发明领域

本发明涉及用于治疗呼吸道上皮病变的方法和组合物，例如，所 述病变可能是由病毒，细菌，和真菌感染，炎症，过敏原，吸入的有 机溶剂，颗粒物或刺激性气体导致的。

                      发明背景

包括从外鼻孔到咽喉的上呼吸道病变，是由多种局部激动剂，过 敏原，和传染性制剂引起的。通常，所述激动剂会产生鼻炎或‘流鼻 涕’的症状。不过，在严重损伤的情形中，呼吸道上皮粘膜的紧密连 接受到破坏，以便有利于过敏原或传染剂的进入。

气管支气管病变(气管和达到呼吸道细支气管的水平的传导性支 气管)，通常也是由呼吸道感染，激动剂或过敏原引起的。一旦破坏 了气管支气管上皮和紧密连接，传染性、刺激性或过敏性材料可能使 肺过敏，引起介体的释放，并随后引起呼吸道狭窄和哮喘。

远离呼吸道细支气管的肺泡上皮，通常能很好地受到保护避免发 生传染性、刺激性和过敏性接触。不过，穿透深层肺结构的传染性， 免疫性或化学制剂可能导致肺炎。进入下呼吸道的体循环的非传染性 制剂，可能进一步导致脓毒性肺炎或呼吸窘迫综合征。另外，在某些 炎症状态下，如哮喘，粘膜破坏会导致增加水平的过敏原和激动剂， 以便进一步加剧炎症和粘膜分解。

因此，为了减轻由持续的致病性或过敏性机制在呼吸组织中导致 的病变和缓解相关的症状，正常呼吸道上皮屏障的快速恢复是重要 的。

                      发明概述

本发明涉及通过给哺乳动物施用治疗有效量的三叶肽(trefoil peptide)或它的生物学活性片段，治疗哺乳动物呼吸道上皮病变的方 法和组合物。按照本发明方法治疗病变，可以加速病变的愈合，减轻 痛苦，延缓或预防病变的发生，并且抑制病变的扩大，二次感染或其 他并发症。呼吸道上皮病变可能由任何原因造成，例如，包括过敏性 反应，哮喘，感染，吸入的化学制剂或接触颗粒，热病变，吸入烟雾， 药物诱导的肺损伤，创伤(例如，通过手术或插管引起的病变)，微 生物感染(细菌，病毒或真菌)，慢性阻塞性肺病，抗肿瘤治疗，囊 性纤维化，心血管损伤，如充血性心脏衰竭或高压氧治疗。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，它包括存在于适合吸入 治疗的可以药用的载体中的三叶肽。在按这种方法制备组合物时，该 组合物可以是通过计量剂量吸入器施用的气溶胶(例如，鼻腔喷雾，吸 入喷雾，吸入溶液，吸入悬浮液)。如果需要的话，可以将含有所述三 叶肽的制剂雾化(例如，通过喷头，超声波喷雾器或电子喷雾器)。另 外，所述三叶肽制剂能够以干粉形式施用，例如，使用计量剂量吸入 器或干粉吸入器。

在本发明的上述所有方面，所述哺乳动物优选是人，并且所述三 叶肽是人肠三叶因子(ITF)，解痉肽(SP)，pS2，或它的生物学活性片 段。例如，所述片段包括ITF15-73，ITF21-73，ITF1-72，ITF15-72，或ITF21-72 或SEQ ID NO.：1。

在本发明的方法和组合物中，可以包括第二种治疗剂。所述治疗 剂包括抗炎剂，如糖皮质激素(丙酸氯地米松，氟尼缩松，budenoside， 去炎松，强的松龙，地塞米松，或氟替卡松)或非甾族抗炎剂(例如， 异丁苯丙酸，他克莫司，色甘酸，奈多罗米，refecoxib，或 celecoxib)；抗微生物剂(例如，氨羟丁卡那霉素A，庆大霉素，卡那 霉素，新霉素，乙基西梭霉素，巴龙霉素，链霉素，或妥布拉霉素)； 抗组胺制剂(例如，苯海拉明，甲美芳铵，西替利嗪，或氯雷他定)； 或胆碱能受体拮抗剂(例如，异丙托溴铵或tiotropium)；神经激肽 受体拮抗剂；白三烯受体拮抗剂；解充血药；磷酸二酯酶抑制剂，或 β-肾上腺素能受体拮抗剂(舒喘宁，比托特罗，肾上腺素，非诺特罗， 福莫特罗，新异丙肾上腺素，异丙肾上腺素，间羟异丙肾上腺素，吡 布特罗，丙卡特罗，消旋肾上腺素，沙美特罗，或特布他林)。第二 种治疗剂可以在施用所述三叶肽(之前或之后)14天，7天，1天，12 小时，1小时之内施用，或同时施用。

所述第二种治疗剂可以存在于与三叶肽相同或不同的药物组合物 中。当所述第二种治疗剂存在于不同的药物组合物中时，可以使用不 同的施用途径。例如，所述第二种治疗剂可以口服，通过静脉内，肌 内或皮下注射施用。因此，第二种治疗剂不一定是通过吸入施用的。

当然，药物组合物可以包括两种，三种或三种以上三叶肽或生物 学活性三叶肽片段。另外，所述三叶肽的吸入，可以通过全身性(例 如，口服或可注射)施用相同或不同的三叶肽进行补充。

在预期的刺激(例如，手术，抗肿瘤治疗)之前，通过施用含有 所述肠三叶肽的组合物，可以预防或改善呼吸道上皮病变。所述预防 性治疗优选在所述刺激开始之前至少1天，3天，5天，7天，或10 天开始。非预期的呼吸道病变的治疗优选在刺激之后马上或在24小时 之内开始。

在一种优选实施方案中，所述三叶肽或生物学活性片段是由分离 的核酸序列编码的，该序列能在高严格条件下与具有SEQ ID NO：4， SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列的多核苷酸序列杂交。

另一方面，本发明涉及适合吸入施用的药物组合物，它含有分离 的核酸序列编码的三叶肽或生物学活性片段，所述核酸序列能够在高 严格条件下与具有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6， SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9的序列的多核苷酸 序列杂交。

哺乳动物三叶肽是在1982年发现的。哺乳动物三叶肽之一——人 肠三叶因子(ITF)业已进行过充分的表征，并且描述于美国专利号6, 063,755和6,221,840中，以上专利文献被收作本文参考。另外两 种已知的人三叶肽是解痉多肽(SP)和pS2。正如在文献中充分描述的 (例如，Sands等，Annu.Rev.Physiol.58：253-273(1996)， 被收作本文参考)，三叶肽是在胃肠道中表达的，并且具有通过保守 性半胱氨酸残基之间的链内二硫键形成的三环结构。所述肽能保护肠 道免受病变，并且可用于治疗肠道疾病，如消化性溃疡和炎性肠病。 业已在多种非人动物物种中发现了所述人类肽的同系物。人和非人的 该蛋白家族的所有成员，在本文都被称为三叶肽。在本申请中，人ITF 将被最广泛地提到；不过，人ITF的活性，是每一种哺乳动物三叶肽 所共有的。

术语“三叶肽”表示包括人解痉多肽，人pS2和人ITF多肽的所 有哺乳动物同系物，以及它们的生物学活性片段。三叶肽的同系物与 所述人的序列优选具有70％的氨基酸相同性，更优选85％的相同性，最 优选95％，或甚至99％的序列相同性。对比序列的长度，通常为至少8 个氨基酸残基，通常至少20个氨基酸残基，更常见的是至少24个氨 基酸残基，一般的是至少28个氨基酸残基，并且优选超过35个氨基 酸残基。

