用于治疗Ullrich先天性肌营养不良的非免疫抑制性环孢霉素
阅读：571发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于治疗Ullrich先天性肌营养不良的非免疫抑制性环孢霉素专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及非免疫抑制性环孢霉素A衍 生物 的用途，所述衍生物用于减轻据诊断患有Ullrich先天性肌营养不良或Bethlem肌病的患者的线粒体功能障碍，并降低肌肉细胞的凋亡率。，下面是用于治疗Ullrich先天性肌营养不良的非免疫抑制性环孢霉素专利的具体信息内容。
1.式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在用于减轻Ullrich先天性 肌营养不良或Bethlem肌病患者细胞中线粒体功能障碍和降低凋亡率中的 用途。
2.权利要求1的用途，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式II 的环孢霉素衍生物。
3.权利要求1的用途，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式III 的非免疫抑制性环孢霉素[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。
4.式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在用于制造意图治疗Ullrich 先天性肌营养不良无力或Bethlem肌病的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式II 的环孢霉素衍生物。
6.权利要求4的用途，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式III 的非免疫抑制性环孢霉素[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA。
7.治疗Ullrich先天性肌营养不良或Bethlem肌病患者的方法，其包含 对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物。
8.权利要求7的方法，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式II 的环孢霉素衍生物。
9.权利要求7的用途，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物是式III 的非免疫抑制性环孢霉素[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA。
10.治疗Ullrich先天性肌营养不良或Bethlem肌病患者的药物组合物， 其包含有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物、可药用的载体和， 可选地，赋形剂和稀释剂。
11.权利要求10的药物组合物，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 是式II的环孢霉素衍生物。
12.权利要求10的药物组合物，其中非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 是式III的非免疫抑制性环孢霉素[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA。
13.权利要求10-12任一项的药物组合物，其还包含其他活性组分。
技术领域
本发明涉及非免疫抑制性环孢霉素A衍生物的用途，所述衍生物用于 减轻据诊断患有Ullrich先天性肌营养不良或Bethlem肌病的患者的线粒体 功能障碍，并降低肌肉细胞的凋亡率。
背景技术
胶原VI基因的遗传突变引发两种主要的骨骼肌疾病，Bethlem肌病 (BM，在线人类孟德尔遗传[OMIM]158810)和Ullrich先天性肌营养不 良(UCMD，OMIM 254090)。
BM是常染色体显形遗传疾病，特征为中轴肌和近端肌的缓慢进行性 虚弱无力，并伴随屈曲性手指挛缩(Bethlem and Wijngaarden.Brain 1976；99： 91-100；Merlini et al.Neuromuscul Disord 1994；4：503-11)。表现为家族内部 的变异性和不同的临床发作时间，从出生前到中年不等。出生前疾病发作 的特征为胎动减少；新生儿疾病发作的特征为张力减退或斜颈；幼儿疾病 发作的特征为运动里程碑延迟、肌肉无力和挛缩；而成年人疾病发作的特 征为近端无力、跟腱和手指挛缩。对于一些50岁以上、户外活动需要辅 助的患病个体，通常为温和而缓慢的进行性症状(Pepe et al.Biochem Biophys Res Commun 1999；258：802-07.De Visser et al..Muscle Nerve 1992； 15：591-96)。心功能通常是正常的。
UCMD是常染色体隐性遗传疾病，特征为先天性肌肉无力，伴有关节 挛缩和与其共存的远端关节过度松弛(Ullrich.Z.Ges.Neurol.Psychiatr. 1930；126：171-201.Camacho Vanegas et al..Proc Natl Acad Sci USA 2001； 98：7516-21.)。表现通常是出生时有张力减退、先天性臀部脱臼、跟骨隆起 和暂时脊柱后凸畸形。运动里程碑延迟，而且大多数孩子从不能独立行走。 通常在上下肢的伸肌表面有毛囊角化过度症，并形成瘢痕瘤和香烟纸样的 疤痕。中轴肌严重受累，导致进行性脊柱侧凸，并伴有脊柱僵硬。早期并 且严重的呼吸受累可能在生命的第一个或第二个十年中需要人工通气支 持。受UCMD影响的研究对象具有正常的智力，而且MRI显示大脑发育 正常。带有隐性或新生杂合突变的患者通常有严重而典型的表型，虽然他 们可能偶尔表现出更轻的Bethlem类疾病的症状(Pan et al.Am J Hum Genet 2003；73：355-69.Baker et al.Hum Mol Genet 2005；14：279-93.Demir et al.. Am J Hum Genet 2002；70：1446-58.)。在一些具有UCMD表型的患者中， 没有发生胶原VI基因的突变，表明即使对于这种疾病，仍然存在遗传异 质性(Pan et al Am J Hum Genet 2003；73：355-69)。
近来，研究表明因为Col6a1靶向失活而缺乏胶原VI的小鼠具有由通 透性转换孔(PTP)的不合理张开而导致的潜在线粒体缺陷，其中所述PTP 是内膜通道，在几种形式的细胞死亡中起作用，环孢霉素A能使其失敏 (Irwin et al.Nat Genet 2003；35：267-71.Bernardi et al.FEBS J 2006；273： 2077-99.)。进一步在体内利用了这一发现，并在小鼠模型中实现了成功的 治疗干预。确定线粒体是否与遗传和临床异质UCMD的发病机理有关是 主要的挑战，这是在小鼠模型中确定的疗法用于人类治疗应用的主要障 碍。这个挑战现在已经被克服。此外，本发明的发明人已经能证明UCMD 患者细胞中存在的潜在线粒体缺陷和由此导致的高凋亡率能够由非免疫 抑制性的环孢霉素A衍生物如[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA抑制。因此，本发 明提供新方法，用于抑制UCMD患者肌肉细胞的凋亡，和使用环孢霉素A 的非免疫抑制性衍生物，优选[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA，治疗这些患者中这 种疾病的新方法。目前还没有治疗UCMD的有效方法。因此，需要如本 文所述的新治疗方法。本发明的发明人还发现了BM患者中对环孢霉素A 敏感的相似的线粒体缺陷。因此，本文公开的对UCMD患者的新治疗方 法也适用于BM患者的治疗。
BM是常染色体显形遗传疾病，特征为中轴肌和近端肌的缓慢进行性 虚弱无力，并伴随屈曲性手指挛缩(Bethlem and Wijngaarden.Brain 1976；99： 91-100；Merlini et al.Neuromuscul Disord 1994；4：503-11)。表现为家族内部 的变异性和不同的临床发作时间，从出生前到中年不等。出生前疾病发作 的特征为胎动减少；新生儿疾病发作的特征为张力减退或斜颈；幼儿疾病 发作的特征为运动里程碑延迟、肌肉无力和挛缩；而成年人疾病发作的特 征为近端无力、跟腱和手指挛缩。对于一些50岁以上、户外活动需要辅 助的患病个体，通常为温和而缓慢的进行性症状(Pepe et al.Biochem Biophys Res Commun 1999；258：802-07.De Visser et al..Muscle Nerve 1992； 15：591-96)。心功能通常是正常的。
UCMD是常染色体隐性遗传疾病，特征为先天性肌肉无力，伴有关节 挛缩和与其共存的远端关节过度松弛(Ullrich.Z.Ges.Neurol.Psychiatr. 1930；126：171-201.Camacho Vanegas et al..Proc Natl Acad Sci USA 2001； 98：7516-21.)。表现通常是出生时有张力减退、先天性臀部脱臼、跟骨隆起 和暂时脊柱后凸畸形。运动里程碑延迟，而且大多数孩子从不能独立行走。 通常在上下肢的伸肌表面有毛囊角化过度症，并形成瘢痕瘤和香烟纸样的 疤痕。中轴肌严重受累，导致进行性脊柱侧凸，并伴有脊柱僵硬。早期并 且严重的呼吸受累可能在生命的第一个或第二个十年中需要人工通气支 持。受UCMD影响的研究对象具有正常的智力，而且MRI显示大脑发育 正常。带有隐性或新生杂合突变的患者通常有严重而典型的表型，虽然他 们可能偶尔表现出更轻的Bethlem类疾病的症状(Pan et al.Am J Hum Genet 2003；73：355-69.Baker et al.Hum Mol Genet 2005；14：279-93.Demir et al.. Am J Hum Genet 2002；70：1446-58.)。在一些具有UCMD表型的患者中， 没有发生胶原VI基因的突变，表明即使对于这种疾病，仍然存在遗传异 质性(Pan et al Am J Hum Genet 2003；73：355-69)。
近来，研究表明因为Col6a1靶向失活而缺乏胶原VI的小鼠具有由通 透性转换孔(PTP)的不合理张开而导致的潜在线粒体缺陷，其中所述PTP 是内膜通道，在几种形式的细胞死亡中起作用，环孢霉素A能使其失敏 (Irwin et al.Nat Genet 2003；35：267-71.Bernardi et al.FEBS J 2006；273： 2077-99.)。进一步在体内利用了这一发现，并在小鼠模型中实现了成功的 治疗干预。确定线粒体是否与遗传和临床异质UCMD的发病机理有关是 主要的挑战，这是在小鼠模型中确定的疗法用于人类治疗应用的主要障 碍。这个挑战现在已经被克服。此外，本发明的发明人已经能证明UCMD 患者细胞中存在的潜在线粒体缺陷和由此导致的高凋亡率能够由非免疫 抑制性的环孢霉素A衍生物如[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA抑制。因此，本发 明提供新方法，用于抑制UCMD患者肌肉细胞的凋亡，和使用环孢霉素A 的非免疫抑制性衍生物，优选[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA，治疗这些患者中这 种疾病的新方法。目前还没有治疗UCMD的有效方法。因此，需要如本 文所述的新治疗方法。本发明的发明人还发现了BM患者中对环孢霉素A 敏感的相似的线粒体缺陷。因此，本文公开的对UCMD患者的新治疗方 法也适用于BM患者的治疗。
发明内容
本发明源自下述发现：UCMD中的关键问题是骨骼肌肉细胞凋亡率增 加。发明人发现凋亡率增加是潜在的线粒体功能障碍的结果，所述障碍能 够通过使细胞接触环孢霉素A而修正。重要的是，非免疫抑制性环孢霉素 A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在减轻线粒体功能障碍和抑制过度凋亡 中同母体化合物一样有效。因此，本发明涉及使用式I的非免疫抑制性环 孢霉素A(CsA)衍生物，优选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和 最优选式III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA减 轻UCMD患者的线粒体功能障碍和降低UCMD患者细胞凋亡率。Novartis AG的国际专利申请PCT/EP2004/009804(WO2005/021028)在3-6页描述了 适用于本发明的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物。美国专利6,927,208中 公开了[D-MeAla]3-[EtVal]4CsA。
式I
其中
