发明背景

发明领域：

本发明涉及将至少一种编码转化生长因子β超家族的一个成员的基因导入至少 一种哺乳动物的结缔组织以在哺乳动物宿主中再生结缔组织的方法。本发明还涉及 导入至少一种转化生长因子β超家族的基因产物和至少一种哺乳动物结缔组织细胞 以用于哺乳动物宿主中再生结缔组织。本发明还涉及含有包含编码转化生长因子β 超家族的一个成员的基因的DNA载体分子的结缔组织细胞系。

相关技术的简要描述：

在矫形外科领域，变性关节炎或骨关节炎以及参加体育活动引起的损伤是与软骨 损伤相关的最常见疾病。对于骨关节炎，几乎在全身每个关节，如膝、髋、肩、甚 至腕都被累及。该疾病的发病机理是透明关节软骨的变性(Mankin等，J Bone Joint Surg，52A：460-466，1982)。关节的透明软骨出现变形、形成原纤维和最终蚀空。如 果变性的软骨可以某种形式再生，大多数患者可能在没有令人虚弱的疼痛中享受人 生。至今尚无报道有关再生损伤的透明软骨的方法。

药物传递的传统途径，如口服、静脉内或肌肉内施用，输送到关节的药物是不足 的。关节内注射的药物的半衰期通常是短的。关节内注射药物的另一个缺点是需要 经常重复注射以获得在关节空间可接受的药物水平以治疗慢性疾病如关节炎。由于 迄今治疗剂不能选择性地定向于关节，所以需要将哺乳动物宿主系统地暴露于高浓 度的药物以获得持续的关节内治疗剂量。用此方式暴露非靶向器官加剧了抗关节炎 药物产生严重副作用的倾向，如哺乳动物宿主的胃肠道紊乱和血液学、心血管、肝 脏和肾脏系统的变化。

在矫形外科领域，已经考虑一些细胞因子作为治疗矫形疾病的候选药物。已经考 虑骨形成蛋白作为骨形成的有效刺激剂(Ozkaynak等，EMBO J，9：2085-2093，1990； Sampath和Rueger，Complications in Ortho，101-107，1994)，和已报道TGF-β作 为骨形成和软骨形成的刺激剂(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990)。

转化生长因子β(TGF-β)被认为是多功能的细胞因子(Sporn和Roberts，Nature (London)，332：217-219，1988)，在细胞生长、分化和细胞外基质蛋白合成中起调 节作用(Madri等，Cell Biology，106：1375-1384，1988)。TGF-β体外抑制表皮细胞 和破骨细胞样细胞的生长(Chenu等，Proc Natl Acad Sci，85：5683-5687，1988)，但 体内刺激(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553- 556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8：215-220，1994)。TGF-β诱导的骨形成是 骨膜下多能细胞刺激介导的，该多能细胞最终分化成软骨形成细胞(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-6：2021-2036， 1994)。

已报道在矫形外科中TGF-β的生物效应(Andrew等，Calcif Tissue In.52：74- 78，1993；Borque等，Int Dev Biol.，37：573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology，107：1969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)：553-556，1993； Matsumoto等，In vivo，8：215-220，1994)。在鼠胚胎中，染色显示TGF-β与源自 间充质的组织密切相关，如结缔组织、软骨和骨。除了胚胎学中的发现，TGF-β在 骨形成和软骨形成的部位存在。它也可增强兔胫骨的骨折愈合。最近，已报道TGF-β 的治疗价值(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A Orthop Scand，64(5)： 553-556，1993)，但其短期效应和高成本限制了在临床上的广泛应用。

以前，已经确定关节内注射TGF-β治疗关节炎是不理想的，因为注射的TGF-β 的作用持续时间短，在体内TGF-β降解为无活性形式。因此，需要TGF-β的长期 释放以再生透明软骨的新方法。

已报道用软骨细胞的自体移植再生关节软骨(Brittberg等，New Engl J Med 331：889-895，1994)，但该步骤必须做广泛切除软组织的两次手术。如果关节内注射 同种异源细胞，如一起加有或是外源的TGF-β蛋白或是软骨细胞的包含编码TGF-β 基因的载体生产的TGF-β蛋白的软骨细胞足以治疗变性关节炎，对患者来说有极大 的经济益处和身体益处。

基因治疗，即转移特定蛋白质到特定部位的方法，可解决该问题(Wolff和 Lederberg，《基因疗法》(Gene Therapeutics)Jon A.Wolff编，3-25，1994；和Jenks， J Natl Cancer Inst，89(16)：1182-1184，1997)。

美国专利5,858,355和5,766,585公开了制备IRAP(白细胞介素-1受体拮抗 蛋白)基因的病毒或质粒构建物；再构建物转染滑液细胞(5,858,355)和骨髓细胞 (5,766,585)；将转染的细胞注射到兔关节中，但并未公开使用属于TGF-β超家族 的基因来再生结缔组织。

美国专利5,846,931和5,700,774公开了将包含属于TGF-β“超家族”的骨形态 形成蛋白质(BMP)的组合物和截短的甲状旁腺激素相关蛋白一起注射，以有效维持软 骨组织形成和诱导软骨组织。但是，未公开使用BMP基因的基因治疗方法。

美国专利5,842,477公开了将支架、骨膜/软骨膜组织和基质细胞(软骨细胞最佳) 的组合物植入到软骨受损的区域。由于该专利公开要求所有三种成分都存在于植入 的系统中，参考文献未能公开或提示不要求植入支架或骨膜/软骨膜组织的简单基因 治疗方法。

尽管有这些公开的先有技术，仍然很真空的需要稳定地再生软骨和具有长期效应 的方法。

发明概要

本发明满足了上文所述的需要。本发明提供了将编码一种产物的至少一种基因导 入至少一种哺乳动物结缔组织的细胞以用于治疗哺乳动物宿主。本发明包括使用重 组技术生产包含编码产物的基因的DNA载体分子并把包含编码产物的基因的DNA载 体分子导入结缔组织细胞。DNA载体分子可以是任何能传递和维持在靶细胞或组织内 使编码感兴趣产物的基因可以稳定表达的DNA分子。用于本发明的较佳的DNA载体 分子是病毒或质粒DNA载体分子。本方法优选包括将编码产物的基因导入哺乳动物 结缔组织的细胞以用于治疗。

本发明也涉及治疗骨关节炎的方法包括：

a)产生或获得蛋白质的转化生长因子超家族的一个成员；

b)产生或获得可包含编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群，或不包含编码 基因的任何载体的培养的结缔组织细胞群；和

c)将a)步骤的蛋白质和b)步骤的结缔组织细胞通过关节内注射转移到哺乳动物 宿主的患关节炎的关节空间，使关节空间内的组合活性导致再生结缔组织。

在结缔组织细胞包含编码蛋白的基因的载体的情况中，重组载体可以是，但不 限于病毒载体，优选是逆转录病毒。载体也可以是质粒载体。

本发明的方法包括在移植前储存结缔组织细胞群。细胞在移植前可在液氮下储 存于10％DMSO。

结缔组织细胞包括，但不限于成纤维细胞、成骨细胞或软骨细胞。成纤维细胞 可以是NIH 3T3细胞或人包皮成纤维细胞。软骨细胞可以是自体的或是同种异源的。 软骨细胞优选是同种异源。

续编组织包括，但不限于软骨、韧带或腱。软骨可以是透明软骨。

本发明的方法使用转化生长因子超家族的一个成员，包括转化生长因子β (TGF-β)。转化生长因子超家族的成员可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、 BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。TGF-β优选是人或猪TGF-β1、TGF-β2或 TGF-β3。

