高强度壳多糖复合材料及其制造方法
阅读：470发布：2020-11-07
专利汇可以提供高强度壳多糖复合材料及其制造方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 针对的是具有高机械强度的复合层状材料以及制造所述材料的方法。本发明还提供了将医学植入装置粘附至组织的方法。，下面是高强度壳多糖复合材料及其制造方法专利的具体信息内容。
1.一种复合层状材料，所述复合层状材料包含基于碳水化合物的基底和蛋白。
2.如权利要求1所述的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底包括膜、纤维、海绵、网片、泡沫或纳米结构。
3.如权利要求1-2中任一项所述的复合层状材料，其中，所述碳水化合物与所述蛋白的比值为10:1到1:10。
4.如权利要求1-3中任一项所述的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于如下物质的基底:壳多糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖、甘露糖寡糖、糖原、淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、葡萄糖胺聚糖(例如，透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等)、纤维素、3 -葡聚糖(酵母聚糖、香菇多糖、西佐糖)、麦芽糖糊精、菊粉或果聚糖P (2 — 6)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于壳聚糖的基底。
6.如权利要求1-5中任一项所述的复合层状材料，其中，所述蛋白选自于由如下物质所组成的组:丝纤蛋 白、perculin、abductin、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、角蛋白、肌联蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、Tau蛋白、微管蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、上述蛋白的片段和类似物及衍生物、以及上述物质的任意组合。
7.如权利要求1所述的复合层状材料，其中，所述碳水化合物是壳聚糖，所述蛋白包含丝纤蛋白，且所述壳聚糖与所述丝纤蛋白的比值为1: 1.5到1:2。
8.如权利要求1-7中任一项所述的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底包含具有预定微观形态的至少一个表面，并且将所述蛋白施用至所述表面。
9.如权利要求8所述的复合层状材料，其中，将所述预定微观形态模制到所述基于碳水化合物的基底中。
10.如权利要求1-9中任一项所述的复合层状材料，其中，所述蛋白包含具有预定微观形态的至少一个表面。
11.如权利要求10所述的复合层状材料，其中，将所述预定微观形态模制到所述蛋白中。
12.如权利要求1-11中任一项所述的复合层状材料，所述复合层状材料进一步包含基于碳水化合物的第二基底。
13.如权利要求12所述的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的第二基底为基于壳多糖的基底。
14.如权利要求1-13中任一项所述的复合层状材料，其中，所述复合材料在碳水化合物层或蛋白层的至少一个中包含选自于由如下物质所组成的组中的分子:碳纤维；碳纳米管；玻璃纤维；小分子；聚合物；蛋白；肽；拟肽；核酸；有机化合物；无机化合物；晶体材料；生物化合物；生物学活性化合物；具有生物活性的化合物；生物试剂；药剂或治疗剂；以及上述物质的任意组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述分子处于所述碳水化合物层中。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述分子与所述碳水化合物层共价连接。
17.如权利要求14所述的方法，其中，所述分子处于所述蛋白层中。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述分子与所述蛋白层共价连接。
19.如权利要求14-18中任一项所述的复合层状材料，其中，所述晶体材料是碳酸钙。
20.如权利要求1-19中任一项所述的复合层状材料，所述复合层状材料在至少部分所述复合材料上进一步包含防水涂层。
21.如权利要求20所述的复合层状材料，其中，所述复合材料由聚对二甲苯组成。
22.如权利要求20-21中任一项所述的复合层状材料，其中，当暴露至水性环境时，所述复合材料表现出随所述防水涂层在部分复合材料上的位置而变化的机械性能。
23.一种形成复合层状材料的方法，所述方法包括:提供基于碳水化合物的基底，并使所述基于碳水化合物的基底与蛋白溶液接触。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于如下物质的基底:壳多糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖、甘露糖寡糖、糖原、淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、葡萄糖胺聚糖(例如，透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等)、纤维素、3 -葡聚糖(酵母聚糖、香菇多糖、西佐糖)、麦芽糖糊精、菊粉或果聚糖3 (2 — 6)。
25.如权利要求23-24中任一项所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于壳聚糖的基底。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，所述蛋白选自于由如下物质所组成的组:丝纤蛋白、perculin、abductin、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、角蛋白、肌联蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、Tau蛋白、微管蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、上述蛋白的片段和类似物及衍生物、以及上述物质的任意组合。`
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，所述碳水化合物与所述蛋白的比值为10:1到约1:10。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的材料的溶液进行脱水而形成。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的材料的溶液包含酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述酸选自于由如下物质所组成的组:衣康酸、聚衣康酸、乌头酸、尿酸、葡糖醛酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、4-氯丁酸、3-氯丁酸、2-溴丁酸、2-氯丁酸、亚氯酸、次氯酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸、麦德鲁姆酸、氢氟酸、氢氰酸、硫化氢、正磷酸、亚硫酸、碳酸、弱碱的共轭酸、以及上述物质的任意组合。
31.如权利要求29-30任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过施用碱性溶液来中和所述基于碳水化合物的材料。
32.如权利要求30所述的方法，其中，所述碱性溶液包含选自于由如下物质所组成的组中的碱:氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化锶、氢氧化锂、氢氧化铷、碳酸钠和氨；或所述碱性溶液为高pH缓冲液。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述高pH缓冲液为碳酸盐缓冲液。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的材料的溶液进行冷冻干燥而形成。
35.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过向基于碳水化合物的材料的溶液中注入气泡而形成。
36.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过将基于碳水化合物的溶液纺丝以形成纤维来形成。
37.如权利要求23-33中任一项或权利要求35所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于壳多糖的溶液进行电纺丝以形成纤维来形成。
38.如权利要求22-32中任一项或权利要求35所述的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的溶液进行旋喷式纺丝以形成纤维来形成。
39.如权利要求23-38中任一项所述的方法，所述方法进一步包括诱导所述蛋白的 转变。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述¢-转变通过用下述的一种或多种试剂处理所述蛋白来诱导，所述试剂包括醇、有机溶剂、水溶液；或者所述¢-转变通过施加应力、压力或加热来诱导。
41.如权利要求23-40中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将选自于由如下物质所组成的组中的被运载材料引入至所述复合材料中:碳纳米管；玻璃纤维；小分子；聚合物；蛋白；肽；拟肽；核酸；有机化合物；无机化合物；晶体材料；生物化合物；生物学活性化合物；具有生物活性的化合物；生物试剂；药剂或治疗剂；以及上述物质的任意组合。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述被运载材料共价连接至所述复合材料。
43.一种复合物质，所述复合物质通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成。
44.一种假体装置，所述假体装置包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
45.一种组织工程化支架，所述组织工程化支架包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
46.一种药物输送装置，所述药物输送装置包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
47.一种可植入材料，所述可植入材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
48.一种材料，所述材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质，所述复合物质含有矿物或结晶材料。
49.一种透明薄膜，所述透明薄膜包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
50.一种多层材料，所述多层材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质。
51.一种多层材料，所述多层材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质，所述多层材料含有另外的组分以提供定制的机械性能。
52.—种材料，所述材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质，所述材料包含防水涂层材料。
53.—种材料，所述材料包含通过权利要求23-42中任一项所述的方法形成的复合物质，所述材料含有可变的防水涂层材料区域，从而提供具有可变柔性的区域。
54.—种形成复合层状材料的方法，所述方法包括: 将基于壳多糖的材料溶于酸性溶液中； 通过蒸发溶剂，形成所述基于壳多糖的材料的基于壳多糖的结构； 用碱溶液对所述基于壳多糖的结构进行处理，从而中和质子化的氨基基团； 对所述基于壳多糖的结构进行洗涤； 任选地，对所述基于壳多糖的结构进行脱水； 将蛋白溶液施用至所述基于壳多糖的结构，从而在基于壳多糖的结构上产生具有至少一个蛋白层的复合材料； 对所述处于基于壳多糖的结构上的所述蛋白层进行干燥； 用基于醇的溶液对所述复合材料进行处理，从而诱导所述蛋白的P -转变。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述基于壳多糖的材料与所述蛋白的比值为10:1 到 1:10。
56.如权利要求54-55中任一项所述的方法,其中,所述基于壳多糖的材料为壳聚糖。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中，所述蛋白为丝心蛋白。
58.如权利要求54-57中任一项所述的方法,其中,所述酸性溶液包含乙酸。
59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中，所述碱溶液包含NaOH。`
60.如权利要求54-59中任一项所述的方法，其中，所述基于醇的溶液包含甲醇。
61.一种复合物质，所述复合物质通过权利要求54-60中任一项所述的方法形成。
62.一种将医学植入装置粘附至组织或器官的方法，所述方法包括:将有效量的转谷氨酰胺酶施用至所述组织或器官的表面，并使所述医学植入装置与所述组织的表面接触。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述医学植入装置包含转谷氨酰胺酶。
64.一种将医学植入装置粘附至组织或器官的方法，所述方法包括:使所述医学植入装置与所述器官接触，其中，所述医学植入装置包含有效量的转谷氨酰胺酶。
65.如权利要求64所述的方法，所述方法进一步包括将有效量的转谷氨酰胺酶施用至所述组织的表面。
66.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为哺乳动物转谷氨酰胺酶。
67.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶(mTgase)。
68.如权利要求62-67中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为钙非依赖性转谷氨酰胺酶。
69.如权利要求62-68中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶选自于由如下物质所组成的组:因子XIII A (纤维蛋白稳定因子)、1型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)、2型转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶，tTgase)、3型转谷氨酰胺酶(表皮转谷氨酰胺酶)、4型转谷氨酰胺酶(前列腺转谷氨酰胺酶)、5型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶X)、6型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Y)、7型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶V)、以及上述物质的任意组合。
70.如权利要求62-69中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶配制成如下剂型:溶液剂、乳剂、气雾剂、泡沫剂、软膏剂、糊剂、洗剂、粉末剂、凝胶剂、水凝胶剂、水胶体剂、微粒剂、纳米颗粒剂或乳膏剂。
71.如权利要求62-70中任一项所述的方法，其中，所述医学植入装置选自于由如下物质所组成的组:人工组织、人工器官、假体装置、药物输送装置、伤口敷料、膜、泡沫、海绵、止血材料、以及上述物质的任意组合。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述医学植入装置为选自于由如下物质所组成的组中的伤□敷料:绷带、纱布、胶带、网片、网状物、橡皮膏、膜、膜状物、贴片、微粒、纳米颗粒、以及上述物质的任意组合。
73.如权利要求71所述的方法，其中，所述医学植入装置是泡沫。
74.如权利要求62-73中任一项所述的方法，其中，所述医学植入装置包含蛋白，并且其中所述蛋白可由转谷氨酰胺酶交联。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述医学植入装置涂覆有所述蛋白。
76.如权利要求74-75中任一项所述的方法，其中，所述蛋白为丝纤蛋白。
77.如权利要求62-76中任一项所述的方法，其中，将所述转谷氨酰胺酶涂覆于所述医学植入装置的表面上。
78.如权利要求62-77中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述医学植入装置非共价连接。
79.如权利要求62-78中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶的有效量为所述组织或器官与所述医学植入装置之间的接触表面积每cm2约I y g到约lOOmg。
80.如权利要求62-79中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予伤口愈合试剂。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述伤口愈合试剂选自于由如下物质所组成的组:右泛醇；生长因子；酶、激素；聚乙烯吡咯酮-碘化物；脂肪酸；消炎剂；抗生素；抗微生物剂；防腐剂；细胞因子；凝血酶；镇痛剂；阿片；氨基氧化物；呋咱氮氧化物；亚硝基硫醇；硝酸盐与花色苷；核苷，如腺苷；以及核苷酸，如二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP);神经递质/神经调质，如乙酰胆碱和5-羟色胺(血清素/5-HT);组胺和儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素；脂质分子，如鞘氨醇-1-磷酸酯和溶血磷脂酸；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；肽，如缓激肽、P物质和钙基因相关肽(CGRP)氧化氮；以及上述物质的任意组合。
82.如权利要求62-81中任一项所述的方法，其中，所述医学植入装置由生物相容的可生物降解材料制得。
83.如权利要求62-82中任一项所述的方法，其中，所述医学植入装置由权利要求1-21中任一项所述的复合材料制得。
84.如权利要求62-83中任一项所述的方法，其中，所述施用包括增高主体转谷氨酰胺酶的表达或活性。
85.一种在有需要的受试者中促进伤口愈合的方法，所述方法包括将有效量的转谷氨酰胺酶施用至伤口表面，并使伤口敷料与所述伤口接触，其中，所述伤口敷料包含权利要求1-21中任一项所述的复合材料。
86.如权利要求85所述的方法，所述方法进一步包括将泡沫施用至所述伤口，其中，所述泡沫包含权利要求1-21中任一项所述的复合材料。
87.如权利要求85-86中任一项所述的方法，其中，所述伤口选自于由如下伤口所组成的组:割伤和撕裂伤、手术切口、穿刺伤、擦伤、抓伤、压迫伤口、磨伤、摩擦伤口、慢性伤口、溃疡、热作用伤口、化学伤口、由病原性感染造成的伤口、供体与受体皮肤移植部位、免疫应答病症、口部伤口、胃部伤口或肠部伤口、受损的软骨或骨骼、截肢部位和角膜病损。
88.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为哺乳动物转谷氨酰胺酶。
89.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶(mTgase)。
90.如权利要求85-89中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为钙非依赖性转谷氨酰胺酶。
