吡唑并[1，5-a]嘧啶类、方法、用途及组合物
阅读：10发布：2020-05-15
专利汇可以提供吡唑并[1，5-a]嘧啶类、方法、用途及组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供新的吡唑并[1，5-a]嘧啶类，其可用于 治疗 或 预防 焦虑症 、 癫痫 症和包括 失眠 症的 睡眠障碍 ，以及用于诱导 镇静 - 催眠 、麻醉、睡眠和肌 肉松 弛。，下面是吡唑并[1，5-a]嘧啶类、方法、用途及组合物专利的具体信息内容。
1.化合物，其选自：
a)N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
b)N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
c)N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
d)N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
e)N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
f)N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
g)N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
h)N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
i)N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
j)N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
k)N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-甲基磺酰胺；
l)N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-甲基磺酰胺；
m)N-{2-甲基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺；
n)N-{2-甲氧基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺；
o)N-{2，4-二氟-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺；和
p)N-{5-氟-2-甲氧基-3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺；
以及其药学上可接受的盐和水合物。
2.根据权利要求1的化合物在制备药物中的用途，该所述药物 用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治疗或预防与GABAA受体调 节有关疾病。
3.权利要求2的用途，其中所述GABAA受体是α1-GABAA受体。
4.权利要求2的用途，其中所述GABAA受体是α2-GABAA受体。
5.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中治疗或预防焦虑症。
6.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中治疗或预防癫痫症。
7.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中治疗或预防睡眠障碍。
8.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中治疗或预防失眠症。
9.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中诱导镇静-催眠。
10.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中诱导麻醉。
11.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中调节诱导睡眠的必要时间和它的持 续时间。
12.权利要求1的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在 有此需要的人类或非人哺乳动物中诱导肌肉松弛。
13.药物组合物，其包含治疗有效量的如在权利要求1中所定义 的化合物，以及适合量的药物赋形剂或载体。
技术领域
本发明涉及对GABAA受体具有亲和力的药剂，具体涉及吡唑并 [1，5-a]嘧啶类，更具体涉及N-{2-取代-5-[3-取代-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺和N-{2-取代-5-[3-取代-吡唑并 [1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺。
背景技术
GABAA受体(γ-氨基丁酸A)是形成膜离子通道的五聚体蛋白。GABAA 受体与镇静、焦虑、肌紧张、致癫痫活性和记忆功能的调节有关。这 些作用归因于GABAA受体确定的亚单位，特别是α1-和α2-亚单位。
镇静受α1-亚单位的调节。唑吡坦的特征在于在体内对α1-受体具 有高亲和力并且其镇静和催眠作用由这些受体所介导的。同样地，扎 来普隆的催眠作用也是由α1-受体所介导的。
地西泮的抗焦虑作用是由GABA能传递在表达α2-受体的一组神经 元中的增强所介导的。这表明α2-受体是治疗焦虑的高度特异性靶点。
由于这些受体表现出在脊髓中高度特异性的表达，因此地西泮中 的肌松弛主要是由α2-受体所介导的。
地西泮的抗惊厥作用部分归因于α1-受体。在地西泮(一种记忆损 伤化合物)中，顺行性遗忘是由α1-受体所介导的。
GABAA受体以及它的α1-和α2-亚单位被H.等(J.Pharmacol. Exp.Ther.，300，2-8，2002)；H.等(Curr.Opin.Pharmacol.， 1，22-25，2001)；u.Rudolph等(Nature，401，796-800，1999)； 以及D.J.Nutt等(Br.J.Psychiatry，179，390-396，2001)广泛 地综述。
地西泮和其它经典的苯二氮卓类被广泛作为抗焦虑药、安眠药、 抗惊厥药和肌肉松弛剂。它们的副作用包括顺行性遗忘、运动活动减 少以及乙醇作用的增强作用。
在本文上下文中，本发明的化合物是用于在睡眠障碍，优选为失 眠症、焦虑症和癫痫症中临床应用的α1-和α2-GABAA受体的配体。
失眠症是非常普遍的疾病。慢性失眠症影响10％的人群并且当还 计算短暂性失眠症时影响30％的人群。失眠症描述为入睡困难或保持 熟睡困难，并且与隔日宿醉效应(例如疲倦、能量缺乏、低下的注意 力和应激性)有关。这种疾病的社会影响和健康影响是重大的并且会 带来明显的社会经济影响。
处理失眠症的药理学治疗最初包括巴比妥酸盐和水合氯醛，但是 这些药物引起许多已知不良反应，例如服药过量毒性、代谢诱导以及 依赖和耐受增强。此外，它们通过减少上述所有的持续时间和REM睡 眠阶段的数目影响睡眠结构。后来，由于它们的低毒性苯二氮卓类意 味着一个重要的治疗进步，但是它们仍显示出依赖、肌肉松弛、健忘 和在该药中断后的反弹性失眠的严重问题。
最新的已知治疗方法为引进非苯二氮卓类安眠药，例如吡咯并 [3，4-b]吡嗪类(佐匹克隆)、咪唑并[1，2-a]吡啶类(唑吡坦)和， 最后吡唑并[1，5-a]嘧啶类(扎来普隆)。随后，两个新的吡唑并[1，5-a] 嘧啶类(茚地普隆(indiplon)和奥西普隆)已经进入开发，后者具 有一定抗焦虑作用。所有这些化合物显示出快速睡眠诱导作用并且相 对于苯二氮卓类具有较少的隔日宿醉效应、更低的滥用可能性和更低 的反弹性失眠的风险。这些化合物作用的机制是通过其结合到苯二氮 卓结合位点使GABAA受体的变构活化(C.F.P.George，The Lancet， 358，1623-1626，2001)。苯二氮卓类是GABAA受体结合位点的非特异 性配体，而唑吡坦和扎来普隆显示出对α1-亚单位更高的选择性。尽管 这样，这些药物仍影响睡眠结构并且在长期治疗中可诱导依赖。
许多相关的吡唑并[1，5-a]嘧啶类已经在专利公开US4178449、 US4281000、US4521422(2-吡啶基[7-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶 -3-基]甲酮，奥西普隆)、US4576943，US4626538(N-{3-[3-(氰基 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-乙基-乙酰胺，扎来普隆)、 US4654347，US6399621(N-{3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺，茚地普隆)、WO2005014596、 WO2005014597和WO 2006136530中公开。
对处理失眠症的新的活性化合物的研究符合潜在的健康需求，因 为即使最近引进的安眠药仍影响睡眠结构并且在长期治疗中可引起依 赖。
因此，需要集中于开发具有更低副作用风险的新的安眠药剂。
镇静受α1-亚单位的调节。唑吡坦的特征在于在体内对α1-受体具 有高亲和力并且其镇静和催眠作用由这些受体所介导的。同样地，扎 来普隆的催眠作用也是由α1-受体所介导的。
地西泮的抗焦虑作用是由GABA能传递在表达α2-受体的一组神经 元中的增强所介导的。这表明α2-受体是治疗焦虑的高度特异性靶点。
由于这些受体表现出在脊髓中高度特异性的表达，因此地西泮中 的肌松弛主要是由α2-受体所介导的。
地西泮的抗惊厥作用部分归因于α1-受体。在地西泮(一种记忆损 伤化合物)中，顺行性遗忘是由α1-受体所介导的。
GABAA受体以及它的α1-和α2-亚单位被H.等(J.Pharmacol. Exp.Ther.，300，2-8，2002)；H.等(Curr.Opin.Pharmacol.， 1，22-25，2001)；u.Rudolph等(Nature，401，796-800，1999)； 以及D.J.Nutt等(Br.J.Psychiatry，179，390-396，2001)广泛 地综述。
地西泮和其它经典的苯二氮卓类被广泛作为抗焦虑药、安眠药、 抗惊厥药和肌肉松弛剂。它们的副作用包括顺行性遗忘、运动活动减 少以及乙醇作用的增强作用。
在本文上下文中，本发明的化合物是用于在睡眠障碍，优选为失 眠症、焦虑症和癫痫症中临床应用的α1-和α2-GABAA受体的配体。
失眠症是非常普遍的疾病。慢性失眠症影响10％的人群并且当还 计算短暂性失眠症时影响30％的人群。失眠症描述为入睡困难或保持 熟睡困难，并且与隔日宿醉效应(例如疲倦、能量缺乏、低下的注意 力和应激性)有关。这种疾病的社会影响和健康影响是重大的并且会 带来明显的社会经济影响。
处理失眠症的药理学治疗最初包括巴比妥酸盐和水合氯醛，但是 这些药物引起许多已知不良反应，例如服药过量毒性、代谢诱导以及 依赖和耐受增强。此外，它们通过减少上述所有的持续时间和REM睡 眠阶段的数目影响睡眠结构。后来，由于它们的低毒性苯二氮卓类意 味着一个重要的治疗进步，但是它们仍显示出依赖、肌肉松弛、健忘 和在该药中断后的反弹性失眠的严重问题。
最新的已知治疗方法为引进非苯二氮卓类安眠药，例如吡咯并 [3，4-b]吡嗪类(佐匹克隆)、咪唑并[1，2-a]吡啶类(唑吡坦)和， 最后吡唑并[1，5-a]嘧啶类(扎来普隆)。随后，两个新的吡唑并[1，5-a] 嘧啶类(茚地普隆(indiplon)和奥西普隆)已经进入开发，后者具 有一定抗焦虑作用。所有这些化合物显示出快速睡眠诱导作用并且相 对于苯二氮卓类具有较少的隔日宿醉效应、更低的滥用可能性和更低 的反弹性失眠的风险。这些化合物作用的机制是通过其结合到苯二氮 卓结合位点使GABAA受体的变构活化(C.F.P.George，The Lancet， 358，1623-1626，2001)。苯二氮卓类是GABAA受体结合位点的非特异 性配体，而唑吡坦和扎来普隆显示出对α1-亚单位更高的选择性。尽管 这样，这些药物仍影响睡眠结构并且在长期治疗中可诱导依赖。
许多相关的吡唑并[1，5-a]嘧啶类已经在专利公开US4178449、 US4281000、US4521422(2-吡啶基[7-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶 -3-基]甲酮，奥西普隆)、US4576943，US4626538(N-{3-[3-(氰基 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-乙基-乙酰胺，扎来普隆)、 US4654347，US6399621(N-{3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺，茚地普隆)、WO2005014596、 WO2005014597和WO 2006136530中公开。
