以膝关节或肩关节等为代表的关节组织中，由关节连接的骨的顶部，为了 使骨头之间不直接摩擦而覆盖有软骨组织。随着年龄的增长或由于过大的负重 负荷或负重的反复负荷等原因，该软骨组织受到损伤的话，在关节内产生炎症， 即，自己可以意识到的关节疼。关节的软骨组织的损伤和关节疼，在从年轻人 到老年人中广泛且高频率地见到，从提高患者的生活质量(Quality of Life)的 观点出发，或从医疗经济学的角度出发，需要开发一种有效且合理的治疗方法。
在受到损伤的软骨组织的治疗中，最重要的问题是软骨组织在生物体内不 能自然再生，因此，通过投入药物等使受损的软骨组织再生是非常困难的。例 如，在软骨下骨中施加多个小孔的微骨折法虽然可以形成纤维软骨，但是作为 正常的关节软骨的透明软骨不再生。因此，受到损伤的软骨组织的治疗实际上 是通过专门从生物体中取出的软骨组织的移植而进行的。
利用从生物体中取出的软骨组织移植的治疗方法，可以大致分为自体骨软 骨移植法(Mosaicplasty)和培养自体骨软骨移植法这两类。自体骨软骨移植 法是指，安装骨塞物(bone plug)后从受到损伤的关节的正常健康部分或相反 侧的关节组织选取自身的软骨组织，将其自体移植到缺损部的方法。但是，这 个治疗方法有弄伤选取软骨的部位中正常软骨这样不可避免的问题，另外，软 骨组织的损伤部位大时，有不能从生物体中选取移植所需量的软骨组织这样的 问题。而另一方面，培养自体骨软骨移植法是选取患者的自体骨软骨(透明软 骨)组织的一部分，通过将其在培养基和/或培养基材中培养，在试验管内使 软骨组织再生，将其自体移植到患部的方法。但是，培养自体骨软骨移植法具 有如下的问题：由于软骨组织的无菌培养需要准备非常昂贵的设备；由于软骨 组织的选取操作和移植这两次处置、患者的长期住院而引起的治疗成本的增 加；由培养时的污染而引起人兽共通疾病感染的危险；治疗效果不确定性。
为了避开这样的问题，促进患者体内软骨组织的自然再生的治疗方法的开 发成为重要的课题。现在也在试验性地研究将b-FGF或OP-1等细胞因子和载 体一起局部投入到含有受到损伤的软骨组织的关节中的方法，或将自体骨间质 干细胞或ES细胞投入到含有受到损伤的软骨组织的关节中的方法。但是，有 关这些方法的效果或副作用等问题点的确认仍然是今后的大的课题，这种治疗 方法也完全没有被实用化。

发明要解决的问题
本发明提供一种医疗材料，其使得一种新的软骨组织再生治疗方法成为可 能，该方法不同于移植自体软骨组织、软骨替代物或其他未分化细胞的治疗方 法，是基于全新概念的方法。
本发明人等发现，由具有交联网络结构的聚合物形成的水凝胶，可以作为 通过特殊的外科处置而进行的软骨组织再生治疗用骨填充剂，从而完成了下述 各发明。
(1)一种软骨组织再生治疗用骨填充剂，其特征在于，由水凝胶构成， 该水凝胶具有由2个以上的具有交联网络结构的聚合物形成的互穿网络结构 或由具有交联网络的聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。
(2)根据(1)所述的骨填充剂，其中，具有交联网络结构的聚合物或直 链聚合物是具有电荷的不饱和单体和/或电中性的不饱和单体的聚合物。
(3)根据(2)所述的骨填充剂，其中，具有电荷的不饱和单体为具有酸 性基团和/或碱性基团的不饱和单体。
(4)根据(3)所述的骨填充剂，其中，酸性基团为羧基、磷酸基或磺酸 基或这些基团的盐。
(5)根据(3)所述的骨填充剂，其中，具有酸性基团的不饱和单体为 2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸或其盐。
(6)根据(2)所述的骨填充剂，其中，电中性的不饱和单体为N，N-二 甲基-丙烯酰胺。
(7)根据(1)所述的软骨组织再生治疗用骨填充剂，其由水凝胶构成， 该水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚 合物和以N，N-二甲基-丙烯酰胺为原料单体的具有交联网络结构的聚合物构成 的互穿网络结构。
一种软骨或软骨组织再生诱导剂，其特征在于，由水凝胶构成，该水凝胶 具有由2个以上的具有交联网络结构的聚合物形成的互穿网络结构或由具有 交联网络结构的聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。