91.如85-90权利要求中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶选自于由如下物质所组成的组:因子XIII A (纤维蛋白稳定因子)、1型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)、2型转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶)、3型转谷氨酰胺酶(表皮转谷氨酰胺酶)、4型转谷氨酰胺酶(前列腺转谷氨酰胺酶)、5型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶X)、6型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Y)、7型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Z)、以及上述物质的任意组合。
92.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶配制成如下剂型:溶液剂、乳剂、气雾剂、泡沫剂、软膏剂、糊剂、洗剂、粉末剂、凝胶剂、水凝胶剂、水胶体剂、微粒剂、纳米颗粒剂或乳膏剂。
93.如权利要求85-92中任一项所述的方法，其中，所述伤口敷料选自于由如下物质所组成的组:绷带、纱布、胶带、网片、网状物、橡皮膏、膜、膜状物、贴片、以及上述物质的任意组合。
94.如权利要求85-93中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述伤口敷料相结合。`
95.如权利要求94所述的方法，其中，将所述转谷氨酰胺酶涂覆于所述伤口敷料的表面上。
96.如权利要求94-95中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述伤口敷料非共价连接。
97.如权利要求85-96中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶的有效量为每cm2伤口面积约Iug到约IOOmg0
98.如权利要求85-97中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者给予伤口愈合试剂。
99.如权利要求98的方法，其中，所述伤口愈合试剂选自于由如下物质所组成的组:右泛醇；生长因子；酶、激素；聚乙烯吡咯酮-碘化物；脂肪酸；消炎剂；抗生素；抗微生物剂；防腐剂；细胞因子；凝血酶；镇痛剂；阿片；氨基氧化物；呋咱氮氧化物；亚硝基硫醇；硝酸盐与花色苷；核苷；核苷酸；神经递质/神经调质，如乙酰胆碱和5-羟色胺(血清素/5-HT);组胺和儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素；脂质分子，如鞘氨醇-1-磷酸酯和溶血磷脂酸；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸)；肽，如缓激肽、P物质和钙基因相关肽(CGRP)氧化氮；以及上述物质的任意组合。
100.如权利要求85-99中任一项所述的方法，其中，所述施用包括增高主体转谷氨酰胺酶的表达或活性。
101.如权利要求85-99中任一项所述的方法，其中，所述施用在接触所述医学植入装置或所述伤口敷料之前、之后或期间进行。
高强度壳多糖复合材料及其制造方法
[0001] 相关申请
[0002] 根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求美国临时申请号61/378,056 (2010年8月30日提交)的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明针对的是由碳水化合物和蛋白形成的有机复合材料。具体而言，本发明涉及由蛋白(如丝心蛋白)和壳聚糖(Chitosan)层形成的复合生物相容材料,所述材料具有较高弓虽度与消倉泛性(energy—dissipating properties)。
背景技术
[0005] 壳多糖是在自然界中广泛使用的聚合物。在真菌细胞壁、软体动物壳以及节肢动物的外骨骼中发现了壳多糖。由于其机械性能，壳多糖提供了许多结构用途。已进行了许多尝试来将该聚合物用作目前的合成塑料的替代物；然而，在实验室中未能够再现其杰出的自然性能。由于未能明白由自然结构中所存在的壳多糖相关蛋白以及由活生物体产生的天然材料的层状微结构所发挥的重要的结构作用，从而缺乏成功。
[0007] 在现有技术中，通过将处 于溶液中的壳多糖和蛋白(如丝纤蛋白)这两种材料进行简单混合，来生产两者的掺和物(blends)。这些方法意在通过将处于溶液中的壳多糖/壳聚糖和丝纤蛋白这两种聚合物进行混合、并对混合物进行浇铸(casting)，来生产这两种聚合物的一致性混合物(consistent mixtures)。该方法在混合物的机械性能方面相对于其组分并没有产生任何改善，并且由于两种聚合物的相互作用(干扰了相互的分子结构和晶体结构)，通常产生了甚至更弱的材料。
[0008] 丝纤蛋白是公知的聚合物材料。由于出色的机械性能、生物相容性和生物降解性，对于生物材料和组织工程而言，丝提供了材料选项的重要集合。丝聚合物和丝纤蛋白包括蚕丝心蛋白以及昆虫丝蛋白或蜘蛛丝蛋白(Lucas等，Adv.Protein Chem, 13:107-242(1958))。丝心蛋白优选从包含溶解后的蚕丝或蜘蛛丝的溶液中获得。通常，对来自丝的丝心蛋白聚合物(或蛋白)进行处理，从而在实质上去除丝胶蛋白(sericin)。蚕丝蛋白从例如家蚕(Bombyx mori)中获得,而蜘蛛丝是从例如棒络新妇蜘蛛(Nephila clavipes)中获得。或者，适用于本发明中的丝蛋白可从含有基因工程化丝的溶液中获得，例如从细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物中获得。参见，例如WIPO公开号W01997/108315和美国专利5，245，012，以引用的方式将其并入本文。
[0009] 丝纤蛋白具有出色的成膜能力，并且在人体中使用时也是相容的。由于无规卷曲的蛋白结构占优势，丝纤蛋白膜无需进一步的操作或处理便可溶于水。蛋白的结构特征通过包括机械拉伸、极性有机溶剂中浸溃或水蒸气中固化在内的多种处理可从无规卷曲转变为折叠结构。不希望受理论的束缚，还已知使用高度浓缩的丝溶液来促进从无规卷曲转变为¢-折叠。这一结构转变导致了水不可溶性，从而提供了将该材料用于一系列生物医学及其它应用中的选择。一些纯丝纤蛋白膜倾向于随时间在干燥状态下变得硬而脆，然而，却表现出出色的拉伸强度及低的延展性。此外，可将溶解后的丝纤蛋白与颗粒物质混合以生产均匀的混合物，所述混合可形成可植入结构。制造丝聚合物结构和丝纤蛋白膜的方法在WIPO公开号W02009/0100280和W02010/0042798中示出，以引用的方式将两者并入本文。
发明内容
[0010] 本发明涉及用碳水化合物聚合物(如寡糖和多糖)和形成复体3D结构的方法以及由该方法所得到的复合材料，所述复体3D结构具有高度控制的形状(shape)、形态(topography)和材料性质。本发明还涉及用蛋白对这些结构进行的序列修饰以改善具体特征，例如，通过使用丝纤蛋白来限制材料的机械性能、以及用抗水涂层对材料的不同区域进行涂覆以改变水合作用。所得到的复合材料具有优于任何组分材料的增强的机械强度性质，并且该强度性质无法由任何组分材料预知。
[0011] 根据本发明的实施方式，可提供下述的一种或多种性能。
[0012] 本发明的一个目的在于提供制造由蛋白和基于碳水化合物的聚合物的层形成的复合材料的方法。例如，由蛋白和基于壳多糖的材料的层形成的复合材料。
[0013] 本发明的另一目的在于提供制造由丝心蛋白和基于碳水化合物的聚合物的层形成的复合材料的方法。例如，制造由丝心蛋白和基于壳多糖的材料的层形成的复合材料的方法。
[0014] 本发明的另一目 的在于提供由基于碳水化合物的聚合物与蛋白形成的复合材料，相比于其组分材料，所述复合材料具有较好的机械性能。例如，由基于壳多糖的材料与蛋白形成的复合材料，相比于其组分材料，所述复合材料具有较好的机械性能。
[0015] 本发明的另一目的在于提供由壳聚糖与丝心蛋白形成的复合材料，相比于其组分材料，所述复合材料具有较好的机械性能。
[0016] 本发明的另一目的在于提供由基于碳水化合物的聚合物和蛋白形成的复合材料，所述复合材料具有可调节的机械性能。例如，由基于壳多糖的材料与蛋白形成的复合材料，所述复合材料具有可调节的柔性性能(flexibility properties)。
[0017] 本发明的另一目的在于提供由壳聚糖与蛋白形成的复合材料，所述复合材料具有可调节的机械性能。
[0018] 本发明的另一目的在于提供由壳聚糖与蛋白形成的复合材料，所述复合材料生物相容并可生物降解，但在潮湿的情况下稳定。
[0019] 在查看下述的附图、具体实施方式和权利要求书后，将更全面地理解本发明的这些性能和其它性能以及发明本身。附图说明[0020] 图1A表示的是本发明所述复合材料的图示，该复合材料模拟了昆虫表皮和甲壳动物外骨骼的天然层状结构。壳聚糖膜(蓝色)与分离的丝心蛋白相(黄色)结合。
[0021] 图1B表示的是称为“Shrilk”的、本发明所述的壳聚糖-丝心蛋白膜的图片(尺度线为 2.3cm)。
[0023] 图1D表示的是Shrilk复合材料、壳聚糖、丝心蛋白以及丝心蛋白-壳聚糖掺和物的韧性模量(灰色，左竖轴)与断裂强度(黑色，右竖轴)的图(具有SD误差棒)。
[0024] 图2A表示的是在不同的壳聚糖:丝心蛋白比值下根据本发明制造的Shrilk复合材料的断裂强度。短划线标明了在不存在蛋白的情况下壳聚糖膜的断裂强度。
[0025] 图2B表示的是Shrilk层状物内的壳聚糖-丝心蛋白界面的扫描电子显微照片(SEM)图片。较暗的材料(顶部)对应于壳聚糖层，而较亮的材料(底部)为丝心蛋白层(尺度线为20 u m)。
[0026] 图2C表示的是水合样品的重量相对于丝心蛋白:壳聚糖含量而变化的曲线图。线性拟合假定各相独立吸附，并显示出聚合物层之间没有相互作用。线性拟合的斜率是8.20mg, y 截距是 18.89mg。
[0027] 图2D表示的是根据本发明制造的干燥Shrilk复合材料(红色)和水饱和Shrilk复合材料(蓝色)在断裂点处的机械应变的图(具有SD误差棒)。
[0028] 图3A表示的是根据本发明通过将蛋白层沉积在微观结构化的壳聚糖膜上而制造的Shrilk复合材料的形态(尺度线=100 u m)。
[0029] 图3B表示的是部分表面被微观结构化的复合材料管道。对蛋白层的区域进行处理以形成开口区域(白色箭头)，该开口区域显示出了下面的壳聚糖层(尺度线=lmm)。
[0030] 图3C表示的是Shrilk的表面微观形态(microtopography),其中，该结构在丝心蛋白层中形成(尺度线=50 u m)。
[0031] 图3D表示的是在更高放大倍数下更加详细的、根据本发明制造的结构化的表面(尺度线=5 Pm)。
[0032] 图3E表示的是包含根据本发明制造的、壳聚糖和丝心蛋白的多个重复层的多层材料(1、2和3表示壳聚糖-丝心蛋白层状物的3个顺序层)。
[0034] 图4B表示的是根据本发明制造的复合层状材料的FTIR光谱。清楚地观察到了来自丝心蛋白的酰胺I与酰胺IK分别是1640cm—1和1536cm—1)以及壳聚糖(95001^-1850(^1)的大量的多糖结构。
[0035] 图4C表示的是丝心蛋白(黑色)和根据本发明制造的复合层状材料中的丝心蛋白(灰色)的FTIR光谱。
[0036] 图5表示的是将以圆柱形泡沫或海绵(sponge)结构制造的Shrilk复合材料与单独的壳聚糖进行比较的图片。
[0037] 图6A表示的是根据本发明制造的矿化泡沫复合材料结构。[0038] 图6B表示的是来自图6A插图中高度多孔材料的放大部分。
[0040] 图8表示的是具有开放切口的组织块。
[0041] 图9表示的是用于对分离的组织块进行粘合的基于壳聚糖的膜(Shrilk)。
[0042] 图10表示了将转谷氨酰胺酶(即白色粉末)在组织上沉积。
[0043] 图11表示的是通过在经转谷氨酰胺酶处理的组织上使用图9的基于壳聚糖的膜来封闭组织切口。
[0044] 图12表示的是三天后来自图11的样品。
[0045] 图13表示的是遵循与图10-图12相同程序的样品，但是所述样品具有更高浓度的脂肪。
[0046] 图14表示的是图13中的样品的横向切口(traversal cut),其中，可清楚地看到膜。
[0047] 图15表示的是开有孔的组织块。
[0048] 图16表示的是用转谷氨酰胺酶处理 并在顶部具有基于壳聚糖的泡沫的、来自图15的样品。
[0049] 图17表示的是在处理后的空穴中插入基于壳聚糖的泡沫块。
[0050] 图18表示的是用基于壳聚糖的膜(类似于图9中的膜)覆盖图17的样品。将所述壳聚糖膜下的区域也用转谷氨酰胺酶进行处理以促进交联。
[0051] 图19表示的是与图18中的样品相同、但在三天后的样品。将该样品沿孔穴的直径进行切割，以观察泡沫/组织的粘合情况。
[0052] 图20表示的是与图19中的样品相同、但从不同角度来看的样品。
[0053] 图21和图22表示的是与泡沫和组织间的界面更近的图像。还观察到该膜清楚地附着于泡沫。
[0054] 图23A-图23D表示的是对膜与生物组织粘附强度的分析。该组织是解剖后的家猪(“Sus domesticus”)腰部组织。图23A表示的是由壳聚糖-丝心蛋白膜覆盖的组织块的图片，所述膜以酶法附着至组织(如插图中所示)。组织块中做出了一个沟槽以示出所述膜可容易地遵循复杂的几何学。图23B表示的是通过牵拉来移除膜(T-剥离试验)。将该膜从右向左移除。插图示出了 T-剥离试验的原理。图23C表示的是由T-剥离试验得到的测量结果。图23D是表示在下述情况下，剥离Icm宽的膜所需的平均力度的柱状图:通过酶粘附附着至组织(Shr+tTG);无任何促进剂，仅膜在组织上(Shr);两个组织块通过酶粘附而胶着的粘附力(tTG)、膜与基于氰基丙烯酸盐/酯的胶(亦称为“超强力胶，superglue")的胶着力(Cyn)。正如所看到的，酶粘附(Shr+tTG)不仅明显高于天然组织的粘附力，并且非常接近于氰基丙烯酸盐/酯的粘附力，同时方法和材料均完美相容且可生物吸收。
[0055] 图24是显示出甚至在极端条件下聚对二甲苯(parylene)涂层也是有效的防潮层的柱状图。干燥样品对应于简单涂覆的Shrilk (标准条件)，而“水合后”是与基于水的环境处于平衡的Shrilk (浸溃24h)。在这一环境中并仅具有I微米厚的涂层的情况下，样品强度在标准条件下为约80% (84MPa)。
[0056] 图25是显示出粘附至真皮组织(猪)的柱状图。因为表皮的最外层通过角质化作用产生，该作用包括用转谷氨酰胺酶对这一层进行强烈(天然)处理。因此，在通过转谷氨酰胺酶处理进行结合方面，这一层可能是受试者中仅有的无可用基团(groups)的组织。结果证实，没有观察到通过转谷氨酰胺酶进行的结合。然而，当最外层轻微受损并且第二层暴露时，通过转谷氨酰胺酶进行的结合得以成功，如下述实验中所示:其中，shrilk结合至真皮而非表皮。在图25中，Tg-1到Tg-5:用转谷氨酰胺酶处理的样品；No Tg-2:未用转谷氨酰胺酶处理的样品；以及真皮+Tg:在转谷氨酰胺酶存在的情况下粘附至真皮。这显示在皮肤处理中，可将shrilk用作“贴片”(例如绷带)。
具体实施方式
[0057] 本发明涉及由碳水化合物聚合物以及一种或多种蛋白形成的复合材料，以及将这些复合材料制造成有用结构的方法。本发明针对的是包含组分材料层的复合材料。根据本发明，可由所得到的复合材料制造具有高度控制的形状、形态和材料性质的复体3D结构。
[0058] 在一些实施方式中，复合材料具有[(蛋白层)X:[(碳水化合物层)y:(蛋白层)JJn的结构，其中，m、n、y和Z独立地为大于等于I的整数；并且x为0或大于等于I的整数。
[0059] 通常，n、m、y和z独立地为从I到IO6的整数。例如，m、n、y和z可各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20。类似地，x 可为 0 或从 I 到IO6 的整数。例如，X 可为 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20。
[0060] 在一些实施方式中，复合材料包含一个或多个碳水化合物层:蛋白层，例如，m是l、n是I到106、x是0、y是l、z是1，并且该复合材料具有[碳水化合物层:蛋白层]„的结构。在一些实施方式中，m是I ;11是1、2、3、4、5、6、7、8或9 ;x是0 ;y是I ;并且z是I。
[0061] 在一些实施方式中，复合材料包含一个碳水化合物层和一个蛋白层，例如，m、n、y和z是1，并且x是0，该复合材料具有碳水化合物层:蛋白层的结构。
[0062] 在一些实施方式中，复合材料包含三个碳水化合物层和三个蛋白层，例如，m、y、z是1，x是0，并且n是3，该复合材料具有[碳水化合物层:蛋白层]3的结构。
[0063] 在一些实施方式中，复合材料最外层(outer most layer)是蛋白层,例如，m是I到106，并且11、^7和2都是1，该复合材料具有蛋白层:(碳水化合物层:蛋白层)m的结构。
[0064] 在一些实施方式中，复合材料包含一个碳水化合物层和两个蛋白层，例如，m、n、x、y和z都是1，该复合材料具有蛋白层:碳水化合物层:蛋白层的结构。
[0065] 在一些实施方式中，复合材料包含一个碳水化合物层以及两个以上的蛋白层，例如，m是l,n是I到106,x是0,y是l,z是2到IO6,该复合材料具有[(碳水化合物层):(蛋白层)Jn的结构。在一些实施方式中，n是1，X是0，y是1，并且z是2到106，复合材料具有碳水化合物层:(蛋白层)z的结构。在一些实施方式中，z是2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0066] 在一些实施方式中，复合材料具有[(碳水化合物层)p:[(蛋白层)，:(碳水化合物层)Jt]u的结构，其中，P、q、r、t和u独立地为大于等于I的整数。
[0067] 通常，P、q、r、t和U独立地为从I到IO6的整数。在一些实施方式中，P、q、r、t和u 独立地为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20。
[0068] 在一些实施方式中，复合材料最外层是碳水化合物层，例如，p、q、r和U是1，并且t为I到106，该复合材料具有碳水化合物层:[蛋白层:碳水化合物层]t的结构。在一些实施方式中，复合材料包含两个碳水化合物层和一个蛋白层，例如，P、q、r、t和u都是1，该复合材料具有碳水化合物层:蛋白层:碳水化合物层的结构。
[0069] 碳水化合物层和蛋白层相互可具有共同边界(coextensive)或不具有共同边界。换句话说，可用蛋白层涂覆碳水化合物层的全部表面，或者可用蛋白层仅涂覆碳水化合物层的部分表面。
[0070] 根据本发明的一个实施方式，用蛋白制造复合结构以及对作为组分的基于碳水化合物的材料的序列修饰可提供具体特征的改善。在一些实施方式中，所得到的复合材料具有显著高于任何组分的机械强度性能。在一些实施方式中，本发明复合材料的机械强度比任何一种组分材料的机械强度高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍。
[0071] 在一些实施方式中，本发明复合材料的机械强度比组分材料的总机械强度高至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍。
[0072] 此外，本发明的复合材料具有极低的密度。在一些实施方式中，复合材料的密度小于 2g/cm3、小于 1.9g/cm3、小于 1.8g/cm3、小于 1.7g/cm3、小于 1.6g/cm3、小于 1.5g/cm3、小于 1.4g/cm3、小于 1.3g/cm3、小于 1.2g/cm3、小于 1.lg/cm3、小于 lg/cm3、小于 0.9g/cm3、小于0.8g/cm3、小于 0.7g/cm3、小于 0.6g/cm3、小于 0.5g/cm3、小于 0.4g/cm3、小于 0.3g/cm3、小于0.2g/cm3、小于 0.lg/cm3、小于 0.05g/cm3。
[0073] 复合材料的密度可如ASTM规范D792-00所述进行计算。根据ASTM规范标准D792-00,复合材料的密度(P )以g/cm3计为:
[0074]..
