[0002] 本发明总体上涉及医疗植入物，特别是产生良性身体应答的医疗植入物。
[0003] 相关技术描述
[0004] 超高分子量的聚乙烯(UHMWPE)是全关节置换术中最常用的支承材料，是在20世纪60年代早期由John Charnley引入的(The UHMWPE Handbook，S.Kurtz编辑，Elsevier，2004)。自那时起，由于该材料的高韧性和良好的机械性能，已开发广泛种类的应用用于全
关节成形术。UHMWPE是仅有的以纯净形式使用并不含添加剂的
聚合物之一(ASTM F
648-07)。
[0005] 尽管“常规的”UHMWPE具有出色的临床记录，但植入物系统的最长寿命受限于UHMWPE支承表面释放的磨损颗粒(Willert H.G.，Bertram H.，Buchhorn G.H.，Clin Orthop 258，95，1990)。磨损颗粒的负面
生物效应被认为是植入物长寿的最重要的限制因素。亚微米大小磨屑释放到人体组织内，导致慢性
炎症。UHMWPE颗粒引起的持续炎症激活炎症细胞(巨噬细胞)，其刺激骨再吸收细胞(破骨细胞)并最终导致植入物松动。
[0006] 在20世纪70年代，已引入高度交联的UHMWPE，意在提高材料的
耐磨性(Oonishi H.，Kadoya Y.，Masuda S.，Journal of Biomedical Materials Research，58，167，2001；Grobbelaar C.J.，du Plessis T.A.，Marais F.，The Journal of Bone and Joint Surgery，60-B，370，1978)。以至高100Mrad的高剂量用γ照射UHMWPE材料，这与通常接受2.5-4.0Mrad剂量的γ灭菌的UHMWPE形成对比。使用高剂量是为了促进材料中的交联过程从而增加耐磨性。因此，交联过程导致磨损颗粒减少从而还减少恶性的身体应答反应。
高度交联的材料的缺点在于仍有自由基存在于材料中，潜在地导致
氧化降解。
[0007] γ射线的
能量足够使聚乙烯链的一些
碳-碳或碳-氢键断裂，导致自由基的形成。这些基团部分重新结合，但其中一些是长久存活的，并能与存在于或扩散到植入物周围
包装中的氧气反应(Costa L.，Jacobson K.，Bracco P.，Brach del Prever.E.M.，Biomaterials 23，1613，2002)。氧化降解反应导致材料脆变，由此降低材料的机械性能并可导致植入物的断裂(Kurtz S.M.，Hozack W.，Marcolongo M.，Turner J.，Rimnac C.，Edidin A.，J Arthroplasty 18，68-78，2003)。
[0008] 早已知晓可在UHMWPE结晶
熔化温度之上或之下通
过热处理猝灭自由基(S.Kurtz，The UHMWPE Handbook，Elsevier Academic Press，2004，p.112)。因此，在20世纪90年代，已开发在照射过程后
热处理(
退火或
重熔化)从而将增强的磨损和氧化
稳定性结合的高度交联的材料，因为在热处理过程期间残余的自由基已被猝灭。
[0009] 临床研究已经确认，尽管高度交联的UHMWPE的磨损率较低，因而磨损颗粒的体积较小，但骨质溶解并没有完全消失。在几项研究中，已描述对于使用高度交联的UHMWPE的植入物系统的溶骨区域或透亮带(J.A.D′Antonio等，Clinical Orthopaedics and Related Research，441，2005；C.A.Engh 等，The Journal of Arthroplasty，21(6 Suppl.2)，2006；G.Digas等，Clinical Orthopaedics and Related Research，417，2003)。因此，即使由高度交联的UHMWPE形成的少量磨损颗粒也能启动炎症反应，最终导致骨质溶解。
[0010] 印度医学详细记载了姜黄素(印度香料姜黄的组分)的药用特性。除了其它有益性质，姜黄素被描述为具有抗
