产生组织的方法和装置以及所获得的组织
阅读：1015发布：2020-08-24
专利汇可以提供产生组织的方法和装置以及所获得的组织专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及组织产生、再生、重建、加固和/或复壮领域。更确切地，本发明涉及使特定组织再生的方法，所述组织优选间充质组织如骨、脂肪、 腱 、肌肉、软骨和骨髓基质以及血液学组织(RBC、WBC、血小板、淋巴细胞、血液干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)等)。本发明还涉及在 哺乳动物 对象优选人患者中使用通过本发明方法获得的(再生)组织重建、再生、复壮或加固受损或患病组织的方法。，下面是产生组织的方法和装置以及所获得的组织专利的具体信息内容。
1.作为药物的富血小板血浆(PRP)和凝血因子。
2.根据权利要求1的药物，其为非凝固(可溶性)混合物。
3.PRP和凝血因子在制备用于富集干细胞群的药物中的用途，所述干细胞群优选哺乳动物对象的内皮祖细胞和/或间充质干细胞的群。
4.PRP和凝血因子在制备用于治疗和/或预防心血管疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4的用途，其中所述心血管疾病选自(退行性)心肌病、(先天性)心脏病、冠状动脉病、局部缺血、舒张功能不全、动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎和/或心肌梗死。
6.PRP和凝血因子在制备用于治疗和/或预防神经疾病的药物中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中所述神经疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、泰-萨病、脊髓损伤、中风、脑血管意外和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
8.PRP和凝血因子在制备用于治疗和/或预防自体免疫性疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述自体免疫性疾病选自再生障碍性贫血、多发性硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征、I型糖尿病、突眼性甲状腺肿和/或红斑狼疮。
10.PRP和凝血因子在制备用于治疗和/或预防骨退行性疾病的药物中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述骨退行性疾病选自骨萎缩、骨质疏松症、骨重建和骨加固。
12.根据前述权利要求3至11中任一项的用途，其中所述药物为可溶性混合物的形式。
13.根据前述权利要求3至12中任一项的用途，其中将所述富血小板血浆和所述凝血因子注射到哺乳动物对象的骨髓和/或脂肪性组织中，优选地注射到所述哺乳动物对象的髂嵴或胸骨的骨髓中。
14.根据前述权利要求3至13中任一项的用途，其中所述哺乳动物对象为人患者。
15.根据前述权利要求中任一项的药物，其中所述凝血因子选自：(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf或人组织因子)、因子Xa、因子VIIa、因子X、因子VII或其混合物。
16.成套部件，其包含：
-离心设备，其用于从哺乳动物对象(优选人患者)的血浆中获得自体PRP和可能的自体凝血酶；
-一种或多种哺乳动物(优选人)的活化化合物，或者包含所述化合物的流体，其可能存在于小瓶中，
-注射装置，其用于注射自体PRP和MSC活化化合物或者包含所述化合物的流体，和-可能地，收集装置，其从血液样品或骨髓液样品中收集干细胞。
17.根据权利要求16的成套部件，其中所述活化化合物选自：
-有效量的促凝血酶原激酶(组织因子或Tf)，优选地重组促凝血酶原激酶(重组组织因子或rTf)，优选地人组织因子(hTf)，更优选地重组人组织因子(rhTf)，更优选地重组可溶性人组织因子(rshTf)，更优选地，添加了磷脂，更具体地，添加了磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，或者
-有效量的人因子VII，
-有效量的人因子X，
-有效量的组织因子-因子VIIa，
-有效量的组织因子Xa，
-有效量的组织因子-因子VIIa-因子Xa，
-有效量的因子VIII，
-有效量的因子IX，或者
-上述因子的组合，其中所述因子是活化的或未活化的。
18.骨髓样品，其包含富含经活化MSC的群体。
19.根据权利要求18的骨髓样品，其中所述MSC形成集落的能力得到提高。
20.根据权利要求18或19的骨髓，其中所述MSC形成集落的能力提高了至少约30％和/或其中当培养所述骨髓样品的1,000,000个单个核细胞时，获得至少13个集落(CFU-F)。
21.凝血因子，其用作富集哺乳动物对象干细胞群的药物。
22.凝血因子，其用作治疗和/或预防心血管疾病的药物。
23.凝血因子，其用作治疗和/或预防哺乳动物对象神经疾病的药物。
24.凝血因子，其用作治疗和/或预防自身免疫性疾病的药物。
25.凝血因子，其用作治疗和/或预防癌症和/或传染性疾病的药物。
26.根据前述权利要求21至25中任一项的药物，其中所述凝血因子选自组织因子(Tf)、因子Xa、因子VIIa或其混合物。
27.根据前述权利要求21至25中任一项的药物，其中所述凝血因子是可溶性人组织因子。
28.使用足够量的PRP和凝血因子进行非人胚胎干细胞体外培养的方法，优选地所述凝血因子选自(可溶性)促凝血酶原激酶(人组织因子(hTf))、因子Xa、因子VIIa或其混合物。
29.获得富含经活化MSC的细胞群体的方法，其包括从经活化骨髓中获得样品的步骤。
30.根据权利要求29的方法，其中所述骨髓是(先前)通过添加PRP和凝血因子活化的。
31.根据权利要求29或30的方法，其还包括富集骨髓样品中存在的干细胞的步骤。
32.根据权利要求31的方法，其中通过将骨髓样品离心和回收中间级分来进行干细胞的富集。
33.根据前述权利要求29至32中任一项的方法，其中所述MSC形成集落的能力得到提高。
34.根据权利要求32或33的方法，其中所述MSC形成集落的能力提高了至少约30％和/或其中当培养从经活化骨髓所获得的样品的1,000,000个单个核细胞时，获得至少13个集落。
35.用于获得非胚胎人干细胞和可能地用于使组织(优选人患者组织)或细胞再生的方法，其包括以下步骤：
b)从哺乳动物对象收集血液样品；
c)从所述血浆制备自体PRP；
d)通过添加哺乳动物(优选人)活化成分来活化所述自体PRP，所述活化成分选自：
-有效量的凝血酶，
-有效量的促凝血酶原激酶，或
-有效量的CaCl2，
-有效量的因子VII，
-有效量的因子X，
-有效量的组织因子和因子VIIa，
-有效量的因子Xa，
-有效量的组织因子、因子VIIa和因子Xa，
-有效量的因子VIII，
-有效量的因子IX，或者
-上述因子的组合；
从而获得含有浓缩的经活化自体富血小板血浆的第一流体；
e)在同一哺乳动物对象中选择富含非胚胎干细胞的目标注射区；
f)将所述第一流体注射到所述哺乳动物对象的所述目标注射区，从而在所述哺乳动物对象中局部诱导干细胞体内增殖；
g)可能地，在足够的孵育时间后，从同一哺乳动物对象中收集富含细胞的血液样品和+ +
/或骨髓样品并回收所获得的干细胞，优选非胚胎人CD34CD31 干细胞，可能地，将步骤a)至步骤e)或步骤a)至步骤f)重复数次；
h)可能地，收集第二血液流体样品；
i)可能地，从所述第二血液样品制备第二自体PRP；
j)可能地，通过活化成分来活化所述自体PRP，所述活化成分选自：
-有效量的凝血酶，
-有效量的促凝血酶原激酶，或
-有效量的CaCl2，
-有效量的因子VII，
-有效量的因子X，
-有效量的组织因子和因子VIIa，
-有效量的组织因子和因子Xa，
-有效量的组织因子、因子VIIa和因子Xa，
-有效量的因子VIII，
-有效量的因子IX，或者
-上述因子的组合；
从而获得含有浓缩的经活化自体富血小板血浆的第一流体；
k)可能地，将所述第二流体与先前收集的所述血液或骨髓流体样品混合，从而获得包含经活化浓缩的自体PRP和MSC的组合物；
l)可能地，将分化辅剂添加到所述干细胞中，优选地添加到包含经活化浓缩的自体PRP和MSC的组合物中，其中所述辅剂包括用于细胞锚定的至少一种基质以及优选地其他成分，所述其他成分选自：维生素、可的松或可的松衍生物(地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、曲安西龙、倍他米松)和/或β-甘油磷酸酯，从而诱导干细胞向分化(骨)组织细胞的分化并且可能地获得组织再生，以及，
