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一种 胶原蛋白海绵的制备方法

阅读：765发布：2020-05-16

专利汇可以提供一种胶原蛋白海绵的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备方法，包括胶原蛋白的冻干成型、交联、清洗、浸泡功能溶液、压缩冻干和包装灭菌过程，本发明提供了一种亲水性能和机械性能好，粘附性和吸胀性强且密度大的可吸收胶原蛋白海绵。，下面是一种胶原蛋白海绵的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：
（1）取胶原蛋白粉，用0.5mol/L的乙酸将其完全溶解，并配制成浓度为5~8mg/mL的胶原蛋白溶液；将配制好的胶原蛋白溶液置于模具中，并在-80℃下真空冷冻干燥48小时，得到胶原蛋白海绵材料；
（2）将胶原蛋白海绵材料置入pH为3~6的由体积分数分别为1~5%缩水甘油醚和
10~40%乙醇配制成的交联溶液中，于4℃下浸泡48小时；
（3）将经步骤（2）处理过的胶原蛋白海绵材料置于4℃纯水中反复浸泡清洗，最后挤掉水分，得到胶原蛋白海绵预产品；
（4）将胶原蛋白海绵预产品浸入4℃功能溶液中；
（5）将吸取功能溶液后的胶原蛋白海绵预产品压缩，同时在压缩状态下在-80℃真空冷冻干燥；
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（6）将步骤（5）处理过的胶原蛋白海绵预产品包装后用 Co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述胶原蛋白粉的制备方法包括以下步骤：
a）取新鲜哺乳动物皮肤或肌腱除去筋膜和油脂后，洗净，粉碎；
b）将经步骤a）处理后的新鲜哺乳动物皮肤或肌腱置入0.5mol/L乙酸溶液中搅拌均匀，调整体系pH为3~5.0，并向体系中加入质量为处理后的新鲜哺乳动物皮肤或肌腱质量的0.1%的蛋白酶，于37℃下恒温搅拌48小时；
c）酶解后的混合液在12000rpm下离心20分钟，取上清液；
d）向上清液中加入磷酸盐缓冲液，调整体系pH为6.5~7.0，沉淀胶原蛋白；
e）继续步骤d）的体系中加入NaCl粉末，使体系中NaCl的浓度达到1~3mol/L，盐析胶原蛋白；
f）使用孔径为20kD的超滤器超滤，浓缩脱盐，收集截留液得到胶原蛋白；
g）步骤f）所得胶原蛋白在-80℃下真空冷冻干燥冻干。
3.根据权利要求1或2所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中的胶原蛋白溶液浓度为7mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中的pH为5，交联溶液由3~5%的缩水甘油醚和30~40%的乙醇混合而成。
5.根据权利要求4所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中的纯水浸泡清洗次数至少为3次。
6.根据权利要求5所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中的功能溶液为0.9%的NaCl水溶液、含生长因子溶液或含局部麻醉剂溶液。
7.根据权利要求6所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中
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干燥后克重为0.1~0.15g/cm。
8.根据权利要求7所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤b）中体系的pH为3.0。
9.根据权利要求8所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤b）中的蛋白酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。
10.根据权利要求9所述的一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤e）中的NaCl的浓度为3mol/L。

说明书全文

一种胶原蛋白海绵的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物医学材料领域，具体涉及一种胶原蛋白海绵。

背景技术

[0002] 胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，其在哺乳动物体内占蛋白质总量的25%～30%。胶原蛋白也是生物科技产业最具关键性的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛应用。

[0003] 胶原蛋白（也称胶原）是细胞外基质的一种结构蛋白质，普遍存在于动物体的骨、软骨、皮肤、肌腱和韧带中，对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。胶原蛋白种类较多，根据其结构和功能的不同可细分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等27种类型，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等，在生物医学材料领域获得广泛的应用。特别是在医学领域中，胶原蛋白可制成胶原海绵、胶原膜或人工皮肤等。

[0004] 与人工合成的生物材料（如聚乳酸、聚羟基乙酸等）相比，热变性温度过低、机体内降解速率过快以及材料机械性能不理想是天然胶原蛋白的主要不足之处。国内外学者围绕天然胶原蛋白的性能改进开展了大量前沿研究。

[0005] 中国专利CN103772734A公开了一种高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其含盖了胶原蛋白的提取、提纯、交联和冻干成型的整个过程，其主要目的首先是获得高纯度的胶原蛋白，而后再利用其制备胶原蛋白海绵。

