核苷酸分子SR5B2及其在制备抗糖尿病药物中的应用
阅读：563发布：2023-03-07
专利汇可以提供核苷酸分子SR5B2及其在制备抗糖尿病药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗糖尿病药物中的应用。糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征。临床以高血糖为主要标志，久病可引起多个系统损害。本发明的核苷酸分子SR5B2加入胰岛B细胞中，细胞培养上清中胰岛素的含量增加。因此认为，本发明的核苷酸分子SR5B2有促进胰岛素分泌的功能，可以作为新的抗糖尿病药物进行开发，为缓解和 治疗 糖尿病提供了一种新的途径和手段。，下面是核苷酸分子SR5B2及其在制备抗糖尿病药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种分离出的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括： UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。
2.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括：dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1或者2所述的核苷酸分子。
4.一种含有权利要求1或者2所述的核苷酸分子的宿主细胞。
5.一种如权利要求1或者2所述的核苷酸分子的制备方法，其特征在于， 按权利要求1或者2所述的核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团依次脱水缩合。
6.如权利要求1或者2所述的核苷酸分子在制备抗糖尿病药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征是所述的抗糖尿病药物是由含有效治 疗量的权利要求1或者2所述的核苷酸分子和药学上的载体或者赋形剂组成的药 物组合物。
8.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述药物是针剂或者片剂。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗糖尿病药物中 的应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床 综合征。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要标志， 久病可引起多个系统损害。病情严惩或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒 等。
糖尿病主要临床类型胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，I型)可发生在任何年 龄，但多发生于青幼年。临床特点是起病急，多食、多尿、多饮、体重减轻等症 状较明显，有发生酮症酸中毒的倾向，必须依赖胰岛素治疗维持生命。起病初期 血中胰岛细胞自身抗体阳性率高。口服葡萄糖胰岛释放试验可见基础胰岛素水平 低于正常，葡萄糖刺激后胰岛素分泌曲线低平，显示胰岛素缺乏。
非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，II型)也可发生在任何年龄，但多见于 40岁以后中、老年。大多数病人起病缓慢，临床症状相对较轻或缺如。无酮症酸 中毒倾向，但在一定诱因作用下，也可发生酮症酸中毒或高渗性昏迷。依赖胰岛 素，但在饮食和口服降糖药治疗效果欠佳时，或因并发症和伴发病的存在，有时 亦需要用胰岛素控制高血糖。
然而，到目前为止，尚未有人报道用于抗糖尿病的基因药物。
糖尿病主要临床类型胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，I型)可发生在任何年 龄，但多发生于青幼年。临床特点是起病急，多食、多尿、多饮、体重减轻等症 状较明显，有发生酮症酸中毒的倾向，必须依赖胰岛素治疗维持生命。起病初期 血中胰岛细胞自身抗体阳性率高。口服葡萄糖胰岛释放试验可见基础胰岛素水平 低于正常，葡萄糖刺激后胰岛素分泌曲线低平，显示胰岛素缺乏。
非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，II型)也可发生在任何年龄，但多见于 40岁以后中、老年。大多数病人起病缓慢，临床症状相对较轻或缺如。无酮症酸 中毒倾向，但在一定诱因作用下，也可发生酮症酸中毒或高渗性昏迷。依赖胰岛 素，但在饮食和口服降糖药治疗效果欠佳时，或因并发症和伴发病的存在，有时 亦需要用胰岛素控制高血糖。
然而，到目前为止，尚未有人报道用于抗糖尿病的基因药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备抗糖尿病药物的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸的应用。
本发明提供了一种分离出的核苷酸分子，它的序列包括： UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。称为SR5B2。
在本发明中，术语“核苷酸分子SR5B2”指具有抑制BRSK2蛋白活性或 者增加胰岛素分泌量，并且含有与UUUCUGAAUGUGCUCUAGC序列高度同源 的核苷酸序列。该术语还包括与UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的同源性至少 70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的核苷酸序列变异形式。这 些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地 1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10 个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 前(5‘端)加入若干dT后形成的序列。
本发明中的一个实施例中，所用的核苷酸分子序列包括：dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。
本发明还提供了一种载体，它含有上述的核苷酸分子SR5B2。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用 市售的载体，然后将含有本发明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载 体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些 部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作 为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连 于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如 果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序 列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于本发明的核酸分子则意味着 相邻且不影响功能。
