技术领域
[0001] 本
发明涉及一种新型胶原蛋白单体海绵的制备方法,属于
生物医用材料领域的制备范畴。
背景技术
[0002] 胶原是动物体中含量最多、分布最广的
蛋白质,占体内蛋白质总量的25%-30%,其广泛存在结缔组织如
皮肤、
腱、韧带中。在动物体中胶原是以不溶性的胶原
纤维的形式存在的;与此同时胶原还与蛋白多糖及糖蛋白具有特异性
亲和性,因而使其呈不溶性;随着生长的进行,胶原分子间及与其他成分之间形成了共价键,也增加了溶解的困难。
[0003] 胶原的可溶和不可溶是相对而言的,与提取条件如
溶剂等有关。胶原的提取一般有两种手段,一是溶剂的化学法,二是用酶的生物化学法。根据所用的溶剂不同,化学法可分为中性盐法和酸性法,中性盐溶液提取组织材料中的可溶性胶原,成年动物组织中的胶原交联较多,可溶性胶原较少,用中性盐提取的胶原量较少。酸法提取是针对酸溶性胶原的,稀
有机酸除了可以提取可溶性胶原外,还可以使多数组织溶胀,打开其中含有
醛胺类的交联键,使这部分胶原即酸溶性胶原溶解出来。对于所谓的不溶性胶原,可采用交互提取法。
牛跟腱中存在的Ⅰ型胶原是酸不溶性的,由于胶原肽链间的共价交联链都是通过分子末端肽里的赖
氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的,末端肽被切下后(可通过一些蛋白酶将胶原进行限制性降解,即将末端肽切割下来)会有三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来。
[0004] 胶原蛋白在酸性条件下是以胶原三螺旋单体形式存在的,胶原分子稳定地分散在溶液中,是均一、透明的粘性
流体。而当外界条件(pH、T、I、C)改变时,如用
碱液调节溶液PH值时,胶原溶液中
力平衡被破坏,胶原分子之间靠非共价键作用力(包括静电作用、范德华力、疏
水作用力、氢键等)自发形成具有一定结构和功能的聚集体,如胶原微纤维、原纤维、纤维等。胶原分子间作用力加强,而胶原与水之间的水化作用力减弱了,体系中发生相分离,由均一稳定透明的单相体系变为白色半透明的固液混合体系。
[0005] 传统制备工艺主要集中在用碱液调节PH或PBS
透析使冻干前胶原溶液PH值升高,该方法缺点在于胶原海绵灰分高,同时PH值升高导致胶原纤维生成,最后得到的胶原蛋白纤维海绵力学强度低、吸水后易碎、吸水量小。同时也有通过交联剂如戊二醛等对冻干前胶原蛋白溶液进行交联,该方法的
缺陷在于交联剂毒性大。因此寻求一种无毒性、力学强度大,吸水率高的胶原海绵是未来
止血材料发展的方向。
[0006] 发明优点:
[0007] 1、生产周期短,生产效率和蛋白纯度高。
[0008] 2、灰分低,蛋白含量高。
[0009] 3、胶原蛋白单体溶液呈均一透明状,冻干后生物力学强度大,遇水膨胀后不易
破碎。
[0010] 4、胶原蛋白单体具有较胶原蛋白纤维更好的促血小板黏结、聚集的生物学功能。
发明内容
[0011] 本发明的目的是提供一种医用级I型胶原蛋白单体海绵的制备工艺,其主要特点是制备的
胶原蛋白海绵是以三螺旋单体的形式存在的,生物力学强度大,遇水膨胀后不易破碎;吸水率高,对伤口有保湿作用,提高临床应用效果。
[0012] 本发明的目的由以下技术措施实现,其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。
[0013] Ⅰ型胶原蛋白单体海绵的制备方法包括以下几个步骤:
[0014] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0015] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.2-0.6mol/ml的
醋酸水溶液1000-3000份,然后加入胃蛋白酶0.5-1.5份,置于10℃
冰箱中放置2-5天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0016] 2、酸复溶
[0017] 用浓度为0.2-0.6mol/ml的醋酸水溶液1000-3000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0018] 3、盐析
[0019] 在上述清液中加入粉末状
氯化钠固体100-200份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0020] 4、酸透析
[0021] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.2-0.6mol/ml的醋酸水溶液作透析外液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手
挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0022] 5、水透析
[0023] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,离子强度为10-100μs/cm。
[0025] 将透析好的胶原蛋白单体溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
具体实施方式
[0026] 现结合
实施例,对本发明作详细描述,但本发明的实施不仅限于此。
[0027] 实施例1
[0028] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0029] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.2mol/ml的醋酸水溶液1000份,然后加入胃蛋白酶0.5份,置于10℃冰箱中放置2天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0030] 2、复溶
[0031] 用浓度为0.2mol/ml的醋酸水溶液1000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0032] 3、盐析
[0033] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体100份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0034] 4、酸透析
[0035] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.2mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0036] 5、水透析
[0037] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0038] 6、冷冻干燥
[0039] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0040] 实施例2
[0041] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0042] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.6mol/ml的醋酸水溶液3000份,然后加入胃蛋白酶1.5份,置于10℃冰箱中放置5天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0043] 2、复溶
