有关癌症发展及对治疗的反应的快速预测
阅读：195发布：2021-05-27
专利汇可以提供有关癌症发展及对治疗的反应的快速预测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种针对侵袭和转移特征、异质性及对 治疗 剂的反应来迅速筛选 肿瘤 细胞的方法，并且提供一种用于斑 马 鱼胚胎的自动成像和显微注射的多孔显微注射系统。，下面是有关癌症发展及对治疗的反应的快速预测专利的具体信息内容。
1.一种通过从活检体或以手术方式取出的肿瘤获得的原发肿瘤细胞产生肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)分离原发肿瘤细胞，
(b)用细胞示踪染料标记所述肿瘤细胞，
(c)将所述细胞注射到受精后24到48小时(hpf)的斑马鱼胚胎中，
(d)将所述胚胎孵育24小时或更长时间。
2.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤细胞是从循环肿瘤细胞(CTC)获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞示踪染料是荧光染料。
4.一种预测原发肿瘤侵袭或转移的可能性的方法，所述方法包括：
(a)将所述肿瘤细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄中，
(b)对注射有所述肿瘤细胞的胚胎进行孵育，
(c)在孵育之后，观察所述肿瘤细胞的位置，
(d)分析所述肿瘤细胞是否(i)通过所述卵黄囊侵袭所述胚胎的主体或(ii)所述细胞是否保留在所述卵黄囊中并且表现接近于非侵袭性原发肿瘤细胞。
5.一种鉴别具有较高疾病复发可能性的癌症患者的方法，所述方法包括：
(a)将原发肿瘤细胞注射到胚胎的卵黄中，
(b)对所述注射有肿瘤细胞的胚胎进行孵育，
(c)在孵育之后，观察所述肿瘤细胞的位置，
(d)如果所述肿瘤细胞进入所述胚胎的主体中，那么所述原发肿瘤侵袭和转移的倾向较高。
6.一种对癌细胞侵袭进行定量的方法，所述方法包括：
(a)从实体肿瘤分离肿瘤细胞，
(b)用细胞示踪染料标记肿瘤细胞，
(c)将所述细胞显微注射到24-48hpf斑马鱼胚胎的卵黄中，
(d)在35℃下孵育所述胚胎24小时或更长时间，
(e)在荧光显微镜下采集所述肿瘤细胞的自动荧光图像，
(f)使用图像分析软件对所述肿瘤病灶进行自动分析，以采集所述肿瘤病灶的宽度(W)和长度(L)、每个病灶的信号强度及所述图像中光点的位置，
2
(g)以1/2WL计算所述病灶的体积，其中W＝宽度并且L＝长度，
(h)使用所述肿瘤病灶的位置测量所述原发肿瘤侵袭的倾向，侵袭性指数可以通过以下测量：侵袭指数(II)＝1/nΣ(在T小时的时候，所述胚胎中肿瘤病灶的数量/所述胚胎中注射的肿瘤细胞的总数)，其中n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间T，并且所述II越大，则所述原发肿瘤侵袭的倾向越高，
(i)使用所述肿瘤病灶的位置，使用迁移指数测量所述侵袭的侵袭能力，所述迁移指数计算如下：迁移指数(MI)＝1/nΣ(在T小时的时候的CD/在时间T小时的时候肿瘤病灶的总数，其中CD＝肿瘤细胞行进的累积距离，n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间，其中所述MI的值越高，则所述肿瘤细胞侵袭的侵袭能力越强。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤细胞对化学试剂的反应是通过确定以下任一项在存在与不存在所述化学试剂的情况下是否不同来测量：所述肿瘤病灶的体积；所述侵袭指数；或所述迁移指数。
8.一种预测肿瘤细胞归巢的优选器官的方法，所述方法包括：
(a)从实体肿瘤分离肿瘤细胞，
(b)用细胞示踪染料标记细胞，所述细胞示踪染料具有红色荧光，如但不限于，PKH-26或DiD，
(c)将所述细胞显微注射到24-48hpf Tg(Fli:EGFP)斑马鱼胚胎的卵黄中，(d)在35℃下孵育所述胚胎24小时或更长时间，
(e)使用针对绿色和红色荧光的滤光器，在荧光显微镜下采集所述肿瘤细胞的自动荧光图像，
(f)使用图像分析软件自动分析所述肿瘤病灶，以采集所述图像中所述病灶的位置，(g)使用所述图像分析计算所述肿瘤的归巢指数如下：归巢指数(HI)＝1/nΣ(在T小时的时候器官中病灶的总数/在时间T小时的时候肿瘤病灶的总数)，其中n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间T。
9.一种监测在肿瘤侵袭、癌转移或器官归巢过程期间斑马鱼免疫系统的变化的方法，所述方法包括：
(a)使用具有在免疫细胞中表达的荧光蛋白的遗传修饰的胚胎，如但不限于，表达gata2-GFP的斑马鱼胚胎，以监测存在于所述斑马鱼身体的任何部分处的特定免疫细胞，如但不限于嗜酸性细胞的位置和数量变化，
(b)对胚胎使用全胚胎免疫组织化学染色来定位并列举免疫细胞。
10.一种用于在存在或不存在合成或天然存在的化学试剂或生物试剂的情况下孵育之后，测量存活肿瘤细胞的数量的方法，所述方法包括：
(a)在蛋白酶溶液中消化斑马鱼胚胎，
(b)通过用移液管抽吸来轻轻地分散细胞以将所述斑马鱼胚胎解离成单细胞悬浮液，(c)将细胞固定并在荧光显微镜下进行计数，
(d)比较经过处理的斑马鱼胚胎与未处理的斑马鱼胚胎之间存活荧光肿瘤细胞的总数比注射的细胞数量的比率，以相对于未处理的胚胎预测合成或天然存在的化学试剂和生物试剂的影响。
11.一种预测药物针对肿瘤细胞侵袭性的功效的方法，所述方法包括测量并比较在存在或不存在所述药物的情况下肿瘤细胞的侵袭性模式，以及比较细胞侵袭性在所述药物存在下是否不同。
12.一种预测药物对癌细胞的器官归巢偏好的影响的方法，所述方法包括观察在不存在与存在所述药物的情况下注射的肿瘤细胞的器官归巢模式的变化。
13.一种用于评估肿瘤细胞DNA的变化的方法，所述方法包括：
a.酶促消化整个胚胎或含有肿瘤细胞的斑马鱼组织的一部分，
b.从所述消化的胚胎或组织分离DNA，
c.使用被设计用于人类基因序列的PCR引物对相关基因进行PCR扩增，
d.进行测序以鉴别基因突变，
e.进行亚硫酸氢盐测序以定位表观遗传修饰。
14.一种分析癌细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：
(a)酶促消化整个胚胎或含有肿瘤细胞的斑马鱼组织的一部分，
(b)从所述消化的胚胎或组织分离RNA，
(c)使用被设计用于人类基因序列的特定引物对基因表达进行定量实时PCR分析。
15.一种分析癌细胞中的蛋白质表达的方法，所述方法包括以下之一：
(a)使用化学固定剂，如4％多聚甲醛固定整个胚胎，并使用免疫组织化学分析，用针对人类蛋白质的特异性抗体观测蛋白质表达；
(b)在注射肿瘤细胞之后，使用免疫组织化学分析在斑马鱼胚胎的组织学切片载片上观测蛋白质，
(c)使用ELISA(酶连免疫吸附分析)观测蛋白质表达，或
(d)使用蛋白质印迹法观测蛋白质表达。
16.一种自动显微注射24到72hpf斑马鱼胚胎的多孔显微注射系统，所述系统包括：
(A)保持架；多个可拆式多孔模块，其中每个多孔模块由槽板和可拆式插件组成；每个槽板具有以线性形式布置的多个胚胎保持孔，所述保持孔具有敞开式圆锥形底部；在所述槽板外缘的孔模块呈圆柱形，由此容许通过所述孔处理液体；可拆式插件，其具有垂直侧面和上部圆形开口，所述上部圆形开口与所述槽板中的每个凹槽对准，由此在放于所述槽板的顶部之上时形成胚胎保持和处理孔；及用于遮盖所述保持架、所述槽板和所述可拆式插件的盖子，
以及
(B)可旋转地安置在所述多孔板之上的显微注射用微量移液管，其能够在不同角度和/或高度注射所述胚胎。