对处理失眠症的新的活性化合物的研究符合潜在的健康需求，因 为即使最近引进的安眠药仍影响睡眠结构并且在长期治疗中可引起依 赖。
因此，需要集中于开发具有更低副作用风险的新的安眠药剂。
发明内容
发明人已经发现新的吡唑并[1，5-a]嘧啶类，其对GABAA有活性， 特别是对GABAA的α1-和α2-亚单位有活性。因此，本发明的化合物在 治疗和预防所有那些由GABAA受体α1-和α2-亚单位所介导的疾病中是 有益的。所述疾病的非限制性的实例是睡眠障碍，优选为失眠症、焦 虑症和癫痫症。本发明化合物的相关适应症的非限制性的实例是所有 那些需要诱导睡眠、诱导镇静或诱导肌肉松弛的疾病或病症，例如失 眠症或麻醉。
扎来普隆(吡唑并[1，5-a]嘧啶类参考化合物)是与本发明化合物 结构类似的化合物。但是，由于醛氧化酶，扎来普隆表现出广泛的生物 转化(B.G.Lakeetal.，Metabolism of zaleplon by humanliver： evidence for invol vement of aldehyde oxidase，Xenobiotica，2002 Oct；32(10)：835-47；和K.Kawashima et al.，Aldehyde oxidase-dependent marked species difference in hepatic metabolism of the sedative-hypnotic zaleplon，between monkeys 和rats，Drug Metab Dispos.1999 Mar；27(3)：422-8)。尽管另一 个吡唑并[1，5-a]嘧啶类(茚地普隆)相对于扎来普隆具有更好的代谢 稳定性在本领域中是公知的，但是该化合物正如细胞活性实验所显示 的具有更高毒理学效应的缺点。
化合物对生物转化的敏感性是与它们的代谢稳定性，即药物在体 内的半衰期以及它是否形成代谢产物有关。这些是评价生物利用度、 毒性以及对于药物-药物相互作用的给药可能性的重要参数，同样也是 确定用于人类使用潜力的重要参数。在这方面，具有最高代谢稳定性 的化合物使药物-药物相互作用的可能性减少到最小，并且需要更低频 繁的给药间隔。
本发明化合物显示出意想不到地更少的生物转化，即相对于其它 已知相关的吡唑并[1，5-a]嘧啶类具有更高的代谢稳定性，这改善了有 助于维持药理学作用的药物代谢动力学特征并提供了未被预料的用于 维持完整夜间睡眠的适应症。所述特性涉及在苯环，即取代基R3和R4 上取代。特别适合的是在苯环上具有吸电子取代基的化合物。
此外，如在实施例中所说明的，本发明化合物还显示出良好的体 内镇静/催眠治疗活性和如在细胞活性实验中表明的低毒理学效应。
因此，本发明涉及式(I)的化合物：
和其药学上可接受的盐和水合物，它们是GABAA受体的配体，其 中R和R1代表烷基(C1-C6)，R2选自氰基、硝基和噻吩-2-羰基，R3选自 氢和卤素，R4选自氢、卤素、烷基(C1-C6)和烷氧基(C1-C6)，R5选自氢和 烷基(C1-C6)，并且Y选自-CO-和-SO2-；和其药学上可接受的盐和水合 物。
本发明的另一个目的是提供治疗或预防焦虑症、癫痫症和包括失 眠症的睡眠障碍的新方法，和通过给予治疗有效量的所述化合物或其 药学上可接受的盐或水合物诱导镇静催眠、麻醉、睡眠和肌肉松弛。
发明详述
如上所述，本发明涉及式(I)化合物：
；和其药学上可接受的盐和水合物，其中R、R1、R2、R3、R4、R5 和Y如上所述。
在本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”包括由有机酸和无 机酸所形成的任何形式的盐，所述有机酸和无机酸例如氢溴酸、盐酸、 磷酸、硝酸、硫酸、醋酸、脂肪酸、天门冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、 柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、谷氨酸、乳酸、马来酸、苹果酸、 丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、1，5-萘二磺酸、草酸、新戊酸、丙酸、对 甲苯磺酸、琥珀酸、酒石酸等。
式(I)的具体化合物选自：
N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
N-{2-甲基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
N-{2-甲氧基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
N-{2，4-二氟-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；和
N-{5-氟-2-甲氧基-3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺。
下述反应方案说明了制备本发明的化合物。
方案1
R、R1、R2、R3、R4、R5和Y如上所述，并且Q是选自下述基团的适 当的离去基团：N(二烷基(C1-C6))、烷硫基(C1-C6)和烷氧基(C1-C6)。 优选地，Q选自二甲氨基、甲硫基或甲氧基。
通式(III)的氨基吡唑与适当被取代的1-芳基-2-丙烯-1-酮(II) 的反应在50℃-130℃的温度范围内在惰性极性质子或非质子溶剂，例 如冰醋酸、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中进行。经过几 个小时(反应时间)，除去溶剂并且所获得的残余物在碳酸氢钠的水溶 液和二氯甲烷间分配。由蒸发有机层至干燥所获得的粗物质可通过下 述方法之一纯化：(a)使用醋酸乙酯或二氯甲烷/甲醇作为洗脱液的硅 胶色谱；或(b)在合适的溶剂(醋酸乙酯、乙醇、甲醇等)中结晶。
当Q是二甲氨基[中间体(VI)]时，式(II)的中间体可按照如在方 案2中所显示的反应顺序获得。
方案2
，其中R、R1、R3、R4和Y如上所述。
当Y是磺酰基时，式(IV)的中间体根据R.H.Uloth等(J.Med. Chem.9，88-96，1966)所描述的方法制备。
根据有机化学中技术人员所公知的方法，经过阴离子形成和随后 与卤代烷反应进行中间体(IV)的烷基化产生式(V)的中间体。
式(V’)和(VI)的烯胺酮根据J.M.Domagala等(J.Heterocyclic Chem.，26(4)，1147-58，1989)；和K.Sawada等(Chem.Pharm. Bull.，49(7)，799-813，2001)所描述的烯胺的一般合成操作通过使 乙酰苯与N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(DMFDMA)或Bredereck试 剂(叔-丁氧双(二甲氨基)甲烷)反应制备。
当Q是二甲氨基，Y是磺酰基并且R1是甲基(VII)时，式(II)的中 间体可根据方案3替代制备，
方案3
其中R、R3和R4如上所定义。
(IV)转化为(VII)导致烯胺酮形成，并且同时由于应用作为甲基化 试剂的N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛的性质，形成N-甲基-磺酰胺。
当Q是二甲氨基，并且R1是甲基(X)时，式(II)的中间体还可根 据方案4制备，
方案4
其中R、R3、R4和Y如上所定义。
所述方法的优点是基于下述事实，即磺酰胺或羧酰胺的形成发生 在该方法的最后阶段。因此，反应步骤的总数目在制备大批量产物中 减少。此外，如在方案中所显示地，(VIII)转化为(IX)导致在一锅法 (one-pot process)中存在下述三个反应：(a)烯胺酮的形成；(b) 三氟乙酰胺的甲基化；和(c)脱酰基产生N-甲基化胺。(IX)与相应的 磺酰氯或羧酰氯的随后反应导致获得中间体(X)。
本发明的化合物或它们药学上可接受的盐或水合物可用于制备用 于在人类或非人哺乳动物中治疗或预防与GABAA受体调节有关的疾病 的药物。更具体地，与GABAA受体调节有关的疾病包括疾病与α1-GABAA 受体调节和/或α2-GABAA受体调节有关的疾病。这种疾病的非限制性目 录包括焦虑症、癫痫症、包括失眠症的睡眠障碍等。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在人类或非人哺乳动物中治疗或预防焦 虑症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防癫痫症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防睡眠障碍的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防失眠症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导镇静-催眠的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导麻醉的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中调 节诱导睡眠的必要时间和它的持续时间的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导肌肉松弛的药物的用途。
本发明还涉及治疗或预防患有与在人类或非人哺乳动物中GABAA 受体调节有关的疾病的人类或非人哺乳动物的方法，该方法包括给予 有此需要的所述人类或非人哺乳动物治疗有效量的本发明的化合物或 其药学上可接受的盐或水合物以及药学上可接受的稀释剂或载体。更 具体地，与GABAA受体调节有关的疾病包括与α1-GABAA受体调节和/或 α2-GABAA受体调节有关的疾病。这种疾病的非限制性目录包括包括焦 虑症、癫痫症、包括失眠症的睡眠障碍等。
如本文所用的，术语″哺乳动物″指高级脊椎动物的哺乳动物类。 该术语″哺乳动物″包括但不限于人类。
本发明的另一个实施方案是提供药物组合物，该药物组合物含有 本发明的化合物或其药学上可接受的盐和水合物以及治疗上惰性的载 体。
所述组合物包括适合于口服给药、直肠给药和非肠道给药(包括皮 下给药、肌肉内给药和静脉内给药)的那些，尽管最适合的途径将取决 于待治疗病症的性质和严重性。本发明最优选的途径是经口进入。所 述组合物通常可以单位剂型呈现，并且可通过药学领域中任何公知的 方法制备。
根据常规药物配料技术，可将活性化合物与药物载体组合。所述 载体可以采取多种多样的形式，这取决于所需给药的制剂形式，例如 口服或非肠道给药(包括静脉内注射或输注)。可使用任何常用药物 介质用于制备口服剂型组合物。常用药物介质包括，在口服液体制剂 的情况下(例如，悬浮液、溶液、乳液和酏剂)，例如水、二醇类、 油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；气雾剂；或在口服固体制 剂的情况下(例如粉末、胶囊和片剂)载体，例如淀粉、糖、微晶纤 维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，相对于口服液 体制剂更优选口服固体制剂。
由于它们给药的容易性，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单 位形式，在这种情况下，使用固体药物载体。如果需要，片剂可通过 标准的含水或不含水技术包衣。
每日给药一次，或者如果需要以分开的剂量，适合使用的剂 量范围是每日总剂量从约0.01mg-约100.00mg。
本发明的化合物对α1-和α2-GABAA受体具有高亲和力。这些体外结 果与那些在镇静-催眠试验所获得的体内结果一致。
本发明的化合物的药理学活性如下述所显示地进行测定。
a)配体-结合测定。受试化合物对α1-和α2-GABAA受体的亲和力的 测定
在实验期间使用雄性Sprague-Dawley大鼠(体重200-250g)。 动物断头处死后，取走小脑(含α1-GABAA受体最多的组织)和脊髓(含 α2-GABAA受体最多的组织)。根据J.Lameh等(Prog. Neuro-Psychopharmacol.Biol.Psychiatry，24，979-991，2000) 和H.Noguchi等(Eur.J.Pharm.，434，21-28，2002)的方法稍作 改动制备膜。组织一旦称重后，就将它们悬浮在50mM Tris·HCl(pH 7.4)，1∶40(v/v)中，或就脊髓而言将其悬浮在0.32M蔗糖中，匀浆， 然后在7℃以20000g离心10min。所得的沉淀在相同的条件下重悬并 再次离心。最后沉淀以最小体积重悬并保存在-80℃过夜。在第二天， 重复上述过程直至终沉淀就小脑而言以1∶10(v/v)的比例重悬，并且 就脊髓而言以1∶5(v/v)的比例重悬。