m)可能地，向包含经活化浓缩的自体PRP和干细胞的所述组合物中添加能够形成凝胶组合物的适当胶凝剂，和
n)可能地，将因此所获得的凝胶组合物应用到所述哺乳动物(优选人患者)的目标组织重建部位中/上，使得可在所述重建部位发生组织重建。
36.根据权利要求35的方法，其中所述孵育时间在3天至3个月之间，优选地在15天至1月之间，更优选地为3周。
37.根据前述权利要求35或36中任一项的方法，其中所述PRP所包含的血小板浓度在
600,000个血小板/微升至8,000,000个血小板/微升之间。
38.用于组织重建的凝胶组合物，其有可能通过根据前述权利要求28至37中任一项的方法获得，其包含通过足够量的促凝血酶原激酶活化的浓缩自体PRP、非人胚胎干细胞和至少一种适当的胶凝剂以及可能的辅剂，所述辅剂选自：维生素、可的松、可的松衍生物(地塞米松)或其混合物。
39.提高(优选提高至少50％)来自哺乳动物对象的细胞因子之血液浓度的方法，其包括在所述哺乳动物对象中注射PRP和凝血因子的步骤。
40.根据权利要求39的方法，其中将所述PRP和凝血因子注射到骨髓中，优选地注射到哺乳动物对象髂嵴的骨髓中。
41.根据权利要求39或40的方法，其中所述细胞因子为2、3或4种不同的细胞因子，其选自：FGF-2、VEGF、Rantes和BDNF。
42.根据前述权利要求39至41中任一项的方法，其中FGF-2、VEGF、Rantes和BDNF以外的其他细胞因子不受影响。
43.根据权利要求42的方法，其中所述细胞因子选自：IGF-1、SDF-1α、MIP-1α和PDGF或其混合物。
产生组织的方法和装置以及所获得的组织
技术领域
[0001] 本发明涉及组织产生(再生、重建、加固(reinforcement)和/或复壮(rejuvenation))领域。
[0002] 更确切地，本发明涉及使特定组织或细胞再生的方法和装置(产品和设备)，所述组织或细胞优选间充质组织如骨、脂肪、腱、肌肉、软骨和骨髓基质以及血液学组织或细胞(RBC、WBC、血小板、淋巴细胞、血液干细胞(hematological stem cell，HSC)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)等。)。
背景技术
[0004] 对于重建受损或患病组织说，具体地，对骨来说，存在不同的技术。细胞介导的再生技术是其中之一。
[0005] 间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)或HSC对应于在被称为“间充质”的骨髓基质中存在的并且还在脂肪组织中存在的干细胞。
[0006] MSC和HSC可以在离体培养中扩增以获得适当数目的细胞。然而，为了获得足够量的干细胞，需要收集大量的骨髓和长时间的培养。干细胞的体外培养改变了它们的增殖能力并且降低了它们的分化潜能。这些细胞表现出分化和增殖的多能性，并且通过使用适当的细胞因子和生长因子以及包括EPC在内的血细胞，可以使它们分化成多种细胞类型，如肌肉、脉管系统、神经元组织、肝、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、成角化细胞(keratinoblast)和成纤维细胞。
[0007] 已经从逻辑上提议在细胞介导的再生技术中使用这些MSC。
[0008] 此外，众所周知的是衰老改变了干细胞性能和它们的分化能力。
[0009] 实践中，在骨再生方法中，从患者中提取MSC，使用适当的骨生长因子使其体外增殖并分化成成骨细胞。因此，产生了骨组织，然后在重建方法中将其用作植入物移植给患者。心脏病发作后，对患者局部麻醉以收集大量骨髓样品，其全部或部分地或在细胞分选后被再注射。在癌症疗法中，在将它们再注射给患者之前，可以分离并刺激干细胞，并且可能地，进行离体转染。作为用于治疗白血病之移植的辅剂，将大量异源MSC与供体骨髓一起注射。
[0010] 对富血小板血浆(platelet-rich plasma缩写为“PRP”)在组织再生和组织重建中潜在用途的研究已经开始。
[0011] 已证明PRP能够引起基质干细胞的体外增殖(Lucarelli E.等人，Biomaterials24(2003)，3095-3100页)。
[0012] 最近的科学研究还提供了涉及与MSC一起用作移植材料的富血小板血浆(缩写为“PRP”)在骨重建中有益作用的首次结果(Kitoh H.等人，Clin.Oral Implants Res.，第15卷，第5期(2004)，589-597页；Yamada Y等人，J.Biomed.Mater.Res.，第68A卷，第4期(2004)，747-755页)。
[0013] 然而，目前的使用MSC-HSC以及HSC细胞的组织再生方法存在一些缺点。具体来说，使用这些方法和细胞难以赋予所产生的骨组织以适当的形状。还难以获得具有能够耐受移植的足够机械强度的骨组织。此外，用于获得足够量骨组织的体外培养是非常耗时的。
发明内容
[0014] 本发明提供了改进和替代性方法和装置，其用于获得和/或诱导(非人胚胎)干细胞(优选MSC和EPC并且可能地不包括HSC)增殖和用于“产生”(再生、重建、加固和/或复壮)哺乳动物组织或细胞，所述方法和装置不存在现有技术的缺点。
[0015] 优选地，MSC定义为(在它们的细胞表面)表达1、2或(优选地)3种阳性标志物，所述标志物选自CD105、CD73、CD90；并且(在它们的细胞表面)缺少1、2、3、4或(优选地)5种标志物的表达，所述标志物选自CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR。
[0016] 作为替代地(或补充地)，当维持在标准培养条件下时，MSC是塑料粘附细胞。
[0017] 作为替代地(或补充地)，MSC能够体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和/或软骨细胞。
[0018] 优选地，EPC定义为(在它们的细胞表面)表达CD133和CD34两者，并且优选地还表达CD31和/或CD144，但是可能地不表达CD45。
[0019] 作为替代地(或补充地)，以体外形成集落的能力来定义EPC，其中优选地，集落定义为在外周具有更长的萌发细胞的圆形细胞的中央核心。
[0020] 作为替代地(或补充地)，以VEGF存在之下在基质胶测定(matrigel assay)中铺板时其血管生成性质来定义EPC。
[0021] 优选地，HSC定义为表达CD34和CD45标志物。
[0023] 本发明还提出了改善和简化的方法和装置，其可以不需要对老年患者或患有心脏病或损伤的患者来说特别有害的任何全身麻醉。
[0024] 有利地，本发明所述的产品、方法和装置用于使组织或细胞再生。
[0025] 具体地，本发明提供了使得能够获得对(骨)重建来说具有满意的结构和物理特性的新(骨)组织的方法和装置。这些物理特性即包括形状、机械强度和弹性。生物特性即包括在一些成熟组织(如骨、皮肤、脂肪或肌肉)中具有高增殖、定型和分化潜能的未成熟细胞的高比率和浓度。
[0026] 本发明还提供了治疗心脏病的方法和装置，其通过在骨髓中诱导高浓度的未成熟干细胞(包括MSC并且可能包括EPC(可能不包括HSC))和/或通过在血液中诱导高浓度的EPC细胞来动员干细胞。
[0028] 本发明还提供了简化的方法和装置，其将降低或减少体外培养时间并减少所需的收获骨髓的量。
[0029] 本发明涉及用于获得干细胞(优选MSC-EPC，可能地不包括HSC)以及可能地用于哺乳动物对象组织或细胞(优选人患者的组织或细胞)的再生、重建、加固和/或复壮的方法和装置，该方法包括以下步骤：
[0030] a)从该哺乳动物对象(优选人患者)中收集(流体)血液样品；
[0031] b)从该(流体)血浆样品制备自体PRP，其中PRP的血小板率的浓度优选地在该哺乳动物对象(优选人患者)的全血的约100％至约1000％之间，更优选地，在约200％至约500％之间；
[0032] c)用有效量的(活性)哺乳动物(优选人)化合物活化该自体PRP，所述化合物选自：
[0033] -凝血酶(异源、自体或者重组人或牛凝血酶)，其包括重组凝血酶(FII)(活化或未活化的)。
[0034] -能够产生凝血酶的化合物(凝血因子)，尤其是促 凝血酶原激酶(thromboplastin)(组织因子)，优选地重组促凝血酶原激酶(recombinant