17.根据权利要求16所述的多孔显微注射系统，其中所述多个胚胎保持孔各自在其敞开式圆锥形底部处与在所述槽板外缘处的所述孔模块的敞开式底部互相连接。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的多孔显微注射系统，其中所述显微注射的自动化是使用机械臂控制的微量移液管保持器进行。
19.根据权利要求16到18并且包括权利要求16和18中任一项所述的多孔显微注射系统，其中所述显微注射的自动化是使用通过机械臂控制的微量移液管进行。
20.根据权利要求16或17所述的多孔显微注射系统，其中所述微量移液管注射系统被构造和布置成可旋转地安置，由此在不同角度和/或高度注射所述胚胎。
21.根据权利要求16到20并且包括权利要求16和20中任一项所述的多孔显微注射系统，其中所述机械臂的位置和/或角度是手动或根据软件控制接口可调节的。
22.根据权利要求21所述的多孔显微注射系统，其中所述软件控制接口是可商购的显微注射器注射系统，或开发的专门设计用于在斑马鱼胚胎中进行显微注射的特定自动注射系统。
23.根据权利要求21所述的多孔显微注射系统，其中所述机械臂是通过胚胎结构的人类视觉辨识，或借助于所述细胞的荧光标记对胚胎结构的视觉辨识，或借助于被编程成能够检测液体的成功注射的软件来控制，所述软件是可商购的显微注射器注射系统，或开发的专门设计用于在斑马鱼胚胎中进行显微注射的特定自动注射系统。
24.根据权利要求21到23并且包括权利要求21和23中任一项所述的多孔显微注射系统，其中关于注射部位和注射方案的选择的自动化是通过软件更新改变的。
25.一种对受精后24到72小时的斑马鱼胚胎进行自动显微注射的方法，所述方法包括：
(a)将多个受精后24到72小时的斑马鱼胚胎放入根据权利要求16到24并且包括权利要求16和24中任一项所述的多孔显微注射系统的多孔模块中的相关孔模块中；及(b)将所选分子显微注射到所述斑马鱼胚胎的卵黄中。
26.根据权利要求25所述的用于对受精后24到72小时的斑马鱼胚胎进行自动显微注射的方法，其中所述所选分子包含肿瘤细胞。
27.根据权利要求26所述的用于对受精后24到72小时的斑马鱼胚胎进行自动显微注射的方法，所述方法包括在所述显微注射所述肿瘤细胞之前、期间或之后，将促血管生成因子添加到含有所述斑马鱼胚胎的水中。
28.根据权利要求27所述的用于对受精后24到72小时的斑马鱼胚胎进行自动显微注射的方法，其中所述促血管生成因子是生长因子血管生成素。
29.一种用于使肿瘤细胞被斑马鱼胚胎高效吸收的方法，所述方法包括将肿瘤细胞显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎的卵黄中，以及在所述显微注射所述肿瘤细胞之前、期间或之后，将促血管生成因子添加到含有所述斑马鱼胚胎的水中。
30.根据权利要求29所述的用于使肿瘤细胞被斑马鱼胚胎高效吸收的方法，其中所述促血管生成因子是生长因子血管生成素。
31.一种用于测试药物对肿瘤细胞的作用的方法，所述方法包括：
(a)将肿瘤细胞显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎的胚胎中；
(b)使所述肿瘤在所述斑马鱼胚胎内生长预定时间；
(c)在含有所述药物的系统水中孵育所述胚胎或将用于测试对肿瘤细胞的作用的所述药物显微注射到所述受精后24到72小时的斑马鱼胚胎中；及
(d)通过测量所述受精后24到72小时的斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的量来监测所述药物对所述肿瘤细胞的作用。
32.根据权利要求31所述的用于测试药物对肿瘤细胞的作用的方法，在受精后24到
72小时的斑马鱼胚胎中，并且在所述显微注射所述肿瘤细胞之前、期间或之后，将促血管生成因子添加到含有所述斑马鱼胚胎的水中。
33.根据权利要求32所述的用于测试药物对肿瘤细胞的作用的方法，其中所述促血管生成因子是生长因子血管生成素。
34.根据权利要求27、29或32中任一项所述的用于测试药物对肿瘤细胞的作用的方法，其中将所述促血管生成因子显微注射到所述受精后24到72小时的斑马鱼胚胎中。
有关癌症发展及对治疗的反应的快速预测
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月2日提交的美国临时申请号61/732,375的权益，该案部分以引入的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种通过注射人类肿瘤细胞在斑马鱼中产生肿瘤的方法。本发明还涉及在斑马鱼中产生的人类肿瘤的用途，所述肿瘤是用于表征肿瘤细胞、测试药物及用于个体化医疗。本发明大体上还涉及一种多孔显微注射系统，并且更确切地说，涉及一种用于斑马鱼胚胎的多孔显微注射系统。
背景技术
[0004] 细胞中信号转导的适当调控会引起多种生物功能，包括正常细胞复制、生长、细胞生理学和细胞死亡。细胞中正常信号转导的任何扰动都会在体内引起各种疾病状态，并且疾病状态通常是涉及到超过一种细胞类型以及整个身体的生理学状态的结果。确切地说，就癌症而言，这一情形尤其复杂，因为涉及到人体的许多潜在的发炎性状态。不同的发炎性病况，如肥胖、过敏、关节炎及糖尿病，都在癌症发展和治疗可能起到的作用方面发挥巨大作用。因此，建立模拟如癌症等复杂病况的体内模型需要具有活性免疫系统的动物模型。如果没有活性免疫系统，那么将无法完全复制在癌症中所观察到的动态细胞异质性。此外，对于此类癌症动物模型的临床有用性，尤其是在预测每一个体的癌症、器官侵袭和身体其它部分的癌细胞转移的生物学方面的有用性，应当有一种方式能在极短时间(在化学疗法开始之前)内模拟个别患者的癌症并且预测癌细胞对治疗的反应。
[0005] 对于基于上皮的癌症，如乳癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌及胰脏癌来说，针对此类转移性肿瘤的焦点疗法是至关重要的。远端转移性IV期癌症的侵袭性呈现极低的存活率(seer.cancer.gov)。
[0006] 转移性癌症涉及侵袭性恶性细胞从原发肿瘤脱离而进入血流和/或淋巴管中。这些循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)设法到达远端器官，在这些器官中，它们产生继发性转移。相应地，这些CTC的存在伴随着不良预后(巴里克M(Balic M),威廉姆A(Williams A),林H(Lin H),达塔R(Datar R),科特RJ.(Cote RJ.)(2012).循环肿瘤细胞：从实验室到病床(Circulating Tumor Cells:From Bench to Bedside),《医学年评》(Annu Rev Med.),2012年10月18日)。
[0007] 转移性疾病患者的治疗在很大程度上仍取决于从原发肿瘤获得的信息，尽管常常在原发肿瘤上观察到的生物标记物与在继发性肿瘤上观察到的那些生物标记物之间存在不一致(新仓直树(Naoki Niikura),刘军(Jun Liu),林直树(Naoki Hayashi),伊丽莎白A.米特多夫(Elizabeth A.Mittendorf),龚云(YunGong),夏娜L.帕拉(Shana L.Palla),德田丰(Yutaka Tokuda),安娜M.冈萨雷斯-安古罗(Ana M.Gonzalez-Angulo),加布雷尔N.霍托巴奇(Gabriel N.Hortobagyi)及直人T.上野(Naoto T.Ueno)(2011)；过表达人表皮生长因子受体2(HER2)的原发乳房肿瘤的转移部位中HER2表达的缺失(Loss of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(HER2)Expression in Metastatic Sites of HER2-Overexpressing Primary Breast Tumors.),《临床肿瘤学杂志》(J Clin Oncol),30:593-599；都彭特杰森J(Dupont Jensen J),拉克霍姆AV(Laenkholm AV),克奴普A(Knoop A),艾沃兹M(Ewertz M),班达鲁R(Bandaru R),刘W(Liu W),哈克W(Hackl W),巴瑞特JC(Barrett JC),加德纳H.