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促进 骨再生或骨形成的多肽及其用途

阅读：230发布：2020-05-13

专利汇可以提供促进骨再生或骨形成的多肽及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请公开了一种用于促进成骨再生或骨形成的肽及包括该肽的组合物。根据本申请的肽或包括该肽的组合物在异种骨和同种异体骨中具有骨再生或骨形成功能，并且在生成过程中也促进骨形成。此外，所述肽或所述组合物没有表现出异养骨化。因此，根据本申请的包括肽的组合物可用于治疗需要骨再生或骨形成功能的各种疾病。此外，根据本申请的肽可通过替代BMP-2或与少量BMP-2的一起使用来确保安全性。，下面是促进骨再生或骨形成的多肽及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于骨再生或骨形成的肽，其具有下式：
[X12]1-15-[X1-X2-X3-X4-X5]m-[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n，
其中
所述-[X1-X2-X3-X4-X5]m中，
X1为任意氨基酸，
X2、X3和X4可相同或不同，各自为L、V、I、E、G或A，X2、X3和X4中的至少一个可不存在，并且X5为K或R，
m为1至5的整数，如果m为2或更大，则每个肽可相同或不同；
所述[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n中，
所述[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n可不存在，或
X6为F、Y和W中的任一个，
7
X为K或R，
X8为A、M和I中的任一个，
X9为L、M和G中的任一个，
X10为任意氨基酸，且
X11为C、S和T中的任一个，
其中(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在，其中n为1或2，
X12为F、K和R中的任一个，并且
所述氨基酸残基是合成的或天然存在的D-型或L-型或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述X1为S、T、C、P、N和Q中的任一个。
3.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述X2-X3-X4为AAA、EEE、LVG、LVA、LVL、LVV、LLA、LLL或LLV。
4.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述[X1-X2-X3-X4-X5]具有QLVVK(SEQ ID NO:1)、QEEEK(SEQ ID NO:2)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、或SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:
72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)中显示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n具有FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)、FRPC(SEQ ID NO:14)或FR中显示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中至少两个所述肽连接在一起。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽具有如下显示的氨基酸序列：
RQLVVK(SEQ ID NO:15)；
FRALPCRQLVVK(SEQ ID NO:16)；
RQLVVKFRALPC(SEQ ID NO:17)；
RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC(SEQ ID NO:18)；
RQLVVKFRALP(SEQ ID NO:19)；
RQLVVKFRAL(SEQ ID NO:20)；
KQLVVKFRALPC(SEQ ID NO:21)；
RQKFRALPC(SEQ ID NO:22)；
RQEEEKFRALPC(SEQ ID NO:23)；
RQAAAKFRALPC(SEQ ID NO:24)；
RQLVVKFRPC(SEQ ID NO:25)；
RQLVVKFREEPC(SEQ ID NO:26)；
RQLVVKFRVVPC(SEQ ID NO:27)；
RQEEEKFREEPC(SEQ ID NO:28)；
EQLVVEFEALPC(SEQ ID NO:29)；
RQLVVKYRALPC(SEQ ID NO:30)；
RQLVVKWRALPC(SEQ ID NO:31)；
RNLVVKFRALPC(SEQ ID NO:32)；
RSLVVKFRALPC(SEQ ID NO:33)；
RQLVVK-(FRALPC)2(SEQ ID NO:37)；
(R)2-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:38)；
(R)5-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:39)；
(R)10-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:40)；
(R)15-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:41).
RQVVVKFRALPC(SEQ ID NO:42)；
RQIVVKFRALPC(SEQ ID NO:43)；
RQAVVKFRALPC(SEQ ID NO:44)；
RQEVVKFRALPC(SEQ ID NO:45)；
RQLLVKFRALPC(SEQ ID NO:46)；
RQLIVKFRALPC(SEQ ID NO:47)；
RQLAVKFRALPC(SEQ ID NO:48)；
RQLEVKFRALPC(SEQ ID NO:49)；
RQLVLKFRALPC(SEQ ID NO:50)；
RQLVIKFRALPC(SEQ ID NO:51)；
RQLVAKFRALPC(SEQ ID NO:52)；
RQLVEKFRALPC(SEQ ID NO:53)；
RQLVVRFRALPC(SEQ ID NO:54)；
RQLVVKFKALPC(SEQ ID NO:55)；
RQLVVEFEALPC(SEQ ID NO:56)；
RQLVVKFRLLPC(SEQ ID NO:57)；
RQLVVKFRILPC(SEQ ID NO:58)；
RQLVVKFRVLPC(SEQ ID NO:59)；
RQLVVKFRELPC(SEQ ID NO:60)；
RQLVVKFRAAPC(SEQ ID NO:61)；
RQLVVKFRAIPC(SEQ ID NO:62)；
RQLVVKFRAVPC(SEQ ID NO:63)；
RQLVVKFRAEPC(SEQ ID NO:64)；
RQEEEEFEEEPC(SEQ ID NO:65)；
RQLVVKFRALXC(SEQ ID NO:66)；
RQLVVKFRALPS(SEQ ID NO:67)；
RQLVVKFRALPT(SEQ ID NO:68)；或
RQLVVKFRALPX(SEQ ID NO:69)。
8.根据权利要求7所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽在其N-末端进一步包括5至20个K或R残基。
9.根据权利要求1所述的用于骨再生或骨形成的肽，
其中
X1为极性Q、N、S、T、P或C。
2 3 4
X、X和X可相同或不同，各自为疏水L、V、I或A，
X5为带正电荷的K或R，
所述[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n中，
(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在，并且具有FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:
10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)、FRPC(SEQ ID NO:14)或FR中显示的氨基酸序列，
X12为带正电荷的K或R，
m和n各自为1或2，当m或n为2时，每个氨基酸序列可相同或不同，所述氨基酸是合成的或天然存在的D-型或L-型。
10.根据权利要求9所述的用于骨再生或骨形成的肽，其所述X2-X3-X4为LVV、AAA、LVA、LVL、LLA、LLL或LLV。
11.根据权利要求9所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述[X1-X2-X3-X4-X5]由以下氨基酸序列中的任一个表示：QLVVK(SEQ ID NO:1)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)。
12.根据权利要求9所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列中的任一个表示：
RQLVVKFRALPC(SEQ ID NO:17)；
RQLVVKFRALP(SEQ ID NO:19)；
RQLVVKFRAL(SEQ ID NO:20)；
KQLVVKFRALPC(SEQ ID NO:21)；
RQAAAKFRALPC(SEQ ID NO:24)；
RQLVVKFRPC(SEQ ID NO:25)；
RQLVVKFREEPC(SEQ ID NO:26)；
RQLVVKFRVVPC(SEQ ID NO:27)；
RQLVVKYRALPC(SEQ ID NO:30)；
RQLVVKWRALPC(SEQ ID NO:31)；
RNLVVKFRALPC(SEQ ID NO:32)；
RSLVVKFRALPC(SEQ ID NO:33)；
RQLVVK-(FRALPC)2(SEQ ID NO:37)；
(R)2-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:38)；
(R)5-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:39)；
(R)10-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:40)；
(R)15-QLVVKFRALPC(SEQ ID NO:41)；
RQVVVKFRALPC(SEQ ID NO:42)；
RQIVVKFRALPC(SEQ ID NO:43)；
RQAVVKFRALPC(SEQ ID NO:44)；
RQLLVKFRALPC(SEQ ID NO:46)；
RQLIVKFRALPC(SEQ ID NO:47)；
RQLAVKFRALPC(SEQ ID NO:48)；
RQLVLKFRALPC(SEQ ID NO:50)；
RQLVIKFRALPC(SEQ ID NO:51)；
RQLVAKFRALPC(SEQ ID NO:52)；或
RQLVVRFRALPC(SEQ ID NO:54)。
13.根据权利要求12所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽在其N-末端进一步包括5至20个K或R残基。
14.具有由SEQ ID NO:15至69中任一个表示的氨基酸序列的用于促进骨形成或骨再生的肽。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽的N-末端或C-末端被非反应性基团取代。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽以药物组合物的形式提供。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述肽用于治疗或预防由于骨丢失而需要增加骨密度的疾病，所述疾病包括骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合或骨囊肿。
18.根据权利要求16所述的用于骨再生或骨形成的肽，其中所述药物组合物用于治疗或预防需要增加骨密度的疾病，所述疾病包括骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合或骨囊肿。
19.一种通过向有需要的受试者施用根据权利要求1至15中任一项所述的肽或根据权利要求16的所述药物组合物来促进骨形成或骨再生的方法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防由于骨丢失而需要增加骨密度的疾病，并且所述疾病包括骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合或骨囊肿。