通过竞争试验使用放射性标记的氟马西尼作为配体测定亲和力。 所述试验根据S.Arbilla等(Eur.J.Pharmacol.，130，257-263， 1986)；和Y.Wu等(Eur.J.Pharmacol.，278，125-132，1995)的方 法使用96-孔微量滴定板进行。将含有实验受体的膜、氟马西尼(以 1nM终浓度放射性标记)和升高浓度的受试化合物(以230μL的总体积 存在于50mM[ph7.4]Tris·HCl缓冲液中)温孵。同时，在存在未标 记的氟马西尼的增高浓度(非特异性结合，放射性标记的配体的评价％) 下，所述膜仅仅与放射性标记的氟马西尼(总结合，100％)温孵。所述反 应在加入放射性配体后开始，随后在4℃温孵60分钟。在温孵时间段 结束时，将200μL反应液转移到细筛过滤板(multiscreen plate) (Millipore)并且使用真空歧管(vacuum manifold)过滤，然后用冷 的试验缓冲液洗涤三次。所述细筛过滤板配备有GF/B过滤器，该过滤 器保留含有受体和已经结合到该受体的放射性标记的配体的膜。洗涤 之后，所述板放置干燥。一旦干燥后，就加入闪烁液并放置搅拌过夜。 第二天，使用Perkin-Elmer Microbeta闪烁计数器对所述板计数。
为了对受试化合物每一个浓度的特异性结合的百分比的结果分 析，如下进行计算：
％特异性结合＝(X-N/T-N)×100
其中，
X：化合物每一个浓度的结合配体的量。
T：总结合，结合到放射性标记的配体的最大量。
N：非特异性结合，放射性标记的配体与所使用的受体无关以非特 异方式结合的量。
化合物的每一个浓度测定三次，并且它们的平均值用于测定相对 于化合物的浓度特异性结合(％)的实验值。亲和力数据对于α1亚单位 而言以在10-5M和10-7M浓度的抑制％表示，并且对于α2亚单位而言以在 10-5M浓度的％抑制表示。这些试验的结果分别在表1和2中给出。
表1.对GABAA受体的α1亚单位的亲和力
化合物 ％抑制10-5M ％抑制10-7M 制备实施例5 98.2 42.3 制备实施例6 98.1 36.4 制备实施例11 97.7 41.8 制备实施例13 98.7 39.8 制备实施例14 97.3 31.9 扎来普隆 97.2 26.1
表2.对GABAA受体的α2亚单位的亲和力
化合物 ％抑制10-5M 制备实施例5 94.5 制备实施例6 87.5 制备实施例11 95.0 扎来普隆 77.4
b)体内预言性的镇静-催眠作用的测定
通过在小鼠中的预言性镇静-催眠试验评价这些化合物的体内作 用(D.J.Sanger等，Eur.J.Pharmacol.，313，35-42，1996；和G. Griebel等，Psychopharmacology，146，205-213，1999)。
在试验期间使用5-8只雄性CD1小鼠的组(体重22-26g)。受试 化合物以单一等摩尔的腹腔内剂量给药，该受试化合物悬浮在含有一 滴吐温80的0.25％琼脂中以10mL/kg体积给药。在每个途径中测定 两种剂量。对照动物单独接受媒介物。使用Smart System(Panlab， S.L.，Spain)按cm记录在腹腔内(ip)给药后的30分钟时间段内每 5-min间隔小鼠的移动距离。计算处理组动物相对于对照组动物的移 动距离的抑制百分比(排除最初5min)和ED50值。该试验的结果在表3 和4中给出。
表3.测定小鼠体内镇静-催眠活性
表4.测定小鼠诱导镇静的ED50值
化合物 ED50(μmol/kg) 制备实施例11 16.9 WO 2005014596的实施例2 30.1 WO 2005014596实施例18 19.9
与现有技术的其它有代表性的吡唑并[1，5-a]嘧啶类相比，本发 明实施例11的化合物显示出明显更低的ED50。这暗示由于所需诱导治 疗作用的剂量更低，因此实施例11的化合物在体内具有更强的效力。
c)体外测定在人类肝细胞胞浆部分中的代谢稳定性
化合物溶解在二甲基亚砜中获得10mM的初始浓度。然后，所述储 备溶液经溶剂和缓冲液稀释以获得5μM的最终测定浓度。化合物与1.0 mg/mL混合的人胞浆(由Xenotech plc获得)在37℃温孵在5μM的单 一浓度一式两份测定。在存在或未存在辅因子时评价代谢，并且通过 LC/MS在0、60和120-分钟时间点的分析检测母体化合物的损失。然 后计算残余母体化合物的百分比。结果在表5显示。使用普通的LC 方法：
流动相：A＝含0.1％甲酸的水
B＝含0.1％甲酸的乙腈
HPLC柱：Higgins Clipius C18 5μm，50×3mm
流速：2ml.min-1
梯度洗脱： 时间 ％A ％B
0.00 95 5
2.00 5 95
2.50 5 95
2.60 95 5
3.00 95 5
表5.在人类肝细胞胞浆部分中的代谢稳定性
出人意料地，在温孵60和120min后制备实施例6和11的化合物 与扎来普隆和WO 2005014596的现有技术的化合物相比显示出更高的 残余母体化合物的百分比(10-20％)。在另一方面，扎来普隆在任何时 间点具有更低的残余母体化合物的百分比并且从60-120分钟具有更 高的生物转化。
d)体外测定在24h时在HepG2、CHO-K1和HeLa细胞中的细胞毒 性
HepG2(人类肝癌细胞)和CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)均由美国 菌种保存中心(ATCC)获得。HepG2在极限必需培养基中培养(MEM)，该 培养基包含含有1.87mM的Earl盐溶液，并且补充有1mM 丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、100000U/L青霉素、100000μg/L 链霉素和10％胎牛血清。CHO-K1保存在Ham F-12培养基中，该培养 基包含1mM并且补充有1mM L-谷氨酰胺、100000U/L青 霉素、100000μg/L链霉素和10％胎牛血清。Promega CellTiter 含水单一溶液细胞活性测定包含四唑盐(MTS)，该盐被在代谢活性细胞 中发现的脱氢酶转化为水溶性甲(formazan)产物。甲产物的数 量与培养液中的活细胞数量是成比例的。
化合物溶解在DMSO中以获得100mM的初始浓度。从所述储备溶液 在DMSO中进行连续稀释以获得从50-0.25mM的浓度范围。然后，所述 储备溶液和连续稀释液用各自的细胞培养基稀释1∶100。就CHO-K1 细胞而言，制备1000、500、250、100、50、25、10、5和2.5μM的 浓度以评价IC50，而就HepG2而言，测定1000、100、10和1μM的终浓 度为了计算细胞的百分比。在所有孔中，DMSO终浓度为1％v/v。细胞 系均与受试化合物温孵24小时。在加入MTS染料并再温孵1小时后， 经分光光度计在490nm测定相对细胞活性。他莫昔芬作为阳性对照使 用。
使用相似的方案测定在24h在HeLa细胞中的细胞毒性。结果在表 6中显示。
表6.在24h时在HepG2、CHO-K1和HeLa细胞中的细胞毒性
这些结果显示本发明实施例11的化合物与参考化合物茚地普隆 相比毒性更低，其原因是在HepG2细胞系中实施例11的化合物的细胞 存活比茚地普隆高(84.5％对70％)。这些结果还在另两个所测定细胞系 中得到证实。
制备实施例1：N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.048g(0.38mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.1g(0.38 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入15mL二氯甲烷和10mL饱和碳酸氢钠溶液。两 层分离，并用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗涤并经硫 酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物使用醋酸乙酯-二氯 甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生61mg相当于N-{2-氟 -5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体 (产率为49％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.97(3H，s)，3.29(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.45(1H，t，J＝8.4Hz)，7.89-8.02(1H， m)，8.07-8.09(1H，m)，8.83(1H，s)，9.0(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝330(MH+)
HPLC＝95.7％
制备实施例2：N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.041g(0.38mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.1g(0.38 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)。 两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗涤并 经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯的存在下，该 油状物产生95mg N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.96(3H，s)，3.28(3H，s)，7.18 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.42(1H，t，J＝8.8Hz)，7.99-8.02(1H， m)，8.09-8.12(1H，m)，8.42(1H，s)，8.79(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝310(MH+)
HPLC＝97.8％
制备实施例3：N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.054g(0.43mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.120 g(0.43mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基- 乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物 使用醋酸乙酯-二氯甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生35mg 相当于N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺的固体(产率为24％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.26(3H，s)，7.30 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.77(1H，d，J＝8Hz)，7.93(1H，dd，J ＝2.4和8.4Hz)，8.08(1H，d，J＝2Hz)，8.83(1H，s)，9.01 (1H，d，J＝4.8Hz)。
MS(ES)m/z＝346(MH+)
HPLC＝91％
制备实施例4：N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.046g(0.43mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.120g(0.43 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶 剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯存在下， 该油状物产生108mg N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.25(3H，s)，7.20 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.74(1H，d，J＝8.8Hz)，7.94(1H，dd， J＝2.4和8.4Hz)，8.10(1H，d，J＝2Hz)，8.43(1H，s)，8.80 (1H，d，J＝4.8Hz)。
