莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用
阅读：220发布：2023-01-26
专利汇可以提供莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及的莫能菌素一种新用途，特别涉及莫能菌素在制备 治疗 肺 腺癌药物中的应用。通过体内抑瘤实验，发现莫能菌素能抑制A549细胞的增殖，抑制裸鼠皮下 肿瘤 的生长。MTT法检测细胞存活率，发现莫能菌素对A549细胞生长的抑制作用表现出一定的时间依赖性以及剂量依赖性。通过Caspase 试剂 盒 检测Caspase酶活性和细胞凋亡的ELISA检测，发现caspase‑3/9/4参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡，caspase‑8没有参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡。以莫能菌素为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的抗肿瘤药物，如各种口服制剂和注射剂等。，下面是莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用专利的具体信息内容。
莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及莫能菌素的一种新用途，特别涉及莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用
背景技术
[0002] 莫能菌素又称莫能霉素、肉桂霉素和瘤胃素，是一种聚醚类离子载体抗生素。其纯品为白色或白色结晶粉末，并伴有特殊臭味，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂。分子量为670.88，分子式为C36H62O11。化学结构式见图1。
[0003] 莫 能 菌 素 由 H a n e y 等 人 于 1 9 6 7 年 率 先 从 肉 桂 地 链 霉 菌(Streptomycescinnamonensis)的发酵液中分离得到。1971年由美国礼来公司将其推向市场，此后被广泛用作反刍动物的饲料添加剂及抗球虫药物。
[0004] 目前，对莫能菌素的研究主要集中在其提高反刍动物及家禽对饲料的利用率、抗虫性及药物残留等方面。研究发现，莫能菌素能影响反刍动物瘤胃内的能量代谢，改变瘤胃的发酵类型，抑制瘤胃高效产氨菌的生长，从而减少瘤胃氨产生，提高蛋白质利用效率。此外，莫能菌素作为一种离子载体，可以有效地结合Na+、K+离子形成脂溶性络合物，通过胞膜转移进入球虫体内，干扰其正常的渗透压，从而达到抑制或杀死球虫的目的。
[0005] 鉴于目前多种抗肿瘤抗生素在临床上的成功应用，莫能菌素也可能具有治疗肿瘤的潜力，所以我们选择莫能菌素作为研究药物。理想的抗肿瘤药物具有高效、低毒、能克服多药耐药等特点，并且能使肿瘤细胞以温和的方式如凋亡或自噬走向死亡，而对正常细胞无毒副作用。
[0006] 本发明以人的肺腺癌A549细胞为研究对象，以莫能菌素为供试药物，来探究莫能菌素的体内外抗肿瘤作用及其初步的作用机制。通过这些研究，希望能为肺腺癌的治疗提供一定的理论研究基础，为肺腺癌的治疗提供新的化疗药物。
发明内容
[0007] 为解决现有技术上的不足，本发明提供了莫能菌素的一种新用途。
[0008] 本发明的技术方案如下：莫能菌素在制备治疗肺腺癌药物中的应用。
[0009] 莫能菌素提高caspase-3活性，诱导A549细胞的凋亡。
[0010] 莫能菌素提高caspase-9活性，诱导A549细胞的凋亡。
[0011] 莫能菌素提高caspase-4活性，诱导A549细胞的凋亡。
[0012] 莫能菌素通过内质网途径及线粒体途径诱导A549细胞的凋亡。
[0013] 以莫能菌素为活性成分，可用于制备治疗肺腺癌药物，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的抗肿瘤药物，如各种口服制剂和注射剂等。
[0015] 图1是莫能菌素的化学结构式。
[0016] 图2是不同监测点的裸鼠肿瘤体积。
[0017] 图3是吉姆萨染色观察细胞凋亡（48h）。
[0018] 图4是不同作用时间莫能菌素对A549细胞生长的抑制作用。
[0019] 图5是透射电镜观察结果（48h）。
[0020] 图6是莫能菌素作用48h后细胞内caspase-3酶活性测定。
[0021] 图7是莫能菌素作用48h后细胞内caspase-4酶活性测定。
[0022] 图8是莫能菌素作用48h后细胞内caspase-9酶活性测定。