[0044] 用浓度为0.6mol/ml的醋酸水溶液3000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0045] 3、盐析
[0046] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体200份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0047] 4、酸透析
[0048] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.6mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0049] 5、水透析
[0050] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0051] 6、冷冻干燥
[0052] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0053] 实施例3
[0054] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0055] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份,然后加入胃蛋白酶1.0份,置于10℃冰箱中放置3天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0056] 2、复溶
[0057] 用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0058] 3、盐析
[0059] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体150份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0060] 4、酸透析
[0061] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0062] 5、水透析
[0063] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0064] 6、冷冻干燥
[0065] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0066] 实施例4
[0067] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0068] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.3mol/ml的醋酸水溶液1000份,然后加入胃蛋白酶1.0份,置于10℃冰箱中放置3天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0069] 2、复溶
[0070] 用浓度为0.3mol/ml的醋酸水溶液1000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0071] 3、盐析
[0072] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体150份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0073] 4、酸透析
[0074] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.3mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0075] 5、水透析
[0076] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0077] 6、冷冻干燥
[0078] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0079] 实施例4
[0080] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0081] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份,然后加入胃蛋白酶0.5份,置于10℃冰箱中放置3天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0082] 2、复溶
[0083] 用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0084] 3、盐析
[0085] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体150份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0086] 4、酸透析
[0087] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0088] 5、水透析
[0089] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0090] 6、冷冻干燥
[0091] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0092] 实施例5
[0093] 1、胶原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0094] 将20份经过前处理的牛跟腱碎片加入浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份,然后加入胃蛋白酶1.5份,置于10℃冰箱中放置3天,每天摇动3-5次。离心取上清液,去渣。用碱溶液调节溶液PH至中性,放置半天,离心得到白色沉淀。
[0095] 2、复溶
[0096] 用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份复溶沉淀,不断搅拌待其完全溶解。
[0097] 3、盐析
[0098] 在上述上清液中加入粉末状氯化钠固体150份,加完后置于10℃冰箱中放置过夜,离心取固体物质用纯水清洗沉淀数次,将多余的离子除去。
[0099] 4、酸透析
[0100] 将白色沉淀装入透析袋中,用浓度为0.5mol/ml的醋酸水溶液进行酸透,直至白色沉淀完全溶解。每天可用手挤压透析袋两次,使沉淀全部溶解。
[0101] 5、水透析
[0102] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后,将其放到纯水中进行水透,每天必须更换两次外液,透析至胶原溶液的PH为4.0-6.0,电导率为10-100μs/cm。
[0103] 6、冷冻干燥
[0104] 将透析好的胶原蛋白溶液根据所要求的浓度可作适当的稀释,静置达到平衡后,用冻干机冷冻干燥24-48小时,制得胶原蛋白单体海绵。
[0105] 实施例6
[0106] 本发明制备的胶原单体海绵和传统工艺制备的胶原蛋白海绵的物理参数对比,见下表。
[0107] 表1本发明制备工艺与传统工艺的制备的胶原海绵的物理参数对比表[0108]物理参数 传统工艺 本发明
吸水量(倍) 51.89 90.75
拉力 >50g >500g
总蛋白含量% 90.50 92.66