术语“片段”表示包括是SP，pS2和ITF的截短物或缺失物的多 肽。所述片段与所述人多肽序列的相应的区域，优选具有70％的氨基酸 相同性。所述片段与相应的人类多肽更优选具有85％的相同性，最优选 95％，或甚至99％的相同性。对比序列的长度，通常为至少8个氨基酸 残基，通常至少20个氨基酸残基，更常见的是至少24个氨基酸残基， 一般的是至少28个氨基酸残基，并且优选超过35个氨基酸残基。

优选的片段包括相当于人ITF的25，35，45，50，51，62，或71 号位置上(图1)或相应于人pS2的31，41，51，56，57，68，和82 号位置上(图2)的半胱氨酸的任何位置中四个半胱氨酸残基。所述片 段更优选在上述位置上包括5个半胱氨酸残基。最优选存在6个，或 者甚至所有7个半胱氨酸。

SP的片段表示包括截短或缺失形式，并且优选与相应的人SP多肽 序列具有70％的序列相同性(图3)。更优选，所述片段与所述人多肽 序列的相同性为85％，最优选为95％，甚至99％。活性片段优选包括相 当于所述人SP多肽的6，8，19，29，34，35，46，58，68，78，83， 84，95，和104号位置的至少4个半胱氨酸残基。更优选的是，所述 片段含有相当于所述位置的6个半胱氨酸。更优选的是含有8个半胱 氨酸的片段，最优选的是含有在10个，12个，或者甚至所有14个位 置上的半胱氨酸的片段。

在本领域中得到认可的是，所鉴定的半胱氨酸残基的一种功能， 是产生所述特有的三环(就是三叶)结构。因此，ITF和pS2的优选片 段具有至少一个环状结构，更优选所述片段具有两个环状结构，最优 选它们具有三个环状结构。同样得到充分认可的是，天然SP多肽具有 六个环状构象。优选的片段包括所述环状结构中的至少两个，更优选 的是，四个环状结构是保守的，最优选的是，存在五个或甚至所有六 个环状结构。

“气溶胶”表示以气溶胶化的制剂形式施用的本发明三叶肽的任 何组合物，例如，包括吸入喷雾剂，吸入溶液，吸入悬浮液，雾化溶 液，或鼻腔喷雾剂。

“抗微生物剂”表示能够改变细菌或真菌细胞或病毒的生长，以 便阻止、稳定或抑制生长，或其中，杀死所述微生物的任何化合物。 换句话说，抗微生物剂可以是杀微生物的或抑微生物的。

“抗肿瘤治疗”表示用于治疗癌症的任何治疗方案。一般的抗肿 瘤治疗包括化疗和放疗。

“生物学活性”在用于表示三叶肽、片段或同系物时，表示具有 它相关的，天然存在的家族成员所共有的活性的任何多肽，并且，所 述活性是天然存在的三叶肽家族所共有的。所述三叶肽家族所共有的 生物学活性的一种例子是，恢复胃肠道粘膜(Taupin等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.97(2)：799-804)。

术语“分离的DNA”表示在产生所述特定DNA的天然存在的生物的 基因组上不含位于所述DNA旁侧的基因的DNA。因此，举例来说，术语 “分离的DNA”包括cDNA，克隆的基因组DNA，和合成的DNA。

术语“药物组合物”表示含有至少一种治疗性或生物学活性制剂， 并且适合给患者施用的任何组合物。适合向所述呼吸道中输送治疗剂 的药物组合物包括，但不局限于气溶胶和干粉。上述任何制剂都可以 通过众所周知的和本领域接受的方法制备。例如，参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th edition，(ed.AR Gennaro)，Mack Publishing Co.，Easton，PA，2000。

“高严格性条件”表示以高温和低离子强度为特征的任何类型的 条件，并且可以进行与在以下条件下进行的杂交相当的杂交：使用长 度为至少40个核苷酸的DNA探针，在含有0.5M NaHPO4，pH 7.2， 7％ SDS，1mM EDTA，和1％ BSA(Fraction V)的缓冲液中，在65℃下， 或在含有48％甲酰胺，4.8×SSC，0.2M Tris-Cl，pH 7.6，1×Denhardt′s 溶液，10％硫酸葡聚糖，和0.1％ SDS的缓冲液中，在42℃下。用于 诸如PCR，Northern，Southern，或原位杂交的高严格杂交，DNA测 序等的其他条件，为分子生物学领域的技术人员所熟知。例如，参见 F.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，1998，被收作本文参考。通过以下详 细说明，以及通过权利要求书可以理解本发明的其他特征和优点。

“基本相同”表示一种多肽或核酸与参考氨基酸或核酸序列具有 至少75％，但优选85％，更优选90％，最优选95％或99％的相同性。对 于多肽来说，比对序列的长度通常为至少20个氨基酸，优选至少30 个氨基酸，更优选至少40个氨基酸，最优选50个氨基酸。对于核酸 来说，比对序列的长度通常为至少60个核苷酸，优选至少90个核苷 酸，更优选至少120个核苷酸。

“治疗有效量”表示足以提供医学效果的用量。当按照此处描述 的方法给人类患者施用三叶肽时，有效用量通常根据要治疗的病变面 积的大小而改变；不过，治疗有效量通常为每个剂量大约1-2500mg 三叶肽。用药通常是每天进行1-4次。还可以在一定时间内给所述患 者连续施用三叶肽。

                      附图简述

图1是人肠三叶因子的氨基酸序列(ITF；登记号BAA95531)(SEQ ID NO.：1)。

图2是人pS2蛋白的氨基酸序列(登记号NP-003216)(SEQ ID NO.： 2)。

图3是人解痉多肽的氨基酸序列(SP；登记号1909187A)(SEQ ID NO.：3)。

图4是编码人肠三叶因子的cDNA序列(SEQ ID NO.：4)。

图5是编码人pS2蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO.：5)。

图6是编码人解痉多肽的cDNA序列(SEQ ID NO.：6)。

图7是编码人肠三叶固子的基因的核苷酸序列(基因座10280533： 52117-55412)(SEQ ID NO.：7)。

图8是编码人pS2蛋白的基因的核苷酸序列(基因座10280533： 16511-21132)(SEQ ID NO.：8)。

图9是编码人解痉多肽的基因的核苷酸序列(基因座10280533： 957-5208)(SEQ ID NO.：9)。

                        详述

本发明提供了用于治疗，改善，和预防对呼吸道上皮的多种病变 的方法和组合物。按照本发明治疗的呼吸道上皮的病变，可能是由物 理(例如，手术介入或插管)，化学(例如，吸烟或接触挥发性溶剂)， 或热创伤；血管病变(例如，由充血性心脏衰竭或慢性阻塞性肺病所 导致的)；传染性或炎性过程；抗肿瘤治疗(例如，放疗或化疗)； 或其他疾病过程，如囊性纤维化或哮喘所引起的。另外，对呼吸道上 皮的另一种常见的化学刺激，包括长时间地接触高浓度的氧气(例如， 高压氧治疗)。

按照本发明方法治疗所述病变，能够加速上皮愈合，减轻与呼吸 道上皮病变相关的症状，并且减轻，延缓或阻止加重鼻炎，哮喘，肺 炎的继发性并发症，或所述呼吸道上皮损病变的其他并发症。另外， 由于本发明能加速正常的上皮愈合并且减轻感染，所以它能够降低获 得性二次感染以及呼吸道的持续过敏的晚期继发作用(例如，枯草热 和哮喘)的机会。

呼吸道上皮的病变，如由过敏反应或物理创伤导致的病变可以用 以气溶胶或干粉形式输送的三叶肽进行治疗。按照已知的和常规的用 于制备所述制剂的方法，将所述组合物制备(微粉化)成干粉吸入剂 或气溶胶。在用于治疗气管支气管呼吸道上皮时，本发明组合物的施 用优选在症状出现时马上进行，并且持续3-10天时间，或者直到呼吸 道上皮的病变消失。不过，对于轻度病变来说，三叶肽治疗可以在较 短时间内治愈所述病变，特别是在与另一种活性成分组合时更是如 此。