[0075] 其中:Wa是挂于空气中时的样品重量；Ww是挂持样品的线材(部分浸溃)的重量是完全浸溃入蒸馏水中的样品以及挂持样品的线材(部分浸溃)的重量；P #是在试验温度下以g/cm3计的蒸馏水密度(例如，在23°C下是0.9975g/cm3)。尽管上述讨论与水有关，但是可使用其它液体代替水。或者，除上述外，如ASTM规范D1505中所述，可应用用于测量塑料密度的密度梯度技术。
[0076] 复合材料的密度可以在任意合适的温度和压力下测定。在一些实施方式中，复合材料的密度在0 V到25 V的温度下测定。例如，密度可以在(TC、5°C、10°C、15°C、20°C或25°C下测定。在一些实施方式中，复合材料的密度在IOOkPa或101.325kPa的压力下测定。
[0077] 在一些实施方式中，复合材料的密度处于标准条件的温度和压力下。无任何限制的情况下，标准条件的温度和压力可以是国际理论和应用化学联合会(IUPAC)或美国国家标准与技术研究院(NIST)定义的温度和压力。现行版本的IUPAC标准是温度为0°C而绝对压力为IOOkPa,而NIST版本是温度为20°C而绝对压力为101.325kPa。
[0078] 在一些实施方式中，密度在(TC和IOOkPa下、在(TC和101.325kPa下、在15°C和101.325kPa 下、在 20。。和 101.325kPa 下、在 25。。和 101.325kPa 下、在 25。。和 IOOkPa 下、在20。。和IOOkPa下、在15。。和IOOkPa下、在20。。和101.3kPa下进行测量。
[0079] 在一些实施方式中，复合材料包含外侧的防水涂层。本文所使用的术语“防水”是指可针对液态与气态水的屏障物(即，针对液体水和水蒸气)。通常，如通过水蒸气透过试验ASTM96进行的测定，防水涂层具有小于I的渗透率(permeability)。示例性的防水材料包括但不限于:聚对二甲苯、聚二甲基娃氧烧、聚乙烯、乙烯基聚合物(polyvinyl)、聚丙烯、聚酯、胶乳、油、有机溶剂、蜡、脂质、脂肪酸酯、固醇酯、长链醇、棕榈酸蜂花酯、鲸蜡醇棕榈酸酯、羊毛脂、小烛树腊(candelila wax)、小冠巴西棕腊(ouricury wax)、甘鹿腊、retamo腊、希蒙得木油(jojoba oil)、石腊和上述物质的任意组合。
[0080] 可通过将复合材料浸没入有机溶液(例如，防水材料的溶液)中，和/或通过保护一些区域免受水合作用(例如，通过复合材料表面上的防水蜡材料的微接触印刷图案)、并允许其它区域受到水合作用，而用防水层对复合材料进行涂覆。通常，有机溶液对碳水化合物层和/或蛋白层具有亲合力。在一些实施方式中，有机溶液含有蜡或蜡和蛋白。或者，复合材料可通过将防水材料层沉积到复合材料的至少一个表面上而防水。在一些实施方式中，通过防水材料的气相沉积对复合材料进行涂覆。还可将防水材料图案化，在相邻于对水接触不敏感的区域产生对水接触敏感的区域，从而产生在其表面上机械性能和降解性发生变化的复合材料。
[0081] 在一些实施方式中，复合材料的至少一个表面包含例如一层或多层聚对二甲苯外侧涂层。聚对二甲苯是各种化学气相沉积的聚(对亚二甲苯基)聚合物的商品名，是USP的VI类中的生物相容聚合物。示例性的聚对二甲苯包括但不仅限于:聚对二甲苯A、聚对二甲苯AF-4、聚对二甲苯AM、聚对二·甲苯C、聚对二甲苯D、聚对二甲苯E、聚对二甲苯HT、聚对二甲苯N、聚对二甲苯SF和聚对二甲苯X。在三种最常见类型的聚对二甲苯中(聚对二甲苯C、聚对二甲苯D和聚对二甲苯N)，聚对二甲苯C在工业上应用最广泛。使用聚对二甲苯的优点包括其已证明的生物相容性、强度和柔性(例如，杨氏模量=4GPa)、保形无针孔室温沉积(conformal pinhole-free room-temperture deposition)、低介电常数(=3)和高体积电阻系数(> 1016Q-cm)、透明度和采用标准微制造技术进行操作的简易性。因此，可将聚对二甲苯涂层用于在复合材料上生成生物相容的防水涂层。可将聚对二甲苯涂层图案化，从而在相邻于非疏水或非生物相容区域处产生疏水或生物相容区域。不希望受理论的束缚，可生成在其表面上具有不同生物相容性、机械性能或降解性的复合材料。碳水化合物聚合物
[0082] 本文所使用的术语“基于碳水化合物的聚合物”包括但不仅限于包含具有式C111(H2O)n单体的寡聚物或多聚物，其中，m和n彡3，并且m和n可以相同或不同。优选m和n独立地为3、4、5、6或7。基于碳水化合物的聚合物包括但不限于如寡糖、多糖、糖蛋白和糖脂等化合物。
[0083] 在本发明这一方面及其它方面的一些实施方式中，碳水化合物聚合物包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个糖单体。
[0084] 不受任何限制，碳水化合物聚合物包含独立地选自于由如下物质所组成的组中的糖单体:赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、唾液酸、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、岩藻糖、墨角藻糖(fuculose)、鼠李糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、辛糖、硫代奎诺糖和壬糖(神经氨酸)；其中，糖可被任选取代。没有任何限制，各糖可独立地具有L-构型或D-构型。
[0085] 两个糖单体之间的键可独立地具有a -构型或P -构型。此外，两个糖之间的键可以是 I — 3、1 — 4、1 — 5 或 I — 6。
[0086] 在一些实施方式中，糖单体的至少一个(例如，1、2、3或4个)羟基被氨基基团取代。在一些实施方式中，糖单体2-位上的羟基被氨基基团取代。氨基可任选地由(^-(:6烷基或酸基取代。优选的C1-C6烧基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基和叔丁基。个优选的酸基基团是乙酰基。
[0087] 在本发明这一方面及其它方面的一些实施方式中，碳水化合物聚合物包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上)的二糖、三糖或四糖单体，所述单体独立地选自于由下述单体所组成的组:蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、¢, ¢-海藻糖、a，¢-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖(gentibiose)、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖(palatinose)、gentibiulose、甘露二糖、蜜二糖、芸香糖、rutinulose、木二塘、棉子糖、松三糖、阿卡波糖和水苏糖。
[0088] 本文所使用的术语“寡糖”是指(无任何限制)数个(例如，5到10个)共价连接的单糖单元。本文所使用的术语“多糖”是指(无任何限制)多个(例如，11个以上)共价连接的糖单元。多糖可具有直到数百万道尔顿的分子量。示例性的寡糖和多糖包括但不仅限于:果糖寡糖、半乳糖寡糖、甘露糖寡糖、糖原、淀粉(直链淀粉(amylase )、支链淀粉)、葡萄糖胺聚糖(例如，透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等)、纤维素、^ -葡聚糖(酵母聚糖、香菇多糖、西佐糖)、麦芽糖糊精、菊粉、^ -果聚糖(2 — 6)、壳多糖和壳聚糖。
[0089] 在本发明这一方面及其它方面的一些实施方式中，碳水化合物聚合物是壳多糖或其衍生物。一个优选的壳 多糖衍生物是壳聚糖(a -(1-4)2-氨基-2-脱氧-P -D-葡聚糖)及其衍生物。示例性的壳聚糖衍生物包括但不仅限于:N-(氨基烷基)壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、季铵化的壳聚糖、N-酰化壳聚糖(例如，己酰基壳聚糖、辛酰基壳聚糖、十四酰基壳聚糖和棕榈酰基壳聚糖)、N-亚甲基膦酸壳聚糖、N-月桂基-N-亚甲基膦酸壳聚糖、N-月桂基-羧甲基壳聚糖、N-烷基-0-硫酸化壳聚糖、巯基化壳聚糖(例如，壳聚糖-2-亚氨基四氢噻吩、壳聚糖-4-硫代丁基脒和壳聚糖-巯基乙酸)和磷酸化壳聚糖。
[0090] 本领域技术人员熟知可用于合成碳水化合物聚合物的合成方法。参见例如，Stick, R.V., Carbohydrates:The Sweet Molecules of Life ；Academic Press,第113-177页(2002) ;Crich，D.与 Dudkin V.，J.Am.Chem.Soc.，123:6819-6825 (2001) ；Garegg, P.J., Chemtracts-Org.Chem.,5:389 (1992) ；Mayer, T.G., Kratzer, B.和 Schmidt, R.R.， Synthesis of a GPI anchor of the yeast Saccharomyces cerevisiae， Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.，33:2177-2181 (1994) ; Seifert，J.，Lergenmul I er，M.和 I to，Y.，Synthesis of an a-(2，3)-sialylated complex-type undecasaccharide, Angew.Chem.1nt.Ed.，39:531-534 (2000) ；Wang, Z.-G.等，Toward fully synthetic homogeneousglycoproteins: a high mannose core containing glycopeptide containing carryingfull H-type2human blood group specifity，Angew.Chem.1nt.Ed.，40:1728-1732(2001) ；Caruthers, M.H., Gene synthesis machines:DNA chemistry and its uses，Science,230:281-285 (1985) ；Sears, P.和 Wong，C._H.，Toward automated synthesisof oligosaccharides and glycoproteins，Science，291:2344-2350 (2001) ；Zhang,Z.等，Programmable one-pot oligosaccharide synthesis, J.Am.Chem.Soc.，121:734-753(1999)；Nishimura, S.,Automated glycosynthesizer’Golgi’by mimicking biosyntheticprocess，Tanpakushitsu Kakusan Koso，48:1220-1225 (2003)；Plante, 0.J.,Palmacci, E.R.和 Seeberger，P.H.，Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides，Science，291: 1523-1527 (2001) ；Andrade, R.B.，Plante, 0.J.，MeIean，L.G.和Seeberger,P.H.，Solid-phase oligosaccharide synthesis!preparation of complexstructures using a novel I inker and different glycosylating agents，Org.Lett.1，1811-1814 (1999) ；Love, K.R.和 Seeberger，P.H.，Automated solid-phasesynthesis of protected tumor-associated antigen and blood group determinantoligosaccharides, Angew.Chem.1nt.Ed., 43:602-605 (2004)；以及 Seeberger，P.H.和Werzj D.B.，Synthesis and medical applications of oligosaccharides，Nature，446:1046-1051 (2007)，以引用的方式将上述内容全部并入本文。
[0091]蛋白
[0092] 通常，可被诱导形成有序结构(例如，从无规卷曲和/或螺旋结构到P -折叠)的任何蛋白都可用于制造本发明的复合材料。通过用加热、机械拉伸、浸溃于有机溶剂(例如，乙醇、甲醇)中以及在水蒸气中固化进行处理，蛋白可从无规卷曲转变为3 -折叠形式。参见例如，Hu 等，41Macromolecules，3939-48 (2008);Jin 和 Kaplan，424Nature，1057-61 (2003)；Canetti 等，28Biopolymers-Peptide Sc1.，1613-24 (1989)；以及 Jin 等，15Adv.Funct.Mat.,1241-47 (2005)，以引用的方式将上述内容全部并入本文。在一些情况中，使用高度浓缩的蛋白溶液还可促进从无规卷曲转变为¢-折叠。不希望受理论的束缚，这一结构转变导致了水不溶性，因此，提供了将此类材料用于一系列生物医学及其它应用(例如传感器平台)中的选项。参见例如，Zhang，16Biotechnol.Adv.，961-71 (1998)，以引用的方式将其内容并入本文。
[0093] 在一些实施方式中，蛋白是丝蛋白或者其类似物或衍生物。在一些实施方式中，丝蛋白为丝心蛋白。丝蛋白可为天然存在的丝蛋白(例如，从蚕茧中抽取的丝)或丝样蛋白或聚合物(silk like protein or polymer)。本领域已知许多丝样蛋白和聚合物并适合于本发明。参见例如，Asakura等，Production and characterization of a silk-like hybridprotein, based on the polyalanine region of Samia cynthia ricini silk fibroinand a cell adhesive region derived from fibronectin，Biomaterials，25(4):617-624(2004);Yang，M和 Kawamura，J.,Development of silk-like materials based on Bombyxmori and Nephila clavipes dragline silk fibroins， Polymer，50 (I):117-124(2009) ;Barr，L A.，Fahnestock, S.R.和 Yang，J.，Production and purification ofrecombinant DPlB silk-like protein in plants,Molecular Breeding，13 (4):345-356(2004) ；Anderson, J.P.，Cappello，J.和 Martin，D.C.，Morphology and primary crystalstructure of a silk-like protein polymer synthesized by genetically engineeredEscherichia coli bacteria,Biopolymers,34 (8):1049-1058 (2004);Huang，J.，Foo，C.ff.P.和Kaplan, D.L.,Biosynthesis and Applications of Silk-like and Collagen-likeProteins, Polymer Reviews,47 (1) 29-62 (2007) ；Yao, J.和 Asakura, T.，Synthesisand Structural Characterization of Silk-Like Materials Incorporated with anElastic Motif, J.Biochem.,133 (1):1147-1154 (2003) ;Yang 等，Silklike materialsconstructed from sequences of Bombyx mori silk fibroin, fibronectin, and elastin,J.Biomed.Mater.Res.Part A,84A (2):353-363 (2007);以及 Werten 等，Biosynthesis ofan Amphiphilic Silk-LikePolymer,Biomacromolecules,9 (7): 1705-1711 (2008),以弓I用的方式将上述内容全部并入本文。Hardy和Scheible给出了引入有丝的聚合物和蛋白的综述，Hardy, J.G.和 Scheibel, T.R.，Biochem.Soc.Trans.,36:677-681 (2009)，以引用的方式将其内容并入本文。
[0094] 不希望受理论的束缚，丝纤蛋白具有出色的成膜能力，并且也生物相容，且可接受用于人体中。Altman 等，24Biomats, 401-16(2003)；Vepari 和 Kaplan, 32Prog.Polym.Sc1.，991-1007 (2007)。丝纤蛋白膜在润湿状态时具有良好的溶氧渗透率(dissolved oxygenpermeability),类似于人皮肤,表明了这些膜在伤口敷料和人工皮肤系统方面的潜在应用。Minoura 等，IlBiomats,430-34 (1990) ;Minoura 等，31Polymer, 265-69 (1990a)。然而，由于无规卷曲蛋白结构占优势，由丝纤蛋白形成的膜无需进一步的操作即可溶于水。
[0095] 此外，丝纤蛋白的结构特征通过用加热、机械拉伸、浸溃于有机溶剂(如乙醇、甲醇)中、在水蒸气中固化进行处理可从无规卷曲转变至3 -折叠形式。通过使用高度浓缩的丝心蛋白溶液还可诱导丝纤蛋白形成¢-折叠。
[0096] 在本文所述各方面的一些实施方式中，蛋白选自于由如下物质所组成的组:perculin、abductin、纤维蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白(elastin)、节肢弹性蛋白(resilin)、纤连蛋白、纤维蛋白原、角蛋白、肌联蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、Tau蛋白、微管蛋白、底板反应蛋白(F-spondin)、皮卡丘素、蛋白片段、合成肽、蛋白的基因表达部分、上述蛋白的片段、以及上述物质的任意组合。
[0097] 复合材料的特征 可通过使用除丝蛋白或丝样蛋白外的蛋白、蛋白混合物和/或通过向蛋白层中并入非蛋白分子来调节(例如增强)。例如，可将弹性蛋白或节肢弹性蛋白用于蛋白层，或加至碳水化合物层和/或蛋白层以提高弹性(elasticity)。类似地，可将perlucin用于蛋白层或加至碳水化合物层和/或蛋白层以改善矿化作用。
[0098] 在本文所述各方面的一些实施方式中，复合材料在该复合材料的至少一个碳水化合物层或蛋白层中包含选自于由下述物质所组成的组中的分子:碳纤维；碳纳米管；玻璃纤维；小分子；聚合物；蛋白；肽；拟肽(peptidomimimetics);核酸；有机化合物；无机化合物；晶体材料；生物化合物；生物学活性化合物；具有生物活性的化合物；生物试剂；药剂或治疗剂；以及上述物质的任意组合。
[0099] 复合材料的合成
[0100] 本发明的复合材料可通过在适合表面上制备碳水化合物层和蛋白层的交替层来制备。基于碳水化合物的基底(如膜)可首先通过对碳水化合物溶液(例如，碳水化合物聚合物溶液)进行干燥来准备。在一些实施方式中，基于碳水化合物的基底处于酸溶液中。一些示例性的酸包括但不仅限于:衣康酸、聚衣康酸、乌头酸(acontic acid)、尿酸、葡糖醛酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、4-氯丁酸、3-氯丁酸、2-溴丁酸、2-氯丁酸、亚氯酸、次氯酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸、麦德鲁姆酸(Meldrum’ s acid)、氢氟酸、氢氰酸、硫化氢、正磷酸、亚硫酸、碳酸、弱碱的共轭酸。不受任何限制，处于溶液中的酸浓度可为约0.l%w/v到约10%w/v。在一些实施方式中，溶液含有约l%w/v到约2%w/v的酸。在一些实施方式中，该酸是在25°C下具有小于10_2酸电离常数(Ka)的弱酸。在一些实施方式中，该酸是乙酸。
