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纯化牛跟 腱 胶原蛋白的方法及其海绵的制备

阅读：806发布：2020-05-17

专利汇可以提供纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及纯化胶原蛋白的方法，目的是通过采用新的方法充分粉碎牛跟腱，纯化胶原蛋白中用调节pH析出胶原法代替盐析、透析脱盐法，海绵成型工艺中不添加化学交联剂，简易工艺流程，提高胶原蛋白的提取率，达到高合格率的胶原蛋白海绵，以及采用所述的胶原蛋白制备止血海绵。，下面是纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备专利的具体信息内容。

权利要求

1.纯化牛跟腱胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成
0.3mm厚，再用组织搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，4℃下搅拌48～72小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)采用切片机将牛跟腱切成薄片，再用组织搅碎机充分绞碎，可保证牛跟腱在提取过程中与酸溶液充分接触，提高胶原蛋白的提取率；所述步骤2)中的稀碱溶液为0.1mol/L～0.2mol/L的氢氧化钠或碳酸钠溶液，醇类为10％～12％的异丙醇或70％～75％的乙醇溶液；所述步骤3)中的稀酸为1％～
3％的醋酸溶液；所述步骤4)牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为(50～100)∶1；所述步骤5)中主要利用透析的小分子经过半透膜扩散到透析外液中，将胶原溶液中的小分子杂质与胶原蛋白大分子分开的原理，以阶梯式稀释胶原溶液中醋酸的浓度的水洗方法，来代替使用透析袋透析溶液的方法。
3.医用胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成
0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入胃蛋白酶，4℃搅拌48～72小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原提取液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白；
6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻6～8小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵状材料。
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7)用Co 照射灭菌，包装，入库。
4.根据权利要求3所述的制备胶原蛋白海绵的方法，其特征在于，胶原海绵中不含有
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化学交联剂，采用物理交联法Co 照射灭菌，包装，入库。

说明书全文

纯化牛跟 腱 胶原蛋白的方法及其海绵的制备

技术领域

[0001] 本发明涉及以简易工艺达到高合格率的胶原海绵的制备方法。

背景技术

[0002] 胶原蛋白是脊椎动物体内含量最多、分布较广的蛋白质。纤维状胶原蛋白形成所有哺乳动物结缔组织的结构基础，也是构成许多组织尤其结缔组织的主要成分，约占机体总蛋白的25％。胶原蛋白独特的三股螺旋结构，赋予其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性使其在医药、生物组织工程等方面展现出极大潜力。

[0003] 但是，市场上的胶原海绵的价格昂贵，柔韧性比较差，且用有潜在毒性的交联剂交联，其会严重影响海绵的生物相容性。一般的胶原蛋白海绵工艺复杂，工艺流程主要包括原料预处理--提取胶原蛋白--盐析--透析脱盐--交联--冷冻干燥。工艺流程中，一方面，在盐析过程中会引入氯离子杂质，需要采用透析进行脱盐纯化胶原过程中。由于透析袋的孔径比较小，大分子胶原溶液呈粘稠状，容易堵塞膜孔，限制胶原溶液中的小分子杂质如氯离子的排出，难以实现提高胶原的纯度目的。且透析耗时较长，操作比较麻烦，如中国发明专利公开说明书CN100444902C中用0.01％～0.1％醋酸作为透析外液透析2天，每天至少换液一次，再用磷酸氢二钠溶液透析至pH达到5以上。中国发明专利公开说明书CN101569759A用NaCl为透析外液透析，每4小时换一次透析液，透析5天。透析过程中由于杂质离子和水离子发生置换，引起透析袋的膨胀，导致膜孔变大，胶原溶液会部分析出透析袋，且透析袋会因过度膨胀而涨破，这些因素均会导致胶原溶液的损失，降低胶原的产率。若用水洗胶原代替透析法，需要重复多次水洗才能洗至加硝酸银没有出现沉淀(图1和图2)，此操作较繁琐，且在洗涤过程中部分胶原溶液随水洗液流失，同样降低胶原的提取率。在研究过程中，我们发现将胶原提取液调节至中性可析出大量胶原(图3)，而取其上清液盐析析出的胶原量很少，调节pH对胶原析出的影响程度远远大于盐析，故可选择直接调节pH而不盐析，减少水洗胶原的次数，进而简化工艺流程。