根据权利要求8所述的软骨或软骨组织再生诱导剂，其由水凝胶构成，该 水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合 物和以N，N-二甲基-丙烯酰胺、丙烯酰胺或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷硫酸钠为原 料单体的具有交联网络结构的聚合物构成的互穿网络结构。
发明的效果
本发明的骨填充剂正如后面详细所述，通过填充到设在位于受到损伤的软 骨组织的正下方的下骨中的孔或沟中，从而可以促进软骨组织的再生或软骨组 织和软骨下骨两者的再生。这样的治疗方法，完全不具有目前的自体骨移植法 和培养自体骨软骨移植法所被指出的上述各种问题，是一种极为有效的治疗方 法。
附图说明
图1是模式性的显示本发明的「互穿网络结构」(双网型)的图。图中A 表示一方的交联网络聚合物，B为另一方的交联网络聚合物，1和2表示各交 联网络聚合物的交联点。另外，该图是在网络结构中含有溶剂(水)的凝胶的 概念图。
图2是模式性的显示本发明的「半互穿网络结构」(双网型)的图。图中 C表示交联网络聚合物，D表示直链聚合物，3表示交联网络聚合物的交联点。
图3表示从骨缺损部的关节面到具有由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为单 体的具有交联网络结构的聚合物和以N，N-二甲基-丙烯酰胺为原料单体的具有 交联网络结构的聚合物构成的互穿网络结构的水凝胶(以下，表示为 PAMPS/PDMAAm凝胶)的表面的间隔为0.0mm时的组织学的染色图像(番 红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。
图4表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 0.0mm～0.6mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。
图5表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 0.7mm～1.3mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。上下两种照片是关于接受同样条件手术的不同个体 的染色图像。
图6表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 1.4mm～2.0mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。上下两种照片是关于接受同样条件手术的不同个体 的染色图像。
图7表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 2.1mm～2.8mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。
图8表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔大于 2.8mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部 分表示软骨组织。
图9表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 0.7mm～1.3mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。
图10表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 1.4mm～2.0mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。
图11表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为 2.1mm～2.7mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉 红色的部分表示软骨组织。
图12表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔大于 2.8mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部 分表示软骨组织。
图13模式性地表示使用本发明的骨填充剂的软骨再生治疗。