本发明也涉及再生透明软骨的方法，包括：

a)产生或获得蛋白质的转化生长因子超家族的一个成员；

b)产生或获得可包含编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群，或不包含编码 基因的载体的培养的结缔组织细胞群；和

c)将a)步骤的蛋白质和b)步骤的结缔组织细胞通过关节内注射转移到哺乳动物 宿主的患关节炎的关节空间，使在关节空间内的组合活性导致再生透明软骨。

如果使用转染细胞，转染的方法可以通过脂质体包囊、磷酸钙共沉淀、电穿孔 和DEAE-右旋糖酐介导。

本发明还涉及包含有编码转化生长因子超家族的一个成员的DNA序列的重组病毒 或质粒载体的结缔组织细胞系。结缔组织细胞系可包括，但不限于成纤维细胞系、 软骨细胞系、成骨细胞系、骨细胞系。软骨细胞可以是自体的或是同种异源的。软 骨细胞优选是同种异源的。

本发明结缔组织细胞系可包含转化生长因子超家族的一个成员。转化生长因子超 家族的成员优选是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 或BMP-7。

本发明的这些目的和其他目的可以通过以下的发明描述、所附的参考图和所附的 权利要求更全面地理解。

附图的简要描述

本发明可以通过下文的详细描述更全面地理解，附图只是为了说明而不是对本发 明的限制，其中：

图1显示TGF-β1 mRNA的表达。从NIH 3T3细胞中分离总的RNA或用pmTβ1 稳定地转染NIH 3T3细胞，pmTβ1是一种在无锌或有锌的情况下生长的TGF-β1表 达载体。

用TGF-β1 cDNA或β肌动蛋白探测的总RNA(15mg)作为对照。

图2A-2B显示再生的软骨的总体发现。

2A.在股髁上制成一个矩形的部分软骨缺损并在膝关节注射没有TGF-β1转染的 NIH 3T3细胞。缺损处未被覆盖。

2B.在注射NIH 3T3-TGF-β1细胞后6周，缺损处被新形成的组织覆盖。再生 组织的颜色与周围软骨的颜色几乎相同。

图3A-3D显示再生的软骨的显微镜发现(X 200)。

3A和3B.用对照细胞注射后4和6周缺损区域的苏木素-伊红(H&E)分析。开始 的缺损区域没有组织覆盖。

3C和3D.在注射TGF-β1转染的细胞后4和6周缺损区域的苏木素-伊红(H&E) 分析。在4周，部分缺损区域在注射TGF-β1转染的细胞后被透明软骨覆盖。在注 射后4和6周，再生组织变厚，在6周其高度几乎与正常软骨相同。在组织学上， 再生软骨(箭头)与周围透明软骨相同。

图4A-4B显示在兔关节中TGF-β1表达的免疫组化分析(X 200)。褐色的免疫过 氧化物酶反应产物表明在NIH 3T3-TGF-β1细胞中(4B)高水平的重组TGF-β1表达。

4A显示在注射对照细胞的兔关节中的透明软骨。

图5A-5B显示用H&E染色(A)和番红-O染色(B)显示的再生组织的显微镜发现(X 200)。

5A.在部分损伤区域，通过H&E染色(黑箭头)显示再生的透明软骨。

5B.在完全剥露的软骨区域，再生的组织(白箭头)是纤维性胶原蛋白。

图6显示pmTβ1的质粒图。

图7A-7D显示注射TGF-β1转染细胞的兔腱的大体形态。

7A.注射对照细胞的腱。

7B.注射TGF-β1转染细胞的腱，注射后6周。

7C.图7A中腱的横截面。

7D.图7B中腱的横截面。

图8A-8F显示用H&E染色显示的兔腱的再生组织的显微镜发现。

8A，8B和8C显示注射对照细胞6周后的腱。8A.×50放大。8B.×200放大。 8C.×600放大。

8D，8E和8F显示注射TGF-β1转染细胞6周后的腱。8D.×50放大。8E.×200 放大。8F.×600放大。注射到腱的TGF-β1转染细胞似乎比内源性腱细胞更圆。 纤维性胶原蛋白通过自分泌和旁分泌作用方式产生，腱有增大。在注射TGF-β1转 染细胞后腱有增大。

图9A-9B显示用H&E染色(A)和用TGF-β1抗体的免疫组化染色(B)显示的急眼腱 中再生组织的显微镜发现。褐色的免疫过氧化物酶反应产物表明在NIH 3T3-TGF-β1 细胞中高水平的重组TGF-β1表达。

图10A-10F和10A’-10F’显示用照射的NIH 3T3-TGF-β1成纤维细胞的再生软骨。

图11A-H显示用人包皮成纤维细胞产生的TGF-β1再生软骨。

图12A-H显示用NIH 3T3-TGF-β1细胞在狗模型中再生软骨。

图13A-C显示在注射成纤维细胞产生的TGF-β1后3周用TGF-β1抗再生软骨的 免疫组化染色。

图14A-14D显示人软骨细胞和重组TGF-β1蛋白的混合物在部分厚度受损的兔中 再生软骨。

图15A-15F显示在部分厚度受损的狗中注射人类软骨细胞和重组TGF-β1蛋白的 混合物再生软骨。

本发明的详细描述

本文中使用的术语“患者”包括动物王国的成员包括但不限于人类。

本文中使用的术语“哺乳动物宿主”包括动物王国的成员包括但不限于人类。

本文中使用的术语“软骨细胞”指分离的软骨细胞群，不管它们是否经历去分化 或再分化。已经观察到在体外培养数次传代后，软骨细胞去分化成其他细胞类型， 如成纤维细胞。但是，在诱导时，这些细胞可以再分化成软骨细胞。为了本发明的 目的，“软骨细胞”，意指包含软骨细胞的起始培养细胞的样本，其中可任选地包含 在整个传代时间中已去分化的软骨细胞。

本文中使用的术语“结缔组织”是连接和支持其他组织和器官的任何组织，包括 但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、腱、骨和滑膜。

本文中使用的术语“结缔组织细胞”“或结缔组织的细胞”包括在结缔组织中发 现的细胞，如分泌胶原细胞外基质的成纤维细胞、软骨细胞(软骨细胞)和骨细胞(成 骨细胞/骨细胞)，以及脂肪细胞(脂肪细胞)和平滑肌细胞。结缔组织细胞优选是成 纤维细胞、软骨细胞和骨细胞。结缔组织细胞更优选是软骨细胞。软骨细胞优选是 同种异源细胞。应当认识到本发明可以用结缔组织细胞的混合培养物和单一类型的 细胞来实施。也应当认识到组织细胞可以用化学或放射处理使细胞稳定地表达感兴 趣的基因，优选是TGF-β。当注射入宿主生物时不产生负免疫反应的结缔组织较佳。 据说同种异源细胞可用于这方面，以及自体细胞可用于细胞介导的基因治疗或体细 胞治疗。

本文中使用的术语“结缔组织细胞系”包括源自共同亲代细胞的许多结缔组织细 胞。

本文中使用的术语“透明软骨”指覆盖在关节表面的结缔组织。仅通过举例，透 明软骨包括，但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。

特别是，已知透明软骨是自身更新，对变化有反应，并提供较少摩擦的稳定移动 的。在相同关节或在厚度、细胞密度、基质组成和机械特性不同的关节中透明软骨 仍保持相同的总体结构和功能。透明软骨的一些功能包括对压力有惊人的韧性、回 弹性和分散重量负荷的特珠能力、将软骨下骨上的峰应力减至最小的能力，和大的 耐久性。

在大体上和组织学上，透明软骨表现为抵抗变形的光滑、坚固的表面。软骨的细 胞外基质包含软骨细胞，但缺少血管、淋巴管和神经。维持软骨细胞和基质之间相 互作用的精巧、高度有序的结构起保持透明软骨的结构和功能的作用，同时保持低 水平的代谢活动。参考文献O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A：1795-1812，1998 详细描述了透明软骨的结构和功能，本文纳入作为参考。