本发明的组合物还可以在有可能病变呼吸道上皮的治疗之前预防 性地使用。例如，所述组合物可以在抗肿瘤治疗之前或在手术介入之 前施用，以便减轻上皮完整性的损失。由于鼻咽呼吸道上皮破坏所产 生的症状的预防或改善还可以通过在预期的刺激之前施用所述三叶肽 而实现。例如，患者可以在“枯草热”季节在接触树木或草的花粉之 前进行三叶肽治疗，或在所述患者在有发生鼻咽感染危险的期间，以 较小的间隔进行预防性治疗。

通常，计量剂量的吸入剂或干粉吸入剂是患者自己施用的。通常 在医生的监督下进行的连续喷雾剂的波动大的呼吸，还可以对三叶肽 和辅助药用剂量进行独立的调控。

药用制剂

气溶胶

气溶胶化的制剂，能够以低的全身吸收形式直接将高浓度三叶肽 输送到呼吸道中，并且包括，例如，鼻腔喷雾，吸入溶液，吸入悬浮 液，和吸入喷雾剂。鼻腔喷雾剂通常包括溶解或悬浮在溶液或赋形剂 (例如，防腐剂，粘度改性剂，乳化剂或缓冲剂)的混合物中的具有 治疗活性的三叶肽，它装在能够输送计量剂量的喷雾剂的常压分液器 中。吸入溶液和悬浮液是水基制剂，它含有三叶肽，并且如果必要的 话还含有其他赋形剂。所述制剂预计是通过吸气输送到呼吸道中的。 通常，计量剂量的气溶胶吸入器，能产生直径为20-30微米的液滴。

肺输送的主要限制是难于到达肺的底部。为了能够在上呼吸道和 下呼吸道获得高浓度的三叶肽溶液，优选在喷头喷雾器，超声波喷雾 器，或电子喷雾器中对所述三叶肽进行雾化，特别是使用通过添加单 向流动阀改进过的喷雾器，例如，Pari LC PlusTM喷雾器可以从Pari Respiratory Equipment，Inc.，Richmond，Va.购买，该装置能输 送比未改进的喷雾器多出20％的药物。

所述制剂的pH对于气溶胶的输送来说也是重要的。当所述气溶胶 是酸性的或碱性的时，它可能导致支气管痉挛和咳嗽。pH的安全范围 是相对的，并且取决于患者的耐受力。某些患者能耐受弱酸性气溶胶， 而这种气溶胶在其他患者体内可能导致支气管痉挛。通常，pH低于4.5 的气溶胶溶液诱导支气管痉挛。pH在4.5-5.5之间的气溶胶，偶然会 导致这种问题。pH为5.5-7.0的气溶胶溶液通常被认为是安全的。pH 超过7.0的任何气溶胶都应当避免，因为身体组织不能够缓冲碱性气 溶胶，并且导致刺激和支气管痉挛。因此，所述制剂的pH优选保持在 5.5-7.0之间，最优选5.5-6.5，以便能够产生患者能够很好耐受的三 叶肽气溶胶，而又没有任何继发性的不希望的副作用，如支气管痉挛 和咳嗽。还可以根据患者的耐受力将所述制剂的渗透摩尔浓度调整到 大约250-350mosm/L。施用高渗或低渗溶液，在某些场合下可能具有 较差的耐受力，特别是当给裸露的粘膜使用时更是如此。还可将HFA 134a，HFA227的推进剂和它们的组合用于所述制剂中。如果需要的话， 还可将能够促进药物分散或增强阀的润滑度的赋形剂与所述三叶肽配 制在一起。

干粉制剂

作为气溶胶输送的替代治疗方法，所述三叶肽还能够以干粉制剂 形式施用，以便有效输送到内部支气管空间。所述制剂具有若干优点， 包括产品和制剂稳定性，每次吹气输送较大体积的药物，以及微生物 生长的低易感性。因此，当需要输送大量三叶肽时，干粉吸入和计量 剂量的吸入是最可行的，例如，包括较大部分的呼吸道上皮细胞受到 影响的状况。根据干粉输送装置的效力，有效的干粉剂量水平，通常 在大约20-大约60毫克范围内。因此，本发明提供了药物颗粒的干粉 或计量剂量形式的足够有效的制剂。这种制剂是方便的，因为它不需 要任何进一步的处理，如稀释所述干粉。另外，它采用了足够小的， 完全便携的，并且倾向于具有长的货架寿命的装置。

对于本发明的干粉制剂来说，通过培养基研磨，喷射研磨，喷雾 干燥，超临界流体能力，或颗粒沉淀技术将三叶肽组合物研磨成物质 平均空气动力学直径为1-10微米的粉末。

粒度测定可以用多级Anderson级联冲击器或其他合适的方法进 行。另外，所述干粉制剂可以通过喷雾干燥或溶液沉淀技术制备。喷 雾干燥的优点是，最不容易降解所述三叶肽。溶液沉淀是通过将能降 低药物溶解度的助溶剂添加到均匀的药物溶液中进行的。当添加了足 够的助溶剂时，所述药物的溶解度降低到形成固体药物颗粒的程度， 所述颗粒可以通过过滤或离心收集。沉淀具有高度可再现性的优点， 并且可以在能减弱降解的低温条件下进行。超临界流体技术可以产生 具有适合粉末制剂的受控制的粒度、密度和结晶度的药用化合物的颗 粒。

本发明的干粉制剂可以直接用于计量剂量或干粉吸入器中。目 前，对计量剂量吸入器技术进行了优化，以便输送质量为1微克-5毫 克的治疗剂。诸如空气腔室的间隔区技术也可用于增强肺接触，并且 协助患者协调。

干粉输送的另一种途径是通过干粉吸入器。有两种主要的干粉吸 入器设计，装置-计量设计，其中，将药物容器储存在所述装置中，并 且，患者将所述装置的一定计量‘加载’到所述吸入腔室中，并且所 述患者的吸入气流加速了所述粉末离开所述装置，并且进入口腔。另 外，干粉吸入器还可以采用空气源，气体源，或静电，以便输送所述 三叶肽。用于干粉吸入器的现有技术是这样的，有效负载限制为大约 10毫克粉末。所述干粉制剂是温度稳定性的，并且具有4.0-7.5的 生理学可接受的pH，优选6.5-7.0。

治疗剂

除了所述三叶肽之外，本发明的治疗性制剂还可以包括第二种治 疗剂，或治疗方案。所述第二种治疗剂可以在(在施用所述三叶肽之 前或之后)14天，7天，1天，12小时，1小时内施用或与所述三叶 肽同时施用。所述第二种治疗剂还可以存在于与所述三叶肽相同或不 同的药物组合物中。因此，除了三叶肽之外，用于局部治疗呼吸道上 皮的药物组合物可以包括，例如，抗炎化合物，抗生素，β-肾上腺素 能支气管扩张剂，胆碱能受体拮抗剂，神经激肽受体拮抗剂，甾族化 合物，解充血药，磷酸二酯酶抑制剂，止痛剂，或麻醉剂。

当所述第二种治疗剂存在于不同的药物组合物中时，可以使用不 同的施用途径。例如，所述第二种治疗剂可以口服，或通过静脉内、 肌内、或皮下注射。因此，第二种治疗剂不一定通过吸入施用。如果 需要的话，一种以上的治疗剂可以与三叶肽一起施用。当然，药物组 合物还可以包括两种，三种，或三种以上三叶肽，或生物学活性片段。