说明书全文

促进骨再生或骨形成的多肽及其用途

技术领域

[0001] 本公开涉及可促进骨再生和骨形成的技术。

背景技术

[0002] 预计到2050年60岁以上人口占总人口的21.8％，因此老龄化、代谢性疾病和其他骨骼疾病将继续增加。

[0003] 已知老年人和骨质疏松症患者骨折时受伤部位的融合速率可能很低，并且对于70岁以上的骨质疏松症患者而言，已知由于生活质量降低，骨折会导致很高的死亡率。

[0004] 因此，可有效且快速治疗骨折的医疗技术已成为重要的社会问题。当骨组织受到感染、创伤和疾病的影响时，自然愈合的速度变得非常慢。随着年龄的增长，速率进一步降低。因此，考虑到患者承受的疼痛，基于骨再生的快速且准确的恢复和愈合比任何疾病都更重要。

[0005] 仅在韩国，每年需要骨再生治疗的患者数量估计就达到200万，并且相关的健康保险和医疗费用估计超过1万亿韩元，而且由于骨丢失造成的社会经济损失预计将更大。

[0006] 因此，从健康和社会经济角度，开发能够有效诱导骨组织再生的骨移植材料具有重要价值(Dimitriou等人，BMC Medicine 2011，9:66)。

[0007] 为了有效的骨再生，骨传导材料、成骨材料和骨诱导材料是必需的。

[0008] 作为骨传导材料，使用能够提供类似于骨的环境的物质，例如具有特定机械强度的羟基磷酸钙，并且将骨源性成骨细胞群和成骨生物活性因子一起使用。

[0009] WO 2009-093240公开了用于骨再生的促红细胞生成素和纤维连接蛋白组合物。BMP-2、4和7蛋白是目前应用最广泛的成骨生物活性因子。尤其，BMP-2已于2002年被FDA批准用于颈椎融合、腰椎融合和牙槽骨再生的目的。然而，如下述的许多副作用被指出成为问题。例如，炎性副作用导致假关节炎、由于骨吸收而抑制骨形成(反而加重骨矿物质密度)、延迟伤口愈合和疼痛，这些是在85％的BMP-2治疗的患者中发现的典型副作用。异位性骨化是另一种不可逆的致命副作用，其导致肌肉钙化、注射副作用或气道阻塞(宫颈手术患者，死亡)。此外，在所有患者中的1.5％发生注射副作用。已知，在使用5mg或更多时会在24个月内发生超过约20种癌症(包括罕见的癌症)，并且发生在5％的人群中。在牙科领域，已知有关疼痛的副作用是严重的。

[0010] 因此，BMP-2由于其副作用的严重性而被认为在进一步的应用中有局限性。因此，期望可克服或替代BMP-2副作用的安全性和有效性的技术的社会经济效应是非常大的。然而，目前尚未开发出有效和有力的候选药物。发明内容

[0011] 本公开提供了一种可有效促进骨形成或骨再生而没有副作用的组合物或方法。

[0012] 在一个方面中，本公开提供了具有以下式IV的多肽用于骨再生或骨形成的用途：

[0013] [X12]1-15-[X1-X2-X3-X4-X5]m-[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n，

[0014] 其中

[0015] -[X1-X2-X3-X4-X5]m中，

[0016] X1为任意氨基酸，

[0017] X2、X3和X4可相同或不同，各自为L、V、I、E、G或A，X2、X3和X4中的至少一个可不存在，并且

[0018] X5为K或R，

[0019] m为1至5的整数，如果m为2或更大，则每个多肽可相同或不同；

[0020] [X6-X7-X8-X9-X10-X11]n中，

[0021] [X6-X7-X8-X9-X10-X11]n可不存在，或

[0022] X6为F、Y和W中的任一个，

[0023] X7为K或R，

[0024] X8为A、M和I中的任一个，

[0025] X9为L、M和G中的任一个，

[0026] X10为任意氨基酸，且

[0027] X11为C、S和T中的任一个，

[0028] 其中(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在，其中n为1或2，

[0029] 并且

[0030] X12为F、K和R中的任一个，

[0031] 氨基酸残基是合成的或天然存在的D-型或L-型或其衍生物。

[0032] 在一个实施方式中，X1为S、T、C、P、N和Q中的任一个。

[0033] 在另一实施方式中，X2-X3-X4为AAA、EEE、LVG、LVA、LVL、LVV、LLA、LLL或LLV。

[0034] 在又一实施方式中，[X1-X2-X3-X4-X5]具有QLVVK(SEQ ID NO:1)、QEEEK(SEQ ID NO:2)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4))或SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)中显示的氨基酸序列。

[0035] 在又一实施例中，[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n具有FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)、FRPC(SEQ ID NO:14)或FR中显示的氨基酸序列。

[0036] 在又一实施方式中，本公开的多肽的至少两个分子可连接在一起。

[0037] 在又一实施方式中，本发明的肽具有SEQ ID NO:15至33或37至69中显示的氨基酸序列。

[0038] 在又一实施方式中，肽可在其N-末端进一步包括5至20个K或R残基。

[0039] 在另一方面中，本发明的式IV中用于骨再生或骨形成的肽，其中X1为极性Q、N、S、T、P或C；X2、X3和X4可相同或不同，各自为疏水性L、V、I或A；X5为带正电荷的K或R，并且[X6-7 8 9 10 11 8 9 10 11
X-X -X-X -X ]n中，(X 和X)以及(X 和X )中的至少一个组可不存在，并且具有FRALPC
(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:
13)、FRPC(SEQ ID NO:14)或FR所述的氨基酸序列；X12为带正电荷的K或R；m和n各自为1或2，当m或n为2时，每个氨基酸序列可相同或不同，氨基酸是合成的或天然存在的D-型或L-型。

[0040] 在一个实施方式中，X2-X3-X4为LVV、AAA、LVA、LVL、LLA、LLL或LLV。

[0041] 在又一实施方式中，[X1-X2-X3-X4-X5]具有以下任一种表示的氨基酸序列：QLVVK(SEQ ID NO:1)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)和QLVVR(SEQ ID NO:79)。

[0042] 在又一实施方式中，本发明的肽由SEQ ID NO:17、19、20、21、24、25、26、27、30、31、32、33、37、38、39、40、41、42、43、44、46、47、48、50、51、52或54表示。

[0043] 在一个实施方式中，本发明的肽可在其N-末端进一步包括5至20个K或R残基。

[0044] 在另一方面中，提供了用于促进骨形成或骨再生，具有由SEQ ID NO:15至69中的任一个表示的氨基酸序列的肽或组合物或药物组合物。

[0045] 在一个实施方式中，肽的N-末端或C-末端被非反应性基团取代。

[0046] 本发明的肽或包括该肽的组合物用于治疗或预防需要增加骨密度的疾病，所述疾病包括骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合或骨囊肿，但不限于此。

[0047] 在另一方面中，提供了通过向有需要的受试者施用本发明的多肽或包括该多肽的组合物来促进骨形成或骨再生，以治疗由于骨丢失而需要增加骨密度的疾病的方法。

[0048] 在另一方面中，提供了如本文所述的本发明的肽用于治疗或预防尤其由于骨丢失而需要增加骨密度的疾病的用途，并且所述疾病包括骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合或骨囊肿，但不限于此。