氧化剂和抗炎症性质(R.K.Maheshwari等，Life Sciences，78(18)，2006；A.Sahu，Acta Biomaterialia，付印文章，2008；J.Merell等，the World Biomaterials Conference(世界
生物材料会议)上的演讲，Amsterdam 2008；The University of Texas MD Anderson Cancer Center，网页：http://www.mdanderson.org/departments/cimer/)。其它文献研究描述了不同物质的有益性质：一项最近的研究指出，当与胶原基质混合时，槲皮素促进骨形成(R.W.K.Wong等，Journal of Orthopaedic Research，26(8)，2008)。另一项研究描述了通过加入二
磷酸盐减少的由
肿瘤提取物诱导的骨质溶解(A.Jung等，Schweiz.Med.Wochenschr.，109(47)，1979。二磷酸盐的相同效果示于另一项研究(C.S.B.Galasko等，the Fourth Tripartite Surgical Meeting(第四届三方手术会议)上提出的论文，Oxford，England，5-7 19797月)中。
[0011] 发明概述
[0012] 鉴于上述涉及用于医疗植入物的UHMWPE材料的问题，本发明的一个目的在于提供一种改善的UHMWPE材料，使得形成克服与先前已知医疗植入物材料相关的负面生物效应的医疗植入物。
[0013] 本发明的目标就是提供一种用于医疗植入物的材料，特别为人工关节置换物的形式，其产生显示良性身体应答特性的磨损颗粒。直到最近，从人工关节置换物产生的磨损颗粒通常与炎症、骨质溶解或其他负面身体应答相关。本发明的一个实施方案描述了一种与天然添加剂混合的材料，其显示良性身体应答特性，如抗炎症、抗肿瘤、抗
微生物等。
[0014] 因此，本发明的教导标志着提高医疗植入物长期生物效应战略的转折点。先前提高医疗植入物长期生物效应的方法集中在提高医疗植入物材料的耐磨性，以便使炎症、骨质溶解和其他负面身体应答相关的磨损颗粒的产生最小化。与此相反，本发明的实施方案提供了用于医疗植入物的材料，其产生显示良性身体应答特性的磨损颗粒。在一些实施方案中，该材料也可提高材料的耐磨性。
[0016] 参考附图，下文详述了本发明某些优选实施方案(或其的部分)的医疗植入物，其中：
[0018] 图2图示表明抗炎作用的结果。
[0019] 优选实施方案详述
[0020] 在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种选自抗炎物质、抗微生物物质、抗肿瘤物质、抗病毒物质和/或骨刺激物质的物质的用途，其作为用于生产医疗植入物的UHMWPE材料的添加剂，用来给予医疗植入物良性身体应答特性。
[0021] 本
发明人惊奇地发现将这些物质用作UHMWPE材料的添加剂，则给予这类材料极大改良的细胞应答特性。
[0022] 在优选的实施方案中，添加剂是一种或多种如下物质：抗炎物质，其以姜黄素、姜辣素、姜油
酮、土木香灵、
水杨苷、水杨酸、大麻环萜酚、黄酮类的形式，特别地以槲皮素、
白藜芦醇和/或杨梅黄酮、
单宁、萜类、夏至草素和/或甾体抗炎剂的形式，特别是以皮质甾类的形式；和/或抗微生物物质，如基于肽的物质(特别是乳
铁蛋白)或非基于肽的物质(特别是青霉素和/或
银)；和/或抗肿瘤物质如蒽环类抗肿瘤抗生素、姜黄素和/或土木香灵；和/或抗病毒物质如单宁；和/或骨刺激物质，如基于肽的物质特别地为乳铁蛋白，和/或非基于肽的物质，特别地为槲皮素和/或二磷酸盐的形式，和/或生长因子，特别为BMP家族，更特别为BMP-2。
[0023] 在特别优选的实施方案中，添加剂为姜黄素。
[0024] 添加剂以宽范围的量使用。一个优选实施方案为，基于医疗植入物的总重量，使用添加剂的量为0.0001-5％重量，优选为0.001-1％重量，更优选为0.02-0.1％重量。