W是MeBmt、二氢-MeBmt、8’-羟基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R是Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y是MeLeu、硫代MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、 MeAla、MeaIle或MeaThr、N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile，N-乙基Thr、 N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R是Sar时Y不 能是MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeAla或Pro，
T1是(D)Ala或Lys，
T2是MeLeu或γ-羟基-MeLeu，和
T3是MeLeu或MeAla。
式II
其中
W’是MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R’是Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、Melle、MeVal、MeThr、MeAla、Mealle 或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N- 乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R是Sar时Y不能是MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
式III
其中MeBmt是N-甲基-(4R)-4-丁-2E-烯-1-基-4-甲基-(L)苏氨酸，αAbu 是L-α-氨基丁酸，D-MeAla是N-甲基-D-丙氨酸，EtVal是N-乙基-L-缬氨 酸，Val是L-缬氨酸，MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，Ala是L-丙氨酸，(D)Ala 是D-丙氨酸，和MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍 生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在产生意欲用于 治疗UCMD的药物的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗患者中UCMD的方法，其包 含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式 II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。有效量的非免疫抑制性环孢霉素 A衍生物应理解为当在治疗方案中对UCMD患者重复施用时产生目的临 床反应，比如改善、稳定或疾病发展进程的减缓。当口服给药时，每日给 药或每周三次给药的有效量在约1mg/kg至约100mg/kg之间，优选从约1 mg/kg至约20mg/kg。通过静脉途径时，指定的相应剂量可以从约1mg/kg 至约50mg/kg，优选从约1mg/kg至约25mg/kg。
此外，本发明涉及用于治疗UCMD的药物组合物，其包含有效量的 式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4CsA，可药用载体和，可选地，赋形剂和稀释剂。稀释 剂通常是水。通常向非肠道用制剂加入的赋形剂包括等渗剂、缓冲液或其 他控制pH的试剂，和防腐剂。组合物可以包含其他活性组分如抗生素。
本发明进一步涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式 II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在用于减轻Bethlem肌病患者的线 粒体功能障碍和降低其细胞凋亡率的用途。此外，本发明还涉及治疗患者 中BM的方法，其包含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素 A衍生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III 的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。此外，本发 明还涉及式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在产生意欲用于 治疗BM的药物中的用途。最后，本发明涉及用于治疗BM的医药组合物， 其包含有效量的式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可药用 的载体和可选地，赋形剂和稀释剂。
附图说明
图1在图A和B中表示从接触寡霉素的UCMD患者的肌肉活体组织 获得的成肌细胞的线粒体膜电位，在图C中表示UCMD患者和健康个体 中成肌细胞的凋亡率。
图2为典型实验，测试[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA对分离自Col6a(1)-/- 小鼠的肝脏和肌肉线粒体钙保持能力(CRC)的影响。其中如箭头所示，加 入10μM Ca2+的脉冲。最后一次处理的5小时后，从安慰组处理的小鼠分 离图A1和B1中检验的线粒体，图AII和BII中的线粒体来自用 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的小鼠。线a-d：未加入；线a’-d’：向培养基 中加入[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(0.8μM)。数据代表4次重复实验。
图3从用安慰剂或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理后的Col6a1-/-小鼠肝 脏和肌肉分离线粒体，进行CRC测定的结果汇总。实验如图2所述进行。 CRCmax指向培养基加入0.8μM[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA后观察到的 CRC。图A：每个点代表一只小鼠。小鼠24-27用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 处理，小鼠28-31用安慰制剂处理。
图4寡霉素对分离自用安慰剂或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理后的 Col6a1-/-小鼠FDB纤维中线粒体TMRM荧光的影响。TMRM检测如实 施例4(方法)中所述进行。如其中所述，加入5μM寡霉素(Oligo)或4μM 羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙(FCCP)。每条线代表一条纤维的荧光值。 图中还显示了加入寡霉素后，相对于随意设定的90％荧光的阈值，去极化 的纤维数目。
图5在用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰剂处理的Col6a1-/-小鼠横 膈膜切片中的凋亡发生率。标明了来自用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(第1 组，小鼠24-27)或安慰剂(第2组，小鼠28-31)处理的每只Col6a1-/-小 鼠的横膈膜切片中每mm2的凋亡核数目。棒表示每只小鼠20-30个切片的 平均值+/-SD。未处理(基础)和CsA(环孢霉素A)处理动物的数据来 自历史样本。
图6对用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰剂处理的Col6a1-/-小鼠横 膈膜中发生线粒体改变的纤维的评估。图A表示用电镜在来自个体动物的 样本中检测到的线粒体发生改变的肌肉纤维的百分比。图B表示两个处理 组的平均值。棒条表示平均百分比+/-SD。使用Mann-Whitney测试计算显 著性。
式I
其中
W是MeBmt、二氢-MeBmt、8’-羟基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R是Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y是MeLeu、硫代MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、 MeAla、MeaIle或MeaThr、N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile，N-乙基Thr、 N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R是Sar时Y不 能是MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeAla或Pro，
T1是(D)Ala或Lys，
T2是MeLeu或γ-羟基-MeLeu，和
T3是MeLeu或MeAla。
式II
其中
W’是MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R’是Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、Melle、MeVal、MeThr、MeAla、Mealle 或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N- 乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R是Sar时Y不能是MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
式III
其中MeBmt是N-甲基-(4R)-4-丁-2E-烯-1-基-4-甲基-(L)苏氨酸，αAbu 是L-α-氨基丁酸，D-MeAla是N-甲基-D-丙氨酸，EtVal是N-乙基-L-缬氨 酸，Val是L-缬氨酸，MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，Ala是L-丙氨酸，(D)Ala 是D-丙氨酸，和MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍 生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在产生意欲用于 治疗UCMD的药物的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗患者中UCMD的方法，其包 含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式 II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。有效量的非免疫抑制性环孢霉素 A衍生物应理解为当在治疗方案中对UCMD患者重复施用时产生目的临 床反应，比如改善、稳定或疾病发展进程的减缓。当口服给药时，每日给 药或每周三次给药的有效量在约1mg/kg至约100mg/kg之间，优选从约1 mg/kg至约20mg/kg。通过静脉途径时，指定的相应剂量可以从约1mg/kg 至约50mg/kg，优选从约1mg/kg至约25mg/kg。
此外，本发明涉及用于治疗UCMD的药物组合物，其包含有效量的 式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4CsA，可药用载体和，可选地，赋形剂和稀释剂。稀释 剂通常是水。通常向非肠道用制剂加入的赋形剂包括等渗剂、缓冲液或其 他控制pH的试剂，和防腐剂。组合物可以包含其他活性组分如抗生素。
本发明进一步涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式 II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III的非免疫抑制性环孢 霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在用于减轻Bethlem肌病患者的线 粒体功能障碍和降低其细胞凋亡率的用途。此外，本发明还涉及治疗患者 中BM的方法，其包含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素 A衍生物，更优选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和最优选式III 的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。此外，本发 明还涉及式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在产生意欲用于 治疗BM的药物中的用途。最后，本发明涉及用于治疗BM的医药组合物， 其包含有效量的式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可药用 的载体和可选地，赋形剂和稀释剂。
附图说明
图1在图A和B中表示从接触寡霉素的UCMD患者的肌肉活体组织 获得的成肌细胞的线粒体膜电位，在图C中表示UCMD患者和健康个体 中成肌细胞的凋亡率。
