宿主中旺盛生长,然而对照肿瘤不能旺盛生长。为了确认在T细胞介导的抗肿瘤免疫不存在的情况下在肿瘤生长率上无本质差异,将肿瘤接种在其中已使用单克隆+ +
抗体耗竭CD4和CD8 T细胞的接种的动物中。如图24B中所示,在T细胞耗竭后,MCA105RFP和MCA105VISTA肿瘤以相等的速率生长,并且比非T耗竭的宿主快得多。总之,这些数据表明肿瘤细胞上的VISTA表达可干扰宿主的保护性抗肿瘤免疫。
[0906] 特异性单克隆抗体阻断VISTA在体外和体内增强T细胞反应
[0907] 鉴定了在A20-DO11.10测定系统中中和VISTA介导的抑制的VISTA特异性单克隆抗体(13F3)(图25A)。为了进一步确认13F3对T细胞反应的影响,从首次接触试验的小鼠hi +中纯化了CD11b 骨髓APC以在13F3存在或不存在的情况下刺激OT-II转基因CD4 T细胞
hi
(图25B)。与其中和作用一致,13F3增强了CD11b 骨髓细胞刺激的T细胞增殖,所述骨髓hi + hi -
细胞显示出表达高水平的VISTA(图3)。可在CD11b CD11c骨髓DC和CD11b CD11c单核
细胞中看到13F3的相似作用(图25C-D)。
[0908] 随后,在被动转移EAE模型中研究对单克隆抗体阻断VISTA的影响,所述模型是人多发性硬化的小鼠自身免疫炎性疾病模型(Stromnes和Goverman,2006)。通过用蛋白脂质蛋白(PLP)肽主动免疫和过继转移至首次接触实验的小鼠中来在供体小鼠中启动致脑+炎CD4T细胞。为了谨慎地评价α-VISTA加重疾病的能力,将滴定量的活化致脑炎T细胞过继转移至用α-VISTA或对照Ig处理的首次接触实验的宿主中,监测EAE的发展。发现
13F3明显加速疾病发作,以及在最适度以下T细胞转移剂量下加重疾病严重度。到第14天
13F3处理组达到100%发病率,然而利用对照抗体处理的那些小鼠在实验持续时间过程中未达到100%发病率。在整个病程中,在13F3处理组中平均疾病评分显著高于对照组。与较高疾病评分相符,病程结束时中枢神经系统的分析确认了13F3处理组中显著更多的产+
生IL-17A的CD4T细胞浸润。
[0909] 讨论
[0910] VISTA是Ig超家族网络的新成员,其在体外和体内均对T细胞产生免疫抑制活性,并且在控制针对癌症的自身免疫和免疫反应的发展中是重要调节剂。所示数据表明(a)VISTA是Ig超家族的新成员,并包含具有与PD-L1遥远的序列相似性的Ig-V结构域,(b)+当产生为Ig融合蛋白或在人工APC上过表达时,其抑制CD4和CD8T细胞增殖及细胞因子
产生,(c)VISTA在骨髓APC上的表达在体外抑制T细胞反应,(d)在肿瘤细胞上的过表达损害已接种的小鼠的保护性抗肿瘤免疫,和(e)抗体介导的VISTA阻断加速T细胞介导的自身免疫疾病EAE的发展。
[0911] VISTA Ig-V结构域的生物信息学分析表明B7-嗜乳脂蛋白家族成员PD-L1、PD-L2和MOG以及非B7家族CAR和VCBP3是VISTA的最接近的进化相关蛋白(图A、B和C)。然而,一级序列特征的仔细研究表明所有VISTA直系同源物共有独特和保守的序列基序,以及VISTA可能代表Ig超家族的结构和功能上是新的成员。具体地,对于VISTA胞外域是独特的4个不变的半胱氨酸(3个在Ig-V结构域中,一个在茎中)的存在可促成影响其功能
的新的结构特征。鉴于它们的严格不变性,所有4个VISTA特异性半胱氨酸似乎合理地参与二硫键。该观察表明几种可能性,包括4个半胱氨酸(a)形成2个分子内二硫键,(b)在二聚体界面上形成4个分子间二硫键,和(c)形成一个分子内二硫键和2个分子间二硫键。
这些情况的任一种可代表新型二硫键合模式,并且可导致相对于典型的Ig超家族成员独特的三级和/或四级结构。此外,全局序列比较表明VISTA不是Ig超家族内任何已知的官能团的成员。
[0912] VISTA的表达模式还区分VISTA与其它B7家族配体。由于这PD-L1和PD-L2与VISTA之间的较高序列同源性以及它们对T细胞活化的相似抑制性功能,该数据与这两个配体形成鲜明的对比。VISTA的稳态表达选择性地在造血细胞上表达,并且主要在APC(巨+
噬细胞和骨髓DC)和CD4T淋巴细胞上高度表达。在本说明书中,PD-L1广泛地在造血细胞和非造血细胞上表达,然而PD-L2被限制在DC和巨噬细胞上(Keir,等人2006,2008)。虽然PD-L1和PD-L2在体外培养后和活化后在APC上均被上调(Yamazaki,等人2002;Liang,等人2003;Keir,等人2008),但VISTA在骨髓细胞和T细胞上的表达在短期体外培养后丢失,无论是否存在任何刺激(图6)。这样的丢失可能反映淋巴组织微环境在体内维持或调节VISTA表达的必需作用。与该假说相符,即使在稳态,VISTA在不同组织部位差异表达(即,在肠系膜淋巴结比外周淋巴组织更高以及在血液中最低)。我们推测这样的差异表达水平可能反映VISTA在特定组织部位的差异抑制功能。
[0913] VISTA的体内表达在主动免疫反应过程中受到高度调控。TCR转基因小鼠中利用hi佐剂+抗原(OVA/CFA)但非单独的佐剂(CFA)的免疫在引流淋巴结内诱导了一组VISTA 骨髓APC(图7)。对抗原的需要表明APC上VISTA的上调可能是T细胞活化的结果。相较于
+
VISTA,PD-L1和PD-L2还响应免疫在骨髓APC上被上调,但程度低得多。我们推测VISTA骨髓APC的诱导构成了减弱正在进行的免疫反应的自我调控机制。与该假说相符,当受到表达VISTA的骨髓APC刺激时,中和VISTA单克隆抗体在体外增强T细胞增殖反应(图
25A-D)。