MS(ES)m/z＝326(MH+)
HPLC＝97.7％
制备实施例5：N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.043g(0.33mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.1g(0.33mmol) 的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-甲基磺酰胺在 10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物使用醋酸 乙酯-二氯甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生58mg相当于 N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺的固体(产率为48％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.02(3H，s)，3.39(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.38-7.42(1H，m)，8.05-8.13(2H，m)，8.83 (1H，s)，8.98(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝366(MH+)
HPLC＝97.6％
制备实施例6：N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.036g(0.33mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.1g(0.33mmol) 的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-甲基磺酰胺在 10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯的存在 下，该油状物产生81mg N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为70％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.01(3H，s)，3.38(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.36-7.41(1H，m)，8.08-8.15(2H，m)，8.42 (1H，s)，8.77(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝346(MH+)
HPLC＝99.1％
制备实施例7：N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.050g(0.39mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.124g (0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-甲 基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙 酯的存在下，该油状物产生56mg N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.08(3H，s)，3.38(3H，s)，7.30 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.71(1H，d，J＝8.4Hz)，8.04(1H，dd， J＝2和8.4Hz)，8.14(1H，d，J＝2.4Hz)，8.83(1H，s)，8.99 (1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝382(MH+)
HPLC＝98.5％
制备实施例8：N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.042g(0.39mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.124g (0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-甲 基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙 酯的存在下，该油状物产生99mg N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为70％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.08(3H，s)，3.37(3H，s)，7.20 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.69(1H，d，J＝8.8Hz)，8.05(1H，dd， J＝2.4和8.8Hz)，8.16(1H，d，J＝1.6Hz)，8.42(1H，s)，8.78 (1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝362(MH+)
HPLC＝93.7％
制备实施例9：N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶 -7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.046g(0.38mmol)的5-氨基-3-甲基-lH-吡唑-4-甲腈和 0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲 基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸 馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢 钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层 经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸 乙酯的存在下，该油状物产生92mg N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为75％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.98(3H，s)，2.61(3H，s)，3.3 (3H，s)，7.09(1H，d，J＝4Hz)，7.39-7.44(1H，m)，7.89-8.02 (1H，m)，8.08-8.11(1H，m)，8.70(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝324(MH+)
HPLC＝98.4％
制备实施例10：N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.055g(0.43mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.120g(0.43mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N- 甲基-乙酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压 蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢 钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层 经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸 乙酯的存在下，该油状物产生106mg N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为73％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.91(3H，s)，2.61(1H，s)， 3.25(3H，s)，7.10(1H，d，J＝4.8Hz)，7.73(1H，d，J＝8.4 Hz)，7.97(1H，dd，J＝2和J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝2.4Hz)， 8.71(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝340(MH+)
HPLC＝99.6％
制备实施例11：N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.041g(0.33mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.1g(0.33mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲 基-甲基磺酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减 压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳 酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有 机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在 醋酸乙酯的存在下，该油状物产生66mg N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基- 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为 55％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.78(3H，s)，3.17(3H，s)，3.54 (3H，s)，7.24(1H，d，J＝4.4Hz)，7.51-7.56(1H，m)，8.25- 8.31(2H，m)，8.84(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝360(MH+)
HPLC＝98.9％
制备实施例12：N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.048g(0.39mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.124g(0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N- 甲基-甲基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过 减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳 酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有 机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在 醋酸乙酯的存在下，该油状物产生89mg N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基- 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为 60.5％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.61(3H，s)，3.08(1H，s)， 3.66(3H，s)，7.10(1H，d，J＝4.8Hz)，7.68(1H，d，J＝8.8 Hz)，8.04(1H，dd，J＝2.4和J＝8.8Hz)，8.15(1H，d，J＝2.4 Hz)，8.70(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝376(MH+)