[0023] 图9是莫能菌素作用48h后细胞内caspase-8酶活性测定。
[0024] 图10是caspase酶抑制剂对莫能菌素诱导的A549细胞凋亡的影响，其中A．对照，B．3.6uM莫能菌素处理，C．3.6uM莫能菌素+Z-VAD-FMK(pan-casp)处理，D．3.6uM莫能菌素+Z-DEVD-FMK(casp.3)处理，E．3.6uM莫能菌素+Z-LEHD-FMK(casp.9)处理，F．3.6uM莫能菌素+Z-LEVD-FMK(casp.4)处理，G．3.6uM莫能菌素+Z-IETD-FMK(casp.8)处理。
具体实施方式
[0025] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0027] 实施例2 莫能菌素的体内抑瘤实验将雄性裸鼠随机分为对照组及实验组，每组5只。用生理盐水稀释A549细胞至1.2×
107/mL后，取0.2mL接种于每只裸鼠上肢腋下。待瘤长到约4mm×6mm大小时，对照组注射生理盐水0.2mL/只，实验组加入莫能菌素20mg/Kg。每隔三天测量一次瘤的直径(A)和横径（B），按公式V=π/6×(A/2+B/2)3计算肿瘤体积，绘制生长曲线。
107/mL后，取0.2mL接种于每只裸鼠上肢腋下。待瘤长到约4mm×6mm大小时，对照组注射生理盐水0.2mL/只，实验组加入莫能菌素20mg/Kg。每隔三天测量一次瘤的直径(A)和横径（B），按公式V=π/6×(A/2+B/2)3计算肿瘤体积，绘制生长曲线。
[0028] 结果表明（图2），裸鼠皮下接种人肺腺癌A549细胞，待瘤体长至4mm×6mm大小时开始加药。从图2中可以看出，加药处理的第三天裸鼠肿瘤的体积就明显小于对照组，其抑制率约为17.3%。此后，随着药物作用时间的延长，其抑制率逐渐增大。这表明，莫能菌素能抑制A549细胞的增殖，抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。
[0029] 实施例3 吉姆萨染色实验实验设置对照组和实验组。每组设3个复孔。将灭菌处理的盖玻片置于6孔板中。将对数
4
生长期的A549细胞以每孔4×10的密度接种于含盖玻片的6孔板中。每孔分别加入2mL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞接板24h后弃旧培养液。向对照组各孔中分别加入2mL细胞培养液；向实验组各孔中分别加入2mL药物浓度为1.8μM和3.6μM培养液，继续培养。培养48h后，取出盖玻片，用PBS漂洗细胞，干燥后用甲醇固定10min，用Giemsa工作液染色10min，流水冲洗掉未结合的染液，充分干燥后用二甲苯透明2min，中性树胶封片。在普通光学显微镜下观察细胞凋亡形态，并拍照保存。
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生长期的A549细胞以每孔4×10的密度接种于含盖玻片的6孔板中。每孔分别加入2mL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞接板24h后弃旧培养液。向对照组各孔中分别加入2mL细胞培养液；向实验组各孔中分别加入2mL药物浓度为1.8μM和3.6μM培养液，继续培养。培养48h后，取出盖玻片，用PBS漂洗细胞，干燥后用甲醇固定10min，用Giemsa工作液染色10min，流水冲洗掉未结合的染液，充分干燥后用二甲苯透明2min，中性树胶封片。在普通光学显微镜下观察细胞凋亡形态，并拍照保存。
[0030] 结果表明（图3），细胞经吉姆萨染色后，对照组细胞核大而均匀，被染成蓝紫色或紫红色，细胞质被染成浅蓝色；经1.8μM及3.6μM莫能菌素处理48h的实验组中，可见部分细胞核染色质凝集、趋边，呈深紫色，且能观察到清晰的凋亡小体。
[0031] 实施例4 MTT法检测细胞存活率实验设置空白组、对照组、溶剂对照组和实验组。将对数生长期且生长状态良好的细胞以每孔2×103的密度接种于96孔板中。空白组加入100μL细胞培养液；其他各组每孔加入
100μL细胞悬液。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。接板24h后弃旧培养液。向空白组及对照组各孔中分别加入100μL培养液；向溶剂对照组各孔中加入100μL含0.2%乙醇浓度的培养液；向实验组各孔中分别加入100μL药物浓度分别是0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM的培养液。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。在药物作用时间结束前4h，直接向每组各孔中分别加入20μLMTT贮存液，培养箱培养4h。4h后弃各孔上清液，每孔加入100μLDMSO，室温避光震荡15min。用空白组调零，在酶标仪570nm条件下检测各孔的OD值，并记录实验结果。