thromboplastin，rTF)，更优选地人组织因子(hTF)，更优选地重组人组织因子(rhTF)，更具体地为重组可溶性人组织因子(rshTF)，其可能与加入磷脂(phospholipid，PL)相组合，所述磷脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，
thromboplastin，rTF)，更优选地人组织因子(hTF)，更优选地重组人组织因子(rhTF)，更具体地为重组可溶性人组织因子(rshTF)，其可能与加入磷脂(phospholipid，PL)相组合，所述磷脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，
[0035] -CaCl2，
[0036] -(重组)人因子VII或因子VIIa(如化合物NOVOSEVEN )，
[0037] -(重组)人因子X(a)，
[0038] -(重组)组织因子和(重组)因子VII或(重组)因子VIIa，
[0039] -(重组)组织因子和因子Xa，
[0040] -(重组)组织因子/因子-VIIa/因子Xa，
[0041] -(重组)因子VIII；
[0042] -(重组)因子IX，或
[0043] -上述化合物的组合；
[0044] 从而获得第一流体(溶液)，其含有浓缩的经活化自体富血小板血浆；
[0045] d)在同一哺乳动物对象(优选同一人患者)中选择富含非胚胎(优选MSC、EPC)干细胞(优选胸骨或髂嵴(sternum or iliac crest)的骨髓)或脂肪组织的目标注射区；
[0046] e)将该第一流体(溶液)注射进哺乳动物对象(优选人患者)的该目标注射区，从而在该哺乳动物对象(优选该人患者)中局部诱导干细胞(优选MSC-EPC)的体内增殖；
[0047] f)(可能地)在足够的孵育时间后，从同一哺乳动物对象(优选同一人患者)中该目标注射区收集富含(MSC、EPC)细胞的骨髓(流体)样品，或者从该哺乳动物收集血液(流体)样品，或者从该哺乳动物收集脂肪样品，以及从该样品中回收干细胞；
[0048] 可能地，以确定的时间间隔(优选每星期)将步骤a)至步骤e)或步骤a)至步骤f)重复数次，优选重复至少2次、3次或4次；
[0049] g)可能地，收集第二血液(流体)样品；
[0050] h)可能地，从该第二血液(流体)样品制备第二自体富血小板血浆；
[0051] i)可能地，通过添加有效量的步骤c)中所添加的上述活化化合物来活化该自体富血小板血浆，从而从该第二血液(流体)样品中获得含有浓缩的经活化自体富血小板血浆的第二流体(溶液)；
[0052] j)可能地，将该第二流体(溶液)与富含干细胞的并且先前已收集的骨髓或血液(流体)或脂肪样品混合，从而获得包含浓缩的经活化自体富血小板血浆和干细胞的组合物；
[0053] k)可能地，将分化辅剂添加到这些干细胞中，优选地添加到所述组合物(包含浓缩的经活化自体PRP和干细胞)中，其中这些辅剂包含在步骤c)中使用的上述活化化合物和/或用于细胞锚定的至少一种基质和用于获得(诱导)干细胞向特定细胞分化的一种或多种成分，所述特定细胞如成骨类细胞(骨细胞、成骨细胞，……)、肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、肝细胞或成纤维细胞和角化细胞，其中这些成分优选地选自维生素(维生素C(L-抗坏血酸)、维生素D3(1,25(OH)2D3维生素)、可的松(或可的松衍生物，如地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、曲安西龙、倍他米松)和可能的β-甘油磷酸酯(这些成分优选地存在于聚DL-乳酸共聚乙醇酸(poly DL-lactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚乙醇酸和/或聚L-乳酸(poly-L-lactic acid，PLLA)、海藻酸盐支架(如微珠)中，从而使得所述成分能够缓慢释放)和/或BMP2(可能地，得自MEDTRONICS)，或表皮生长因子，或神经生长因子，或本领域技术人员所知的任何其它细胞因子、生长或分化因子，从而诱导(MSC、EPC，可能不包括HSC)干细胞分化为“预定”已分化组织细胞并且可能地获得所需组织的再生，和
[0054] l)可能地，向包含浓缩的经活化自体富血小板血浆和干细胞的组合物中添加适当的胶凝剂(该胶凝剂优选地得自步骤c)中添加的足够量活化化合物)以获得凝胶，和
[0055] m)可能地，将所获得的凝胶用作植入物，其通过可能地将因此所获得的凝胶应用到哺乳动物对象(优选人患者)目标重建部位(如自体收获的骨、同种异体移植物、异源移植物或胶原叶(collagen leaf))中/上实现，使得可在该重建部位发生组织重建。
[0056] 可以以确定的时间间隔(优选每星期)将步骤a)至m)重复数次(优选至少2、3或4次)，从而获得足够量的干细胞。
[0057] 本发明还涉及用于获得富含经活化MSC的(单个核)细胞(MSC)群体的方法，其包括以下步骤：
[0058] -任选地，活化骨髓干细胞，优选地通过本发明的方法和/或通过添加PRP和凝血因子实现；
[0059] -获得经活化骨髓样品；
[0060] -任选地，富集该样品的干细胞。
[0061] 优选地，在用于获得富含经活化MSC的(单个核)细胞(MSC)群体的该方法中，(当体外生长时)这些MSC形成集落的能力得到提高，更优选地，提高至少约30％(至少约50％，更优选地提高至少约100％)。
[0062] 有利地或另外地，在用于获得富含经活化MSC的(单个核)细胞(MSC)群体的该方法中，体外培养从来自该经活化骨髓的样品中获得的1000000个单个核细胞后，形成至少约13个(更优选地至少约15个，更优选地至少约20个)集落(CFU-F)。
[0063] 有利地或另外地，在用于获得富含经活化MSC的(单个核)细胞(MSC)群体的该方法中，(体外)培养MSC后形成的集落(CFU-F)中至少约35％(更优选地至少约40％，更优选地至少约50％)表达成骨标志物(如碱性磷酸酶)。
[0064] 优选地，在用于获得富含经活化MSC的(单个核)细胞(MSC)群体的该方法中，干细胞的富集是通过骨髓样品的离心(得到流体上清，富含非MSC细胞和碎片的沉淀以及富含(经活化)MSC细胞的中间级分)以及通过回收该中间级分进行的。
[0065] 本发明的另一个方面涉及骨髓样品，其包含(增加的)经活化MSC群体，其中(当体外生长时)优选地该(经活化)MSC形成集落(CFU-F)的能力提高，更优选地提高至少约30％(更优选地提高至少约50％，更优选地提高至少约100％)。
[0066] 有利地(或另外地)，在包含(增加的)经活化MSC群体的该骨髓样品中，体外培养从该样品(优选地，得自该经活化骨髓)获得的1000000个单个核细胞后，形成至少约13个(至少约15个，更优选地至少约20个)集落(CFU-F)。
[0067] 有利地(或另外地)，在富含经活化MSC群体的该骨髓样品中，MSC培养所形成的集落(CFU-F)中至少35％(更优选地至少约40％，更优选地至少约50％)表达成骨标志物(如碱性磷酸酶)。
[0068] 可能地，在获得富含经活化MSC的MSC群体的该方法中和/或在富含经活化MSC的该骨髓样品中，EPC的(相对)含量未提高和/或HSC的含量降低。
[0069] 有利地，将通过本发明方法获得的MSC细胞注射到哺乳动物对象(优选人患者)中，优选地在靠近(或位于)再生部位处，或者作为替代地，通过血液输注进行。
[0070] 根据本发明的方法可用于再生受损或患病组织或者用于回收特定干细胞，以用作表征毒性化合物作用的筛选细胞或者储存(在库中)备用，其是自体或异源的。
[0071] 根据本发明，术语“组织再生”表示从干细胞再生出新组织，术语“重建”或“加固”定义为将该获得的再生组织移植或整合到哺乳动物对象(优选人患者)中，其中需要组织修复或组织生长刺激。由于损伤、疾病或衰弱(衰老状态)影响患者组织或影响患者的一般全身健康状况，因此可能需要组织修复或刺激。在以下情况下特别需要组织再生：癌、心肌病、先天性心脏病、冠状动脉病、局部缺血、舒张功能不全、心内膜炎、心肌梗死、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、泰-萨病(Tay-Sachs disease)、脊髓损伤、中风、脑血管意外(cerebrovascular accident)、再生障碍性贫血、多发性硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征(Sjorgen syndrome)、I型糖尿病、突眼性甲状腺肿(Graves’disease)、红斑狼疮、骨重建、骨萎缩、骨质疏松症和骨加固以及可能的动脉粥样硬化和心肌炎。