[0004] 另一方面，若胶原溶液交联程度控制不好，会导致在去除交联剂过程中胶原海绵出现裂缝，且难以去除交联剂，如中国发明专利公开说明CN101005865A中胶原溶液与戊二醛交联，但是要从高亲水性胶原海绵中完全清除戊二醛比较困难，需要重复多次水洗至无戊二醛，该工艺不仅复杂，而且难以彻底清除戊二醛，残留的少量戊二醛对周围细胞有害，严重影响生物相容性，造成胶原蛋白海绵的合格率降低，市场价格昂贵。

[0005] 为此，本研究重点在于充分粉碎牛跟腱以提高胶原提取率，不盐析直接调节pH来纯化胶原蛋白来简化工艺，避免使用有毒的化学交联剂来提高胶原蛋白的性能，简化工艺，降低成本，提高牛跟腱的经济价值。

发明内容

[0006] 本发明鉴于上述现状，目的是提供简易工艺得到高纯度，其止血效果好，修复效果好，价格低的医用胶原蛋白海绵。

[0007] 解决问题的技术方案

[0008] 本发明涉及采用切片机和组织搅碎机依次充分绞碎速冻的牛跟腱，再用NaOH去除杂蛋白，异丙醇或乙醇脱脂，使产品的脂肪含量降到最低。

[0009] 本发明涉及将提取的胶原溶液的pH调节至中性，使胶原充分析出来，代替盐析胶原的方法，避免引入氯离子，再采用直接水洗的方法纯化胶原蛋白。

[0010] 本发明涉及不添加交联剂，冷冻干燥得到胶原海绵的制造方法。

[0011] 本发明生产工艺简单，生产成本较低，具有广泛的推广价值。

[0012] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

[0013] 实施例1纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：

[0014] 1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；

[0015] 2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；

[0016] 3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；

[0017] 4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为25∶1，4℃下搅拌48小时；

[0018] 5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。

[0019] 6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻6小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。

[0020] 7)用Co60照射灭菌，包装，入库。

[0021] 实施例2纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：

[0022] 1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；

[0023] 2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；

[0024] 3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；

[0025] 4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为50∶1，4℃下搅拌60小时；

[0026] 5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。

[0027] 6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻7小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。

[0028] 7)用Co60照射灭菌，包装，入库。

[0029] 实施例3纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：

[0030] 1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；

[0031] 2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；

[0032] 3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；

[0033] 4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为100∶1，4℃下搅拌72小时；

[0034] 5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。

[0035] 6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻8小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。

[0036] 7)用Co60照射灭菌，包装，入库。

[0037] 本发明通过对牛跟腱的预处理，加酶量，提取时间，胶原溶液预冻时间的工艺参数的控制，得到的胶原蛋白通过紫外扫描表明牛跟腱胶原蛋白在235nm处有明显的吸收峰，与I型胶原蛋白的特征性吸收峰基本重叠，可判定提取的为I型胶原蛋白(图4)。另外，I型胶原蛋白为由三条多肽链互相缠绕形成的三螺旋结构，包括α1(2条)、α2(1条)链两种。SDS-PAGE凝胶电泳图中的胶原蛋白条带电泳迁移的位置与I型胶原蛋白标准品相同，表明提取的胶原蛋白提取物符合I型胶原蛋白特征，此外SDS-PAGE电泳图上几乎无杂带，表明提取物的纯度比较高(图5)。未交联的胶原蛋白溶液冷冻干燥后，形成疏松多孔的海绵结构，其色泽洁白并带有一定的韧性(图6和图7)。附图说明
图1是加硝酸银检测胶原溶液中氯离子浓度的脱盐工艺图；图2是胶原蛋白水洗液的紫外扫描图；图3是胶原等电点析出图；图4是牛跟腱胶原蛋白紫外扫描图(A：I型胶原蛋白标准品；B：牛跟腱胶原蛋白)；图5是牛跟腱胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱图；图6是胶原海绵表面形貌图；图7是胶原海绵受力后形貌图。

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