图2为典型实验，测试[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA对分离自Col6a(1)-/- 小鼠的肝脏和肌肉线粒体钙保持能力(CRC)的影响。其中如箭头所示，加 入10μM Ca2+的脉冲。最后一次处理的5小时后，从安慰组处理的小鼠分 离图A1和B1中检验的线粒体，图AII和BII中的线粒体来自用 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的小鼠。线a-d：未加入；线a’-d’：向培养基 中加入[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(0.8μM)。数据代表4次重复实验。
图3从用安慰剂或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理后的Col6a1-/-小鼠肝 脏和肌肉分离线粒体，进行CRC测定的结果汇总。实验如图2所述进行。 CRCmax指向培养基加入0.8μM[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA后观察到的 CRC。图A：每个点代表一只小鼠。小鼠24-27用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 处理，小鼠28-31用安慰制剂处理。
图4寡霉素对分离自用安慰剂或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理后的 Col6a1-/-小鼠FDB纤维中线粒体TMRM荧光的影响。TMRM检测如实 施例4(方法)中所述进行。如其中所述，加入5μM寡霉素(Oligo)或4μM 羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙(FCCP)。每条线代表一条纤维的荧光值。 图中还显示了加入寡霉素后，相对于随意设定的90％荧光的阈值，去极化 的纤维数目。
图5在用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰剂处理的Col6a1-/-小鼠横 膈膜切片中的凋亡发生率。标明了来自用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(第1 组，小鼠24-27)或安慰剂(第2组，小鼠28-31)处理的每只Col6a1-/-小 鼠的横膈膜切片中每mm2的凋亡核数目。棒表示每只小鼠20-30个切片的 平均值+/-SD。未处理(基础)和CsA(环孢霉素A)处理动物的数据来 自历史样本。
图6对用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰剂处理的Col6a1-/-小鼠横 膈膜中发生线粒体改变的纤维的评估。图A表示用电镜在来自个体动物的 样本中检测到的线粒体发生改变的肌肉纤维的百分比。图B表示两个处理 组的平均值。棒条表示平均百分比+/-SD。使用Mann-Whitney测试计算显 著性。
具体实施方式
为了评估UCMD患者中是否出现凋亡发生率增加和潜在的线粒体功 能障碍，相对于健康个体，研究了五名UCMD患者。患者1和5患有已 获得基因验证的UCMD(Demir et al.Mutations in COL6A3cause severe and mild phenotypes of Ullrich congenital muscular dystrophy.Am J Hum Genet 2002；70：1446-58.Giusti et al.Dominant and recessive COL6A1mutations in Ullrich scleroatonic muscular dystrophy.Ann Neurol2005；58：400-10.)。在患 者2体内，COL6A1外显子9的序列分析表明杂合性中存在15个核苷酸 缺失(横跨登录号AJ011932的核苷酸35.374-35.388，对应于包括COL6A1 基因外显子1-20的基因组克隆；登录号NM_001848的核苷酸921-936， 对应于COL6A1转录子)。在患者4体内，COL6A1外显子9的序列分析 表明杂合性中存在G→A变异(登录号AJ011932的核苷酸35.400；登录 号NM_001848的核苷酸850)。未提供患者3的基因分析结果，其表现出 UCMD的典型临床和免疫组织化学特征。
这五名患者代表了UCMD的不同严重程度范围：全部为先天发作； 三人(患者2、3和5)从来不能站立和行走；一人(患者4)只能在支撑 下站立；一人(患者1)能够行走。胶原VI的减少从轻微(患者1和4)， 到显著(患者2和3)，再到完全缺乏(患者5)。突变影响了三个个案 (患者2、4和5)中的COL6A1基因和一个个案(患者1)中的COL6A3 基因，一个个案(患者3)中则不明确。
在征得患者同意并获得伦理委员会批准之后，得到了来自五名患者和 一名健康志愿者的四头肌肌肉活体组织。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导 的dUTP缺口末端标记(TUNEL)方法评估凋亡率。从肌肉活体组织制备七 微米厚的冷冻切片，并在50％丙酮-50％甲醇中固定。使用Apoptag原位凋 亡检测试剂盒(Chemicon)进行TUNEL。样品用过氧化物酶-二氨基联苯胺 染色，显示TUNEL-阳性核，并用Hoechst 33258(Sigma)复染，标记所有核。 使用安装有数码相机的Zeiss Axioplan显微镜(40倍放大)在随机选择的 视野中确定核的总数和TUNEL-阳性核的数目。数据以平均值±SD的形式 表示。用非配对Student t检验分析数据，认为P＜0.01的数值显著。结果 显示，与健康供体相比，所有患者样本中凋亡核的频率要高得多，对于患 者1、2和3，其数值约增加10倍，对于患者4和5，增加超过200倍。 凋亡增加与所有患者的肌肉活体组织切片中胶原VI表达显著下降相对应， 如用针对胶原VI的选择性抗体染色所证明的。
进行实验测试胶原VI缺乏和凋亡之间是否存在因果关系。从两名未 患病的对照和患者1、2、3和4的肌肉活体组织切片，通过酶和机械处理， 并在补加20％胎牛血清、青霉素、链霉素和两性霉素B(Sigma)的Dulbecco 修正Eagle培养基(DMEM)上涂布，制备成肌细胞培养物。为了测试凋亡， 细胞在50％丙酮-50％甲醇中固定，并处理以用于使用Dead End荧光 TUNEL系统(Promega)进行TUNEL分析。通过用Hoechst 33258染色，显 示所有核。来自所有患者的培养物与健康供体相比，表现出更高的凋亡发 生率。在胶原VI上涂布或用环孢霉素A处理可将患者样品中凋亡发生率 完全正常化。来自患者2、3和4的肌肉细胞培养物如预期地显示出较低 水平的胶原VI到几乎没有胶原VI，如之前在患者1和5中所示(Demir et al.2002.Giusti et al.2005)。
要评估胶原VI和CsA的抗凋亡作用是否能上溯至线粒体，研究了活 体肌肉细胞培养物中的线粒体功能。如同预期的，向建立自健康供体的培 养物中加入寡霉素没有引起线粒体去极化，而加入质子载体羰基氰化物- 对-三氟甲氧基苯腙则可立刻引起线粒体去极化。改为向来自所有UCMD 患者的细胞中加入寡霉素之后产生了线粒体去极化。明显地，用环孢霉素 A或胞内Ca2螯合剂BAPTA-M，或在胶原VI上涂布细胞，可将对寡霉素 的响应完全恢复正常，表明UCMD的发病机理与PTP有关。根据四甲基 罗丹明甲酯(TMRM)的积累评估线粒体膜电位。要注意的是，预期在健康 的呼吸细胞中加入寡霉素会引起超极化，其中线粒体膜电位通过呼吸链质 子泵维持，而且用质子电化学梯度驱动ATP合成。因此，由寡霉素在UCMD 成肌细胞培养物中诱导的线粒体去极化是反常响应，说明膜电位不是由呼 吸维持，而是通过线粒体ATP合成酶“反向”工作，将质子从基质泵至膜 间空间，从而消耗糖酵解的ATP。
通过电镜研究了建立自健康供体和患者1、2和3的肌肉细胞培养物。 在UCMD样品中，患者1、2和3体内的线粒体面积/周长比例明显增加， 分别比健康供体高62.5、75和50％(p＜0.05)。这一发现说明在UCMD肌肉 细胞中，线粒体拉长显著少于正常样本。还观察到，与对照相比(＜300nm)， 患者中4-8％的线粒体的短轴值增加(＞400nm)。综上所述，这些发现表明 在UCMD细胞中存在尺度增加的线粒体部分。来自UCMD患者的细胞中 有较小百分比(在4和5％之间，来自健康供体的细胞为1％)还显示有肿 胀的线粒体，伴有低密度基质，而且缺少嵴。明显地，当UCMD细胞在 胶原VI上涂布时，面积/周长比例和短轴值变得与健康供体相似；而在胶 原VI上涂布或用环孢霉素A处理可将具有肿胀线粒体的细胞的数目降至 来自健康供体的培养物中观察到的数值。
用F1FO ATP合成酶抑制剂寡霉素处理培养物可将对照中具有肿胀线 粒体的细胞百分比增加至4％，UCMD患者中则超过40％，这一发现表明 存在能由寡霉素选择性放大的潜在线粒体功能障碍，如前面胶原VI缺陷 小鼠模型所表明的。寡霉素的作用可以通过用环孢霉素A处理而阻止，使 具有肿胀线粒体的细胞百分比恢复至与所有细胞培养物的基础数值相似。 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在防止来自 UCMD患者的细胞出现寡霉素依赖型线粒体去极化上和环孢霉素A一样 有效，并将凋亡发生率恢复至来自健康供体的细胞所表现的水平。在实施 例1中讨论了得出这些发现的实验。
明显的是，可以从具有UCMD临床症状的患者的原代培养物中发现 线粒体缺陷，无论原代基因缺陷是在COL6A1还是COL6A3基因中，而且 潜在的线粒体异常并不预测临床症状严重性。这些发现表明，线粒体与所 有UCMD个案的发病机理有关，而且有其他基因和/或环境因素在个体对 肌肉纤维死亡和再生的易感性中起作用。所有线粒体异常和随之而来的凋 亡可以通过将UCMD细胞涂布在胶原VI上或将它们接触环孢霉素A而治 愈。这些发现证明，从原理来讲，遗传病变下游的发病链可以由合适的药 物阻断，至少在早期可以阻断。公知环孢霉素A可以引起免疫抑制，这是 对患者进行长期治疗的主要障碍。本发明发明人关键的观察结果是，非免 疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在减轻UCMD细胞中 的线粒体障碍和降低凋亡率时，与环孢霉素A一样有效。这一发现证明， 环孢霉素的免疫抑制活性与其细胞保护作用无关，可以为受胶原VI失调 影响的患者提供新的药理学治疗。
根据这些发现，本发明涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物， 更优选式I的非免疫抑制性环孢霉素A，和最优选式III的非免疫抑制性环 孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于减轻UCMD患者细胞中线粒 体障碍和凋亡率的用途。
式I
其中
W是MeBmt、二氢-MeBmt、8’-羟基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R是Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y是MeLeu、硫代MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、 MeAla、MeaIle或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、 N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R为Sar时Y不 能为MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeAla或Pro，
T1是(D)Ala或Lys，
T2是MeLeu或γ-羟基-MeLeu，和
T3是MeLeu或MeAla。
式II
其中
W’是MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R’是Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeaIle 或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N- 乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R为Sar时Y不能为MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
式III
其中MeBmt是N-甲基-(4R)-4-丁-2E-烯-1-基-4-甲基-(L)苏氨酸，αAbu 是L-α-氨基丁酸，D-MeAla是N-甲基-D-丙氨酸，EtVal是N-乙基-L-缬氨 酸，Val是L-缬氨酸，MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，Ala是L-丙氨酸，(D)Ala 是D-丙氨酸，而MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
可以使用非免疫抑制性环孢霉素A衍生物体外抑制由UCMD患者活 体组织切片制备的肌肉细胞的凋亡。抑制凋亡的发现可以作为说明用非免 疫抑制性环孢霉素A衍生物治疗患者有效减轻了疾病严重程度的指标。