本文使用的术语“转化生长因子β(TGF-β)超家族”包含了一组结构上相关的蛋 白，它们在胚胎发育期间影响了大范围的分化过程。该家族包括，正常雄性发育需 要的米勒管抑制物(MIS)(Bohringer等，Nature，345：167，1990)，背-腹轴形成和器 官芽的形态发生需要的果蝇decapentaplegic(DPP)基因产物(Padgett等，Nature， 325：81-84，1987)，定位于卵的营养极的非洲蟾蜍Vg-1基因产物(Weeks等，Cell， 51：861-867，1987)，活化素(activins)(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.， 135：957-964，1986)，它在非洲蟾蜍胚胎中诱导中胚层和腹面结构的形成(Thomsen 等，Cell，63：485，1990)，和骨形态发生蛋白(BMP’s，如BMP-2，3，4，5，6和7， 成骨蛋白，OP-1)，它可再诱导软骨和骨形成(Sampath等，J.Biol.Chem.，265：13198， 1990)。TGF-β基因产物可影响许多分化过程，包括脂肪形成、肌形成、软骨形成、 血细胞生成和表皮细胞分化(综述见Massague，Cell 49：437，1987)，本文纳入作为 参考。

TGF-β家族的蛋白质一开始被合成为一个大前体蛋白质，随后从C末端大约 110-140个氨基酸的一串碱基残余处经历蛋白酶剪切。蛋白质的C末端区域在结构上 都是相关的，不同的家族成员可以按照它们的同源性程度被归类到不同的亚组。虽 然特定亚组内的同源范围从70％到90％氨基酸序列同一性，但亚组间的同源性明显低， 通常范围只有20％到50％。每一种情况中，活性种类似乎是C末端片段的二硫化物连 接的二聚物。对于大多数已研究的家族成员，发现同型二聚体种类有生物活性，但 是对于其他家族成员，如抑制素(Ung等，Nature，321：779，1986)和TGF-β(Cheifetz 等，Cell，48：409，1987)，也已经检测到异型二聚体似乎有与各个同型二聚体不同 的生物特性。

TGF-β基因的超家族成员包括TGF-β3，TGF-β2，TGF-β4(鸡)，TGF-β1， TGF-β5(非洲蟾蜍)，BMP-2，BMP-4，果蝇DPP，BMP-5，BMP-6，Vgr1，OP-1/BMP-7， 果蝇60A，GDF-1，非洲蟾蜍Vgf，BMP-3，抑制素-βA，抑制素-βB，抑制素-α，和 MIS。这些基因在Massague，，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1998中讨论，本文 纳入作为参考。

TGF-β基因的超家族成员优选是TGF-β。该成员较优选是TGF-β1，TGF-β2， TGF-β3，BMP-2，BMP-3，BMP-4，BMP-5，BMP-6，或BMP-7。该成员更优选是人或猪 TGF-β。该成员更加优选是人或猪TGF-β1，TGF-β2，或TGF-β3。该成员最优选 是人或猪TGF-β1。

本文使用的术语“选择性标记物”包括可稳定维持导入DNA的细胞所表达的基因 产物，并使得该细胞表达改变的表型如形态变形，或酶活性。表达转染基因的细胞 的分离是通过把编码选择性标记物的第二个基因导入相同细胞中获得的，选择性标 记物如赋于一种抗生素或其他药物抗性的酶活性。选择性标记物的例子包括，但不 限于苷激酶、二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶，它们赋于氨基糖苷抗生素抗 性如卡那霉素、新霉素和庆大霉素，潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 基转移酶、CAD(具有尿苷从头生物合成的前三个酶活性—氨基甲酰磷酸合成酶、天 冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶的单一蛋白质)、腺苷脱氨酶和天冬酰胺合成酶 (Sambrook等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，第16章，1989)，本文纳入作为 参考。

本文使用的“启动子”可以是有活性的且控制真核细胞中转录的任何DNA序列。 该启动子在真核细胞或是原核细胞中有活性。该启动子优选在哺乳动物细胞中有活 性。该启动子可组成型表达或诱导。该启动子优选是可诱导的。该启动子可优选被 外源的刺激诱导。该启动子较优选被激素或金属诱导。该启动子更加优选被重金属 诱导。该启动子最优选是金属硫蛋白基因启动子。同样的，“增强剂成分”也控制转 录，可以插入DNA载体构建物，和用于本发明的构建物以增强感兴趣基因的表达。

本文使用的术语“DC-chol”指包含阳离子胆固醇衍生物的阳离子脂质体。 “DC-chol”分子包括一个叔氨基酸基团，一个中等长度间隔臂(两个原子)和一个氨 甲酰基连接键(Gao等，Biochem.Biophys.Res，Commun.，179：280-285，1991)。

本文使用的“SF-chol”被定义为阳离子脂质体的一种类型。

本文使用的术语“生物活性”相对于脂质体使用，表明在靶细胞中导入功能性DNA 和/或蛋白质的能力。

本文使用的术语“生物活性”与核酸、蛋白质、蛋白质片段或它们的衍生物有关， 被定义为核酸或氨基酸序列模拟核酸或蛋白质的野生型形式引出的已知生物功能的 能力。

本文使用的术语“维持”，当用于脂质体传递的情况时，表明导入的DNA在细胞 中保持存在的能力。当在其他情况中使用时，它指靶向DNA在靶细胞或组织中保持 存在以产生疗效的能力。

基因治疗

本发明公开了传递感兴趣的DNA序列到哺乳动物宿主的结缔组织细胞的活体外和 体内技术。活体外技术涉及靶结缔组织细胞的培养，DNA序列、DNA载体或其他感兴 趣的传递载体体外转染到结缔组织细胞，接着移植修饰的结缔组织细胞到哺乳动物 宿主的靶关节，以体内有效表达感兴趣的基因产物。

可以理解物质如支架或构架以及各种外源性组织可以在本发明的基因治疗方案 中一起植入，该支架或组织不包括在本发明的注射系统中较佳。在一个较佳的实施 方案中，在细胞介导的基因治疗或体细胞治疗中，本发明涉及将转染或转导的结缔 组织细胞群注射到关节空间以使外源性TGF超家族蛋白质在关节空间中表达的简单 方法。

作为软骨细胞的体外操作的替代方法，编码感兴趣产物的基因被导入脂质体和直 接注射到关节区域，在那里脂质体与结缔组织细胞融合，产生属于TGF超家族的基 因产物的体内基因表达。

作为结缔组织细胞的另外的替代方法，编码感兴趣产物的基因(如裸DNA)被导入 到关节区域。裸DNA进入结缔组织细胞，产生属于TGF-β超家族的基因产物的体内 基因表达。

在本文说明书中公开的治疗结缔组织紊乱的一种活体外方法包括开始产生含有 编码蛋白质或其生物活性片段的DNA序列的重组病毒或质粒载体。随后该重组载体 用来感染或转染体外培养的结缔组织细胞群，产生含有载体的结缔细胞群。这些结 缔组织细胞然后移植到哺乳动物宿主的靶关节空间，在关节空间内产生随后的蛋白 质或蛋白质片段的表达。该感兴趣的DNA序列的表达在充分减少与结缔组织紊乱有 关的至少一种有害的关节病理学上是有用的。

本领域中的普通技术人员可以理解治疗人类患者的较佳的细胞来源是患者自身 的结缔组织细胞，如自体软骨细胞，但是同种异源细胞也可使用而与细胞的组织相 容性无关。

更特别地，本方法包括使用能编码转化生长因子β超家族的成员，或它的生物 活性衍生物或片段和选择性标记物，或它的生物活性衍生物或片段的基因。

本发明的另外的实施方案包括使用能编码转化生长因子β超家族的至少一个成 员或它的生物活性衍生物或片段，和使用本领域普通技术人员已知的能在传递时靶 细胞或组织内稳定维持的任何DNA质粒载体，而不管使用的传递方法。

一种方法是直接传递DNA载体分子(它是一种病毒或质粒DNA载体分子)到靶细胞 或组织。该方法还包括使用能编码转化生长因子β超家族的成员或它的生物活性衍 生物或片段的基因。