[0049] 有益效果

[0050] 本发明的肽和包括该肽的组合物可促进骨形成和骨再生，并在发育过程中促进骨形成。此外，本发明的肽和包括该肽的组合物对异位性骨化也没有副作用。因此，包括本发明的肽的组合物可有利地用于治疗需要骨再生和/或骨形成的各种疾病。此外，本发明的肽可替代BMP-2的使用，或与低于常规使用的BMP-2的浓度结合使用。

[0051] 从恢复率角度，本发明的肽与BMP-2相当或优于BMP-2。因此，本发明的肽或包括该肽的组合物可替代BMP-2，比BMP-2便宜，并且可与现有的骨替代物或骨移植一起使用，以高于传统的水平实现骨组织的恢复。此外，由于其化学结构比其他骨诱导性或骨传导性骨替代材料等简单，在合成、储存和稳定性方面也具有优势。而且本发明的对骨组织具有粘附性的肽不仅可用于外科手术，而且可用于各种途径的施用，比如局部施用。附图说明

[0052] 图1是根据本发明的肽处理在小鼠异种移植骨再生实验中形成的硬组织形成的定量分析结果。进行H&E染色，以确定硬组织特异性高密度染色区域的面积。对照组采用生理盐水处理，并且作为比较组，采用仅BMP-2以及rhBMP-2与本发明的肽混合。

[0053] 图2显示了使用小鼠的异种移植骨再生实验中再生的组织的骨化组织的免疫组织化学染色结果。免疫染色采用骨钙素特异性抗体进行，骨钙素是一种硬组织生物钙化过程中特异性表达的标记物。

[0054] 图3显示了使用抗CD31抗体的免疫组织化学染色的结果，CD31是使用小鼠的异种移植骨再生实验中再生的硬组织中的血细胞和血管的标记物。该结果被用来评估通过血管形成的组织是否保持其生物活性。

[0055] 图4显示了在使用大鼠颅骨缺损模型的骨再生实验中，在受伤的颅骨治疗后3周和5周拍摄的三维渲染图像的结果。对照组采用生理盐水处理，作为比较组采用仅BMP-2以及与本发明的肽混合的rhBMP-2。

[0056] 图5是在使用大鼠颅骨缺损模型的骨再生试验中，新骨组织的骨体积的定量测量的结果。

[0057] 图6是在使用大鼠颅骨缺损模型的骨再生实验中，形成的新骨组织中各种成骨因子和标记物表达的定量分析的结果。

[0058] 图7显示了研究与异位性骨化相关的副作用的分析结果。小鼠的左股肌使用BMP-2，并且小鼠的右股肌使用本发明的肽。4周后，进行uCT分析，以利用三维渲染图像分析肌肉组织的钙化。

[0059] 图8显示了发育期间骨形成促进试验的微CT分析的结果。

[0060] 图9显示了发育期间骨形成促进试验的全骨骼染色(WSS)分析的结果。

[0061] 图10显示了使用实验中每个实验组的胚胎后肢的H&E染色的组织学分析结果，以测试在发育过程中的骨形成促进。

[0062] 图11显示了实验中每个实验组的胚胎后肢的阿利新(Alcian)蓝染色结果，以测试在发育过程中的骨形成促进。

[0063] 图12是对细胞的疏水表面的表面粘附性(这是促进骨形成的重要生物学机制)分析的结果，显示了根据所用肽浓度的粘附性变化。通过对附着于表面的细胞的DNA定量来进行对附着的细胞的定量分析。

[0064] 图13是对细胞的疏水表面的表面粘附性(这是促进骨形成的重要生物学机制)分析的结果，显示了根据本发明的肽处理后的时间变化的粘附性。

[0065] 图14显示了用本发明的肽处理的具有高硬度的刚性结构支撑体(比如骨)上的细胞附着形式或形状的一系列变化的结果。所用的支撑体为钛，其用作牙科植入材料。

[0066] 图15显示了利用共焦显微镜方法进行分析，本发明的肽对细胞附着在具有高硬度的刚性结构支撑体(比如骨)上的区域的影响，显示了本发明的肽对细胞附着的促进作用。所用的支撑体是具有各种强度和表面特性的矫形钛。

[0067] 图16是通过测量具有高硬度的刚性结构支撑体(比如骨)上的细胞所占的粘附面积，本发明的肽的粘附促进特性的定量分析的结果。

[0068] 图17是检查具有高硬度的刚性结构支撑体(比如骨)上细胞的表面分布的结果。这是使用氧化锆作为高硬度支撑体的结果。

[0069] 图18是基于附图所示的各种分析结果，说明本发明的肽诱导骨再生的作用机理的图。

[0070] 图19是显示本发明的具有促进细胞附着特性的各种肽(水平轴)对促进骨形成的作用的结果。结果表明，向怀孕小鼠中注入肽时促进了胎儿成骨。水平轴表示所用肽的SEQ ID NO。

具体实施方式

[0071] 在一个方面中，本发明涉及式I：[X1-X2-X3-X4-X5]m的具有促进骨再生和/或骨形成活性的肽或多肽或其衍生物：

[0072] 其中，

[0073] X1为任意氨基酸，或尤其具有极性不带电荷的侧链，

[0074] X2、X3和X4可相同或不同，各自为L、V、I、E、G或A，

[0075] 并且X2、X3和X4中的至少一个可不存在，

[0076] X5为带正电荷的氨基酸，并且

[0077] 其中m为1至5的整数，如果m为2或更大，则每个多肽可相同或不同，其中，氨基酸为天然的或非天然的D-型或L-型残基。

[0078] 如本文所使用的，术语“氨基酸”指天然存在的20种氨基酸或非天然氨基酸，以及翻译修饰后的氨基酸，以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物，包括例如磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；稀有氨基酸，比如2-氨基己二酸、羟赖氨酸、正缬氨酸和正亮氨酸；被修饰以提高其在细胞中的稳定性和细胞穿透性的氨基酸；以及D-型和L-型的光学异构体。

[0079] 可用于本公开的带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸、极性不带电荷的氨基酸和非极性脂族氨基酸是本领域公知的，并且可由本领域普通技术人员毫不费力地选择。

[0080] 在本公开的一个实施方式中，带正电荷的氨基酸为K或R。

[0081] 在本公开的其他实施方式中，带负电荷的氨基酸为D或E。

[0082] 在本公开的仍其他实施方式中，极性不带电荷的氨基酸为S、T、C、P、N或Q。

[0083] 在本公开的仍其他实施方式中，非极性脂族氨基酸为G、A、L、V、M或I。

[0084] 如本文使用的，术语天然的和非天然的分别各自指在细胞、组织或体内发现的化合物；和为了特定目的对其人工修饰的化合物。

[0085] 如本文使用的，术语肽和多肽可互换使用，并且除非另有定义，从N-末端至C-末端读取，并且指其中氨基酸单体彼此共价连接的分子，并且被解释为包括由天然氨基酸或其裂解产物组成的肽、合成肽、以重组方式制备的肽、肽模拟物(通常为合成肽)、肽类似物(比如类肽和半类肽)以及被修饰来改善/改变其在细胞中的稳定性功能的肽。修饰的例子包括N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰(比如CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O和CH2-CH2)、主链修饰以及侧链修饰。肽模拟物通过本领域已知的方法制备，该方法可参考，例如，Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Choplin Pergamon Press(1992年)。

[0086] 在本公开中，发现式I的肽(也称为第一结构域/区)参与到对细胞表面或细胞膜的粘附中，并且还可取决于本文所述的感兴趣的具体应用以多种数目存在。尤其，如下所述，第一区本质上是疏水的，使得表面分子之间，或感兴趣的细胞之间或与感兴趣的细胞进行疏水相互作用，并且被认为是可影响本发明的肽的二级结构的核心区，且有助于保持其他区的分子特性。