本发明还提供了上述载体转化的宿主细胞。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿 主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞， 昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、 COS、NIT细胞等。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子SR5B2的制备方法，即按 UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
本发明的核苷酸分子SR5B2可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的 核苷酸分子SR5B2序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子SR5B2在制备抗糖尿病药物中的应用。
用siRNA的方法将含有本发明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT转染入小 鼠的胰岛β细胞(NIT)中，放射性免疫学方法检测结果显示，细胞培养上清中 胰岛素的含量增加。
进一步研究表明，上述siRNA干扰实验中，原理是干扰了小鼠的胰岛β细 胞(NIT)中内源BRSK2的表达，才导致细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
从Northern的结果可见，BRSK2主要在脑和胰腺中表达，尤其以胰腺中的 表达量为最高。Western的结果与前面Northern的结果一致，BRSK2在小鼠中也 主要在脑和胰腺表达。从免疫组化的结果中可见，BRSK2主要在胰腺组织的胰 岛中表达。
神经元分化相关基因BRSK2(NCBI中核苷酸的序列号为AF533880，核苷 酸的序列号为AAP97727)在胰腺中有很高的表达量，甚至超过在脑中的表达量。 进一步的免疫组化结果显示，BRSK2主要在胰腺的胰岛中高表达。将BRSK2在 小鼠的胰岛β细胞(NIT)中过量表达，放射性免疫学方法检测细胞培养上清中 胰岛素的含量，结果显示，胰岛素分泌减少；另一方面用siRNA的方法干扰小 鼠的胰岛β细胞(NIT)中内源BRSK2的表达活性，同样的放射性免疫学方法检 测结果显示，细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
本发明的核苷酸分子SR5B2及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时， 可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受 的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可 随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通 过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或 局部给药。
以本发明的核苷酸分子SR5B2为例，可以将其与合适的药学上可接受的载 体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形 剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及 其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子SR5B2可以被制 成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进 行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组 合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗 有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的BRSK2 还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核苷酸分子SR5B2被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽 施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大 多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1 毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这 些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的抗糖尿病药物是由含有效治疗量的核苷酸分子SR5B2和 药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片 剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。
本发明中，所述药物是针剂或者片剂。
糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床 综合征。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要标志， 久病可引起多个系统损害。病情严惩或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒 等。
本发明的核苷酸分子SR5B2加入小鼠的胰岛β细胞(NIT)中，细胞培养上 清中胰岛素的含量增加。因此认为，本发明的核苷酸分子SR5B2有促进小鼠的胰 岛β细胞(NIT)中胰岛素分泌的功能，可以作为新的抗糖尿病药物或者进行开发， 为缓解和治疗糖尿病提供了一种新的途径和手段。
附图说明
图1为BRSK2过量表达对胰岛素分泌的影响图。该图中，从左到右的柱状 图依次为胰岛素测定浓度、细胞数和相对胰岛素分泌值对空白对照与加入BRSK2 后对细胞的影响。从相对胰岛素分泌值图和最右侧的western图可见，BRSK2过 量表达将导致胰岛素分泌降低。
图2为BRSK2被内源干扰后对胰岛素分泌的影响图。该图中，从左到右的 柱状图依次为胰岛素测定浓度、细胞数和相对胰岛素分泌值对空白对照与加入 siRNA(1μl、3μl、5μl)后对细胞的影响。从相对胰岛素分泌值图和最右侧的 western图可见，BRSK2被内源干扰后将导致胰岛素分泌升高。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸的应用。
本发明提供了一种分离出的核苷酸分子，它的序列包括： UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。称为SR5B2。