[0914] 与髓系细胞上的表达模式相反,VISTA表达在体内活化CD4+T细胞上减少。该结果表明在体内CD4T细胞上的VISTA表达可受其活化状态以及主动免疫反应过程中细胞因子微环境调控。这样的下调是独特的,并且对于其它抑制性B7家族配体例如PD-L1、PD-L2和+B7-H4未看到该下调。虽然CD4T细胞上VISTA表达的功能意义目前还不清楚,但在将来的研究中调查在它们的同种相互作用过程中从T细胞至APC的反向信号传导的可能性。
[0915] 通过使用VISTA-Ig融合蛋白、表达VISTA的APC和过表达VISTA的肿瘤以及中和单克隆抗体,在体外和体内描绘VISTA的抑制性配体功能。过表达VISTA的肿瘤可克服已接种的宿主的有效力的保护性免疫。VISTA单克隆抗体在EAE模型中的强增强作用进一步验证了假说:VISTA在体内为抑制性配体。类似的方法已被用于表征其它B7家族配体的功能(Sica,等人2003;Keir,等人2008)。重要地要指出VISTA通过衔接与PD-1不同的受体发挥其抑制作用(图9)。VISTA途径的阻断加重EAE的事实确认了其功能不因PD-L1或
PD-L2而冗余。相反地,我们推测VISTA以通过其独特结构特征、表达模式和动力学反映的方式控制免疫反应。其未知受体的鉴定将进一步为VISTA介导的抑制的机制提供线索。
[0916] 总的来说,VISTA被鉴定为新的免疫抑制配体。APC上VISTA的表达在T细胞与APC之间的同种相互作用过程中通过衔接T细胞上的其仍待鉴定的反受体抑制T细胞表达。
VISTA阻断在自身免疫疾病模型中增强T细胞介导的免疫,从而表明当与其它抑制性B7家族配体例如PD-L1和PD-L2相比较时,其在控制自身免疫中的独特和非冗余的作用。其在免疫活化早期阶段的高度受调控的表达模式还显示了下调T细胞免疫和减弱炎症反应的反馈控制途径。在这一点上,VISTA抑制性途径的治疗性干预代表了调节T细胞介导的免疫以治疗疾病例如病毒感染和癌症的新方法。
[0917] 实施例29
[0918] 作为自身免疫中免疫干预的靶的VISTA途径
[0919] 本研究的目的是确定可溶性VISTA-Ig蛋白是否可抑制体内免疫反应。在体内使用鼠VISTA-mIGg2a的研究显示晚至第14天的治疗性治疗对EAE的临床疾病评分具有有益作用。这些正在进行的实验看起来令人振奋,因为我们可能已在自身免疫疾病干预中鉴定了新的轴(图26)。有了这个成功,我们已将我们使用鼠VISTA的研究扩展至鼠IgG1或IgG2a主链,以利用它们的嗜细胞能力。已产生了与IgG1Fc(野生型IgG1和现有的非FcR结合IgG1)在同一读框内的VISTA的Fc融合构建体。测试这些可溶性VISTA分子的每一
种以确定它们是否可抑制EAE,并且显示VISTA-IgG1和VISTA-IgG2a均抑制EAE的发展和进展(图27)。这些结果表明二聚体嗜细胞VISTA将具有体内活性。基于这些结果,还预期VISTA的其它多聚体形式将具有相似活性。例如,可使用位点特异性生物素化和与抗生物素蛋白复合(以进行多聚化)来四聚化VISTA。这些多聚体可用于体外和具体地,在EAE及其它自身免疫性、炎性和过敏性疾病的背景中调节T细胞功能。最后,我们相信本提案中描述的努力很有希望用于开发新的治疗策略,并且对兴趣在于一般自身免疫和T细胞功能的整个团体具有相当益处。
[0920] 实施例30
[0921] VISTA-Ig缀合物减缓EAE进展
[0922] 实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的模型。EAE通过用175μg MOG/CFA和百日咳毒素(PT)300ng(第0、2天)免疫小鼠来诱导。在第14、17和20天,施用150μg VISTA-IgG 2a(n=8)或150μg对照IgG2a(n=8)。数据在图26中显示为平均值±SEM。在另一个实验中,在第6天,每周用3次剂量的150μg对照IgG1(n=3)、150μg对照
IgG2a(n=6)、150μg mVISTA-IgG1(n=3)或150μg mVIS TA IgG2a(n=6)(总共进行
2周)处理小鼠。数据在表27中显示为平均值±SEM。在另一个实验中,在第14天,每周
用3次剂量的PBS(n=6)、100μg对照IgG2a(n=6)、300μg对照IgG2a(n=6)、100μg VIS TA-IgG2a(n=6)或300μg mVISTA IgG2a(n=6)(总共进行2周)处理小鼠。数据
在图28中显示为平均值±SEM。因此,VISTA-Ig融合蛋白对炎性病症例如多发性硬化具有治疗效果。
[0923] 实施例31
[0924] VISTA在人细胞中的表达和被VISTA-Ig抑制的分析
[0925] 在人细胞样品中研究VISTA的表达模式及其抑制(通过施用VISTA-Ig融合蛋白)。
[0926] 材料和方法
[0927] VISTA-Ig融合蛋白的产生—产生融合蛋白,其由来自人VISTA的胞外IgV结构域的氨基酸16-194和经突变具有低的对Fc受体的结合的人IgG1的形式组成。将VISTA
序列克隆进载体CDM7B的SpeI–BamHI位点。按照制造商的说明书(Invitrogen),使用
Freestyle转染剂和无蛋白质Freestyle表达培养基通过Freestyle CHO细胞的瞬时转染产生蛋白质。在5天的生长后收获上清液,通过蛋白G亲和柱进行纯化。使用10K MWCO离心柱(Amicon)浓缩蛋白质。
[0928] 细胞制备—从未经鉴定的健康人供体获得人血液成分部分清除样品。对于培养实验,将血液铺在Lymphoprep(PAA)上,通过密度梯度离心进行分离。将界面细胞于PBS中洗涤2次,随后在MACS中洗涤一次,然后按照制造商的说明书,使用Miltenyi CD4阴性选择试剂盒II、CD8阴性选择试剂盒或CD4记忆T细胞选择试剂盒进行磁珠选择。对于效应细+胞分离,随后用Miltenyi CD27阳性选择珠粒耗竭CD4T细胞的CD27细胞类型。