[0101] 可对所制备的碳水化合物基底进行洗涤和进一步的修饰和/或中和。取决于所制备基底的特性，可将酸性溶液或碱性溶液用于对基底进行修饰和/或中和。示例性的碱包括但不仅限于:氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化锶、氢氧化锂、氢氧化铷、碳酸钠和氨。不受任何限制，处于中和溶液中的碱浓度可为约0.l%w/V到约10%w/v。在一些实施方式中，溶液含有约4%w/v到约6%w/v的碱。在一些实施方式中，中和溶液是PH缓冲液，例如，高pH的碳酸盐缓冲液。高pH的缓冲液意味着pH高于7、8、9、10、11、12以上的缓冲液。
[0102] 如果需要的话，可使用本领域技术人员已知的用于如下目的的方法将任何剩余的水分子从碳水化合物基底移除。例如，可使用有机溶剂、如醇(例如甲醇、乙醇)对膜进行洗涤。此外，本领域公知制备碳水化合物膜的方法，并可用于制备此膜。参见例如，Ito，R.和 Matsuo, Y.编著，Handbook of Carbohydrate Polymers:Development, Properties andApplications,Nova Science Pub.1nc.(2010);以及 Richert 等，Langmuir, 20 (2):448-58(2004)，以引用的方式将上述内容并入本文。
[0103] 然后，可通过将碳水化合物基底浸入蛋白溶液中，从而用蛋白层进行涂覆。或者，可通过在碳水化合物基底上沉积蛋白溶液层，从而用蛋白层进行涂覆。通常，可将任意比例(例如重量比或摩尔比)的蛋白/碳水化合物用于形成复合材料。在一些实施方式中，碳水化合物与蛋白的比例是10:1到1:10。在一些实施方式中，碳水化合物与蛋白的比例是5:1到1:5、2.5:1到1:2.5、1.15:1到1:1.15。在一些实施方式中，该比例是1:1.5到1:2.5。在一些实施方式中，比例 是1:2。该比例可基于加入至用于形成各层的溶液中的碳水化合物和蛋白的干重或摩尔数。
[0104] 通常，碳水化合物溶液含有约l%w/v到约50%w/v的碳水化合物聚合物。在一些实施方式中，碳水化合物溶液含有约l%w/v到约25%w/v的碳水化合物。在一些实施方式中，碳水化合物溶液含有约2%w/v到约6%w/v的碳水化合物。不希望受理论的束缚，在一些实施方式中，使用了高浓度碳水化合物溶液。例如，在一些实施方式中，碳水化合物溶液含有约50%w/v到约95%w/v的碳水化合物。在一些实施方式中，碳水化合物溶液含有约75%w/v到约85%w/v的碳水化合物。
[0105] 类似于碳水化合物溶液，蛋白溶液含有约l%w/v到约50%w/v的蛋白。在一些实施方式中，蛋白溶液含有约l%w/v到约25%w/v的蛋白。在一些实施方式中，蛋白溶液含有约2%w/V到约6%w/V的蛋白。
[0106] 可任选对蛋白层进行处理以诱导蛋白结构方面的变化，例如从纤维状到晶体状、从a-螺旋到¢-折叠，反之亦然。例如，可对蛋白层进行处理以诱导形成晶体结构。在一些实施方式中，可对蛋白层进行处理以诱导形成¢-折叠或类似结构。在一些实施方式中，对蛋白层进行处理以诱导P转变。诱导蛋白结构变化的示例性方法包括但不限于:使用高浓度的蛋白溶液、加热、冷冻、机械拉伸、压力、用有机溶剂(如乙醇、甲醇)浸溃或洗涤、在水蒸气中固化。
[0107] 通过层连层设计(layer-by-layer design)可对蛋白层本身进行构建。例如,可用第一层蛋白对碳水化合物基底进行涂覆。然后，可用第二层相同或不同的蛋白对由此涂覆的碳水化合物进行涂覆。可重复这一方法，直到总的蛋白层达到合适的厚度。在每次用蛋白涂覆后，可任选对蛋白层进行处理以诱导蛋白结构方面的上述变化。
[0108] 通常，复合材料具有约I U m到约500 u m的厚度。在一些实施方式中，复合材料具有约I u m到约250 u m、约I u m到约150 u m、约I u m到约100 u m、约I u m到约75 u m、约Ium 至Ij约 50 u m、约 Ium 至Ij约 25 u m、约 Ium 至Ij约 20 u m、约 Ium 至Ij约 15 u m、约 Ium 至Ij约10 u m、或约I y m到约5 y m的厚度。
[0109] 复合材料中的各碳水化合物层和蛋白层的厚度可独立地从数埃到数毫米，例如从约I A到约5mm。在一些实施方式中，各碳水化合物层的厚度可独立地为约Ium到约250 u m0在一些实施方式中，各碳水化合物层的厚度独立地选自于由如下厚度所组成的组:约 I U m 至Ij约 100 u m、约 I U m 至Ij约 75 u m、约 Ium 至Ij约 50 u m、约 I u m 至Ij约 40 u m、约 I u m 至Ij约 30 u m、约 Ium 至Ij约 25 u m、约 Ium 至Ij约 20 u m、约 Ium 至Ij约 15 u m、约 Ium 至Ij约 10 u m、以及约Ium到约5i!m。在一些实施方式中，所有的碳水化合物层具有相同的厚度。在一些实施方式中，至少两个碳水化合物层具有不同的厚度。
[0110] 类似地，复合材料中的蛋白层厚度也可独立地从数埃到数毫米，例如从约I A到约5mm。在一些实施方式中,各蛋白层的厚度独立地从约I ii m到约250 u m。在一些实施方式中，各蛋白层的厚度独立地选自于由如下厚度所组成的组:约Iiim到约lOOiim、约Iiim到约 75 u m、约 Ium 至Ij约 50 u m、约 Ium 至Ij约 40 u m、约 Ium 至Ij约 30 u m、约 Ium 至Ij约 25 u m、约I U m到约20 u m、约I u m到约15 u m、约I u m到约10 u m、以及约I U m到约5 u m。在一些实施方式中，所有的蛋白层具有相同的厚度。在一些实施方式中，至少两个蛋白层具有不同的厚度。
[0111] 在一些实施方式中 ，蛋白层的厚度是碳水化合物层厚度的0.1倍到约5倍。在一些实施方式中，蛋白层的厚度是复合材料中的碳水化合物层厚度的约0.25倍、约0.5倍、约0.75倍、约I倍、约1.25倍、约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.5倍、或约5倍。
[0112] 在一些实施方式中，复合材料的所有层具有相同的厚度。在一些实施方式中，复合材料的至少两层具有不同的厚度。具有不同厚度的至少两层可为具有相同组分的层(例如，碳水化合物层或蛋白层)，或为至少一个碳水化合物层和至少一个蛋白层。
[0113] 在一个非限制性实例中，复合材料通过制备壳聚糖膜形成。壳聚糖膜可通过如下步骤制备:对处于酸、例如乙酸中的壳聚糖溶液进行干燥，随后使用例如NaOH对膜进行中和。壳聚糖膜使用例如甲醇任选脱水，甲醇促进了链间水分子的释放。所得到的经干燥壳聚糖膜可变得水合性更低和更脆。然而，例如通过将壳聚糖膜浸入丝心蛋白水溶液中，使壳聚糖膜与蛋白、例如丝心蛋白的涂层进行结合，并使所得到的复合材料干燥，产生具有显著改善的强度特征的复合层状膜。根据本发明的一个实施方式，当壳聚糖膜以丝心蛋白:壳聚糖为约1:1到4:1 (优选2:1.5-2:1) (w/w)的比例与丝心蛋白结合时,所得到的复合材料显示出比起单独的壳聚糖显著更高的强度特征。
[0114] 根据本发明的可选实施方式，复合材料可由中等分子量的壳聚糖制造。具有中等分子量和高度脱乙酰化的壳聚糖材料(Sigma Aldrich)可在l%v/v乙酸中以2%w/v溶解。可将所得到的6mL溶液倒于9cm直径的皮氏培养皿，并且溶剂在37°C下挥发。可将所得到的膜在4% (w/v) NaOH中浸没5_15分钟、例如10分钟，以中和质子化的氨基基团并避免进一步的溶解。可将所得到的壳聚糖膜在去离子水(DI)中剧烈洗涤以移除剩余的NaOH，然后，任选在37°C下干燥。壳聚糖的最终厚度可为7 V- m-13 u m、例如10 u m。
[0115] 壳聚糖-丝心蛋白层状复合物的制造
[0116] 根据本发明的一个实施方式，将来自家蚕的脱胶后的丝(可从Mielke’s FiberArts (USA)得到)用于形成蛋白层。可将丝在DI水中洗涤数次，然后于60°C下以10%w/V在80% (w/v) LiBr中溶解6小时。将溶解后的丝在截留分子量为12_14kDa的透析管(VffR Scientific, USA)中用水进行透析。不断地换水使透析进行3、4或5天。可通过称重(XS205，Mettler Toledo, USA)来测量丝心蛋白的终浓度。所得到的丝心蛋白的浓度为2-6%、例如约 4% (w/v)。在 WIPO 公开号 W02005/012606、名称为 “Concentrated AqueousSilk Fibroin Solution and Uses Thereof ”的专利申请中详细描述了用于生产水性丝纤蛋白溶液的可选方法，以引用的方式将其内容并入本文。
[0117] 可将丝心蛋白溶液沉积在固定于9cm直径皮氏培养皿底部的壳聚糖膜上，并在37°C下干燥。可将所得到的复合膜在甲醇中浸溃25-35分钟、例如30分钟，以推动蛋白的^转变(并防止进一步的溶解)，再用DI水进行洗涤。在其它实施方式中，可通过其它诱导剂诱导3转变，所述诱导剂包括醇、有机溶剂、水溶液、施加压力和/或加热。
[0118] 图1A和图1B示出了本发明所述的复合材料样品。图1A示出了本发明一个实施方式所述的复合材料的图片，其中，壳聚糖膜(蓝色)粘合至丝心蛋白层(绿色)，模拟了天然层状结构，所述结构提供了昆虫表皮和甲壳动物外骨骼及其新的机械性能。图1B示出了复合层状材料的图片，在这一实例中，所述复合层状材料为透明薄膜(15um)(尺度线为2.3cm)。
[0119] 微观形态
[0120] 根据本发明的实 施方式，可通过在聚二甲氧基硅烷(PDMS)模具(通过将聚合物浇铸于结构化的硅表面上制造)与平的碳水化合物层或膜之间浇铸蛋白溶液，来产生所得复合膜的预定微观形态。然后，对复合膜进行处理，以诱导蛋白结构方面的变化，例如，从纤维状变为晶体状、从a-螺旋变为¢-折叠，反之亦然。例如，可对蛋白层进行处理以诱导晶体结构的形成。在一些实施方式中，可对蛋白层进行处理以诱导¢-折叠或类似结构的形成。在一些实施方式中，对蛋白层进行处理以诱导¢-转变。可对复合材料进行干燥并从模具中剥离。[0121 ] 在非限制性实例中，可通过在聚二甲氧基硅烷(PDMS)模具(通过将聚合物浇铸于结构化的硅表面上制造)与平的壳聚糖膜之间浇铸丝心蛋白溶液，来产生所得复合膜的预定微观形态。水可在37°C下挥发数小时，再将复合材料从模具中剥离。在非结构化的复合材料的情况中，将样品用甲醇处理，以推动P -转变，并在DI水中洗涤。
[0122] 根据本发明的实施方式，可通过将蛋白沉积于结构化的碳水化合物膜上产生所得复合膜的微观形态。碳水化合物膜可通过已知方法(例如，使碳水化合物溶液在PDMS模具上干燥)进行结构化。然后，如本文所述，可对结构化的碳水化合物薄膜进一步处理，以生产本发明所述的结构化复合材料。
[0123] 在一个非限制性实例中，可通过将丝心蛋白沉积于结构化的壳聚糖膜上产生所得复合膜的微观形态。壳聚糖膜可通过已知方法(例如，使处于溶液中的壳聚糖在PDMS模具上干燥)进行结构化。如本文所述，可对结构化的壳聚糖进一步处理，以生产本发明所述的结构化复合材料。
[0124] 图3示出了本发明实施方式所述的浇铸物。图3A示出了通过将蛋白相沉积于结构化的壳聚糖膜上形成的本发明所述复合材料的形态(尺度线=100 y m)。图3B示出了部分表面结构化且部分表面未结构化的本发明所述复合材料的管道。白色箭头指向蛋白层上的开口，揭示了在下面的壳聚糖层(尺度线=lmm)。图3C示出了根据本发明实施方式形成的复合材料的形态，其中，在丝心蛋白中形成结构化的表面(尺度线=50 iim)。图3D示出了更详细的图3C的结构化表面。壁上的水平带是模具的深反应离子蚀刻标记的复制品(尺度线=5um)0图3E示出了根据本发明实施方式形成的多层复合壳聚糖-丝心蛋白材料的多个层的SEM图像。线条之间的数字是指3个不同的壳聚糖层(尺度线=50 u m)。
[0125] 应力/应变测量
[0126] 将经干燥的复合材料的样品剪切为1.5cm宽X 8cm长的条状物，并用Instron3342(500N, Instron, USA)进行测试。样品的厚度用显微镜(Axio Observer, Zeiss,德国)以膜5处不同点的平均值来进行测量。厚度测量在接受SEM分析的样品中也得到确证。
[0127] 图1C示出了将本发明所述的复合材料与单独的组分进行比较的应力-应变曲线。如图所示，比例为1:2的复合壳聚糖-丝心蛋白层状材料(本文称为“Shrilk”)的强度实质上高于壳聚糖的强度或非层状壳聚糖-丝心蛋白掺和物(通过将均处于液相的壳聚糖和丝心蛋白混合而产生)的强度。丝心蛋白膜非常脆(图1C中未示出数据)，具有3.14MPa的低断裂强度(在图1C中示出)。图1D示出了复合Shrilk材料以及组分材料的韧性模量和断裂点。如图所示，复合层状Shrilk材料的韧性模量和断裂点实质上均高于壳聚糖、丝心蛋白或未结构化的壳聚糖-丝心蛋白掺和物。
[0128] 图2A示出了强度特征随复合层状材料中的壳聚糖与丝心蛋白的比值的变化情况。图2A示出了当壳聚糖与丝心蛋白的比值为1:2时，复合材料的断裂强度显著高于单独的壳聚糖的断裂强度。图 2B示出了层状复合物内的壳聚糖-丝心蛋白界面的SEM图像。
[0129] 如上所示，根据本发明制造的复合材料具有与掺和物相同的组分和含量，然而，复合材料模拟了自然结构(例如，昆虫表皮中的结构)，强了几乎十倍。此外，出乎意料的是，特定构型的“Shrilk”复合层状材料中的壳聚糖和丝心蛋白的结合几乎为最强组分(S卩，壳聚糖)的两倍。断裂前各材料所能吸收的单位体积的能量(即，韧性模量，图1D)进一步阐明了本发明所述的壳多糖/蛋白复合材料的预料不到的性能。本来可预期的是，向壳聚糖中加入非常脆的材料、例如丝心蛋白将产生弱于壳聚糖但强于丝心蛋白的材料(例如，掺和物)时，所得到的“Shrilk”复合层状材料在断裂前相比于壳聚糖吸收了 1.5倍的能量。
[0130] 因此，在断裂前，比起作为组成部分的碳水化合物膜，复合材料可吸收至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍的能量。
[0131] 相比于常用材料，复合材料的120MPa的极限强度是尼龙的两倍，并与铝相当。然而，由于复合材料的密度为约1.46g/cm3，壳聚糖-丝心蛋白复合“Shrilk”材料表现出与铝合金及等同物类似的机械特征，但是重量仅为一半。此外，Shrilk为生物相容的并可生物降解，在某些构型中，其还在光学上透明。
[0132] 因此，复合材料比起由作为组成部分的单独的碳水化合物或蛋白或者其掺和物形成的材料更强，达到至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍以上。在一些实施方式中，复合材料具有至少5MPa、至少lOMPa、至少20MPa、至少30MPa、至少40MPa、至少50MPa、至少60MPa、至少70MPa、至少80MPa、至少90MPa或至少IOOMPa以上的强度。
[0133] 在Shrilk中，当壳聚糖:丝心蛋白的重量比为约1:2时，复合材料达到最大强度(图2A)。将蛋白的量增高至高于一定限度后看起来并不会增强结合作用；此外，已观察到将蛋白增高至高于1:2的比值看起来使设计的效果无效，产生机械上接近丝心蛋白的材料。
[0134] 在丝心蛋白/壳聚糖界面的SEM图像中(图2B)，通过材料的不同电学性能清楚地限定了界限，而没有其它分离的证据，证实了两种组分的高度化学亲合性。
[0135] 当将复合材料从用蛋白层涂覆的碳水化合物膜方面进行讨论时，碳水化合物层可处于除膜以外的形式。因此，在一些实施方式中，碳水化合物层可处于泡沫、海绵、纤维、网片(mesh)或纳米结构的形式。
[0136] 通过随着溶液干燥向碳水化合物溶液中注入气泡，或通过使用在泡沫或海绵形成后可被溶解的可浸出材料(例如，盐晶体)，可将本发明实施方式所述的复合材料制成泡沫样材料或海绵样材料(foam-like or sponge-like material)。或者,可通过对碳水化合物溶液进行冷冻干燥形成泡沫或海绵结构。溶剂升华形成气泡的核，该气泡产生泡沫或海绵的多孔结构。有很多方式来控制孔的尺寸。例如，可通过控制冷冻干燥期间的温度、改变溶剂浓度等来控制孔的尺寸。然后，所形成的碳水化合物泡沫或海绵可浸溃入蛋白溶液中或用蛋白溶液涂覆，以产生泡沫样或海绵样结构的复合材料。不受任何限制，仅有部分或全部的基于碳水化合物的泡沫或海绵可用蛋白进行涂覆。
[0137] 关于形成多孔碳水化合物材料的进一步信息可在例如下述文献中发现:Madihally,S.V.和 Matthew·,H.W.T., Porous Chitosan scaffolds for tissueengineering, Biomaterials, 20 (12):1133-1142 (1999);以及 Xu, H.H.K 和 Simon, C.G., Fast setting calcium phosphate—Chitosan scaffold:mechanical properties andbiocompatibility, Biomaterials, 26 (12):1337-1348 (2005)，以引用的方式将两者的内容并入本文。用于形成泡沫的另一感兴趣的选项是使用高压的CO2 (即，超临界的CO2)与固体材料。这一选项主要是通过增高压力(通常在20Bar的范围内)将CO2引入到分子结构中来起作用。当压力释放时，CO2产生材料中的成穴作用。这一方法逐渐流行并被视为“绿色”。
[0138] 所得到的泡沫或海绵可通过如下步骤进行矿化:引入晶体材料(如碳酸钙)，将复合材料泡沫或海绵结构浸溃入晶体材料的过饱和溶液中，使结晶在表面上和空穴中形成。
[0139] 在非限制性实例中，通过随着溶液干燥向壳聚糖溶液中注入气泡，或通过使用在泡沫或海绵形成后可被溶解的可浸出材料(例如，盐晶体)，可将本发明实施方式所述的复合材料制成泡沫样材料或海绵样材料。根据本发明的实施方式，可将壳聚糖泡沫海绵浸溃入丝心蛋白溶液中，或用丝心蛋白溶液涂覆，以产生复合材料的泡沫样结构。所得到的泡沫可通过如下步骤进行矿化:引入晶体材料(例如碳酸钙)，将复合材料泡沫结构浸溃入到处于水中的碳酸钙的过饱和溶液中，并使结晶在泡沫的表面上和气穴中形成。在本发明的一个实施方式中，将任意大量的CaCO3溶于水中，并接受1-3天的20psi的C02。在压力释放后，将所得到的液体过滤以移除未溶的CaC03。在溶液恢复到室温后，可将壳聚糖泡沫或海绵(或膜)浸溃入CaCO3溶液中。
[0140] 在另一非限制性实例中，泡沫或海绵结构可通过将溶于溶液中的壳聚糖冷冻干燥来形成。溶剂升华形成气泡的核，所述产生泡沫或海绵的多孔结构。有很多方式来控制孔的尺寸。例如，可通过控制冷冻干燥期间的温度来控制孔的尺寸。或者，可通过改变溶剂的浓度来控制气泡的尺寸。对于图5和图6中所示的结构，相比于将2%乙酸溶液用于制备壳聚糖膜，将壳聚糖溶于1%的乙酸溶液中。关于形成多孔基底材料的进一步信息可见于例如下述文献中:Madihally, S.V.和 Matthew, H.W.T., Porous Chitosan scaffolds fortissue engineering, Biomaterials, 1999, 20( 12): 1133-1142 ；以及 Xu, H.H.K 和 Simon, C.G.， Fast setting calcium phosphate—Chitosan scaffold:mechanical properties andbiocompatibility，Biomaterials，2005，26 (12): 1337-1348，，以引用的方式将两者的内容并入本文。
[0141] 图5示出了在本发明所述泡沫中制造的复合材料的样品以及处于圆柱形式的基于壳聚糖的泡沫结构。图6A和图6B示出了矿化的泡沫复合材料结构。图6B示出了图6A插图中的放大，其中，所述结构的开口孔清楚可见。