在本发明中，术语“核苷酸分子SR5B2”指具有抑制BRSK2蛋白活性或 者增加胰岛素分泌量，并且含有与UUUCUGAAUGUGCUCUAGC序列高度同源 的核苷酸序列。该术语还包括与UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的同源性至少 70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的核苷酸序列变异形式。这 些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地 1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10 个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 前(5‘端)加入若干dT后形成的序列。
本发明中的一个实施例中，所用的核苷酸分子序列包括：dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。
本发明还提供了一种载体，它含有上述的核苷酸分子SR5B2。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用 市售的载体，然后将含有本发明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载 体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些 部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作 为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连 于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如 果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序 列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于本发明的核酸分子则意味着 相邻且不影响功能。
本发明还提供了上述载体转化的宿主细胞。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿 主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞， 昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、 COS、NIT细胞等。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子SR5B2的制备方法，即按 UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
本发明的核苷酸分子SR5B2可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的 核苷酸分子SR5B2序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子SR5B2在制备抗糖尿病药物中的应用。
用siRNA的方法将含有本发明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT转染入小 鼠的胰岛β细胞(NIT)中，放射性免疫学方法检测结果显示，细胞培养上清中 胰岛素的含量增加。
进一步研究表明，上述siRNA干扰实验中，原理是干扰了小鼠的胰岛β细 胞(NIT)中内源BRSK2的表达，才导致细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
从Northern的结果可见，BRSK2主要在脑和胰腺中表达，尤其以胰腺中的 表达量为最高。Western的结果与前面Northern的结果一致，BRSK2在小鼠中也 主要在脑和胰腺表达。从免疫组化的结果中可见，BRSK2主要在胰腺组织的胰 岛中表达。
神经元分化相关基因BRSK2(NCBI中核苷酸的序列号为AF533880，核苷 酸的序列号为AAP97727)在胰腺中有很高的表达量，甚至超过在脑中的表达量。 进一步的免疫组化结果显示，BRSK2主要在胰腺的胰岛中高表达。将BRSK2在 小鼠的胰岛β细胞(NIT)中过量表达，放射性免疫学方法检测细胞培养上清中 胰岛素的含量，结果显示，胰岛素分泌减少；另一方面用siRNA的方法干扰小 鼠的胰岛β细胞(NIT)中内源BRSK2的表达活性，同样的放射性免疫学方法检 测结果显示，细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
本发明的核苷酸分子SR5B2及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时， 可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受 的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可 随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通 过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或 局部给药。
以本发明的核苷酸分子SR5B2为例，可以将其与合适的药学上可接受的载 体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形 剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及 其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子SR5B2可以被制 成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进 行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组 合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗 有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的BRSK2 还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核苷酸分子SR5B2被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽 施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大 多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1 毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这 些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的抗糖尿病药物是由含有效治疗量的核苷酸分子SR5B2和 药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片 剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。