[0929] 培养—将T细胞以2x 105个细胞/孔涂铺在用抗CD3(克隆OKT3,BioXCell)和VISTA-Ig或对照Ig(ZZ,R&D biosystems)包被的96孔平底板中。除非另有所指,否则将抗CD3以2.5μg/ml与10μg/ml(比率1:4)VISTA-Ig或对照Ig蛋白在PBS中混合,于4℃包
被过夜。用完全培养基洗涤孔2次,随后添加细胞。当指定时,将滴定量的抗CD28(Miltenyi Biotech)包含在包被混合物中,或将50ng/ml的IL-2、IL-4、IL-7或IL-15(Peprotech)添加至培养基中。在第2天分析培养物的早期活化,并且在第5天分析培养物的晚期活化或CFSE谱。
[0930] 流式细胞术—关于染色下列培养物,收获细胞,将其转移进入V型底96孔板。洗涤细胞,在包含抗体(CD4、CD8、CD25、CD69、CD45RA;BD biosciences)和近红外修复活-死染料(Invitrogen)的HBSS/5%BCS染色缓冲液进行染色。洗涤细胞,利用BD固定缓冲液固定细胞,随后进行分析。
[0931] 对于用于VISTA表达的染色,洗涤全血,用包含针对胞外标志物的抗体的PBA缓冲液(PBS/0.1%BSA/0.1%叠氮化钠)进行染色。抗CD4、CD8、CD3、CD45RA、CD56、CD11b、CD11c、CD123、HLA-DR、CD14和CD16抗体购自BD biosciences,如本文中所述,产生抗VISTA。为了在细胞内染色FoxP3,使用来自BD biosciences的Foxp3固定/透化浓缩物和稀释剂试剂盒。参见图33D。
[0932] 在 利 用 FACSDiva 软 件 6.1.2 版 (Becton&Dickinson) 的 LSRIIFortessa(Becton&Dickinson,San Jose,CA,USA)上获得样品,利用FlowJo软件(Tree
Star,Inc.)分析所述样品。使用Prism 5(GraphPad Software,Inc.)绘制图表。
[0933] 结果
[0934] 人VISTA蛋白—小鼠VISTA序列针对人基因组的BLAST鉴定了第10号染色体的开放阅读框架54(C10orf54或血小板受体Gi24前体,GENE ID:64115),e值为8e-165,同一性为77%。与小鼠VISTA一样,该蛋白经预测编码具有单个胞外IgV结构域的I型跨膜蛋白。人VISTA为311个氨基酸(aa)长,由32-aa的信号肽、130-aa的胞外IgV结构域、
33-aa的茎区、20-aa的跨膜结构域和96-aa的长胞质尾部组成。参见SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
[0935] VISTA表达分析—通过cDNA组织小组(Origene)的实时PCR分析研究VISTA健康人组织的表达(图29A)。与小鼠组织类似,VISTA主要在造血组织或包含大量造血组织的组织中表达。这与VISTA在免疫相关功能中的重要性相符。有趣地,VISTA的表达在人胎盘中特别高,这可表示VISTA在维持对怀孕的异基因环境的耐受性中的功能作用。已发现该表达模式遵循与VISTA的最接近的同源物PD-L1的趋势相似的趋势(图29B)。
[0936] 随后,通过流式细胞术研究造血室内的VISTA蛋白表达。从外周血分离PBMC,用抗VISTA单克隆抗体GA1进行染色。VISTA由大部分单核细胞、树突状细胞和由约20%dim +
的CD4和CD8T细胞高度表达(图30)。在血液单核细胞的‘巡察’(CD14 CD16)和‘炎
+ +/-
性’(CD14CD16 )亚组内以及树突状细胞的淋巴和骨髓亚组内均观察到VISTA表达。
[0937] VISTA对T细胞功能的功能作用—先前已证明VISTA对小鼠T细胞免疫反应具有负面影响(Wang,等人(2011)J.Exp.Med.第1–16页 )。研究VISTA在人细胞介导的免疫反应中是否具有相同的作用。产生Ig融合蛋白,其由VISTA的胞外域和包含用于减弱Fc受体结合的突变的人IgG的Fc区组成。将10μg/ml的VISTA-Ig或对照Ig与2.5μg/ml
的抗CD3(OKT3)一起固定在板上,随后通过CFSE稀释测量增殖。发现VISTA抑制粗纯化的CD4(图31A)和CD8(图31B)T细胞的CFSE稀释。由VISTA产生的抑制可与由PD-L1-Ig(R&D + -
biosystems)诱导的抑制相当。此外,VISTA-Ig在记忆(CD45RO,图31C)和效应子(CD27,图31D)亚组的抑制上是有效的。人CD4T细胞上的小鼠VISTA和人VISTA的比较表明VISTA具有跨物种的交叉反应性。人VISTA-Ig和人VISTA-Ig在不同的OKT3浓度上的滴定显示
更高浓度的OKT3可被更高浓度的VISTA克服(图32A和32B)。
[0938] 为了深入了解抑制的机制,在VISTA-Ig存在或不存在的情况下在活化后研究细胞的状态。在2天的培养过程中,抗CD3对早期活化标志物CD25和CD69的上调被VISTA-Ig阻断(图33A和33B)。类似地,在5天的培养后,表示抗原体验(antigen-experience)的从CD45RA的表达至CD45RO的表达的偏移被阻止(图33C)。VISTA对细胞活力没有影响。与增殖的阻断相符,利用VISTA-Ig处理的细胞具有与未经刺激的细胞而非利用单独的OKT3看到的胚细胞相似的前向散射和侧向散射谱。为了确定由VISTA诱导的抑制是否是稳定的,将细胞在抗CD3和VISTA-Ig上培养2天,随后移至单独的抗CD3上进行3天。该进一