[0087] 在本公开中，第一区或式I的肽可包括多个由5个氨基酸构成的单元，并且当包括两个或更多个单元时，每个单元可相同或不同。包括在本发明的肽中的单元的数目可不同，并且鉴于本发明的肽的感兴趣的功能(比如用于制备、储存或递送)或鉴于下文所述的效果或各种应用而确定。例如，在式I中，n可为1至10、1至9、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1。

[0088] 在本公开中，一个或多个由5个氨基酸构成的第一区或式I的肽可包括在本发明的肽中，并且当存在超过1个时，每个可相同或不同。可包括在本发明的肽中的式I的数量可以是不同的，并且鉴于本发明的肽的感兴趣的功能(比如用于制备、储存或递送)或鉴于下文所述的效果或各种应用而确定。例如，在式I中，n可为1至10、1至9、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1。

[0089] 在其他实施方式中，在式I中，X1为任意氨基酸，尤其为极性不带电荷的氨基酸，更尤其为S、T、C、P、N或Q。

[0090] 在其他实施方式中，在式I中，X2、X3和X4可相同或不同，并且各自为L、V、I、E、G或A。X2-X3-X4的序列例如为AAA、EEE、LVG、LVA、LVL、LVV、LLA、LLL或LLV等，但不限于此。在其他实施方式中，式I可为X1-LVV-X5、X1-AAA-X5或X1-EEE-X5。

[0091] 在一个实施方式中，式I的序列由QLVVK(SEQ ID NO:1)、QEEEK(SEQ ID NO:2)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:
74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)表示，但不限于此。

[0092] 在其他方面中，本公开涉及具有本文公开的生物性质的以下式II的肽或进一步包括式II的式I的肽：

[0093] [X6-X7-X8-X9-X10-X11]n，

[0094] 式II中，

[0095] X6为F、Y和W中的任一个，

[0096] X7为K或R，

[0097] X8为A、M和I中的任一个，

[0098] X9为L、M和G中的任一个，

[0099] X10为任意氨基酸，

[0100] X11为C、S和T中的任一个，

[0101] 其中(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在，

[0102] 其中n为1或2，氨基酸为天然或非天然D-型或L-型或其衍生物。

[0103] 式II的肽可连接到式I的肽的氨基末端(N-末端)或羧基末端(C-末端)，或连接到式I肽的N-末端和C-末端两者。

[0104] 根据本公开，式II的肽(称为第二区/结构域)赋予本发明的肽亲水性质，使得能够容易解离，并且当其作为单个分子存在与式I的肽组合时，可形成作为第二结构的α螺旋。

[0105] 在一个实施方式中，式I的肽和式II的肽中的至少一个可各自以各种布置包括在本发明的肽中。例如，本发明的肽可包括其中至少一个式I的肽连接到至少一个式II的肽的肽，例如包括式I-II的肽、式II-I的肽、式I-I-式II-II的肽，或其中至少两个连续连接的式I的肽和式II的肽进一步连接的肽，例如包括式I-II-I-II的肽或式I-II-I的肽或式II-I-II的肽。该顺序可改变。

[0106] 在本公开的一个实施方式中，式II的肽由FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)、或FRPC(SEQ ID NO:14)或FR表示。

[0107] 在本公开的其他方面中，式I的肽、式II的肽或包括式I和式II两者的肽可在其N-末端或C-末端进一步包括式III的肽：X121-15，包括比如式III-I-II，其中X12为带正电荷的或带负电荷的氨基酸。当本发明的多肽以式III开始时，第一个氨基酸可为带正电荷的或带负电荷的，其也包括在本公开中。

[0108] 在本公开的其他方面中，式I的肽、式II的肽或包括式I和式II两者的肽可在其N-12 12
末端或C-末端进一步包括式III的肽(称为第三区)：X 1-15，包括其中X 为带正电荷的或带负电荷的氨基酸。

[0109] X12为带正电荷的或带负电荷的氨基酸。

[0110] 在一个实施方式中，在式III中，带正电荷的氨基酸为K或R，或F、K或R。

[0111] 在其他实施方式中，在式III中，带负电荷的氨基酸为D或E。

[0112] 在本公开的其他实施方式中，提供了具有促进骨再生或骨形成的生物活性的式IV的肽或包括该肽的组合物。

[0113] [式IV]

[0114] [X12]1-15-[X1-X2-X3-X4-X5]m-[X6-X7-X8-X9-X10-X11]n，

[0115] 式IV肽中包括的每一种肽的定义可参考上文所述。

[0116] 或在式IV中，

[0117] -[X1-X2-X3-X4-X5]m中

[0118] X1为任意氨基酸，

[0119] X2、X3和X4可相同或不同，各自为L、V、I、E、G或A，X2、X3和X4中的至少一个可不存在，并且

[0120] X5为K或R，

[0121] m为1至5的整数，如果m为2或更大，则每个多肽可相同或不同；

[0122] [X6-X7-X8-X9-X10-X11]n中，

[0123] [X6-X7-X8-X9-X10-X11]n可不存在，或

[0124] X6为F、Y和W中的任一个，

[0125] X7为K或R，

[0126] X8为A、M和I中的任一个，

[0127] X9为L、M和G中的任一个，

[0128] X10为任意氨基酸，且

[0129] X11为C、S和T中的任一个，

[0130] 其中(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在，其中n为1或2，氨基酸为天然或非天然D-型或L-型或其衍生物。

[0131] 在一个实施方式中，式IV的至少两个肽可例如在N至C方向上连接在一起。

[0132] 在其他实施方式中，式IV的X1的氨基酸的任何一个可为极性S、T、C、P、N或Q，X2-X3-4 1 2 3 4 5
X可为AAA、EEE、LVG、LVA、LVL、LVV、LLA、LLL或LLV，并且式IV的[X-X-X-X-X ]可由QLVVK(SEQ ID NO:1)、QEEEK(SEQ ID NO:2)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:
76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)表示，式IV的[X6-X7-X8-X9-X10-X11]可由FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)、FRPC(SEQ ID NO:14)或FR表示。

[0133] 在其他实施方式中，包括在上述定义中的肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO:15至33或37至69表示。

[0134] 在其他实施方式中，在式IV的肽中，X1为Q、N、S、T、P或C，X2、X3和X4可相同或不同，各自为L、V、I或A，X5为带正电荷的K或R，[X6-X7-X8-X9-X10-X11](其中(X8和X9)以及(X10和X11)中的至少一个组可不存在)可为FRALPC(SEQ ID NO:6)、FREEPC(SEQ ID NO:7)、FRVVPC(SEQ ID NO:8)、FEALPC(SEQ ID NO:9)、YRALPC(SEQ ID NO:10)、WRALPC(SEQ ID NO:11)、FRALP12
(SEQ ID NO:12)、FRAL(SEQ ID NO:13)或FRPC(SEQ ID NO:14)或FR，X 为带正电荷的或带负电荷的氨基酸，m和n为1或2，如果m或n为2，则每个多肽可相同或不同，氨基酸为天然或非天然D-型或L-型氨基酸。

[0135] 在这种情况下，X2-X3-X4可为LVV、AAA、LVA、LVL、LLA、LLL或LLV。

[0136] 此外，在这种情况下，[X1-X2-X3-X4-X5]可为QLVVK(SEQ ID NO:1)、QAAAK(SEQ ID NO:3)、NLVVK(SEQ ID NO:4)、SLVVK(SEQ ID NO:5)、QVVVK(SEQ ID NO:70)、QIVVK(SEQ ID NO:71)、QAVVK(SEQ ID NO:72)、QLLVK(SEQ ID NO:73)、QLIVK(SEQ ID NO:74)、QLAVK(SEQ ID NO:75)、QLVLK(SEQ ID NO:76)、QLVIK(SEQ ID NO:77)、QLVAK(SEQ ID NO:78)或QLVVR(SEQ ID NO:79)。

[0137] 在一个实施方式中，满足上述条件的本发明的肽具有由SEQ ID NO:17、19、20、21、24、25、26、27、30、31、32、33、37、38、39、40、41、42、43、44、46、47、48、50、51、52或54表示的氨基酸序列。

