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单平面照明 显微镜

阅读：597发布：2020-05-12

专利汇可以提供单平面照明显微镜专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种单平面照明显微镜，该单平面照明显微镜包括用于照射位于介质中的样品载体(2)上的样品(1)的照明光学系统，样品载体(2)平行于平坦参考表面(3)延伸。经由照明光路由光片照射样品。单平面照明显微镜还包括具有检测光路的检测光学系统。照明光学系统和检测光学系统的光轴每一个都与参考表面(3)的法线一起限定不等于零度的角度。单平面照明显微镜还包括阻挡层系统，该阻挡层系统包括由具有给定厚度的给定材料形成的至少一层并且将介质与照明和检测光学系统分离，且阻挡层系统的基部区域与可以用于照明和检测活动的区域接触，所述基部区域平行于参考表面(3)延伸。在照明光路和/或检测光路中的至少一个校正元件允许减少当待检测的光或用于照射样品(1)的光以一定角度穿过阻挡层系统的界面时产生的像差。这种类型的单平面照明显微镜包括一装置，所述装置与光片的产生无关，并用于在光片平面的大致点状区域中或在至少暂时包括所述光片平面的给定空间中通过至少一个操纵光路将光强度施加到样品(1)。，下面是单平面照明显微镜专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种光片显微镜，包括：
用于经由照明光路利用光片照射样品(1)的照明光学单元，所述样品位于介质中的样品载体(2)上，其中所述样品载体(2)平行于平坦参考表面(3)，所述光片具有光片平面，所述光片平面与所述参考表面(3)的法线形成不为零的照明角度；
检测光学单元，所述检测光学单元具有带有光轴(5)的检测光路，所述光轴在所述样品载体(2)的区域中与所述参考表面(3)的法线形成不为零的检测角度；
分离层系统，所述分离层系统具有至少一个层，所述至少一个层由具有指定厚度的指定材料制成并将所述介质与所述照明光学单元和所述检测光学单元分离，其中所述分离层系统至少在能够进行检测和照明的区域中通过与参考表面(3)平行的基面与所述介质接触；
至少一个校正元件，所述至少一个校正元件位于所述照明光路和/或所述检测光路中以用于减少由于待检测的光和/或用于照射所述样品(1)的光倾斜通过所述分离层系统的界面而发生的像差，其特征在于，
所述光片显微镜包括下述装置：所述装置独立于光片生成，用于在所述光片平面中的大致点状区域中或在至少暂时包括所述光片平面的指定的空间中，通过至少一个操纵光路将光强度施加在所述样品(1)上。
2.根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于，所述照明光学单元包括照明物镜(O1)，并且所述检测光学单元包括检测物镜(O2)。
3.根据权利要求2所述的光片显微镜，其特征在于，所述照明物镜(O1)与所述检测物镜(O2)相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵装置包括在所述操纵光路中的操纵物镜(O3)。
5.根据从属于权利要求2或3的权利要求4所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵物镜(O3)与所述照明物镜(O1)或所述检测物镜(O2)相同。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵装置包括点扫描器或多点扫描器，所述点扫描器用于将光强度以时间顺序的方式施加在所述样品(1)的各个单独的大致点状区域上，所述多点扫描器用于将光强度以时间顺序的方式施加在所述样品(1)的多个大致点状区域上，其中相应数量的所述大致点状区域能够同时被施加光强度。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵装置包括第一空间光调制器(23,41)，所述第一空间光调制器用于将指定的强度分布施加在所述样品上。
8.根据权利要求7所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵装置包括第二空间光调制器，所述第二空间光调制器用于将指定的幅值分布施加到所述指定的强度分布。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵装置包括数字微镜阵列(27)，所述数字微镜阵列用于在一平面中产生指定的强度分布，所述平面优选地平行于所述光片平面，特别优选地位于所述光片平面中。
10.根据从属于权利要求7或8的权利要求9所述的光片显微镜，包括切换装置，优选地是包括切换镜(38)，所述切换装置用于在所述第一空间光调制器(23)、所述数字微镜阵列、或两者的组合之间进行切换。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的光片显微镜，其中，所述操纵物镜(O3)与所述检测物镜(O2)相同，其特征在于，空间光调制器的第一区域(29)被实施用于将指定的强度分布或幅值分布施加在所述样品上并用作校正元件，并且所述空间光调制器(23)的第二区域(30)专门被实施为所述检测光路中的校正元件，其中偏转装置被设置以用于将待检测光转向到所述第二区域(30)上以及将用于操纵的光转向到所述第一区域(29)上。
12.根据权利要求11所述的光片显微镜，其特征在于，所述偏转装置包括二向色元件(31)，所述二向色元件具有有源光学表面，所述有源光学表面被布置成相对于彼此平行并且优选垂直于所述第一空间光调制器(23)的有源光学表面，其中所述光路被引导以使得用于操纵的和待检测的光在每种情况下被两次引导到二向色元件(31)上，并且到相应区域上的偏转通过所述二向色元件(31)的厚度来实现。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的光片显微镜，其中所述操纵物镜(O3)与所述照明物镜(O1)相同，其特征在于，所述照明光学单元包括空间光调制器(41)，用于所述光片形成的相位图案在光片生成区域(43)中被压印该空间光调制器上，并且用于将指定的强度分布施加在所述样品上的相位图案在操纵区域(42)中被压印在该空间光调制器上，并且所述照明光学单元包括用于将用于操纵的光专门偏转到所述操纵区域(42)上和将用于所述光片生成的光专门偏转到所述光片生成区域(43)上的装置。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，所述操纵光的光源、波长和强度被设计用于激发双光子和多光子跃迁。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的光片显微镜，其特征在于，设置用于时间聚焦的机构，该用于时间聚焦的机构用于沿着所述操纵光路的轴线进行用于操纵的光的强度的轴向定位，所述用于时间聚焦的机构优选地包括飞秒脉冲激光器(56)，所述飞秒脉冲激光器具有用于控制群速度色散的控制器。

