一株沙雷氏杆菌及其在制备地尔硫卓手性前体中的应用
专利汇可以提供一株沙雷氏杆菌及其在制备地尔硫卓手性前体中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种产立体选择性酯 水 解 酶的沙雷氏菌菌株及其在制备地尔硫 手性 前体中的应用。本发明所说的菌株在进行 发酵 培养后所产的胞外脂肪酶可用于拆分消旋物(±)-对甲 氧 苯基缩水甘油酸甲酯，从而获得生产心血管药物地尔硫所需的关键手性前体——(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。实验表明，所说的沙雷氏菌脂肪酶具有催化效率高、选择性强、产品光学纯度好且回收容易等优点。，下面是一株沙雷氏杆菌及其在制备地尔硫卓手性前体中的应用专利的具体信息内容。
1、一株沙雷氏杆菌菌株Serratia sp.ECU1010，保藏号为：CGMCC No.1219。
2、如权利要求1所说的菌株的应用，其特征在于，所说的菌株用于拆分(±)-对甲氧苯基缩水 甘油酸甲酯。
3、如权利要求2所说的应用，其特征在于，其中所说的拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯 包括如下步骤：
(1)权利要求1所说的菌株ECU1010进行发酵培养，发酵液经分离后得游离脂肪酶；
(2)将由步骤(1)所得的游离脂肪酶或其固定化物与消旋底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲 酯在能溶解底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯而与水不互溶的有机溶剂中反应，油-水两相的 体积比为1/9～9/1，反应温度为20～50℃，反应3～30小时后收集有机相即得(-)-对甲氧苯基缩 水甘油酸甲酯；
其中：底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯加入量为10～200g/L反应物总体积，酶的加 入量为10～100U/g底物。
4、如权利要求3所说的应用，其特征在于，其中步骤(2)中所说的有机溶剂为环己烷、正 庚烷、异辛烷、氯仿、甲苯、异丙醚或甲基叔丁基醚中的一种。
5、如权利要求3所说的应用，其特征在于，其中步骤(2)中所说的游离脂肪酶固定化物，其 载体为硅藻土或高分子树脂。
6、如权利要求5所说的应用，其特征在于，其中所说的载体是“优派吉C”。
技术领域
本发明涉及一株沙雷氏杆菌及其应用，具体地说，涉及一株产立体选择性酯水 解酶的沙雷氏杆菌及其在制备地尔硫卓手性前体中的应用方法。
技术背景
地尔硫卓(diltiazem)是70年代合成的苯并噻平类钙离子通道阻滞剂，由于该药 疗效确切，毒副作用小，长期以来，被广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采 用化学-酶法合成地尔硫可以简化合成路线、提高收率、降低成本。在化学-酶法 生产工艺中，一般采用脂肪酶催化拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，其中不需 要的(+)-异构体被酶选择性地水解，而有用的(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被完 整地保留下来，作为起始原料用于合成单一对映体(+)-地尔硫卓。已有一些文献和 专利涉及了这方面的技术，较为典型的有：
(1)欧洲专利EP 362 556(其同等优先专利为JP 221016/88)于1990年公开了采用数种 微生物，如Achromobacter cycloclasters IAM 1013，Alcaligenes faecalis OUT 8030， 以及Serratia marcescens ATCC 27117等，催化(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯立 体选择性水解的方法，但反应的底物浓度非常低，后处理较为复杂，收率也不高。
(2)美国专利USP 5,274,300(1989-2-10申请，1993-12-28授权)公开了一种在多相酶 膜反应器系统中利用微生物来源的商品酶制剂(例如Lipase OF和Lipase MAP等) 催化拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯及其结构类似物的方法。其主要特征在 于将含有酶的水相与含有底物的有机溶剂相分别置于中空纤维膜的两侧进行反 应，并利用亚硫酸氢钠(NaHSO3)与醛的加成反应，消除水解产物(对甲氧苯基缩 水甘油酸)脱羧后的副产物(对甲氧基苯乙醛)对酶可能造成的不利影响。该方法的 主要缺点是所用商品酶的成本较高，产品光学纯度不够好，而且需要复杂的膜反 应器设备。
(3)文献J Ferment Bioeng 1994，78：59-63报道了一种比较可行的微生物酶促拆分方 法。该方法将微生物Serratia marcescens Sr41 8000发酵所产的胞外脂肪酶，固 定在中空纤维膜上，用于催化(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的水解拆分。该方 法的不足之处是仍需先将酶进行提取后上载到膜反应器上，其技术和设备比较复 杂，而且酶在反应器中并不十分稳定，22℃下的半衰期只有127小时，其生产 效率随反应器运行逐步降低。此外，该工艺需要使用特制的能耐受有机溶剂的中 空纤维膜，而且由于反应过程中底物和产物的跨膜传质阻力较大，因此在一定程 度上限制了酶催化效率的发挥。
发明内容
本发明通过如下方案实现：