[0006] 事实上，胶原蛋白海绵的性能好坏不光取决于胶原蛋白的纯度，其海绵本身的密度和性能（如柔韧性，粘附性和吸胀性）在实际应用中也非常重要。良好的粘附性可提高其与创口的紧密贴合；柔韧性好可提高胶原蛋白海绵的机械性能，保证其在弯曲时不易折断，两者共同保证了出血创口与海绵的紧密接触，同时，较大的吸胀性保证了海绵及时吸收出血和渗出液，对创口局部的出血点起到按压止血作用。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种亲水性能和机械性能好，粘附性和吸胀性强且密度大的可吸收胶原蛋白海绵。

[0008] 本发明采用如下技术方案：一种胶原蛋白海绵的制备方法，其包括以下步骤：
（1）取胶原蛋白粉，用0.5mol/L的乙酸将其完全溶解，并配制成浓度为5~8mg/mL的胶原蛋白溶液；将配制好的胶原蛋白溶液置于模具中，并在-80℃下真空冷冻干燥48小时，得到胶原蛋白海绵材料；
（2）将胶原蛋白海绵材料置入pH为3~6的由体积分数分别为1~5%缩水甘油醚和
10~40%乙醇配制成的交联溶液中，于4℃下浸泡48小时；
（3）将经步骤（2）处理过的胶原蛋白海绵材料置于4℃纯水中反复浸泡清洗，最后挤掉水分，得到胶原蛋白海绵预产品；
（4）将胶原蛋白海绵预产品浸入4℃功能溶液中；
（5）将吸取功能溶液后的胶原蛋白海绵预产品压缩，同时在压缩状态下在-80℃真空冷冻干燥；
60
（6）将步骤（5）处理过的胶原蛋白海绵预产品包装后用 Co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。

[0009] 进一步的，胶原蛋白粉的制备方法包括以下步骤：a）取新鲜哺乳动物皮肤或肌腱除去筋膜和油脂后，洗净，粉碎；
b）将经步骤a）处理后的新鲜哺乳动物皮肤或肌腱置入0.5mol/L乙酸溶液中搅拌均匀，调整体系pH为3~5.0，并向体系中加入质量为处理后的新鲜哺乳动物皮肤或肌腱质量的0.1%的蛋白酶，于37℃下恒温搅拌48小时；
c）酶解后的混合液在12000rpm下离心20分钟，取上清液；
d）向上清液中加入磷酸盐缓冲液，调整体系pH为6.5~7.0，沉淀胶原蛋白；
e）继续步骤d）的体系中加入NaCl粉末，使体系中NaCl的浓度达到1~3mol/L，盐析胶原蛋白；
f）使用孔径为20kD的超滤器超滤，浓缩脱盐，收集截留液得到胶原蛋白；
g）步骤f）所得胶原蛋白在-80℃下真空冷冻干燥冻干。

[0010] 进一步的，所述步骤（1）中的胶原蛋白溶液浓度为7mg/mL。

[0011] 进一步的，所述步骤（2）中的pH为5，交联溶液由体积分数分别为3~5%的缩水甘油醚和30~40%的乙醇混合而成。

[0012] 进一步的，所述步骤（3）中的纯水浸泡清洗次数至少为3次。

[0013] 进一步的，所述步骤（4）中的功能溶液为0.9%的NaCl水溶液、含生长因子溶液或含局部麻醉剂溶液。

[0014] 进一步的，所述步骤（5）中干燥后克重为0.1~0.15g/cm2。

[0015] 进一步的，所述步骤b）中体系的pH为3.0。

[0016] 进一步的，所述步骤b）中的蛋白酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。

[0017] 进一步的，所述步骤e）中的NaCl的浓度为3mol/L。

[0018] 本发明方法的有益效果为：（1）本发明采用冻干后交联的方法对胶原蛋白海绵进行改性，增加了交联时单位体积内胶原蛋白的浓度，胶原蛋白得以充分交联，从而使胶原蛋白获得极强的亲水性，保证了海绵的可润湿性和更快速的水化以及扩张特性，同时也使得胶原蛋白海绵成型后更加致密。