(Gardner H.)(2011)；PIK3CA突变可能在原发乳癌与其相应转移性疾病之间不一致(PIK3CA mutations may be discordant between primary and corresponding metastatic disease in breast cancer.),《临床癌症研究》(Clin Cancer Res.)17:667-77)。作为根据情况得到的继发性肿瘤和转移的起源，应了解，继发性肿瘤的生物学将为晚期癌症患者的个体化治疗增添新的视角。为了支持这一假说，已经关于若干癌症类型证实CTC在预后方面的重要性(克里斯托法力M(Cristofanilli M),布德GT((Budd GT),艾利斯MJ(Ellis MJ),斯托派克A(Stopeck A),马特拉J(Matera J),米勒MC(Miller MC),鲁本JM(Reuben JM),多伊尔GV(Doyle GV),艾拉德WJ(Allard WJ),特斯塔彭LW(Terstappen LW),哈耶斯DF.(Hayes DF.)(2004)；在转移性乳癌中的循环肿瘤细胞、疾病发展及存活情况(Circulating tumor cells,disease progression,and survival in metastatic breast cancer.),《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)351:781-91；莫伦诺JG(Moreno JG),米勒MC(Miller MC),格罗斯S(Gross S),艾拉德WJ(Allard WJ),盖米拉LG(Gomella LG),特斯塔彭LW(Terstappen LW).(2005)；循环肿瘤细胞预测转移性前列腺癌患者的存活率(Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cancer.),《泌尿学》(Urology)65:713-8；克汉SJ(Cohen SJ),庞特CJ(Punt CJ),伊安诺提N(Iannotti N),塞德曼BH(Saidman BH),萨巴斯KD(Sabbath KD),加布埃尔NY(Gabrail NY),皮卡斯J(Picus J),莫斯MA(Morse MA),米歇尔E(Mitchell E),米勒MC(Miller MC),多伊尔GV(Doyle GV),提辛格H(Tissing H),特斯塔彭LW(Terstappen LW),米罗普NJ(Meropol NJ).(2009)；转移性结肠直肠癌患者中循环肿瘤细胞的预后重要性(Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.)《肿瘤学年刊》(Ann Oncol.)20:1223-9；克雷布斯MG(Krebs MG),索兰R(Sloane R),普雷斯特L(Priest L),兰卡夏L(Lancashire L),侯JM(Hou JM),格蕾丝托克A(Greystoke A),沃德TH(Ward TH),法拉德奇R(Ferraldeschi R),胡吉斯A(Hughes A),科拉克G(Clack G),拉森M(Ranson M),戴维C(Dive C),布拉克霍FH.(Blackhall FH.)(2011)；非小细胞肺癌患者中循环肿瘤细胞的评价和预后重要性(Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer.)《临床肿瘤学杂志》(J Clin Oncol.)29:1556-63)。
[0008] 癌细胞的分子和基因组特征分析已经成为靶向疗法和肿瘤学研究的新趋势。然而，癌细胞的分子异质性及其常常改变的性质的关联性、原发肿瘤以及CTC的分子标签的关联性是有限的(鲍威尔AA(Powell AA),塔拉萨斯AH(Talasaz AH),张H(Zhang H),克拉姆MA(Coram MA),雷迪A(Reddy A)等人,(2012),循环肿瘤细胞的单细胞特征分析：乳癌细胞系中的转录异质性和多样性(Single Cell Profiling of Circulating Tumor Cells:Transcriptional Heterogeneity and Diversity from Breast Cancer Cell Lines.)《公共科学图书馆综合期刊》(PLoS ONE)7:e33788)。
[0009] 癌细胞的分子和基因组特征分析极为重要，因为它可以提供针对个体的特定癌症的靶向疗法。然而，原发肿瘤的特征分析无法呈现在转移性CTC中出现的分子变化。转移性继发性肿瘤的靶向治疗需要的是一种对CTC进行特征分析的方式。然而，在患者的血液中存在极少的CTC，因此，很难分离和表征这些细胞。此外，在患者的血液中分离少量CTC的应用也有限，除非这些细胞可以繁殖并进行检查。使CTC在组织培养物中生长是可行的，不过体外培养不能完全呈现细胞特征，具体地说，其侵袭正常组织并形成三维肿瘤，以及募集生长因子和血管的能力。
[0010] 斑马鱼(Danio rerio；一种常用的淡水水族箱鱼)，是一种重要的模型生物体，并且越来越多地用于科学研究中(雷萨科(Lieschke)和科瑞(Currie)(2007)“人类疾病的动物模型：斑马鱼(Animal models of human disease:zebrafish swims into view.)”《自然评论：遗传学》(Nature Reviews Genetics)8:353-367)。在医学上，常常将斑马鱼用于胚胎发生研究、心血管研究、神经元发育及视网膜再生中，而且近期还将其确立为几乎每类癌症的重要模型(斯托勒托夫(Stoletov)和克莱蒙科(Klemke)(2008)“今日焦点：斑马鱼作为人类癌症模型(Catch of the day:zebrafish as a human cancer model.)”《癌基因》(Oncogene)27:4509-4520)。
[0011] 斑马鱼对致癌化学试剂起反应并形成与人体中所见极其类似的赘瘤(拜克维斯(Beckwith)等人(2000)“乙基亚硝基脲在斑马鱼(Danio rerio)中诱发瘤形成(Ethylnitrosourea induces neoplasia in zebrafish(Danio rerio).)”《实验室研究》(Lab Invest.)80(3):379-385)。它还是癌症遗传学的最佳模型(斯特恩(Stern)和祖恩(Zon)(2003).“斑马鱼中的癌症遗传学和药物发现(Cancer genetics and drug discovery in the zebrafish.)”《自然评论：癌症》(Nature Rev.Cancer)3:533-539)。在斑马鱼体内基因操作的简易性有助于其成为了解血管生成、细胞凋亡和转移的优良模型(萨博迪迦(Serbedija)等人(1999)“斑马鱼血管生成：一种新颖的药物筛选模型(Zebrafish angiogenesis:a novel model for drug screening.)”；《血管 生 成》(Angiogenesis)3:353-359；帕恩格(Parng)等人(2002)“斑马鱼：用于药物筛选的临床前模型(Zebrafish:a preclinical model for drug screening.)”；《分析与药物开发技术》(Assay Dev.Technol.)1:41-48；马奎斯(Marques)等人(2009)“在斑马鱼异种移植模型中原发性人类肿瘤的转移行为(Metastatic behavior of primary human tumours in a zebrafish xenotransplantation model.)”《BMC癌症》(BMC Cancer)9:128)。