图14是表示实施例1的4)的从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm 凝胶表面的间隔为1.4mm～2.0mm时，1～4周的经时变化的组织学的染色图 像(番红-O染色图像)。
图15是实施例1的4)的从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶 表面的间隔为1.4mm～2.0mm时，再生部位的2型胶原的免疫学的染色图像。
图16为表示测定试验例2的再生部位中的软骨组织细胞的II型胶原(图 A)、聚集蛋白聚糖(图B)、Sox9(图C)的mRNA量的结果的图表。柱1 和2表示正常软骨(阳性对照)，柱3和4为填充有本发明填充剂的样品，柱 5和6为在骨缺损部中没有填充任何东西的样品，柱7和8表示在骨缺损部填 充有超高分子量聚乙烯(以下表示为UHMPE)的样品。
图17表示在骨缺损部填充有比较例的聚乙烯醇凝胶的样品、在骨缺损部 填充有UHMPE的样品的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。

本发明的骨填充剂由水凝胶构成，该水凝胶具有由2个以上的具有交联网 络结构的聚合物(以下，将具有交联网络的聚合物表示为交联网络聚合物)形 成的互穿网络结构或者由交联网络聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结 构。本发明中所说的交联网络结构，例如，如国际专利申请公开WO2006/013612 的图1(本说明书作为图1引用)所示，是指由具有多个交联点的聚合物而形 成的网络结构。另外，本发明中所说的“互穿网络结构”是指2个以上的交联 网络聚合物以进入彼此的网络结构中的方式缠绕，结果在内部形成有多个网络 结构的结构或状态。例如，如图1所示，由具有多个交联点1的交联网络聚合 物A和具有多个交联点2的交联网络聚合物B构成，两交联网络聚合物进入 彼此的网络中相互物理性缠绕的结构或状态。
本发明中所说的“半互穿网络结构”，是指直链聚合物以进入交联网络聚 合物的网络中的方式缠绕在交联网络聚合物中，结果在内部形成有多个网络结 构的水凝胶的结构或状态。例如，如国际专利申请公开WO2006/013612(图2) (本说明书作为图2引用)所示，由具有多个交联点3的交联网络聚合物C 和直链聚合物D构成，直链聚合物D进入交联网络聚合物的网络中相互物理 性缠绕的水凝胶的结构或状态。
具有本发明的“互穿网络结构”的水凝胶还可以部分地进一步含有直链聚 合物缠绕而成的上述半互穿网络结构，另外，本发明的“半互穿网络结构”还 可以部分地进一步含有其它的交联网络聚合物缠绕而成的“互穿网络结构”。 即，一个水凝胶可以同时具有互穿网络结构和半互穿网络结构。
另外，虽然在图1和图2中第一网络结构A和C描绘成比第二网络结构 B和直链聚合物D粗，但这只是为了方便而改变了粗度描绘出的。另外，“互 穿网络结构”和“半互穿网络结构”的概念是，不仅是由2个聚合物形成的结 构(双网型)，也包括由三个或三个以上的聚合物形成的形态。另外，“2个以 上”意味着形成“互穿网络结构”或“半互穿网络结构”的聚合物为2个以上， 意思是：既包括作为种类不同即彼此不同的化学物质的2种以上的聚合物形成 网络结构的情况，也包括作为化学物质为相同种类的2个以上的聚合物形成网 络结构的情况。
本发明中，构成交联网络结构的2个以上的聚合物优选为，由具有能够荷 正电或负电的基团的不饱和单体形成的聚合物和由具有电中性的基团的不饱 和单体形成的聚合物的组合。作为上述的具有能够荷正电或负电的基团的不饱 和单体，适宜的为具有酸性基团(例如，羧基、磷酸基和磺酸基)、碱性基(例 如氨基)的不饱和单体，例如可以举出：2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)、 丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸或它们的盐。另外，作为具有电中性基团的不饱和 单体，例如可以举出：二甲基硅氧烷、苯乙烯(St)、丙烯酰胺(AAm)、N- 异丙基丙烯酰胺、N，N-二甲基-丙烯酰胺、乙烯基吡啶、苯乙烯、甲基丙烯酸 甲酯(MMA)、含氟不饱和单体(例如，丙烯酸三氟乙酯(TFE))、丙烯酸羟 乙酯或醋酸乙烯酯。