[0019] （2）通过调整胶原蛋白浓度、交联时体系的pH以及使用缩水甘油醚和乙醇混合得到的交联剂，改善胶原蛋白海绵的内部孔隙结构，增大单位体积的孔隙率。

[0020] （3）通过改变功能溶液的种类，可制备针对不同需求的各类胶原蛋白海绵。

[0021] （4）成品前将胶原蛋白海绵进行含水压缩并冻干处理以达到预期的密度，保证了成品在使用时获得更好的膨胀性。

[0022] （5）采用冻干后交联以及压缩冻干最终成型的二次冻干工艺，保证胶原蛋白海绵成型后形成更加稳定的结构。

[0023] （6）本发明的方法制备了一种高密度，结构稳定，具有极强的吸水能力和膨胀能力，可起到局部按压止血效果的可吸收胶原蛋白海绵。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。

[0025] 胃蛋白酶：酶活为10000U/g；胰蛋白酶：酶活为10000U/g。

[0026] 胶原蛋白的终产率最后冷冻干燥得到的高淳胶原蛋白的质量为m1，最初反应的原料质量为m2，用m1/m2即为胶原的终产率。

[0027] 胶原海绵的吸水率测试取胶原海绵，称重，精确至0.001g，分别浸入室温下的蒸馏水中，用镊子轻轻揉搓海绵，但不能将其揉碎，待海绵充分吸水后，将其提出水面，并在水面上停留一端时间，使多余的蒸馏水滴落后称重，精确至0.001g，计算吸收水分的质量与样品质量之比，每个样品测量5次，求平均值即可得到胶原海绵相对于自身重量的吸水率。

[0028] 胶原海绵的孔隙率测试先用一个容积为10mL的塑料瓶，倒满乙醇称重W1，把重为Ws的海绵浸入乙醇中，超声波震荡一段时间，时间的长短依据海绵的形状及大小，充分脱除海绵孔隙中的空气，使乙醇充满海绵的孔结构中，然后向瓶中加乙醇直至充满，称重为W2，将已经吸满乙醇的样品取出，称剩余的乙醇与塑料瓶的质量为W3，计算孔隙率θ，每个样品测试5次，最后求平均值，θ=（W2-W3-WS）/（W1-W3）。

[0029] 兔耳动脉止血实验将实验兔用木架固定，耳部褪毛，在兔子耳部中央动脉处进行安尔碘消毒，75%酒精脱碘，通过兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉，用量为40mg/kg，待兔子麻醉后将其固定在手术台上开始实验。用手术刀剥离兔耳中央动脉，做1cm×1cm创面，并将表面撕下，于
1/2处切断中央动脉。

[0030] 动脉血涌出，首先用灭菌后的医用纱布吸收，迅速用1cm2的胶原蛋白海绵敷于创面，以2层1.5cm×1.5cm的ORC纱布作为对照，用砝码垂直敷压，同时开启秒表记录止血时间，之后每隔20s观察是否仍有渗血，并及时用已经精确称量质量的普通杀不吸取渗血，同时观察止血材料与创面的粘附情况，连续观察15min。当不在出血和渗血时停止秒表，此为止血时间，用吸血后普通纱布的质量减去原普通纱布的质量即为出血量。

[0031] 膨胀倍数的计算公式：式中，吸水膨胀后的体积为其吸水饱和时的体积。

[0032] 实施例1（1）取市售的胶原蛋白粉（纯度不低于70%），用0.5mol/L乙酸将其完全溶解，并配制成浓度为5~8mg/mL的胶原蛋白溶液；将配制好的胶原蛋白溶液置于模具中，并在-80℃下真空冷冻干燥48小时，得到胶原蛋白海绵材料。

[0033] （2）将胶原蛋白海绵材料置入pH为3~6的由体积分数分别为1~5%缩水甘油醚和10~40%乙醇配制成的交联溶液中，于4℃下浸泡48小时；。

[0034] （3）将经步骤（2）处理过的胶原蛋白海绵材料置于4℃纯中浸泡清洗至少3次，最后挤干水分，得到胶原蛋白海绵预产品。

[0035] （4）将胶原蛋白海绵预产品浸入4℃功能溶液中，所述功能溶液为0.9%的NaCl水溶液、含生长因子溶液或含局部麻醉剂溶液。所述生长因子溶液中的生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、糖胺聚糖或纤连蛋白中的一种或几种。

[0036] （5）将吸取功能溶液后的胶原蛋白海绵预产品压缩，并于压缩状态下在-80℃真空2
冷冻干燥。干燥后克重为0.1~0.15g/cm。

[0037] （6）将步骤（5）处理过的胶原蛋白海绵预产品包装后用60Co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。