[0012] 在斑马鱼中的操作是在其生长的各个阶段进行，不过常常使用受精后48小时(hours post fertilization，hpf)并且这是特别优选用于操作的阶段之一。在大规模遗传研究、药物筛选和毒性研究，以及癌细胞分析期间处理许多斑马鱼胚胎所需的时间和人力通常是大部分实验室的限制因素。然而，目前尚无可商购的用于48hpf斑马鱼胚胎的多孔显微注射系统，这主要是因为斑马鱼胚胎较长并且奇怪的形状。
[0013] 在细胞生物学领域中众所周知自动多孔显微注射系统，其中这些系统主要被用于如DNA、RNAi、蛋白质或甚至其它细胞(如精子)等材料的核内或细胞质内注射。自动系统能够以可再现的一致性和准确性进行大量显微注射，而这通常是难以手动实现的。
[0014] 因此，为了对原发肿瘤细胞和CTC进行特征分析和表征，需要一种在动物模型中体内产生并生长肿瘤细胞的方法。此方法可以允许对肿瘤细胞进行药物测试，并且可以提供针对患者体内肿瘤细胞的靶向疗法。此外，本领域中还需要一种能够高效操作和注射48hpf斑马鱼胚胎用于遗传、毒性、药物及癌症研究的系统。
[0015] 现有技术
[0017] 斯蒂芬妮E.高斯(Stephanie E.Gaus)在2004年8月20日提交的题为“网底多孔板(Meshwell Plates)”的美国专利申请号10/923,253(或US2005/0112030A1)中披露了一种多孔板，如96孔板，其底部尖端被去除并且用带有开口的网代替，由此允许快速排干溶液并防止孔间溶液的“芯吸作用”。预计所陈述的“网底多孔板”特别适用于分析斑马鱼胚胎。
[0018] 阿方索古特-雷兹亚当(Alfonso Gutier-Rez Adan)等人在2005年5月12日提交的题为“有关胚胎和/或细胞操作的补充(Supplementation for Embryo and/or Cell Manipulation)”的PCT专利申请号PCT/ES2005/000255中披露了一种通过补充含有化合物(如合成透明质酸、从大豆获得的磷脂或不饱和脂肪酸)操作介质降低粘附性并增加粘度，同时保持所述介质的流动性以帮助在植入前阶段期间的显微操作(包括将细胞显微注射到胚胎中)，从而增加胚胎和细胞操作介质的质量和安全性的系统。
[0019] 莱昂纳多克里斯特曼(Leandro Christmann)在2005年9月12日提交的题为“用于显微注射和再植入禽蛋的显微注射组合件及其方法(Microinjection Assembly and Methods for Microinjecting and Reimplanting Avian Eggs)”的美国专利申请号11/224,364(或US2006/0010510A1)中披露了一种显微注射组合件，其包括显微镜；包含显微操作器、微量移液管和压电振荡器的显微注射系统；及呈倾斜角度的大型监测单元，所述组合件允许对禽蛋的胚盘进行显微注射。
[0020] 丹尼尔G.奥康奈尔(Daniel G.O'Connell)在2006年2月27日提交的题为“细胞盘(Cell Tray)”的PCT专利申请号PCT/US2006/0006868中披露了一种多孔细胞盘，其能够自动处理并且同时监测和分析大量的细胞、生物流体、化学试剂和/或固体样品。
[0021] 简德索尼威尔(Jan De Sonneville)在2012年3月19日提交的题为“阵列式显微注射设备及方法(Array microinjection apparatuses and methods)”的英国专利申请号1004629中披露了一种阵列式显微注射设备，所述设备包括带有一系列部分呈球形的凹口的表面。每个凹口可以容纳单个细胞或单个胚胎。接着，可以使用与保持细胞或胚胎的凹口相配的一系列注射器将材料显微注射到细胞或胚胎中，尤其是核中。
[0022] L.克里斯特曼(L.Christmann)在2008年3月4日申请专利的题为“显微注射装置及使用方法(Microinjection Device and Method of Use)”的美国专利号7,339,090中披露了包括针和观测仪器的显微注射装置，其中所述观测仪器使操作员能从除直角外的角度观测放大的物体。
[0023] M.帕拉西奥-博伊斯(M.Palacios-Boyce)在题为“可用于操作细胞或胚胎的微机电装置(Microelectromechanical Devices Useful for Manipulating Cells or Embyos)”的WO 0065137-2000-11-02中提及包括一对复合物粘接的硅晶片的细胞标记用微机电系统装置。
[0024] M.帕拉贾普(M.Paranjape)等人在题为“使用硅单晶片显微制造的阵列结合集成的微穿孔注射器进行细胞转化(Cell Transformation Using a Single Chip Silicon Microfabricated Array incorporating Micro-Piercing Injectors)”的WO2058847-2002-08-01中提供了用于将分子引入细胞中，从而在高通量水平上为所采取的这些程序提供高效手段的一种改进的方法。
[0025] 非专利文献
[0026] 1.seer.cancer.gov
[0027] 2.巴里克M(Balic M),威廉姆A(Williams A),林H(Lin H),达塔R(Datar R),科特RJ.(Cote RJ.)(2012).循环肿瘤细胞：从实验室到病床(Circulating Tumor Cells:From Bench to Bedside),《医学年评》(Annu Rev Med.),2012年10月18日[印刷版前电子版]
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发明内容
[0035] 本发明的目标
[0036] 本发明的目标是解决在动物模型中对原发肿瘤细胞和CTC进行特征分析和表征的技术问题，并且提供一种能够对斑马鱼胚胎进行高效操作和注射的系统。
[0037] 申请人已经发现，这些技术问题可以借助于一些方法来解决，所述方法包括：通过将人类CTC异种移植到斑马鱼体内来产生存活肿瘤，研究所注射的CTC的转移潜力，预测所分离的CTC的器官偏好，以及评估对治疗剂的反应。还提供了一种预测癌症发展及对化学疗法的反应的高通量快速分析方法。
[0038] 本发明的内容
[0039] 在本发明的一个方面中，提供了一种通过从活检体或以手术方式取出的肿瘤获得的原发肿瘤细胞产生三维肿瘤的方法，其步骤包括：
[0040] (a)分离肿瘤细胞，
[0041] (b)用细胞示踪染料标记肿瘤细胞，
[0042] (c)将所述细胞注射到受精后24到48小时(hpf)的斑马鱼胚胎中，
[0043] (d)将所述胚胎孵育24小时或更长时间。
[0044] 在一个实施例中，肿瘤细胞是从循环肿瘤细胞(CTC)获得。
[0045] 在另一个实施例中，细胞示踪染料是荧光染料。
[0046] 在另一方面，本发明提供了一种预测原发肿瘤侵袭或转移的可能性的方法，所述方法包括：
[0047] (a)将所述肿瘤细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄中，
[0048] (b)对所述注射有肿瘤细胞的胚胎进行孵育，
[0049] (c)在孵育之后，观察所述肿瘤细胞的位置，
[0050] (d)分析所述肿瘤细胞是否(i)通过所述卵黄囊侵袭所述胚胎的主体或(ii)所述细胞是否保留在所述卵黄囊中并且表现接近于非侵袭性原发肿瘤细胞。
[0051] 在本发明的另一个实施例中，提供了一种用于鉴别具有较高疾病复发可能性的癌症患者的方法。所述方法包括：
[0052] (a)将原发肿瘤细胞注射到胚胎的卵黄中，
[0053] (b)对所述注射有肿瘤细胞的胚胎进行孵育，
[0054] (c)在孵育之后，观察所述肿瘤细胞的位置，