本发明的另一个实施方案提供了将至少一种编码产物的基因导入至少一种结缔 组织细胞以用于治疗哺乳动物宿主的方法。该方法包括使用非病毒手段把编码产物 的基因导入结缔组织细胞。更特别地，该方法包括脂质体包囊、磷酸钙共沉淀、电 穿孔和DEAE-右旋糖酐介导，并包括使用能编码转化生长因子β超家族的成员或它 的生物活性衍生物或片段，和选择性标记物或它的生物活性衍生物或片段的基因。

本发明的另一个实施方案提供了另外的方法将至少一种编码产物的基因导入至 少一种结缔组织细胞以用于治疗哺乳动物宿主。该另外的方法包括使用一种病毒传 递DNA载体分子到靶细胞或组织的生物手段。该病毒优选是假病毒，其基因组已改 变使得假病毒只能传递和在靶细胞内稳定维持，但不保留在靶细胞或组织内复制的 能力。改变的病毒基因组以重组DNA技术进一步操作使得病毒基因组作为包含在靶 细胞或组织内表达感兴趣的异源基因的DNA载体分子。

本发明的一个较佳实施方案是一种传递TGF-β到目标关节空间的方法，该方法 通过使用本说明书内公开的活体外技术的逆转录病毒载体，传递TGF-β基因到哺乳 动物宿主的结缔组织。换句话说，编码功能性TGF-β蛋白质或蛋白质片段的感兴趣 的DNA序列被亚克隆入选择的逆转录酶病毒载体，重组病毒载体随后被生长到足够 的滴度并用于感染体外培养的结缔组织细胞，和转导的结缔组织细胞，优选自体移 植细胞，被移植到感兴趣的关节，优选通过关节内注射。

本发明的另一个方法涉及通过使用腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体或单纯疱 疹病毒(HSV)载体直接在体内传递TGF-β超家族基因到哺乳动物宿主的结缔组织。 换句话说，编码功能性TGF-β蛋白质或蛋白质片段的感兴趣的DNA序列被亚克隆入 各个病毒载体。包含病毒载体的TGF-β随后生长到足够的滴度并被直接导入关节空 间，优选通过关节内注射。

将包含感兴趣的基因的DNA分子直接关节内注射入关节产生受体结缔组织细胞的 转染，并避开转移、体外培养、转染、选择的要求，以及移植包含成纤维细胞的DNA 载体以促进感兴趣的异源基因的稳定表达。

将DNA分子提供给关节的靶结缔组织的方法包括，但不限于DNA分子包囊入阳离 子脂质体，将感兴趣的DNA序列亚克隆到逆转录病毒载体或质粒载体，或直接将DNA 分子本身注射到关节。该DNA分子，不管在膝关节出现的形式，优选以DNA载体分 子，重组病毒DNA载体分子或是重组DNA质粒载体分子出现。感兴趣的异源基因的 表达是通过直接插入在真核细胞中有活性的启动子片段异源基因的编码区域的上游 来保证的。本领域普通技术人员可使用已知的载体构建的策略和技术来保证表达的 合适水平在DNA分子进入之后进入结缔组织。

在一个较佳实施方案中，从膝关节分离的软骨细胞在体外培养随后用作基因治疗 的传递系统。很明显本申请并不限于使用公开的特定结缔组织。在体外培养技术中 可能使用其他组织来源。本发明使用基因的方法可用于预防和治疗关节炎。很明显 本申请并不限于只对膝关节的预防和治疗应用。本发明可能用于预防和治疗任何易 感关节中的关节炎。

在本发明的另一个实施方案中，提供了对患者胃肠外施用预防或治疗上有效量的 化合物，该化合物包含编码TGF-β超家族蛋白质的基因和合适的药物载体。

在本发明的进一步的实施方案中包括上述的方法，包括将基因体外导入细胞。该 方法也包括随后将感染的细胞移植入哺乳动物宿主。该方法包括在结缔组织细胞有 效转染后但在感染细胞移植入哺乳动物宿主前，储存转染的结缔组织细胞。本领域 技术人员会理解感染的结缔组织细胞可冷冻储存在液氮10％ DMSO中。该方法包括使 用充分预防对关节炎有高度易感性的哺乳动物宿主中产生关节炎的方法。

在本发明的另一个实施方案中包括将至少一种编码产物的基因导入至少一种哺 乳动物宿主的结缔组织细胞以按照上文所述用于治疗哺乳动物宿主的方法，该方法 包括将包含编码产物的基因的病毒载体直接导入哺乳动物宿主在体内有效感染细 胞。该方法优选包括通过关节内注射直接导入哺乳动物宿主。该方法包括使用充分 预防对关节炎有高度易感性的哺乳动物宿主中产生关节炎的方法。该方法还进一步 包括使用上文所述的修复和再生结缔组织的方法。

本领域技术人员会理解，使用脂质体的病毒载体不受到细胞分裂的限制，而细胞 分裂对逆转录酶病毒有效感染和整合方法组织细胞是需要的。本方法使用上文所述 的非病毒手段包括使用能编码属于TGF-β超家族成员的基因和选择性标记物基因， 如抗生素抗性基因。

本发明的另一个实施方案是通过本文中公开的在体内有效表达胶原以再生结缔 组织(如软骨)的任何方法，传递编码TGF-β超家族的成员的DNA序列到哺乳动物宿 主的结缔组织。

在本文作为实施例公开的特定方法中，并不作为对本发明的限制，包含TGF-β 编码序列的DNA质粒载体被连接金属硫蛋白启动子的下游。

结缔组织是很难在治疗上定向的组织。本领域已知的静脉内和口服给药途径对这 些结缔组织的利用差，并有将哺乳动物宿主机体系统全身暴露于治疗剂的缺点。更 特别地，已知的关节内注射蛋白质到关节提供了直接接近关节。但是，大多数注射 药物以胶囊的蛋白质形式，在关节内的半衰期短。本发明通过将编码可用于治疗哺 乳动物宿主的蛋白质的基因导入哺乳动物宿主的结缔组织解决了这些问题。更特别 地，本发明提供了将编码有抗关节炎特性的蛋白质的基因导入哺乳动物宿主的结缔 组织的方法。

本发明中，基因治疗被用于解决与施用TGF-β有关的作用持续时间短和高成本 问题。转染细胞可以在组织培养中生存6周多，而没有形态改变。为了确定生存力 和作用的持续时间，细胞被注射入兔腱。如果在体内对细胞的营养供应是足够的， 细胞可生存并在足够长的时间产生TGF-β以刺激周围细胞。细胞在腱内和在关节内 环境中都有功能。

转染细胞的浓度是局部作用的一个重要因素。在以前的实验中(Joyce等，上述， 1990)，TGF-β的剂量决定形成组织的类型。特别是，软骨形成与膜内骨形成的比率 随着剂量的降低而减少。TGF-β在初级成骨细胞和MC3T3细胞的刺激中也是双相的 (Centrella等，Endocrinology，119：2306-2312，1986)。即，按照浓度它可以是刺 激性的和抑制性的(Chenu等，Proc Natl Acad Sci，85：5683-5687，1988)。在本文提 供的实施例中，NIH 3T3-TGF-β细胞在104、105、和106细胞/ml的不同浓度中刺激 胶原合成。腱大部分在106细胞/ml的浓度下增大。

在实施例中，用0.3ml浓度的106细胞/ml注射关节。从注射后2周到6周收集 样品。关节中的环境与腱中的环境不同。细胞在关节内可自由移动。细胞移动到对 它们有特异亲和力的部位。滑膜、半月板和软骨缺损区域是细胞粘附的可能部位。 在注射后6周，在部分或完全受损的软骨缺损区域观察到再生的组织，但不在滑膜 或半月板。这种对损伤区域的特异亲和力是临床应用的另一优点。如果变性关节炎 可以用注射细胞到关节中治愈，患者可以方便地治疗而不需要大手术。