步刺激不能补救抑制,如34A和34B中显示的。
[0939] 随后,研究VISTA-Ig对细胞因子产生的作用。在递增量的VISTA-Ig存在的情况下,利用结合板的OKT3刺激细胞,进行5天,随后通过细胞计数珠粒阵列测量培养上清液中的各种细胞因子的浓度。仅痕量水平的IL-2、IL-4或IL-6被检测到(<5pg/ml),并且未观察到差异。然而,VISTA-Ig显著降低CD4(图35A)和CD8(图35B)T细胞的IL-10、TNFα和IFN□产量,并且存在朝向IL-17产量的适度减少的趋势。
[0940] 还研究能够克服VISTA诱导的T细胞的抑制的因子。抗CD28激动抗体提供了对T细胞的强力共刺激,因此滴定至培养物中以挑战VISTA抑制(图36A-C)。虽然较低量的抗CD28不能克服VISTA,当以1□g/ml的包被浓度包含抗CD28时,VISTA不能阻断增殖。
类似地,虽然低浓度的VISTA可通过添加细胞因子例如IL-2、IL-7和IL-15来克服,但即使对于50ng/ml的生理上高浓度的细胞因子,较高浓度的VISTA仍然具有抑制性。
[0941] 实施例32
[0942] 在CD4+T细胞增殖测定的情况下VISTA-Ig缀合物对健康受试者和狼疮受试者的CD4+T细胞的增殖的作用
[0943] 实验方案中使用的材料
[0944] 需要的试剂:
[0945] 1.具有盖的 96孔EIA/RIA透明平底聚苯乙烯高结合微量滴定板,具有盖,无菌的(产品号3361)
[0946] 2.BioXCell,抗人CD3,目录号:BE0001-2,克隆:OKT3,物种:小鼠IgG2a
[0947] 3.R&D,重组人IgG1Fc(对照Ig),CF,人IgG1,目录号:110-HG-100
[0948] 4.Pan T细胞分离试剂盒II,目录号:130-091-156
[0949] 5.Invitrogen, 修复紫外死亡细胞染色试剂盒,用于405nm激发,目录号:L34955
[0950] 6.Sigma,Histopaque-1077,无菌过滤的,密度:1.077g/ml,目录号:10771-500ML[0951] 7.Cellgro,RPMI 1640,目录号:10-040-CV,10%热灭活的FBS/青霉素/链霉素/50uM 2-ME,
[0952] 1.胎牛血清:HyClone,目录号:SH30910.03
[0953] 1.BD Cytofix,固定缓冲液,目录号:554655
[0954] 8.Cellgro,磷酸缓冲盐溶液(PBS),1X,无菌的,不含钙和镁,目录号:21-040-CV[0955] 9.Polysciences,甲醛,目录号:04018
[0956] 10.Sigma,人Ig,目录号:G4386-1G,以1.25mg/ml的终浓度使用
[0957] 11.Invitrogen,CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒-用于流式细胞术,目录号:C34554
[0958] 12.人VISTA-Ig(批号100912,来自Freestyle CHO)
[0959] 实验方案
[0960] 在第-1天,用每孔100ml PBS中的抗CD3(克隆OKT32.5mg/ml)+对照Ig或VISTA Ig(10mg/ml)包被96孔平板。将板在4℃温育过夜或在37℃温育3小时。
[0961] 在第0天:按照Miltenyi Biotec的说明书分离人CD4+T细胞,用CFSE标记细胞。将细胞以200,000个细胞/孔接种在包被的96孔板中。
[0962] 在第3-4天,收获细胞,使用流式细胞术通过CFSE标记分析细胞,以测定CD4+细胞的增殖水平。具体地,使用图37中包含的流动门控策略进行流式细胞术。
[0963] 将CFSE增殖测定的结果包含在图38中。可从其看到当与对照Fc组相比较时,对于人对照受试者和狼疮受试者,VISTA Ig在10ug/ml上均显示最大的对人CD4T细胞的抑制。
[0964] 实施例33
[0965] 不同接头对VISTA Ig蛋白的体外效力的作用
[0966] 融合至人IgG1Fc的人VISTA蛋白已在体外抑制抗CD3诱导的T细胞反应中显示了强效的活性。使用CDM8衍生的构建体产生该数据的大部分。该蛋白的部分氨基酸序列数据示于下列序列中。在所述序列中,VISTA蛋白以绿色突出显示,人IgG1以黄色突出显示。huVISTA序列之前的序列的无阴影部分是信号肽序列。介于VISTA与人IgG1人序列
之间并且介于序列的带星号部分之间的序列的无阴影部分是包含19个氨基酸残基的接头肽。
[0967] 使用CFSE标记的人T细胞测定该多肽的体外抑制活性,所述人T细胞在2.5ug/ml与结合平板的抗CD3和对照Ig或下列序列(SEQ ID NO.:68)中的VISTA-Ig多肽存在的情况下已被培养5天。该测定的结果示于图39A中。
[0968] 序列1:huVISTA-IgG1-CDM8-衍生的
[0969]
[0970] 使用来自Invivitrogen的pFUSE-hIgG1e3-Fc2载体产生第二人VISTA-人IgG1Fc构建体。类似地,在序列中,VISTA蛋白以绿色突出显示,人IgG1以黄色突出显示。huVISTA序列之前的序列的无阴影部分为信号肽序列。介于VISTA与人IgG1序列之间并且还介于序列的带星号部分之间的序列的无阴影部分是包含19个氨基酸残基的接头肽。(同样地,序列的不同部分也通过星号分隔)。