[0142] 根据本发明的实施方式，通过电纺丝可将碳水化合物制成纤维——使用电荷以从碳水化合物溶液中生产碳水化合物聚合物的纤维。例如，可通过向第二溶液中注入碳水化合物溶液使得碳水化合物凝结，来形成碳水化合物纤维。然后，可将凝结物通过小直径的开口挤出以控制纤维的直径。例如，可将处于酸中的碳水化合物溶液注入到碱溶液中，反之亦然。或者 ，可通过调节溶液的盐浓度、通过化学手段和/或机械手段(如，压力、加热或冷却、振荡等)来诱导凝结。关于纤维形成的进一步信息可见于例如下述文献中:Duan, B.,Dong, C.,Yuan X.等，Electrospinning of chitosan solutions in acetic acidwith poly(ethylene oxide), Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition,15 (6):797-811 (2004)和 Ohkawa, K., D.Cha, H.Kim 等，Electrospinning of Chitosan,Macromolecular Rapid Communications, 25 (18):1600-1605 (2004),以引用的方式将两者的内容并入本文。在本发明的可选实施方式中，可通过旋喷式纺丝使碳水化合物形成纤维，如 “Nanofiber assembly by rotary jet-spinning”，Badrossamay MR, McIlwee HA,Goss JA, Parker KK，Nano Lett.，2010 年 6 月 9 日；10 (6) 2257-6 中所述，以引用的方式将其并入本文。
[0143] 在非限制性实例中，通过电纺丝可将壳聚糖制成纤维——使用电荷以从壳聚糖溶液中生产壳聚糖的纤维。根据本发明的一个实施方式，壳聚糖纤维可通过向碱溶液(如NaOH冲注入处于酸(如乙酸冲的壳聚糖溶液形成。壳聚糖在与碱溶液接触时立即凝结，产生壳聚糖的纤维。可将凝结物通过小直径的开口挤出以控制纤维的直径。或者，可使用其它纤维挤出方法，如旋喷式纺丝(例如，Mohammad Reza Badrossamay, Holly Alice Mcllwee,Josue A.Goss,Kevin Kit Parker.,Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning,NanoLett.,2010,10 (6)，第 2257-2261 页)。
[0144] 根据本发明，碳水化合物层可在纳米尺度下形成限定的形态。然后，可将蛋白相施用于限定的纳米尺度形态上。不希望受理论的束缚，各向同性的沉积作用和通过形态引入的物理作用(例如，毛细管作用)产生了在限定区域中的结构降解。例如，将蛋白相施用于结构化的壳聚糖膜上，可在纳米尺度下形成具有限定形态的壳聚糖。该结果(图3A，与图3B和图3C具有相同的形态)显示出，各向同性沉积作用和由形态引入的物理作用(例如，毛细管作用)甚至在极低的丝心蛋白浓度下产生了在限定区域中的结构降解。
[0145] 通过聚合物浇铸还可将蛋白用于制造微观结构。因此，可通过在预先形成的微观结构上浇铸蛋白层来形成微观结构。此外，通过使复合材料在适当形状干燥，可按第二形状(secondary shape)烧铸所得到的复合材料。例如,通过使复合材料在圆形固定物或管道上干燥，可将复合材料浇铸成管。
[0146] 通过在局部区域或在整体上暴露至水，然后放置于模型(form)或固定物上进行干燥并建立第二形状，可使复合材料变得柔性。通过保护一些区域免受水合作用(例如，通过复合材料的表面上的防水蜡材料的微接触印刷图案)、并允许其它区域受到水合作用，可使相同的复合层状材料表现出可变的材料性质，例如基于各自不同的吸水程度的不同程度柔性的区域。不希望受理论的束缚，这一模拟了节肢动物外骨骼的机理获得了其可变的机械性能。
[0147] 丝心蛋白也是用于通过聚合物浇铸制造微观结构的良好材料。根据本发明的实施方式，可通过如图3C和图3D中所示浇铸蛋白层来形成微观结构。此外，可将所得到的复合材料浇铸成第二形状，例如通过使复合材料在圆形的固定物或管道上干燥而浇铸为管(图3B)。或者，通过在局部区域或在整体上暴露至水，然后放置于模型或固定物上进行干燥并建立第二形状，可使复合材料变得柔性。通过保护一些区域免受水合作用(例如，通过Shrilk表面上的防水蜡材料的微接触印刷图案)、并允许其它区域受到水合作用，可使相同的复合层状材料表现出可变的材料性质，例如基于各自不同的吸水程度不同程度柔性的区域。这一模拟了节肢动物外骨骼的机理获得了其可变的机械性能。
[0148] 根据本发明，通过将组分与蛋白、如丝心蛋白进行“胶着(gluing)”，可将组分之间的亲合性用于组装分离的复合材料层或或结构化的组分。这一方法使得复合材料的多个层得以装配，从而制造出复体三维的生物相容结构。在一些实施方式中，通过将蛋白施用至碳水化合物组分的脱水区域(或整个表面)可将碳水化合物组分胶着在一起，从而引起蛋白结构方面的变化、例如¢-转变。
[0149] 因此，在本发明的实施方式中，可将丝心蛋白用于“胶着”壳聚糖结构。在这一实施方式中，通过将丝心蛋白施用至壳聚糖组分的脱水区域(或整个表面)可将壳聚糖组分胶着在一起，并任选地例如通过施用乙醇、压力或加热引起蛋白的¢-转变。
[0150] 根据本发明的实施方式，使用低浓度蛋白溶液(“胶着溶液”)通过“胶着”可将复合材料的第一层(具有连接至第一层碳水化合物的第一层蛋白)连接至复合材料的第二层(具有连接至第二层碳水化合物的第二层蛋白)。在一些实施方式中，胶着溶液提供了小于1:2的碳水化合物/蛋白的比。在一些实施方式中，胶着溶液包含< 4%w/v的蛋白。例如通过使用刮板或滚子(straight edge or squeegee),可将两层复合材料压制在一起并移除任何气泡，从而提供处于碳水化合物层之间的实质上均一的蛋白层。可将所得到的多层复合材料在例如37°C下干燥。可向胶着层中加入另外的不同类型的材料(如碳纤维、碳纳米管或其它强力材料、颗粒或纤维)，以进一步提高材料性能或优化层状材料的期望性质。
[0151] 在非限制性实例中，使用较低浓度(< 4%w/v)的丝心蛋白溶液通过“胶着”可将复合材料的第一层(具有连接至第一层壳聚糖的第一层丝心蛋白)连接至复合材料的第二层(具有连接至第二层壳聚糖的第二层丝心蛋白)，所述丝心蛋白溶液提供了小于2:1的丝心蛋白/壳聚糖的比。例如通过使用刮板或滚子，可将两层复合材料压制到一起并移除任何气泡，从而提供处于壳聚糖层之间的实质上均一的丝心蛋白层。可将得到的多层复合材料在例如37°C下干燥。图3E示出了多层复合材料的SEM横截面图像。所得到的结构具有单层复合材料膜的机械特征(极限强度=116.7±12.3MPa)。如上所述，可向胶着层中加入另外的不同类型的材料(如碳纤维、碳纳米管或其它强力材料、颗粒或纤维)，以进一步提高材料性能或优化层状材料的期望性质。
[0152] Shrilk组分:壳聚糖/蛋白/水
[0153] 对具有恒定壳聚糖厚度和可变丝心蛋白量的、每边长2cm的壳聚糖/蛋白复合材料的正方形样品进行称重，然后浸溃于37°C的DI水中24小时。假设两相独立，在图2C中进行线性近似，并通过下式得出复合材料样品的最终重量:[0154] Wwet=Wcs Acs+fffib Afib (i)
[0155] 其中，Wwet是水合后的复合材料的重量，Wcs和Wfib分别是样品中的壳聚糖和丝心蛋白的干重，Acs和Afib是与其相关联的吸水率。
[0156] 本发明人还发现可用水对复合材料的柔性进行调节。此外，可通过调节水含量使复合材料可逆地从非常刚性的材料(当干燥时)转化为柔性的弹性体(elastomer)，而无关于其它因素、如鞣制(tanning)或组成。图2C示出了通过壳聚糖/蛋白复合材料对水的吸收，提供了相对于壳聚糖/丝心蛋白比值示出的水饱和样品的重量的图。水饱和度取决于样品的体积而非其表面积，并且样品最终重量与两种材料层各自的水摄取量的总和拟合得非常好(R2=0.99);这显示出水的摄取与组分间界面的相互作用无关。由于壳聚糖相的吸水率比丝心蛋白的吸水率高2.3倍，具有更多壳聚糖的样品也就包含更多的水，成为直接关联于其它两种组分的浓度的平衡量。
[0157] 因此，在本文所述方面的一些实施方式中，复合材料是水合后的。本文所使用的关于复合材料的术语“水合后”是指含有水的复合材料。因此，在一些实施方式中，复合材料是水合后的，并包含约5%到约95%的水。水合后的复合材料的水含量可基于复合材料中的水的重量与水合后的复合材料的总重量的比值。或者，水合后的复合材料的水含量可基于复合材料中的水的重量与水合前的复合材料的重量的比值。在一些实施方式中，复合材料的水含量与复合材料中的碳水化合物或蛋白的总量有关。
[0158] 相比于干燥后的复合材料的极限强度，用水饱和复合材料可使复合材料的极限强度减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少I倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍以上。
[0159] 本发明人还发现，在水饱和的复合材料与干燥的对应物之间的显著差异是前者的均化作用，在它们之间不存在显著的机械差异。不希望受理论的束缚，对水引入的变化使其它类型的相互作用无效。此外，在复合材料、碳水化合物和蛋白水合后的膜的机械特征方面没有显著的差异。再次，不希望受理论的束缚，复合材料的突出的机械特征来自于组分的不同的机械性能。
[0160] 在一个非限制性实例中，用水饱和壳聚糖/丝心蛋白复合材料使极限强度降低至平均值3.5MPa，比干燥材料所得值低多于30倍。然而，在屈服(yielding)之前的能量吸收仅减少二分之一；如图2D中所示，剩余的能量储存使弹性显著增高，直至其原始尺寸极限应变的23%，与复合材料干燥时的2.7%形成对比。
[0161] IR 光谱
[0162]用 ^iOOOcnT1 到 SOOcnT1 之间的 2CHT1 的分辨率来得到 IR 光谱(Vertex70, Bruker,德国)，并用Essential FTIR (Operant LLC，美国)进行分析。在傅里叶变换前，通过使用来自壳聚糖膜的单束光谱作为本底信号，获得了复合材料上的丝心蛋白的FTIR数据。
[0163] 从分子学观点出发，通常将壳多糖描述为每个单体上有一个羟基被乙酰氨基团替换的纤维素。图4示出了壳聚糖膜的FTIR分析，并证实了酰胺C=O伸缩(酰胺I，1658cm-1)的特征性吸收，表明了壳多糖的不完全脱乙酰作用。将每一葡糖胺残基的乙酰基基团的比例(即，乙酰化程度)计算为甲基基团谱带(1379CHT1)摆动的两侧吸收谱带的相对强度，如图4中所示，谱带位于13210^1和1417CHT1处。在这些实验所分析的壳聚糖中，20.3±0.7%的葡糖胺基团被乙酰化。
[0164] 如图4B中所示，复合Shrilk材料(壳聚糖与丝心蛋白的比为1:2)示出了非常类似于壳聚糖(图4A，黑色)与丝心蛋白(图4C，黑色)总和的IR吸收光谱。相对于壳聚糖存在胺II谱带迁移(从1562CHT1到1536CHT1),甚至具有非常薄的丝心蛋白层。这一谱带涉及了 C-N伸缩模式与来自酰胺和胺的N-H弯曲模式之间的混合。因此，两相之间的主要的相互作用似乎通过处于壳多糖/壳聚糖糖环2号位的氮原子来产生。
[0165] 如本文所示，复合材料中的不同组分之间的相互作用似乎局限于界面处，通过来自基体材料(bulk material)的信号筛选出新键。为了更详细地探索新的分子键,相比于作为本底的由壳聚糖膜产生的单束光谱，在图4C中以灰色示出复合材料中的丝心蛋白光谱。与纯的丝心蛋白膜进行的比较证实，在约3454CHT1 (自由NH的伸缩)的区域中有明显的缺失，这支持了用初始的自由NH产生新键的假说。此外，除已提到的酰胺II谱带的改变夕卜(由于吸收谱带中在1560CHT1处的缺失)，存在1417CHT1处谱带的显著下降。光谱的所有变化的特质是这些变化位于由壳聚糖中的胺基团(图4A，灰 色)的质子化作用改变的相同谱带处，进一步表明特别是通过这些化学基团产生复合层状材料中的蛋白和壳聚糖之间的键入
口 o
口 o
[0166] 这一观察结果还可解释壳聚糖:丝心蛋白掺和物相比于Shrilk层状物的非常差的机械特征；氮原子似乎通过壳聚糖中的分子间氢键N-HeO-C (处于葡糖胺的第6位)并通过壳多糖中的C-OhH-N间(基体结晶中无游离的OH和NH基团)的氢键直接包含于晶体结构中。因此，与丝心蛋白的相互作用是与壳聚糖链间结合和晶体结构形成进行竞争的过程。
[0167] 根据本发明制成的复合材料是由可生物降解及生物相容的材料制成的有机复合层状材料，具有铝合金的强度、但密度为铝合金的一半。复合材料的强度远高于原来的组分，可成型并适用于很多用途、包括医学应用和非医学应用。另外，它还是在动物学和材料科学中用于研究具有重要意义的天然结构的出色模型。控制复合材料中的水的量使得该材料能够提供宽范围的机械特征，从干燥时非常刚性的复合材料(杨氏模量=5.75±0.48GPa)到用水饱和时极其弹性的材料(杨氏模量=0.017±0.004GPa)。
[0168] 复合材料的用途
[0169] 由于复合材料的生物相容性、高强度以及调节其刚性的能力，可将复合材料用于很多生物医学应用中。例如，可将复合材料用于假体装置、组织工程支架、伤口愈合装置和组件、以及作为塑料及其它合成材料或无机材料的替代物。此外，通过控制复合材料中的水含量，材料的刚性或柔性使其能够用于替代广泛的组织类型和功能，例如，作为支架或其它假体组件。此外，泡沫和海绵结构实施方式的多孔性质使得能够通过在制造过程中或之后将药剂并入孔中，将本发明的实施方式用于进行药物和治疗剂的输送。
[0170] 还可将复合材料用于非医学应用，例如用于工业应用。例如，可将复合材料用于需要轻质高强度材料的任何地方，如用于汽车工业(例如，混合动力车辆、电动车辆和赛车)与航天工业中。还可将复合材料用于替代食品工业中所使用的塑料，例如用于容器和瓶。还可将复合材料用于制造消费品，所述消费品包括但不限于:贮藏容器、行李箱、背包、帐篷、衣服以及一次性垃圾袋。复合材料的其它示例性用途可包括但不限于:防弹窗户、防震窗户、船帆、降落伞、火炮存储器、轮胎、车辆保险杠、防撞护栏和养路设备(例如，塔架(pylons))。此外，可将复合材料用于制造电子装置(如便携式电脑)中的组件。
[0171] 本发明的复合材料具有很多应用，包括例如:药物输送系统、组织工程化材料或其它生物医学装置。用药物、抗生素、细胞应答分子、染料、酶及其它小分子和大分子可容易地使本文所述的所有复合物官能化，并保持其功能。
[0172] 本发明的实施方式由此提供了可适用于组织工程化构造的复合材料，可将所述组织工程化构造用于可能会得益于这些经修饰的丝材料的缺陷修复和器官修复、器官置换或再生策略。本发明的复合物可用于器官修复、器官置换或再生策略，包括但不限于:椎间盘、颅组织、硬膜、神经组织、肝、胰腺、肾、膀胱、脾、心肌、骨骼肌、腱、韧带、角膜组织和乳腺组织。可将本发明的复合物用于缺陷修复，例如，疝修复和伤口闭合以及对医学应用的修复。可将复合材料用作完整或部分的假体以及用于整形外科手术应用中，例如用于支持重建和用于减少伤疤。可向用于培养及可能的植入的组织工程化构造中加入任何类型的细胞，所述细胞包括从供体或已建立的细胞培养系获得、或者甚至在分子基因工程之前或之后获得的如下细胞:肌肉和骨骼系统的细胞，如软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞和骨细胞；实质细胞，如肝细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)；肠来源的细胞；以及其它细胞，如神经细胞、骨髓细胞、皮肤细胞、多能细胞和干细胞(包括例如，胚胎干细胞、成年干细胞与诱导多能干细胞(iPS));以及上述细胞的组合。还可使用组织块，所述组织块在单个结构中可提供很多不同类型的细胞。
[0173] 可对复合物进行修饰以包含至少一种活性试剂。在形成复合材料前，可将所述试剂与碳水化合物和/或蛋白溶液进行混合，或在形成复合材料后，可将所述试剂负载入复合材料或其部分中。所述试剂还可与碳水化合物或蛋白层共价连接。对于共价连接，所述试剂可在复合材料形成前与碳水化合物或蛋白连接。或者，所述试剂可在复合材料形成后共价连接至碳水化合物或蛋白层。因此，所述试剂可通过中间连接头或通过键直接与碳水化合物或蛋白层连接。
[0174] 可用于缀合本发明复合材料的活性试剂种类广泛，并可包括小分子、聚合物、蛋白、肽、拟肽、核酸、有机化合物、无机化合物、生物化合物、生物学活性化合物、具有生物活性的化合物。例如，活性试剂可为治疗剂或生物材料，如细胞(包括干细胞)、蛋白、肽、核酸(DNA、RNA、质粒、siRNA、反义寡核苷酸、诱骗寡核苷酸、微小RNA、适体和核酶)、核酸类似物、核苷酸、寡核苷酸或序列、肽核酸、抗体、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段与变体、细胞因子、酶、抗生素、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子、药物以及上述物质的组合。适合于修饰本发明复合材料的一些示例性活性试剂包括:细胞(包括干细胞)、促红细胞生成素(EPO)、HGSR肽、葡萄糖胺聚糖(GAGs)、透明质酸(HA)、整联蛋白、选择蛋白和钙粘着蛋白；镇痛剂与镇痛剂组合物；类固醇；抗生素；胰岛素；干扰素a和干扰素Y ;白细胞介素；腺苷；化疗剂(例如抗癌剂)；肿瘤坏死因子a和肿瘤坏死因子^ ;抗体；细胞附着介体(如RGD或整联蛋白)；或其它天然衍生或基因工程化的蛋白、多糖、糖蛋白、细胞毒素、前体药物、免疫原或脂蛋白。
[0175] 其它示例性治疗剂包括但不限于见于如下文献中的治疗剂:Harrison’ sPrinciples of Internal Medicine,第 13 版，T.R.Harrison 等编著，McGraw-Hill N.Y.,NY ；Physicians Desk Reference,第50版，1997,Oradell New Jersey,Medical EconomicsC0.!Pharmacological Basis of Therapeutics,第 8 版，Goodman and Gilman,1990 ；United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990 ；Goodman与 Oilman,现行版的 The Pharmacological Basis of Therapeutics ;以及现行版的 TheMerck Index,以引用的方式将上述所有内容并入本文。
[0176] 嵌入复合材料中的其它材料可包括:脂质体和输送遗传物质的相关系统；用于活化细胞信号级联的肽和蛋白；用于促进矿化作用或来自细胞的相关事件的肽和蛋白；用于改善膜-组织界面的粘附肽和蛋白；抗微生物肽；蛋白及相关化合物；以及碳水化合物，包括例如葡萄糖胺聚糖和蛋白聚糖。
[0177] 如上所述，可将一种或多种活性试剂用于修饰复合材料。因此，当将本发明的复合物用作平台来支持生物材料、如细胞时，可期望加入其它材料以促进试剂的增长、促进试剂在从复合物中释放后的功能性、或增高试剂继续存在的能力、或保持试剂在加工期间的效力。已知用于促进细胞生长的示例性材料包括但不限于:细胞生长介质，如DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸和抗生素；以及生长因子与形态发生因子，如成纤维细胞生长因子(例如FGF1-9)、转化生长因子(TGFs)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-1I)、骨形态生长因子(例如BMPs 1-7)、骨形态样蛋白(例如GFD_5、GFD_7和6?0-8)、转化生长因子(例 如，16?-0 ,TGF-^ 1-111)、神经生长因子及相关的蛋白。本领域已知生长因子参见例如Rosen&Thies,Cellular & Mol.Basis Bone Formation & Repair(R.G.Landes C0.)。
[0178] 对胞外基质的酶促结合
[0179] 本发明另一方面提供了将医学植入装置附着至组织或器官的方法。所述方法包括将有效量的转谷氨酰胺酶施用至需要附着医学植入装置的组织或器官表面，并使医学植入装置与组织表面接触。作为替代或除此以外，可将转谷氨酰胺酶施用至医学植入装置表面，并将该医学植入装置与组织表面接触。而且，在另一实施方式中，医学植入装置可与组织表面，随后施用转谷氨酰胺酶。