[0138] 在本发明的其他方面中，提供了一种具有促进骨再生或骨形成的活性的肽或包括该肽的组合物，尤其是具有由SEQ ID NO:15至69表示的氨基酸序列的肽。

[0139] 根据本发明的具有各种氨基酸序列的多肽是鉴于本文公开的实验数据和下文所述对氨基酸残基可能的修饰的描述而产生的，因此，在没有直接实验结果的情况下，本领域普通技术人员能够理解本发明的肽对骨形成和再生的效果，而无需进行过度的实验。

[0140] 根据本发明的多肽不限于上述序列，而是包括其生物等同物。术语生物等同物指包含对本文公开的氨基酸序列的额外修饰但具有与本文公开的多肽基本上相同或类似的活性的多肽。

[0141] 这样的修饰包括，例如，氨基酸序列中的一个或多个残基的缺失、插入和/或替换。该修饰可鉴于比如尺寸、电荷、疏水性或亲水性的侧链的相似性的性质来确定。基于侧链在尺寸、形状和化学/电学性质方面的特性，认为精氨酸、赖氨酸和组氨酸为带正电荷的残基；
丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有类似尺寸的侧链；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有类似结构的侧链。因而，鉴于此，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被认为是生物学上等同的。

[0142] 在一个实施方式中，本发明的肽还包括在本发明的肽中具有保守氨基酸替换的肽。保守替换是指不实质影响或改变原肽活性的替换。例如，替换可包括在至少一个中。

[0143] 保守氨基酸替换是本领域已知，其可参考：基于如下的表1：BLOcks Substitution Matrix；Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)；和Henikoff，S.；Henikoff，J.G.(1992)“. Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks”.PNAS 89(22)：10915-10919.doi:10.1073/pnas.89.22.10915；WO2009012175 A1。

[0144] 表1

[0145]

[0146] 因此，在一个实施方式中，本发明的肽包括具有由SEQ ID NO:1至69表示的氨基酸序列的肽，以及在上述肽中具有保守氨基酸替换的肽。

[0147] 当引入修饰时也考虑疏水指数。每个氨基酸根据其疏水性和电荷被赋予唯一的疏水指数，如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

[0148] 如上所述的疏水指数可用于赋予蛋白质相互作用生物功能。已知，类似的生物活性可用具有类似疏水指数的氨基酸的替换来获得。当参考疏水指数进行修饰时，优选选择疏水指数差在±2，更优选±1，尤其优选±0.5以内的氨基酸用于替换。

[0149] 还已知，具有类似亲水性值的氨基酸之间的替换产生生物学上等同的蛋白质。

[0150] 例如，可参考美国专利号4,554,101，其中亲水性值公开如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

[0151] 此外，与亲本蛋白质相比，落入不会导致生物学特性实质性改变的范围内的氨基酸替换在本领域内是已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Protections，3rd Edition，Academic Press，New York，1979)。例如，典型的替换包括Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

[0152] 此外，当考虑如上所述具有生物学上等效活性的变体时，本发明不仅包括本文公开的氨基酸序列或下述编码该氨基酸序列的核酸，而且还包括与本文公开的序列基本上相同的序列。术语“基本上相同的序列”指当将序列与本文公开的序列比对以便尽可能最高程度地彼此对应，并且使用本领域中一般使用的算法来分析比对的序列时，示出优选至少61％，更优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的与本文公开的序列的相似度的那些序列。比对序列用于比较的方法是本领域公知的。例如，在Smith和Waterman，
Adv.Appl.Math.(1981年)2:482；Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.(1970年)48:443；
Pearson和Lipman，Methods in Mol.Biol.(1988年)24：307-31；Higgins和Sharp，Gene(1988年)73:237-44；Higgins和Sharp，CABIOS(1989年)5:151-3；Corpet等，Nuc.Acids Res.(1988年)16:10881-90；Huang等，Comp.Appl.BioSci.(1992年)8:155-65以及Pearson等，Meth.Mol.Biol.(1994年)24:307-31中描述了各种程序和比对算法。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.(1990年)215:403-10)可从
NBCI等获得，用于与序列分析程序(比如blast、blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx)组合使用。BLAST在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可获得。如何使用此程序确定序列同一性的说明在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html上可获得。

[0153] 在一个实施方式中，C-末端和/或N-末端，尤其C-末端可用惰性基团比如NH2基团取代，以增加肽的稳定性。

[0154] 在另外的方面中，本公开还涉及编码本文公开的肽的核苷酸序列或核酸分子以及含有其的载体和包括该载体的细胞。本领域普通技术人员将能够从本领域已知的密码子表中确定核苷酸序列，并且还将能够分别选择本发明的核苷酸被克隆和递送到的合适的载体和细胞。

[0155] 本发明的肽或包括该肽的组合物在同种和异种移植骨中具有骨再生和骨形成的生物活性。本发明的肽没有表现出异养骨化。

[0156] 因此，根据本发明的式I、式II或式IV的肽或包括它们的组合物可有利地用于治疗需要骨再生或骨形成的各种疾病，或促进骨再生或骨形成促进。

[0157] 如本文所用，术语“骨再生”是指丢失骨组织的愈合，并且期望包括促进成骨或骨形成。如本文所用的促进(promoting)或促进(promotion)是指缩短用于增加骨组织、骨细胞或骨基质等的量的时间，而没有限制，并且可通过骨折等的治疗效果来证实。

[0158] 在这方面，骨再生或骨形成可互换使用。

[0159] 在提供硬的环境时，认为骨骼是自愈组织。因此，其是可通过为需要骨再生的区域提供骨样环境来恢复的特殊组织。骨传导是用来描述固体环境(即，骨可生长良好的环境)的技术术语，并且加工过的骨碎片和硬聚合物已经被开发出来并用作提供这种环境的介质(植入物)。

[0160] 然而，从外部注入的骨传导性材料达不到完全骨恢复的刺激水平，并且体内骨传导性材料的生物学特性以及对骨传导性材料作出反应的生物学机制尚不清楚。来自骨组织的成骨材料没有达到克服该技术限制的水平，并且BMP-2、4、7和7作为骨诱导材料具有如前所述的许多限制。

[0161] 根据本发明的肽能够大幅度增强体内骨传导，并且促进骨诱导生长因子的表达，但不限于该理论。例如，认为促进细胞粘附促进骨传导，从而促进成骨生长因子的表达，并促进骨再生的各种机制。

[0162] 在不期望受该理论限制的情况下，发现本发明的肽极大增强了体内骨传导，并且从而促进骨诱导生长因子的表达。例如，促进细胞粘附使得促进了骨传导，并且从而促进骨诱导生长因子的表达，从而促进骨再生的各种机制。

[0163] 通常，骨传导只是通过模仿骨的物理化学性质来起到支撑体的作用，而本身并不能作为活性成分发挥作用。另一方面，本发明的肽本身可作为有效成分发挥作用，并且可认为，即使本发明的肽可增强骨传导性，但不能作为用作支撑体的骨传导性材料发挥作用。因此，根据本发明，在没有骨诱导材料的情况下，仅通过使用骨传导材料和本发明的肽的混合物来增加骨再生，这最终导致提高骨传导率。

[0164] 根据本发明的肽可替代BMP-2，因为其可导致骨丢失的快速恢复。根据本发明的肽在骨恢复率和骨质量再生量方面表现出与BMP-2相当或优于BMP-2的骨再生结果。

[0165] 因此，在另一方面中，提供了包括用于促进骨再生和/或骨形成或用于治疗需要骨再生或骨形成的疾病的本发明的肽的药物组合物。

[0166] 如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指向哺乳动物施用本发明的组合物以延迟、抑制、减轻或消除需要骨再生或促进骨形成的疾病或病症的发展。

[0167] 如本文所用，术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”指通过向哺乳动物施用本发明的组合物来抑制需要骨再生或促进骨形成的疾病或病症的发展。