[0025] 尽管添加剂可用于任一种医疗植入物，但在人工关节置换物中格外有价值。当使用添加剂时，这类人工关节置换物可产生相当数量显示良性身体应答特性的磨损颗粒。
[0026] 在又一方面，本发明的实施方案涉及一种UHMWPE材料，用于医疗植入物，特别是矫形外科关节置换物，包括如下特性：
[0027] ●磨屑具有抗炎性质，使得由炎症引起的骨质溶解级联反应减弱。
[0028] ●磨屑具有其他的有益性质，如抗肿瘤、抗微生物(如抗细菌)、抗病毒、抑制骨刺激或骨再吸收性质。
[0029] ●该材料使得生产过程轻松且容易。在
烧结之前，将姜黄素粉末或另一抗炎添加剂与UHMWPE粉末混合。照射可在空气中进行，而不使用复杂的保护性环境。或者材料无需照射即可使用。
[0030] ●
加速老化研究证实(见
实施例1)，姜黄素等的加入保护材料免受氧化降解。
[0031] 在又一方面，本发明涉及一种具有良性身体应答特性的UHMWPE材料，包括UHMWPE和一种或多种选自抗炎物质、抗微生物物质、抗肿瘤物质、抗病毒物质和/或骨刺激物质的添加剂，所述添加剂作为用于生产医疗植入物的UHMWPE材料的添加剂，给予医疗植入物良性身体应答特性。
[0032] 在优选的实施方案中，添加剂是：抗炎物质，其以姜黄素、姜辣素、姜油酮、土木香灵、水杨苷、水杨酸、大麻环萜酚、黄酮类的形式，特别地以槲皮素、白藜芦醇和/或杨梅黄酮、单宁、萜类、夏至草素和/或甾体抗炎剂的形式，特别是以皮质甾类的形式；和/或抗微生物物质，如基于肽的物质(特别是乳铁蛋白)或非基于肽的物质(特别是青霉素和/或银)；和/或抗肿瘤物质如蒽环类抗肿瘤抗生素、姜黄素和/或土木香灵；和/或抗病毒物质如单宁；和/或骨刺激物质，如基于肽的物质特别地为乳铁蛋白，和/或非基于肽的物质，特别地为槲皮素和/或二磷酸盐的形式，和/或生长因子，特别为BMP家族，更特别为BMP-2。
[0033] 在特别优选的实施方案中，添加剂为姜黄素。
[0034] 在进一步优选的实施方案中，基于医疗植入物的总重量，用于上述的UHMWPE材料的添加剂的量为0.0001-5％重量，优选为0.001-1％重量，更优选为0.02-0.1％重量。
[0035] 本发明的实施方案还涉及从上述UHMWPE材料形式的预成型体材料制备的医疗植入物。
[0036] 本
说明书全文所使用的术语“预成型体”意指UHMWPE材料的
压实(consolidate)
块、片或棒，且特别地，指随后可接受进一步加工，最终可由其获得医疗植入物形式的终产物的一种。
[0037] 本发明实施方案的材料可经照射，但非必须。用γ或
电子束
辐射照射UHMWPE预成型体将导致交联
密度增加。材料交联密度的一个等价量度是交联点间分子量(molecular weight between crosslink)。显而易见，单个UHMWPE聚合物间的交联密度越大，交联点间分子量就越小。优选地，用γ或
电子束照射的剂量为5-20Mrad，该值的选择可依所需UHMWPE材料的最终性质而定。照射剂量的改变将导致交联点间分子量的差异，且照射剂量的改变意在基于所需最终产物而选择。
[0038] 又一个优选实施方案为上述的医疗植入物，其中预成型体材料已用剂量为2-20Mrad，优选为4-20Mrad，更优选为5-20Mrad且特别优选为5-15Mrad的γ或电子束辐射照射。照射剂量精确值的选择可依所需UHMWPE材料的最终性质而定。照射可在环境条件下空气中进行。在另一方面，照射也可在
真空或保护性环境下进行，如氮气或氩气气氛。
[0039] 在另一方面，本发明实施方案的预成型体材料也可不经照射或用非常小的照射剂量照射而使用。
[0040] 因此，在本发明的另一个实施方案中，材料未经γ或电子束辐照照射，或用小于2Mrad剂量的γ或电子束辐照照射。
[0041] 又一个优选实施方案为医疗植入物，其中预成型体材料已在空气中照射。
[0042] 在又一个优选实施方案中，预成型体材料照射后未经退火或进一步加热。
[0043] 优选地，本发明该实施方案的医疗植入物为人造关节置换物。
[0044] 在另一实施方案中，本发明涉及用于