100μL细胞悬液。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。接板24h后弃旧培养液。向空白组及对照组各孔中分别加入100μL培养液；向溶剂对照组各孔中加入100μL含0.2%乙醇浓度的培养液；向实验组各孔中分别加入100μL药物浓度分别是0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM的培养液。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。在药物作用时间结束前4h，直接向每组各孔中分别加入20μLMTT贮存液，培养箱培养4h。4h后弃各孔上清液，每孔加入100μLDMSO，室温避光震荡15min。用空白组调零，在酶标仪570nm条件下检测各孔的OD值，并记录实验结果。
[0032] 计算：存活率=（实验组OD-空白组OD）/（溶剂对照组OD-空白组OD）×100%，抑制率=1-存活率。
[0033] 结果表明（图4），用浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM的莫能菌素分别处理A549细胞24h、48h、72h后，与对照组相比，细胞存活率总体呈现降低趋势，并且随着药物作用时间的逐渐延长以及药物浓度的逐渐增大，细胞存活率逐渐降低，即莫能菌素对A549细胞生长的抑制作用表现出一定的时间依赖性以及剂量依赖性。虽然0.01μM的莫能菌素处理细胞48h及72h后，细胞存活率较对照组高，但差异不显著（P＞0.05，n﹦8）。
[0034] 此外，除0.05μM莫能菌素作用细胞48h的实验组与对照组相比差异不显著（P＞0.05，n﹦8），0.01μM、0.05μM、0.1μM莫能菌素作用细胞24h的实验组与对照组相比差异显著外（0.05＞P＞0.01，n﹦8），其余均差异极显著（P＜0.01，n﹦8）。数据显示药物作用48h的半数抑制浓度为1.8μM。
[0035] 实施例5 透射电镜下细胞超微结构的观察实验设对照组和实验组。每组设3个平行皿。将对数生长期A549细胞以一定的密度接种于塑料培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞培养24h后弃旧培养液。对照组加入培养液；实验组加入含1.8μM莫能菌素的培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。药物作用48h后，胰蛋白酶消化细胞，将细胞置成单细胞悬液。离心弃上清，PBS重悬细胞，转移至有琼脂空槽的离心管中，离心使细胞成团，去上清，加入2.5%戊二醛固定。
PBS冲洗，置于1%锇酸中固定1h。丙酮梯度脱水，将细胞置于1:1丙酮与包埋剂混合液中置换
30min，用包埋剂浸润2h后包埋细胞。经超薄切片、乙酸铀及柠檬酸铅染色后，置于透射电子显微镜下观察细胞超微结构变化，并拍照保存。
PBS冲洗，置于1%锇酸中固定1h。丙酮梯度脱水，将细胞置于1:1丙酮与包埋剂混合液中置换
30min，用包埋剂浸润2h后包埋细胞。经超薄切片、乙酸铀及柠檬酸铅染色后，置于透射电子显微镜下观察细胞超微结构变化，并拍照保存。
[0036] 结果表明（图5），对照组细胞核大，核仁明显，线粒体结构清晰；经1.8μM莫能菌素处理48h的实验组细胞染色质凝集、弯曲呈新月形，细胞空泡化现象明显。
[0037] 实施例6 Caspase试剂盒检测Caspase酶活性实验设对照组和实验组。每组设3个平行皿。将对数生长期的A549细胞以一定的密度接种于塑料培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞培养24h后弃旧培养液。
对照组加入培养液；实验组加入药物浓度为1.8μM和3.6μM培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。药物作用48h后，胰蛋白酶消化细胞并收集细胞。离心后弃上清，用PBS冲洗细胞后，按每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解
15min。4℃16000g离心15min,并将上清转移至冰浴预冷的离心管中。