[0168] 根据本发明的肽可用于治疗或预防由于骨丢失而需要增加骨密度的各种疾病或由于低骨密度而增加的骨折风险。

[0169] 需要骨再生和促进骨形成的疾病包括但不限于骨折、牙槽骨再生、关节成形术、脊柱融合和骨囊肿/骨肿瘤。还包括需要外科手术比如骨移植的疾病，因为由于上述疾病很难实现骨的自然恢复。

[0170] 可使用根据本发明的肽或组合物的其他疾病包括但不限于闭合性、开放性和不愈合骨折；通过减少闭合性和开放性骨折预防性治疗最大骨矿物质密度；促进整形手术中的骨愈合；刺激非胶结矫形手术和牙科植入术后的骨生长；增加绝经前妇女的骨矿物质密度至最大值；治疗生长缺陷；治疗溶骨性骨病比如癌症；牙周疾病和缺陷治疗以及其他牙齿修复过程；肾软骨形成期间骨形成增加；与衰老、绝经后骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症或闭塞性骨质疏松症等相关的骨质疏松症。

[0171] 本领域技术人员将能够使用本领域已知的各种方法确定症状或病症的延迟、抑制、缓解或消除。

[0172] 本发明的肽或药物组合物可用于促进先天性、创伤性或外科切除(例如癌症治疗)或整形手术后的骨再生。

[0173] 此外，本发明的肽可与任何现有的骨替代物组合使用，并且可预期比单独使用骨替代物更高的恢复水平。

[0174] 在其他实施方式中，根据本发明的肽可用于替代BMP-2或与BMP-2组合以治疗或预防其中使用BMP-2的各种疾病。

[0175] 根据本申请的组合物可以以药物组合物的形式提供。

[0176] 本文的药物组合物可通过使用一种或多种药学或生理上可接受的载剂，以及作为活性成分的根据本发明的肽来制备。

[0177] 如本文所用的术语，载剂意思是对暴露于所用组合物的剂量和浓度下的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。这种载剂的例子包括缓冲液，比如生理盐水、林格溶液、缓冲盐水、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸，抗氧化剂，包括抗坏血酸、低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸，用于药物的碳水化合物，比如单糖、双糖和葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂(比如EDTA)、糖醇(比如甘露醇或山梨醇)，成盐抗衡离子(比如钠)，和(或)非离子表面活性剂(比如双分子、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。可通过各种途径施用本发明的组合物。在一个实施方式中，尤其优选肠胃外施用(例如，静脉、皮下、腹膜内或局部施用)和肠胃外施用。剂量可根据患者的病情和体重、病情的严重程度等而变化。

[0178] 如有必要，可添加其他常规添加剂，比如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，将其配制成注射制剂(比如水溶液、悬浮液、乳液等)、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。或特异性抗体或其他配体可与载剂结合使用用于靶向递送。此外，可使用本领域中的适当方法或使用Remington's Pharmaceutical Scinece，Mack Publishing Company，Easton PA(最新版本)中公开的方法根据感兴趣的疾病或组分有利地配制。

[0179] 本发明的组合物可肠胃外施用，或具体施用方法可根据施用途径和时间而变化，并且本领域技术人员可适当地选择。

[0180] 用于肠胃外施用的制剂包括消毒水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冻干制剂、栓剂等。

[0181] 非水溶剂和悬浮剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(比如橄榄油)、可注射酯(比如油酸乙酯)等。作为栓剂的基础，可使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可纸(cacao paper)、月桂酸甘油酯、甘油、明胶等。

[0182] 以药物有效量施用根据本发明的组合物。在本发明中，“药物或治疗有效量”意思是足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，且有效剂量水平将取决于药物的类型、严重程度、活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和释放速率、治疗持续时间、包括联合施用的因素以及医学领域所周知的其他因素。本发明的组合物可作为单个治疗剂或与其他治疗剂组合施用，并且可顺序地或同时与传统治疗剂施用，并且可单次或多次剂量使用。重要的是要考虑到上述所有因素，并施用可以以最小的量获得最大效果而无副作用的量，这是本领域技术人员容易确定的。

[0183] 具体而言，根据本发明的组合物的有效量可根据患者的年龄、性别和体重而变化。通常，每千克体重0.01μg至100mg，优选0.01μg至10mg，可每日、隔日或每日一至三次。但是，剂量可根据施用途径、疾病严重程度、性别、体重、年龄等而变化，因此，剂量决不限制在本发明的范围内。

[0184] 除了根据本发明的肽之外，本发明的组合物可进一步包括一种或多种具有相同或类似功能的活性成分，或维持/增加活性成分的溶解性和/或吸收性的化合物。

[0185] 此外，本发明的组合物可单独使用或与外科手术、药物治疗或使用生物反应调节剂的其他方法结合使用。

[0186] 本文中的肽也可以以其药学活性盐的形式施用。合适的药物活性盐包括酸加成盐和碱金属盐或碱土金属盐。例如，可以获得钠、钾、锂、镁或钙盐。

[0187] 根据本发明的肽的药学上可接受的盐具有亲本肽期望的生物活性，而没有毒副作用。此类盐的例子包括(a)由无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；以及由有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸(pamoic acid)、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等)形成的盐；(b)由多价金属阳离子比如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等形成的碱加成盐；或由N,N’-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐；或(c)(a)(比如锌鞣酸盐等)和(b)的组合。

[0188] 在另一方面中，本发明还提供了使用根据本发明的肽或包括该肽的组合物促进骨再生或骨形成的方法。

[0189] 在另一方面中，本发明还提供了骨再生或骨形成的方法，或治疗或预防需要促进骨形成或再生的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的肽或包括该肽的组合物。

[0190] 本发明的方法中所包括的具体疾病种类、肽、剂量和施用方法可参考上述。

[0191] 使用根据本发明的药物组合物或方法的受试者包括但不限于哺乳动物，包括例如狗、牛、马、灵长类动物和人类。

[0192] 下文将参考实施例进一步详细描述本发明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不旨在限制本发明的范围。

[0193] 实施例

[0194] 实施例1.本发明的肽的制备

[0195] 实施例中使用的肽由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)法(Lugen Sci，韩国；Peptron，韩国)合成。为了确认使用肽的实验结果的再现性，相同组的肽分别独立地由Lugen Sci和Peptron合成2次或3次。从不同公司和不同批次之间合成的肽获得了一致的结果。

[0196] 实施例2.本发明的肽对作为骨再生主要机制的细胞粘附性的影响

[0197] 除非另有说明，否则在异种移植骨模型和以下实施例中使用具有由SEQ ID NO:17表示的序列的肽来测试本发明的用于促进骨再生的肽。

[0198] 如下所述，使用具有如表2所示组分的移植材料，将以下四组中的每一组移植到免疫缺陷小鼠的背部上，并在移植后3周和6周分析新形成的硬组织。使用的剂量如下：Geistlich Bio-Oss：100mg；hDPSC(人牙髓干细胞)：5x106细胞；根据本发明的肽：10μg；和BMP-2(BD Science)：2μg(Kevin等人，Adv Drug Deliv Rev.2012；64：1277-1291)。

[0199] 表2

[0200]

[0201] 对于动物实验，麻醉6周龄的免疫低下的小鼠(NIH-bg-nu/nu-xid，Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN，USA)，并将上述的各组合物与0.5％纤维蛋白凝胶插入小鼠背部造成的切口中，并重新缝合切口。在生理盐水中溶液稀释肽和BMP-2，并使用相同体积的生理盐水溶液作为对照。术前和术后的小鼠体重无显著变化，并且饲料消耗无显著性差异。术前和术后，根据首尔国立大学实验动物中心的标准，对实验动物进行饲养和管理。

[0202] 施用上述各组合物后3周和6周处死小鼠，并将处理部位分离并固定在4％的多聚甲醛溶液中。在10％的EDTA溶液中脱钙后，将组织包埋在石蜡中并切片，用于H&E染色和免疫染色。除了使用CD31抗体进行血管形成分析外，还进行了免疫染色以检测硬组织标记物骨钙素。如前所述，采用H&E染色对新形成的硬组织进行定量分析(Lee等人，Biomaterials
2011；32:9696-9706)。