[0971] 该第二VISTA Ig融合肽的氨基酸序列存在于下文所示的序列2(SEQ ID NO:69)中。该多肽的体外抑制性活性再次使用CFSE标记的人T细胞来测定,所述T细胞已在2.5ug/ml结合板的抗CD3和对照Ig或所述序列2中的VISTA-Ig多肽存在的情况下培养了
5天。该测定的结果示于图39B中。基于图39B中的结果,可看到该蛋白的体外活性比SEQ ID NO:68中的VISTA Ig多肽低得多。
[0972] 序列2:huVISTA-IgG1-pFUSE衍生的。
[0973] 信号序列
[0974]
[0975] 基于这些不同的结果,可推测这2种VISTA Ig融合蛋白的免疫抑制活性的差异潜在地可能通过VISTA融合蛋白的Fc区的序列变异来解释。因此,对序列1和2的Fc结构域(黄色)进行测序和比较。该序列比较如在下文中的比对中描述的。在研究后,本发明人注意到序列差异,然而未指出可为这些多肽的免疫抑制活性的显著差异提供解释的突变。
[0976] Fc的比对:
[0977] 评分=315比特(808),期望值=2e-109,方法:组合矩阵调整。
[0978] 同一性=158/203(78%),阳性=164/203(81%),缺口=0/203(0%)
[0979]
[0980] 随后推测活性的差异可能是糖基化差异的结果或可能归因于介于融合蛋白的VISTA与Ig结构域之间的接头的尺寸或性质的作用。具体地,在测序后,观察到介于序列1的VISTA蛋白与Fc结构域之间的间隔子或接头包含19个氨基酸,其中相当多数目包含柔性甘氨酸残基。相反地,接头介于序列2中的VISTA多肽与IgG1之间的(SEQ ID NO:73的长度仅为11个氨基酸并且不包含甘氨酸残基)。
[0981] 基于该观察,推测更具柔性的接头的包含可能进一步提高VISTA-Ig的活性。与之相关地,甘氨酸-丝氨酸接头因它们的柔性和已知免疫原性风险的不存在而在抗体工程领域中用于连接各种结构域。然而,在本情况下,尚不清楚这样的接头是否可显著影响活性。例如,VISTA具有与不需要为了活性而二聚化的一些其它蛋白相似的结构。
[0982] 基于该假设,本发明人从而决定比较序列1和序列2中的VIST A Ig融合多肽与包含另一种柔性接头即丝氨酸-甘氨酸接头的第三VI STA Ig序列的免疫抑制活性。具体地,选择的接头为GTSGSSGSGS GGSGSGGGG(SEQ ID NO:71)。该序列用作人VISTA与pFUSE-hIg G1e3-Fc2Fc结构域之间的接头,以产生序列3中包含的VISTA Ig蛋白(SEQ ID NO:72)。
[0983] 序列:3huVISTA-IgG1-pFUSE,利用Ser/Gly接头衍生的。
[0984] 信号肽VISTA序列的起始
[0985] MYRMQLLSCIALSLALVTNS***FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQDSENITAAA***GTSGSSGSGSGGSGSGGGG***RSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKLYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSKEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0986] (SEQ ID NO:72)
[0987] 在序列3中,VISTA蛋白再次地以绿色突出显示,人IgG1以黄色突出显示。huVISTA序列之前的序列的无阴影部分再次地为信号肽序列。介于VISTA与人IgG1序列之间并且还介于序列的星号部分之间的序列的部分为接头肽,其包含19个氨基酸残基,所述残基为丝氨酸或甘氨酸氨基酸残基。(同样地,序列的不同部分以星号间隔)。
[0988] 如可从图39C中的结果看到的,包含该接头的VISTA Ig多肽具有比VISTA-Ig蛋白更大的免疫抑制活性。具体地,包含Ser-Gly接头的VISTA Ig融合蛋白显示比序列1中的VISTA Ig融合蛋白高约10%的免疫抑制活性,和为约序列2(SEQ ID NO:69)的9倍的免疫抑制活性。由本发明人构建的另一个VISTA-Ig序列示于下面(SEQ ID NO:73)。该序列用于本申请中描述的MLR实验和其它hVISTA-Ig实验。序列从N末端至C末端的不同部分在下文中进行了标识,并且通过序列中的星号进一步间隔开。
[0989] 红色=信号肽粗体
[0990] 绿色=vista
[0991] 蓝色=生物素化受体肽
[0992] 紫色=接头
[0993] 橙色=IgG1Fc
[0994] 加以下划线的=Fc突变
[0995] (同样地,序列的不同部分也通过星号间隔开)。
[0996] 胞外
[0997]
[0998] 人IgG1与载体Fc的比对
[0999]
[1000] 这些结果表明具有特定长度和/或柔性的接头的包含可显著增强VISTA-Ig融合蛋白(单体和多聚体VISTA-Ig融合蛋白)的免疫抑制活性。
[1001] 实施例34:
[1002] 利用mVISTA-Ig处理小鼠在鼠狼疮模型中抑制疾病
[1003] 良好表征的小鼠品系NZBW-F1(“BW”,仅雌性)和NZM2410(NZM,雄性和雌性)发展了与在具有SLE的人中看到的症状相似的自身免疫疾病狼疮的多个症状。这些症状包括自身反应性抗体的发生、肾小球中免疫复合物的沉积、蛋白尿、增加的促炎细胞因子产量和体重减轻。最终小鼠在1岁以内屈服于肾功能衰竭。为了确定mVISTA-Ig是否可抑制全身性自身免疫疾病,我们在第8周利用mVISTA-Ig预防性处理BW小鼠,在第24周用mVISTA-Ig治疗性处理BW和NZM小鼠。利用VISTA-Ig的处理不引发总的白细胞数量的任何变化,表明该试剂不明显地耗竭T细胞(数据未显示)。利用VISTA-Ig的预防性处理防止体重减轻和蛋白尿,治疗性处理逆转这些小鼠的蛋白尿。结果包含在图40中。同样地,还在于第24周处理的NZM小鼠中观察到相似的结果(数据未显示)。