本发明还涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉 素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于治疗UCMD患者的用途。活性 化合物，例如非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可以通过便利的途径给药。 可以肠道外给药，例如以注射溶液或混悬液的形式，或者以可注射沉降制 剂的形式给药。优选地，通过饮用的溶液或混悬液、片剂或胶囊的形式口 服给药。实施例中描述了包含非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的口服给药的药物组合物。如实施例所证明的， 这些药物组合物通常包含优选的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和一种或 更多可药用的载体物质。合适的药用载体在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA (1990)中描述，所述文献为本领域标准的参考文本。有时将这些组合物浓 缩，并在给药前需要与合适的稀释剂例如水混合。肠道外给药的药物组合 物通常还包括一种或更多赋形剂。可选的赋形剂包括等渗剂、缓冲液或其 他控制pH的试剂，和防腐剂。可以为保持组合物和获得优选的pH范围(约 6.5-7.5)和渗透浓度(约300mosm/L)而加入这些赋形剂。
用于口服的环孢霉素制剂的其他实例可以在美国专利5,525,590和 5,639,724和美国专利申请2003/0104992中找到。通过口服进入，非免疫 抑制性环孢霉素A衍生物每天给药的或每周三次给药的指定剂量可以从约 1mg/kg至约100mg/kg，优选从约1mg/kg至约20mg/kg。通过静脉途径， 相应的指定剂量可以从约1mg/kg至约50mg/kg，优选从约1mg/kg至约 25mg/kg。有效量的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物应理解为在治疗期间 对UCMD患者反复给药时，产生目的临床反应，比如改善、稳定或疾病 发展进程减缓。这些临床反应可以通过，例如定量等长肌力(QIS)测试进行 评价。QIS可以在压力传感和记录设备的辅助下，客观评价肌肉力量。可 替换地，凋亡率的正常化可以通过本领域技术人员已知的生物化学和免疫 组织化学方法在肌肉活体组织切片中进行评价。最后，可以使用肌电图， 其显示肌肉图而不是神经图，其可以量化。
进行初始的I期临床研究，评价[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA口服剂量的 安全性，并确定药物的药物动力学性质和安全性。研究显示，水中微乳液 50至1600mg的剂量可以很好地耐受。观察到有轻微而短暂的副作用，包 括恶心、呕吐、腹痛和轻微头痛。这些副作用不是剂量相关型的。
在为测试本发明包含式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 药物组合物效果而确定试验剂量时，临床医生会考虑很多因素。其中最主 要的是非免疫抑制性环孢霉素A衍生物的毒性和半衰期。其他因素包括患 者的体形大小、患者的年龄、患者的概况(包括机械通气、疾病的临床阶 段、症状的严重程度)、患者体内是否有其他药物等。治疗过程需要将本 发明的药物组合物反复给药。通常，每天约按足够的剂量给药一次。因为 疾病的遗传性质，治疗可能需要持续很长时间，可能是患者的一生。
目前已知还没有UCMD的有效药理学治疗。通过接种疫苗支持患者 对抗流行性感冒和肺炎球菌感染，并用抗生素激进地治疗任何感染。因此， 除了非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，本发明的药物组合物可以包含一种 或更多其他活性组分，比如，例如，一种或更多的抗生素。环孢霉素A衍 生物和这些其他活性组分可以作为相同药物组合物的一部分一起给药，或 者可以作为为获得所有活性组分的益处而设计的适当剂量方案的一部分 而单独给药。适当剂量方案、每次给药的剂量和每种活性组分剂量之间的 具体间隔将取决于使用的活性剂的具体组合、要治疗的患者的条件和前面 部分中讨论的其他因素。这些其他活性组分通常将以与已知作为单独的治 疗剂而有效的量的相同量给药。公众可以获得已经获得FDA批准的对人 用药的这些活性剂的FDA批准剂量。
本发明还涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉 素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于减轻BM患者细胞中线粒体功能 障碍和降低凋亡率的用途。此外，本发明还涉及患者中BM的治疗方法， 其包含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优 选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制 性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。此外，本发明还涉及式I、 II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在用于生产治疗BM的药物中 的用途。最后，本发明涉及治疗BM的药物组合物，其包含有效量的式I、 II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可药用的载体和，可选地， 赋形剂和稀释剂。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物应该视为通过引用全部并入 本文。
本发明进一步由下述实施例详细阐述。实施例为向本领域技术人员说 明而提供，并不意欲将发明范畴限定于权利要求所述内容。因此，本发明 不应该理解为受所提供实施例的限定，而应该理解为包括因为本文提供教 导而显而易见的任何和全部变化。
实施例
实施例1：环孢霉素A和非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对来自UCMD患者的成肌细胞培养物的线粒体 TMRM荧光(线粒体膜电位的度量)和凋亡发生率的影响。
图1的A和B表明，来自UCMD患者l(A)和4(B)的成肌细胞中线粒 体膜电位是时间的函数。根据四甲基罗丹明甲酯(TMRM)的积累测定线粒 体膜电位。将成肌细胞接种于24mm圆形盖玻片上，并在补加20％FCS 的DMEM中生长两天。因此，载入电位滴定探针的线粒体和细胞的范围 受质膜多药物抗性泵的活性影响，所述泵受环孢霉素A抑制。因此用环孢 霉素A治疗可能引起线粒体荧光增加，其会被错误理解为线粒体膜电位的 增加。为了避免这样的假象并将载入条件标准化，在1.6μM环孢霉素H 存在的情况下进行实验，环孢霉素H可以抑制多药物抗性泵，但不影响 PTP。对于线粒体膜电位的测定，将细胞漂洗一次，然后在补加1.6μM环 孢霉素H并载入10nM TMRM的无血清DMEM中培育30分钟。在每次 实验末期，通过加入4μM质子载体羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙(FCCP) 而使线粒体完全去极化。用安装有用于落射照明的氙光源(75W)和12比特 数字致冷CCD照相机(Micromax，Princeton Instruments)的Olympus IX71/IX51倒置显微镜获得细胞荧光图像。对于荧光检测，使用568+/-25nm 带通激发和585nm长通发射过滤器设置。使用40X、1.3NA的油浸物镜 (Nikon)，用100毫秒的曝光时间收集图像。使用Cell R软件(Olympus)收 集并分析数据。将几个(10-30)线粒体组成的簇确定为目的区域，将不包含 细胞的视野作为背景。每2分钟获得连续的数字图像，记录并保存平均荧 光强度，用于后面的分析。在图A和B所示的实验中，如讨论的将玻片上 的细胞载入TMRM，在箭头指示的位置，在不进行进一步处理(空心符号) 或用1.6μM环孢霉素A(实心方块)或1.6μM[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(实 心三角)处理30分钟后，加入6μM寡霉素(寡)和4μM FCCP。图1的 C：在不进行进一步处理(基础)或用1.6μM环孢霉素A或1.6μM [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理培育2小时后，将来自患者1(P1)和4(P4)的 成肌细胞在塑料碟上培育，并计数存在的TUNEL-阳性核。数据为至少四 次独立实验的±S.D的平均值。(*)，与基础条件相比，P＜0.01。如前所述 评价凋亡情况。
图1中报告的结果证明，在防止来自UCMD患者的细胞中产生寡霉素 依赖型线粒体去极化和将凋亡发生率恢复至来自健康供体的细胞所显示 的水平中，非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA与环 孢霉素A一样有效。
实施例2：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的合成
(翻译自Jean Francois Guichou题为“De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-VIH-1”的博士论文，Faculte des Sciences， University of Lausanne，CH-1015 Lausanne，Switzerland(2001))。
实例A：
H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Oac)-A bu-Sar-OMe的合成：
向环孢霉素A(CsA)(8.3毫摩尔；10g)的100ml乙酸酐溶液加入4-二 甲基氨基吡啶(DMAP)(41.5毫摩尔；5.8g)。室温搅拌溶液18小时。然 后用600ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用水洗涤两次，用碳酸氢钠饱和 水溶液洗涤四次。将有机相通过无水Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。 获得的黄色残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：98∶2的二氯甲烷/ 甲醇)并在醚中重结晶。回收得到9.5g MeBmt(OAc)-CsA，其为白色粉末， 得率为92％。
向MeBmt(OAc)-Cs(7.5毫摩尔；9.4g)的60ml二氯甲烷溶液加入三甲 基氧鎓四氟硼酸(22.5毫摩尔；3.3g)。室温放置16小时后，加入35ml 0.26M甲醇钠的甲醇溶液。1小时后，加入35ml甲醇和35ml 2N硫酸， 将反应混合物再搅拌15分钟，用饱和KHCO3(28ml)中和至pH 6.0，并用 乙酸乙酯萃取两次。用饱和NaCl洗涤两次有机相，通过无水Na2SO4干燥 并过滤。然后，减压蒸发溶剂。残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂： 5∶1乙酸乙酯/甲醇)。得到7.3g H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-S ar-OMe(得率：76％)。
HPLC tr＝268.23mn(98％)
ES/MS：m/z：1277.5[M+H+]，639.2[M+2H+]
实例B：
H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar- OMe的合成：
向
H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)- Abu-Sar-OMe(4.6毫摩尔；7g)的48ml四氢呋喃溶液中加入DMAP(2.3 毫摩尔；334mg)和异硫氰酸苯酯(6.9毫摩尔；0.75ml)。2小时后，将 溶剂蒸发，并将粗产物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：9∶1叔丁基甲 醚(MTBE)/乙酸乙酯(1)；9∶1MTBE/甲醇(2))。得到5.8g Ph-NH-C(S)- MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar- OMe(90％得率)。
向后者化合物(4毫摩尔；5.6g)的290ml二氯甲烷溶液中加入13.8ml 三氟乙酸。反应1小时后，使用KHCO3中和，并用500ml二氯甲烷稀释。 用饱和NaCl洗涤两次有机相，通过无水Na2SO4干燥并过滤。然后，减压 蒸发溶剂。残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：9∶1MTBE/乙酸乙 酯(1)；3∶1MTBE/甲醇(2))。得到2.8g H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(61％得率)。
HPLC tr＝25.80mn(99％)
ES/MS：m/z：1050.5[M+H+]，547.7[M+2H+]
实例C：
Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeB mt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH的合成：