注射细胞分泌的TGF-β可以通过两种可能的途径刺激透明软骨再生。一种是保 持在受损区域的软骨细胞在它们的细胞表面上产生TGF-β受体(Brand等，J Biol Chem，270：8274-8284，1995；Cheifetz等，Cell，48：409-415，1987；Dumont等，M Cell Endo，111：57-66，1995；Lopez-Casillas等，Cell，785-795，1991；Miettinen 等，J Cell Biology，127：6，2020-2036，1994；和Wrana等，Nature，370：341-347， 1994)。这些受体可以被粘附在受损区域的注射的细胞分泌的TGF-β刺激。因为在 体内TGF-β是以潜伏形式分泌的(Wakefield等，J Biol Chem，263，7646-7654，1988)， 潜伏的TGF-β需要一个活化过程。另一种途径是潜伏的TGF-β或转染细胞分泌的 TGF-β可在部分受损的软骨层的细胞外基质与TGF-β结合蛋白(LTBT)结合(Dallas 等，J Cell Biol，131：539-549，1995)。

无论是什么作用机理，透明软骨合成的发现表明长持续时间的高TGF-β浓度可 以刺激透明软骨再生。局部高浓度的载体可能不是局部刺激的重要因素，但是在理 论上，软骨细胞可以是传递TGF-β到软骨受损区域的最合适的载体(Brittberg等， New Eng J Med 331：889-895，1994)。胶原双层基质是另一个转染细胞局部分布的可 能载体(Frenkel等，J Bone J Surg(Br)79-B：831-836，1997)。

新形成的组织的特性是通过组织学方法确定的。在H&E染色中，新形成的组织与 周围透明软骨是相同的(图4)。为了评价新形成的组织的特性，组织用番红-O染色 (Rosenburg，J Bone Joint Surg，53A：69-82，1971)。与纤维胶原的白色相反，新形 成的组织染红色，提示是透明软骨(图5)。

在完全受损区域中的细胞产生纤维胶原。由于对TGF-β刺激的骨样基质屏障， 周围的成骨细胞可以不被刺激。NIH 3T3-TGF-β细胞通过自分泌刺激产生纤维胶原 而不是刺激周围细胞。细胞通过自分泌和旁分泌活化被刺激的事实增加了以TGF-β 表达构建物稳定转染的软骨细胞治疗变性关节炎的可能性。

以TGF-β表达构建物稳定转染的细胞系可以在腱和膝关节中生存。该细胞系在 腱和完全受损的软骨区域中产生纤维胶原。但是，该细胞系在部分受损的关节软骨 中产生透明软骨。通过自分泌和旁分泌作用方式的刺激机理表明用基因的TGF-β超 家族成员的基因治疗是对透明软骨损伤的一种新的治疗方法。

发明人通过转染TGF-β表达构建物制备稳定的成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β，和 人包皮成纤维细胞TGF-β1)。这些产生TGF-β的细胞在体内长持续时间维持高浓度 的活性TGF-β。

关于基因治疗的可能性，特别是细胞介导的基因治疗需要回答的第一个问题是细 胞在体内的生存力。虽然TGF-β体外可以抑制免疫细胞，但细胞在其他种类的具有 高度有效的免疫监视系统的组织中不能存活。第二个问题是，应当评估体内基因表 达的最佳浓度。我们将细胞以不同的浓度注射入兔的腱回答这个问题。关节内注射 使用的浓度是从腱内注射的最佳浓度来确定的。第三个问题是细胞如何在关节内刺 激软骨的再生。对注射的细胞有两种作用方式。一种是周围细胞通过分泌的 TGF-β(旁分泌活化)活化(Snyder，Sci Am，253(4)：132-140，1985)，其他的是自身 活化(自分泌活化)。细胞的浓度可以影响途径，但是周围环境可以是确定作用方式 的最重要因素。关节内关节液和韧带内部在血液供应、营养供应和周围细胞方面是 两个不同的环境。转染的细胞被注射入两个不同的环境以发现细胞的作用方式。本 研究的总目的是评价对矫形外科疾病的TGF-β介导的基因治疗和确定体内的作用方 式。

治疗组合物

本发明涉及软骨再生。在特定的实施例中，本发明的方法包括使用转化生长因子 β超家族成员的基因产物，或它的生物活性衍生物或片段TGF-β超家族蛋白质是与 结缔组织细胞(如软骨细胞，包括同种异源的软骨细胞)联合施用的。TGF-β蛋白质 可以与细胞同时施用，或在施用细胞以前或以后施用，只要软骨在治疗部位再生。

在本发明的另一个实施方案中，提供了以预防上或治疗上有效量的胃肠道外施用 到患者的化合物，该化合物包含TGF-β超家族蛋白质和合适的药物载体。

在治疗应用中，TGF-β蛋白质可制成用于局部施用，和与结缔组织细胞(如软骨 细胞，包括同种异源的软骨细胞)联合施用。在本发明中，TGF-β蛋白质通常可与载 体结合，载体如赋形剂的稀释剂包括填充剂、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 表面活化剂、可侵蚀聚合物或润滑剂，取决于使用方式和剂量形式的特性。典型的 剂量形式包括，粉剂、液体制剂包括悬液、乳剂和溶液、颗粒，和胶囊。

本发明的TGF-β蛋白质也可与药学上可接受的载体结合以施用于爱试者。合适 的药物载体的例子是各种阳离子脂质，包括，但不限于N-(1-2，3-二油酰氨)丙 基)-n，n，n-氯化三甲铵(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇铵(DOPE)。脂质体也是本发明 TGF-β蛋白质分子的合适载体。另一种合适的载体是包含TGF-β蛋白质分子的缓释 凝胶体或聚合物。

TGF-β蛋白质可与生理学上可接受的载体或稀释剂的量混合，如盐溶液或其他合 适的液体。TGF-β蛋白质分子也可与其他载体手段结合以保护TGF-β蛋白质和它的 生物活性形式以免降解，直至它们到达目标和/或促进TGF-β蛋白质和它的生物活 性形式的移动穿过组织屏障。

本发明的进一步的实施方案包括在转移细胞前储存结缔组织细胞。本领域技术人 员会理解结缔组织细胞可冷冻储存在液氮10％DMSO中。该方法包括使用充分预防对 关节炎有高度易感性的哺乳动物宿主中产生关节炎的方法。

治疗组合物的配制是一般本领域内熟知的，可以很方便地参考《雷明顿制药科学》 (Remington’s Pharmaceutical Science)，第17版，Mack Publishing Co.，Easton， Pa.，USA。例如，可施用约0.05μg到约20mg每公斤体重每天。可调整剂量方案 以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用数次均分剂量或治疗情况的紧急表明可成 比例地减少剂量。活性化合物可以方便的方式施用，如口服、静脉内(水溶性的)、 肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(如通过腹膜内途径使用缓慢释放分子 或用细胞，如体外敏感化处理的单细胞或树突细胞，并过继地转移到接受者)。取决 于施用的途径，需要将肽包被在一种物质中以保护它免受酶、酸或其他可灭活所述 成分的自然条件的作用。

例如，肽的低亲脂性会使它们在胃肠道中被能切割肽键的酶破坏和在胃中被酸水 解。为了以除了胃肠外施用的方式施用肽，肽会被一种物质包被，或与一种物质一 起施用以防止物质灭活。例如，肽可在佐剂中施用，可与酶抑制剂共施用或在脂质 体中施用。本文所考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油醚和 n-十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸盐(DEP) 和抑胰肽酶。脂质体包括水包油包水CGF乳剂和传统的脂质体。

活性化合物也可胃肠外或腹膜内施用。也可在甘油液体聚乙二醇，和它们的混合 物和在油中制备分散剂。在储存和使用的一般情况下，这些制剂包含防腐剂以防止 微生物的生长。

适合注射使用的药物形式包括无菌含水溶液(水溶性的)或分散剂和无菌粉剂以 即时制备无菌注射溶液或分散剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的和必须是达 到易于注射器能力范围的液体。它在制造和储存的情况下必须稳定且必须防止微生 物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，例如，水、乙醇、多羟 基化合物(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，它们的合适的混合物，和 植物油。例如，适当的流动性可以通过使用包衣如卵磷脂，通过保持分散需要的颗 粒大小和使用表面活性剂来维持。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，三氯叔 丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等产生防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括 等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如，单硬脂酸 铝和凝胶来参数可注射组合物的延长吸收。