本发明中可利用的水凝胶的情况为，通过先使具有能够荷正电或负电的基 团的不饱和单体聚合而形成第一网络结构，然后，使该网络部分中含有具有电 中性基团的不饱和单体后，将具有电中性基团的不饱和单体聚合或聚合并交 联，从而可以形成“互穿网络结构”或“半互穿网络结构”。“互穿网络结构” 和“半互穿网络结构”中任一情况下，就交联网络聚合物的交联度来说，第一 交联网络可以在大约0.1摩尔％～20摩尔％的范围内任意设定，第二交联网络 可以在大约0摩尔％～20摩尔％的范围内任意设定。优选第一交联网络在大约 0.5摩尔％～10摩尔％的范围内任意设定，第二交联网络在大约0摩尔％～5 摩尔％的范围内任意设定。进一步优选第一交联网络在大约2摩尔％～6摩尔 ％的范围内任意设定，第二交联网络在大约0摩尔％～2摩尔的范围内任意设 定。这里，“交联度”是指交联剂的摩尔浓度与单体的投料摩尔浓度的比以百 分数表示的值。另外，“互穿网络结构”中的2个以上的交联网络聚合物的交 联度可以各自独立地设定。例如，可以设定为具有能够荷电的基团的交联网络 聚合物的交联度比具有电中性基团的交联网络聚合物的交联度大，或者反之也 可以。交联剂可以根据单体成分适宜地选择而使用。
本发明中可利用的水凝胶和其制造方法均在本发明的发明人等的发明相 关的国际专利申请公开WO2003/093337、国际专利申请公开WO2006/013612、 日本特开2006-42795、国际专利申请公开WO2006/001313、日本特开 2006/213868、进而J.P.Gong等人(Advanced Materials(先进材料)，2003年， 第15卷，第1155-1158页)等中详细公开。本发明可以利用这些现有技术中记 载的任何一种凝胶。另外，本发明的骨填充剂由于不特别需要在国际专利申请 公开WO2006/013612中公开的作为人工半月板所期望的机械强度，因此，对 于本发明的骨填充剂或其制造方法来说，不一定需要在国际专利申请公开 WO2006/013612中记载的用于提高水凝胶强度的种种条件。
本发明优选的骨填充剂是由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为原料 单体的交联网络聚合物(PAMPS)和以N，N-二甲基-丙烯酰胺(DMAA)为原 料单体的交联网络聚合物(PDMAAm)构成的、具有互穿网络结构的水凝胶 (以下称为PAMPS/PDMAAm凝胶)。该PAMPS/PDMAAm凝胶为按国际专 利申请公开WO2006/013612的实施例23中所记载的方法而制造的水凝胶。 PAMPS/PDMAAm凝胶具有以下特征：摩擦系数大约为10-3，与软骨大致相同， 6周的皮下植入试验中的物理特性几乎没有变化，另外，颗粒埋植试验中1周 后的炎症反应虽然显著高于阴性对照而显著少于阳性对照，但是4周后和6 周后，炎症反应比阴性对照少。
另外，由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为原料单体的交联网络 聚合物(PAMPS)和以丙烯酰胺形成原料单体的交联网络聚合物(PAAm)构 成的、具有互穿网络结构的水凝胶(PAMPS/PAAm凝胶)，或由以2-丙烯酰胺 -2-甲基丙烷硫酸钠(Sodium 2-acrylamido-2-methylpropanesulfate，NaAMPS)为 原料单体的交联网络聚合物(PNaAMPS)和以N，N-二甲基-丙烯酰胺(DMAA) 为原料单体的交联网络聚合物(PDMAAm)构成的、具有互穿网络结构的水 凝胶(PNaAMPS/PDMAAm凝胶)也具有和PAMPS/PDMAAm水凝胶同样的 促进软骨组织再生的功能。
本发明的骨填充剂虽然不特别要求具有人工软骨程度的强度，但是考虑到 填充到骨时的操作性或软骨组织的再生促进能力等，优选具有某种程度的强 度。例如，关于上述优选方式的PAMPS/PDMAAm凝胶和PAMPS/PAAm凝胶 的机械强度可以如下表所示。
表1
  PAMPS/PAAm凝胶   PAMPS/PDMAA凝胶   正切弹性模量(Tangent Modulus)MPa   0.3(0.05)   0.20(0.01)   断裂强度(Ultimate Stress)MPa   11.40(2.60)   3.10(0.29)   断裂变形(Strain at failure)mm/mm   0.83(0.05)   0.73(0.01)   水分含量％   90.90(0.3)   94.00(0.00)
接下来，说明有关本发明的骨填充剂的使用方法。