HPLC＝98.1％
制备实施例13：N-{2-甲基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.074g(0.38mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-甲基-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生132mg的N-{2-甲基 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.87(3H，s)，2.37(3H，s)，3.25 (3H，s)，7.13(1H，d，J＝4Hz)，7.18-7.20(1H，m)，7.54(1H， D，J＝7.6Hz)，7.70(1H，d，J＝5.2Hz)，7.94-7.98(2H，m)， 8.08(1H，d，J＝2.8Hz)，8.71(1H，s)，8.81(1H，d，J＝4 Hz)。
MS(ES)m/z＝391(MH+)
HPLC＝98.3％
制备实施例14：N-{2-甲氧基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并 [1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.070g(0.36mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-甲氧基-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生135mg N-{2-甲氧基 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.23(3H，s)，3.97 (3H，s)，7.12(1H，d，J＝4.8Hz)，7.17-7.21(2H，m)，7.70(1H， d，J＝4.4Hz)，8.02(1H，S)，8.09(1H，d，J＝4Hz)，8.15(1H， d，J＝8.8Hz)，8.71(1H，s)，8.79(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝407(MH+)
HPLC＝100％
制备实施例15：N-{2，4-二氟-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并 [1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.217g(1.12mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.3g(1.12mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2，4-二氟-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生320mg N-{2，4-二氟 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为69％)。
1H NMR(250MHz，CDCl3)：δ1.82(3H，s)，3.11(3H，s)， 6,96-7,06(3H，m)，7,55(1H，d，J＝4，9Hz)，7.76(1H，t，J＝ 8,2Hz)，7.91(1H，dd，J＝1和3.6Hz)，8.52(1H，s)，8.68 (1H，d，J＝4.1Hz)。
MS(ES)m/z＝413(MH+)
HPLC＝99.0％
制备实施例16：N-{5-氟-2-甲氧基-3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.180g(0.93mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.275g(0.93mmol)的N-[3-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-5-氟-2-甲氧 基-苯基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然 后通过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL) 和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤 水层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生 油状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生160mg N-{5-氟-2-甲氧基 -3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为40％)。
1H NMR(250MHz，CDCl3)：δ2.04(3H，s)，3.32(3H，s)，3.56 (3H，s)，7.09-7.25(3H，m)，7.35(1H，dd，J＝2.2和J＝7.1 Hz)，7.72(1H，d，J＝4.9Hz)，8.12(1H，d，J＝3.8Hz)，8.68 (1H，s)，8.85(1H，d，J＝4Hz)。
MS(ES)m/z＝425(MH+)
HPLC＝98.4％
组合物实施例1：5mg片剂
组合物实施例2：10mg胶囊
组合物实施例3：经口滴剂
组合物实施例4：2.5mg片剂
组合物实施例5：5mg胶囊
组合物实施例6：经口滴剂
扎来普隆(吡唑并[1，5-a]嘧啶类参考化合物)是与本发明化合物 结构类似的化合物。但是，由于醛氧化酶，扎来普隆表现出广泛的生物 转化(B.G.Lakeetal.，Metabolism of zaleplon by humanliver： evidence for invol vement of aldehyde oxidase，Xenobiotica，2002 Oct；32(10)：835-47；和K.Kawashima et al.，Aldehyde oxidase-dependent marked species difference in hepatic metabolism of the sedative-hypnotic zaleplon，between monkeys 和rats，Drug Metab Dispos.1999 Mar；27(3)：422-8)。尽管另一 个吡唑并[1，5-a]嘧啶类(茚地普隆)相对于扎来普隆具有更好的代谢 稳定性在本领域中是公知的，但是该化合物正如细胞活性实验所显示 的具有更高毒理学效应的缺点。
化合物对生物转化的敏感性是与它们的代谢稳定性，即药物在体 内的半衰期以及它是否形成代谢产物有关。这些是评价生物利用度、 毒性以及对于药物-药物相互作用的给药可能性的重要参数，同样也是 确定用于人类使用潜力的重要参数。在这方面，具有最高代谢稳定性 的化合物使药物-药物相互作用的可能性减少到最小，并且需要更低频 繁的给药间隔。
本发明化合物显示出意想不到地更少的生物转化，即相对于其它 已知相关的吡唑并[1，5-a]嘧啶类具有更高的代谢稳定性，这改善了有 助于维持药理学作用的药物代谢动力学特征并提供了未被预料的用于 维持完整夜间睡眠的适应症。所述特性涉及在苯环，即取代基R3和R4 上取代。特别适合的是在苯环上具有吸电子取代基的化合物。
此外，如在实施例中所说明的，本发明化合物还显示出良好的体 内镇静/催眠治疗活性和如在细胞活性实验中表明的低毒理学效应。
因此，本发明涉及式(I)的化合物：
和其药学上可接受的盐和水合物，它们是GABAA受体的配体，其 中R和R1代表烷基(C1-C6)，R2选自氰基、硝基和噻吩-2-羰基，R3选自 氢和卤素，R4选自氢、卤素、烷基(C1-C6)和烷氧基(C1-C6)，R5选自氢和 烷基(C1-C6)，并且Y选自-CO-和-SO2-；和其药学上可接受的盐和水合 物。
本发明的另一个目的是提供治疗或预防焦虑症、癫痫症和包括失 眠症的睡眠障碍的新方法，和通过给予治疗有效量的所述化合物或其 药学上可接受的盐或水合物诱导镇静催眠、麻醉、睡眠和肌肉松弛。
发明详述
如上所述，本发明涉及式(I)化合物：
；和其药学上可接受的盐和水合物，其中R、R1、R2、R3、R4、R5 和Y如上所述。
在本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”包括由有机酸和无 机酸所形成的任何形式的盐，所述有机酸和无机酸例如氢溴酸、盐酸、 磷酸、硝酸、硫酸、醋酸、脂肪酸、天门冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、 柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、谷氨酸、乳酸、马来酸、苹果酸、 丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、1，5-萘二磺酸、草酸、新戊酸、丙酸、对 甲苯磺酸、琥珀酸、酒石酸等。
式(I)的具体化合物选自：
N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰 胺；
N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺；
N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-甲基磺酰胺；
N-{2-甲基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
N-{2-甲氧基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；
N-{2，4-二氟-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺；和
N-{5-氟-2-甲氧基-3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺。
下述反应方案说明了制备本发明的化合物。
方案1
R、R1、R2、R3、R4、R5和Y如上所述，并且Q是选自下述基团的适 当的离去基团：N(二烷基(C1-C6))、烷硫基(C1-C6)和烷氧基(C1-C6)。 优选地，Q选自二甲氨基、甲硫基或甲氧基。
通式(III)的氨基吡唑与适当被取代的1-芳基-2-丙烯-1-酮(II) 的反应在50℃-130℃的温度范围内在惰性极性质子或非质子溶剂，例 如冰醋酸、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中进行。经过几 个小时(反应时间)，除去溶剂并且所获得的残余物在碳酸氢钠的水溶 液和二氯甲烷间分配。由蒸发有机层至干燥所获得的粗物质可通过下 述方法之一纯化：(a)使用醋酸乙酯或二氯甲烷/甲醇作为洗脱液的硅 胶色谱；或(b)在合适的溶剂(醋酸乙酯、乙醇、甲醇等)中结晶。
当Q是二甲氨基[中间体(VI)]时，式(II)的中间体可按照如在方 案2中所显示的反应顺序获得。
方案2
，其中R、R1、R3、R4和Y如上所述。
当Y是磺酰基时，式(IV)的中间体根据R.H.Uloth等(J.Med. Chem.9，88-96，1966)所描述的方法制备。
根据有机化学中技术人员所公知的方法，经过阴离子形成和随后 与卤代烷反应进行中间体(IV)的烷基化产生式(V)的中间体。
式(V’)和(VI)的烯胺酮根据J.M.Domagala等(J.Heterocyclic Chem.，26(4)，1147-58，1989)；和K.Sawada等(Chem.Pharm. Bull.，49(7)，799-813，2001)所描述的烯胺的一般合成操作通过使 乙酰苯与N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(DMFDMA)或Bredereck试 剂(叔-丁氧双(二甲氨基)甲烷)反应制备。
当Q是二甲氨基，Y是磺酰基并且R1是甲基(VII)时，式(II)的中 间体可根据方案3替代制备，
方案3
其中R、R3和R4如上所定义。
(IV)转化为(VII)导致烯胺酮形成，并且同时由于应用作为甲基化 试剂的N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛的性质，形成N-甲基-磺酰胺。
当Q是二甲氨基，并且R1是甲基(X)时，式(II)的中间体还可根 据方案4制备，
方案4
其中R、R3、R4和Y如上所定义。