三叶肽

治疗性三叶肽通常是哺乳动物三叶肽或它们的片段，尽管也可以 使用大体上与所述哺乳动物三叶肽相同的非天然存在的同系物。优选 使用人类三叶肽或片段；不过，可以使用来自包括大鼠、小鼠、和非 人灵长类的其他物种的三叶肽。通常，三叶肽是肠三叶肽因子(ITF)； 不过，还可以使用解痉多肽(SP)，或pS2。

特定的三叶肽片段保留了生物学活性，并且可以在使用三叶肽的 任何方法或组合物中作为替代物使用。例如，含有三叶肽的可以用所 述三叶肽片段替代的方法和组合物描述于以下文献中：美国专利号6, 063,755和6,221,840，以及申请日为2002年4月24日的美国专 利申请号10/131,363，申请日为2001年9月6日的60/317,657， 申请日为2002年10月5日的60/327,673，申请日为2001年11月 28日的60/333,836，以及申请日为2002年3月26日的60/367,574 (被收作本文参考)。

保留了生物学活性的特别有用的ITF片段包括相当于SEQ ID NO： 1的15-73号氨基酸残基的多肽(ITF15-73)和相当于SEQ ID NO：1的 21-73号氨基酸残基的多肽(ITF21-73)。其他有用的ITF片段是通过裂 解C-末端苯丙氨酸残基形成的(即ITF1-72，ITF15-72和ITF21-72)。

本发明的生物学活性三叶肽片段可以用任何合适的方法生产。例 如，可以将编码需要的ITF片段的cDNA用于本领域已知的任何方法， 用来生产重组蛋白。本文提供了示例性的方法。ITF片段，特别是 ITF21-73，可以用毕赤酵母表达系统生产(例如，参见美国专利号4, 882,279和5,122,465)，该表达系统是用编码长的ITF类型，如 完整长度的ITF(例如SEQ ID NO：4)或ITF15-73的cDNA转化过的， 在发酵时，培养物保持在pH大约5.0。

包括ITF在内的三叶肽是可溶性的，因此，可以溶解在可以药用 的载体液体中，例如，用于气溶胶化或雾化。对含有三叶肽的气溶胶 进行空气动力学粒度的优化，以便靶定感兴趣的呼吸道部位。通常， 大小为1-3微米的气溶胶靶定深层肺(肺泡)结构，而5-10微米的粒 度会导致气管支气管沉积。另外，可以用某些赋形剂延长输送到肺或 鼻腔部位的三叶肽的局部释放，或通过改变粘膜纤毛清除速度，将所 述三叶肽制剂保持在肺的需要的局部。

三叶肽剂量

通常，根据要治疗的病变的类型和严重程度，对治疗的剂量、次 数和持续时间进行调整。例如，间歇性用药就足以治疗小的呼吸道病 变。由诸如严重的烟雾吸入或热病变导致的更严重的呼吸道病变可能 需要连续使用三叶肽。另外，治疗还可以是预防性的，预防对呼吸道 上皮的病变。所述预防性治疗可以在刺激之前至少1天，3天，5天， 7天，或10天开始。对非预料的呼吸道病变的治疗，优选在刺激之后 马上或24小时之内开始。三叶肽治疗优选每天进行1次，2次，3次， 4次，或4次以上，持续至少1天，5天，14天，或甚至持续到接受治 疗的患者的一生。另外，所述三叶肽可以在一定时间内给所述患者连 续施用，例如，持续1小时，2小时，6小时，1天，或1天以上。为 此，举例来说，所述三叶肽可以用喷雾器系统的口罩接头施用。

优选将含有浓度为5，10，20，40，60，80，100毫克/毫升或更 高浓度的三叶肽气溶胶制剂，配制成生理学上可接受的溶液，优选为 正常盐溶液的1/4浓度。患者优选施用至少10，50，100，200，500， 700，1000，或1000微克以上的气溶胶形式的三叶肽。干粉吸入的使 用优选导致将至少大约1，5，10，20，30，40，50，60，或60毫克 以上的三叶肽输送到接受治疗的患者的呼吸道中。在所述制剂中，所 述三叶肽是以非结晶或晶体状态的粉末形式输送的，将三叶肽有效输 送到支气管内部间隙中所必须的物质平均空气动力学直径为1-10微米 的粒度，以便治疗、改善、和预防呼吸道上皮的病变。还可以采用2- 4微米的组分以便靶定外周肺。患者吸入技术，如呼吸保持技术，还可 以优化三叶肽的沉积。

如果必要的话，所述三叶肽还可以口服，或通过静脉注射施用， 特别是在以受控制的或连续的三叶肽释放为目的时。

包括所述三叶肽成分在内的在本发明的组合物中所使用的所有治 疗剂，能够以目前已知的用于所述制剂的剂量范围使用。根据患者的 临床状况，治疗目标(治疗或预防)，预期的持续，病变部位，以及 使用所述三叶肽的病变的严重程度，使用不同浓度的三叶肽或其他制 剂。剂量选择的其他因素包括：疾病病因，患者年龄(少儿，成人， 老年人)，一般健康和共发病率。

抗炎剂

合适的抗炎剂可以与三叶肽一起配制，并且用本发明的方法使 用。合适的抗炎剂可以全身地施用，或者可以通过吸入施用。示例性 的制剂包括，但不局限于非甾族抗炎药物(例如，异丁苯丙酸，他克 莫司，色甘酸，奈多罗米)，环加氧酶-2-特异性抑制剂，如rofecoxib (Vioxx)和celecoxib(Celebrex)，和糖皮质激素。

可以通过气溶胶化使用的特别有效的糖皮质激素制剂包括，例如 丙酸氯地米松，氟尼缩松，budesonide和去炎松。其他有用的糖皮质 激素制剂包括强的松龙，地塞米松和氟替卡松。尽管哮喘是使用皮质 甾类的主要肺状况，当呼吸道上皮受到吸烟的病变时也可以使用所述 制剂，例如，慢性支气管炎和肺气肿。还可将皮质甾类用于治疗其他 肺部疾病，如肉样瘤病，肺泡炎和慢性发炎状况。所述药物可以通过 口服，静脉内(例如，在严重情况下)或通过吸入使用。优选给所述 患者施用吸入的皮质甾类，因为需要的剂量少的多，并且是直接输送 到肺中的小的空气通道中，因此具有很少的相关的副作用。

可以使用已知在吸入施用之后有效的抗炎浓度。例如，异丁苯丙 酸能够以足以每天向呼吸道病变输送25-800毫克的浓度存在于所述 组合物中。

支气管扩张剂

任何活性支气管扩张剂都可以常用剂量与所述三叶肽共同配制， 以便呼吸道应用于鼻咽或气管支气管解剖学。有用的支气管扩张剂包 括，但不局限于甲基黄嘌呤(例如，茶碱，可可碱，和咖啡因)，拟交 感神经药(例如，肾上腺素(adrenaline)，肾上腺素(epinephrine)， 异丙肾上腺素，和β-肾上腺素能激动剂)，胆碱能受体拮抗剂，如异 丙托溴铵和tiotropium和神经激肽受体拮抗剂。

肾上腺素能支气管扩张剂通常是通过吸入施用的，以便打开肺的 支气管(空气通道)，并且，通常被用于治疗，改善，或预防哮喘， 慢性支气管炎，肺气肿，和其他肺病的症状。所述示例性的支气管扩 张剂包括舒喘宁，比托特罗，肾上腺素，非诺特罗，福莫特罗，新异 丙肾上腺素，异丙肾上腺素，间羟异丙肾上腺素，吡布特罗，丙卡特 罗，消旋肾上腺素，沙美特罗，和特布他林。