[0055] (d)如果所述肿瘤细胞进入所述胚胎的主体中，那么所述原发肿瘤侵袭和转移的倾向较高。
[0056] 在另一个实施例中，癌细胞侵袭可以通过多个步骤定量，所述步骤包括：
[0057] (a)从实体肿瘤分离肿瘤细胞，
[0058] (b)用细胞示踪染料标记细胞，
[0059] (c)将所述细胞显微注射到24-48hpf斑马鱼胚胎的卵黄中，
[0060] (d)在35℃下孵育所述胚胎24小时或更长时间，
[0061] (e)在荧光显微镜下采集所述肿瘤细胞的自动荧光图像，
[0063] (g)在所采集的图像上所述肿瘤病灶的面积提供了所述病灶的大小并且可以使用2
1/2WL计算体积，其中W＝宽度并且L＝长度。
1/2WL计算体积，其中W＝宽度并且L＝长度。
[0064] (h)使用所述肿瘤病灶的位置来测量所述原发肿瘤侵袭的倾向。侵袭性指数可以测量如下：
[0065] 侵袭指数(II)＝1/nΣ(在T小时的时候，所述胚胎中肿瘤病灶的数量/所述胚胎中注射的肿瘤细胞的总数)，其中n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间T。
[0066] (i)可以使用所述肿瘤病灶的位置来测量所述肿瘤的侵袭的侵袭能力(aggressiveness)。迁移指数可以测量如下：
[0067] 迁移指数(MI)＝1/nΣ(在T小时的时候的CD/在时间T小时的时候肿瘤病灶的总数)，其中CD＝肿瘤细胞行进的累积距离，n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间。
[0068] 在另一个实施例中，提供了一种测量肿瘤细胞对化学试剂的反应的方法，所述方法是通过确定以下任一项在存在与不存在所述化学试剂的情况下是否不同来实现：所述肿瘤病灶的体积；侵袭指数；或迁移指数。
[0069] 在本发明的另一个实施例中，可以使用具有荧光标记(如Tg(Fli:EGFP))的血管形成的转基因鱼，通过图像分析以一种自动方式预测归巢的优选器官。基于血管形成，可以预测出胚胎中肿瘤病灶的位置。所述方法包括：
[0070] (a)从实体肿瘤分离肿瘤细胞，
[0071] (b)用细胞示踪染料标记细胞，所述细胞示踪染料具有红色荧光，如PKH-26(西格玛公司(Sigma))或DiD(生命技术公司(Lifetech))，
[0072] (c)将所述细胞显微注射到24-48hpf Tg(Fli:EGFP)斑马鱼胚胎的卵黄中，[0073] (d)在35℃下孵育所述胚胎24小时或更长时间，
[0074] (e)使用针对绿色和红色荧光的滤光器，在荧光显微镜下采集所述肿瘤细胞的自动荧光图像，
[0075] (f)使用图像分析软件自动分析所述肿瘤病灶。所采集的数据是所述图像中所述病灶的位置，
[0076] (g)图像分析可以通过一种自动方式预测所述肿瘤的归巢指数并且可以计算如下：
[0077] 归巢指数(HI)＝1/nΣ(在T小时的时候器官中病灶的总数/在时间T小时的时候肿瘤病灶的总数)，其中n是实验中所认为的胚胎的数量，以及T是孵育时间T。
[0078] 在另一个实施例中，本发明呈现一种监测在肿瘤侵袭、转移和器官归巢过程期间斑马鱼免疫系统的变化的方法，所述方法包括：
[0079] (a)可以使用含有在免疫细胞中表达的荧光蛋白的遗传修饰的胚胎监测特定免疫细胞的位置和数量变化。举例来说，可以使用表达gata2-GFP的胚胎监测存在于斑马鱼身体任何部分处的嗜酸性细胞的位置并测量其数量。
[0081] 在本发明的另一个方面中，提供了一种用于测量在存在或不存在合成或天然存在的化学试剂或生物试剂的情况下孵育之后存活肿瘤细胞的数量的方法，所述方法包括：
[0082] (a)在蛋白酶溶液中消化胚胎，
[0083] (b)通过用移液管抽吸来轻轻地分散细胞以将所述斑马鱼胚胎解离成单细胞悬浮液，
[0084] (d)固定细胞并在荧光显微镜下进行计数，
[0085] (e)比较经过处理的斑马鱼胚胎与未处理的斑马鱼胚胎之间存活荧光肿瘤细胞的总数比注射的细胞数量的比率，以相对于未处理的胚胎预测合成或天然存在的化学试剂和生物试剂的影响。
[0086] 在另一个实施例中，提供了一种预测药物针对肿瘤细胞侵袭性的功效的方法，所述方法包括测量并比较在存在或不存在所述药物的情况下肿瘤细胞的侵袭性模式，以及比较在所述药物存在下细胞侵袭力是否不同。
[0087] 在另一个实施例中，提供了一种通过观察在不存在与存在所述药物的情况下器官归巢模式的变化来预测药物对癌细胞的器官归巢偏好的影响的方法。
[0088] 在本发明的另一个方面中，提供了一种用于评估肿瘤细胞DNA的变化的方法，所述方法包括：
[0089] (a)酶促消化整个胚胎或含有肿瘤细胞的斑马鱼组织的一部分，
[0090] (b)从所述消化的胚胎或组织分离DNA，
[0091] (c)使用被设计用于人类基因序列的PCR引物对相关基因进行PCR扩增，[0092] (d)进行测序以定位突变，
[0093] (e)进行亚硫酸氢盐测序以定位表观遗传修饰。
[0094] 在本发明的另一个方面中，提供了一种分析癌细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：
[0095] (a)酶促消化整个胚胎或含有肿瘤细胞的斑马鱼组织的一部分，
[0096] (b)从所述消化的胚胎或组织分离RNA，
[0097] (c)使用被设计用于人类基因序列的特定引物对基因表达进行定量实时PCR分析。
[0098] 在本发明的另一个方面中，提供了一种分析癌细胞中的蛋白质表达的方法，所述方法包括以下之一：
[0100] (b)在注射肿瘤细胞之后，可以使用免疫组织化学分析在斑马鱼胚胎的组织学切片载片上观测蛋白质，
[0102] 在另一个方面中，本发明提供了一种自动显微注射48hpf斑马鱼胚胎的多孔显微注射系统。所述系统包括(A)保持架；负载于所述保持架内的底部保持板；及多个可拆式多孔模块。每个多孔模块由槽板和可拆式插件组成。每个槽板具有以线性形式布置的多个胚胎保持孔，这些保持孔具有敞开式圆锥形底部。每个槽板在槽板的外缘处具有一个呈圆柱形的孔模块，由此允许通过此孔处理液体。每个槽板具有可拆式插件，其具有垂直侧面以及与槽板中的每个凹槽对准的上部圆形开口，由此当放在槽板顶部之上时，形成胚胎保持和处理孔。提供了盖子用于遮盖保持架、槽板和可拆式插件。所述系统还包括(B)可旋转地安置于所述多孔板之上以便能在不同角度和/或高度注射胚胎的显微注射用微量移液管。
[0103] 在另一个实施例中，本发明提供了一种用于自动显微注射受精后24到72小时的斑马鱼胚胎的方法，所述方法包括：将多个受精后24到72小时的斑马鱼胚胎放入所述多孔显微注射系统(如本文特别描述的)的多孔模块中的相关孔模块中，以及将所选分子显微注射到斑马鱼胚胎的卵黄中。
[0104] 在另一个实施例中，本发明提供了一种用于使肿瘤细胞被斑马鱼胚胎高效吸收的方法，所述方法包括将肿瘤细胞显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎的卵黄中，以及在显微注射所述肿瘤细胞期间或之后，另外将促血管生成因子(例如血管生成素)显微注射到斑马鱼胚胎的卵黄中，或将促血管生成因子(例如血管生成素)添加到有斑马鱼仔鱼游动的水中。
[0105] 在另一个实施例中，本发明提供了一种用于测试药物对肿瘤细胞的作用的方法，所述方法包括将肿瘤细胞显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎中；使肿瘤在所述斑马鱼胚胎内生长预定时间；将用于测试对肿瘤细胞的作用的药物显微注射到所述斑马鱼胚胎中；及通过测量肿瘤细胞的量来监测所述药物对肿瘤细胞的作用。
[0106] 本发明的变化形式
[0107] 本发明的多孔显微注射系统方面的变化形式包括以下各项：
[0108] 所述多个胚胎保持孔各自在其敞开式圆锥形底部与在槽板外缘处的孔模块的底部互相连接；
[0110] 所述显微注射的自动化是使用通过机械臂控制的微量移液管单元进行；