在惰性气氛下，向H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(0.87毫摩尔；1.00g)、DIPEA(2.78毫摩尔； 0.48ml)和Boc-D-MeAla-EtVal-OH(0.96毫摩尔；0.32g)的15ml二氯 甲烷溶液中加入氟-N，N，N’-四甲基甲脒六氟磷酸酯(TFFH)(0.96毫摩尔； 0.25g)。15分钟后，将二氯甲烷蒸发，并将残余物溶于乙酸乙酯。用饱 和NaHCO3溶液、10％的柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液先后洗涤有机相，然 后通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝胶上的色谱(洗脱剂：98∶2乙酸 乙酯/甲醇)纯化得到1.14g(90％) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe。
将后面的产物(0.64毫摩尔；0.93g)溶于45ml无水甲醇，并历时3 小时30分钟，每隔15分钟加入少量硼氢化钠(25.5毫摩尔；0.96g)。4小 时时，将反应化合物冷却至0℃，通过加入10％柠檬酸而水解并浓缩。将 残余物溶于乙酸乙酯。用10％柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液洗涤有机相， 通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝胶上进行色谱(洗脱剂：95∶5乙酸 乙酯/甲醇)纯化后，得到0.63g(81％) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH。
ES/MS：m/z：1434.9[M+H+]，717.9[M+2H+]
实例D：
H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt -Abu-OH的合成：
向Boc-D-Me Ala-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH(0.425毫摩尔；610mg)的42.5ml 甲醇烷溶液加入甲磺酸(3.18毫摩尔；2.060ml)，将混合物加热至50℃ 并保持该温度。通过HPLC和质谱监控反应进程。80小时后，将混合物冷 却至0℃，并通过加入1M NaHCO3而水解。除去甲醇，并将残余物溶于 乙酸乙酯。先用1M NaHCO3溶液，然后用饱和NaCl溶液洗涤有机相， 通过无水Na2SO4干燥并浓缩。产物(557mg)， H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-O-CH2-CH2-NHMe，用于下一步骤而无需纯化。
将产物(0.42毫摩尔；557mg)溶解于20ml甲醇中，并在惰性气氛 下与甲醇钠(1.26毫摩尔)的1.26ml甲醇溶液合并。室温18小时后，将 反应化合物冷却至0℃，并滴加氢氧化钠(4.2毫摩尔；168mg)的5ml 水溶液。室温21小时后，再次将反应物冷却至0℃，并用1M KHSO4中 和。去除甲醇，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。用半饱和NaCl溶液洗涤 有机相，通过无水Na2SO4干燥并浓缩。产物(335mg；64％)， H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala- MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH在下一步骤中使用且无需纯化。
HPLC tr＝26.27mn(86％)
ES/MS：m/z：1235.5[M+H+]，618.2[M+2H+]
实例E：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的合成：
在惰性气氛下，向(7-氮杂苯丙三唑-1-酰氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸 盐(PyAOP，0.486毫摩尔；254mg)的3.2升二氯甲烷溶液中滴加入 H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu -OH(0.162毫摩尔；200mg)和sym可力丁(1.78毫摩尔；0.24ml)的 50ml二氯甲烷溶液。72小时后，通过加入10％Na2CO3溶液将反应混合 物水解。将二氯甲烷蒸发，并将残余物溶于乙酸乙酯。用0.1N HCl溶液 和NaCl饱和溶液先后洗涤有机相，通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝 胶上纯化粗产物，得到110mg(59％)[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA。
HPLC tr＝30.54mn(100％)
ES/MS：m/z：1217.6[M+H+]，609.3[M+2H+]
实施例3：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的口服制剂
量以重量百分比(w％w)表示。
实例A：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
糖原质(Glycofurol)75 35.95
中链三甘油酯(Miglycol)812 18
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 35.95
α-生育酚 0.1
实例B：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
四甘醇 2
Captex 800 2
Nikkol HCO-40 85.9
丁基羟基甲苯(BHT) 0.1
实例C：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
糖原质75 39.95
中链三甘油酯812 14
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 36
丁基羟基苯甲醚(BHA) 0.05-0.1
实例D：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
四甘醇 10
辛酸/癸酸三甘油酯 5
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 74.9
α-生育酚 0.1
实例E：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
乙醇 9
丙二醇 8
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 41
甘油单亚油酸酯 32
对于制剂A-D中每种组分及制备方法参见英国专利申请2,222,770。
实施例4：胶原VI敲除小鼠中[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的治疗效果
对一组四只胶原VI敲除小鼠(Col6a1-/-；5-6个月大；性别平衡)每 天腹腔给药两次，共5天，给药剂量为5mg/kg[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。 对照组的四只动物用安慰制剂进行相似的治疗。在宰杀动物后，收集每个 动物的血液样品，然后分离肝脏，并从后腿分离肌肉，处理制备线粒体， 用于钙保持能力(CRC)检测。同时，分离横膈肌和屈趾短肌，处理用于组 织病理学和原位线粒体功能评价(线粒体跨膜电位)。所有体内实验都由 合适的机构批准，并根据机构的指导进行。
方法
线粒体的制备和CRC检测
如Fontaine et al.1998.J.Biol.Chem.273：25734-25740和Fontaine and Bernardi 1999.J.Bioenerg.Biomembr.31：335-345所述，通过差速离心从肝 脏和肌肉匀浆制备线粒体。在Ca2+指示剂Calcium Green-5N (Molecular Probes；激发：505nm；发射：535nm)存在的情况下，使用安装有磁力搅 拌子和控温装置的荧光分光光度计评估线粒体制备物的CRC。培养基包含 0.25M蔗糖、10mM Tris-MOPS、5mM谷氨酸、2.5mM苹果酸、1(肝 脏)或10(肌肉)mM Pi-Tris、20μM Calcium Green-5N(pH 7.4)。
骨骼肌纤维的分离与培养和TMRM检测
如Irwin et al.2003.Nat.Genet.35：267-271所述分离FDB纤维。将完 整的肌纤维涂布在包被层粘蛋白(3μg/cm2)的盖玻片上，并在包含10％胎牛 血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。就本实验而言，将FDB纤维 置于1ml Tyrode缓冲液中，并如Irwin等所述载入20nM TMRM(Molecular Probes)。使用Olympus IX71/IX51倒置显微镜获得线粒体TMRM荧光的 图像。
TUNEL检测
在4％多聚甲醛中固定和石蜡包埋后，制备肌肉横膈的7μm切片。使 用ApopTag原位凋亡检测试剂盒(Intergen)进行TUNEL。用过氧化物酶/二 氨基联苯胺将样品染色，检测TUNEL阳性的核，并用Hoechst 33258(Sigma) 复染，如Irwin等所述标记出所有核。使用安装有Leica DC 500照相机的 Zeiss Axioplan显微镜，确定随机选择的纤维中核的总数和TUNEL阳性核 的数目。
结果
[D-Me Ala]3-[EtVal]4-CsA对通透性转换孔(PTP)的离体影响
在监控线粒体外Ca2+的Calcium Green-5N存在的情况下，培育分离自 用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰制剂处理的Col6a1-/-小鼠的肝脏和后腿 肌肉的能化线粒体。然后施加Ca2+脉冲系列，每次脉冲加至到达引起PTP 打开的阈值浓度为止。这种操作可以对PTP增敏剂和脱敏剂的作用进行详 细分析(Fontaine et al.1998.)。结果显示，在用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处 理的小鼠肝脏和肌肉线粒体中，均出现了PTP对Ca2+和Pi脱敏现象，显 示PTP开放所需的Ca2阈值增加(图2)。这种作用对于肌肉线粒体特别显 著，CRC接近直接向培养基加入[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA可实现的最大水 平。参见图BII，d线与d’线。从对四只[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理(小 鼠24-27)和四只安慰剂处理小鼠(小鼠28-31)的线粒体的分析得出的结 果概要示于图3中。
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对FDB纤维中线粒体跨膜电位的作用
通过四甲基罗丹明甲酯(TMRM)的线粒体荧光变化评估线粒体跨膜电 位，TMRM是一种荧光探针，可以在极化线粒体中积累，当跨膜电位降低 时会释放出去。曾经表明，线粒体F1F0-ATP合成酶的抑制剂寡霉素可以 显示Col6a1-/-肌肉纤维中的线粒体功能障碍。向分离自安慰剂处理Col6a1-/- 小鼠的纤维加入寡霉素，大多数纤维中的TMRM荧光产生了预期的降低 (图4A)。体内用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理使观察到线粒体去极化的 纤维数目显著降低(图4B)。表1分别总结了用安慰剂或 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的每只个体小鼠的结果。
表1：加入寡霉素后的去极化纤维
组 小鼠# 加入寡霉素后去极化 的纤维数目 纤维总数 2(安慰剂) 28 3 6 29 6 8 30 4 8 31 5 9 1 ([D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA) 24 4 12 25 2 8 26 4 10 27 0 10
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对横膈凋亡的作用
将来自[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(#24-27)或安慰剂(#28-31)处理的 Co16a1-/-每只小鼠的横膈制成切片。通过TUNEL检测检查每只动物的二十 至三十个切片。与用安慰剂处理的小鼠相比，来自用 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的小鼠的横膈纤维表现出凋亡核显著减少 (图5)。用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA进行体内处理与CsA一样有效。
超微结构评估
将来自用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(#24-27)或安慰剂(#28-31)处理的 Col6a1-/-小鼠的横膈肌样品在牙科蜡支撑物上轻轻拉长，以防止在固定过 程中收缩。为了固定，将样品在包含2.5％戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中4℃培育3小时，在0.15M磷酸盐缓冲液中过夜洗涤，在1％四氧 化锇的巴比妥溶液中后固定，脱水并包埋在Epon 812环氧树脂中。用乙酸 铀酰和柠檬酸铅将超薄切片染色，并在以100千伏工作的Philips EM 400 透射式电子显微镜下观察。为了计学分析，研究了来自每个样品组织的三 个不同块中的300条肌肉纤维(图6)。与对照小鼠(#28-31)相比， [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理小鼠(#24-27)中发生改变的显示有肿胀或电 密内含物的线粒体的纤维数目显著降低。