按照要求，在具有以上列举的各种其它成分的合适溶剂中以所需的量掺入活性化 合物，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，分散剂的制备是通过将各种无菌 活性成分掺入无菌载体中，无菌载体中包含基础分散介质和以上列举的所需其它成 分。在制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况中，制备的较佳方法是真空干燥和冷冻 干燥技术，该技术从其以前无菌过滤的溶液中产生活性成分加任何其他所需成分的 粉剂。

当肽按照上述被合适保护时，活性化合物可口服施用，例如，连同惰性稀释剂或 连同可同化可食用载体，或者被封装在硬或软壳明胶胶囊中，或者被压制成片剂， 或者可与饮食的食品直接掺入。对于口服治疗施用，活性化合物可与赋形剂掺入并 用于可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片等等。该组合 物和制剂应包含至少1％重量的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以变化和 可以方便地在每单位重量的约5％到约80％。在用于治疗的组合物中活性化合物的量 是可获得的合适剂量。本发明的较佳组合物或制剂的制备是口服剂量单位形式包含 约0.1μg和约2000mg之间的活性化合物。

片剂、药丸、胶囊等也可包含下列物质：粘合剂如西黄嗜胶、阿拉伯胶、玉米淀 粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；润滑剂 如硬脂酸镁；和可加入甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或矫味剂如薄荷、冬青油或樱桃 香料。当剂量单位形式是胶囊，除上述类型的物质以外它可包含液体载体。各种其 他物质可作为包衣出现或用来改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、药丸或胶囊 可以用虫胶、糖或二者包被。糖浆或酏剂可包含活性化合物，以蔗糖为甜味剂、以 羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯为防腐剂、以樱桃或柑橘香料为染色和矫味剂。 当然，制备任何剂量单位形式作用的任何物质应是药学上纯的和在使用的量上完全 无毒性的。此外，活性化合物可掺入缓释制品和制剂中。

本文使用的“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和所有的溶剂、分散 介质、包衣抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的介 质和制剂的用途是本领域熟知的。除了在任何常规介质或制剂范围中与活性成分不 相容的物质，治疗组合物是考虑使用的。补充活性成分也可掺入组合物中。

配制易于施用或剂量统一的剂量单位形式的胃肠外组合物是特别有利的。本文使 用的剂量单位形式指适于待治疗哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位； 每个单位包含预先确定量的活性物质，该活性物质联合需要的药物载体被计算以产 生需要的疗效。本发明的剂量单位形式的规格是由以下内容说明和直接取决于以下 内容：(a)活性物质的独特特征和要获得的特别疗效，和(b)在身体健康受损的有疾 病情况的活受试者中使用活性物质治疗疾病的现有技术的限制。

在剂量单位形式中为了方便和有效的施用，有效量的主要活性成分与合适的药学 上可接受的载体组合。例如，一个单位剂量形式可包含范围在0.5μg到约2000mg 量的主要活性化合物。在比例上，活性化合物通常在约0.5μg/ml的载体中存在。 在组合物包含补充活性成分的情况中，剂量是参考所述成分施用的通常剂量和方式 确定的。

传递系统

各种传递系统是已知的且可用于施用本发明的组合物，如，包囊于脂质体、微粒、 微囊，可表达化合物的重组细胞，受体介导的(细胞)内吞作用，作为逆转录病毒载 体或其他载体的部分的核酸构建等。导入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜 内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物或组合物可以任何常规的途 径施用，如输液或推注，通过上皮或粘膜衬吸收(如，口粘膜，直肠和肠粘膜等)和 可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。此外，将本发明 的药物化合物或组合物以任何合适的途径导入中枢神经系统是合乎需要的，这些合 适的途径包括室内注射和鞘内注射；室内注射可以通过室内导管进行，例如，该导 管可连接于贮器，如Ommaya贮器。也可采用肺部施用，如通过使用吸入器或喷雾器， 和具有雾化剂的制剂。

在特定的实施方案中，需要将本发明的药学化合物或组合物局部施用到需要治疗 的区域；例如，但非限于这可以通过手术中局部输注、局部应用，如联合手术后伤 口敷料，通过注射，通过导管方式，通过栓剂方式，或通过植入方式，所述植入是 多孔的、非多孔的或胶状物质，包括膜，如Sialastic膜，或纤维。当施用蛋白质， 优选包括抗体或本发明的肽，必须小心使用蛋白质不吸收的物质。在另一个实施方 案中，化合物或组合物可在囊泡，特别是脂质体中传递。而在另一个实施方案中， 化合物或组合物可在控制释放系统中传递。在一个实施方案中，可使用泵。在另一 个实施方案中，可使用聚合材料。而在另一个实施方案中，控制释放系统可置于治 疗目标的附近，因此仅需要系统性剂量的小部分。

如果它的施用可以被受体动物耐受和另外适合施用到该动物，一个组合物被称为 “药学上或生理学上可接受的”。如果施用的量是生理学上明显的，该制剂被称为以 “治疗上有效的量”施用。如果某制剂的存在导致受体患者生理上可检测的变化， 该制剂是生理学上明显的。

本发明的范围不受到本文所描述的特定实施方案的限制。当然，从本文的描述和 所附的数据，除了本文描述的内容，本发明的各种改进对于本领域技术人员是显而 易见的。此类改进被认为是属于本发明所附的权利要求的范围内。下列实施例被用 于阐明本发明，而不是限制。

实施例

实施例1-材料和方法

质粒构建

为了产生金属硫蛋白表达构建物(pM)，通过聚合酶链扩增产生金属硫蛋白I启动 子(-660/+63)，该聚合酶链扩增使用基因组DNA，使用装入寡核苷酸的Xba I和Bam H I限制部位用于扩增。扩增的片段被亚克隆入pBluescript(Stratagene，La Jolla， CA)的Xba I-Bam H I位点。通过将1.2-kb Bgl II片段(包含TGF-β编码序列和在 3’末端的生长激素poly A位点)亚克隆入pM的Bam H I-Sal I位点产生质粒pmTβ1。

细胞培养和转染—TGF-β cDNA被转染入成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β)或人类包 皮成纤维细胞/TGF-β1。它们在有10％浓度的胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培 养基(Gibco-BRL，Rockville，MD)中培养。TGF-β1 cDNA序列用金属硫蛋白基因启 动子加入pmTβ1载体。新霉素抗性基因序列也被插入载体中。

使用将该载体插入细胞中的磷酸钙方法。为了选择有转染基因序列的细胞，新霉 素(300μg/ml)被加入培养基中。随后选择生存的克隆，TGF-β1 mRNA的表达用 Northern分析和TGF-β1 ELISA分析(R&d系统)来确定。有TGF-β1表达的细胞储 存在液氮中，刚好在注射前培养。

Northern印迹分析—用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿从细胞中分离总RNA。10μg RNA 在包含0.66M甲醛的1.0％琼脂凝胶上电泳，转移到DURALON-UV膜，用UV STRATALINKER(STRATAGENE)交联。印迹在1％牛血清白蛋白溶液，7％(w/v)SDS，0.5M 磷酸钠和1mM EDTA溶液中，在65℃预杂交和杂交。在胶片曝光前杂交的印迹在 0.1％SDS，1X SSC中，50℃洗涤20分钟。RNA印迹用人TGF-β1的32P-标记的cDNA 探针杂交。β-肌动蛋白的探针用于控制加样。