[0111] 所述微量移液管注射系统被构造和布置成可旋转地安置，由此在不同角度和/或高度注射胚胎；
[0113] 所述机械臂是通过胚胎结构的人类视觉辨识，或通过借助于细胞的荧光标记对胚胎结构的视觉辨识，或借助于被编程成能够检测液体成功注射的软件来控制的，所述软件是可商购的软件控制接口，或开发的专门设计用于在斑马鱼胚胎中进行显微注射的特定自动注射系统；
[0114] 关于注射部位和注射方案的选择的自动化是通过软件更新改变的；及[0115] 自动显微注射系统是通过可商购的显微注射器注射系统，或通过所开发的专门设计用于在斑马鱼胚胎中进行显微注射的特定自动注射系统控制的。
[0116] 本发明的有关测试药物对肿瘤细胞的作用的方法方面的变化形式包括在向肿瘤细胞注射或不注射染色剂(例如亲脂性荧光染色剂)之前，将肿瘤细胞显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎中，以及在将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼胚胎中之前、期间或之后，另外将促血管生成因子(例如生长因子血管生成素)显微注射到受精后24到72小时的斑马鱼胚胎的胚胎中，或将促血管生成因子添加到有仔鱼游动的水中。
[0117] 本发明的其它特征
[0118] 所述设备可以在存在适当保持架和槽板并且不含可拆式插件的情况下使用，由此允许胚胎保持在槽板的凹槽中，同时可以通过微量移液管接近以在不同角度进行显微注射。在此配置中，可以将可拆式注射盖板放到槽板上并且可以使用其来引导注射受精后48小时的斑马鱼胚胎，所述可拆式注射盖板在由槽板形成的每个圆锥形孔之上具有内衬橡胶的孔口。
[0119] 本发明还提供了有关通过胚胎结构的视觉辨识来控制机械臂的一种选择。在这些情况下，软件可以被设计成能够在液体或标记的细胞发荧光时检测成功注射。关于注射部位和注射方案的选择的自动化也可以通过简单的软件更新改变。通过视觉辨识系统进行自动化也能够使用较小数量的胚胎和排空的孔。
[0120] 本文中所描述的设备还可以与可商购的手动显微注射器一起使用。即使用于手动操作，这一设备仍将通过减少额外的导管处理和标记来减少劳动力。由于胚胎没有从其孔中取出，故胚胎混合和误标记的几率以及胚胎中的诱导应力大幅减小。
[0121] 当在液体中存在活胚胎时，不能使用机械臂更换孔中的液体。然而，更换内部不含活胚胎的一个孔中的介质的能力使机械臂的使用可行。此外，手动更换含有活胚胎的孔中的液体会对胚胎产生极大应力。通过这种方法，逐渐更换槽板外缘处呈圆柱形的孔模块中的溶液可以降低对胚胎的不必要的应力。
[0122] 本发明不仅容易地处理用于显微注射液体和细胞的大量胚胎，而且还能够以一种高通量的方式进行胚胎中肿瘤块的适当定位和注射。
[0123] 本文中所描述的多显微注射系统具有低成本，并且可以按“一次性使用”方式制造。
[0124] 本文中所描述的多孔显微注射系统和使用方法大大地简化了大量胚胎的处理并且改进了众多实验间的注射准确性和一致性。由于单一模块中的所有孔都是连接的，故所有胚胎都得到相同处理。由干燥引起的介质体积的不等损失，或每个孔的添加量不等不会引起孔间的任何变化。同一处理组中的胚胎全部同等地暴露于此类改变。
[0125] 这一多孔显微注射系统的优选实施例适于以96孔形式使用，不过这一系统也可以改为6孔板、12孔板或24孔板形式。
[0126] 这一多孔显微注射系统的优选实施例适用于受精后48小时的斑马鱼胚胎，但也适于操作受精后24到72小时的斑马鱼胚胎、操作来自其它鱼种(例如青鳉鱼(Medaka))的胚胎以及来自非洲爪蟾属、啮齿动物、犬类及其它实验动物的胚胎。附图说明
[0127] 在附图中：
[0128] 图1：侵袭性与非侵袭性原发性肺肿瘤细胞对药物的差异性反应。
[0129] 图1A：以图形方式呈现通过成像采集的30个异种移植物的肿瘤坐标。
[0130] 图1B：用太平洋紫杉醇(Paclitaxel)处理的28个异种移植物的肿瘤坐标。
[0131] 图1C：用太平洋紫杉醇和卡铂(Carboplatin)处理的29个异种移植物的肿瘤坐标。(-D＝无药物对照，+P＝用太平洋紫杉醇处理，C+P＝用卡铂和太平洋紫杉醇处理)[0132] 图1D：计算的未处理的异种移植物和经过处理的异种移植物的迁移指数。(-D＝无药物对照，+P＝用太平洋紫杉醇处理，C+P＝用卡铂和太平洋紫杉醇处理)
[0133] 图1E：计算的未处理的异种移植物和经过处理的异种移植物的侵袭指数。(-D＝无药物对照，+P＝用太平洋紫杉醇处理，C+P＝用卡铂和太平洋紫杉醇处理)
[0134] 图1F：在异种移植物中观察到脑转移性肿瘤，简要概述了在患者中所观察到的器官归巢现象。
[0135] 图1G：异种移植物中脑转移性肿瘤的药物反应。(-D＝无药物对照，+P＝用太平洋紫杉醇处理，C+P＝用卡铂和太平洋紫杉醇处理)
[0136] 图1H：用太平洋紫杉醇处理的异种移植物中侵袭性细胞和非侵袭性细胞的药物反应。药物反应是通过MGMT的表达测量，其中9种关于存活并且9种关于死亡。
[0137] 图1I：用太平洋紫杉醇和卡铂处理的异种移植物中侵袭性细胞和非侵袭性细胞的药物反应。
[0138] 图2是本发明一个方面的多孔板组装部件的俯视图；
[0139] 图3是图2实施例的一个可拆式模块的俯视图；
[0140] 图4是显示胚胎处理孔的截面，其中槽板位于图2实施例的保持架内；
[0141] 图5是图2实施例的胚胎处理孔和可拆式插件的放大的截面；
[0142] 图6A是48hpf斑马鱼胚胎的水平截面图，并且图6B是48hpf斑马鱼胚胎的横向截面图；
[0143] 图7是在图2实施例的存在注射盖板和用于显微注射的微量移液管的槽板中48hpf斑马鱼胚胎的布置的示意性侧视图；
[0144] 图8是图2实施例的用于显微注射的可旋转微量移液管的示意性侧视图；
[0145] 图9是根据本发明的实施例，在槽板中的48hpf斑马鱼胚胎的示意性侧视图，所述槽板具有注射盖板作为用于将肿瘤显微注射到48hpf斑马鱼胚胎中的微量移液管的引导件；
[0146] 图10是根据本发明的实施例，在槽板中的48hpf斑马鱼胚胎的示意性侧视图，显示了在胚胎处于槽板中时，用于显微注射的微量移液管的可旋转角度；及
[0147] 图11A和图11B是根据本发明的实施例，在槽板中的48hpf斑马鱼胚胎的示意性侧视图，显示了微量移液管旋转的灵活性，同时仍允许接近槽板中用于进行显微注射的胚胎。
具体实施方式
[0148] 概述
[0149] 癌细胞的分子和基因组特征分析已经成为靶向疗法和肿瘤学研究的新趋势。然而，癌细胞的分子异质性和其常常变化的动态性质的关联性、原发肿瘤以及侵袭或转移的肿瘤细胞的分子标签的关联性是有限的。在此情况下，由于当前针对转移性癌症的化学疗法的功效有限，以及癌细胞基因组特征分析的应用有限，我们已探索在肿瘤组织外(例如，以手术方式取出的原发肿瘤、活检体、CTC等)产生在生物学上相关的代表性存活3D肿瘤来获得关于侵袭和转移的临床相关生理学信息的可能性。
[0150] 对于一种成功的个体化靶向癌症治疗方法，需要一种能预测患者的肿瘤生理学(如生长、侵袭能力、转移性器官归巢等)以及对各种抗癌治疗的反应的快速分析方法。
[0151] 然而，由于所有癌症的动态性质，使得个体化靶向治疗方法变得复杂。由于每个原发性、侵袭性或转移性肿瘤是由非均质细胞群组成。因此，一种将癌细胞库分离/分级分离成各种生理性或分子类别的方法是很重要的。
[0152] 本发明提供了用于预测癌症发展和对治疗的反应的分析和方法。所述方法可以使用一种高级的“癌症发展和反应基质(Cancer Progression and Response Matrix)”。因此，本发明的某些实施例可以用于促进基于可预测的肿瘤发展和对治疗的反应进行个体化靶向疗法的设计。
[0153] 定义
[0154] 如本文中所使用，除非详细说明，否则以下术语具有以下含义：
[0156] “肿瘤”包括在受试者体内或身体上发现的细胞块，其具有某种生理、组织学、分子和或构造异常的形式。