本发明的骨填充剂是用于以软骨组织的再生治疗为目的的外科处置中使 用的骨填充剂。该外科处置是指将位于受到损伤的软骨组织的正下方的软骨下 骨和软骨组织一起进行切削，设置具有适当深度的孔或沟(以下，称为骨缺损 部)，在其中填充本发明的骨填充剂至残存有适当深度的骨缺损部。在图13 中模式性的表示了使用本发明的骨填充剂的上述外科处置。
以往存在的治疗理念的人工软骨不是希望软骨的再生，而是将作为替代材 料的人工材料以不留有骨缺损的方式对合填充到软骨面上，但是本发明的人工 材料的使用方法与此完全不同。就通过利用本发明的骨填充剂的外科处置而进 行的软骨组织的再生治疗来说，从生物体中选取的软骨组织的移植和促进软骨 的再生的特别的体液因子的投入都不是必须的，而是通过将凝胶材料填充到软 骨下骨中来提供用于软骨组织的自然再生的生物学的和力学的环境，是促进软 骨组织的自然再生的至今为止没有先例的软骨组织的再生治疗方法。特别是用 该治疗方法，除了可以使软骨组织再生之外，还可以使软骨下骨组织再生成覆 盖住埋在骨缺损部的骨填充剂，以进一步覆盖该再生的软骨下骨组织的方式使 软骨组织再生。以往，在生物体内再生软骨组织被认为是不可能的，因此通过 利用本发明的骨填充剂不仅可以再生软骨组织，而且可以共同再生软骨下骨和 软骨组织，这是史无前例令人吃惊的结果。
使用本发明的骨填充剂的外科处置，如前所述，将位于受到损伤的软骨组 织的正下方的软骨下骨与软骨组织一起切削，设置骨缺损部，在其中填充本发 明的骨填充剂至残存有适当深度的骨缺损部。在该外科处置中，优选调节水凝 胶的填充量使残存有从骨缺损部周围的软骨组织的关节面(与软骨下骨接触的 面的相反侧的面，简称为关节面)到朝向该关节面侧的水凝胶的表面(以下简 单表示为水凝胶表面)的间隔。例如，就实施例中所示的日本白色家兔来说， 从骨缺损面的关节面到水凝胶表面的间隔希望为5mm以下，优选为0.7mm～ 2.8mm，进一步优选为0.7mm～2.1mm。优选根据作为对象的生物种类或软骨 部位周围的力学环境来适宜地调整该间隔。
另外，本发明的骨填充剂在填充到骨中这样的使用方式中，对于生物体是 无毒的，在软骨组织或软骨组织和软骨下骨组织再生后，不一定非要从骨缺损 部中除去。因此，接受用本发明的骨填充剂的外科处置的患者，由于只要接受 一次设置骨缺损部来填充骨填充剂这样的处置就可以了，因此与需要多次处置 的以往的治疗方法相比，可以减轻患者的负担。
像这样，本发明的骨填充剂通过如上所述埋入骨缺损部中，可以诱导软骨 下骨组织、软骨组织的再生，因此，本发明也是一种意图将上述水凝胶作为软 骨和/或软骨组织再生诱导剂，或软骨和/或软骨组织再生促进剂来利用的发明。
以下，例示本发明的骨填充剂的制造例和使用例，进一步详细地说明本发 明，但是这些例子不能限定性地解释本发明。
实施例
实施例1
准备纵80mm×横80mm×厚5mm，宽度为5mm的硅板框，在板框的一边 上由框的外侧向内侧挖一个3mm的沟。将该硅板框夹在2张纵100mm×横 100mm×厚3mm的玻璃板中，装配成重合容器。
混合25mL的2mol/L的2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)水溶液、1mL 的作为交联剂的2mol/L的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)水溶液、0.5mL 的0.1mol/L的2-氧代戊二酸水溶液和水，调制成50mL的水溶液。从上述重 合容器的沟流入用氮气脱氧的水溶液，密封沟部分后，用波长为365nm的UV 灯(22W，0.34A)在常温下照射6小时的紫外线使其聚合，从而制成交联度 为4mol％的PAMPS凝胶(第一网络结构)。
然后，混合100mL的6mol/L的N，N-二甲基-丙烯酰胺(DMAA)水溶液、 2mL的0.1mol/L的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)水溶液、2mL的0.1mol/L 的过硫酸钾水溶液和水，制成200mL的水溶液(浸渍溶液)。该浸渍溶液用氮 气进行30分钟的脱氧。
将从重合容器中取出的上述PAMPS凝胶浸泡在移入适当盆中的浸渍溶液 中，在4℃冰箱中一边不时轻轻振荡，一边放置2天，使上述浸渍溶液在所述 PAMPS凝胶中扩散·浸透。
然后，从所述浸渍液中取出凝胶，裁剪成适当大小后，在不混入气泡的状 态下将该凝胶夹持在纵100mm×横100mm×厚3mm的两张玻璃板之间。通过 密封该2张玻璃板周围的4边后，在60℃的水浴中进行6小时的DMAA聚合， 从而制成作为双网型水凝胶的骨填充剂(PAMPS/PDMAAm凝胶)。