[0072] 因此，术语“重建部位”表示出于修复或加固的目的需要组织重建的哺乳动物内部的特定组织部位。
[0073] 根据本发明，“富血小板血浆(PRP)”表示流体(溶液)，其中血小板浓度相对于所治疗的哺乳动物对象(人患者)的基线静脉计数提高了至少约100％，优选地在约200％至1000％之间，并且血小板浓度达到至少600,000个(每微升：μL)、至少800,000个/μl或至少1,000,000个血小板/μL，优选地在约800,000个/μL(或约1,500,000个血小板)至约6,000,000个/μL(或约8,000,000个血小板)之间，更优选地在约2,000,000个血小板/μL至约5,000,000个血小板/μL之间。有利地，使用离心设备获得PRP，如文献US
6719901、WO02/080991、US 6855119、WO03/106040、WO00/61256和WO2004/024198中所述的设备。
6719901、WO02/080991、US 6855119、WO03/106040、WO00/61256和WO2004/024198中所述的设备。
[0074] 在Graziani F.等人，Clinical oral implant research，第17卷，第2期，212-219页(2006)中测试了不同PRP浓度对细胞增殖的影响。似乎在2.5倍浓度下实现了最大影响，更高的浓度则导致细胞增殖减少。在约72小时，鉴定出PRP对细胞增殖的影响最显著。该血小板浓度为可以获得的最大浓度的约一半。然而，对于一些细胞增殖来说，更高的PRP浓度可以是优选的。
[0075] 凝血酶可以有利地为自体、异源或重组凝血酶，优选地为重组凝血酶，如ZYMOGENETICS公司所生产的凝血酶(www.zgi.com)。
[0076] 优选地将约10至约200单位的(重组、牛或自体)凝血酶，更优选地约10至约75单位的(重组)凝血酶添加到6至20ml抗凝血(失活的)PRP中。
[0077] 因此，为了诱导非常缓慢的PRP凝固，将约0.5单位/毫升至约33单位/毫升，优选地约0.5单位/毫升至约3.75单位/毫升，更优选地约1.5单位/毫升至约3.75单位/毫升的(重组、牛或自体)凝血酶添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0078] 作为替代地，为了诱导缓慢的PRP凝固，将约0.5单位/毫升至约10单位/毫升，优选地约1.5单位/毫升至约10单位/毫升的(重组、牛或自体)凝血酶添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0079] 凝血酶单位是在37℃下30秒内使1ml草酸盐血浆凝固的物质。
[0080] 还可使用参与哺乳动物凝血的其它凝血因子(因子VII、因子VIIa(NovoSeven ，得自Novonordisk)、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa等)或参与凝血(或能够产生凝血酶)的任何化合物。然而，优选促凝血酶原激酶(人组织因子：hTF或hTf)，这是因为它安全，可以以可溶性形式存在，并且与凝血酶不同，可控制凝血级联并且获得凝血的速度不太快。在EP 1239894中说明了所述组合物中可能存在的相关脂肪和其它分子的实例。
[0081] 优选地，在向患者注射前(不久)，混合PRP和凝血因子(更优选地，为可溶性人组织因子；shTf)。
[0082] 有利地，(优选约20℃至约37℃之间的温度)将PRP和凝血因子(更优选可溶性人组织因子：shTf)混合，并且(在约20℃至约37℃之间的温度)保持可溶(优选地几分钟)。
[0083] 更优选地，当与凝血因子(更优选shTf)混合时，PRP非常缓慢地凝固，优选地，当混合时，(在约20℃至约37℃之间的温度)保持(或能够保持)液体(可溶的)超过1分钟，更优选地超过2、3、4或甚至5分钟。
[0084] 更优选地，当与凝血因子(更优选shTf)混合时，PRP非常缓慢地凝固，优选地，当注射到哺乳动物对象(人患者)中时，保持(或能够保持)液体(可溶的)超过30秒，更优选地超过1、2、3、4或甚至5分钟。
[0085] 优选地，将约600至约120000单位的(经活化的)因子VIIa(约12μg至约2400μg)，更优选地约600至约60000单位的(经活化的)因子VIIa(约12μg至约
1200μg)，更优选地约600至约6000单位的(经活化的)因子VIIa(约12μg至约120μg)添加到6至20ml抗凝血(失活的)PRP中。
1200μg)，更优选地约600至约6000单位的(经活化的)因子VIIa(约12μg至约120μg)添加到6至20ml抗凝血(失活的)PRP中。
[0086] 因此，(为了诱导PRP的缓慢凝固)，将约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约20000单位/毫升(400μg/ml)，优选地约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约10000单位/毫升(200μg/ml)，更优选地约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约1000单位/毫升(20μg/ml)
的(经活化的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。
的(经活化的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0087] 作为替代地，(为了引起PRP非常缓慢的凝固)，将约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约6000单位/毫升(120μg/ml)，优选地约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约3000单位/毫升(60μg/ml)，更优选地约30单位/毫升(0.6μg/ml)至约300单位/毫升(6μg/
ml)；更优选地约100单位/毫升(2μg/ml)至约300单位/毫升(6μg/ml)的(经活化
的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。
ml)；更优选地约100单位/毫升(2μg/ml)至约300单位/毫升(6μg/ml)的(经活化
的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0088] 人促凝血酶原激酶表示添加(不同)磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰丝氨酸)的人组织因子(human tissue factor，hTF)。该hTf可以由263个氨基酸的(完整)hTf、243个氨基酸之多肽的截短hTf(组织因子的胞质外尾和膜部分)或者仅219或206个氨基酸之多肽的(截短)(可溶性)组织因子(仅胞质外尾)或它们的任何变体形式。
[0089] 优选地，将100μg至3000μg，更优选地约300μg至约900μg的可溶性组织因子添加到约6至约20ml抗凝血(失活的)PRP中。
[0090] 因此，(为了诱导非常缓慢的凝固)将约2μg/ml至约150μg/ml，优选地约15μg/ml至约150μg/ml，更优选地约15μg/ml至约45μg/ml的可溶性组织因子添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0091] 作为替代地，(为了诱导PRP的缓慢凝固)，将约15μg/ml至约500μg/ml，优选地约50μg/ml至约150μg/ml的可溶性组织因子添加到抗凝血(失活的)PRP中。
[0092] (未修饰的)hTf的变体可包括不影响未修饰分子的功能活性(PRP活化)的一个或多个氨基酸的缺失、添加或取代。
[0093] 还可以通过参与凝血级联的其它分子，优选地，通过上述方法的步骤c)中所使用的活化化合物之一来获得PRP活化。
[0095] 在本发明方法中，特别是在上述方法的步骤k)中，将微珠用作药物递送系统，其中表层含有可的松，其中中间层含有抗坏血酸以及其中内层涂层包含β甘油磷酸酯。
[0096] 可以在根据本发明的方法中使用这些微珠的其它修饰以改善干细胞分化，特别地，用于它们在选中部位的募集以及它们的定型、向所需细胞的分化，如肌细胞、血管细胞、神经元细胞、肝细胞、破骨细胞、成纤维细胞等。