[0038] 实施例2胶原蛋白的制备：
（1）取除去筋膜和油脂后的新鲜猪皮200g，洗净，粉碎。

[0039] （2）将经步骤（1）处理后的猪皮置入0.5mol/L乙酸溶液中搅拌均匀，此时体系pH为3.0，向体系中加入0.2g的胃蛋白酶，于37℃下恒温搅拌48小时。

[0040] （3）酶解后的混合液在12000rpm下离心20分钟，取上清液。

[0041] （4）向上清液中加入磷酸盐缓冲液，调整体系pH为6.5~7.0，沉淀胶原蛋白。

[0042] （5）继续步骤（4）的体系中加入NaCl粉末，使体系中NaCl的浓度达到1mol/L。盐析胶原蛋白。

[0043] （6）使用孔径为20kD的超滤器超滤，浓缩脱盐，收集截留液得到胶原蛋白。

[0044] （7）步骤（6）所得胶原蛋白在-80℃下真空冷冻干燥冻干。

[0045] 胶原蛋白海绵的成型：（8）取步骤（7）得到的冻干的胶原蛋白粉，用0.5mol/L乙酸将其完全溶解，并配制成浓度为8mg/mL的胶原蛋白溶液；将配制好的胶原蛋白溶液置于模具中，并在-80℃下真空冷冻干燥48小时，得到胶原蛋白海绵材料。

[0046] （9）将胶原蛋白海绵材料置入pH为3的含1%缩水甘油醚和10%乙醇的交联溶液中，于4℃下浸泡48小时。

[0047] （10）将经步骤（9）处理过的胶原蛋白海绵材料置于4℃纯中浸泡清洗至少3次，最后挤干水分，得到胶原蛋白海绵预产品。

[0048] （11）将胶原蛋白海绵预产品浸入4℃功能溶液中，所述功能溶液为0.9%的NaCl水溶液。

[0049] （12）将吸取功能溶液后的胶原蛋白海绵预产品压缩，并于压缩状态下在-80℃真2
空冷冻干燥。干燥后克重为0.1g/cm。

[0050] （13）将步骤（12）处理过的胶原蛋白海绵预产品包装后用60Co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。

[0051] 实施例3步骤（2）中，使用氢氧化钠调节pH为4.0，蛋白酶选用胰蛋白酶，其余条件同实施例2。

[0052] 实施例4步骤（2）中，使用氢氧化钠调节pH为5.0，蛋白酶选用胰蛋白酶，其余条件同实施例2。

[0053] 实施例5仅改变步骤（5）中的NaCl在体系中的浓度为2mol/L，步骤（12）中干燥后克重为
2
0.15g/cm，其余条件同实施例2。

[0054] 实施例6仅改变步骤（5）中的NaCl在体系中的浓度为3mol/L，步骤（12）中干燥后克重为
2
0.12g/cm，其余条件同实施例2。

[0055] 实施例7仅改变步骤（8）中的胶原蛋白浓度为5mg/mL，其余条件同实施例6。

[0056] 实施例8仅改变步骤（8）中的胶原蛋白浓度为6mg/mL，其余条件同实施例6。

[0057] 实施例9仅改变步骤（9）中的pH为6，交联溶液由体积分数为5%缩水甘油醚和40%乙醇混合而成，其余条件同实施例6。

[0058] 实施例10仅改变步骤（9）中的pH为4，交联溶液由体积分数为3%缩水甘油醚和30%乙醇混合而成，其余条件同实施例6。

[0059] 取实施例2~6得到的胶原蛋白，计算胶原蛋白的终产率，结果如表1所示。

[0060] 表1实施例胶原蛋白终产率/%
2 48.15
3 48.29
4 52.56
5 54.33
6 54.98
表1中可知，本发明的胶原蛋白提取方法具有较高的胶原蛋白产率。

[0061] 取实施例2和6得到的胶原蛋白，利用氨基酸分析仪分析其氨基酸含量，结果如表2所示。

[0062] 表2氨基酸含量/% 商品胶原蛋白实施例2 实施例6
天门冬氨酸 4.16 5.41 5.38
苏氨酸 1.34 1.75 1.80
丝氨酸 2.37 3.20 3.26
谷氨酸 7.20 9.55 9.70
甘氨酸 16.53 22.56 21.01
丙氨酸 6.36 9.12 9.00
胱氨酸 0.21 0.33 0.25
缬氨酸 1.52 2.35 2.33
蛋氨酸 0.98 0.76 0.75
异亮氨酸 0.89 1.34 1.53
亮氨酸 2.06 3.30 3.22
酪氨酸 0.63 0.31 0.34
苯丙氨酸 1.46 2.54 2.99

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