另外，本发明的三叶肽可以与白三烯受体拮抗剂(例如，孟鲁司 特，或扎鲁司特)，神经激肽受体拮抗剂，抗组胺剂(例如，苯海拉明， 甲美芳铵，西替利嗪，或氯雷他定)或胆碱能受体拮抗剂一起施用。

抗微生物剂

可以将任何合适的抗微生物剂以这些制剂的常用浓度用于本发明 的组合物中。合适的抗微生物剂包括抗细菌，抗真菌，抗寄生物和抗 病毒制剂。典型的抗细菌制剂(抗生素)包括青霉素(例如，青霉素G， 氨苄青霉素，甲氧苯青霉素，苯甲异噁唑青霉素，和阿莫西林)，头孢 菌素(例如，羟氨苄头孢菌素，头孢雷特，头孢噻肟，和头孢三嗪)， 四环素(例如，强力霉素，二甲胺四环素，和四环素)，氨基糖苷(例 如，氨羟丁卡那霉素A，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，链霉素，和妥 布拉霉素)，大环内酯(例如，azithromycin，克拉霉素，和红霉素)， 氟喹诺酮(例如，环丙沙星，洛美沙星，和诺氟沙星)，以及其他抗生 素，包括氯霉素，氯林肯霉素，环丝氨酸，异烟肼，利福平，和万古 霉素。特别有用的制剂包括氨基糖苷，例如，包括氨羟丁卡那霉素A， 庆大霉素，卡那霉素，新霉素，乙基西梭霉素，巴龙霉素，链霉素， 和妥布拉霉素。

抗病毒制剂是能够破坏或抑制病毒复制的物质。抗病毒制剂的例 子包括1，-D-核糖呋喃糖基-1，2，4-三唑-3氨甲酰，9-＞2-羟基- 乙氧基-甲基鸟嘌呤，金刚烷胺，5-碘-2′-脱氧尿苷，三氟胸苷，干 扰素，阿糖腺苷，蛋白酶抑制剂，胸苷激酶抑制剂，糖或糖蛋白合成 抑制剂，结构蛋白合成抑制剂，附着和吸附抑制剂，以及核苷类似物， 如阿昔洛韦，喷昔洛维，伐昔洛韦，和更昔洛韦。

抗真菌制剂包括杀真菌剂和抑真菌剂，例如，苯甲酸，十一碳烯 链烷醇酰胺，环吡酮胺，多烯，咪唑，烯丙胺，硫代氨甲酸酯，两性 霉素B，对羟基苯甲酸丁酯，氯林肯霉素，econaxole，氟康唑，氟胞 嘧啶，灰黄霉素，制霉菌素，和酮康唑。

已知诸如喷他脒的抗寄生物剂的其他抗微生物剂，具有呼吸道副 作用。因此，同时施用三叶肽和这种类型的抗微生物剂，有可能减弱 或预防副作用。

可以使用已知能有效治疗呼吸道感染的抗微生物剂浓度。

抗癌制剂

肺癌包括小细胞和非小细胞癌，可损伤肺上皮。抗癌治疗常会加 重这种病变，因为很多抗癌制剂对上皮细胞具有负面影响。因此，优 选在抗肿瘤之前，同时，或之后施用三叶肽，以便预防，改善，或治 疗对呼吸道上皮的病变。化疗剂通常是通过静脉内注射全身性施用 的。三叶肽可以作为对化疗制剂的添加剂，通过吸入同时使用，或者 单独使用。对接受放射疗法的患者来说，优选通过吸入施用三叶肽， 始于每一个治疗期的1-3天，持续整个的疗程，并且在最后一次放射 疗法之后继续1-3天。

三叶肽的生产

三叶肽和片段可以通过本领域已知的用于表达重组蛋白的任何方 法生产。可以将编码三叶肽(例如，人肠三叶因子(图4和7))，人pS2 (图5和8)，和人解痉多肽(图6和9)或它们的片段)的核酸导入用于 表达的各种类型的细胞或无细胞系统，以便能够大规模生产，纯化， 和进行患者治疗。

可以制备真核和原核三叶肽表达系统，其中，将三叶肽基因序列 导入质粒或其他载体，然后用于转化活细胞。可以将其中的三叶肽cDNA 包括沿正确方向插入表达质粒的完整可读框的构建体用于蛋白表达。 原核和真核表达系统可以表达和回收三叶肽融合蛋白，其中，所述三 叶肽与标记分子共价连接，这种标记有利于鉴定和/或纯化。可以在三 叶肽和所述标记分子之间产生酶促或化学裂解位点，以便在纯化之后 可以将所述标记除去。

典型的表达载体包括指导相当于具有质粒的细胞中插入的三叶肽 核酸的大量mRNA的合成的启动子。它们还可以包括真核生物和原核生 物的复制起点序列，使它们能够在宿主生物体内自主复制，包括编码 遗传学性状的序列，以便能够在存在其他有毒药物的情况下选择含有 载体的细胞，以及包括能提高合成的mRNA翻译的效率的序列。通过使 用如病毒的调控元件(例如，来自EB病毒基因组的OriP序列)，稳 定的长期载体可以作为自由复制的实体保持。还可以生产业已将所述 载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式连续地生产所述 基因产物。

外源序列在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌中的表达， 需要将三叶肽核酸序列插入细菌表达载体。所述质粒载体包括在细菌 中繁殖质粒及插入到质粒中的DNA表达所需要的若干元件。仅有携带 质粒的细菌的繁殖，是通过以下方法实现的：将编码使得携带质粒的 细菌能够在存在其他有毒药物的条件下生长的选择标记的序列导入所 述质粒。所述质粒还包括能够由克隆的基因产生大量mRNA的转录启动 子。所述启动子可以是(但不一定是)诱导型启动子，它能在诱导时 启动转录。所述质粒优选还包括多接头，以便简化将所述基因沿正确 方向插入所述载体的过程。还可以用哺乳动物细胞表达三叶肽。可以 用三叶肽表达载体制备稳定的或瞬时的细胞系克隆，以便生产可溶(截 短的和标记过的)形式的三叶肽。例如，合适的细胞系包括COS， HEK293T，CHO，或NIH细胞系。

一旦构建了合适的表达载体，就通过转化技术将它们导入合适的 宿主细胞，例如，但不局限于磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖转染，电穿孔， 显微注射，原生质体融合，或脂质体介导的转染。用本发明的载体转 染过的宿主细胞，可以包括(但不局限于)大肠杆菌或其他细菌，酵 母，真菌，昆虫细胞(例如，使用杆状病毒载体，以便在SF9昆虫细 胞中表达)，或源于小鼠，人，或其他动物的细胞。在三叶肽的体外 表达中，还可以使用由克隆的DNA编码的融合体或多肽片段。分子生 物学领域的技术人员可以理解的是，可以用多种表达系统和纯化系 统，生产重组三叶肽和它们的片段。例如，某些上述系统描述于Ausubel 等的文献中(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY 2000，被收作本文参考)。

转基因植物，植物细胞，和藻类也特别适用于制备用于本发明方 法和组合物中的重组三叶肽。例如，可以用本领域公知的技术制备能 表达三叶肽的转基因烟草植物或培养的转基因烟草植物细胞(例如， 参见美国专利号5,202,422和6,140,075)。还可以利用转基因 藻类表达系统生产重组三叶肽(例如，参见Chen等，Curr.Genet.39： 365-370，2001)。

一旦表达了重组蛋白，就可以利用诸如亲和层析的蛋白纯化技 术，从细胞裂解液中分离它们。一旦分离了所述重组蛋白，如果需要 的话，可以通过诸如高效液相层析的方法进行进一步纯化(HPLC；例 如，参见Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology，Work and Burdon，Eds.，Elsevier，1980)。