[0203] 图1中显示了根据本公开的肽处理增加了硬组织形成的结果。根据图1，在3周时分析每个实验条件下的硬组织形成，并且证实了，与其他肽相比，通过本发明的肽的处理，形成的硬组织数量显著增加。在作为阳性对照的BMP-2处理组中，硬组织再生相比于阴性对照组增加，但在本发明的肽处理组中观察到更显著的组织再生。另一方面，在混合处理组(肽+BMP-2)中，其效果小于仅用肽处理的组，但仍比单用BMP-2处理的组增加了约1.8倍。在异种移植骨移植模型中，单独肽处理就能够得到最高的硬组织发育率。6周时的硬组织形成分析显示，在单用肽处理的组中观察到最高的硬组织发育水平，并且混合处理组的硬组织发育处于单独用肽处理组的水平，但存在细微差别。在BMP-2处理组中，硬组织发育显著高于阴性对照组，但低于单独用本发明的肽或混合处理组。

[0204] 图2中显示了本发明的肽处理组的硬组织的组织学分析和观察结果。图2显示了骨钙素(OC，骨钙化的标记物)的免疫组织化学染色结果，以检查再生组织的成骨组织。其清楚地证实了骨细胞类型的组织发育和成熟天然骨中发现的钙化组织的分布模式。此外，当与骨诱导因子BMP-2处理的组织再生相比时，证实了通过本发明的肽处理而再生的硬组织的特征没有差异。

[0205] 图3中显示了根据本发明的肽处理的血管生成结果。图3显示了异种移植骨再生模型中新形成的硬组织中血管生成或血液供应发育良好。在异种移植骨移植领域，已知血液的顺利供应对整个组织再生的质量有很大影响，并且它也是临床移植后成功组织再生的主要决定因素。CD31(血细胞和血管的标记物)的免疫组织化学染色显示，血管生成以与硬组织再生水平(图1)成正比地发育良好。尤其，与阳性对照(BMP-2)相比，在用含有本发明的肽的组合物处理的组中显示出优异的血管形成。

[0206] 从以上结果可看出，根据本发明的肽在异种移植骨模型中对骨再生发挥了优异的作用，因此可应用于各种异种移植骨领域，并可有效地用于快速骨再生，克服或弥补BMP-2的缺点。

[0207] 实施例3.通过本发明的肽促进颅骨缺损模型中的骨再生。

[0208] 利用颅骨缺损模型，对根据本发明的肽的骨再生能力进行了如下分析。

[0209] 首先，在实验室大鼠上使用具有对应于表3中各自条件的组分的移植材料作为动物模型。使用8周龄的雄性大鼠以避免激素变化引起的误差。根据首尔国立大学实验动物中心的标准对实验动物进行饲养和管理。根据表3所示的条件制备植入物后，通过手术在大鼠的颅骨中诱发特定尺寸的骨折，并用植入物进行处理。移植后3周和5周，检查新形成的骨组织。将骨再生肽和BMP-2在生理盐水中稀释，并使用相同体积的生理盐水作为对照。使用的剂量为：ACS(可吸收胶原海绵)(Kevin等人，ADV Drug Deliv Rev.2012；64:1277-1291)：直径8mm；根据本发明的肽：100μg/ACS盘；rhBMP-2：2μg/ACS盘。

[0210] 表3

[0211] 组1 组2 组3 组4
对照：生理盐水处理的肽处理的 BMP-2处理的混合物处理的
ACS ○ ○ ○ ○
BMP-2 - - ○ ○
肽 - ○ - ○

[0212] 对于动物实验，利用麻醉的实验大鼠制备颅骨骨折模型。将冠部皮肤切开，以露出整个头盖骨。用金刚石涂覆的环钻钻头去除直径8mm的组织。在颅骨缺损后，将制备好的ACS移植到损伤部位，并迅速缝合切口部位。损伤组织的尺寸，直径8mm，对应于大鼠伤口没有很好恢复的严重缺损。定义为严重的缺损被认为是评价药物疗效的良好模型。小心地进行手术，以防止手术期间硬脑膜的损伤。脑脊髓膜损伤可通过目测观察或过量出血来判断。术前和术后体重无显著性差异，并且饲料消耗无显著性差异。

[0213] 术后3周和5周处死大鼠之后，采用微CT法进行分析，并取出颅骨。用生理盐水溶液冲洗颅骨后，将其分离并固定在4％的多聚甲醛溶液中，随后进行微CT分析。通过测量受伤区域内钙化组织的体积，对新形成的再生骨进行定量分析，以评估骨再生的程度。

[0214] 图4和图5中显示了本发明的肽对骨再生的影响。图4和5分别显示了受损颅骨区的三维渲染图像和新骨组织的体积。根据结果表明，在颅骨缺损模型中，通过用本发明的肽处理，缺损区的骨再生显著增加，与显示祖细胞的骨细胞分化诱导的BMP-2处理组获得的结果相当。此外，证实了当BMP-2与肽混合时，还表现出加性效应。这些结果表明，根据本发明的肽可单独使用或与能够促进骨再生的常规物质结合使用以进一步促进骨再生。

[0215] 图6显示了检查骨再生作用的分子标记物的表达结果。这是针对图中所示每个基因在3周和5周时对从新形成组织中提取的分离RNA合成的cDNA进行的定量实时PCR结果。在
3周时，基因表达水平普遍较高。在BMP-2、本发明的肽和混合处理组中检测的成骨相关基因表达水平高于对照组。另一方面，骨细胞的形成(成骨细胞分化的最终阶段)是决定骨组织完全成熟的非常重要的标准。对于此，Dmp1(牙本质基质蛋白1)是骨细胞的主要标记物。有趣的是，该标记仅在本发明的肽处理组中显示显著增加，这可解释为用本发明的肽处理的骨具有更好的骨质量。

[0216] 实施例4.分析本发明的肽是否导致异位性骨化或异养骨化。

[0217] 为了分析本发明的肽是否诱导任何异位性骨化，进行了以下实验。

[0218] 首先，将本发明的肽或BMP-2吸附在ACS上以制备移植材料。所用的ACS是直径为5mm的圆盘，并将本发明的肽和BMP-2溶解在生理盐水溶液中。使用的BMP-2的浓度为2μg，并且使用的本发明的肽的浓度为600μg，是BMP-2的300倍。

[0219] 对于动物实验，将含有BMP-2的移植材料插入6周龄雄性小鼠左股骨肌肉的切口中，并将含有本发明的肽的移植材料插入右股骨的切口中，这些在麻醉小鼠随后进行左股骨和右股骨的表皮和筋膜的连续切口之后进行。术前和术后以及临处死前的体重无显著性差异。此外，饲料消耗无显著性差异。术后8周对动物进行安乐死，并进行微CT分析，以观察肌肉钙化(异位性骨化)。使用全部10只动物。

[0220] 结果示于图7中。根据这些结果，对插入股骨肌肉中的每种活性成分的异位性骨化的比较分析显示，其中插入BMP-2的左股骨在所有接受治疗的小鼠(n＝10)中都表现出明显的异位性骨化，而其中插入本发明的肽的右股骨在所有接受治疗的小鼠中都没有显示出异位性骨化。这些结果清楚地表明，本发明的肽对骨再生的作用与BMP-2相当，而且由于采用本发明的肽即使在高浓度下也未观察到异位性骨化，因此本发明的肽作为活性成分比BMP-2更安全。

[0221] 实施例5.胚胎发育过程中促进骨形成的分析

[0222] 如下分析本发明的肽对发育过程中促进骨形成的作用。

[0223] 对于此，将10mg/kg的根据本发明的肽注射到怀孕小鼠(C57BL/6，10周龄，Orenbio，韩国)的腹腔中。注射后两天(E16.5)，处死小鼠，取出胚胎，并分析骨形成。