试验例1
使用实施例中制造的本发明的骨填充剂，如下所述进行用于软骨组织再生 的外科处置。
在成熟的日本白色家兔(3.0～4.2kg，20只)的两膝大腿骨/膝盖骨关节的 大腿骨侧，垂直地制作直径为4.3mm×9.0mm的骨缺损部，在右膝的骨缺损中 通过嵌压填充实施例中制造的PAMPS/PDMAAm凝胶(直径4.5mm×9.0mm)。 这时，调节从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为0.0～ 5.0mm来填充PAMPS/PDMAAm凝胶。这里，间隔0.0mm是指以关节面和 PAMPS/PDMAAm凝胶表面一致的方式填充有PAMPS/PDMAAm凝胶的状态 或处置组，间隔5.0mm是指以在关节面和PAMPS/PDMAAm凝胶表面之间设 置5.0mm的缝隙的方式填充有PAMPS/PDMAAm凝胶的状态或处置组。
手术后在笼内饲养4周后将其杀死，用肉眼观察膝关节后，分别对左右膝 进行组织学(番红-O染色，广谷等人，临床整形外科，1976，第11卷，第12 号，40-44页)的评价。在进行组织学的评价时，大腿骨以通过圆形损伤部位 中心的矢状面做切片，膝盖骨以正中矢状面做切片。另外，从骨缺损部的关节 面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔(mm)的测定，是对填充有 PAMPS/PDMAAm凝胶的中心部、以及与夹持该中心部而相对的位置的水凝胶 的两个端点共计三个点进行的，该实际测定值的平均作为从骨缺损部的关节面 到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔。另外，在成熟的日本白色家兔(3.0～ 4.2kg，20只)的两膝大腿骨/膝盖骨的大腿骨侧，垂直地制作骨缺损部(直径 为4.3mm，深度随机设定为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm)，然后在不填充 任何东西的状态下，在笼内饲养4周后作为无处置对照组。
其结果为，无处置对照组在任何深度的骨缺损部中，几乎所有膝盖的骨缺 损部都填充有新生骨，但是该表层在存在有高低差的状态下被纤维组织覆盖， 完全没有发现软骨组织。在几个膝盖中虽然新生骨的表层的纤维组织和纤维软 骨样组织混合存在，但是在这些膝盖上没有发现透明软骨的再生。
与此相对，在骨缺损部填充有实施例中制造的PAMPS/PDMAAm凝胶的 组中，根据关节面和PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔观察到如下的结果。
1)间隔为0.0mm时(图3)
在骨缺损部周围，与无处置对照组相比没有观察到特别的变化，也没有观 察到关节浮肿。骨缺损部被PAMPS/PDMAAm凝胶填充，与填充时没有变化。 在PAMPS/PDMAAm凝胶和骨缺损部的交界部确认围绕有由新生骨而成的骨 壁，在其中一部分中确认有软骨组织的再生。
2)间隔为0.0mm～0.6mm时(图4)
PAMPS/PDMAAm凝胶表面覆盖有薄的纤维组织，另外，在 PAMPS/PDMAAm凝胶和骨缺损部的交界部确认有软骨样组织。
3)间隔为0.7～1.3mm时(图5)
设置在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上的间隔完全被再生的软骨组织埋住。 该再生的软骨组织被番红-O很好地染色。软骨细胞存在与PAMPS/PDMAAm 凝胶表面近的部分致密，与关节面近的部分疏松，显示与正常软骨接近的分布。 另外，在再生的软骨组织的最表层确认有菲薄的光亮层(Lamina Splendensde) 样结构。
4)间隔为1.4mm～2.0mm时(图6)
与3)同样地，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上设置的间隔完全被软骨组 织埋住。进而，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面和再生的软骨组织之间确认有 软骨下骨的骨新生。
5)间隔为2.1mm～2.8mm时(图7)
确认有在PAMPS/PDMAAm凝胶表面的软骨下骨的骨新生，以及在其上 的软骨组织的再生。并且，在与再生的软骨组织的关节面近的部位，确认有混 合存在有纤维组织和软骨组织的软骨样组织的再生。在该软骨样组织内分散存 在有新生骨。