还可以通过化学合成，生产本发明的多肽，特别是三叶肽片段， 例如，采用Merrifield固相合成方法，液相合成方法，或这两种方法 的组合(例如，参见描述于以下文献中的方法：Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford， IL)。然后通过标准肽组装化学任选地缩合肽片段。

下面的实施例要说明本发明的原理以及需要三叶肽治疗的场合。 以下实施例并不是限定性的。

实施例1：由鼻病毒(Rhinovirus)导致的鼻炎的治疗

在头伤风发作之后，马上开始给患者施用含有三叶肽的制剂。该 制剂含有治疗剂量的ITF15-73。所述三叶肽可以使用标准制备方法以鼻 腔喷雾剂的形式施用，以便输送100微升的50mg/ml三叶肽喷雾剂。 在接下来的连续5天，患者通过每隔12小时自己施用所述鼻腔喷雾剂 进行治疗。另外，所述三叶肽活性材料可以以鼻腔解充血喷雾剂的标 准剂量使用(例如，0.05％盐酸氧甲唑啉)。

实施例2：治疗由草木花粉诱导的过敏性鼻炎

在枯草热季节中，患有过敏性鼻炎的患者施用抗组胺剂，如苯海 拉明，甲美芳铵，西替利嗪，或氯雷他定。另外，患者同时施用含有 治疗剂量的ITF15-73的鼻腔喷雾制剂。在一种例子中，这种成分是使用 标准制备方法的鼻腔喷雾剂，以便输送5mg/ml ITF喷雾剂。在随后 的5天时间，患者通过每隔12小时或根据需要自己施用鼻腔喷雾剂接 受治疗。在严重情况下，所述ITF活性材料还可以与标准剂量的鼻腔 糖皮质激素喷雾剂一起使用(例如，丙酸氯地米松，氟替卡松，莫美达 松，或去炎松)。

实施例3：病毒延长的支气管痉挛后的治疗

在病毒气管支气管上皮病变后治疗中，含有三叶肽的材料可以与 标准剂量的吸入的沙美特罗制剂共同配制到干粉吸入器，气溶胶计量 剂量吸入器中，或作为存在于超声波或空气喷射喷雾器中的溶液或悬 浮液。患者通过每隔12小时自己施用药物，继续治疗至少72小时。

实施例4：成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的治疗。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，是肺对多种病变反应的特有的响 应。ARDS的治疗应当尽可能早的进行，以便减轻所导致的对肺的病变。 治疗的目的是对受损的呼吸系统(和其他系统)提供足够的支持，直 到所述系统有时间愈合。ARDS的受损的呼吸系统的主要支持性治疗， 是机械通气(呼吸机)，以便向受损的肺输送大剂量的氧气，并且提 供连续的高压水平，被称为PEEP(正末端呼气压力)。为了加速愈合， 通过吸入给患有确立的ARDS或前期ARDS综合征的患者施用三叶肽。 ITF21-73的用量，在每隔24小时1000毫克的水平上。根据病例的严重 程度，以及患者的临床反应，所述治疗持续至少72小时。重复所述治 疗方案，直到愈合或进行10天治疗。可能更方便的是，以较少的次数 (每隔12或24小时)，并且以更高的浓度给所述患者施用有或没有 制剂的三叶草蛋白，以便增强肺毛细管上皮与所述肽的接触。可以与 三叶肽治疗同时使用的其他形式的治疗包括，例如，抗生素，免疫抑 制剂，血压支持治疗，插管喂饲，和利尿剂，用它减少肺中的液体。 由于ARDS的病理学还与过量产生的氧化氮相关，如果需要的话，可以 施用NO阻断剂。

实施例5：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncitial Uirus) 的治疗

人呼吸道合胞病毒是在世界范围内幼儿因病毒性呼吸道疾病而住 院的最重要的原因。初步感染通常会导致上呼吸道症状。尽管所述感 染从上呼吸道开始，它可能通过吸入分泌物或通过呼吸道上皮扩散到 下呼吸道，导致支气管炎和肺炎。在所述感染期间，RSV能导致对上皮 和支气管纤毛装置的严重病变。患有RSV的儿童，可以进行ITF治疗， 以便加速呼吸道上皮的恢复。患者通过吸入施用三叶肽，例如使用干 粉吸入器，吸入的气溶胶计量剂量，装在超声波或空气喷射喷雾器中 的溶液或悬浮液。每天3次施用所述三叶肽，剂量为1mg/吹气。优选 还施用能减轻疾病严重程度和持续时间的气溶胶化药物利巴韦林。

实施例6：流感感染的治疗

流感病毒感染气管和支气管的上皮细胞。由于感染造成的对上皮 的广泛病变，有可能导致严重的咳嗽以及胸部疼痛，并且，从受损的 细胞中释放出的细胞因子，有可能进一步导致发热，发冷，不舒服和 肌肉疼痛。另外，粘膜上皮的严重病变，有可能导致二次细菌感染和 支气管炎。为了缓解所述症状并且加快恢复速度，患者在出现感染症 状之后，应当尽快进行三叶肽治疗。ITF或它的生物学活性片段是用干 粉吸入器施用的，气溶胶计量剂量吸入的，或以装在超声波或空气喷 射喷雾器中的溶液或悬浮液形式施用的。另外，患者还可以通过鼻腔 喷雾进行所述三叶肽治疗。所述治疗每天进行3-4次，并且可以在所 述症状消失之后持续1周时间。

实施例7：慢性支气管炎的治疗

慢性支气管炎通常是由呼吸道的慢性刺激或由微生物感染导致 的。同样，它是一种通常与吸烟相关的症状，并且它的发病率通常与 肺气肿相关。患者通常患有带痰的慢性咳嗽。由慢性支气管炎对所述 上皮造成的病变，倾向于使个体受到肺炎球菌细菌入侵，这种入侵有 可能导致进一步的并发症，如肺炎。因此，呼吸道上皮的恢复或改善， 有可能减轻与慢性支气管炎相关的症状。被诊断患有慢性支气管炎的 患者或吸烟者，马上施用装在干粉喷雾器中的三叶肽，气溶胶计量剂 量吸入，或以装在超声波或空气喷射喷雾器中的溶液或悬浮液形式施 用。患者可以每天自己施用这种药物至少3次，持续至少7天时间， 或者直到停止咳嗽。如果必要的话，所述三叶肽治疗还可以包括施用 抗生素。

实施例8：治疗由吸入烟雾导致的病变

由诸如烟雾的快速作用毒素导致的直接毒性作用，可能马上使患 者致残。因此，所产生的包括支气管痉挛和肺泡病变的作用，可能导 致患者的快速恶化和高死亡率。吸入烟雾有可能启动患者的炎症反 应，导致组胺和其他血管活性物质释放，所述物质有可能造成对呼吸 道上皮的病变。治疗根据由吸入烟雾导致的病变的严重程度而改变。 治疗的主要目的是保持通畅的呼吸道，并且提供适当水平的氧气。如 果呼吸道开放并且稳定的话，可以通过呼吸面罩给患者提供高流量的 潮湿的100％的氧气。如果呼吸道组织的肿胀封闭了呼吸道，患者可能 需要插入气管内插管，以便人工保持开放的呼吸道。

还可以通过喷射喷雾器给患者马上、并且连续地施用ITF15-73至少 5天时间，以便减轻由烟雾诱导的对呼吸道上皮的病变，以及高压氧治 疗的有害作用。

实施例9：哮喘的治疗

哮喘的控制主要涉及通过治疗潜在的炎症过程，减轻和预防症 状，所述过程能诱导对呼吸道上皮的病变。另外，如果不治疗的话， 慢性发炎使得呼吸道对诸如冷空气，运动，粉尘螨，空气中的污染物 过敏，因此加重对上皮的病变。因此，给哮喘患者施用茶碱，抗炎剂 和治疗有效量的ITF15-73，以便改善与哮喘相关的症状，并且减轻对呼 吸道的病变。