对用包含[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的制剂或安慰剂制剂口服治疗的 Col6a1-/-小鼠进行了类似的实验。观察到来自[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA治疗 动物的肌肉线粒体中CRC明显增加，说明环孢霉素引起了PTP去极化。 此外，横膈肌切片上的TUNEL检测说明用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA进行 体内治疗可引起凋亡产生率显著降低。
实施例5：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对UCMD和BM患者的初步临床 试验
有五名患者参加，其中四名UCMD患者，一名BM患者。患者分别 在COL6A1、COL6A2或COL6A3基因发生变异。设计试验，测试用CsA 治疗是否对于减轻线粒体功能障碍有效，这通过寡霉素引起肌肉纤维中线 粒体去极化进行评估。根据TMRM荧光的变化检测去极化。用每日5mg/kg CsA的口服剂量治疗患者，持续三十天。在治疗前和治疗后立即取肌肉活 体组织，并处理用于TMRM检测。五名患者的平均结果表明，在治疗前， 寡霉素诱导90％肌肉细胞极化，但治疗后仅有37％。因此，通过用寡霉素 诱导的极化进行检测，用CsA进行短期治疗能够基本减轻线粒体功能障 碍。
这五名患者代表了UCMD的不同严重程度范围：全部为先天发作； 三人(患者2、3和5)从来不能站立和行走；一人(患者4)只能在支撑 下站立；一人(患者1)能够行走。胶原VI的减少从轻微(患者1和4)， 到显著(患者2和3)，再到完全缺乏(患者5)。突变影响了三个个案 (患者2、4和5)中的COL6A1基因和一个个案(患者1)中的COL6A3 基因，一个个案(患者3)中则不明确。
在征得患者同意并获得伦理委员会批准之后，得到了来自五名患者和 一名健康志愿者的四头肌肌肉活体组织。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导 的dUTP缺口末端标记(TUNEL)方法评估凋亡率。从肌肉活体组织制备七 微米厚的冷冻切片，并在50％丙酮-50％甲醇中固定。使用Apoptag原位凋 亡检测试剂盒(Chemicon)进行TUNEL。样品用过氧化物酶-二氨基联苯胺 染色，显示TUNEL-阳性核，并用Hoechst 33258(Sigma)复染，标记所有核。 使用安装有数码相机的Zeiss Axioplan显微镜(40倍放大)在随机选择的 视野中确定核的总数和TUNEL-阳性核的数目。数据以平均值±SD的形式 表示。用非配对Student t检验分析数据，认为P＜0.01的数值显著。结果 显示，与健康供体相比，所有患者样本中凋亡核的频率要高得多，对于患 者1、2和3，其数值约增加10倍，对于患者4和5，增加超过200倍。 凋亡增加与所有患者的肌肉活体组织切片中胶原VI表达显著下降相对应， 如用针对胶原VI的选择性抗体染色所证明的。
进行实验测试胶原VI缺乏和凋亡之间是否存在因果关系。从两名未 患病的对照和患者1、2、3和4的肌肉活体组织切片，通过酶和机械处理， 并在补加20％胎牛血清、青霉素、链霉素和两性霉素B(Sigma)的Dulbecco 修正Eagle培养基(DMEM)上涂布，制备成肌细胞培养物。为了测试凋亡， 细胞在50％丙酮-50％甲醇中固定，并处理以用于使用Dead End荧光 TUNEL系统(Promega)进行TUNEL分析。通过用Hoechst 33258染色，显 示所有核。来自所有患者的培养物与健康供体相比，表现出更高的凋亡发 生率。在胶原VI上涂布或用环孢霉素A处理可将患者样品中凋亡发生率 完全正常化。来自患者2、3和4的肌肉细胞培养物如预期地显示出较低 水平的胶原VI到几乎没有胶原VI，如之前在患者1和5中所示(Demir et al.2002.Giusti et al.2005)。
要评估胶原VI和CsA的抗凋亡作用是否能上溯至线粒体，研究了活 体肌肉细胞培养物中的线粒体功能。如同预期的，向建立自健康供体的培 养物中加入寡霉素没有引起线粒体去极化，而加入质子载体羰基氰化物- 对-三氟甲氧基苯腙则可立刻引起线粒体去极化。改为向来自所有UCMD 患者的细胞中加入寡霉素之后产生了线粒体去极化。明显地，用环孢霉素 A或胞内Ca2螯合剂BAPTA-M，或在胶原VI上涂布细胞，可将对寡霉素 的响应完全恢复正常，表明UCMD的发病机理与PTP有关。根据四甲基 罗丹明甲酯(TMRM)的积累评估线粒体膜电位。要注意的是，预期在健康 的呼吸细胞中加入寡霉素会引起超极化，其中线粒体膜电位通过呼吸链质 子泵维持，而且用质子电化学梯度驱动ATP合成。因此，由寡霉素在UCMD 成肌细胞培养物中诱导的线粒体去极化是反常响应，说明膜电位不是由呼 吸维持，而是通过线粒体ATP合成酶“反向”工作，将质子从基质泵至膜 间空间，从而消耗糖酵解的ATP。
通过电镜研究了建立自健康供体和患者1、2和3的肌肉细胞培养物。 在UCMD样品中，患者1、2和3体内的线粒体面积/周长比例明显增加， 分别比健康供体高62.5、75和50％(p＜0.05)。这一发现说明在UCMD肌肉 细胞中，线粒体拉长显著少于正常样本。还观察到，与对照相比(＜300nm)， 患者中4-8％的线粒体的短轴值增加(＞400nm)。综上所述，这些发现表明 在UCMD细胞中存在尺度增加的线粒体部分。来自UCMD患者的细胞中 有较小百分比(在4和5％之间，来自健康供体的细胞为1％)还显示有肿 胀的线粒体，伴有低密度基质，而且缺少嵴。明显地，当UCMD细胞在 胶原VI上涂布时，面积/周长比例和短轴值变得与健康供体相似；而在胶 原VI上涂布或用环孢霉素A处理可将具有肿胀线粒体的细胞的数目降至 来自健康供体的培养物中观察到的数值。
用F1FO ATP合成酶抑制剂寡霉素处理培养物可将对照中具有肿胀线 粒体的细胞百分比增加至4％，UCMD患者中则超过40％，这一发现表明 存在能由寡霉素选择性放大的潜在线粒体功能障碍，如前面胶原VI缺陷 小鼠模型所表明的。寡霉素的作用可以通过用环孢霉素A处理而阻止，使 具有肿胀线粒体的细胞百分比恢复至与所有细胞培养物的基础数值相似。 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在防止来自 UCMD患者的细胞出现寡霉素依赖型线粒体去极化上和环孢霉素A一样 有效，并将凋亡发生率恢复至来自健康供体的细胞所表现的水平。在实施 例1中讨论了得出这些发现的实验。
明显的是，可以从具有UCMD临床症状的患者的原代培养物中发现 线粒体缺陷，无论原代基因缺陷是在COL6A1还是COL6A3基因中，而且 潜在的线粒体异常并不预测临床症状严重性。这些发现表明，线粒体与所 有UCMD个案的发病机理有关，而且有其他基因和/或环境因素在个体对 肌肉纤维死亡和再生的易感性中起作用。所有线粒体异常和随之而来的凋 亡可以通过将UCMD细胞涂布在胶原VI上或将它们接触环孢霉素A而治 愈。这些发现证明，从原理来讲，遗传病变下游的发病链可以由合适的药 物阻断，至少在早期可以阻断。公知环孢霉素A可以引起免疫抑制，这是 对患者进行长期治疗的主要障碍。本发明发明人关键的观察结果是，非免 疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在减轻UCMD细胞中 的线粒体障碍和降低凋亡率时，与环孢霉素A一样有效。这一发现证明， 环孢霉素的免疫抑制活性与其细胞保护作用无关，可以为受胶原VI失调 影响的患者提供新的药理学治疗。
根据这些发现，本发明涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物， 更优选式I的非免疫抑制性环孢霉素A，和最优选式III的非免疫抑制性环 孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于减轻UCMD患者细胞中线粒 体障碍和凋亡率的用途。
式I
其中
W是MeBmt、二氢-MeBmt、8’-羟基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R是Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y是MeLeu、硫代MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、 MeAla、MeaIle或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、 N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R为Sar时Y不 能为MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeAla或Pro，
T1是(D)Ala或Lys，
T2是MeLeu或γ-羟基-MeLeu，和
T3是MeLeu或MeAla。
式II
其中
W’是MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt，
X是αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)，
R’是Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)，
Y’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeaIle 或MeaThr；N-乙基Val(EtVal)、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N- 乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)，其中R为Sar时Y不能为MeLeu，
Z是Val、Leu、MeVal或MeLeu，
Q’是MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
式III
其中MeBmt是N-甲基-(4R)-4-丁-2E-烯-1-基-4-甲基-(L)苏氨酸，αAbu 是L-α-氨基丁酸，D-MeAla是N-甲基-D-丙氨酸，EtVal是N-乙基-L-缬氨 酸，Val是L-缬氨酸，MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，Ala是L-丙氨酸，(D)Ala 是D-丙氨酸，而MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
可以使用非免疫抑制性环孢霉素A衍生物体外抑制由UCMD患者活 体组织切片制备的肌肉细胞的凋亡。抑制凋亡的发现可以作为说明用非免 疫抑制性环孢霉素A衍生物治疗患者有效减轻了疾病严重程度的指标。
本发明还涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉 素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于治疗UCMD患者的用途。活性 化合物，例如非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可以通过便利的途径给药。 可以肠道外给药，例如以注射溶液或混悬液的形式，或者以可注射沉降制 剂的形式给药。优选地，通过饮用的溶液或混悬液、片剂或胶囊的形式口 服给药。实施例中描述了包含非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的口服给药的药物组合物。如实施例所证明的， 这些药物组合物通常包含优选的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物和一种或 更多可药用的载体物质。合适的药用载体在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA (1990)中描述，所述文献为本领域标准的参考文本。有时将这些组合物浓 缩，并在给药前需要与合适的稀释剂例如水混合。肠道外给药的药物组合 物通常还包括一种或更多赋形剂。可选的赋形剂包括等渗剂、缓冲液或其 他控制pH的试剂，和防腐剂。可以为保持组合物和获得优选的pH范围(约 6.5-7.5)和渗透浓度(约300mosm/L)而加入这些赋形剂。
用于口服的环孢霉素制剂的其他实例可以在美国专利5,525,590和 5,639,724和美国专利申请2003/0104992中找到。通过口服进入，非免疫 抑制性环孢霉素A衍生物每天给药的或每周三次给药的指定剂量可以从约 1mg/kg至约100mg/kg，优选从约1mg/kg至约20mg/kg。通过静脉途径， 相应的指定剂量可以从约1mg/kg至约50mg/kg，优选从约1mg/kg至约 25mg/kg。有效量的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物应理解为在治疗期间 对UCMD患者反复给药时，产生目的临床反应，比如改善、稳定或疾病 发展进程减缓。这些临床反应可以通过，例如定量等长肌力(QIS)测试进行 评价。QIS可以在压力传感和记录设备的辅助下，客观评价肌肉力量。可 替换地，凋亡率的正常化可以通过本领域技术人员已知的生物化学和免疫 组织化学方法在肌肉活体组织切片中进行评价。最后，可以使用肌电图， 其显示肌肉图而不是神经图，其可以量化。