[1004] 如图41A-D中所示,对肾(当小鼠开始生病或在30周龄时从接受实验性VISTA-IgG2a或对照IgG2a的2只NZBW F1(BW)和3只NZM获取的)的切片进行苏木精和
伊红(H&E)染色。BW在第8周开始处理,NZM在24周龄(在疾病发作后很长时间)时开始
处理。来自所有5只VISTA-IgG2a处理的小鼠的切片显示最低至轻微程度的肾小球肾炎,未显示间质病以及肾小球疤痕(图40B)。相反地,来自所有5只接受对照IgG2a的小鼠的切片均具有严重的增殖性肾小球肾炎的证据,3/5显示显著的疤痕,包括1只伴有所有肾小球闭塞的终末期肾病的小鼠。(图41C、D)。同样地在2/5的小鼠中看到间质性炎症。(数据未显示)。总的IgG dsDNA滴度的总体评估未显示对VISTA-Ig处理的任何影响;然而,现已清楚该小鼠模型中的一些自身特异性来源于长寿浆细胞,一些来自短寿浆细胞。因此,在得出VISTA-Ig对抗elf抗体滴度有什么影响之前,需要评估VISTA-Ig对抗SLE抗体的所
有同种型和那些抗体的精细特异性的影响的更详尽分析。如先前所述,利用抗CD40L对BW和NZM小鼠的晚期处理(其对□dsDNA抗体滴度没有影响)也可改善疾病。这样,抗CD40L和VISTA-Ig可替代调控另外的过程例如过度的T细胞介导的炎症和肾的水平上的组织损伤。重要地,无论机制如何,这些初步结果表明VISTA-Ig处理也以治疗方式起作用,施用始于第24周,导致相较于IgG2a对照处理的动物降低的蛋白尿水平和减轻的肾小球损伤。因此,VISTA-Ig可消除已建立的疾病中正在进行的免疫介导的损伤,一种针对人SLE的治疗的明显更加相关的效果。
[1005] 如图60中的实验中显示的,从用PBS、150ug对照IgG2a、mVISTA-IgG2a(每隔一日施用的)处理的20周龄的NZBWF1小鼠收集全血。用缀合于抗体的荧光对全血进行染色,以鉴定(a)炎性单核细胞和(b)T细胞的存在和数目,通过流式细胞术分析测定细胞群体。图中的结果表明处理不改变炎性单核细胞和T细胞的细胞频率。
[1006] 如图61中的实验中所示,在利用VISTA-IgG2a处理的20周NZBWF1小鼠的血液中还检测到IL-17水平。结果显示炎性细胞因子的表达可通过处理减少。
[1007] 如图62和63中的实验中显示的,还比较利用对照IgG2a或VISTA-IgG2a处理的24周龄NZBWF1小鼠的细胞因子谱。结果表明利用VISTA-IgG2a的处理以与本文中炎症反应的减轻相符的方式减少或影响与炎症相关的细胞因子(包括IL-2、IL-10、CXCL1、IL-5、IL-4、IL-12和Il-1-β)的表达。相反地,ds DNA抗体水平在统计学上未受影响(结果未显示)。
[1008] 结果表明VISTA-Ig治疗性干预SLE而不影响抗体水平或免疫复合物沉积,表明其通过非B细胞机制进行干预。相反地,VISTA-Ig增强Treg标签,并且减少肾中的T细胞的细胞因子,这表明对T细胞活化的直接影响。同样地,结果揭示了VISTa-Ig施用极大地减少了肾的粒细胞浸润,这可导致疾病消退。
[1009] 因此,基于上述内容,VISTA-Ig融合蛋白可用作炎症或自身免疫或过敏的负调节剂。如所显示的,这样的多肽可显著减少CD4+和CD8+T细胞的IL-10、TNFα和IFNγ的产量。这反过来应当导致免疫反应的治疗性下调,并且提供自身免疫、过敏性或炎性疾病的缓解。
[1010] 实施例35
[1011] VISTA-Ig在治疗呼吸系统疾病例如哮喘中的用途
[1012] 调节性T细胞和耐受性:表达CD4Foxp3的Treg是最好表征的Treg亚组,是维持对自身和外来抗原的耐受性所必不可少的。具有Foxp3突变的患者可呈现过敏性症状7,并且来自哮喘气道的Foxp3+Treg的抑制活性受损6。T细胞中Foxp3诱导的转录程序赋予抑制相邻T细胞和抗原呈递细胞(APC)的活化的能力。表达Foxp3的Treg还可在TGF-β和IL-2存在的情况下从首次接触实验的外周血CD4+T细胞诱导,并且由全反式维甲酸(ATRA)进一步增强8。在肠道中从外周CD4T细胞诱导Foxp3+Treg依赖于TGF-β和维甲酸的产生
9。对于Foxp3+或Foxp3-表型,产生IL-10的Treg的重要作用也已在呼吸耐受性方面得
以确立10、11、12。扩增Treg数量、增强它们针对过敏原的特异性或恢复它们在肺组织中的抑制活性的新策略从而极有希望作为哮喘的潜在疾病修饰免疫疗法。
[1013] 本发明人已开发了一系列过敏性肺炎症和耐受性的鼠模型,并且显示在过敏性致敏后CD4反应由混合的Th2+Th17反应组成13。过敏性致敏和耐受性诱导均伴随着肺组织但非引流淋巴结中的总的Foxp3+CD4群体的增加(图49)。然而GARP(功能上相关的Treg的活化标志物14)的表达在肺和淋巴结都被上调(图49)。有趣的是,粘膜组织中的Treg在耐受性小鼠中响应过敏原而增殖,但当炎症存在时未能如此(图50),发炎的肺中Treg的该“瘫痪”状态与降低的Helios表达相关(图51)。Helios是结合Foxp3启动子和可能参与Treg活性的转录因子15。此外,在耐受性而非致敏的动物中显示了产生IL-10和IFN-□的T细胞的启动。