                            序列表

<110>The General Hospital Corporation

<120>用于治疗呼吸道上皮病变的方法和组合物

<130>50206/007W02

<140>PCT/US02/38258

<141>2002-11-27

<150>US 60/333,836

<151>2001-11-28

<160>9

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>73

<212>PRT

<213>智人(Homo sapien)

<400>1

Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu

 1               5                  10                  15

Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gin Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg

            20                  25                  30

Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg

        35                  40                  45

Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe

65                  70

<210>2

<211>84

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ala Thr Met Glu Asn Lys Val Ile Cys Ala Leu Val Leu Val Ser

 1               5                  10                  15

Met Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Glu Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr

            20                  25                  30

Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly

    50                  55                  60

Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu

65                  70                  75                  80

Glu Cys Glu Phe

<210>3

<211>106

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Glu Lys Pro Ser Pro Cys Gln Cys Ser Arg Leu Ser Pro His Asn Arg

 1               5                  10                  15

Thr Asn Cys Gly Phe Pro Gly Ile Thr Ser Asp Gln Cys Phe Asp Asn

            20                  25                  30

Gly Cys Cys Phe Asp Ser Ser Val Thr Gly Val Pro Trp Cys Phe His

        35                  40                  45

Pro Leu Pro Lys Gln Glu Ser Asp Gln Cys Val Met Glu Val Ser Asp

    50                  55                  60

Arg Arg Asn Cys Gly Tyr Pro Gly Ile Ser Pro Glu Glu Cys Ala Ser

65                  70                  75                  80

Arg Lys Cys Cys Phe Ser Asn Phe Ile Phe Glu Val Pro Trp Cys Phe

                85                  90                  95

Phe ProAsn Ser Val Glu Asp Cys His Tyr

           100                 105

<210>4

<211>222

<212>DNA

<213>智人

<400>4

atgctggggc tggtcctggc cttgctgtcc tccagctctg ctgaggagta cgtgggcctg 60

tctgcaaacc agtgtgccgt gccagccaag gacagggtgg actgcggcta cccccatgtc 120

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tggtgtttca agcccctgca ggaagcagaa tgcaccttct ga                    222

<210>5

<211>255

<212>DNA

<213>智人

<400>5

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<210>6

<211>390

<212>DNA

<213>智人

<400>6

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ccgaagtctg tggaagactg ccattactaa                                  390

<210>7

<211>3280

<212>DNA

<213>智人

<400>7

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tgtgagtact gccctgactg ccccggtggc agggtgggcg tgaagggaag ggatccagga 120

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accggggctg ctgctttgac tccaggatcc ctggagtgcc ttggtgtttc aagcccctgc 1860

