技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体而言，涉及一种毛乳头细胞的培养方法。
背景技术
[0002] 毛发在
皮肤特定部位具有相应的
密度及形态，它对人体具有防御、保护功能外，还具有增加信息交流和美观的作用。毛发由毛囊生成，毛囊具有周期性再生的特性，即经历生长期、退化期、静止期的循环。其中，由静止期向生长期的转换，即生长期启动为最关键的环节。当毛囊的周期性再生功能发生障碍时，就会出现脱发、斑秃等毛囊相关
疾病。随着社会发展，人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视，对毛囊周期性再生的研究将显得越来越重要。
[0003] 由于毛囊具有周期性生长的特性，为组织再生研究提供了一个非常好的模型。毛囊的周期性生长由毛囊干细胞介导发生，和其他干细胞一样，毛囊干细胞的静息与活化受到干细胞微环境的调控。毛囊干细胞位于毛囊隆突区，人们对影响毛囊干细胞自我更新和分化的微环境因素了解的还不多。
[0004] 特别引人注意的是，在毛囊干细胞的周期性活动过程中，毛乳头(dermal papilla，DP)居于非常特殊的地位。DP是真皮中的一群特化的间充质来源的细胞。大量研究表明：出生后的每一个毛囊周期中DP和毛囊干细胞均会发生定期的，规律性的
接触，而这种接触在静止期末或生长期启动时最为紧密，说明DP细胞可能为毛囊干细胞提供微环境支持，并在毛囊周期性再生的起始阶段发挥作用。基因敲除研究发现，DP缺失，不能形成完整的毛囊2；随后又发现，DP是一个分泌因子的中心，可以生成大量的
信号分子；最近的研究表明，这些
信号分子所激活的信号通路是毛囊周期性生长的重要调控因素，它们在毛囊生长的不同时期发挥着不同的调节作用。
[0005] 已有报道，将DP细胞制成微囊能够诱导大鼠
耳毛囊再生，并有将人DP细胞条件培养液用于斑秃
治疗的临床试验报道。这些应用都需要大量的DP细胞，因此，DP细胞的大量培养是毛囊周期相关疾病治疗需要解决的关键技术之一。不少学者尝试进行DP细胞原代培养，发现随着DP细胞培养代数的增加，其生物学活性快速改变；当传代至第6代时，细胞丧失诱导毛囊生长的特性。
[0006] 可见，DP细胞在毛囊周期中具有极其重要的作用。因此，获取大量的DP细胞就成为治疗毛囊周期障碍相关疾病的重要条件。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种毛乳头(DP)细胞的培养方法，该培养体系能够长期培养DP细胞，并成功应用于DP细胞建系。
[0008] 本发明一方面涉及一种毛乳头细胞的培养方法，其特征在于包括如下步骤：
[0009] 配制溶液：1.0.25％Dispase(中性蛋白酶，也称为分散酶)溶液的配制：准确称取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽滤分装，4℃或-20℃保存；
[0010] 2.2mg／ml胶原酶的配制：用TESCA缓冲液(50mM TES，0.36mM CaCl2，pH7.4)在37℃配制，配好后-20℃分装保存；
[0011] 3.DP培养基的配制：α-MEM
基础培养基，加入10％胎
牛血清，100×丙
酮酸钠，100×非必需
氨基酸，1000×青
链霉素，10ng／ml bFGF；
[0012] 培养过程：
[0013] 1.取新生8～9d健康C57小鼠1只，颈椎脱臼处死，酒精
棉球消毒触须部位；眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤，放入装有D-Hank's液的培养皿中；用
镊子夹着皮肤清洗，吸去多余D-Hank's液；
[0014] 2.解剖
显微镜下用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来，并转移到另一个装有D-Hank's培养基的培养皿中；
[0015] 3.分离完毕后，在超净台中用吸管将D-Hank's液吸干，加入
质量分数为0.25％的Dispase，20min(10-30min)；
[0016] 4.消化完成后，将毛囊转移到大的培养皿中，加入D-Hank's液将Dispase稀释(少量多次)，
手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来
[0017] 5.在手术显微镜下分离毛乳头，收集移入离心管；
[0018] 6.向离心管中加入0.2％胶原酶，37℃消化5-6小时；
[0019] 7.消化5-6小时后，离心管中加入DMEM培养基终止消化，吹打，离心1000rpm，3min；
[0020] 8.弃上清，细胞用DP培养基重悬，于6孔板中培养，培养4d后观察，常规方法传代；
[0021] 9.细胞传至第15代及以上时，收集细胞。
附图说明
[0022] 图1：免疫
荧光鉴定传代15代的原代培养的DP细胞的荧光显微镜照片。
具体实施方式
[0023] 一、DP细胞培养体系的建立
[0024] (一)I型胶原的包被
[0025] 1.配制0.01mol／L的HCl,PBS，高压灭菌后备用；
[0026] 2.稀释胶原：用0.01mol／L的HCl将I型胶原稀释成50μg／ml
[0027] 3.包被：六孔板每孔加入2ml(终浓度10μg／cm2)；
[0028] 4.室温放置1h
[0029] 5.吸掉上清
[0030] 6.PBS清洗包被板3次
[0031] 7.包被板置于4℃备用(可保存1周)
[0033] 1.0.25％Dispase(中性蛋白酶，也称为分散酶)溶液的配制：准确称取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽滤分装，4℃或-20℃保存。
[0034] 2.2mg／ml胶原酶的配制：用TESCA缓冲液(50mM TES，0.36mM CaCl2，pH7.4)在37℃配制，配好后-20℃分装保存
[0035] 3.DP培养基的配制：α-MEM基础培养基，加入10％胎牛血清，100×
丙酮酸钠，100×非必需氨基酸，1000×青链霉素，10ng／ml bFGF。
[0036] (三)实验步骤
[0037] 1.取新生8～9d健康C57小鼠1只，颈椎脱臼处死，酒精棉球消毒触须部位。眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤，放入装有D-Hank's液的培养皿中。用镊子夹着皮肤稍做清洗，吸去多余D-Hank's液；
[0038] 2.解剖显微镜下(×3.2)用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来，并转移到另一个装有D-Hank's培养基的培养皿中；
[0039] 3.分离完毕后，在超净台中用吸管将D-Hank's液吸干，加入质量分数为0.25％的Dispase，20min(10-30min)；
[0040] 4.消化完成后，将毛囊转移到大的培养皿中，加入D-Hank's液将Dispase稀释(少量多次)，手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来
[0041] 5.在手术显微镜下分离毛乳头，收集移入离心管；
[0042] 6.向离心管中加入0.2％胶原酶，37℃消化5-6小时；
[0043] 7.消化5-6小时后，离心管中加入DMEM培养基终止消化，吹打，离心1000rpm，3min；
[0044] 8.弃上清，细胞用DP培养基重悬，于6孔板中培养，培养4d后观察，常规方法传代；
[0045] 9.细胞传至第15代及以上时，收集细胞。
[0046] 10.传代至第15代时，用建立的培养体系培养的DP细胞仍表达DP细胞特异性标记物FGF7和a-SMA进行鉴定，鉴定结果显示(如图1所示)所建立的DP细胞培养体系，培养DP细胞15代后，细胞仍保持原代细胞特性，实验进一步证实其仍具有诱导毛囊生长的特性。因此，利用该方法可以获取足量的DP细胞，用于科学研究和临床治疗。所建立的DP细胞株，具有与原代DP细胞相同的基因表达模式。因此，除用于科学研究和临床治疗外，还可用于大规模的中试研究。
[0047] 以上所述是本发明的优选
实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