所述方法的优点是基于下述事实，即磺酰胺或羧酰胺的形成发生 在该方法的最后阶段。因此，反应步骤的总数目在制备大批量产物中 减少。此外，如在方案中所显示地，(VIII)转化为(IX)导致在一锅法 (one-pot process)中存在下述三个反应：(a)烯胺酮的形成；(b) 三氟乙酰胺的甲基化；和(c)脱酰基产生N-甲基化胺。(IX)与相应的 磺酰氯或羧酰氯的随后反应导致获得中间体(X)。
本发明的化合物或它们药学上可接受的盐或水合物可用于制备用 于在人类或非人哺乳动物中治疗或预防与GABAA受体调节有关的疾病 的药物。更具体地，与GABAA受体调节有关的疾病包括疾病与α1-GABAA 受体调节和/或α2-GABAA受体调节有关的疾病。这种疾病的非限制性目 录包括焦虑症、癫痫症、包括失眠症的睡眠障碍等。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在人类或非人哺乳动物中治疗或预防焦 虑症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防癫痫症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防睡眠障碍的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中治 疗或预防失眠症的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导镇静-催眠的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导麻醉的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中调 节诱导睡眠的必要时间和它的持续时间的药物的用途。
本发明的另一个实施方案是提供本发明的化合物或其药学上可接 受的盐或水合物用于制备用于在有此需要的人类或非人哺乳动物中诱 导肌肉松弛的药物的用途。
本发明还涉及治疗或预防患有与在人类或非人哺乳动物中GABAA 受体调节有关的疾病的人类或非人哺乳动物的方法，该方法包括给予 有此需要的所述人类或非人哺乳动物治疗有效量的本发明的化合物或 其药学上可接受的盐或水合物以及药学上可接受的稀释剂或载体。更 具体地，与GABAA受体调节有关的疾病包括与α1-GABAA受体调节和/或 α2-GABAA受体调节有关的疾病。这种疾病的非限制性目录包括包括焦 虑症、癫痫症、包括失眠症的睡眠障碍等。
如本文所用的，术语″哺乳动物″指高级脊椎动物的哺乳动物类。 该术语″哺乳动物″包括但不限于人类。
本发明的另一个实施方案是提供药物组合物，该药物组合物含有 本发明的化合物或其药学上可接受的盐和水合物以及治疗上惰性的载 体。
所述组合物包括适合于口服给药、直肠给药和非肠道给药(包括皮 下给药、肌肉内给药和静脉内给药)的那些，尽管最适合的途径将取决 于待治疗病症的性质和严重性。本发明最优选的途径是经口进入。所 述组合物通常可以单位剂型呈现，并且可通过药学领域中任何公知的 方法制备。
根据常规药物配料技术，可将活性化合物与药物载体组合。所述 载体可以采取多种多样的形式，这取决于所需给药的制剂形式，例如 口服或非肠道给药(包括静脉内注射或输注)。可使用任何常用药物 介质用于制备口服剂型组合物。常用药物介质包括，在口服液体制剂 的情况下(例如，悬浮液、溶液、乳液和酏剂)，例如水、二醇类、 油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；气雾剂；或在口服固体制 剂的情况下(例如粉末、胶囊和片剂)载体，例如淀粉、糖、微晶纤 维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，相对于口服液 体制剂更优选口服固体制剂。
由于它们给药的容易性，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单 位形式，在这种情况下，使用固体药物载体。如果需要，片剂可通过 标准的含水或不含水技术包衣。
每日给药一次，或者如果需要以分开的剂量，适合使用的剂 量范围是每日总剂量从约0.01mg-约100.00mg。
本发明的化合物对α1-和α2-GABAA受体具有高亲和力。这些体外结 果与那些在镇静-催眠试验所获得的体内结果一致。
本发明的化合物的药理学活性如下述所显示地进行测定。
a)配体-结合测定。受试化合物对α1-和α2-GABAA受体的亲和力的 测定
在实验期间使用雄性Sprague-Dawley大鼠(体重200-250g)。 动物断头处死后，取走小脑(含α1-GABAA受体最多的组织)和脊髓(含 α2-GABAA受体最多的组织)。根据J.Lameh等(Prog. Neuro-Psychopharmacol.Biol.Psychiatry，24，979-991，2000) 和H.Noguchi等(Eur.J.Pharm.，434，21-28，2002)的方法稍作 改动制备膜。组织一旦称重后，就将它们悬浮在50mM Tris·HCl(pH 7.4)，1∶40(v/v)中，或就脊髓而言将其悬浮在0.32M蔗糖中，匀浆， 然后在7℃以20000g离心10min。所得的沉淀在相同的条件下重悬并 再次离心。最后沉淀以最小体积重悬并保存在-80℃过夜。在第二天， 重复上述过程直至终沉淀就小脑而言以1∶10(v/v)的比例重悬，并且 就脊髓而言以1∶5(v/v)的比例重悬。
通过竞争试验使用放射性标记的氟马西尼作为配体测定亲和力。 所述试验根据S.Arbilla等(Eur.J.Pharmacol.，130，257-263， 1986)；和Y.Wu等(Eur.J.Pharmacol.，278，125-132，1995)的方 法使用96-孔微量滴定板进行。将含有实验受体的膜、氟马西尼(以 1nM终浓度放射性标记)和升高浓度的受试化合物(以230μL的总体积 存在于50mM[ph7.4]Tris·HCl缓冲液中)温孵。同时，在存在未标 记的氟马西尼的增高浓度(非特异性结合，放射性标记的配体的评价％) 下，所述膜仅仅与放射性标记的氟马西尼(总结合，100％)温孵。所述反 应在加入放射性配体后开始，随后在4℃温孵60分钟。在温孵时间段 结束时，将200μL反应液转移到细筛过滤板(multiscreen plate) (Millipore)并且使用真空歧管(vacuum manifold)过滤，然后用冷 的试验缓冲液洗涤三次。所述细筛过滤板配备有GF/B过滤器，该过滤 器保留含有受体和已经结合到该受体的放射性标记的配体的膜。洗涤 之后，所述板放置干燥。一旦干燥后，就加入闪烁液并放置搅拌过夜。 第二天，使用Perkin-Elmer Microbeta闪烁计数器对所述板计数。
为了对受试化合物每一个浓度的特异性结合的百分比的结果分 析，如下进行计算：
％特异性结合＝(X-N/T-N)×100
其中，
X：化合物每一个浓度的结合配体的量。
T：总结合，结合到放射性标记的配体的最大量。
N：非特异性结合，放射性标记的配体与所使用的受体无关以非特 异方式结合的量。
化合物的每一个浓度测定三次，并且它们的平均值用于测定相对 于化合物的浓度特异性结合(％)的实验值。亲和力数据对于α1亚单位 而言以在10-5M和10-7M浓度的抑制％表示，并且对于α2亚单位而言以在 10-5M浓度的％抑制表示。这些试验的结果分别在表1和2中给出。
表1.对GABAA受体的α1亚单位的亲和力
化合物 ％抑制10-5M ％抑制10-7M 制备实施例5 98.2 42.3 制备实施例6 98.1 36.4 制备实施例11 97.7 41.8 制备实施例13 98.7 39.8 制备实施例14 97.3 31.9 扎来普隆 97.2 26.1
表2.对GABAA受体的α2亚单位的亲和力
化合物 ％抑制10-5M 制备实施例5 94.5 制备实施例6 87.5 制备实施例11 95.0 扎来普隆 77.4
b)体内预言性的镇静-催眠作用的测定
通过在小鼠中的预言性镇静-催眠试验评价这些化合物的体内作 用(D.J.Sanger等，Eur.J.Pharmacol.，313，35-42，1996；和G. Griebel等，Psychopharmacology，146，205-213，1999)。
在试验期间使用5-8只雄性CD1小鼠的组(体重22-26g)。受试 化合物以单一等摩尔的腹腔内剂量给药，该受试化合物悬浮在含有一 滴吐温80的0.25％琼脂中以10mL/kg体积给药。在每个途径中测定 两种剂量。对照动物单独接受媒介物。使用Smart System(Panlab， S.L.，Spain)按cm记录在腹腔内(ip)给药后的30分钟时间段内每 5-min间隔小鼠的移动距离。计算处理组动物相对于对照组动物的移 动距离的抑制百分比(排除最初5min)和ED50值。该试验的结果在表3 和4中给出。
表3.测定小鼠体内镇静-催眠活性
表4.测定小鼠诱导镇静的ED50值
化合物 ED50(μmol/kg) 制备实施例11 16.9 WO 2005014596的实施例2 30.1 WO 2005014596实施例18 19.9
与现有技术的其它有代表性的吡唑并[1，5-a]嘧啶类相比，本发 明实施例11的化合物显示出明显更低的ED50。这暗示由于所需诱导治 疗作用的剂量更低，因此实施例11的化合物在体内具有更强的效力。
c)体外测定在人类肝细胞胞浆部分中的代谢稳定性
化合物溶解在二甲基亚砜中获得10mM的初始浓度。然后，所述储 备溶液经溶剂和缓冲液稀释以获得5μM的最终测定浓度。化合物与1.0 mg/mL混合的人胞浆(由Xenotech plc获得)在37℃温孵在5μM的单 一浓度一式两份测定。在存在或未存在辅因子时评价代谢，并且通过 LC/MS在0、60和120-分钟时间点的分析检测母体化合物的损失。然 后计算残余母体化合物的百分比。结果在表5显示。使用普通的LC 方法：
流动相：A＝含0.1％甲酸的水
B＝含0.1％甲酸的乙腈
HPLC柱：Higgins Clipius C18 5μm，50×3mm
流速：2ml.min-1
梯度洗脱： 时间 ％A ％B
0.00 95 5
2.00 5 95
2.50 5 95
2.60 95 5
3.00 95 5
表5.在人类肝细胞胞浆部分中的代谢稳定性
出人意料地，在温孵60和120min后制备实施例6和11的化合物 与扎来普隆和WO 2005014596的现有技术的化合物相比显示出更高的 残余母体化合物的百分比(10-20％)。在另一方面，扎来普隆在任何时 间点具有更低的残余母体化合物的百分比并且从60-120分钟具有更 高的生物转化。
d)体外测定在24h时在HepG2、CHO-K1和HeLa细胞中的细胞毒 性
HepG2(人类肝癌细胞)和CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)均由美国 菌种保存中心(ATCC)获得。HepG2在极限必需培养基中培养(MEM)，该 培养基包含含有1.87mM的Earl盐溶液，并且补充有1mM 丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、100000U/L青霉素、100000μg/L 链霉素和10％胎牛血清。CHO-K1保存在Ham F-12培养基中，该培养 基包含1mM并且补充有1mM L-谷氨酰胺、100000U/L青 霉素、100000μg/L链霉素和10％胎牛血清。Promega CellTiter 含水单一溶液细胞活性测定包含四唑盐(MTS)，该盐被在代谢活性细胞 中发现的脱氢酶转化为水溶性甲(formazan)产物。甲产物的数 量与培养液中的活细胞数量是成比例的。
化合物溶解在DMSO中以获得100mM的初始浓度。从所述储备溶液 在DMSO中进行连续稀释以获得从50-0.25mM的浓度范围。然后，所述 储备溶液和连续稀释液用各自的细胞培养基稀释1∶100。就CHO-K1 细胞而言，制备1000、500、250、100、50、25、10、5和2.5μM的 浓度以评价IC50，而就HepG2而言，测定1000、100、10和1μM的终浓 度为了计算细胞的百分比。在所有孔中，DMSO终浓度为1％v/v。细胞 系均与受试化合物温孵24小时。在加入MTS染料并再温孵1小时后， 经分光光度计在490nm测定相对细胞活性。他莫昔芬作为阳性对照使 用。
使用相似的方案测定在24h在HeLa细胞中的细胞毒性。结果在表 6中显示。
表6.在24h时在HepG2、CHO-K1和HeLa细胞中的细胞毒性
这些结果显示本发明实施例11的化合物与参考化合物茚地普隆 相比毒性更低，其原因是在HepG2细胞系中实施例11的化合物的细胞 存活比茚地普隆高(84.5％对70％)。这些结果还在另两个所测定细胞系 中得到证实。