[0180] 在施用转谷氨酰胺酶的背景下，本文所使用的术语“施用”是指在期望部位增高转谷氨酰胺酶的量或活性。因此，术语“施用”包括将转谷氨酰胺酶局部施用至表面，提高了主体(host)转谷氨酰胺酶在附着部位的表达、和/或提高了转谷氨酰胺酶在附着部位的活性。不希望受理论的束缚，可通过施用提高转谷氨酰胺酶表达和/或活性的组合物来增高主体转谷氨酰胺酶的表达或活性。例如，Davies等，J.Biol.Chem.，( 1985) 260:5166-5174描述了使用视黄酸诱导转谷氨酰胺酶的表达。示例性的转谷氨酰胺酶活化剂包括但不限于:凝血酶、TIG3蛋白、氯化|丐和鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine)。此外，Sigma-Aldrich销售可用于筛选转谷氨酰胺酶活化剂的转谷氨酰胺酶分析试剂盒。
[0181] 本文所使用的“转谷氨酰胺酶”意味着由酶学委员会分类系统号2.3.2.13(EC2.3.2.13)所表示的的酶组中的成员。技术人员所公知的是，转谷氨酰胺酶是催化肽链中的谷氨酰胺残基的Y-氨甲酰基团的酰基转移反应的酶。当蛋白中的赖氨酸残基的e-氨基基团充当酰基受体时，转谷氨酰胺酶在蛋白分子中或蛋白分子之间形成e - (Y-Glu)-Lys交联。当水充当酰基受体时，转谷氨酰胺酶还可使谷氨酰胺残基脱氨基成为谷氨酸。
[0182] 此类转谷氨酰胺酶包括钙非依赖性转谷氨酰胺酶和钙依赖性转谷氨酰胺酶。前者包括来源于微生物的酶(参见例如JP-A-1-27471，以引用的方式将其内容整体并入本文)，而后者包括来源于豚鼠肝脏的酶(参见例如，JP-B-150382,以引用的方式将其内容整体并入本文)、来源于鱼的酶(参见例如，Seki Nobuo等，Nihon Suisan Gakkaishi,第56卷第I期:125 (1990)，以引用的方式将其内容整体并入本文)等。此外，转谷氨酰胺酶包括通过基因重组产生的酶(参见例如，JP-A-1-300889、JP-A-5-199883、JP-A-6-225775，以引用的方式将其内容整体并入本文)。
[0183] 用于本发明方法中的转谷氨酰胺酶可来自于天然来源或合成来源(例如重组)。因此，本文囊括了由哺乳动物组织样品制备(即，提取)的转谷氨酰胺酶以及通过重组手段表达的哺乳动物转谷氨酰胺酶。此外，天然存在的哺乳动物转谷氨酰胺酶的变体也囊括在内。
[0184] 在一些实施方式中，所述转谷氨酰胺酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶。哺乳动物转谷氨酰胺酶可由动物细胞 和组织以及细胞产物获得。
[0185] 在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶是组织转谷氨酰胺酶(tTgase )。
[0186] 在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。微生物转谷氨酰胺酶可从一种或多种吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)菌株、巴氏轮枝链霉菌(Streptoverticillium Baldaccii)> 茂原轮枝链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)或大肠杆菌(Escherichia Coli)中分离。参见例如，Cui L 等，BioresourceTechnology, (2008)，99 (9) =3794-3800,以引用的方式将其内容整体并入本文。
[0187] 在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶是人转谷氨酰胺酶。人转谷氨酰胺酶可由人组织或细胞制备。例如，人转谷氨酰胺酶可从人组织来源(例如，肺、肝、脾、肾、心肌、骨骼肌、晶状体、内皮细胞、红细胞、平滑肌细胞、骨和巨噬细胞)提取。
[0188] 或者，可使用本领域公知的细胞培养方法学，从表达哺乳动物转谷氨酰胺酶的人细胞培养物中获得人转谷氨酰胺酶。此类转谷氨酰胺酶细胞系来源优选包括但不限于:人内皮细胞系ECV304 (用于组织转谷氨酰胺酶)和人骨肉瘤细胞系MG63。
[0189] 在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶是钙非依赖性转谷氨酰胺酶。在一些其它实施方式中，转谷氨酰胺酶是钙依赖性转谷氨酰胺酶。
[0190] 一些示例性转谷氨酰胺酶包括但不限于:因子XIII A (纤维蛋白稳定因子)、1型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)、2型转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶)、3型转谷氨酰胺酶(表皮转谷氨酰胺酶)、4型转谷氨酰胺酶(前列腺转谷氨酰胺酶)、5型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶X)、6型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Y)和7型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶z)。
[0191] 本领域技术人员将了解的是，可根据医学植入材料的具体使用(例如，植入部位)选择转谷氨酰胺酶的来源。例如，如果将医学植入材料用作人工骨骼，包含来源于骨骼的转谷氨酰胺酶对材料来说是有利的。因此，在本发明的方法中，可使用任何转谷氨酰胺酶，其来源和生产方法不受限制。
[0192] 转谷氨酰胺酶可来源于哺乳动物或微生物。此外，还可使用人化的重组转谷氨酰胺酶。
[0193] 一些可商购的转谷氨酰胺酶来源于哺乳动物，如源于豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶、源于山羊的转谷氨酰胺酶和源于兔的转谷氨酰胺酶可从Oriental Yeast C0.Ltd.,Upstate USA Inc.and Biodesign International得到。可商购的转谷氨酰胺酶产品的其它非限制性实例包括:由 Ajinomoto C0.(Kawasaki, Japan)生产的如 Activa TG_T1、ActivaTG-FP、Activa TG-GS、Activa TG-RM 和 Activa MP;以及由 Yiming Biological ProductsC0.(中国，江苏)生产的如TG-B和TG-A等。
[0194] 转谷氨酰胺酶可以任何合适的形式施用，所述合适的形式包括但不限于:溶液剂、乳剂(水包油、油包水)、气雾剂(aerosoI)、泡沫剂、软膏剂(ointment)、糊剂、洗剂(lotions)、粉末剂、凝胶剂、水凝胶剂、水胶体剂、乳膏剂(cream)和上述形式的任意组合。在一个实施方式中，将转谷氨酰胺酶以粉末的形式施用。
[0195] 转谷氨酰胺酶可任选处于药学上可接受的组合物中。药学上可接受的组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的转谷氨酰胺酶。本文所使用的术语“药学上可接受”是指在健全的医疗判断范围内，适合用于与人类和动物的组织相接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0196] 通常,转谷氨酰胺 酶活性在高温(elevated temperature)下增强。因此,键合可在任何温度下进行。在一些实施方式中，键合在高温下进行，如30°C以上、35°C以上、40°C以上、45°C以上、50°C以上、55°C以上或60°C以上。在一些实施方式中，键合在室温下进行，例如约15°C到约25°C。在一些实施方式中，键合在约20°C到约30°C的温度下进行。
[0197] 本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意味着参与将对象化合物从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)、或溶剂包封材料。从与制剂的其它成分相容和对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。一些可作为药学上可接受载体的材料的实例包括:(I)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇(PEG) ;(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；
(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL ; (24)C2-C12醇，如乙醇；和(25)其它可用于药物制剂中的无毒相容性物质。湿润剂、着色剂、隔离剂(release agents)、包衣剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。本文所使用的术语如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等可互换使用。
(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL ; (24)C2-C12醇，如乙醇；和(25)其它可用于药物制剂中的无毒相容性物质。湿润剂、着色剂、隔离剂(release agents)、包衣剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。本文所使用的术语如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等可互换使用。
[0198] 药学上可接受的组合物还可包含用于转谷氨酰胺酶的任何辅因子、如盐。
[0199] 在一些实施方式中，在使医学植入装置附着至组织或器官之前，可将转谷氨酰胺酶与医学植入装置进行结合。在医学植入装置和转谷氨酰胺酶的背景下，术语“结合”是指将转谷氨酰胺酶涂覆于医学植入装置上或以其它方式(共价或非共价)与医学植入装置连接。在一些实施方式中，可将转谷氨酰胺酶分散于用来制造医学植入装置的材料中。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶可共价连接至医学植入装置的表面。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶可非共价连接至医学植入装置的表面。
[0200] 在一些实施方式中，在医学植入装置制造后，可将转谷氨酰胺酶加入至医学植入装置。这可通过例如将制成的医学植入装置浸入转谷氨酰胺酶溶液中完成。
[0201] 包含转谷氨酰胺酶的医学植入装置的附着可能需要或可能不需要将任何另外的转谷氨酰胺酶施用至将发生附着的组织或器官表面。
[0202] 本文所使用的术语“转谷氨酰胺酶的有效量”是指可有效地将医学植入装置连接至组织或器官的转谷氨酰胺酶的量。因此，在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶的有效量为每cm2接触表面积约Iiig到约lOOmg。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶的有效量选自于由下述有效量所组成的组:每cm2约Img到约50mg、每cm2约5mg到约40mg、每cm2约IOmg到约30mg、每cm2约15mg到约25mg或每cm2约20mg。“接触表面积”意味着将与植入装置接触的组织表面积。对于伤口，接触表面积可意味着伤口和/或伤口总暴露区域的尺寸。
[0203] 本文所使用的术语“医学植入装置”是指用于植入受试者机体中的装置。示例性的医学植入装置包括但不仅限于:人工组织、人工器官、假体装置、药物输送装置、伤口敷料、纤维、纳米颗粒(nanoparticle)、微粒(microparticle)、泡沫和海绵。不受任何限制，医学植入装置可处于任何形式，包括但不限于:3D支架、纤维、泡沫、海绵、膜以及上述形式的任意组合。可将医学植入装置用于永久替代器官(机能)。
[0204] 在一些实施方式中，医学植入装置是泡沫或海绵。
[0205] 在一些实施方式中，医学植入装置包含纳米颗粒或微粒。
[0206] 在一个实施方式中，医学植入装置是伤口敷料。示例性的伤口敷料包括但不限于:绷带(bandages)、纱布(gauzes)、胶带(tapes)、网片(meshes)、网状物(nets)、橡皮膏(adhesive plaster)、膜(films)、膜状物(membranes)和贴片(patches)。在一些实施方式中，伤口敷料可包含本文所述的复合材料。
[0207] 在一些实施方式中，医学植入装置不是凝胶。[0208] 在一些实施方式中，医学植入装置与可由转谷氨酰胺酶交联的蛋白结合。在用于医学植入装置的背景下，术语“结合”是指涂覆、含有或包含可连接转谷氨酰胺酶的蛋白(transglutaminase linkable protein)的医学植入装置。在一些实施方式中，医学植入装置涂覆有可连接转谷氨酰胺酶的蛋白。“涂覆”意味着将可连接转谷氨酰胺酶的蛋白施用至医学植入装置的表面。因此，可用包含可连接转谷氨酰胺酶的蛋白的溶液刷涂或喷涂医学植入装置。或者，可将医学植入装置浸入可连接转谷氨酰胺酶的蛋白的溶液中。
[0209] 可连接转谷氨酰胺酶的蛋白可与医学植入装置共价或非共价结合，例如在医学植入装置的外表面。一旦与医学植入装置结合，可连接转谷氨酰胺酶的蛋白提供了将医学植入装置附着至组织或器官的手段。
[0210] 本文所使用的术语“转谷氨酰胺酶可交联”是指充当转谷氨酰胺酶底物的蛋白或多肽。
[0211] 因此，转谷氨酰胺酶可交联蛋白为转谷氨酰胺酶底物或包含转谷氨酰胺酶底物。本文所使用的术语“转谷氨酰胺酶底物”是指与适当转谷氨酰胺酶靶点交联的肽或多肽序列。不受任何限制，可连接转谷氨酰胺酶的蛋白为选自于由下列物质所组成的组中的转谷氨酰胺酶底物、或包含该底物:醛缩酶A、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸化酶激酶、晶体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白、0-微管蛋白3&11、池0、组蛋白、a-酮戊二酸脱氢酶、¢-乳球蛋白、细胞色素、红细胞带III蛋白、⑶38、乙酰胆碱酯酶、胶原蛋白、内功素(entactin)、纤连蛋白、纤维蛋白、丝、丝心蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、骨桥蛋白、巢蛋白(nidogen)、层粘连蛋白、LTBP-1、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨I丐蛋白、血小板反应蛋白、P物质、磷脂酶A2、肝素结合细胞因子(midkine)、小麦明胶、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、豌豆豆球蛋白、白色念珠菌(Candida albicans)表面蛋白、HIV包膜糖蛋白gpl20和gp41、HIV天冬氨酸蛋白酶、丙型肝炎病毒核心蛋白、可结合至转谷氨酰胺酶的上述底物的片段、以及上述物质的组合。在一些实施方式中，可连接转谷氨酰胺酶的蛋白为丝纤蛋白或其可由转谷氨酰胺酶交联的片段。
[0212] 本领域已知与适当转谷氨酰胺酶靶点交联的肽和多肽序列。在例如下述专利中描述了此类肽的非限制性实例:美国专利N0.5，428，014、N0.5，939，385和N0.7，208，171，以引用的方式将上述所有内容并入本文。美国专利N0.5，428，014描述了生物相容、生物粘附、转谷氨酰胺酶可交联的多肽，其中，已知转谷氨酰胺酶催化了蛋白结合的谷氨酰胺酰残基的Y-氨甲酰基团与Lys残基的e-氨基基团之间的酰基转移反应，引起e-(Y-谷氨酰赖氨酸)异肽键的形成。美国专利N0.5，939，385描述了生物相容、生物粘附的转谷氨酰胺酶可交联的多肽。
[0213] 美国专利N0. 7，208，171描述了转谷氨酰胺酶底物肽的合理设计。设计策略是基于将可用于转谷氨酰胺酶交联的酰基供体谷氨酰胺酰-肽底物和可用的酰基受体赖氨酸-肽底物的数量最大化。除此之外，将Lys和Glu底物肽设计为具有已知的生物大分子底物和转谷氨酰胺酶的合成肽底物的基本特征。例如，Glu底物肽含有2-5个连续的Glu残基，这一点基于如下证据:随着Glu重复的长度增加，肽成为更好的转谷氨酰胺酶底物；以及已知含有两个以上相邻Glu残基的蛋白为良好的底物。在数种肽中，将Leu残基置于邻接C端附近的Glu，因为这示出了 Glu特异性的显著增高。关于Lys底物肽，已显示出与肽和蛋白底物中的赖氨酸残基邻接的氨基酸组成与序列可影响胺特异性。最终，在所有的肽中，将Gly残基加入至C端侧，在肽-聚合物缀合物中充当肽和聚合物之间的间隔物，从而使处于该缀合物中的肽可更接近酶。
[0214] 医学植入装置可由任意生物相容材料制造。本文所使用的术语“生物相容材料”是指当植入或放置在邻近于受试者的生物组织时不会随时间而发生可察觉的损害和引起显著的免疫应答或有害的组织反应(例如，毒性反应或显著的刺激)，或者当与血液接触时，不引起凝血或血凝的任何材料。合适的生物相容材料包括，例如聚酰亚胺的衍生物和共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺和聚乙烯胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸盐/酯以及聚苯乙烯。
[0215] 在一些实施方式中，医学植入装置由选自于由下列物质所组成的组中的材料制造:碳水化合物聚合物、蛋白、丝纤蛋白、聚二甲硅氧烷、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯聚砜、聚碳酸盐/酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚醚砜、聚醚醚酮、聚乙二醇、苯乙烯-丙烯腈树脂、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚乙烯醇缩丁醛、聚偏二氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及上述物质的任意组口 o
[0216] 医学植入装置可由可生物降解材料、例如可生物降解聚合物制造。本文所使用的术语“可生物降解”描述了可在生理条件下降解为分解产物的材料。此类生理条件包括例如水解(经由水解分裂的分解)、酶催化(酶促降解)和机械相互作用。本文所使用的术语“可生物降解”还涵盖了术语“可生物吸收”，术语“可生物吸收”描述了下述物质:在生理条件下分解以碎裂成经生物吸收进入主体生物体的产物，即，成为主体生物体的生化体系的代谢物。
[0217] 本文所使用的术语“可生物降解聚合物”，是指在生理条件下至少其部分发生分解的聚合物。该聚合物可因此在生理条件下部分分解或完全分解。
[0218] 示例性的可生物降解聚合物包括但不限于:聚酸酐、聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚硅氧烷、聚己内酯、聚(乳酸-Co-乙醇酸)、聚乳酸、聚乙醇酸和由这些聚合物的单体制备的共聚物。
[0219] 在一些实施方式中，医学植入装置由生物相容的可生物降解材料制造。
[0220] 可用于制造医学植入装置的合适的聚合物包括但不限于选自于由下列物质所组成的组中的一种聚合物或聚合物混合物:碳水化合物聚合物、丝、葡萄糖胺聚糖、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、C2-C4聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚N-乙烯基吡咯烷酮、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-Co-乙醇酸(PLGA)、聚e己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚富马酸丙二醇酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、水解后的聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、聚酸酐、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚硅氧烷、聚己内酯、聚(乳酸-Co-乙醇酸)、聚乳酸、聚乙醇酸、藻酸、藻酸酯、果胶酯酸、果胶酯酸酯、羧甲基纤维素、透明质酸、透明质酸酯、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳多糖、支链淀粉、胶凝糖(gellan)、黄原胶、胶原蛋白、羧甲基淀粉、羧甲基右旋糖酐、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉；以及上述物质的盐和酯。