对照组加入培养液；实验组加入药物浓度为1.8μM和3.6μM培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。药物作用48h后，胰蛋白酶消化细胞并收集细胞。离心后弃上清，用PBS冲洗细胞后，按每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解
15min。4℃16000g离心15min,并将上清转移至冰浴预冷的离心管中。
[0038] 结果表明（图6、7、8、9），Caspase-3酶活性检测试剂盒分析发现，经1.8μM及3.6μM莫能菌素处理A549细胞48h后，与对照组相比，在405nm处的光吸收值有了明显的升高，且随着药物浓度的增大，光吸收值也逐渐升高，这表明caspase-3活性增大。凋亡执行者caspase-3活性增大，即表明莫能菌素能诱导A549细胞走向凋亡。
[0039] Caspase-4/9酶活性检测试剂盒分析结果与caspase-3分析结果相似，表明在A549细胞凋亡过程中，莫能菌素激活了caspase-4/9的活性，即说明内质网途径及线粒体途径参与了莫能菌素介导的A549细胞的凋亡。
[0040] Caspase-8酶活性检测试剂盒分析发现：经1.8μM及3.6μM莫能菌素处理A549细胞48h后，与对照组相比，在405nm处的光吸收值无明显变化，表明在莫能菌素诱导的A549细胞凋亡过程中无caspase-8参与，即膜受体途径不参与莫能菌素介导的A549细胞的凋亡。
[0041] 实施例7 细胞凋亡的ELISA检测实验设对照组和实验组。每组设3个平行皿。将对数生长期的A549细胞以一定的密度接种于塑料培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞培养24h后弃旧培养液。
对照组中分别加入培养液；不同的实验组中加入20uM不同的caspase酶抑制剂，孵育1h后向各实验组加入含3.6μM莫能菌素的培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。药物作用时间结束，胰蛋白酶消化细胞，将细胞制成单细胞悬液。按试剂盒说明书的操作步骤对样品进行处理。在酶标仪405nm处测吸光度，并记录数值。并按试剂盒说明设置反应体系，检测Caspase酶活性。
对照组中分别加入培养液；不同的实验组中加入20uM不同的caspase酶抑制剂，孵育1h后向各实验组加入含3.6μM莫能菌素的培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。药物作用时间结束，胰蛋白酶消化细胞，将细胞制成单细胞悬液。按试剂盒说明书的操作步骤对样品进行处理。在酶标仪405nm处测吸光度，并记录数值。并按试剂盒说明设置反应体系，检测Caspase酶活性。
[0042] 按下述公式计算释放到细胞质中的单或寡核苷酸小体的特异性增加量：加强系数=加药处理组的OD值/对照组细胞的OD值
结果表明（图10），经3.6μM莫能菌素处理48h的实验组与对照组相比，细胞裂解液中的核小体水平显著增加，由3.547上升至34.4582，是对照组的9.7倍；而加入caspase酶抑制剂后，与经药物处理的细胞相比，核小体水平有了明显的降低，说明3.6μM莫能菌素处理细胞
48h后，细胞内caspase酶活化，从而使A549细胞走向凋亡。分别加入caspase-3/9/4的抑制剂后，与经药物处理的细胞相比，细胞裂解液中的核小体水平有了明显的降低；而经caspase-8抑制剂处理的细胞内核小体水平无明显变化，这说明caspase-3/9/4参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡，caspase-8没有参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡。
结果表明（图10），经3.6μM莫能菌素处理48h的实验组与对照组相比，细胞裂解液中的核小体水平显著增加，由3.547上升至34.4582，是对照组的9.7倍；而加入caspase酶抑制剂后，与经药物处理的细胞相比，核小体水平有了明显的降低，说明3.6μM莫能菌素处理细胞
48h后，细胞内caspase酶活化，从而使A549细胞走向凋亡。分别加入caspase-3/9/4的抑制剂后，与经药物处理的细胞相比，细胞裂解液中的核小体水平有了明显的降低；而经caspase-8抑制剂处理的细胞内核小体水平无明显变化，这说明caspase-3/9/4参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡，caspase-8没有参与莫能菌素诱导A549细胞的凋亡。
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