[1014] 通过使用VISTA的单克隆抗体,我们已显示,肺泡巨噬细胞相较于肺中的其它细胞类型(包括肺DC和间质巨噬细胞),具有异常高的细胞表面VISTA的基线表达(图52)。这表明气道内的特殊环境维持已知被抑制的肺泡巨噬细胞上的高VISTA表达。过敏原在耐受和炎症的情况下的吸入进一步增加VISTA在气道巨噬细胞上的表达,这表明免疫激发产生促进负信号至传入的T细胞的递送的环境,所述环境可阻止炎症。气道淋巴细胞表达比肺泡巨噬细胞低得多的水平的VISTA。淋巴细胞VISTA表达在耐受过程中增加,在由过敏原触发的炎症过程中减少(图52)。然而,慢性过敏原激发后(此时上皮功能障碍)VISTA的表达模式和VISTA在呼吸耐受性中的功能作用是未知的。本发明人已证明,VISTA能促进首次接触实验的CD4T细胞至Foxp3+Treg的转化,这表明VISTA在外周耐受机制中的重要作用(图53)。
[1015] 因此,基于上述内容,由于VISTA是肺中对吸入的抗原和微生物材料的免疫的至关重要的研究点调节剂,因此VISTA中和应当在过敏原吸入后减轻过敏原致敏、T细胞亚群发展和肺炎。
[1016] 同样地,VISTA-Ig还应当在呼吸耐受性诱导过程中调节调节性T细胞的发展、分化和活性,并且应当影响肺泡巨噬细胞、肺DC、T细胞和调节性T细胞以及缓解呼吸耐受性。
[1017] 在哮喘性肺中,主要是免疫的Th2和Th17组分介导慢性炎症,然而Th1和Treg反应抑制过敏和提高耐受性。肺的炎症据认为降低上皮的屏障功能和促进对多种过敏原的过敏性致敏。
[1018] 哮喘动物模型:在耐受性诱导过程中VISTA活性的中和
[1019] 我们的数据表明,VISTA在肺中,特别地在肺泡巨噬细胞上强烈表达,所述肺泡巨噬细胞是遭遇吸入的材料的第一细胞,并且在呼吸耐受性和炎症过程中被上调。为了确认VISTA-Ig在治疗哮喘中的潜能,通过用4个剂量的50μg OVA13进行鼻内攻击来使C57BL/6小鼠能够耐受吸入的OVA。持久耐受性的发展通过在2周后利用OVA+TNF-α(1μg)进行动物的粘膜致敏,随后利用OVA攻击,随后评估气道中的炎症细胞和通过细胞内细胞因子分析表征T细胞来进行确认。
[1020] 为了确定VISTA在耐受性诱导中的作用,则使多组的小鼠(n=6)在利用300μg抗VISTA 13F3中和抗体(每隔一日i.p.)或对照IgG的处理下同时耐受OVA。在抗VISTA处理后评估过敏原反应性Foxp3+Treg、分泌IL-10的T细胞的活性耐受性的发展和存在
以及Helios和GARP在Treg上的表达。随后如上所述测定活性耐受性的发展。为了确定
VISTA中和是否能够中断预先建立的耐受性,利用抗VISTA或对照IgG处理耐受的动物,这始于耐受后2周并伴随重复的OVA i.n.攻击(每周3次)。在2周的气道炎症后,测定肺
Th1/2/17CD4细胞和调节性T细胞反应。VISTA在气道高反应性的控制中的作用通过对对照或抗VISTA处理的动物进行重复OVA攻击,随后在如先前所述的雾化乙酰甲胆碱吸入后测量肺抗性和顺从性来进行测定。
[1021] VISTA-/-小鼠中的气道动态平衡的表征
[1022] 通过BAL细胞的流式细胞术(如在我们实验室中常规进行的)测定未处理的C57BL/6-VISTA-/-小鼠和年龄匹配的对照VISTA+/-同胞仔的气道和肺巨噬细胞/DC、T
细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和B细胞的数量16。通过多色流式细胞术评估MHC II类、CD80/86、CD40、抑制受体CD200R和PD-1以及VISTA在各自气道细胞群体上的表面表达。通过Luminex细胞因子珠粒阵列测定BAL上清液中的静息细胞因子水平。随后在利用LPS(1μg/ml)+IFN-□(50ng/ml)刺激后24小时测定诱导的肺泡巨噬细胞(从VISTA-/-和对照BAL纯化的)的细胞因子分泌。呼吸上皮的屏障功能可通过鼻内滴注OVA-Alexa488
标记的过敏原,随后在6小时后进行灌洗,提取肺组织细胞,针对组织固有细胞对过敏原的吸收进行流式细胞术来测定。炎症事件对肺动态平衡的扰动导致增加的过敏原透过上皮的吸收。
[1023] 使用2个过敏性呼吸道疾病的模型:(i)利用上述OVA±TNF-αi.n.的粘膜致敏,随后利用50μg OVA的重复攻击,和(ii)利用屋尘螨的重复处理(HDM,Allergon,25μg i.n.,每周3次,如所描述的17)。HDM具有固有的佐剂活性,是在英国在哮喘中观察到的最显著的致敏,因此可代表更加临床相关的模型。然而,难以确定诱导的反应的过敏原特异性。使用两个模型在VISTA-/-和对照同胞仔中诱导急性过敏性气道炎症,如所描述的,测定炎症细胞至气道中的浸润和肺T细胞的细胞因子谱。如先前一样通过肺功能测试测定气道高反应性。通过过敏原特异性Ig ELISA或总IgE ELISA(如在我们实验室中常规使用的)测量循环IgE、IgG1、IgG2a和IgA血清反应的发展。也测定BAL液体IgA水平。最后,我们将确定VISTA是否下调气道重塑,这在小鼠的长期过敏原攻击后发生,此时AHR和炎症相较于疾病的急性期得以减轻。如上所述使VISTA-/-或对照小鼠致敏,但鼻内攻击将持续
5周。如先前一样测定气道炎症,通过组织学分析肺切片的气道壁增厚、胶原沉着和平滑肌细胞增生。
[1024] VISTA在肺的确定的白细胞亚群中的调节作用
[1025] 我们目前正在开发新的小鼠品系,其中在确定的造血细胞谱系中条件删除VISTA。作为另一个研究的部分,VISTA在T细胞增殖反应、Treg的抑制活性和Th1、Th2、Th17
和CD8T细胞的分化上对不同细胞类型的作用的详尽表征正在进行中。初步的数据表明
Foxp3+Treg上表达的VISTA促成它们的抑制活性。将VISTAflox/flox小鼠与在以下谱系特异性启动子:Lck、CD11c、LyzM和Foxp3下表达Cre重组酶的动物杂交,以将突变分别靶向CD4和CD8T细胞、DC、骨髓细胞和Foxp3+Treg。测试来自所得的集落的PCR筛选的后代的静息气道群体中的任何异常(如上文中在VISTA-/-动物中测定的)和有缺陷的呼吸耐