(1)从土壤及本实验室所保藏的菌株中筛选能高效拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸 甲酯的微生物，结果得到一株产(+)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯水解酶的微生物 菌株Serratia sp.ECU1010。
(2)对菌株Serratia sp.ECU1010进行发酵产酶条件优化，用其游离酶或用载体如“优 派吉C”(Eupergit C，德国Degussa公司的一种商品化环氧树脂)进行固定化后 的酶作为生物催化剂。
(3)将生物催化剂置于水-有机溶剂(如异丙醚或甲苯)两相反应体系中，催化(±)- 对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的拆分反应，经过常规处理后，回收获得地尔硫卓手 性前体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。
(一)菌株
从土壤及本实验室所保藏的菌株中，经初筛、复筛及分离纯化，获得一株产(+)- 对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯水解酶的菌株Serratia sp.ECU1010，水解(±)-对甲氧苯 基缩水甘油酸甲酯得到了(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。因此，本发明选择沙雷 氏杆菌Serratia sp.ECU1010作为发酵产酶菌株，该菌株现保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13 号)，保藏号为：CGMCCNO.1219；保藏号日期：2004年9月14日；分类命名： 沙雷氏杆菌(Serratia sp)。
(二)菌株特性(Serratia sp.ECU1010)
1、大小形态：为短杆菌，菌体长度约0.9～2.0μm，直经：0.5～0.8μm，具有周 鞭毛可帮助其运动；
2、适合生长环境：可在温度10～40℃，pH5～9、NaCl浓度0～7％(w/v)环境中 生存；
3、培养特性：一些沙雷氏菌会产生红色色素，然而不产色素的菌株也很常见， 大约有20％左右会产生红色色素，通常在室温或仅在室温才可形成色素。Serratia sp.ECU1010能产红色色素，但产色素能力与培养条件密切相关，所产色素不稳 定，菌株在4℃保存一段时间后，其红色会褪去。
(三)菌株的培养
1、斜面培养：蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO4 0.2wt％，NaCl 0.05wt％， MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，琼脂2wt％，pH为6.5，将冷 冻保存的甘油悬液接种到斜面培养基上，30℃恒温培养2天；
2、摇瓶培养：吐温-80 0.1～1.5wt％，糊精0～3.0wt％，蛋白胨0～4.5wt％， 玉米浆0～3wt％，硫酸铵0～1.0wt％，K2HPO4 0.2wt％，NaCl 0.05wt％， MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0～0.01wt％，CaCl2 0～0.1wt％，pH为5～8， 摇瓶装液量10～30v/v％，接种量2～10v/v％，培养温度20～40℃，摇床转速 100～200rpm，摇瓶培养1～3天；产酶可达到4000～10000 U/L。
3、罐中发酵：培养基与摇瓶培养相同。在5L发酵罐装入培养基3L，121℃灭 菌后，接入200ml种子培养液，然后于25～35℃，通气量为1.5～6.0L/min(相 当于0.5～2.0vvm)，搅拌转速为200～400转/分，发酵至12～36小时放罐，离 心收集发酵液上清。
(四)酶催化拆分反应
1、培养后的发酵液经离心取上清液作为酶源，以(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯为 底物，其加入量为10-200g/L(反应物总体积)，酶的加入量为10～100U/g底物， 在正庚烷、异辛烷、甲苯、异丙醚、甲基叔丁基醚、环己烷或氯仿等有机溶剂，最 好是异丙醚和Tris-HCl缓冲液组成的两相体系中进行水解反应，油-水两相的体积比 为1/9-9/1(v/v)，最好在1/2-3/1范围内，反应温度为20～50℃，最好为25～40℃， 控制反应转化率在50～52％，反应时间为3～30小时。
2、将培养后的发酵液离心取上清液，不经任何预处理，直接加入高分子树脂[如树 脂Eupergit C(“优派吉C”)或硅胶]或硅藻土等进行固定化。省去了用中空纤维膜 进行固定化时酶的提取步骤，简化了操作，节约操作时间，同时减少了酶活损失。 所制得的固定化酶作为生物催化剂，在上述条件下进行水解反应。固定化酶可重复 多次使用进行水解反应。
(五)(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的提取和精制
收集反应的有机相，先用5％的NaHSO3溶液洗涤，再用5％的NaHCO3溶液洗 涤，经无水硫酸镁干燥处理后，减压蒸馏，在适当溶剂(如异丙醇)中结晶，即可得 到高纯度的晶体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(ee＞99％)。
采用本发明的方法，工艺过程简单，反应条件温和；所用酶的催化活性和立体 选择性较高；制备的固定化酶稳定性高，可连续反应5批以上。所获得的(-)-对甲氧 苯基缩水甘油酸甲酯光学纯度可达99％ee以上。该方法具有简单实用、成本低廉的 优点。可望在工业上推广应用。
具体实施方式
实施例1