[0097] 在一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中，未实施步骤a)、b)和c)，并且如下所述改变了步骤d)和e)：
[0098] d)在哺乳动物对象中，优选地在人患者的骨髓中，选择富含干细胞的目标注射区(优选地，哺乳动物的胸骨或髂嵴)，
[0099] e)在哺乳动物对象(人患者)的该目标注射区中注射足够量的在步骤
[0100] c)中使用的干细胞活化流体或活化化合物，从而在不添加自体PRP的情况下在哺乳动物对象(优选人患者)中局部诱导(间充质)干细胞的直接体内增殖。
[0101] 所述方法该优选实施方案的其它步骤f)至m)可对应于上述的那些。
[0102] 在另一个优选的实施方案中，未实施步骤f)至m)，步骤a)至e)用于在哺乳动物对象(人患者)体内获得干细胞增殖，特别是在干细胞浓度较低的老年人(50岁以上，优选地，约60岁或65岁以上)中。优选地，在对(人)患者身体进行可能的外科手术之前，实施通过干细胞刺激的该复壮步骤，从而改善组织或细胞的再生、重建、加固或复壮，特别是该人患者身体中受损或患病组织或细胞的再生、重建、加固或复壮。
[0103] 如果需要，可以如上述实施方案中所述，不使用步骤a)至c)并且如以上所建议的，通过选择步骤d)和e)而不添加PRP来获得所述刺激。
[0104] 在根据本发明的方法中，在足够的孵育时间后，本领域技术人员可收集富含干细胞的骨髓(流体)样品，(优选地)来自目标注射区，或者收集也富含(EPC、MSC)干细胞的血液(流体)样品。
[0105] 由于干细胞的体内增殖还诱导这些干细胞扩展到哺乳动物对象血液中，因此可以对血液(流体)样品进行该回收步骤(f)。因此，通过本领域技术人员熟知的方法，如经典的去血浆透析法和装置，有可能直接从血液(流体)样品回收干细胞。
[0106] 本发明提供了作为药物的(非凝固的和/或可溶性)PRP和(足够量的)凝血因子或包含它们的(药物)组合物，优选地，其处于PRP和凝血因子的非凝固和/或可溶性混合物的形式。
[0107] 优选地，在向患者注射前(不久)，将PRP和凝血因子(更优选地，为shTf)混合。
[0108] 更优选地，当与凝血因子(更优选地，为shTf)混合时，PRP非常缓慢地凝固，优选地，保持(或能够保持)液体(非凝固和/或可溶)超过1分钟，更优选地，超过2、3、4或甚至5分钟。
[0109] 凝血因子的足够量表示使(失活的)PRP能够(非常)缓慢地凝固的量。
[0110] 更优选地，本发明提供了作为药物的PRP和凝血因子(参与凝血的化合物)(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它们的(药物)组合物，所述凝血因子选自(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(TF))、因子Xa、因子VIIa或它们的混合物。
[0111] 更优选地，本发明提供了PRP和该凝血因子(参与凝血的化合物)(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它们的(药物)组合物，其用作药物用以富集哺乳动物对象(优选人患者)的干细胞群，优选EPC和/或MSC，更优选地，不改变HSC群也不改变止血性。
[0112] 作为替代地，本发明提供了凝血因子，其优选地选自(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(Tf))、因子Xa、因子VIIa或它们的混合物(更优选可溶性组织因子(sTF)，再优选可溶性人组织因子(shTf))，其用作药物以富集哺乳动物对象(优选人患者)的干细胞群，优选EPC和/或MSC，更优选地，不改变HSC群也不改变止血性。
[0113] 本发明提供了用作药物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它们的(药物)组合物，所述凝血因子优选地选自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa和因子VIIa，更优选可溶性hTf，特别地它们在制备用于治疗和/或预防心血管(心脏相关或心脏)疾病的药物中的用途，所述心血管疾病优选地选自(退行性)心肌病、(先天性心脏病)、冠状动脉病、局部缺血、舒张功能不全、动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎和心肌梗死。
[0114] 作为替代地，本发明提供了用作治疗和/或预防心血管(心脏相关或心脏)疾病之药物的凝血因子，其优选地选自(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(Tf))、因子Xa、因子VIIa或它们的混合物(更优选可溶性组织因子(sTf)，再优选可溶性人组织因子(shTf))，所述心血管疾病优选地选自(退行性)心肌病、(先天性心脏病)、冠状动脉病、局部缺血、舒张功能不全、动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎和心肌梗死。
[0115] 本发明提供了用作治疗和/或预防神经疾病之药物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它们的(药物)组合物，所述凝血因子优选地选自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa和因子VIIa，更优选可溶性hTf，所述神经疾病优选地选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、泰-萨病、脊髓损伤、中风和脑血管意外和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
[0116] 作为替代地，本发明提供了用作治疗和/或预防(哺乳动物对象的)神经疾病之药物的凝血因子，其优选地选自(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(Tf))、因子Xa、因子VIIa或它们的混合物(更优选可溶性组织因子(sTf)，更优选可溶性人组织因子(shTf))，所述神经疾病优选地选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、泰-萨病、脊髓损伤、中风和脑血管意外和肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。
[0117] 本发明提供了用作治疗和/或预防退行性(自体免疫性)疾病之药物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)，所述凝血因子优选地选自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa、因子VIIa，更优选可溶性hTf，所述疾病优选地选自再生障碍性贫血、多发性硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征、I型糖尿病、突眼性甲状腺肿和红斑狼疮。
[0118] 作为替代地，本发明提供了用作治疗和/或预防退行性(自体免疫性)疾病之药物的(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(Tf))、因子Xa、因子VIIa或它们的混合物(更优选可溶性组织因子(sTf)，更优选可溶性人组织因子(shTf))，所述疾病优选地选自再生障碍性贫血、多发性硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征、I型糖尿病、突眼性甲状腺肿和红斑狼疮。
[0119] 本发明提供了用作治疗癌症(白血病)和/或传染性疾病(AIDS)之药物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)或包含它们的(药物)组合物，所述凝血因子优选地选自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa和因子VIIa、更优选地可溶性hTf。
[0120] 作为替代地，本发明提供了用作治疗癌症(白血病)之药物的(优选可溶性)促凝血酶原激酶(或组织因子(Tf))，因子Xa，因子VIIa或它们的混合物(更优选可溶性组织因子(sTf)，更优选可溶性人组织因子(shTf))。