6)间隔大于2.8mm时(图8)
与无处置对照组类似的结果，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上设置的间 隔中填充有新生骨，其表面部在残存有高低差的状态下被纤维组织覆盖，没有 发现软骨组织的再生。在几个膝盖中虽然发现在新生骨的表面混合存在有纤维 组织和纤维软骨样组织，但是没有确认出软骨细胞的排列结构，还发现了纤维 软骨样组织内部骨化的膝盖。
试验例2
对试验例1的4)的间隔为1.4mm～2.0mm的样品反复进行实验，通过番 红-O染色来确认每周的软骨组织再生的状态。
试验例3
参考Kumagai等人的方法(Kumagai等人，J.Anat.，1994年，第185卷，第 279-284页)确认出试验例2样品的再生部位中2型胶原的出现。具体为，切 片用蛋白酶K(Proteinase K)在室温下进行6分钟的处理后，用PBS洗净， 1％的过氧化氢/甲醇中浸渍30分钟。用PBS洗净后，使用稀释50倍的一次抗 体(小鼠抗人II型胶原抗体，富士药品工业)在室温下孵育60分钟。用PBS 再次洗净后，使用二次抗体(抗小鼠IgG抗体，Envision)在室温下孵育30 分钟。然后，用DAB DAKO(DAB显色试剂盒)使其生色，最后用苏木精将 核染色。其染色图像表示在图15中。
试验例4
从试验例2的再生部位和对照试验后的处置周围部位回收组织，使用瑞博 普试剂盒(RiboPure Kit)(Ambion公司)提取RNA。相对于1μg的RNA，用 PrimeScript RTTM反应试剂盒(Reagent Kit)(宝生物工程有限公司(TAKARA)) 进行反转录反应，合成单链的cDNA。进而，对于已知作为软骨细胞的标志的 II型胶原、聚集蛋白聚糖、Sox9，使用基于编码各自的蛋白质的核酸的碱基序 列信息而设计的引物DNA，使用SYBR(注册商标)Premi×Ex×Taq(宝生物 工程有限公司)在梯度PCR扩增仪Thermal Cycler Dice(注册商标)TP800(宝 生物工程有限公司)中进行实时聚合酶链反应(95℃5秒和60℃30秒进行40 个循环)，用扩增仪软件(Thermal Cycler Dice Real Time System Software)来 解析这3种类型的蛋白质的mRNA量。就引物DNA的碱基序列来说，聚集蛋 白聚糖为GCTACGACGCCATCTGCTAC(正向)， GTCTGGACCGTGATGTCCTC(反向)，II型胶原为 GACCATCAATGGCGGCTTC(正向)，CACGCTGTTCTTGCAGTGGTAG(反 向)，Sox9为AACGCCGAGCTCAGCAAGA(正向)， TGGTACTTGTAGTCCGGGTGGTC(反向)。
其结果示于图16中。在发现了软骨组织再生的组织中，确认有上述三种 标志蛋白质的mRNA的出现。而另一个方面，对照组中几乎没有发现任何标 志蛋白质的出现。
实施例2
除了将实施例1的6mol/L的N，N-二甲基-丙烯酰胺(DMAA)变成同摩尔 的丙烯酰胺(AAm)之外，在完全相同的条件下进行操作，制成作为双网型 水凝胶的骨填充剂(PAMPS/PAAm凝胶)。
试验例5
使用实施例2中制造的本发明的骨填充剂，用与试验例1所述的同样的方 法进行用于软骨组织再生的外科处置。在骨缺损部中填充有实施例2中制造的 PAMPS/PDMAAm凝胶的组中，根据关节面和PAMPS/PAAm凝胶表面的间隔 观察到如下的结果。
1)间隔为0.0mm～0.6mm时
没有发现软骨组织的再生。
2)间隔为0.7mm～1.3mm时(图9)
在设置在PAMPS/PAAm凝胶表面上的间隔发现了局部的软骨组织的再 生。
3)间隔为1.4～2.0mm时(图10)
在骨表面的附近存在少量的软骨再生组织。
4)间隔为2.1mm～2.8mm时(图11)
虽然在PAMPS/PAAm凝胶表面发现了被认为是脂肪变性样坏死的组织图 像，但是在与关节面接近的部位发现了与关节面平行的软骨样组织的再生。
5)间隔比2.8mm大时(图12)
虽然在PAMPS/PAAm凝胶表面发现了被认为是脂肪变性样坏死的组织图 像，但是在与关节面接近的部位发现了与关节面平行的软骨样组织的再生。
比较例
在与试验例1同样的条件下，对于骨缺损部填充有替代本发明的骨填充剂 的聚乙烯醇凝胶的样品和骨缺损部填充有用作为人工关节材料的超高分子量 聚乙烯(UHMPE)的样品，都没有观察到软骨组织的再生(图17)。