斜面培养：蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO4 0.2wt％，NaCl 0.05wt％， MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，琼脂2wt％，pH6.5。将冷冻保存 的甘油悬液接种到斜面(平板)培养基上，30℃恒温培养大约1.5天。
产酶培养：吐温-80 1.0wt％，蛋白胨3.0wt％，K2HPO4 0.2wt％，NaCl 0.05wt％， MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，pH7.0，250ml摇瓶装液量30ml， 接种量2.5v/v％，培养温度25℃，摇床转速200rpm，在上述条件下摇瓶培养2天， 产酶可达到4780U/L。
酶活单位(U)的定义为：在25℃、pH7.0条件下，每分钟水解对硝基苯酚乙酸酯 (1.0mmol/L)，生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
实施例2
斜面培养与实施例1相同。在250ml摇瓶中装入30ml培养基，其组成如下：
吐温-80 1.0wt％，糊精2.0wt％，玉米浆3.0wt％，硫酸铵0.5wt％，K2HPO4 0.2wt％， NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，pH6.5。将在30℃、 150rpm条件下预培养12小时的培养液作为种子，按5v/v％的接种量转入4个装有 150ml相同培养基的1L摇瓶中，在培养温度30℃，摇床转速150rpm的条件下培 养24小时，酶产量为9480U/L。
实施例3
种子培养与实施例2相同。在5L发酵罐中装入3L培养基，其组成如下：糊精2 wt％，玉米浆1.5wt％，硫酸铵0.5wt％，K2HPO4 0.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，CaCl2 0.05wt％，pH6.5。培养基灭菌后，接入预培养12小时的种子液200 ml，在30℃、400rpm和0.5vvm条件下通气发酵，其间在5-11小时匀速流加吐温 -80共6g，若产生泡沫则滴加泡敌(1wt/v％水溶液)进行消泡。发酵15小时后放罐， 测得酶产量为5600U/L。
实施例4
取实施例1中的发酵液5ml，离心取上清，加入同等体积甲苯，再加入1.40g(±)- 对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，于30℃和150rpm的摇床上保温反应，保持反应pH 恒定在8.5。当反应进行到6小时，转化率接近50％，所得(-)-对甲氧苯基缩水甘油 酸甲酯的分析得率为46.2％，光学纯度＞98％ee，对映选择率(E值)超过100。
实施例5
取实施例1中的发酵液10ml，离心取上清，加入2g环氧树脂“优派吉C” (Eupergit C，德国Degussa公司产品)，于30℃和150rpm的摇床上保温2小时后， 过滤、洗涤固定化酶。将其悬浮在5ml pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入5ml异 丙醚，再加入0.104g(±)-对甲氧基苯基缩水甘油酸甲酯，于30℃和150rpm的摇床 上保温反应，保持反应pH恒定在8.0，反应时间为10-14小时。将反应结束后滤出 的固定化酶加入新的反应底物继续反应，如此重复利用5次后，活力没有明显的下 降，所得(-)-对甲氧基苯基缩水甘油酸甲酯的光学纯度均＞98％ee，E值超过100。
实施例6
取实施例2中的发酵液100ml，离心取上清，加入30g环氧树脂Eupergit C， 于30℃和150rpm的摇床上保温2小时后，过滤、洗涤固定化酶。将所得固定化酶 颗粒悬浮在50ml pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入50ml甲苯，再加入2.08g(±)- 对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，于35℃和150rpm的摇床上保温反应，保持反应pH 恒定在8.5，反应时间为10-14小时。将反应结束后，收集有机相，滤出的固定化酶 加入新的反应底物继续反应，如此重复利用5次。收集5批反应的有机相，用5％的 NaHSO3洗涤三次，再用5％的NaHCO3洗涤，无水硫酸镁干燥处理后，减压蒸馏， 结晶得到高纯度的(-)-对甲氧基苯基缩水甘油酸甲酯晶体(ee＞99％)，收率为42％。
M.P.：87-88℃；
[α]D 20：-207.08(c＝1，甲醇)。
实施例7
在带有机械搅拌和恒温水浴的三颈烧瓶中，加入(±)-对甲氧基苯基缩水甘油酸甲 酯1.0mol(208g)和甲基叔丁基醚溶液2.0L，搅拌至全部溶解。然后取实施例3中的 发酵液1.0L，将水浴温度调至28℃，开动机械搅拌(200转/分)，同时插入pH电极， 用自动电位滴定仪滴加1.0N的NaOH溶液，控制pH在8.0±0.1范围，并根据耗碱 量计算酶促水解的转化率。结果，反应6小时后，转化率为51％，停止反应，用分 液漏斗分出有机相，界面混浊部分倒入铺有硅藻土的布氏漏斗进行抽滤，合并水相 和有机相，水相用甲基叔丁基醚萃取两次(300ml×2)；有机相依次用少量5％NaHSO3、 5％NaHCO3、去离子和饱和食盐水洗涤，再加无水硫酸镁干燥后，旋转蒸发回收有 机溶剂，得到微黄色固体95.7g，收率为46％，在甲醇中重结晶后得到82.3g光学 纯(＞99.9％ee)的无色晶体。
根据本发明公开的技术方案和实施例，有关的工程技术人员可以方便地将本发 明所说的微生物菌种及其培养与转化工艺，举一反三地应用于其它反应体系(如微乳 液和离子液体)中其它结构类似的手性底物(例如3-芳基缩水甘油酸乙酯及其它短 链脂肪醇酯)的催化动力学拆分。
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