[0121] 本发明提供了用作治疗和/或预防骨退行性相关疾病以及可能地用于骨重建或骨加固之药物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)或包含它们的(药物)组合物，所述凝血因子优选地选自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa和因子VIIa，更优选可溶性hTf，所述疾病优选地选自骨萎缩、骨质疏松症。
[0122] 有利地，将本发明的PRP和凝血因子(以非凝固和/或可溶性混合物的形式)(或分开地)同时注射到哺乳动物对象(优选人患者)的髂嵴、胸骨和/或脂肪组织中，更优选地，注射到所述人患者的髂嵴的骨髓中。
[0123] 有利地，在本发明的药物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)约6至约20ml PRP中约2μg/ml至约500μg/ml(可溶性)hTf的混合物，优选地，将其注射到对象或患者的髂嵴、胸骨和/或脂肪组织中。
[0124] 作为替代地，在本发明的药物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)约6至约20ml PRP中约5单位至约500单位的因子Xa的混合物，优选地，将其注射到对象或患者的髂嵴或胸骨和/或脂肪组织中。
[0125] 作为替代地，在本发明的药物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)约6至约20ml PRP中约30单位/毫升至约20000单位/毫升的因子VIIa的混合物，优选地，将其注射到对象或患者的髂嵴或胸骨和/或脂肪组织中。
[0126] 本发明的另一个方面是(非凝固和/或可溶性的)药物组合物，其可能地包含适当的药物载体或稀释剂、有效量的PRP和有效量的凝血因子，其选自：
[0127] -促凝血酶原激酶(组织因子)，优选重组促凝血酶原激酶(rTf)，优选地人组织因子(hTf)，更优选重组人组织因子(rhTf)，更优选重组可溶性人组织因子(rshTf)，更优选添加了磷脂(PL)，更具体地为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，或者，
[0128] -因子VII(a)、
[0129] -因子X(a)、
[0130] -组织因子-因子VII(a)、
[0131] -组织因子-因子VII(a)-因子X(a)、
[0132] -因子VIII(a)、
[0133] -因子IX(a)或上述化合物的组合，这些因子是活化或未活化的，其用于选自治疗和/或预防下列的疾病：心血管疾病、神经疾病、自身免疫性疾病、炎症、肝损伤和/或骨质疏松症。
[0134] 优选地，在心脏病学中使用根据本发明的(非凝固和/或可溶性)药物组合物，其中心血管(心脏或心脏相关)疾病优选地选自动脉粥样硬化、心肌病、先天性心脏病、心肌炎、冠状动脉病、脑血管意外、舒张功能不全、心内膜炎、局部缺血和心肌梗塞。
[0135] 优选地，在神经病学中使用根据本发明的(非凝固和/或可溶性)药物组合物，其中所述神经疾病优选地选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、泰-萨病、脊髓损伤、中风、脑血管意外、再生障碍性贫血、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和/或多发性硬化。
[0136] 本发明的另一个方面是(非凝固(可溶性))PRP和凝血因子(优选hTf)的(混合物)在干细胞体外增殖中的用途。
[0137] 本发明最后一个方面涉及包含多个元件和装置的成套部件，以实施本发明方法的不同实施方案，具体地：
[0138] -用于收集自体PRP的离心设备以及可能地用于从哺乳动物的血浆中获得自体凝血酶或异源凝血酶的装置，
[0139] -上述方法的步骤c)中所使用的一种或多种哺乳动物(优选人)活化化合物(凝血因子)或包含这种(这些)化合物的流体(溶液)，可能地其存在于一个或多个小瓶中，[0140] -可能地，用于从哺乳动物对象中收集血液样品和/或骨髓样品和/或脂肪样品的装置，和
[0141] -可能地，用于在富含MSC的目标注射区向所述哺乳动物对象再注射该自体PRP和/或该活化化合物的装置(注射器、针头、管等)。
[0142] 优选地，这些装置适用于(自体)PRP和MSC活化化合物(凝血因子)或者包含它们的流体的注射，并且还适用于从富含干细胞的该目标注射区收集包含这些干细胞的骨髓液体样品。
[0143] 有利地，这些装置还适用于获得与离心设备之间的连接，适用于收集所获得的自体PRP(和可能的自体凝血酶)以及(同时)适用于将所收集的富血小板血浆流体(和可能的自体凝血酶)注射到同一患者的富含(间充质)干细胞的目标部位(胸骨、髂嵴或脂肪(脂肪性)组织)。这些装置还用于从该目标注射区收集来自同一哺乳动物的骨髓流体样品，该骨髓流体样品在体内增殖后富含干细胞，并且可能地用于将这些干细胞与其杂质分离，优选地通过离心(可能地，通过成套部件的离心设备)或通过US 2007/0276352中所述的装置进行分离。
[0144] 这些装置还可以包含适合的元件，其适于收集富含(间充质)干细胞的血液(流体)样品和通过本领域技术人员熟知的手段将这些干细胞与血液(流体)样品分离，以及可能地用于(优选地)通过离心(可能地，通过成套部件的离心设备)将这些干细胞与其杂质分离。
[0145] 优选地，这些装置包括注射用注射器和收集用注射器，或者用于向骨髓或血液注射流体和/或从中收集流体的专用设备，优选地，根据上述本发明的设备有利地与离心设备连接，优选地，与文献WO 03/106040、US 6855119、WO 02/080991和US 6719901中所述的离心设备连接。
[0146] 在根据本发明的成套部件中，所述干细胞活化化合物有利地存在于小瓶或注射器中，或者存在于用于向骨髓注射流体和/或从中收集流体的专用设备中，优选地，根据上述本发明的设备与包含PRP的注射用注射器分开以避免快速凝固。还可能使用双注射用注射器，其使得能够在富含干细胞的目标注射区同时注射PRP和活化化合物(凝血因子)(即TM由Harvest USA出售的Smarjet 液体和喷雾递送系统，用于产生PRP和凝血酶的其它系TM TM
统，Harvest USA的SMARTPREP 、Medtronic 的自体血小板分离器Magellan 、Depuy的Symphony 血小板浓缩系统、Johnson and Johnson 的Acromed 设备、SORIN-DIDECO的Angel 3i血小板浓缩设备或血库中使用的其它设备)。
统，Harvest USA的SMARTPREP 、Medtronic 的自体血小板分离器Magellan 、Depuy的Symphony 血小板浓缩系统、Johnson and Johnson 的Acromed 设备、SORIN-DIDECO的Angel 3i血小板浓缩设备或血库中使用的其它设备)。
[0147] 成套部件还可包含不同的小瓶，其具有用于注射的不同活化化合物或流体，包括缓冲剂和分化化合物，或者包含这些化合物的流体，等等。
[0148] 根据本发明的注射用注射器或设备适用于在哺乳动物对象(优选人受试者)的胸骨或髂嵴中注射。
[0149] 成套部件还可包含其它元件，如管、泵、阀，其用于允许适当的注射，用于从哺乳动物体充分收集以及用于使得根据本发明的方法能够自动化进行。这些元件有利地集成在自动输液系统中，该系统用于通过本领域技术人员熟知的适当自动输液程序从手术部位向患者收集和再注射生物化合物。
[0151] 图1示出了在通过本发明方法注射之前或之后，患者血液或患者骨髓中存在的每6
10 个非粘附细胞的内皮祖细胞数目。
10 个非粘附细胞的内皮祖细胞数目。
[0152] 图2：处理前后的EPC。
[0153] 图3示出了通过本发明方法注射之前或之后，进行或未进行离体培养的MSC数目。
[0154] 图4示出了PRP+可溶性hTf注射(第0天)之前、之后3天和7天时，从患者血液或骨髓中获得的能够形成集落的EPC的数目。这强调了所述处理对血液中EPC的动员。
[0155] 图5示出了PRP注射后，MSC的体外培养。
[0156] 图6示出了在刺激区中成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的提高。
[0157] 图7示出了在注射部位(左侧)或相对部位(右侧)，在PRP+可溶性hTf注射之前(第0天)所获得的或之后7天所获得的MSC的体外增殖。所述处理提高了MSC的扩增
性能(与左侧第7天和第0天相比)，但是在相对部位处降低。
性能(与左侧第7天和第0天相比)，但是在相对部位处降低。
[0158] 图8示出了PRP+可溶性hTf处理之前、之后3和7天时的血细胞群体。在处理后3和7天，CD 34和CD 133(干细胞)阳性细胞要多得多，这反映了来自骨髓的动员。