治疗炎症
疾病、微生物疾病、肿瘤疾病、病毒疾病和/或骨降解疾病的上述医疗植入物。优选地，添加剂为姜黄素且医疗植入物用于治疗炎症疾病。
[0045] 在另一实施方案中，本发明涉及一种制造具有良性身体应答特性的UHMWPE材料的方法，包括如下步骤：
[0046] 将含有UHMWPE的材料与一定量的选自抗炎物质、抗微生物物质、抗肿瘤物质、抗病毒物质和/或骨刺激物质的添加剂混合，
[0047] 通过施加超过UHMWPE熔点的温度将混合物模制产生预成型体。
[0048] 在本发明的另一实施方案中，选自抗炎物质、抗微生物物质、抗肿瘤物质、抗病毒物质和/或骨刺激物质的添加剂可通过扩散掺入预成型体或最终植入物。扩散可通过直接将预成型体或最终植入物浸入纯的添加剂或添加剂在适当
溶剂中的溶液而进行。添加剂也可借助超临界气体，例如但不限于超临界二氧化碳，掺入预成型体或最终植入物。
[0049] 在上述优选实施方案中，添加剂是一种或多种以下物质：抗炎物质，其以姜黄素、姜辣素、姜油酮、土木香灵、水杨苷、水杨酸、大麻环萜酚、黄酮类的形式，特别地以槲皮素、白藜芦醇和/或杨梅黄酮、单宁、萜类、夏至草素和/或甾体抗炎剂的形式，特别是以皮质甾类的形式；和/或抗微生物物质，如基于肽的物质(特别是乳铁蛋白)或非基于肽的物质(特别是青霉素和/或银)；和/或抗肿瘤物质如蒽环类抗肿瘤抗生素、姜黄素和/或土木香灵；和/或抗病毒物质如单宁；和/或骨刺激物质，如基于肽的物质特别地为乳铁蛋白，和/或非基于肽的物质，特别地为槲皮素和/或二磷酸盐的形式，和/或生长因子，特别为BMP家族，更特别为BMP-2。
[0050] 本发明一些实施方案的UHMWPE的形成通常始于将添加剂与UHMWPE粉末混合。在下文描述的实施例中，UHMWPE粉末为Ticona GUR 1020医用级UHMWPE。此类粉末是公知的且可通过市售获得。当然，也可用任何其他的UHMWPE粉末(如Ticona GUR 1050、DSM UH210、Basell 1900、高纯度UHMWPE粉末)。优选地，在添加剂和UHMWPE粉末混合过程期间，获得完全均一的混合物。一旦添加剂和UHMWPE粉末已混合，就在超过UHMWPE粉末熔点的温度将它们模制成预成型体。在此阶段，对温度进一步的详述对于模制步骤不是特别关键。本领域公知，升高温度会导致材料更快速模制成预成型体。
[0051] 通常地，添加剂材料和UHMWPE粉末的模制在超过UHMWPE粉末熔点的温度，但还优选为低于添加剂材料的降解温度。显而易见，温度影响大多数化合物，这的确同样适用于添加剂材料。尽管非必需，但优选将模制步骤的温度保持在添加剂材料的降解温度之下，因为这导致改善的最终产物。在本发明的一个实施方案中，UHMWPE粉末的模制在惰性气氛(如氩气或氮气)中完成。
[0052] 通常地，生产预成型体的模制步骤通过片、板或棒的压模进行。在本发明的另一个实施方案中，模制步骤也可通过直接压模最终植入物或接近最终植入物进行，模制后仅需较少
机械加工或通过其他方式直接生产最终或接近最终植入物。在又一方面，也可通过
柱塞挤出UHMWPE粉末共混物生产预成型体。
[0053] 在优选实施方案中，本发明的方法还包括用剂量为2-20Mrad的γ或电子束辐射照射预成型体的进一步步骤。照射可在环境条件下空气中进行。在另一方面，照射也可以在真空或保护性环境下进行，如氮气或氩气气氛。
[0054] 在备选实施方案中，本发明的方法包括用小于2Mrad剂量的γ或电子束辐射照射预成型体的进一步步骤。
[0055] 优选地，对预成型体不进行退火或进一步的加热。
[0056] 本发明的一个特别优选的实施方案中的方法还包括下列步骤中的一个或多个：将预成型体成形为植入物；包装该植入物并以2-4Mrad的γ照射灭菌或将植入物暴露于环氧乙烷或气体
等离子体而灭菌。
[0057] 通过任一已知标准方法完成从预成型体获得终产物，最通常地为通过去除或机械加工预成型体不需要的部分从而得到最终成形产物来完成。预成型体可经过如ISO 5834-2标准提到的应
力-消除退火过程。