aggaagcagg taaggcccca gtggcatcgt ggtctgggcc cagccccata aggcaggggg 1920

tctcagggcc tccctgtcct ttctgggctg gagatggagg cacaaggacc ccaggaagcc 1980

acacacacac acctgttcca aggcctcaga gcagaggctt cacacttagg gcagccatgg 2040

ccaggggctg tcctcttctg tcccctttat gtaaaacata aaagcaattg tttcaaaaag 2100

gtgttcaaaa tgatggcatc gcatagaggg aactgattta gtaactattc ttgagagaag 2160

tggaaacgca taggtgtgga aagccgggcc gacttttggg ctgtttttgc aaatcggccc 2220

cccagagtct tgtcatttgt ggcatcccct acacagacgg caggcggtcc cagccctaga 2280

cgtcaggcct cggtgccaca ccccacctcc cccactctgc cccccacaag ggtcatctcc 2340

tctccctctc tctgccgtgg tggagggcag gtgcagggca accaccctgg gggttccctc 2400

cccaggggcg gagagcctgc gtgctgtgcg ggtaacagat ggccctgcac acgggtttgc 2460

caccctggct ccaccaggct tagctgcccc acatcgtggg tggggcgatt ggctataagc 2520

catctgccat gtccaagtgc cagctcagcc cccacgaagg ccgcacctgc gtgaggtacc 2580

ttcctggaac cagcatccag aggggcctct cttgcccttt gtcctagggt gaaatgcggg 2640

aggctgagtc ctgctggccc cggctccctg atcaatgatg ggcccctgcc cagggcctcc 2700

cttcaccctc cccagcaagt ccagggtagg ggtgggggtg ggggtccaga gaaggccagg 2760

agagagaggg gtctggctac tgtccactgc cggtcctgtt ccttcagctc cactggaact 2820

acactctcct ctgagtgcca gccatggccc tgccaaggcc catctcgctt gttatctgcc 2880

tgatccctgg gtcccactat cttgcttagc aacccgaggt gggaatcttg gctattcccc 2940

catgtggtgg ggactcaaca ctccccggtg actctgggga ggaggcagca ctaggtgctg 3000

gccttggagc ctgccctgac cttgggaagc tgggcagcgt gggtggagag agactgctca 3060

cacaagcctt tgctctgttt gcagaatgca ccttctgagg cacctccagc tgcccccggc 3120

cgggggatgc gaggctcgga gcacccttgc ccggctgtga ttgctgccag gcactgttca 3180

tctcagcttt tctgtccctt tgctcccggc aagcgcttct gctgaaagtt catatctgga 3240

gcctgatgtc ttaacgaata aaggtcccat gctccacccg                       3280

<210>8

<211>4623

<212>DNA

<213>智人

<400>8

dccctggggt gcagctgagc tagacatggg acggcgagac gcccagctcc tggcagcgct 60

cctcgtcctg gggctatgtg ccctggcggg gagtgagaaa ccctgtaagt gaaggagagg 120

gtctttttat gtgctttctt tatttctctt aaagaaaaaa aaaaagcaca accataaatt 180

aacttgagag ggggaatggc tataaaggca tctggcaatg tgtgttgttc acatgggatt 240

tgccactgct caggagggtg gctccaagaa gggcctccct cctagggaaa ggctgagtga 300

cggcaggtgt cagcgggccc cgtgtcgggc caggagggca ttcccaccaa gggtccttgg 360

agtcccagag cactcacctc tcgcctggat cttggccttg ggtccatctg ttcaccctcc 420

tctaggaggg ttttgttttt gtttttttcc gagacaggat ctggctttgc cgcccaggca 480

ggagtgcagt ggtgtgatct tggctcactg caacctctgc ctcccaggct caagtgatcc 540

tcccacctca gccgcctgag tagctgaaac cacagttgtg gaccatcatg cccggccaat 600

tttttttttt gtattgtttg tagagatggg gtttcgacat gttgcccagg atggtcttga 660

actcctgagc tcaagcaatc tgcccgcctc ggcttcctaa agtgctggga ttataggtat 720

gagccaccat gcctggcttt tttttttttt tccttttaaa ctaatataac aatttcagca 780

aagccctatc ggcttctcag gaggaaaccg cattgcttaa atatgggcaa gataagactt 840

tgtgtttctc tatgtggcaa caagacagta gaggcatccc ctagaacctc tgagagaagg 900

agcagtgtgg tctggggtac cagggtgggg ccgactgagg gtctttccac agccccctgc 960

cagtgctcca ggctgagccc ccataacagg acgaactgcg gcttccctgg aatcaccagt 1020

gaccagtgtt ttgacaatgg atgctgtttc gactccagtg tcactggggt cccctggtgt 1080

ttccaccccc tcccaaagca aggtaatctt ccagggaatc ttcctgggcc agcagctggc 1140

aacccaggac ccagcttcac aggcggagcc cagagcaggg gccggaggag gcccagttgc 1200

tagtctaggg ttagcctggg tgggttagtc tcgagctagc cccggttggt tagtctgggg 1260

ctagcccagg ttggttagtc tagagctagc ccaggttggt tagtctgggg ctagcccagg 1320

ttggttagtc tggggctagc ccaggttggt tagtctaggg ctagtgtagg ctagttagtc 1380

taaggctagc ccaggttggt tagtttggag ctagcgcagg ttggttagtc tggggctagt 1440

agcccaggtt ggttagcctg gagctagccc aggttggtta gtctagggct agcgtaggct 1500

ggttagtctg gggctagccc aggttggtta gtctggagct agcccaggtt ggttagtctg 1560

gggctagtag cccaggttgg ttagtctggg gctagcccag gttggttagt ctagggctag 1620

tgtaggctag ttagtctagg gctagcccag gttagttagt ttggagctag cacaggttga 1680

ttagtctggg gctagtagcc taggttggtt agtctggagc tagcccaagt tggttagtct 1740

agggctagca taggctggtt agtctggggc tagtagccta ggtttgttag tctggagcta 1800

gcccaggttg gttagtctag ggctagcgta ggctggttag tctagggcta gcccaggttg 1860

gttaatcgga gctagcccag gttggttagt ctggagctag cccaggttgg ttagtctgag 1920

gctagtagcc caggttggtt agtctggggc tagcccaggt ttgttagtct ggagctagcc 1980

caggttgttt agtctggagc tagcccaggt tggttagtct gggactagcc tggactgcta 2040

gtctagaggt agcctagagg actgctagtc tagaggtagt ctagggctag cccaggttgg 2100

ttagtctggg gctagcccat gttggttagt cttagactag cctggactgc tagtctagag 2160

gtagcccagg ttgtttagtc tggtactagc ctggactgtt agtctagagg tagcccaggt 2220

tggttaggtt ggttagtctg ggactagtct ggactgttag tctagaggta gcccaggttg 2280

gttagtctgg gactagcctg gactgttagt ctagaggtag cccagattgg ttagtctggg 2340

actagtctgg actgctagtc tagaggtagc ccaggttggt tagcctgggg ccagcctgga 2400

ctgttagtct agaggtaacc caggtcagcc aacagtgaga tgaaaatttc ccacctaccc 2460

tgtttctaca ctgttagttc tttcaacaga catgtgtgtg tggagccatc agttttactt 2520

tagttgagaa aaaaatatat atatatatag taggtctcct ctagtttttg aagtgtgact 2580

tctgaagaag cttccatggg gaaatgaagg tatttaatag gacagcagta acataagggc 2640

tgacagccct caaatgttag ggaaggaagt gaagccttct agggttcttt gggagtgagt 2700

tttatgttag tgcacgggat caggacccaa gttgtaacgc cgacgagtgc tcaaaggaag 2760

gttgtgtgtg tgtcgtgcac ctgtgtgcgt ggaaccaggc acgtcctctg gagaaggagg 2820

attcatcccc aagattgttg ctgggaggct tgctgggccc cgcagggaaa ccaggcagat 2880

ggtggattgt tcacgagcgc ccactgaatg gcagtgtctt tgggaatcaa taccatgtcc 2940

aaacgctttc catcttacca aggtgcccac aaaccttttc tcatcttggc ccgggggacc 3000

accccattta ctgagaacac tgagtcccga gaggcaaaat gatttcccca aggcggggga 3060

ctccagagct tctgactgtg accaccccac atgggcccca ccttcgcgga ggacaggcca 3120

gccaagcgtc gctggggccg acacttccac agtccccggg ggaggcggtc ccaggggccg 3180

acacttccac agtccccggg ggaggccgtc ccgggggatg ctgccccagg cagcacctca 3240

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gggcacagca ggcctgactg ggtctcggtg ctgtgcctgt cccatggcag agtcggatca 3360

gtgcgtcatg gaggtctcag accgaagaaa ctgtggctac ccgggcatca gccccgagga 3420

atgcgcctct cggaagtgct gcttctccaa cttcatcttt gaagtgccct ggtgcttctt 3480

cccgaagtct gtggaaggta acgtcgctgt gggactctct gtctggttcc cggacaccat 3540

gattcctcct ccgtccgtag aggtggggtg cagggagggg agctgcctcg cagcctcagt 3600

gccatcgagg ccagggcccc tgcctcctat gggattctga aggcaattcc agaatgttct 3660

tggcaaagac agcgtctttt caataagttt atagcctcca gcattgccac tgcgtcatct 3720

gtgatggctc tagaaacagc ggctcatccc tgttgcctcc ccaggtgttg caacgttcag 3780

aggcgttgcc tgttttattg caagcccatc tgcatttgga ggctactgag tgtcttgcac 3840

tgtgctgggt accagagagg gcccaactca agcagacctg gccccttctc ccgtggcttc 3900

cccgttctcc cccacatgac cccgaatgac aaacctcatc cacaacgtcc tgctccgggc 3960

agtcccggga gggtcccgcc ggcagaggtg aacgggtcca cttctcccac ccgcttagtg 4020

atagtgtgtt cctgactcgg agtgtggcga ggtaaaaaaa gaccaagcag atccaggaaa 4080

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aaagcactcc aaagagcgaa atatttcatg ttcaggattt tccgagtgat tttttttatg 4200

tgacctaaag gtccacctag aaaatgttca cttgtctggg gagaatgcgc cccacagagg 4260

aaactctggc ctggggtggg aagatttggt ccctttacac cccctccccg ggaaaggagc 4320

tccttcttca gtaggaagct cctgggcaaa gtgatgcacg cccaccccag cttcgcagcc 4380

taggcactcc catttctggg gttcccttac caaccatctt gcatttaaac ttctagactg 4440

ccattactaa gagaggctgg ttccagagga tgcatctggc tcaccgggtg ttccgaaacc 4500

aaagaagaaa cttcgcctta tcagcttcat acttcatgaa atcctgggtt ttcttaacca 4560

tcttttcctc attttcaatg gtttaacata taatttcttt aaataaaacc cttaaaatct 4620

gct                                                               4623

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gggtggcagg gcccccggag accttcgaga agtgcgacga ggagggggct gccttcagtc 360

ggggctgttt tcctgtgtta ggaagactat acaatcctcc caagtgtcat gtttcaaaga 420

ggaagtgttg gcgtggggtc tcagaatagt gcttttgact gttcatgcca acatctcccc 480

caggggcaga ccctcccaag gcccatccag ataggcccaa atgccggtcc cagtgatggc 540

cacctgggag accctctccc acaggcccga atgcccgtcc cagtggtggc caactgggag 600

accctctcct acaggttcct gggctcccct gggatccatg ctctgggagt caaagccacc 660

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ccctgggtcc ttctagggag tggaggagga ggccattctt gcttccttgg gaagtgtttg 780

catctcaact cctttacctg cagaatggat caacggtctg ccctagggct gtcaggaaat 840

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ctgccctcca gccacctctt gatctctgct gtggggtacc gggcctgagg ggtgggcttg 1080

ggcagcgtag aagagcagcc agcattgggc tgcagtggga agacccccaa gcccatggca 1140

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accccacaca ccctctggct caaggctcag agcgtctttg cgggtcactc aggtccatga 1380

tcctgttaca actgaaatct agaaaattgt gattacagtt tagtgcattc gtgtgtggaa 1440

accatttcca tttatttcca tcatgcgaca aagacaaagc gggtgggcaa gacagagtct 1500

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cccaggatga tgatcctccc tcaccacggg gcctctcttg acccccacag tgtcccgggg 1620

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tctccaaaga catctcgagg cagtccctga tagcaaagca gacaagagaa cagcccctct 1800

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catcctgacg cggtgccgtc cccagcacgg tgattagtcc cagagctcgg ctgccacctc 4140

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