[0224] 从E14.5开始，胚胎进入主要阶段，骨形成速率很高。通过微CT分析、全骨染色(WSS)和其他组织染色来分析骨形成活性。具体来说，术后将胚胎固定在4％的多聚甲醛水溶液中并进行微CT分析。在石蜡中包埋组织后进行组织学分析。组织用H&E和阿利新蓝染色。此外，对于全骨染色，对钙化组织进行乙醇固定，随后进行茜素红染色，并对软骨进行阿利新蓝染色。

[0225] 结果示于图8至11中。

[0226] 图8是显示胚胎骨组织处于未成熟阶段的微CT分析结果。因此，胚胎发育中单位体积的骨矿物质密度仍然很弱，因而微CT分析不能区分骨组织密度与周围软组织密度的差异。鉴于这些特点，胚胎阶段的分析已成为评估可积极影响骨形成的药物(新药或医疗器械中的活性成分)的重要模型。对本发明的肽处理后胚胎阶段形成的骨组织的微CT分析显示，骨组织密度显著增加，因此观察到骨骼结构的独特发育模式。另一方面，对照组中硬组织与周围软组织之间的边界不清，说明骨组织仍处于未成熟阶段。

[0227] 图9显示了WSS(全骨骼染色)分析的结果。确认14天龄胚胎骨组织的茜素红染色和阿利新蓝染色结果与微CT分析结果相似。在用本发明的肽处理的组中，茜素红染色更明显，表明用本发明的肽处理的组中钙化组织发育更多。这一结果表明，本发明的肽显著增加骨钙化水平，从而促进骨形成活性。

[0228] 图10和11是显示通过用H&E(图10)和阿利新蓝(图11)对从小鼠后肢中取出并固定在石蜡中的钙化组织和软骨进行染色的钙化和骨形成特征的结果。与其中通过本发明的肽处理证实钙化组织显著发育的WSS分析一致，组织学分析中钙化也很明显。换言之，用本发明的肽处理的组中的骨组织的组织形态学更为明显，并且也证实了不同骨组织区域的长度增长也都增加。还证实了观察到在骨形成的完成阶段存在二级骨化中心。此外，由H&E染色的软骨组织的组织学特征的分析也显示，用本发明的肽处理的组中有显著差异，这表明软骨的生长也增加了。在胚胎发育期间，骨组织的分化先于软骨的成熟，随后软骨分化为骨组织。因此，众所周知，随着软骨成熟度的增加，它对骨形成有积极的影响。因此，为了验证这点对软骨组织进行的阿利新蓝染色显示，软骨细胞的细胞外基质区域(ECM)的染色更强，并且发现软骨生长或发育的组织学特征(软骨细胞的形状、软骨生长时的形态等)在用本发明的肽处理的组中更为突出。

[0229] 实施例6.本发明的肽促进细胞粘附(其为骨形成所需的机制)。

[0230] 骨再生的重要生理机制之一是骨传导性。提高细胞粘附的技术被认为是提高骨传导性的结果之一。尤其是，骨移植可被视为涵盖骨传导性的整体技术。

[0231] 图12-17中显示了本发明的肽增加的细胞粘附。图12显示了对疏水表面的细胞粘附的影响。疏水表面通常对细胞粘附或附着的反应较低，然而许多移植材料都具有疏水表面环境。如图12所示，对于已知直接参与人类骨组织再生的间充质干细胞，添加本发明的肽可有效地诱导细胞粘附。在至少1μm或更多时观察到显著水平的粘附。此外，在添加10μm的肽的情况下，如图13所示，随时间流逝在光学显微镜下观察到了细胞粘附。结果，在对照组中，大多数细胞甚至在240分钟后仍保持不附着到表面。相反，在用本发明的肽处理的细胞中，观察到超过50％的细胞识别表面，从而早在处理后5分钟就附着到表面。这一结果表明，本发明的肽可有利地用于各种移植材料，比如通过卤素表面处理的材料，因此不容易被细胞附着，以便于细胞在体内附着到材料上，并且还促进移植材料与组织之间的相互作用。

[0232] 图14显示了分析钛表面上细胞附着的结果，钛表面是植入人体中的最具代表性的材料之一。为此，用罗丹明鬼笔环肽和DAPI染色细胞，并在共聚焦显微镜下检查。作为用于本研究的细胞系，使用对钛材料反应相对良好的成骨细胞。肽处理组的细胞形态图案更为明显，而且肽处理组的细胞的突起现象从一开始就非常明显。当存在本发明的肽时，成骨细胞在钛表面的粘附在约60分钟内达到完全成熟阶段，而对照细胞即使在60分钟后仍保持其圆形。当将细胞内肌动蛋白染色时，皮质肌动蛋白仍处于高水平。这些结果表明，当细胞暴露于本发明的肽时，可在较短的时间内预期大区域的细胞分布。分析结果示于图15和16中。图15显示了观察矫形手术中使用的不同钛表面上的成骨前体细胞粘附图案的结果，每个钛表面的组分都略有不同。本发明的肽处理组与对照组之间有明显差异。在肽处理组中，可看到宽且动态的细胞分布图案，并且细胞所占的表面积也更大。测量每个细胞所占的实际面
2
积，并将其表示为图16中的盒形图。就对照组而言，得到的面积为500-1,000μm ，而肽处理组的面积为1,500-3,000μm2。换言之，用本发明的肽处理组处理的细胞所覆盖的面积平均约大三倍。结果表明，至少对于钛植入物的情况，被细胞附着的面积是对照组的至少3倍，并且这一结果可导致骨融合速率的显著水平的差异。这是如上所述本发明的肽在异种移植骨模型和颅骨再生模型中增加骨形成的原因。为了观察成骨细胞的表面附着图案或可在移植材料表面上分化为骨细胞的细胞，将细胞分为对照组和肽处理组，并在直径为10mm的氧化锆表面培养72小时。培养后，对细胞进行ALP(碱性磷酸酶，骨标记物酶)染色，以确认细胞分布。结果示于图17中。在对照组中，间充质干细胞(hMSC)和骨髓源性未分化干细胞(ST-2)的趋势相似，并且细胞的分布局限于特定的区域而非整体分布。另一方面，观察到肽处理组的细胞均匀分布，覆盖移植材料的大部分区域。这意味着早期附着机制的激活显著而积极地影响细胞与移植材料之间的相互作用。然而，这种机制不仅仅局限于外部应用的植入物。相反，当肽能够像本发明的肽一样附着到骨组织上时，不需要使用外部植入物，因为骨组织本身被认为是具有完美骨传导性的结构，而植入物是已经开发出来以具有这种骨传导性的结构，因此它也可用于促进骨再生。

[0233] 实施例7.本发明的肽对骨再生的影响

[0234] 如上所述，在硬结构(比如骨)的表面上或在细胞难以附着的表面上，本发明的肽可促进细胞粘附，这是再生的关键机制。尤其，还发现，通过在具有高硬度的骨表面上与ECM结合，增加细胞粘附，也可促进骨细胞分化(见图18)。因此，在本实施例中，使用本发明中开发和公开的各种粘附性肽来测试其促进骨细胞分化的活性。为此，将每种肽与未分化的干细胞混合，然后在钛骨传导表面上培养，并分析细胞分化为骨细胞。结果示于图19中。将用胰蛋白酶处理并与肽(10μM)混合的两个X104细胞/ml在直径为10mm的牙科钛盘上培养6小时，之后，将培养基替换为成骨细胞分化培养基，并且培养细胞48小时。然后恢复该盘，裂解细胞，并测定ALP(碱性磷酸酶)的活性。如结果所示，与对照(C)相比，在诱导细胞粘附的所有肽中均观察到更高水平的ALP活性。尤其，在含有15个精氨酸残基的N-末端，具有SEQ ID NO:41[(R)15-QLVVKFRALPC]的带正电荷的肽显示出最高的ALP活性。

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骨再生用组合物	2020-05-11	149
再生骨料生态土层	2020-05-12	944
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促进骨再生或骨形成的多肽及其用途

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