[0159] 图9示出了PRP+可溶性hTf处理之前和之后7天在处理部位(左侧)或在相对部位处所获得的骨髓细胞群体。在两个部位的处理都维持了CD34和CD 133的水平，这强调了骨髓补充干细胞含量的能力。CD 31细胞在两个部位均要多得多。
[0160] 图10示出了能够形成以下形式集落的细胞的相对数目，即间充质前体形式(CFU-F)和表达被视作前成骨细胞标志物的碱性磷酸酶的间充质前体形式(CFU-O)。在(G0)处理前、PRP+可溶性hTf处理后3天，在处理部位(G3和RG3)或在相对部位(D3和
RD3)从骨髓收集细胞。还处理了部分细胞以富集间充质细胞(RG3和RD3)。
RD3)从骨髓收集细胞。还处理了部分细胞以富集间充质细胞(RG3和RD3)。
[0161] 图11示出了以钙和碱性磷酸酶为量度的向骨组织的分化。在(G0)处理前、在PRP+可溶性hTf处理后3天，在处理部位(G3)或在相对部位(D3)从骨髓收集细胞，并且将这些细胞在培养皿上培养指定的时间。
[0162] 图12示出了如图10中所处理的细胞的原位钙标记，但是这些细胞培养长达28天。
[0163] 图13示出了使用(较大量的)根据本发明所获得的干细胞的患者颌的骨重建。左3
侧：处理后1周，显示填充了12cm 异源骨的植入物；右侧：处理54天后，显示了同源组织重
99
新形成并新排布了覆盖植入物的骨组织。下图：处理后90天时的 Tc闪烁扫描术，证明了重建颌是由活组织(血管生成)组成的。
侧：处理后1周，显示填充了12cm 异源骨的植入物；右侧：处理54天后，显示了同源组织重
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新形成并新排布了覆盖植入物的骨组织。下图：处理后90天时的 Tc闪烁扫描术，证明了重建颌是由活组织(血管生成)组成的。
[0164] 发明详述
[0165] 在本发明方法中，将人患者既用作供体又用作移植物的宿主。
[0166] 本发明方法的独创性在于增殖细胞的步骤在原位进行，即体内进行而不再像现有技术那样在体外进行。然而，根据本发明刺激的干细胞具有增加的体外生长(与未刺激的干细胞相比)。已知人患者所产生的干细胞的量在新生儿中非常大，但是随年龄增长快速降低。
[0167] 因此，很难从患者，特别是老年患者中回收干细胞。
[0168] 因此，根据本发明的方法和装置可用于在体内快速获得大量干细胞并且在对患者的风险有限的情况下回收这些所得的干细胞。
[0169] 在效率方面与现有技术相比，该技术特征与经活化自体PRP的使用相结合为本发明的方法和装置赋予了实实在在的优势。
[0170] 事实上，由于体外操作是(或可以)最大限度减少，因此，最大程度上降低了移植排斥的风险，优化了方法的安全性。
[0171] 另外，本发明人观察到，有利地，开展本发明方法和/或在使用根据本发明的PRP和凝血因子后，患者血液中的白细胞含量几乎不变。
[0172] 然而，可在体外实现几个步骤，尤其是细胞分化。
[0173] 还将表明富含PRP和可溶性hTf的培养基在诱导干细胞体外增殖以及保持它们未分化上更有效力。
[0174] 从人患者收集约20至约200ml的血液(液体)样品，优选地约60ml血液。从该收集的血液样品中，有可能通过现有技术(WO03106040、WO00/61256、WO2004/024198、US TM6855119、WO02/080991和US 6719901)中所述的Magellan Medtronic 方法以及装置或设备获得自体富血小板血浆(自体PRP)(约6或约7至约40ml的PRP，优选地，约7至约
10ml的PRP)制剂，其包含(人患者全血中原始浓度的约100％至约1000％或更高的)血小板浓度。
10ml的PRP)制剂，其包含(人患者全血中原始浓度的约100％至约1000％或更高的)血小板浓度。
[0175] 将所获得的自体富血小板血浆添加到干燥形式的凝血因子，每微升(约200至约10000单位的凝血酶或约1mg重组人组织因子(促凝血酶原激酶))，以形成含有浓缩的经活化自体PRP的第一溶液。
[0176] 调整血小板浓度以确保血小板在约37℃时的活力。
[0177] 作为替代地，不是将凝血酶或重组可溶性人组织因子(促凝血酶原激酶)添加到所述自体富血小板血浆中，而是(优选地)可使用适合递送流体至骨髓腔和/或将其抽出骨髓腔的现有永久性可移植装置将自体PRP再注射到同一人患者的髂嵴、胸骨或脂肪(脂肪性)组织中。
[0178] 在临注射前，将凝血因子(或CaCl2)添加到PRP注射器中。
[0179] 在同一人患者的髂嵴、胸骨和/或脂肪(脂肪性)组织中再注射该溶液，从而在所述患者中局部诱导(间充质和/或内皮祖细胞，但是有利地，不引起HSC增殖)干细胞的体内增殖。
[0180] 在注射后约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20至约21天，(在相同目标注射部位)收集富含(间充质)干细胞的骨髓样品。3天和7天后，收集10ml血液和骨髓样品以估计血液学参数(血细胞比容、血红蛋白、白细胞)的最终改变。3天和7天后，通过彼此相对进行的两次穿刺收集骨髓样品以比较EPC和MSC并证明干细胞在外周血中的动员。
[0181] 例如针对整形外科或对外科治疗方法，如所计划的在相同日期进行该收集步骤。
[0182] 优选地，在确定的时间间隔(优选每星期)重复这些收集步骤数次以获得足够的干细胞浓度。
[0183] 已知血小板释放多种分子，其包括血小板衍生生长因子、转化生长因子β、血小板衍生表皮生长因子、血小板衍生血管生成因子、胰岛素样生长因子1和血小板生长因子4。这些分子对局部间充质和上皮细胞发出信号以迁移、分化并提高胶原和基质的合成。
[0184] 此外，将先前收集的骨髓样品与富血小板血浆(优选地，除了约1mg重组人组织因子(促凝血酶原激酶)之外)或足够量的上述凝血因子之一混合以获得包含浓缩的经活化自体PRP和MSC的组合物。
[0185] 此外，可以添加一定量的约80mg/ml的维生素C(L-抗坏血酸)、维生素-8
D3(1,25(OH)2D3维生素)和约10 M浓度的地塞米松至该浓度以诱导增殖、分化和基质产生。优选地，地塞米松与允许包封化合物(延迟)释放的PLGA(聚DL-乳酸-共聚-乙醇
酸)、PGA(vp8)(聚乙醇酸)、PLLA(聚L-乳酸)和/或海藻酸盐支架(如微珠)一起制备。
可以使用其它聚合化合物来获得这些优选化合物的有效包封和释放。
D3(1,25(OH)2D3维生素)和约10 M浓度的地塞米松至该浓度以诱导增殖、分化和基质产生。优选地，地塞米松与允许包封化合物(延迟)释放的PLGA(聚DL-乳酸-共聚-乙醇
酸)、PGA(vp8)(聚乙醇酸)、PLLA(聚L-乳酸)和/或海藻酸盐支架(如微珠)一起制备。
可以使用其它聚合化合物来获得这些优选化合物的有效包封和释放。
[0186] 包含用于增强骨形成的活化化合物的这种支架与科学文献(Mariani M.等人，Tissue Eng.12(3)，547-558页(2006)和Inane B.等人，Tissue Eng.12(2)257-266页(2006))中已描述的相类似。
[0187] 所获得的组合物类似于还包含适当胶凝剂(如海藻酸盐或CaCl2溶液)的凝胶，从而形成了可直接用于骨组织再生的糊剂(参见WO2004/024198)。本领域技术人员可以对此进行调整以获得有效的扩增和/或分化。
[0188] 此外，可以在不同的步骤中使用细胞所表达的一些表型标志物(CD34、CD133、CD45、NGF-R、产生细胞因子的，……)来跟踪干细胞向未成熟细胞(未成熟骨原细胞)、成熟骨原细胞、前成骨细胞、成熟成骨细胞、骨细胞等的扩增和/或分化。
[0189] 还可以在本发明的方法和组合物中使用其它化合物，如转录调节子(Cbfa-1、Msx-2 c-fos、fra-2、Dix-5，……)、淋巴因子(IL-1)、生长因子(TGF-β)、(EGF)。
[0190] 在骨髓中获得第一类型的干细胞，其为CD34+和CD31+。图1和2显示使用本发明方法，有可能获得骨髓和周围血液中EPC的体内刺激(通过添加PRP和组织因子：20至1000μg可溶性组织因子(sTF)/6ml PRP，优选地，100-700μg sTF/6ml PRP，更优选地，
334μg sTF/6ml PRP)。此外，在最初培养(primo culture)前后，MSC还显著并出乎意料地扩增(图7)。
334μg sTF/6ml PRP)。此外，在最初培养(primo culture)前后，MSC还显著并出乎意料地扩增(图7)。
[0191] 表1.