[0221] 在一些实施方式中，医学植入装置可由碳水化合物聚合物制造。在一个实施方式中，碳水化合物聚合物是壳聚糖或其衍生物。
[0222] 在一些实施方式中，医学植入装置可由可连接转谷氨酰胺酶的蛋白制造。
[0223] 在一些实施方式中，医学植入装置可由本文所述的复合材料制造。
[0224] 任选地，可将伤口愈合剂给予受试者。在一些实施方式中，医学植入装置包含伤口愈合剂。不希望受理论的束缚，伤口愈合剂可在一段时间后从医学植入装置中释放。
[0225] 本文所使用的术语“伤口愈合剂”是积极促进伤口愈合过程的化合物或组合物。示例性的伤口愈合剂包括但不限于:右泛醇；生长因子；酶；激素；聚乙烯吡咯酮-碘化物(povidon-1odide);脂肪酸；消炎剂；抗生素；抗微生物剂；防腐剂；细胞因子；凝血酶；镇痛剂；阿片；氨基氧化物；呋咱氮氧化物(furoxans);亚硝基硫醇；硝酸盐与花色苷(anthocyanins);核苷，如腺苷；与核苷酸，如二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP);神经递质/神经调质，如乙酰胆碱和5-羟色胺(血清素/5-HT);组胺和儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素；脂质分子，如鞘氨醇-1-磷酸酯和溶血磷脂酸；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；肽(如缓激肽、P物质和钙基因相关肽(CGRP)氧化氮；以及上述物质的任意组合。
[0226] 示例性的生长因子包括但不限于:成纤维细胞生长因子(FGF) (FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-a ,FGF-^ )、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素结合生长因子(IGF) (IGF-UIGF-2)、肝素结合生长因子-1、肝素结合生长因子-2、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF) (TGF-a、TGF-^ )、软骨诱导因子-A与软骨诱导因子-B、骨样诱导因子、成骨素、血管内皮生长因子、骨骼生长因子、胶原蛋白生长因子、胰岛素样生长因子、以及上述物质的生物活性衍生物。
[0227] 还可将使医学植入装置附着至组织或器官的方法用于伤口愈合。因此，本发明提供了在有需要的受试者中促进伤口愈合的方法，所述方法包括使转谷氨酰胺酶与伤口表面接触以及使伤口敷料与伤口接触。可将伤口敷料用于覆盖和闭合伤口。可将本文所述的方法和组合物用于伤口的免缝合闭合。
[0228] 本文所使用的术语“伤口 ”是指由物理(例如机械)作用、生物手段(例如热作用或光化作用)或化学手段造成的组织结构完整性或连续性的物理破坏。尤其是，术语“伤口”涵盖了皮肤伤口。术语“伤口”还涵盖:挫伤伤口 ；以及切伤；刺伤；撕裂伤；开放伤；贯通伤；穿刺伤；磨伤；擦伤；灼伤；冻伤；腐蚀伤；由于撕扯、抓、压力和叮咬造成的创口 ；以及其它类型的伤口。尤其是，术语涵盖了溃疡形成(即溃疡)、优选皮肤溃疡。术语“伤口”还包括手术伤口。
[0229] 本文所使用的术语“伤口愈合”是指诱发了精确的时间和空间愈合程序的再生过程，所述程序包括伤口闭合和涉及伤口闭合的过程。术语“伤口愈合”涵盖但不限于:成粒过程；新血管形成；成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞迁移；胞外基质沉积；表皮再植；以及重塑。术语“伤口愈合”包括组织完整性的恢复。将理解的是，这可指组织完整性的部分恢复或完全恢复。因此，对伤口进行处理是指与伤口愈合过程相关的一个或多个阶段或过程的促进、改善、推进、加速或 进展。
[0230] 本文所使用的术语“伤口闭合”是指伤口的愈合，其中，伤口的侧边重新接合以形成连续的屏障物(例如完好的皮肤)。
[0231] 本文所使用的术语“成粒”是指借助愈合剂在(伤口的)裂伤表面上形成小的红色粒状突起物的过程。
[0232] 本文所使用的术语“新血管形成”是新长出血管，使得氧气和营养供给得以改善。类似地，术语“血管生成”是指包括新的毛细血管发展在内的血管形成过程。
[0233] 本文所使用的术语“细胞迁移”是指细胞(例如，成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞等)移动至伤口部位。
[0234] 本文所使用的术语“胞外基质沉积”是指细胞分泌纤维性成分(例如胶原蛋白、弹性蛋白、网硬蛋白)、连接蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白)和空间填充分子(例如葡萄糖胺聚糖)。
[0235] 本文所使用的术语“上皮再生”是指在裸露表面(例如伤口)上重新形成上皮。
[0236] 本文所使用的术语“重塑”是指肉芽组织的置换和/或血供应阻断。[0237] 伤口可为急性或慢性的。本文所使用的术语“慢性伤口”是指甚至在长的时间段(例如2到3个月以上)后也未完全愈合的伤口。可将包括褥疮、下肢静脉性溃疡和糖尿病足溃疡在内的慢性伤口简单地描述为不能愈合的伤口。虽然还未完全了解慢性伤口的准确分子发病机制，但认为其是多重因素的。由于居留细胞和迁移细胞在急性损伤期间的正常应答受损，这些伤口的特征在于长期的炎症反应、伤口胞外基质(ECM)重塑缺陷和不能上皮再生。
[0238] 伤口可为内在伤口，例如，皮肤的外部结构完整性得以保持，如撞伤或内部溃疡；或者伤口可为外部创口，特别是皮肤伤口 ；因此组织可为任意的内部或外部机体组织。在一些实施方式中，组织是皮肤(如人皮肤)，即，伤口为皮肤伤口、如真皮伤口或表皮伤口。
[0239] 可将伤口分类入两种通用类别之一:部分厚度伤口或完全厚度伤口。部分厚度伤口限于表皮和浅表的真皮，而不破坏真皮血管。完全厚度伤口涉及真皮的破裂并延伸至较深的组织层，包括真皮血管的破裂。部分厚度伤口的愈合通过简单的上皮组织再生而进行。完全厚度伤口中的伤口愈合更复杂。
[0240] 在一些实施方式中，伤口选自于由如下伤口所组成的组:割伤和撕裂伤、手术切口或伤口、穿刺伤、擦伤、抓伤、压迫伤口、磨伤、摩擦伤口(例如，尿布疹、摩擦水泡)、褥疮(decubitus ulcers,例如，pressure or bed sores)、热作用伤口(来自电源以及直接或通过传导、对流或辐射的来自冷源或热源的灼伤)、化学伤口(例如，酸或碱灼伤)或病原性传染(例如，病毒、细菌或真菌)(包括开放性或完好的疖、斑疹、痤疮和粉刺、溃疡)、慢性伤口(包括糖尿病相关伤口，如下肢溃疡和足溃疡、下肢静脉性溃疡和褥疮)、供体与受体皮肤移植部位(skin graft/transplant donor and recipient sites)、免疫应答病症(例如牛皮癣和湿疹)、胃溃疡或肠溃疡、口部伤口(包括嘴部溃疡)、受损的软骨或骨骼、截肢伤口、角膜病损、以及上述伤口的任意组·合。
[0241] 可将包含转谷氨酰胺酶的医学植入装置用于处理出血、停止内部或外部流血。因此，本发明提供了处理、停止或减轻出血或内部流血或外部流血的方法，该方法包括在出血或流血部位施用包含转谷氨酰胺酶的医学植入装置。
[0242] 支架的结合
[0243] 本发明另一方面提供了将两个支架(例如，两个不同支架或一个较大结构的两个不同部分)结合或附着在一起的方法。该方法包括向第二支架附着所需的第一支架的表面施用有效量的转谷氨酰胺酶，并使第二支架与第一支架的表面接触。作为替代或除此以外，可将第一支架与第二支架接触，随后施用转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，在使第一支架和第二支架接触在一起前，将转谷氨酰胺酶施用至二者。
[0244] 在一些实施方式中，可在与第二支架接触前，使转谷氨酰胺酶与第一支架结合。在用于支架和转谷氨酰胺酶的背景下时，术语“结合”是指将转谷氨酰胺酶涂覆于支架上或以其它方式(共价或非共价)连接至支架。在一些实施方式中，可将转谷氨酰胺酶分散在用于制造支架的材料中。在一些实施方式中，可将转谷氨酰胺酶共价连接至支架的表面。在一些实施方式中，可将转谷氨酰胺酶非共价连接至支架的表面。在一些实施方式中，可在第一支架和第二支架接触前，使转谷氨酰胺酶与第一支架和第二支架关联。
[0245] 在一些实施方式中，在支架制成后，可向支架加入转谷氨酰胺酶。这可通过例如将所制成的支架浸入转谷氨酰胺酶溶液中的完成。包含转谷氨酰胺酶的支架的附着可能需要或者可能不需要向待进行附着的支架表面使用任意另外的转谷氨酰胺酶。
[0246] 在两个支架附着在一起的背景下，“转谷氨酰胺酶的有效量”是指有效地将两个支架连接在一起的转谷氨酰胺酶的量。在这一背景下，有效量可为每cm2接触表面积约I U g到约lOOmg。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶的有效量为:每cm2约Img到约50mg、每cm2约5mg到约40mg、每cm2约IOmg到约30mg、每cm2约15mg到约25mg或每cm2约20mg。
[0247] 本文所使用的术语“支架”是指任何三维物体。示例性的支架包括但不仅限于:人工组织、人工器官、假体装置、药物输送装置、伤□敷料(例如，绷带、纱布、胶带、网片、网状物、橡皮膏、膜、膜状物和贴片等)、纤维、膜、泡沫、海绵、纳米颗粒、微粒以及上述物体的任意组合。
[0248] 在一些实施方式中，将支架与转谷氨酰胺酶可交联蛋白相结合。在用于支架的背景中时，术语“结合”是指使支架涂覆有、含有或包含可连接转谷氨酰胺酶的蛋白。在一些实施方式中，支架涂覆有可连接转谷氨酰胺酶的蛋白。“涂覆”意味着将可连接转谷氨酰胺酶的蛋白施用至支架表面。因此，可用包含可连接转谷氨酰胺酶的蛋白的溶液对支架进行刷涂或喷涂。或者，可将支架浸入可连接转谷氨酰胺酶的蛋白的溶液中。
[0249] 可将可连接转谷氨酰胺酶的蛋白共价或非共价地与支架相结合(例如，在支架的外部表面)。一旦与支架结合，可连接转谷氨酰胺酶的蛋白提供了将该支架附着至第二支架和/或组织或器官的手段。
[0250] 支架可由任何的生物相容和/或可生物降解材料制得。在一些实施方式中，支架由碳水化合物聚合物制得。在一些实施方式中，支架由壳聚糖或其衍生物制得。在一些实施方式中，支架由本文所述的复合材料制得。
[0251] 在一些实施方式中，支架由可连接转谷氨酰胺酶的蛋白制得。
[0252] 定义
[0253] 除非另有说明，或在上下文中暗示，下列术语和词组包括下文所提供的含义。除非另有清楚说明，或由上下文明显可见，下列术语和词组并不排除所述术语或词组在其所属领域中已知的含义。提供这些定义以协助描述具体的实施方式，而并非意在对所要求保护的发明加以限定，因为本发明的范围仅由权利要求书进行限定。另外，除非上下文另有要求，单数术语涵盖复数，并且复数术语涵盖单数。
[0254] 本文所使用的术语“包括/包含(comprising or comprises)”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。所述术语“包括”和“包含”囊括了术语“由…组成”和“基本上由…组成”。
[0255] 本文所使用的术语“基本上由…组成”表示给定的实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外成分。
[0256] 术语“由…组成”表示本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
[0257] 除了在操作实施例中或另有指示的地方,本文所用的表示成分或反应条件的量的全部数值在所有例子中都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1%。
[0258] 除非文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和”。[0259] 尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或试验中，合适的方法和材料见下述。术语“包含/包括(comprises)”意思是“含有(includes)”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia),并且用于此处表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
[0260] 本文所使用的术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”都意味着减少统计学上显著的量。然而，为避免疑义，“减少(reduced/reduction)”或“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”表示相对于参比水平降低至少10%，例如降低至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括降低100% (如，相对于参比水平的缺乏水平)、或相对于参比水平降低在10%到100%之间的任意量。
[0261] 本文所使用的术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”通常都意味着增加统计学上显著的量；为避免疑义，术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”表示相对于参比水平增加至少10%,例如增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括增加100%、或相对于参比水平增加在10%到100%之间的任意量；或相对于参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或增加在2倍和10倍或之间的任意量、或是更大量的增加。
[0262] 术语“统计学上显著(statistically significant)”或“显著地(significantly)”表示统计显著性，并且通常意味着比标记物的正常浓度低两个标准差(2SD)以下。该术语是指存在差异的统计性证据。将其定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常使用P值来作出决定。
[0263] 本文所使用的术语“有效”或“有效性”囊括了药理学有效性和生理学安全性。药理学有效性是指治疗在患者中产生期望生物效用的能力。生理学安全性是指毒性水平、或由给予治疗引起的在细胞、 器官和/或组织水平上的其它不利的生理学效应(通常称为副作用)。“较低有效”是指治疗产生了临床上显著的较低水平的药理学有效性和/或临床上更高水平的不利的生理学效应。
[0264] 本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔子或仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前面所述的任何子集，例如除了一个或多个组或物种(如人类、灵长类动物或啮齿动物)的上述所有。在本文所述方面的特定实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，如人类。本文所使用的术语“患者”和“受试者”可互换使用。受试者可为雄性或雌性。
[0265] 优选地,受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不仅限于这些实例。可将除人以外的哺乳动物有利地用作代表与自身免疫病或炎症相关的紊乱的动物模型的受试者。此外，可将本文所述方法用于治疗家畜和/或宠物。
[0266] 本发明可由下述任一编号的段落进行定义:[0267] 1.一种复合层状材料，所述复合层状材料包含基于碳水化合物的基底和蛋白。
[0268] 2.如段落I的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底包括膜、纤维、海绵、网片、泡沫或纳米结构。
[0269] 3.如段落1-2中任一段的复合层状材料，其中，所述碳水化合物与所述蛋白的比值为10:1到1:10。
[0270] 4.如段落1-3中任一段的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于如下物质的基底:壳多糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖、甘露糖寡糖、糖原、淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、葡萄糖胺聚糖(例如，透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等)、纤维素、3 -葡聚糖(酵母聚糖、香菇多糖、西佐糖)、麦芽糖糊精、菊粉或果聚糖P (2 — 6)。
[0271] 5.如段落1-4中任一段的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于壳聚糖的基底。
[0272] 6.如段落1-5中任一段的复合层状材料，其中，所述蛋白选自于由如下物质所组成的组:丝纤蛋白、perculin、abductin、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、角蛋白、肌联蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、Tau蛋白、微管蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、上述蛋白的片段和类似物及衍生物、以及上述物质的任意组合。
[0273] 7.如段落I的复合层状材料，其中，所述碳水化合物是壳聚糖并且所述蛋白包含丝纤蛋白，且所述壳聚糖与所述丝纤蛋白的比值为1:1.5到1:2。
[0274] 8.如段落1-7中任一段的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的基底包含具有预定微观形态的至少一个表面，并且将所述蛋白施用至所述表面。
[0275] 9.如段落8的复合层状材料，其中，将所述预定微观形态模制到所述基于碳水化合物的基底中。
[0276] 10.如段落1-9中任一段的复合层状材料，其中，所述蛋白包含具有预定微观形态的至少一个表面。
[0277] 11.如段落10的复合层状材料，其中，将所述预定微观形态模制到所述蛋白中。
[0278] 12.如段落1-11中任一段的复合层状材料，所述复合层状材料进一步包含基于碳水化合物的第二基底。
[0279] 13.如段落12的复合层状材料，其中，所述基于碳水化合物的第二基底为基于壳多糖的基底。
[0280] 14.如段落1-13中任一段的复合层状材料，其中，所述复合材料在碳水化合物层或蛋白层中的至少一个包含选自于由如下物质所组成的组中的分子:碳纤维；碳纳米管；玻璃纤维；小分子；聚合物；蛋白；肽；拟肽；核酸；有机化合物；无机化合物；晶体材料；生物化合物；生物学活性化合物；具有生物活性的化合物；生物试剂；药剂或治疗剂；以及上述物质的任意组合。
[0281] 15.如段落14的方法，其中，所述分子处于所述碳水化合物层中。
[0282] 16.如段落15的方法，其中，所述分子与所述碳水化合物层共价连接。
[0283] 17.如段落14的方法，其中，所述分子处于所述蛋白层中。
[0284] 18.如段落17的方法，其中，所述分子与所述蛋白层共价连接。[0285] 19.如段落14-18中任一段的复合层状材料，其中，所述晶体材料是碳酸钙。
[0286] 20.如段落1-19中任一段的复合层状材料，所述复合层状材料在至少部分所述复合材料上进一步包含防水涂层。
[0287] 21.如段落20的复合层状材料，其中，所述复合材料由聚对二甲苯组成。
[0288] 22.如段落20-21中任一段的复合层状材料，其中，当暴露至水性环境时，所述复合材料表现出随所述防水涂层在部分复合材料上的位置而变化的机械性能。