细胞注射入兔中—选择重2.0-2.5kg的新西兰白兔作为动物模型。在用氯胺酮 和roumpun麻醉后，每个兔用无菌方式处理。暴露腱，将0.2-0.3ml的浓度为104、、 105、和106细胞/ml的细胞注射到腱的中部。硫酸锌被加入兔的饮用水中用于转染的 DNA的表达。在确定腱内最佳浓度的实验后，进行关节内注射。暴露膝关节，用刀制 成部分和完全的软骨缺损。在透明软骨层上制成部分缺损，小心不要暴露软骨下的 骨。在移除所有的透明软骨后，制成完全的缺损以暴露软骨下的骨。在关闭外科伤 口后，关节内注射浓度为106细胞/ml的细胞，硫酸锌被加入饮用水中。

组织学检查—在收集腱和膝关节后，样品用甲醛水溶液固定和用硝酸脱钙。它们 被石蜡包埋并切成0.8μm厚度的切片。苏木素-伊红，和番红-O染色被用来在显微 镜下观察再生的组织。

实施例2—结果

稳定的细胞系—使用磷酸钙共沉淀方法(图1)进行转染。约80％的生存克隆表达 转基因mRNA。这些选出的TGF-β1产生细胞在硫酸锌溶液中孵育。当细胞在100μM 硫酸锌溶液中培养时，它们产生mRNA。TGF-β分泌速度是约32ng/106细胞/24小 时。

兔关节软骨缺损的再生—观察兔腱以检查NIH 3T3-TGF-β1细胞的生存力。在 106细胞/ml浓度，腱在大体上比104和105浓度的厚。在制成部分和完全的软骨缺损 后，0.3ml的106细胞/ml的NIH 3T3-TGF-β1细胞被注射入膝关节。在注射后2 到6周检查关节。在部分损伤软骨中，我们发现有形成的透明软膏；在注射后2周， 出现透明软骨，在注射后6周，软骨缺损被透明软骨覆盖(图2)。再生的软骨厚度 随时间推移而变厚(图3)。注射的细胞分泌TGF-β1，用有TGF-β1抗体的免疫组化 染色可观察(图3)。对侧处注射没有TGF-β1转染的正常成纤维细胞的没有被透明软 骨覆盖。在部分损伤的区域，再生的透明软骨在番红-O(Safranin-O)染色中是红色 (图4)。(新形成的软骨深度与缺损的深度几乎相同。)此发现提示注射细胞通过旁分 泌作用方式活化周围正常软骨细胞。

完全损伤软骨的再生组织不是透明软骨而是纤维胶原。在番红-O染色中是白色而 不是用透明软骨获得的红色(图5)。软骨被纤维组织覆盖，意味着这些细胞仅通过自 分泌方式活化。可被TGF-β刺激的周围骨细胞在厚的钙化骨基质存在的情况下似乎 受到TGF-β刺激的阻碍。由于也屏障注射细胞不能刺激骨细胞。

TGF-β1转染细胞被注射入兔腱。如此操作的腱显示比对照腱有大体上的形态增 厚(图7)。腱的切片H&E染色在显微镜检查下显示，注射的NIH 3T3-TGF-β1细胞 可生存并在兔腱内产生纤维胶原(图8)。显微镜检查下，有TGF-β1抗体的免疫组化 染色的再生腱组织显示TGF-β1在腱中的表达(图9)。

实施例3

或是对照NIH 3T3或是NIH 3T3-TGF-β1细胞(5-7×105)用6000rad照射并 注射入兔膝关节。这些照射的细胞在组织培养皿中在3周内全部死亡。注射步骤与 前述的用未处理细胞的方案相同。在注射后3或6周收集膝关切。样品用甲醛水溶 液固定和用硝酸脱钙。制成样品的切片并用石蜡包埋，然后切成0.5μm厚度的切片。 在图10中，番红-O染色(A-D和A’-D’)和苏木素-伊红染色(E-F和E’-F’)在切片中 进行以用显微镜观察再生的软骨组织。(原始放大：(A，B，A’和B’)×12.5；(C-F 和C’-F’)×400)。

实施例4

或是对照人包皮成纤维细胞(hFSF)或是hFSF-TGF-β1细胞被注射入包含在股髁 上部分软骨缺损的兔膝关节(3mm×5mm，1.5mm深)。这些细胞(0.5ml的2×106 细胞/ml)按照前述的方案注射，或20-25μl同样浓度的细胞装一缺损的顶部。在后 者的情况中，细胞被置于缺损处15到20分钟使它们在缝合前安置在缺损的底部。 在两种情况中，获得类似的软骨再生水平。在注射后6周收集样品并用显微镜观察。 图11a和B显示用hFSF(A)或hFSF-TGF-β1细胞(B)注射后6周的股髁图片。C，E， 和G显示注射对照hFSF细胞的股髁切片的番红-O染色(c和E)和H和E染色(G)，D，F， 和H显示注射hFSF-TGF-β1细胞的股髁切片的番红-O染色(D&F)和H&E染色(H)。 (原始放大：(c和D)×12.5；(E-H)×400)。

实施例5

或是对照NIH 3T3或是NIH 3T3-TGF-β1细胞被注射入包含在股髁上部分软骨 缺损的狗膝关节(6mm×6mm，2mm深)。这些细胞(4ml的2×106细胞/ml)按照 前述的方案注射，或30-35μl同样浓度的细胞装到缺损的顶部。在后者的情况中， 细胞被置于缺损处15到20分钟使它们在缝合前安置在缺损的底部。在两种情况中， 获得类似的软骨再生水平。在注射后6周收集样品并用显微镜观察。图12，a和B 显示用NIH 3T3(A)或NIH 3T3-TGF-β1细胞(B)注射后6周的股髁图片。C，E，和G 显示注射对照NIH 3T3细胞的股髁切片的番红-O染色(C&E)和H&E染色(G)，D，F，和 H显示注射NIH 3T3-TGF-β1细胞的股髁切片的番红-O染色(D&F)和H&E染色(H)。 (原始放大：(c和D)×12.5；(E-H)×400)。

实施例6

为了研究在再生软骨组织中TGF-β1蛋白的表达，在注射后3周用TGF-β1抗体 进行修复组织的免疫组化染色。结果显示只在再生软骨的细胞中有高水平的TGF-β1 蛋白表达，许多似乎是新形成的软骨细胞(图13，a和B)。单用第二抗体探查的相同 组织未见切片中的染色(图13，C)。(原始放大：A×12.5；(B-C)×40)。

在收集兔膝关节样品后，样品用甲醛水溶液固定和用硝酸脱钙。制备样品切片并 用石蜡包埋，然后切成0.8μm厚度的切片。切片被脱蜡和在二甲苯及乙醇中通过连 续孵育以水合。在1x PBS中洗涤2分钟后，切片用3％H2O2封阻10分钟。对TGF-β1 蛋白的第一抗体被应用于切片并孵育1小时。对照切片在这个步骤在没有第一抗体 的1x PBS中孵育。在用HRP缀合的第二抗体孵育前，切片在1x PBS中洗涤和用5％ 牛奶封阻20分钟。用0.05％二氨基联苯胺(DAB)在1x PBS中进行色原反应5分钟。 该切片随后用苏木精染色和封固。

在本研究中免疫组化染色数据和狗模型研究中的数据提示用当前细胞治疗方法 透明软骨再生的分子机制的可能性。注射入膝关节的成纤维细胞可以某种方式通过 未知的途径分化成软骨细胞，象“反向分化”类型的过程。该途径可能受到体内注 射的成纤维细胞分泌的TGF-β1的引发，这使得存会的软骨细胞和成纤维细胞释放 各种因子象TGF-β1使用的旁分泌和自分泌方式来进行该途径。

实施例7

本研究探索了体内被共注射的重组TGF-β1蛋白质刺激的正常软骨细胞可诱导软 骨组织再生的可能性。人软骨细胞与各种量的重组TGF-β1蛋白质混合。该混合物 被注入到兔或狗的股髁上包含部分厚度软骨缺损的膝关节。