[0157] “癌症”包括具有以不受控制的方式生长的异常细胞的一类疾病的任何成员。这包括了所有赘生性病况和所有癌症，无论其特征是良性、侵袭性、局部性、转移前、转移性、转移后、软组织还是实体性的，包括任何分期或等级。
[0158] “生物学”或“生理学”典型地包括形态、生理机能、解剖结构、行为、起源及分布。
[0159] “病理生理学”完全典型地意谓与病况有关的无序的生理过程。确切地说，癌症是由包括染色体异常、基因突变及表观遗传改变在内的进行性基因异常引发的一组疾病。特别是表观遗传改变，它是对不涉及核苷酸序列变化的基因组的功能相关的修饰，在调控癌细胞总体生物过程方面起到了重要作用。由于环境暴露，已经观察到表观遗传变化。
[0160] “活检”是指取出细胞或组织样品用于诊断或预后评价的方法。任何已知的活检技术都可以应用于本发明的方法和组合物。代表性活检技术包括(但不限于)切除活检、切取活检、针穿刺活检及手术活检。所用活检技术的选择取决于有待评价的组织类型以及肿瘤的位置、大小和类型。
[0161] “侵袭”是指侵犯或侵入。确切地说，侵袭性肿瘤细胞是能够侵入周围组织中的细胞。并非所有肿瘤细胞都具有侵袭能力。
[0162] “转移”是在距癌症原发部位一定距离处发生的继发恶性生长(“转移性肿瘤”)。它是癌细胞从一个器官或身体的一部分扩散到另一不相邻的器官或部分。癌细胞首先移到循环系统(内渗)中，随后定位于继发部位中，产生继发性肿瘤(外渗)。
[0163] “循环肿瘤细胞”或“CTC”是已经历内渗并且在循环中发现的肿瘤细胞。循环肿瘤外细胞包括(但不限于)循环肿瘤细胞、播散性癌细胞和癌症干细胞。循环肿瘤细胞可以潜在地从如全血、痰液、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸液、淋巴、唾液、针抽吸液等任何可得到的生物流体获得。
[0164] “器官归巢”涉及循环肿瘤细胞在转移的器官中的种植。原发肿瘤倾向于转移到特定的远端“目标”器官。举例来说，肺癌常常倾向于转移到脑。所述过程或器官选择不是一个随机过程，不过器官归巢背后的生理学尚未了解。
[0165] “信号转导”是在细胞外信号传导分子活化细胞表面受体(“信号传导分子”或“信号转导蛋白”)时发生。此受体转而改变细胞内分子，产生反应，所述反应典型地包括一系列有序的生物化学反应。
[0166] “分子遗传肿瘤标记物”或“MGTM”已经基于肿瘤的生物特征，如肿瘤发生、生长、侵袭和转移进行鉴别。一些实例包括(但不限于)致癌基因(K-ras、erbB-1(EGFR)、erbB-2(HER-2/neu)、bcl-2、c-myc/N-myc/L-myc、c-kit)、肿瘤抑制基因(p53、RB、p16、p27、FHIT、RASSF1 A)、端粒酶、侵袭和转移标记物(MMP、VEGF、COX-2)、细胞粘附因子(E-钙粘素、β-连环蛋白)、上皮标记物(细胞角蛋白、CEA)、细胞凋亡标记物(半胱天冬酶-3、裂解的PARP)、单核苷酸多态性(SNP)，以及抗癌药敏感性标记物(MRP、LRP、MDR、β-微管蛋白、ERCC1)。在抗癌药存在下信号传导路径的差异性活化/去活化以及细胞侵袭性和/或器官归巢的变化可以帮助选择适于每位患者的适当剂量的癌症疗法方案。可以存在众多相关应用，包括预测指定患者的化学疗法的进展情况。
[0167] “化学试剂”在广义上表示所获得的呈粗品形式，或从天然来源(在自然界通过植物获得)或人工来源(如在实验室人工合成)纯化的所有化合物或物质。
[0168] “合成或天然存在的化学试剂和生物试剂”包括(但不限于)存在于自然界中、人工产生，由活有机体(植物、动物等)制备，或从非活体动物来源或矿石提取的药用或治疗用物质、非药用物质。这些可以包括化学治疗药物、药物配制品、天然保健产品、粉末、茶叶和提取物、血清、疫苗、抗原、抗毒剂等。
[0169] “免疫调节”是对免疫反应的调节，如免疫增强(免疫系统的活化)、免疫抑制(免疫系统的抑制)或免疫耐受性的诱导。确切地说，在肿瘤微环境中，免疫细胞与恶性细胞之间存在一种复杂的动态性，由于免疫系统同时具有肿瘤促进作用和抑制作用，故这种动态性实际上与预后存在重要关联。肿瘤浸润免疫细胞，以及在肿瘤部位处的慢性炎症在生长、进展(procession)、侵袭及转移性疾病中起到重要作用。因此，免疫调节可以极大地影响疾病的发展。因此，在本发明的上下文中，免疫调节表示对伴随患者的肿瘤细胞块一起出现的肿瘤浸润免疫细胞的免疫反应的调节，调控免疫系统调控剂(白细胞介素和干扰素)以及调控宿主免疫系统，确切地说，斑马鱼免疫细胞。
[0170] 循环肿瘤细胞注射的实例
[0171] 实验1：在斑马鱼中注射乳癌细胞系MDA-MB-231
[0172] 收集斑马鱼卵并在36℃下于E3培养基(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4、0.1％亚甲基蓝)中孵育48小时。用三卡因(tricaine)使胚胎麻醉并使用
5号杜蒙(Dumont)镊子脱卵壳。
5号杜蒙(Dumont)镊子脱卵壳。
[0173] 使MDA-MB-231细胞(转移性乳癌细胞)在D-MEM(高葡萄糖)、10％胎牛血清(FBS)、0.1mM MEM非必需氨基酸(NEAA)、2mML-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素中生长并使用CM-Dil(Vibrant，生命技术公司；4ng/μl最终浓度，在37℃下孵育4分钟，随后在4℃下孵育15分钟)进行标记。将50个细胞注射到一个三卡因麻醉的48hpf斑马鱼胚胎的卵黄中。注射后24小时获取图像。
[0174] 结果：注射之后，分离的CTC定位于注射部位，而且在斑马鱼胚胎的整个尾部可见，并能够在斑马鱼胚胎中形成转移模式。
[0175] 实验2.通过从血液分离的CTC在斑马鱼中产生肿瘤
[0176] 从来自已经转移到脑中的第4期肺癌患者以及一名对照健康个体的20ml血液(EDTA-Ca作为抗凝血剂)中收集CTC。根据制造商的说明书，通过使用抗体涂布的磁珠(Dynabeads，生命技术公司)进行连续阳性选择(抗EpCam BerP4抗体，艾碧康(AbCaM))和阴性选择(抗CD45抗体，艾碧康)来收集CTC。对于每个步骤，进行两次捕捉—洗涤—释放。从转移性患者得到约110个细胞，而在健康供体中未能检测到细胞。在37℃下，用DiO(Vibrant，生命技术公司；200mM最终浓度)对所获得的CTC进行染色，保持20分钟。总计将100个染色的CTC细胞注射到一个三卡因麻醉的48hpf斑马鱼胚胎的卵黄中。注射后24小时获取图像。
[0177] 结果：分离的CTC能够形成肿瘤并在斑马鱼仔鱼的脑组织中形成转移。
[0178] 实验3.侵袭性和非侵袭性原发肺肿瘤细胞对药物的差异性反应。
[0179] 将来自已显示转移到脑部的晚期肺癌患者的肿瘤组织切碎，并按照制造商的说明书，在Liberase DL(罗氏公司(Roche))中孵育。使肺细胞通过70微米的细胞过滤器，并将其再悬浮于2ml RPMI 1640中，随后进行计数。通过锥虫蓝排除法确定细胞活力。遵循制造商的说明书，用荧光示踪PKH-67染料(西格玛公司)标记细胞，并将其再悬浮于含有25mM葡萄糖的PBS中。使用NanojectII微操作器装置将100个细胞注射到卵黄囊中。一组胚胎仅注射PBS+葡萄糖作为对照组。接着在含有抗生素/抗霉菌素溶液的TE水中孵育胚胎，并使其在35℃孵育箱中恢复过夜。在肿瘤移植后孵育24小时之后，在荧光显微镜下获取胚胎图像，以确保卵黄囊中存在肿瘤细胞。添加不同浓度的药物/治疗，并且在35℃下再孵育含有胚胎的板3天。用三卡因使胚胎麻醉并且在荧光显微镜再次获取图像。本实验中使用的药物是单独太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇与卡铂的组合。通过18种基因(BCL2、BCL-X、BCL-B、BFL-1、BCL-W、MCL1、CDC2、CYCLIN-D、CYCLIN-A1、BAX、BAK、BOK、BID、BIM、BAD、BMF、NOXA、PUMA)的表达来测量药物反应，其中九种(9)关于存活(生长和细胞周期)以及九种(9)关于死亡(细胞凋亡)。