进行初始的I期临床研究，评价[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA口服剂量的 安全性，并确定药物的药物动力学性质和安全性。研究显示，水中微乳液 50至1600mg的剂量可以很好地耐受。观察到有轻微而短暂的副作用，包 括恶心、呕吐、腹痛和轻微头痛。这些副作用不是剂量相关型的。
在为测试本发明包含式I、II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 药物组合物效果而确定试验剂量时，临床医生会考虑很多因素。其中最主 要的是非免疫抑制性环孢霉素A衍生物的毒性和半衰期。其他因素包括患 者的体形大小、患者的年龄、患者的概况(包括机械通气、疾病的临床阶 段、症状的严重程度)、患者体内是否有其他药物等。治疗过程需要将本 发明的药物组合物反复给药。通常，每天约按足够的剂量给药一次。因为 疾病的遗传性质，治疗可能需要持续很长时间，可能是患者的一生。
目前已知还没有UCMD的有效药理学治疗。通过接种疫苗支持患者 对抗流行性感冒和肺炎球菌感染，并用抗生素激进地治疗任何感染。因此， 除了非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，本发明的药物组合物可以包含一种 或更多其他活性组分，比如，例如，一种或更多的抗生素。环孢霉素A衍 生物和这些其他活性组分可以作为相同药物组合物的一部分一起给药，或 者可以作为为获得所有活性组分的益处而设计的适当剂量方案的一部分 而单独给药。适当剂量方案、每次给药的剂量和每种活性组分剂量之间的 具体间隔将取决于使用的活性剂的具体组合、要治疗的患者的条件和前面 部分中讨论的其他因素。这些其他活性组分通常将以与已知作为单独的治 疗剂而有效的量的相同量给药。公众可以获得已经获得FDA批准的对人 用药的这些活性剂的FDA批准剂量。
本发明还涉及式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优选式II的 非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制性环孢霉 素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA用于减轻BM患者细胞中线粒体功能 障碍和降低凋亡率的用途。此外，本发明还涉及患者中BM的治疗方法， 其包含对患者施用有效量的式I的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，更优 选式II的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，和最优选式III的非免疫抑制 性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。此外，本发明还涉及式I、 II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物在用于生产治疗BM的药物中 的用途。最后，本发明涉及治疗BM的药物组合物，其包含有效量的式I、 II或III的非免疫抑制性环孢霉素A衍生物，可药用的载体和，可选地， 赋形剂和稀释剂。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物应该视为通过引用全部并入 本文。
本发明进一步由下述实施例详细阐述。实施例为向本领域技术人员说 明而提供，并不意欲将发明范畴限定于权利要求所述内容。因此，本发明 不应该理解为受所提供实施例的限定，而应该理解为包括因为本文提供教 导而显而易见的任何和全部变化。
实施例
实施例1：环孢霉素A和非免疫抑制性环孢霉素A衍生物 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对来自UCMD患者的成肌细胞培养物的线粒体 TMRM荧光(线粒体膜电位的度量)和凋亡发生率的影响。
图1的A和B表明，来自UCMD患者l(A)和4(B)的成肌细胞中线粒 体膜电位是时间的函数。根据四甲基罗丹明甲酯(TMRM)的积累测定线粒 体膜电位。将成肌细胞接种于24mm圆形盖玻片上，并在补加20％FCS 的DMEM中生长两天。因此，载入电位滴定探针的线粒体和细胞的范围 受质膜多药物抗性泵的活性影响，所述泵受环孢霉素A抑制。因此用环孢 霉素A治疗可能引起线粒体荧光增加，其会被错误理解为线粒体膜电位的 增加。为了避免这样的假象并将载入条件标准化，在1.6μM环孢霉素H 存在的情况下进行实验，环孢霉素H可以抑制多药物抗性泵，但不影响 PTP。对于线粒体膜电位的测定，将细胞漂洗一次，然后在补加1.6μM环 孢霉素H并载入10nM TMRM的无血清DMEM中培育30分钟。在每次 实验末期，通过加入4μM质子载体羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙(FCCP) 而使线粒体完全去极化。用安装有用于落射照明的氙光源(75W)和12比特 数字致冷CCD照相机(Micromax，Princeton Instruments)的Olympus IX71/IX51倒置显微镜获得细胞荧光图像。对于荧光检测，使用568+/-25nm 带通激发和585nm长通发射过滤器设置。使用40X、1.3NA的油浸物镜 (Nikon)，用100毫秒的曝光时间收集图像。使用Cell R软件(Olympus)收 集并分析数据。将几个(10-30)线粒体组成的簇确定为目的区域，将不包含 细胞的视野作为背景。每2分钟获得连续的数字图像，记录并保存平均荧 光强度，用于后面的分析。在图A和B所示的实验中，如讨论的将玻片上 的细胞载入TMRM，在箭头指示的位置，在不进行进一步处理(空心符号) 或用1.6μM环孢霉素A(实心方块)或1.6μM[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(实 心三角)处理30分钟后，加入6μM寡霉素(寡)和4μM FCCP。图1的 C：在不进行进一步处理(基础)或用1.6μM环孢霉素A或1.6μM [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理培育2小时后，将来自患者1(P1)和4(P4)的 成肌细胞在塑料碟上培育，并计数存在的TUNEL-阳性核。数据为至少四 次独立实验的±S.D的平均值。(*)，与基础条件相比，P＜0.01。如前所述 评价凋亡情况。
图1中报告的结果证明，在防止来自UCMD患者的细胞中产生寡霉素 依赖型线粒体去极化和将凋亡发生率恢复至来自健康供体的细胞所显示 的水平中，非免疫抑制性环孢霉素A衍生物[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA与环 孢霉素A一样有效。
实施例2：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的合成
(翻译自Jean Francois Guichou题为“De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-VIH-1”的博士论文，Faculte des Sciences， University of Lausanne，CH-1015 Lausanne，Switzerland(2001))。
实例A：
H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Oac)-A bu-Sar-OMe的合成：
向环孢霉素A(CsA)(8.3毫摩尔；10g)的100ml乙酸酐溶液加入4-二 甲基氨基吡啶(DMAP)(41.5毫摩尔；5.8g)。室温搅拌溶液18小时。然 后用600ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用水洗涤两次，用碳酸氢钠饱和 水溶液洗涤四次。将有机相通过无水Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。 获得的黄色残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：98∶2的二氯甲烷/ 甲醇)并在醚中重结晶。回收得到9.5g MeBmt(OAc)-CsA，其为白色粉末， 得率为92％。
向MeBmt(OAc)-Cs(7.5毫摩尔；9.4g)的60ml二氯甲烷溶液加入三甲 基氧鎓四氟硼酸(22.5毫摩尔；3.3g)。室温放置16小时后，加入35ml 0.26M甲醇钠的甲醇溶液。1小时后，加入35ml甲醇和35ml 2N硫酸， 将反应混合物再搅拌15分钟，用饱和KHCO3(28ml)中和至pH 6.0，并用 乙酸乙酯萃取两次。用饱和NaCl洗涤两次有机相，通过无水Na2SO4干燥 并过滤。然后，减压蒸发溶剂。残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂： 5∶1乙酸乙酯/甲醇)。得到7.3g H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-S ar-OMe(得率：76％)。
HPLC tr＝268.23mn(98％)
ES/MS：m/z：1277.5[M+H+]，639.2[M+2H+]
实例B：
H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar- OMe的合成：
向
H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)- Abu-Sar-OMe(4.6毫摩尔；7g)的48ml四氢呋喃溶液中加入DMAP(2.3 毫摩尔；334mg)和异硫氰酸苯酯(6.9毫摩尔；0.75ml)。2小时后，将 溶剂蒸发，并将粗产物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：9∶1叔丁基甲 醚(MTBE)/乙酸乙酯(1)；9∶1MTBE/甲醇(2))。得到5.8g Ph-NH-C(S)- MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar- OMe(90％得率)。
向后者化合物(4毫摩尔；5.6g)的290ml二氯甲烷溶液中加入13.8ml 三氟乙酸。反应1小时后，使用KHCO3中和，并用500ml二氯甲烷稀释。 用饱和NaCl洗涤两次有机相，通过无水Na2SO4干燥并过滤。然后，减压 蒸发溶剂。残余物在硅凝胶上进行色谱分析(洗脱剂：9∶1MTBE/乙酸乙 酯(1)；3∶1MTBE/甲醇(2))。得到2.8g H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(61％得率)。
HPLC tr＝25.80mn(99％)
ES/MS：m/z：1050.5[M+H+]，547.7[M+2H+]
实例C：
Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeB mt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH的合成：
在惰性气氛下，向H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(0.87毫摩尔；1.00g)、DIPEA(2.78毫摩尔； 0.48ml)和Boc-D-MeAla-EtVal-OH(0.96毫摩尔；0.32g)的15ml二氯 甲烷溶液中加入氟-N，N，N’-四甲基甲脒六氟磷酸酯(TFFH)(0.96毫摩尔； 0.25g)。15分钟后，将二氯甲烷蒸发，并将残余物溶于乙酸乙酯。用饱 和NaHCO3溶液、10％的柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液先后洗涤有机相，然 后通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝胶上的色谱(洗脱剂：98∶2乙酸 乙酯/甲醇)纯化得到1.14g(90％) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe。
将后面的产物(0.64毫摩尔；0.93g)溶于45ml无水甲醇，并历时3 小时30分钟，每隔15分钟加入少量硼氢化钠(25.5毫摩尔；0.96g)。4小 时时，将反应化合物冷却至0℃，通过加入10％柠檬酸而水解并浓缩。将 残余物溶于乙酸乙酯。用10％柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液洗涤有机相， 通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝胶上进行色谱(洗脱剂：95∶5乙酸 乙酯/甲醇)纯化后，得到0.63g(81％) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH。
ES/MS：m/z：1434.9[M+H+]，717.9[M+2H+]
实例D：
H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt -Abu-OH的合成：