本发明中，所述药物是针剂或者片剂。
糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床 综合征。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要标志， 久病可引起多个系统损害。病情严惩或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒 等。
本发明的核苷酸分子SR5B2加入小鼠的胰岛β细胞(NIT)中，细胞培养上 清中胰岛素的含量增加。因此认为，本发明的核苷酸分子SR5B2有促进小鼠的胰 岛β细胞(NIT)中胰岛素分泌的功能，可以作为新的抗糖尿病药物或者进行开发， 为缓解和治疗糖尿病提供了一种新的途径和手段。
附图说明
图1为BRSK2过量表达对胰岛素分泌的影响图。该图中，从左到右的柱状 图依次为胰岛素测定浓度、细胞数和相对胰岛素分泌值对空白对照与加入BRSK2 后对细胞的影响。从相对胰岛素分泌值图和最右侧的western图可见，BRSK2过 量表达将导致胰岛素分泌降低。
图2为BRSK2被内源干扰后对胰岛素分泌的影响图。该图中，从左到右的 柱状图依次为胰岛素测定浓度、细胞数和相对胰岛素分泌值对空白对照与加入 siRNA(1μl、3μl、5μl)后对细胞的影响。从相对胰岛素分泌值图和最右侧的 western图可见，BRSK2被内源干扰后将导致胰岛素分泌升高。
具体实施方式
实施例1siRNA干扰内源BRSK2表达以后对胰岛素分泌的影响
(1)将NIT细胞以1×105个/孔的密度接种在24孔板上，将细胞放入CO2培 养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到70-80％。
(2)用Invitrogen lipofectamine 2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染 Nonsilence 5μl(siRNA干扰的阴性对照)，siRNA(dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT)-51μl、 3μl和5μl(每μl的浓度为20μM)。每种转染重复4个孔。
(3)转染后16小时，换成完全培养基(DMEM高糖培养基+15％胎牛血清) 继续培养24小时。
(4)重新更换完全培养基(糖浓度为25mM)，培养20分钟后收集培养上清 液。
(5)采用放射免疫分析法测定培养上清中胰岛素的浓度，检测试剂盒由上海 市生物制品研究所提供，测定值批内CV＜4.2％，批间CV＜7.6％。
(6)培养板上的细胞胰酶消化后用细胞计数板计数。
(7)收集计数后的细胞做Western blot检测内源BRSK2的表达。
(8)处理分析数据。
结果表明，用siRNA的方法干扰小鼠的胰岛β细胞(NIT)中内源BRSK2， 同样的放射性免疫学方法检测结果显示，细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
实施例2BRSK2过量表达对胰岛素分泌的影响
(1)将NIT细胞以1×105个/孔的密度接种在24孔板上，将细胞放入CO2培 养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到70-80％。
(2)用Invitrogen lipofectamine 2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染 Pcmv-Myc空载体和Pcmv-Myc-BRSK2两种质粒，每种质粒按照200ng/孔的浓 度各转染4个孔。
(3)转染后16小时，换成完全培养基(DMEM高糖培养基+15％胎牛血清) 继续培养24小时。
(4)重新更换完全培养基(糖浓度为25mM)，培养20分钟后收集培养上清 液。
(5)采用放射免疫分析法测定培养上清中胰岛素的浓度，检测试剂盒由上海 市生物制品研究所提供，测定值批内CV＜4.2％，批间CV＜7.6％。
(6)培养板上的细胞胰酶消化后用细胞计数板计数。
(7)收集计数后的细胞做Western blot检测BRSK2-Myc的表达。
(8)处理分析数据。
过量表达的结果显示，小鼠胰岛Beta细胞NIT中过量表达BRSK2以后， 胰岛素相对分泌量减少。
(1)将NIT细胞以1×105个/孔的密度接种在24孔板上，将细胞放入CO2培 养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到70-80％。
(2)用Invitrogen lipofectamine 2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染 Nonsilence 5μl(siRNA干扰的阴性对照)，siRNA(dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT)-51μl、 3μl和5μl(每μl的浓度为20μM)。每种转染重复4个孔。
(3)转染后16小时，换成完全培养基(DMEM高糖培养基+15％胎牛血清) 继续培养24小时。
(4)重新更换完全培养基(糖浓度为25mM)，培养20分钟后收集培养上清 液。
(5)采用放射免疫分析法测定培养上清中胰岛素的浓度，检测试剂盒由上海 市生物制品研究所提供，测定值批内CV＜4.2％，批间CV＜7.6％。
(6)培养板上的细胞胰酶消化后用细胞计数板计数。
(7)收集计数后的细胞做Western blot检测内源BRSK2的表达。
(8)处理分析数据。
结果表明，用siRNA的方法干扰小鼠的胰岛β细胞(NIT)中内源BRSK2， 同样的放射性免疫学方法检测结果显示，细胞培养上清中胰岛素的含量增加。
实施例2BRSK2过量表达对胰岛素分泌的影响
(1)将NIT细胞以1×105个/孔的密度接种在24孔板上，将细胞放入CO2培 养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到70-80％。
(2)用Invitrogen lipofectamine 2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染 Pcmv-Myc空载体和Pcmv-Myc-BRSK2两种质粒，每种质粒按照200ng/孔的浓 度各转染4个孔。
(3)转染后16小时，换成完全培养基(DMEM高糖培养基+15％胎牛血清) 继续培养24小时。
(4)重新更换完全培养基(糖浓度为25mM)，培养20分钟后收集培养上清 液。
(5)采用放射免疫分析法测定培养上清中胰岛素的浓度，检测试剂盒由上海 市生物制品研究所提供，测定值批内CV＜4.2％，批间CV＜7.6％。
(6)培养板上的细胞胰酶消化后用细胞计数板计数。
(7)收集计数后的细胞做Western blot检测BRSK2-Myc的表达。
(8)处理分析数据。
过量表达的结果显示，小鼠胰岛Beta细胞NIT中过量表达BRSK2以后， 胰岛素相对分泌量减少。
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