[0058] 在又一实施方案中，本发明涉及用于治疗动物和人中炎症疾病、微生物感染、肿瘤疾病、
病毒感染和/或骨降解疾病的方法，其特征为给予上述的医疗植入物。
[0059] 参见本发明书结尾提供的比较实施例，其展示了本发明实施方案材料的几个实例。在这些比较实施例中，所显示样品不含添加剂材料或以姜黄素作为添加剂材料。
[0060] 参见实施例1(特别是其中表1)显示的数据，呈现了各种照射剂量下含和不含姜黄素样品的自由基含量，老化后最大氧化指数(最大OI)，老化后体积氧化指数(体积OI)及交联点间分子量MC的比较。可看出，包含添加剂材料姜黄素的UHMWPE样品与接受相同剂量γ照射(但未提供本发明实施方案的添加剂材料)的UHMWPE材料具有相当的自由基含量和交联点间分子量MC。然而，人工老化后最大和体积氧化指数有很大差异。人工老化按ASTM F 2003中所述的在70℃下在5atm氧压的氧气瓶中进行14天。很明显的是，与不含姜黄素的UHMWPE样品相比，含姜黄素的UHMWPE样品的老化后最大和体积氧化指数显著更低。这种升高的氧化指数是非所需的，因为它意味着在储存和作为植入物使用期间，UHMWPE预成型体将更容易氧化，这将导致材料脆变以及显著的并发症，如植入物增加的磨损或失效。
[0061] 材料的众多机械性能如实施例2所示，并呈现在表2中。从该表可看出，本发明实施方案的材料的屈服
应力、拉伸强度、断裂伸长率和charpy冲击强度与不具有添加剂的标准材料相比较。
[0062] 该实施例和其中的结果清楚地表明，以这种量加入添加剂材料对具有添加剂的UHMWPE材料的最终机械性能没有任何显著的不利影响。因此，与不含添加剂的材料相比，本发明实施方案的材料不仅表现出氧化性能改善，而且提供添加剂没有显著影响最终机械性能。再者，由于显示该材料保持其完整性，并且作为植入物仍有用，因此当该材料用作植入物时，这是具有显著优势的。
[0063] 根据实施例3，两种材料的髋模拟器测试是针对28mm的陶瓷球在AMTI髋模拟器上进行的，该模拟器以
频率为1.2Hz再现人步态周期，并将新生小
牛血清(蛋白浓度为30g/l)作为
润滑剂。通过每0.5mio循环称重髋臼杯(acetabular cup)确定重量分析磨损，并用浸湿对照杯(soak control cup)校正所得结果。
[0064] 这两个样品为，用14Mrad照射的含有0.1％重量姜黄素的UHMWPE材料(本发明实施方案的样品)，和γ-灭菌PE样品(比较)。从图1提供的数据可以看出，在髋模拟器中，当与用于比较的γ-灭菌PE材料相比，本发明该实施方案的UHMWPE材料所显示的重量分析磨损更低。
[0065] 根据所有已完成实验的结果，可确定UHMWPE材料(其磨屑具有抗炎应答)的如下特性：
[0066] ●本发明的材料可为UHMWPE
树脂粉末和一种或多种抗炎剂的混合物。
[0067] ●抗炎剂可为，但不限于，姜黄素。
[0068] ●抗炎剂可在烧结预成型体前与UHMWPE粉末混合。
[0069] ●由本发明实施方案材料制成的矫形外科植入物支承部件可产生具有抗炎特性的磨屑，使得炎症导致的骨质溶解级联反应减少。
[0070] 与
现有技术相比，本发明实施方案的优点包括磨损颗粒的释放，所述磨损颗粒由矫形外科植入物释放，包含良性身体应答特性，具体为抗炎性质。迄今，骨质溶解的减少主要是通过使用高度交联的UHMWPE降低磨损颗粒数目实现的。
[0071] 本发明的实施方案描述了主要通过抗炎磨损颗粒的溶骨性骨再吸收的减少。此外，可(但非必须)通过γ或电子束辐射的方式使UHMWPE交联从而减少磨损颗粒数目。
[0072] 因此，不仅通过颗粒数目的减少而且通过颗粒本身的抗炎性质而减少炎症导致的骨质溶解级联反应。
[0073] 比较实施例
[0074] γ-灭菌的UHMWPE在惰性气体气氛下压模成片(GUR 1020，Quadrant，Germany)、机械加工、包装并用剂量为3Mrad的γ灭菌。通过将UHMWPE树脂粉末与0.03-0.1％重量姜黄素混合生成姜黄素混合样品，压模成块，在空气中用7-14Mrad的γ辐射，机械加工成所需形状。没有施加辐射后的热处理。用这些材料进行如下测试：实施例