图14A-14D显示了在兔中软骨再生与正常人软骨细胞(hChon)和重组TGF-β1蛋 白质的混合物。或是hChon和重组TGF-β1蛋白质的混合物或是hChon对照被注射 入股髁上包含部分厚度软骨缺损(3mm×5mm，1-2mm深)的兔膝关节。混合物(15-20μl 的2×106 NIH 3T3细胞/ml和1，20，50或90ng重组TGF-β1蛋白质)装在缺损 的顶部，然后安置在缺损处15-20分钟以使混合物在缝合前透入伤口。在注射后6 周收集样品并用显微镜观察。图1A和1C显示或是用hChon和重组TGF-β1蛋白质 的混合物或是单用hChon(C)注射后6周的股髁图片。图1B和1D显示或是用hChon 和重组TGF-β1蛋白质的混合物或是单用hChon(D)注射的股髁切片的Mason三色染 色。

结果显示软骨再生不发生在用hChon和1ng重组TGF-β1蛋白质的混合物(数据 未显示)，而透明样软骨被混合物中10，50，或90ng重组TGF-β1蛋白质所诱导。 这些结果也表明随着重组TGF-β1蛋白质的量在混合物中增加，更诱导了透明样软 骨的再生，表明软骨再生取决于施用的TGF-β1蛋白质的量。

实施例8

图15A-15F显示在狗中用正常软骨细胞(hChon)和重组TGF-β1蛋白质的混合物 再生软骨。或是hChon和重组TGF-β1蛋白质的混合物或是hChon对照注入到股髁 上包含的部分厚度软骨缺损(3mm×10mm，1-2mm深)的狗膝关节。混合物(20-25μl的 2×106hChon细胞/ml和100，200，或400ng重组TGF-β1蛋白质)装在缺损的 顶部，然后安置在缺损处15-20分钟以使混合物在缝合前透入伤口。在注射后8周 收集样品并用显微镜观察。图2A，2C和2E显示或是用hChon和200ng(A)或400ng(B) 重组TGF-β1蛋白质的混合物或是单用hChon(E)注射后8周的股髁图片。图2B， 2D和4F显示或是用hChon和200ng(B)或400ng(D)重组TGF-β1蛋白质的混合物或 是单用hChon(F)注射的股髁切片的Mason三色染色。

结果显示软骨再生不发生在用hChon和100ng重组TGF-β1蛋白质的混合物(数 据未显示)，而透明样软骨被混合物中200或400ng重组TGF-β1蛋白质所诱导。在 狗中的这些结果也表明透明样软骨再生取决于混合物中的重组TGF-β1蛋白质的量。

本发明的特定实施方案已在上文描述以用于阐明的目的，对于本领域熟练技术人 员显而易见的是，本发明的细节可进行许多变化而不脱离本发明所附的权利要求的 范围。

本文引用的所有参考文献，全部纳入作为参考。

                                参考文献

Andrew JG，Hoyland J，Andrew SM，Freemont AJ和Marsh D：Demonstration of TGF-βm-RNA by in situ hybridization in normal fracture healing.Calcif Tissue Int，52：74-78，1993。

Bourque WT，Gross M和Hall BK：Expression of four growth factors during fracture repair.Int J Dev Biol，37：573-579，1993。

Brand T和Schneider MD：Inactive type II and type I receptors：TGF-βare dominant inhibitors of TGF-βdependent transcription.J Biol Chem，270：8274- 8284，1995。

Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，Ohlsson C，Isaksson O和Peterson L：Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.New Engl J Med 331：889-895，1994。

Carrington JL，Roberts AB，Flanders KC，Roche NS和Reddi AH：Accumulation， localization and compartmentation of TGF-βduring enchondral bone development.J Cell Biology，107：1969-1975，1988。

Centrella M，Massague J和Canalis E：Human platelet-derived transforming growth factor-βstimulates parameters of bone growth in fetal rat calvariae. Endocrinology，119：2306-2312，1986。

Cheifetz S，Weatherbee JA，Tsang MLS，Anderson JK，Lucas R，Massague J：Transforming growth factor beta system，a complex pattern of cross-reactive ligands and receptors.Cell，48：409-415，1987。

Chenu C，Pfeilschifter J，Mundy GR和Roodman GD：TGF-βinhibits formation of osteoclast-like cells in long-tern human marrow cultures.Proc Natl Acad Sci，85：5683-5687，1988

Critchlow MA，Bland YS和Ashhurst DE：The effect of exogenous transforming growth factor-βon heal ing fractures in the rabbit.Bone，521-527，1995。

Dal las SL，Miyazono K，Skerry TM，Mundy GR和Bonewald LF：Dual role for the latent transforming growth factor beta binding protein(LTBP)in storage of latent TGF-βin the extracellular matrix and as a structural matrix protein. J Cell Biol，131：539-549，1995。

Dumont N，O’Connor M和Philip A：Transforming growth factor receptors on human endometrial cells：identification of the type I and II receptors and glycosyl-phosphatidylinositol anchored TGF-βbinding proteins.M Cell Endo， 111：57-66，1995。

Frenkel SR，Toolan B，Menche D，Pitman MI和Pachence JM：Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair.J Bone J Surg[Br]79-B：831-836，1997。

Heine UI，Munoz EF，Flanders KC，Ellingsworth LR，Peter Lam H-Y，Thompson NL，Roberts AB和Sporn MB：Role of Transforming Growth factor-βin the development of the mouse embryo.J Cell Biology，105：2861-2876，1987。

Jenks S：Gene therapy：mastering the basics，defining details[news].J Natl Cancer Inst，89(16)：1182-1184，1997。

Joyce ME，Roberts AB，Sporn MB和Bolander ME：Transforming Growth Factor-β and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur.J Cell Biology，110：2195-2207，1990。

Lind M，Schumacker B，SoballeK，Keller J，Melsen F，和Bunger：Transforming growth Factor-βenhances fracture healing in rabbit tibiae.A Orthop Scand， 64(5)：553-556，1993。

Lopez-Casillas F，Chifetz S，Doody J，Andres JL，Lane WS Massague J：Structure and expression of the membrane proteoglycan component of the TGF-βreceptor system.Cell，67：785-795，1991。

Madri JA，Pratt BM和Tucker AM：Phenotypic modulation of endothelial cells by Transforming Growth Factor-βdepends upon the composition and organization of the extracellular matrix.J Cell Biology，106：1375-1384，1988。

Mankin HJ：The response of articular cartilage to mechanical injury.J Bone Joint Surg，52A：460-466，1982。

Massague，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1998。

Matsumoto K，Matsunaga S，Imamura T，Ishidou Y，Yosida H Sakou T： Expression and distribution of transforming growth factor-βduring fracture Healing.In vivo，8：215-220，1994。

Miettinen PJ，Ebner R，Lopez AR 和 Derynck R：TGF-βinduced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells： involvement of type I receptors.J Cell Biology，127-6：2021-2036，1994。

O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A：1795-1812，1998。

OZKAYNAK E，Rueger DC，Drier EA，Corbett C和Ridge RJ：OP-1 CDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-βfamily.EMBO J，9：2085-2093，1990。

Rosenburg L：Chemical basis for the histological use of Ssfranin-O in the study of articular cartilage.J Bone Joint Surg，53A：69-82，1971。

Sampath TK，Rueger DC：Structure，function and orthopedic applications of osteogenic protein-1(OP-1).Complications in Ortho，101-107，1994。

Snyder SH：The molecular basis of communication between cells.Sci Am， 253(4)：132-140，1985。

Sporn MB和Roberts AB：Peptide growth factors are multifunctional.Nature (London)，332：217-219，1988。

Wakefield LM，Smith DM，Flanders KC和Sporn MB：Latent transforming growth factor-βfrom human platelets.J Biol Chem，263，7646-7654，1988。

Wolff JA和Lederberg J：A history of gene transfer and therapy.John A. Wolff，Editor.Gene Therapeutics，3-25，1994.Birkhauser，Boston。

Wrana JL，Attisano L，Wieser R，Ventura F和Massague J：Mechanism of activation of the TGF-βreceptor.Nature，370：341-347，1994。