向Boc-D-Me Ala-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH(0.425毫摩尔；610mg)的42.5ml 甲醇烷溶液加入甲磺酸(3.18毫摩尔；2.060ml)，将混合物加热至50℃ 并保持该温度。通过HPLC和质谱监控反应进程。80小时后，将混合物冷 却至0℃，并通过加入1M NaHCO3而水解。除去甲醇，并将残余物溶于 乙酸乙酯。先用1M NaHCO3溶液，然后用饱和NaCl溶液洗涤有机相， 通过无水Na2SO4干燥并浓缩。产物(557mg)， H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-O-CH2-CH2-NHMe，用于下一步骤而无需纯化。
将产物(0.42毫摩尔；557mg)溶解于20ml甲醇中，并在惰性气氛 下与甲醇钠(1.26毫摩尔)的1.26ml甲醇溶液合并。室温18小时后，将 反应化合物冷却至0℃，并滴加氢氧化钠(4.2毫摩尔；168mg)的5ml 水溶液。室温21小时后，再次将反应物冷却至0℃，并用1M KHSO4中 和。去除甲醇，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。用半饱和NaCl溶液洗涤 有机相，通过无水Na2SO4干燥并浓缩。产物(335mg；64％)， H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala- MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH在下一步骤中使用且无需纯化。
HPLC tr＝26.27mn(86％)
ES/MS：m/z：1235.5[M+H+]，618.2[M+2H+]
实例E：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的合成：
在惰性气氛下，向(7-氮杂苯丙三唑-1-酰氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸 盐(PyAOP，0.486毫摩尔；254mg)的3.2升二氯甲烷溶液中滴加入 H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu -OH(0.162毫摩尔；200mg)和sym可力丁(1.78毫摩尔；0.24ml)的 50ml二氯甲烷溶液。72小时后，通过加入10％Na2CO3溶液将反应混合 物水解。将二氯甲烷蒸发，并将残余物溶于乙酸乙酯。用0.1N HCl溶液 和NaCl饱和溶液先后洗涤有机相，通过无水Na2SO4干燥并浓缩。在硅凝 胶上纯化粗产物，得到110mg(59％)[D-MeAla]3[EtVal]4-CsA。
HPLC tr＝30.54mn(100％)
ES/MS：m/z：1217.6[M+H+]，609.3[M+2H+]
实施例3：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的口服制剂
量以重量百分比(w％w)表示。
实例A：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
糖原质(Glycofurol)75 35.95
中链三甘油酯(Miglycol)812 18
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 35.95
α-生育酚 0.1
实例B：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
四甘醇 2
Captex 800 2
Nikkol HCO-40 85.9
丁基羟基甲苯(BHT) 0.1
实例C：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
糖原质75 39.95
中链三甘油酯812 14
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 36
丁基羟基苯甲醚(BHA) 0.05-0.1
实例D：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
四甘醇 10
辛酸/癸酸三甘油酯 5
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 74.9
α-生育酚 0.1
实例E：
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 10
乙醇 9
丙二醇 8
聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 41
甘油单亚油酸酯 32
对于制剂A-D中每种组分及制备方法参见英国专利申请2,222,770。
实施例4：胶原VI敲除小鼠中[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的治疗效果
对一组四只胶原VI敲除小鼠(Col6a1-/-；5-6个月大；性别平衡)每 天腹腔给药两次，共5天，给药剂量为5mg/kg[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。 对照组的四只动物用安慰制剂进行相似的治疗。在宰杀动物后，收集每个 动物的血液样品，然后分离肝脏，并从后腿分离肌肉，处理制备线粒体， 用于钙保持能力(CRC)检测。同时，分离横膈肌和屈趾短肌，处理用于组 织病理学和原位线粒体功能评价(线粒体跨膜电位)。所有体内实验都由 合适的机构批准，并根据机构的指导进行。
方法
线粒体的制备和CRC检测
如Fontaine et al.1998.J.Biol.Chem.273：25734-25740和Fontaine and Bernardi 1999.J.Bioenerg.Biomembr.31：335-345所述，通过差速离心从肝 脏和肌肉匀浆制备线粒体。在Ca2+指示剂Calcium Green-5N (Molecular Probes；激发：505nm；发射：535nm)存在的情况下，使用安装有磁力搅 拌子和控温装置的荧光分光光度计评估线粒体制备物的CRC。培养基包含 0.25M蔗糖、10mM Tris-MOPS、5mM谷氨酸、2.5mM苹果酸、1(肝 脏)或10(肌肉)mM Pi-Tris、20μM Calcium Green-5N(pH 7.4)。
骨骼肌纤维的分离与培养和TMRM检测
如Irwin et al.2003.Nat.Genet.35：267-271所述分离FDB纤维。将完 整的肌纤维涂布在包被层粘蛋白(3μg/cm2)的盖玻片上，并在包含10％胎牛 血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。就本实验而言，将FDB纤维 置于1ml Tyrode缓冲液中，并如Irwin等所述载入20nM TMRM(Molecular Probes)。使用Olympus IX71/IX51倒置显微镜获得线粒体TMRM荧光的 图像。
TUNEL检测
在4％多聚甲醛中固定和石蜡包埋后，制备肌肉横膈的7μm切片。使 用ApopTag原位凋亡检测试剂盒(Intergen)进行TUNEL。用过氧化物酶/二 氨基联苯胺将样品染色，检测TUNEL阳性的核，并用Hoechst 33258(Sigma) 复染，如Irwin等所述标记出所有核。使用安装有Leica DC 500照相机的 Zeiss Axioplan显微镜，确定随机选择的纤维中核的总数和TUNEL阳性核 的数目。
结果
[D-Me Ala]3-[EtVal]4-CsA对通透性转换孔(PTP)的离体影响
在监控线粒体外Ca2+的Calcium Green-5N存在的情况下，培育分离自 用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA或安慰制剂处理的Col6a1-/-小鼠的肝脏和后腿 肌肉的能化线粒体。然后施加Ca2+脉冲系列，每次脉冲加至到达引起PTP 打开的阈值浓度为止。这种操作可以对PTP增敏剂和脱敏剂的作用进行详 细分析(Fontaine et al.1998.)。结果显示，在用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处 理的小鼠肝脏和肌肉线粒体中，均出现了PTP对Ca2+和Pi脱敏现象，显 示PTP开放所需的Ca2阈值增加(图2)。这种作用对于肌肉线粒体特别显 著，CRC接近直接向培养基加入[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA可实现的最大水 平。参见图BII，d线与d’线。从对四只[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理(小 鼠24-27)和四只安慰剂处理小鼠(小鼠28-31)的线粒体的分析得出的结 果概要示于图3中。
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对FDB纤维中线粒体跨膜电位的作用
通过四甲基罗丹明甲酯(TMRM)的线粒体荧光变化评估线粒体跨膜电 位，TMRM是一种荧光探针，可以在极化线粒体中积累，当跨膜电位降低 时会释放出去。曾经表明，线粒体F1F0-ATP合成酶的抑制剂寡霉素可以 显示Col6a1-/-肌肉纤维中的线粒体功能障碍。向分离自安慰剂处理Col6a1-/- 小鼠的纤维加入寡霉素，大多数纤维中的TMRM荧光产生了预期的降低 (图4A)。体内用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理使观察到线粒体去极化的 纤维数目显著降低(图4B)。表1分别总结了用安慰剂或 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的每只个体小鼠的结果。
表1：加入寡霉素后的去极化纤维
组 小鼠# 加入寡霉素后去极化 的纤维数目 纤维总数 2(安慰剂) 28 3 6 29 6 8 30 4 8 31 5 9 1 ([D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA) 24 4 12 25 2 8 26 4 10 27 0 10
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对横膈凋亡的作用
将来自[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(#24-27)或安慰剂(#28-31)处理的 Co16a1-/-每只小鼠的横膈制成切片。通过TUNEL检测检查每只动物的二十 至三十个切片。与用安慰剂处理的小鼠相比，来自用 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的小鼠的横膈纤维表现出凋亡核显著减少 (图5)。用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA进行体内处理与CsA一样有效。
超微结构评估
将来自用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(#24-27)或安慰剂(#28-31)处理的 Col6a1-/-小鼠的横膈肌样品在牙科蜡支撑物上轻轻拉长，以防止在固定过 程中收缩。为了固定，将样品在包含2.5％戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中4℃培育3小时，在0.15M磷酸盐缓冲液中过夜洗涤，在1％四氧 化锇的巴比妥溶液中后固定，脱水并包埋在Epon 812环氧树脂中。用乙酸 铀酰和柠檬酸铅将超薄切片染色，并在以100千伏工作的Philips EM 400 透射式电子显微镜下观察。为了计学分析，研究了来自每个样品组织的三 个不同块中的300条肌肉纤维(图6)。与对照小鼠(#28-31)相比， [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理小鼠(#24-27)中发生改变的显示有肿胀或电 密内含物的线粒体的纤维数目显著降低。
对用包含[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的制剂或安慰剂制剂口服治疗的 Col6a1-/-小鼠进行了类似的实验。观察到来自[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA治疗 动物的肌肉线粒体中CRC明显增加，说明环孢霉素引起了PTP去极化。 此外，横膈肌切片上的TUNEL检测说明用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA进行 体内治疗可引起凋亡产生率显著降低。
实施例5：[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对UCMD和BM患者的初步临床 试验
有五名患者参加，其中四名UCMD患者，一名BM患者。患者分别 在COL6A1、COL6A2或COL6A3基因发生变异。设计试验，测试用CsA 治疗是否对于减轻线粒体功能障碍有效，这通过寡霉素引起肌肉纤维中线 粒体去极化进行评估。根据TMRM荧光的变化检测去极化。用每日5mg/kg CsA的口服剂量治疗患者，持续三十天。在治疗前和治疗后立即取肌肉活 体组织，并处理用于TMRM检测。五名患者的平均结果表明，在治疗前， 寡霉素诱导90％肌肉细胞极化，但治疗后仅有37％。因此，通过用寡霉素 诱导的极化进行检测，用CsA进行短期治疗能够基本减轻线粒体功能障 碍。
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