[0180] 结果：以图形方式呈现的肿瘤坐标(图1)显示出在存在或不存在药物治疗的情况下侵袭和转移模式的极高再现性。如通过侵袭指数、迁移指数以及归巢指数所测量，侵袭性肿瘤与非侵袭性肿瘤细胞在药物存在下具有不同反应。在非侵袭性细胞和侵袭性细胞的存活(通过细胞周期和生长测量)和死亡(通过细胞凋亡测量)方面也存在极明显的差异。
[0181] 使用显微注射设备的实例
[0182] 关于图2到图5的说明
[0183] 如图2到图5中所见，本发明一个方面的多孔板组装部件10包括保持架12，其包括负载多个胚胎处理孔24的底板28。在此实施例中，组合件10被制造成96孔板形式并且遵照国际标准，不过也可以使用其它标准。因此，这种设置可以用于所有标准微量滴定板读取器并且可以在所有适合的液体处理器中操作。多孔板组装部件10包括用于提供安全性、隔离作用并防止孔中的液体干燥的盖子16，所述盖子优选具有标记标出多孔板组装部件10各孔的位置。
[0184] 在此实施例中，在保持架12上安装有八个可分离的可拆式模块18(详情参见图3)。这八个可分离的可拆式模块18各自具有槽板20以及安装在槽板20上的可拆式插件
22。如图4中所见，槽板20包括多个以上提到的胚胎处理孔24和一个侧向液体处理孔26。
22。如图4中所见，槽板20包括多个以上提到的胚胎处理孔24和一个侧向液体处理孔26。
[0185] 每个胚胎处理孔24优选具有圆柱形的上部部分30和圆锥形的下部部分32。侧向液体处理孔26优选完全呈圆柱形。侧向液体处理孔26和胚胎处理孔24在其出口端通过横向排放通道34互相连接。可拆式插件22的外缘紧靠保持架12并且其下缘紧靠胚胎处理孔24的外缘。为了更好地操作胚胎，可以拆掉可拆式插件22。可拆式插件22的安装不需要是气密性的，因为在每个胚胎处理孔24之间存在上述相互连通。底板28应优选是透明并且UV可穿透的。可拆式插件22可以着色。
[0186] 在此实施例中，如图2到图4中所见，有11个用于容纳胚胎的胚胎处理孔24(W1-11)和一个侧向液体处理孔26。如先前所描述，侧向液体处理孔26和胚胎处理孔24在其出口端通过横向排放通道34互相连接。因此，一个孔(例如孔W1)中液位的任何变化都将通过其它孔(例如孔W2到W11)进行补偿。这将防止孔的不均匀干燥并且所有孔都将具有相同液位。因此，所有液体处理、培养基更换等都可以在液体处理孔26中通过机械液体处理器进行，由此实质上防止针对胚胎的处理、损害或应力。
[0187] 所有操作都是在槽板20上进行的。如先前所描述，胚胎处理孔24具有圆锥形底部32，其中可以放置斑马鱼仔鱼。如稍后将在图6A和图6B中见到的，鉴于斑马鱼仔鱼的形状，一旦麻醉，其将落入胚胎处理孔24的孔的圆锥形下部32中，并且卵黄在上面。如将在图7中见到的，可以将盖板36安置在槽板20之上，在可拆式插件22的位置。如将在图7中见到的，此盖板36可以充当将肿瘤细胞以及促血管生成因子注射到胚胎中的引导件。
[0188] 图4中虚线内的矩形区域在图5中放大显示。
[0189] 关于图6A和图6B的说明
[0190] 图6A是48hpf斑马鱼胚胎的水平横截面，并且图6B是48hpf斑马鱼胚胎的垂直横截面。
[0191] 关于图7和图8的说明
[0192] 如图7中所见，微量移液管单元40可以具有可更换的微量移液管42，优选是玻璃制的。48hpf斑马鱼胚胎48被安置在胚胎处理孔24的圆锥形下部部分32中，并且其背侧50在圆锥形部分32的下部较窄端内，而其卵黄52在圆锥形部分32的上部较宽端中。此处提供的单元是通过盖板36保护的。微量移液管单元40被安置用于将肿瘤细胞以及促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)通过盖板38中的孔口注射到卵黄52中。
[0193] 如图8中所见，具有可更换的微量移液管42的微量移液管单元40是通过机械臂54控制的。具有肿瘤细胞以及促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)的液体溶液是经由导管56通过机械臂52导入。机械注射臂54可以借助于控制臂58旋转任何角度。所述旋转示意性地以箭头60显示。
[0194] 关于图9、图10和图11的说明
[0195] 图9是图7的简化复制图，显示了使用盖板36作为引导件，以将肿瘤以及促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)注射到卵黄52中。
[0196] 如图10中所见，操作可以在显微镜62下进行，无需在适当位置具有可拆式插件。这允许在任何角度操作胚胎并且可以对胚体50、52的任何部分进行注射。
[0197] 如图11A中所见，微量移液管单元40可以在实线显示的垂直位置到虚线显示的倾斜位置间旋转，由此可以对胚体50、52的任何部分进行注射。
[0198] 如图11B中所见，微量移液管单元40可以在实线显示的倾斜位置到虚线显示的垂直位置间旋转，由此可以对胚体50、52的任何部分进行注射。图8B还显示，胚体50、52也可以旋转。
[0199] 操作方法
[0200] 在48hpf，对胚胎脱卵壳，并使用玻璃移液管移到孔中。必要时，可以用促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)处理胚胎以增加肿瘤细胞摄取的可能性和效率。通过孔36部分去除培养基，并添加三卡因以使胚胎麻醉。也可以将三卡因溶液添加到每个孔24中以加速所述过程。胚胎经历麻醉并掉落到槽板20的胚胎处理孔24的下部圆锥形底部32中。鉴于在胚胎处理孔24底部的圆锥形状32，以及卵黄52比胚体50的其余部分要轻，故仔鱼掉落时，卵黄52面朝上。必要时，可以安置注射盖板36，用于引导肿瘤细胞以及促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)。使用装备有玻璃微量移液管40的机械臂54将肿瘤细胞以及促血管生成因子(优选生长因子血管生成素)注射到胚胎卵黄50中。卵黄囊自身迅速地密封。
[0201] 一旦注射完成，就移开注射盖板36并安置可拆式插件22以产生孔24。
[0202] 通过孔26用移液管吸出三卡因溶液可以更换孔24中的流体，并通过孔26再次添加新鲜的培养基。用于每行11个胚胎的孔24将因此被填满，并且每个胚胎将从麻醉中苏醒。一旦这些胚胎苏醒，它们就会在其自身孔中自由地四处游动并且不会与相邻的胚胎混合。这允许保持对个别胚胎的追踪。上面带有盖子16并且内部有斑马鱼仔鱼游动的完整组装的单元可以逐一往上堆叠，并且储存在孵育箱中，其它微量滴定板也可以如此处理。
[0203] 由于槽板20优选是透明的，故可以在UV下实时观察仔鱼，无需对仔鱼进行处理。必要时，可以如先前所提到的，使仔鱼麻醉以便观察，而无需对其进行处理。不仅可以使用软件测量肿瘤生长，而且还可以实时观察游动行为。此类观察可以手动地进行或通过使用检测软件进行。
[0204] 在进行上述示例性实验之后，如果需要对仔鱼实施安乐死并进行染色，那么有关仔鱼的所有处理以及液体的更换都可以在此板中进行。全胚胎染色的一个最重要的步骤是在溶液中摇动并振荡胚胎以便适当混合。
[0205] 这一步骤一般是在艾本德管(Eppendorf tube)中进行的，因为在大部分96孔板中无法良好地混合，即使是在振荡机上也是如此。通过仅在孔26中用移液管来回抽吸，可以在单一模块上摇动和振荡全部11个胚胎。类似地，使用编程的液体处理器，可以优化所有此类针对整个板的工艺。
[0206] 一旦完成了全部染色，可以使用UV板读取器直接计算荧光度作为肿瘤质量的量度。这一设备还可以用于其它注射液，如DNA、RNA、吗啉核酸。
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