[0289] 23.一种形成复合层状材料的方法，所述方法包括:提供基于碳水化合物的基底，并使基于所述碳水化合物的基底与蛋白溶液接触。
[0290] 24.如段落23的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于如下物质的基底:壳多糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖、甘露糖寡糖、糖原、淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、葡萄糖胺聚糖(例如，透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等)、纤维素、¢-葡聚糖(酵母聚糖、香菇多糖、西佐糖)、麦芽糖糊精、菊粉或果聚糖P (2 —6)。
[0291] 25.如段落23-24中任一段的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底为基于壳聚糖的基底。
[0292] 26.如段落23-25中任一段的方法，其中，所述蛋白选自于由如下物质所组成的组:丝纤蛋白、perculin、abductin、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、角蛋白、肌联蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、Tau蛋白、微管蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、上述蛋白的片段和类似物及衍生物、以及上述物质的任意组合。
[0293] 27.如段落23-26中任一段的方法，其中，所述碳水化合物与所述蛋白的比值为10:1 到约 1:10。
[0294] 28.如段落23-27中任一段的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的材料的溶液进行脱水而形成。
[0295] 29.如段落28的方法，其中，所述基于碳水化合物的材料的溶液包含酸。
[0296] 30.如段落29的方法，其中，所述酸选自于由如下物质所组成的组:衣康酸、聚衣康酸、乌头酸、尿酸、葡糖醛酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、4-氯丁酸、3-氯丁酸、2-溴丁酸、2-氯丁酸、亚氯酸、次氯酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸、麦德鲁姆酸、氢氟酸、氢氰酸、硫化氢、正磷酸、亚硫酸、碳酸、弱碱的共轭酸、以及上述物质的任意组合。
[0297] 31.如段落29-30中任一段的方法，所述方法进一步包括通过施用碱性溶液来中和所述基于碳水化合物的材料。
[0298] 32.如段落30的方法，其中，所述碱性溶液包含选自于由如下物质所组成的组中的碱:氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化韩、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化银、氢氧化锂、氢氧化铷、碳酸钠和氨；或所述碱性溶液为高pH缓冲液。
[0299] 33.如段落32的方法，其中，所述高pH缓冲液为碳酸盐缓冲液。
[0300] 34.如段落23-33中任一段的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的材料的溶液进行冷冻干燥而形成。
[0301] 35.如段落23-33中任一段的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过向基于碳水化合物的材料的溶液中注入气泡而形成。[0302] 36.如段落23-33中任一段的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过将基于碳水化合物的溶液纺丝以形成纤维来形成。
[0303] 37.如段落23-33中任一段或段落35的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于壳多糖的溶液进行电纺丝以形成纤维来形成。
[0304] 38.如段落22-32中任一段或段落35的方法，其中，所述基于碳水化合物的基底通过对基于碳水化合物的溶液进行旋喷式纺丝以形成纤维来形成。
[0305] 39.如段落23-38中任一段的方法，所述方法进一步包括诱导所述蛋白的¢-转变。
[0306] 40.如段落39的方法，其中，所述P -转变通过用下述的一种或多种试剂处理所述蛋白来诱导，所述试剂包括醇、有机溶剂、水溶液；或者所述3 -转变通过施加应力、压力或加热来诱导。
[0307] 41.如段落23-40中任一段的方法，所述方法进一步包括将选自于由如下物质所组成的组中的被运载材料(carried material)引入至所述复合材料中:碳纳米管；玻璃纤维；小分子；聚合物；蛋白；肽；拟肽；核酸；有机化合物；无机化合物；晶体材料；生物化合物；生物学活性化合物；具有生物活性的化合物；生物试剂；药剂或治疗剂；以及上述物质的任意组合。
[0308] 42.如段落40的方法，其中，所述被运载材料共价连接至所述复合材料。
[0309] 43.一种复合物质(a composition of matter),所述复合物质通过段落23-42中任一段的方法形成。
[0310] 44.一种假体装置，所述假体装置包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0311] 45.一种组织工程化支架，所述组织工程化支架包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0312] 46.一种药物输送装置，所述药物输送装置包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0313] 47.一种可植入材料，所述可植入材料包含通过如段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0314] 48.一种材料，所述材料包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质，所述复合物质含有矿物或结晶材料。
[0315] 49.一种透明薄膜，所述透明薄膜包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0316] 50.一种多层材料，所述多层材料包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质。
[0317] 51.一种多层材料，所述多层材料包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质，所述多层材料含有另外的组分以提供定制的(t a i I or e d )机械性能。
[0318] 52.一种材料，所述材料包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质，所述材料包含防水涂层材料。[0319] 53.一种材料，所述材料包含通过段落23-42中任一段的方法形成的复合物质，所述材料含有可变的防水涂层材料区域，从而提供具有可变柔性的区域。[0320] 54.一种形成复合层状材料的方法，所述方法包括:
[0321] 将基于壳多糖的材料溶于酸性溶液中；
[0323] 用碱溶液对所述基于壳多糖的结构进行处理，从而中和质子化的氨基基团；
[0324] 对所述基于壳多糖的结构进行洗涤；
[0325] 任选地，对所述基于壳多糖的结构进行脱水；
[0326] 将蛋白溶液施用至所述基于壳多糖的结构，从而在基于壳多糖的结构上产生具有至少一个蛋白层的复合材料；
[0327] 对所述处于基于壳多糖的结构上的所述蛋白层进行干燥；
[0328] 用基于醇的溶液对所述复合材料进行处理，从而诱导所述蛋白的¢-转变。
[0329] 55.如段落54的方法，其中，所述基于壳多糖的材料与所述蛋白的比值为10:1到1:10。
[0330] 56.如段落54-55中任一段的方法,其中,所述基于壳多糖的材料为壳聚糖。
[0331] 57.如段落54-56中任一段的方法，其中，所述蛋白为丝心蛋白。
[0332] 58.如段落54-57中任一段的方法，其中，所述酸性溶液包含乙酸。
[0333] 59.如段落54-58中 任一段的方法，其中，所述碱溶液包含NaOH。
[0334] 60.如段落54-59中任一段的方法，其中，所述基于醇的溶液包含甲醇。
[0335] 61.一种复合物质，所述复合物质通过段落54-60中任一段的方法形成。
[0336] 62.一种将医学植入装置粘附至组织或器官的方法，所述方法包括:将有效量的转谷氨酰胺酶施用至所述组织或器官的表面，并使所述医学植入装置与所述组织的表面接触。
[0337] 63.如段落62的方法，其中，所述医学植入装置包含转谷氨酰胺酶。
[0338] 64.一种将医学植入装置粘附至组织或器官的方法，所述方法包括:使所述医学植入装置与所述器官接触，其中，所述医学植入装置包含有效量的转谷氨酰胺酶。
[0339] 65.如段落64的方法，所述方法进一步包括将有效量的转谷氨酰胺酶施用至所述组织的表面。
[0340] 66.如段落62-65中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为哺乳动物转谷氨酰胺酶。
[0341] 67.如段落62-65中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶(mTgase)。
[0342] 68.如段落62-67中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为钙非依赖性转谷氨酰胺酶。
[0343] 69.如段落62-68中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶选自于由如下物质所组成的组:因子XIII A (纤维蛋白稳定因子)、1型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)、2型转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶，tTgase),3型转谷氨酰胺酶(表皮转谷氨酰胺酶)、4型转谷氨酰胺酶(前列腺转谷氨酰胺酶)、5型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶X)、6型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Y)、7型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Z)、以及上述物质的任意组合。
[0344] 70.如段落62-69中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶配制成如下剂型••溶液剂、乳剂、气雾剂、泡沫剂、软膏剂、糊剂、洗剂、粉末剂、凝胶剂、水凝胶剂、水胶体剂、微粒齐U、纳米颗粒剂或乳膏剂。
[0345] 71.如段落62-70中任一段的方法，其中，所述医学植入装置选自于由如下物质所组成的组:人工组织、人工器官、假体装置、药物输送装置、伤口敷料、膜、泡沫、海绵、止血材料、以及上述物质的任意组合。
[0346] 72.如段落71的方法，其中，所述医学植入装置为选自于由如下物质所组成的组中的伤口敷料:绷带、纱布、胶带、网片、网状物、橡皮膏、膜、膜状物、贴片、微粒、纳米颗粒、以及上述物质的任意组合。
[0347] 73.如段落71的方法，其中，所述医学植入装置是泡沫。
[0348] 74.如段落62-73中任一段的方法，其中，所述医学植入装置包含蛋白，并且其中所述蛋白可由转谷氨酰胺酶交联。
[0349] 75.如段落74的方法，其中，所述医学植入装置涂覆有所述蛋白。
[0350] 76.如段落74-75中任一段的方法，其中，所述蛋白为丝纤蛋白。
[0351] 77.如段落62-76中任一段的方法，其中，将所述转谷氨酰胺酶涂覆于所述医学植入装置的表面上。
[0352] 78.如段落62-77中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述医学植入装置非共价连接。
[0353] 79.如段落62-78中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶的有效量为所述组织或器官与所述医学植入装置之间的接触表面积每cm2约I y g到约lOOmg。
[0354] 80.如段落62-79中任一段的方法，所述方法进一步包括给予伤口愈合试剂。
[0355] 81.如段落80的方法，其中，所述伤口愈合试剂选自于由如下物质所组成的组:右泛醇；生长因子；酶；激素；聚乙烯吡咯酮-碘化物；脂肪酸；消炎剂；抗生素；抗微生物剂；防腐剂；细胞因子；凝血酶；镇痛剂；阿片；氨基氧化物；呋咱氮氧化物；亚硝基硫醇；硝酸盐与花色苷；核苷，如腺苷；以及核苷酸，如二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP);神经递质/神经调质，如乙酰胆碱和5-羟色胺(血清素/5-HT);组胺和儿茶酚胺(如肾上腺素和去甲肾上腺素)；脂质分子，如鞘氨醇-1-磷酸酯和溶血磷脂酸；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；肽，如缓激肽、P物质和钙基因相关肽(CGRP)氧化氮；以及上述物质的任意组合。
[0356] 82.如段落62-81中任一段的方法，其中，所述医学植入装置由生物相容的可生物降解材料制得。
[0357] 83.如段落62-82中任一段的方法，其中，所述医学植入装置由段落1_21中任一段的复合材料制得。
[0358] 84.如段落62-83中任一段的方法，其中，所述施用包括增高主体转谷氨酰胺酶的表达或活性。
[0359] 85.一种在有需要的受试者中促进伤口愈合的方法，所述方法包括将有效量的转谷氨酰胺酶施用至伤口表面，并使伤口敷料与所述伤口接触，其中，所述伤口敷料包含段落1-21中任一段的复合材料。
[0360] 86.如段落85的方法，所述方法进一步包括将泡沫施用至所述伤口，其中，所述泡沫包含段落1-21中任一段的复合材料。
[0361]87.如段落85-86中任一段的方法，其中，所述伤口选自于由如下伤口所组成的组:割伤和撕裂伤、手术切口、穿刺伤、擦伤、抓伤、压迫伤口、磨伤、摩擦伤口、慢性伤口、溃疡、热作用伤口、化学伤口、由病原性感染造成的伤口、供体与受体皮肤移植部位、免疫应答病症、口部伤口、胃部伤口或肠部伤口、受损的软骨或骨骼、截肢部位和角膜病损。
[0362] 88.如段落85-87中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为哺乳动物转谷氨酰胺酶。
[0363] 89.如段落85-87中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶(mTgase)。
[0364] 90.如段落85-89中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶为钙非依赖性转谷氨酰胺酶。
[0365] 91.如段落85-90中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶选自于由如下物质所组成的组:因子XIII A (纤维蛋白稳定因子)、1型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)、2型转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶)、3型转谷氨酰胺酶(表皮转谷氨酰胺酶)、4型转谷氨酰胺酶(前列腺转谷氨酰胺酶)、5型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶X)、6型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Y)、7型转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶Z)、以及上述物质的任意组合。
[0366] 92.如段落85-91中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶配制成如下剂型••溶液剂、乳剂、气雾剂、泡沫剂、软膏剂、糊剂、洗剂、粉末剂、凝胶剂、水凝胶剂、水胶体剂、微粒齐U、纳米颗粒剂或乳膏剂。
[0367] 93.如段落85-92中任一段的方法，其中，所述伤口敷料选自于由如下物质所组成的组:绷带、纱布、胶带、网片、网状物、橡皮膏、膜、膜状物、贴片、以及上述物质的任意组合。
[0368] 94.如段落85-93中任一段 的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述伤口敷料相结入
口 o
口 o
[0369] 95.如段落94的方法，其中，将所述转谷氨酰胺酶涂覆于所述伤口敷料的表面上。
[0370] 96.如段落94-95中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶与所述伤口敷料非共价连接。
[0371] 97.如段落85-96中任一段的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶的有效量为每cm2伤口面积约Iug到约IOOmg0
[0372] 98.如段落85-97中任一段的方法，所述方法进一步包括向所述受试者给予伤口愈合试剂。
[0373] 99.如段落98的方法，其中，所述伤口愈合试剂选自于由如下物质所组成的组:右泛醇；生长因子；酶；激素；聚乙烯吡咯酮-碘化物；脂肪酸；消炎剂；抗生素；抗微生物剂；防腐剂；细胞因子；凝血酶；镇痛剂；阿片；氨基氧化物；呋咱氮氧化物；亚硝基硫醇；硝酸盐与花色苷；核苷；核苷酸；神经递质/神经调质，如乙酰胆碱和5-羟色胺(血清素/5-HT);组胺和儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素；脂质分子，如鞘氨醇-1-磷酸酯和溶血磷脂酸；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；肽，如缓激肽、P物质和钙基因相关肽(CGRP); —氧化氮；以及上述物质的任意组合。
[0374] 100.如段落85-99中任一段的方法，其中，所述施用包括增高主体转谷氨酰胺酶的表达或活性。
[0375] 101.如段落85-99中任一段的方法，其中，所述施用在接触所述医学植入装置或所述伤口敷料之前、之后或期间进行。[0376] 对于没有指出的范围，本领域普通技术人员将会理解的是，本文描述和阐明的各种实施方式中的任何一种都能被进一步修改，以将本文公开的任何其它实施方式中的特征并入。因此，其它实施方式也在本发明的精神和范围内。另外，当上面的描述涉及发明时，该描述可包含多于一项发明。
[0377] 实施例[0378] 现已大体上对本发明进行了描述，通过参考下列实施例将会更容易地理解本发明，所述实施例仅出于阐明本发明的某些方面和实施方式而加以囊括，而并非意在用于限定本发明。
[0379] 将处于粉末形式的转谷氨酰胺酶以约20mg/cm2施用于组织上，并使水合后的膜(Shrilk或壳聚糖膜)与组织接触。在室温下结合30分钟后，使样品接受剥离试验。剥离试验的结果在图23中示出。本发明者发现shrilk膜的两侧(碳水化合物层或蛋白层)均可与组织接触以用于结合。
[0380] 进行类似的实验以测试对真皮组织的结合。因为表皮的最外层通过角质化作用产生，在通过转谷氨酰胺酶处理进行结合方面，这一层可能是受试者中仅有的无可用基团的组织。结果证实，没有观察到通过转谷氨酰胺酶的结合。然而，当最外层轻微受损并且第二层暴露时，通过转谷氨酰胺酶的结合得以成功，如实验中所证明，shrilk结合至真皮而非表皮(如图25中所示)。这显示出在皮肤处理中，可将shrilk用作“贴片”(例如绷带)。
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