制备实施例1：N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.048g(0.38mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.1g(0.38 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入15mL二氯甲烷和10mL饱和碳酸氢钠溶液。两 层分离，并用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗涤并经硫 酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物使用醋酸乙酯-二氯 甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生61mg相当于N-{2-氟 -5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体 (产率为49％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.97(3H，s)，3.29(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.45(1H，t，J＝8.4Hz)，7.89-8.02(1H， m)，8.07-8.09(1H，m)，8.83(1H，s)，9.0(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝330(MH+)
HPLC＝95.7％
制备实施例2：N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.041g(0.38mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.1g(0.38 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)。 两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗涤并 经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯的存在下，该 油状物产生95mg N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯 基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.96(3H，s)，3.28(3H，s)，7.18 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.42(1H，t，J＝8.8Hz)，7.99-8.02(1H， m)，8.09-8.12(1H，m)，8.42(1H，s)，8.79(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝310(MH+)
HPLC＝97.8％
制备实施例3：N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.054g(0.43mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.120 g(0.43mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基- 乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物 使用醋酸乙酯-二氯甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生35mg 相当于N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲 基-乙酰胺的固体(产率为24％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.26(3H，s)，7.30 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.77(1H，d，J＝8Hz)，7.93(1H，dd，J ＝2.4和8.4Hz)，8.08(1H，d，J＝2Hz)，8.83(1H，s)，9.01 (1H，d，J＝4.8Hz)。
MS(ES)m/z＝346(MH+)
HPLC＝91％
制备实施例4：N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.046g(0.43mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.120g(0.43 mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-乙酰胺 在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶 剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯存在下， 该油状物产生108mg N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.25(3H，s)，7.20 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.74(1H，d，J＝8.8Hz)，7.94(1H，dd， J＝2.4和8.4Hz)，8.10(1H，d，J＝2Hz)，8.43(1H，s)，8.80 (1H，d，J＝4.8Hz)。
MS(ES)m/z＝326(MH+)
HPLC＝97.7％
制备实施例5：N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.043g(0.33mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.1g(0.33mmol) 的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-甲基磺酰胺在 10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，该油状物使用醋酸 乙酯-二氯甲烷作为洗脱液进行色谱(硅胶)，从而产生58mg相当于 N-{2-氟-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基 磺酰胺的固体(产率为48％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.02(3H，s)，3.39(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.38-7.42(1H，m)，8.05-8.13(2H，m)，8.83 (1H，s)，8.98(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝366(MH+)
HPLC＝97.6％
制备实施例6：N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.036g(0.33mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.1g(0.33mmol) 的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲基-甲基磺酰胺在 10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂。 向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10 mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经10mL水洗 涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙酯的存在 下，该油状物产生81mg N-{2-氟-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7- 基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为70％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.01(3H，s)，3.38(3H，s)，7.29 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.36-7.41(1H，m)，8.08-8.15(2H，m)，8.42 (1H，s)，8.77(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝346(MH+)
HPLC＝99.1％
制备实施例7：N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.050g(0.39mmol)的4-硝基-2H-吡唑-3-基胺和0.124g (0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-甲 基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙 酯的存在下，该油状物产生56mg N-{2-氯-5-[3-硝基-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.08(3H，s)，3.38(3H，s)，7.30 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.71(1H，d，J＝8.4Hz)，8.04(1H，dd， J＝2和8.4Hz)，8.14(1H，d，J＝2.4Hz)，8.83(1H，s)，8.99 (1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝382(MH+)
HPLC＝98.5％
制备实施例8：N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]- 苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.042g(0.39mmol)的5-氨基-1H-吡唑-4-甲腈和0.124g (0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N-甲基-甲 基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压蒸馏 除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠 溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层经 10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸乙 酯的存在下，该油状物产生99mg N-{2-氯-5-[3-氰基-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为70％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.08(3H，s)，3.37(3H，s)，7.20 (1H，d，J＝4.4Hz)，7.69(1H，d，J＝8.8Hz)，8.05(1H，dd， J＝2.4和8.8Hz)，8.16(1H，d，J＝1.6Hz)，8.42(1H，s)，8.78 (1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝362(MH+)
HPLC＝93.7％