[0192] 在骨髓(BM)中在人后髂嵴(左侧)注射sTF-PRP之后，包括干细胞在内的细胞群体的变化。
[0193]
[0194] WBC白细胞计数●
[0195] ％阳性细胞* 6
[0196] 每10 个单个核细胞的成纤维细胞集落形成单位4
[0197] □造血集落形成单位(包括CFU-GM、BFU-e和CFU-e，针对4×10 个单个核细胞)[0198] 数值表示为平均值±标准偏差(n＝5位40到55岁的健康人)。
[0199] 由表1得出，在处理后7天时，“子细胞”含量(如WBC)和CFU-F在骨髓注射侧显著提高。在实践中，该效果更明显。事实上，如注射相对侧中CFU-F和-C含量降低所举例说明的以及如图3和图7中所证明的，这种定量未对细胞向血液的动员计数。即使对健康患者来说，该最初的动员证据显示了对于治疗的潜力。此外，其它“子细胞”(即如图1中所示的EPC)在血液中被动员并且意外地在骨髓中保持(更加)大量(参见图2)，这反映了分化和动员之前的刺激(增殖)的复杂动力学。
[0200] 然后，本发明人测量了所处理细胞形成集落的能力。如图3中所示，从血液和从骨髓获得细胞。如上所示，在PRP+可溶性hTf注射后3天，EPC集落数目增加了超过2倍。该作用持续至第7天。然而，在骨髓中，EPC集落数目在第7天降低，反映了它们的动员。
[0201] 在PRP+可溶性hTf注射7天后，从骨髓收集MSC，然后使它们在培养皿上生长(图5)。PRP+可溶性hTf注射后，从骨髓获得更多的CFU-F。
[0202] 在处理7天之前或之后，本发明人纯化了从骨髓收集的单个核细胞(mononuclear cell，MNC)并测量出它们形成集落的能力提高了3倍(图6)。
[0203] 在PRP+可溶性hTf注射7天之前或之后，从骨髓收集MSC，然后使它们生长(图7)。除了数量更多外，从处理部位收集的细胞获得提高的体外生长能力。
[0204] 然后，本发明人表征了血液(图8)和骨髓(图9)中的细胞。在血液中，所述处理增加了CD 34和CD 133细胞，这揭示了所述处理对干细胞生长和动员的积极作用，而它们在骨髓中的相对丰度保持恒定，这反映了骨髓保持干细胞含量恒定的能力。本发明人还注意+到，在处理后，CD31细胞在骨髓中数量更多。这种动力学与细胞类型和层次有关：“母”CD34+
和CD133 更快，其水平在第7天已几乎回到了基线，而“子”EPC和CFU-F干细胞较慢，其水平在第7天在注射侧较高，并且对于分化WBC可能更慢。
和CD133 更快，其水平在第7天已几乎回到了基线，而“子”EPC和CFU-F干细胞较慢，其水平在第7天在注射侧较高，并且对于分化WBC可能更慢。
[0205] 还可以在改善骨再生组织的凝胶组合物中使用从异源移植物、同种异体移植物或自体移植物获得的矿物型基质。
[0206] 为了获得干细胞向特定组织的分化，有可能使用一些特异性生长因子来获得特定组织的再生，(表皮生长因子EGF)用于获得皮肤组织，BMP类化合物用于诱导骨或软骨的形成，G-CSF或AMD300用于诱导造血分化等。
[0207] 凝胶组合物还可以包含其它成分以通过参与顺序增殖、分化、成熟和可能的矿化(用于获得成骨细胞)的事件的复杂级联来使得干细胞扩增和分化为所需的组织细胞。该凝胶组合物还可以包含β甘油磷酸酯(用于诱导营养不良性矿物沉积形成)、一些更特定的人生长因子或含钙化合物(如CaCl2、β-磷酸三钙、骨颗粒(来自变性骨或未变性骨)、磷灰石、绵马素(aspidine)、硫酸钙、碳酸钙、羟基磷灰石、葡萄糖乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、谷氨酸钙(calcium glutoniate)和它们的混合物)，在EP 1239894中说明了这些化合物的实例。
[0208] 本发明人刺激上述干细胞，然后测量出它们形成集落、表达碱性磷酸酶、使用和固定钙的能力提高(图10至12)。
[0209] 此后，本发明人使用所获得的细胞产生了自体植入物并且重构了完整的骨。
[0210] 如图13中所示，在通过将PRP和可溶性hTf注射到骨髓中活化干细胞并在活化后3天获得干细胞之后，本发明人能够重构活组织。在活化3天后，血液中内皮祖细胞增加了7倍，而骨髓中增加了2倍，这反映了在处理后3天干细胞的增殖和动员。这些干细胞沉积在适合于放置在患者受损颌中的钛网上。这些经活化干细胞能够生长以分化并重构活组织，
99
包括产生新血管，如通过 Tc闪烁扫描术所示的。
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包括产生新血管，如通过 Tc闪烁扫描术所示的。
[0211] 然后，本发明人调查了根据本发明进行治疗的13位患者中细胞因子血液浓度的任何变化。在所述患者的髂嵴的骨髓中注射PRP和凝血因子(shTf)后3天和7天，FGF-2(约4倍)、VEGF(约2倍)、Rantes(约2倍)和BDNF(+50％)显著增加。
[0212] 然后，本发明人测试了在患有神经退行性(神经)疾病的患者中注射PRP和凝血因子(shTf)，其目的在于减缓或甚至阻止它们。本发明入选择患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的患者，然后在左侧向髂嵴的骨髓注射PRP和凝血因子(shTf)，四天后，他在右侧再次进行相同注射并重复该方案1个月，以及在不进行这些注射的情况下使患者恢复1个月。然后，重复该注射方案，疾病恶化得到降低并且甚至得到了一些改善。
[0213] 然后，他还通过在注射PRP和凝血因子(shTf)后3天回收患者骨髓干细胞，然后在将富集的干细胞(MSC)再注射回患者心脏之前通过在2000g离心5分钟纯化来自经活化骨髓的(富含MSC的)干细胞，从而评价本发明在心脏病学(患有心肌梗死的患者)中的作用。总的来说，本发明人注意到在按照本发明的教导所处理的患者中的改善。
[0214] 本发明人还通过从相容供体的髂嵴向骨髓注射PRP和凝血因子(shTf)刺激了干细胞的增殖和激活。然后，在向骨髓已被辐照的白血病患者再注射前，本发明人从该供体分离了(经活化)骨髓样品。
[0215] 然后，本发明人在传染性疾病(AIDS)中评价了本发明。
[0216] 然而，显而易见的是考虑到由本发明方法和/或药物产品所引起的干细胞和/或细胞因子的提高，可以通过技术人员治疗几种其它疾病，所述疾病优选地选自心脏病、神经疾病、包括癌的退行性疾病、炎症、骨质疏松症、肝损伤、自身免疫性疾病和/或传染性疾病。
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