受性(如先前所述的)。随后测试这些组的使用VISTA-Ig融合蛋白进行的呼吸耐受性诱
导。
[1026] 过敏性气道疾病的VISTA途径的治疗性靶向
[1027] 以可溶性形式存在的VISTA-Ig融合蛋白在体外无抑制性,但当结合于塑料时抑制T细胞反应6。因为可溶性VISTA-Ig缺乏针对FcR的结合结构域,所以其不结合APC或在体内发挥抑制作用。因此,在分别资助的项目中,我们正在使用在大肠杆菌(E.coli)中表达的构建体开发VISTA胞外域的非共价寡聚体,将其再折叠和从包涵体纯化出来。在T细胞增殖和Treg分化测定中测试VISTA的四聚体、五聚体或七聚体的免疫抑制活性。一旦这些试剂可获得,我们将测试对于哮喘的治疗干预,靶向VISTA途径是否可行。如上所述在C57BL/6小鼠中诱导急性过敏性气道炎症,利用5-100μg选择的VISTA寡聚物(或
VISTA-Ig作为阴性对照)的鼻内施用连同过敏原攻击一起处理成组的动物。测定气道炎症和Treg介导的耐受原性反应。如果VISTA寡聚物抑制炎症或诱导耐受性,则进行气道高反应性和HDM诱导的炎症的进一步研究。最后,我们将延迟VISTA寡聚物处理直至疾病的急性期后,以确定这样的疗法是否可解决已建立的炎症。在慢性期之前将VISTA寡聚物与过敏原攻击一起提供,在对照和VISTA靶向小鼠中评估气道炎症和重塑。
[1028] 实施例36
[1029] VISTA对信号传导途径的影响
[1030] 进行实验以评估VISTA对TCR诱导的ERK和其它信号传导途径分子的影响。进行这些实验,因为某些信号传导途径的调节已用于治疗癌症和自身免疫疾病。例如,用于治疗CML的伊马替尼为因其对影响癌症的信号传导途径的影响而在临床上有效的抗体的举例说明性实例。。。
[1031] 在这些 实验 中,用2.5ug/孔 的抗CD3抗体 (2C11)+10ug的对照IgG 或VISTA-Ig(1:4的比率)包被24孔板,将孔在40℃温育过夜。随后用经历血清饥饿的纯化的鼠CD4+T细胞在37℃刺激孔,持续不同的时间。
[1032] 收获细胞,通过TCR信号传导途径(包括Fyn、Lck、ZAP70、LAT、GRB2、Vav、Ras、P38、JNK、ERK1/2)中的磷酸化蛋白的Western印迹在给定的时间点评估对TCR信号传导级联。在图54中示意性地描述了这些实验。
[1033] 图55中的印迹显示在CD3刺激后不同时间点上的pErk水平(无VISTA-Ig或对照IgG:活化时间过程)。上样对照包含在图56中。
[1034] 如通过图57中的数据显示的,VISTA抑制ERK1/2活化。相反地,如通过图58中的数据显示的,VISTA不影响pJNK活化。特别地,这些实验的结果表明在10分钟后,VISTA选择性抑制TCR诱导的p-ERK。因此,VISTA激动剂和拮抗剂可用于调节p-ERK表达和信号传导途径。
[1035] 实施例37:VISTA-Ig用于抑制MLR的用途
[1036] 用于MLR实验的材料和方法
[1037] 方法:A)使用来自健康人血供体的PBMC在96孔U形底板中建立人MLR。在4℃用纯化的人或小鼠VISTA-Ig蛋白包被板过夜。
[1038] 用4000rad辐照刺激细胞。在每一个孔中,在VISTA-Ig存在或不存在的情况下,将10^5个“应答”细胞与与10^5个“刺激”细胞混合。
[1039] 人和鼠VISTA-Ig构建体对MLR的抑制
[1040] 将人和小鼠MLR实验的结果各自包含在59A和59(B)中。在实验中,如上所述,使用来自健康人供体的PMBC在96孔U形底板中建立标记的(A)人MLR。在4℃利用纯化的人或小鼠VISTA-Ig蛋白包被板过夜。利用400rad辐照刺激细胞。在每一个孔中,在人或小鼠VISTA-Ig存在或不存在的情况下将10^5个“应答细胞”与10^5个“刺激细胞”混合。
使用3H-胸苷测量细胞增殖。在图59(B)中显示的小鼠MLR实验中,除使用小鼠脾细胞外,大体上相同地进行实验。
[1041] 在这些实验中,将hV-Ig(人VISTA-Ig)、mV-Ig(小鼠VISTA-Ig)以图59(A)和(B)中显示的指定的浓度添加至MLR。在下文中还提供了用于这些实验的人VISTA-Ig构建体的序列。
[1042] FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVDIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQESENITAADPGGGGGRLVPRGFGTGDPEPKSSDKTHTCPPCPAPEFEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:75)
[1043] 结果
[1044] 如图59(A)和(B)中显示的,测试的重组人VISTA-Ig和小鼠VISTA-Ig融合蛋白均显著地抑制人和小鼠混合淋巴细胞反应(MLR)。图中的结果表明测试的重组人VISTA-Ig融合蛋白在抑制小鼠MLR上比重组小鼠VISTA-Ig融合蛋白更强(B中的实验)。相反地,小鼠VISTA-Ig融合蛋白在抑制人MLR上比抑制小鼠MLR强。这些结果进一步表明,VISTA-Ig应当非常适合用于治疗或预防有此需要的受试者的过敏性反应。
[1045] 在全面描述本发明的和示例性实施方案后,本发明通过下列权利要求来进一步定义。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