制备实施例9：N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶 -7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.046g(0.38mmol)的5-氨基-3-甲基-lH-吡唑-4-甲腈和 0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲 基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减压蒸 馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢 钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层 经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸 乙酯的存在下，该油状物产生92mg N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为75％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.98(3H，s)，2.61(3H，s)，3.3 (3H，s)，7.09(1H，d，J＝4Hz)，7.39-7.44(1H，m)，7.89-8.02 (1H，m)，8.08-8.11(1H，m)，8.70(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝324(MH+)
HPLC＝98.4％
制备实施例10：N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.055g(0.43mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.120g(0.43mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N- 甲基-乙酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过减压 蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢 钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有机层 经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在醋酸 乙酯的存在下，该油状物产生106mg N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺的固体(产率为73％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.91(3H，s)，2.61(1H，s)， 3.25(3H，s)，7.10(1H，d，J＝4.8Hz)，7.73(1H，d，J＝8.4 Hz)，7.97(1H，dd，J＝2和J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝2.4Hz)， 8.71(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝340(MH+)
HPLC＝99.6％
制备实施例11：N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.041g(0.33mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.1g(0.33mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氟-苯基]-N-甲 基-甲基磺酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通过减 压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳 酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有 机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在 醋酸乙酯的存在下，该油状物产生66mg N-{2-氟-5-[3-氰基-2-甲基- 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为 55％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.78(3H，s)，3.17(3H，s)，3.54 (3H，s)，7.24(1H，d，J＝4.4Hz)，7.51-7.56(1H，m)，8.25- 8.31(2H，m)，8.84(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝360(MH+)
HPLC＝98.9％
制备实施例12：N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧 啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺
0.048g(0.39mmol)的5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲腈和 0.124g(0.39mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-氯-苯基]-N- 甲基-甲基磺酰胺在12mL冰醋酸中的混合物回流1.5小时，然后通过 减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱和碳 酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水层。有 机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油状物，在 醋酸乙酯的存在下，该油状物产生89mg N-{2-氯-5-[3-氰基-2-甲基- 吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-甲基磺酰胺的固体(产率为 60.5％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.61(3H，s)，3.08(1H，s)， 3.66(3H，s)，7.10(1H，d，J＝4.8Hz)，7.68(1H，d，J＝8.8 Hz)，8.04(1H，dd，J＝2.4和J＝8.8Hz)，8.15(1H，d，J＝2.4 Hz)，8.70(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝376(MH+)
HPLC＝98.1％
制备实施例13：N-{2-甲基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.074g(0.38mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-甲基-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生132mg的N-{2-甲基 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.87(3H，s)，2.37(3H，s)，3.25 (3H，s)，7.13(1H，d，J＝4Hz)，7.18-7.20(1H，m)，7.54(1H， D，J＝7.6Hz)，7.70(1H，d，J＝5.2Hz)，7.94-7.98(2H，m)， 8.08(1H，d，J＝2.8Hz)，8.71(1H，s)，8.81(1H，d，J＝4 Hz)。
MS(ES)m/z＝391(MH+)
HPLC＝98.3％
制备实施例14：N-{2-甲氧基-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并 [1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.070g(0.36mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.1g(0.38mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2-甲氧基-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生135mg N-{2-甲氧基 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(3H，s)，3.23(3H，s)，3.97 (3H，s)，7.12(1H，d，J＝4.8Hz)，7.17-7.21(2H，m)，7.70(1H， d，J＝4.4Hz)，8.02(1H，S)，8.09(1H，d，J＝4Hz)，8.15(1H， d，J＝8.8Hz)，8.71(1H，s)，8.79(1H，d，J＝4.4Hz)。
MS(ES)m/z＝407(MH+)
HPLC＝100％
制备实施例15：N-{2，4-二氟-5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并 [1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.217g(1.12mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.3g(1.12mmol)的N-[5-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-2，4-二氟-苯 基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然后通 过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL)和饱 和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤水 层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生油 状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生320mg N-{2，4-二氟 -5-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为69％)。
1H NMR(250MHz，CDCl3)：δ1.82(3H，s)，3.11(3H，s)， 6,96-7,06(3H，m)，7,55(1H，d，J＝4，9Hz)，7.76(1H，t，J＝ 8,2Hz)，7.91(1H，dd，J＝1和3.6Hz)，8.52(1H，s)，8.68 (1H，d，J＝4.1Hz)。
MS(ES)m/z＝413(MH+)
HPLC＝99.0％
制备实施例16：N-{5-氟-2-甲氧基-3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑 并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙酰胺
0.180g(0.93mmol)的(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-基-甲酮 和0.275g(0.93mmol)的N-[3-(3-二甲氨基-丙烯酰基)-5-氟-2-甲氧 基-苯基]-N-甲基-乙酰胺在10mL冰醋酸中的混合物回流2.5小时，然 后通过减压蒸馏除去溶剂。向所得的残余物中加入二氯甲烷(15mL) 和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)。两层分离，并且用10mL二氯甲烷洗涤 水层。有机层经10mL水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸干二氯甲烷层产生 油状物，在醋酸乙酯的存在下，该油状物产生160mg N-{5-氟-2-甲氧基 -3-[3-(噻吩-2-羰基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基]-苯基}-N-甲基-乙 酰胺的固体(产率为40％)。
1H NMR(250MHz，CDCl3)：δ2.04(3H，s)，3.32(3H，s)，3.56 (3H，s)，7.09-7.25(3H，m)，7.35(1H，dd，J＝2.2和J＝7.1 Hz)，7.72(1H，d，J＝4.9Hz)，8.12(1H，d，J＝3.8Hz)，8.68 (1H，s)，8.85(1H，d，J＝4Hz)。
MS(ES)m/z＝425(MH+)
HPLC＝98.4％
组合物实施例1：5mg片剂
组合物实施例2：10mg胶囊
组合物实施例3：经口滴剂
组合物实施例4：2.5mg片剂
组合物实施例5：5mg胶囊
组合物实施例6：经口滴剂
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