[0075] 实施例1
[0076] 自由基含量，氧化指数和交联点间分子量。
[0077] 表1
[0078]
[0079] 根据ASTM F2102-06，通过傅里叶变换红外
光谱(FTIR)对氧化指数(OI)进行定量。用150μm厚切片记录从表面到2.5mm深度的氧化特征。OI测量之前，在5巴氧压和70℃下，将所有样品在氧气瓶人工老化两周(ASTM F2003-02)。
[0080] 以交联点间分子量(MC)表示的交联密度，依据ASTM D 2767-95方法C通过在每一材料3份样品(10×10×10mm)上的溶胀实验(swelling experiments)得到。
[0081] 实施例2：
[0082] 机械性能
[0083] 表2
[0084]
[0085] 机械测试：双缺口Charpy冲击试验依据DIN EN ISO 11542-2(每一材料最少4份样品)进行，拉伸试验依据ASTM D638(每一材料最少5份样品)使用50mm/min试验速度进行。
[0086] 实施例3：
[0087] 髋模拟器数据
[0088] 髋模拟器测试是用28mm的陶瓷球在AMTI髋模拟器上进行的，该模拟器以频率为1.2Hz再现人步态周期，并将新生
小牛血清(蛋白浓度为30g/l)作为润滑剂。通过每0.5mio循环称重髋臼杯确定重量分析磨损，并用浸湿对照杯校正所得结果。
[0089] 髋模拟器测试的结果如图1。
[0090] 实施例4：
[0091] 抗炎应答
[0092] 通过将UHMWPE树脂粉末与0.1％重量姜黄素混合生成姜黄素混合样品，压模成块，在空气中用14Mrad的γ照射，机械加工成所需形状。没有施加照射后的热处理。一种标准的、常规的高度交联/重熔材料用作对照。
[0093] 评估了1％姜黄素浸透的聚乙烯圆盘对LPS刺激的PMA分化U937细胞的抗炎作用。将U937人单核细胞样细胞在合适的培养基中培养并扩大。将细胞接种在24孔插入物(insert)、200μl含20nMPMA的培养基中，在插入物外部的每个孔加入额外的1ml同样的含PMA的培养基。然后将板在37℃和5％CO2下孵育24小时，分
化成巨噬细胞样细胞。与PMA孵育24小时后，将培养基从细胞移除并用200μl培养基更换，将插入物转移到含1ml培养基(不含PMA)的新24孔板。随后将细胞在37℃和5％CO2下返回孵育72小时。72小时后，将插入物转移到含样品材料(插入物位于样品材料的顶端)和500μl培养基的新24孔板。此刻，也从插入物内部移除培养基并用200μl新鲜培养基更换。加入LPS之前，在37℃下将板再孵育24小时。24小时后，通过用含适量LPS的培养基(插入物内部200μl和插入物外部500μl)更换培养基(插入物内部和外部)，将0ng/ml，1ng/ml或20ng/ml的LPS加入细胞。然后将板在37℃下返回孵育8小时。在适当的孵育期，将来自插入物内部的培养基小心移除并储存在-70℃，用于后续细胞因子评估。
[0094] 一旦收集培养基，就将经调节的培养基在室温下解冻。然后通过对TNF-α特异性的ELISA
试剂盒，按照厂商说明，评估经调节的培养基。简而言之，将ELISA板用合适的捕获
抗体包被过夜。然后在室温下，将板用冲洗缓冲液冲洗3次，并用测定稀释液封闭1小时。封闭之后，将板用冲洗缓冲液冲洗3次，将100μl每个样品的溶液加入孔中，室温下孵育2小时。2小时孵育之后，将板用冲洗缓冲液冲洗5次，并与特异性第一抗体(与酶浓缩液一起用于TNF)在室温下孵育1小时，随后将板冲洗。在彻底冲洗后，接着在室温下在黑暗处将板与底物溶液孵育30分钟。30分钟后，接着将终止溶液加入每个孔，摇动1分钟后，在
450nm和570nm读取板。
[0095] 结果：如图2所示，用0、1或20ng/ml的LPS孵育8小时后的U937细胞(巨噬细胞样细胞)分泌的TNF。
[0096] 与标准的高度交联/重熔UHMWPE(PE44)相比，混合姜黄素的UHMWPE减少了与LPS孵育8小时后的巨噬细胞样细胞(U937)分泌的TNF，从而呈现出一些抗炎作用。