说明书全文

单平面照明显微镜

技术领域

[0001] 本发明涉及一种光片显微镜，包括用于照射样品的照明光学单元。样品位于介质中(例如液体或凝胶中)的样品载体上，。样品载体在此平行于平坦参考表面；该参考表面可以例如是样品载体所在的样品台的平面，例如具有指定厚度的平面平行玻璃板或具有壁的相应容器，所述容器具有与所述参考平面平行的透明底部。容器可以是敞开的，或者所述容器可以被透明的盖玻璃封闭。照明光学单元用于通过照明光路照射样品，使用具有光片平面的光片执行照射，其中所述光片平面与参考表面的法线形成不为零的照明角度。光片显微镜还包括检测光学单元，该检测光学单元具有带光轴的检测光路，该光轴与样品载体的区域中的参考表面的法线形成不为零的检测角度。检测角度和照明角度之间的角度通常为90°，但这不是强制性规范。

[0002] 光片显微镜还包括分离层系统，该分离层系统具有由具有指定厚度的指定材料制成并将样品所在的介质与照明光学单元以及检测光学单元分开的至少一个层。分离层系统在此至少在可用于照明和检测的区域中通过平行于参考表面的基面与介质接触。在倒置光片显微镜的情况下，其中照射和检测设置在样品下部，样品容器的透明底部或样品承载板与空气层或浸没介质一起位于底部和光学单元之间，并形成分离层系统。从上面观察，样品容器的透明盖子，例如与空气层或浸没介质一起，形成在盖子与照明和检测光学单元之间的分离层系统。

[0003] 由于照明和检测光学单元与参考表面的法线形成不为零的角度，因此在照明光路和/或检测光路中布置至少一个校正元件以减少由于待检测的光或用于照射样品的光倾斜通过分离层系统的界面而产生的这种像差。

背景技术

[0004] 特别是在检查生物样品时使用光片显微镜，其中用具有与检测光轴以不为零的角度相交的平面的光片照射样品。这里的光片通常与检测方向形成直角，所述检测方向可以例如对应于仅用于检测的检测物镜的光轴。使用这种技术(也被称为SPIM(选择性或单平面照明显微镜))，甚至可以在相对较短的时间内产生相对较厚的样品的空间记录。基于光学部分结合样品和光片之间的相对移动(即，在垂直于截面平面的方向上)可以实现样品的视觉、空间扩展表示。

[0005] SPIM优选地用在荧光显微镜(被称为LSFM(光片荧光显微镜))中。与其他既定方法(例如，共焦激光扫描显微镜或双光子显微镜)相比，LSFM方法和装置具有以下优点：由于检测可在宽场中进行，因此可以捕获相对较大的样品区域。尽管分辨率低于共焦激光扫描显微镜，但是可以通过LSFM分析较厚的样品，这是因为穿透深度更大。此外，采用这种方法，样品暴露在光线下最低，这尤其降低了样品的不期望漂白的风险，这是因为所述样品仅由薄的光片以相对于检测方向不为零的角度照射。

[0006] 这里使用的光片可以是例如使用柱面透镜制造而成的静态光片，或是准静态光片。所述准静态光片可以通过用光束快速扫描样品来制造而成。当光束相对于被观察样品经历非常快速的相对移动时产生光片型照明，其在时间上连续多次重复以便排列。选择样品最终被成像在其传感器上的相机的积分时间，以使得在积分时间内完成扫描。代替具有二维传感器场的相机，也可以在检测光学单元中使用与另一扫描(重新扫描)组合的线性扫描传感器。另外，检测也可以是共焦检测。

[0007] SPIM已经在文献中建立并且已经多次描述，例如，在DE 102 57 423 A1和基于DE 102 57 423 A1的WO 2004/053558 A1中，以及在2009年在journal Development中第136卷第1963页的J.Huisken等人的文章“Selective plane illumination microscopy technics in developmental biology”中概述。

[0008] 迄今为止，根据SPIM方法操作的光片显微镜仅用于观察样品。然而，为了更深入地检查样品，通常希望在样品上执行光学操纵。在本发明的上下文中，术语光学操纵被理解为意指光激励，即，在形状、尺寸和同时操纵的数量可以被规定的横向和轴向受限的区域中将光强度沉积(deposit)在样品中的指定位置和时间处，其中样品必须不能被操纵光完全穿透，并且其中光强度的沉积导致指定位置的光学驱动反应。这样的反应可以例如是样品的漂白、光转化、解笼锁等。其中操纵光仅在待操纵的区域中沿操纵方向与样品相互作用的样品中的光学操纵在下文中称为局部光学操纵。

[0009] 在现有技术中，在这方面已知各种方法。例如，点扫描器(即，其中检测不是共焦的激光扫描显微镜)可以用于快速瞄准平面中(例如，在光片平面中)的期望位置。在这里，可以在焦点上产生高强度。这里的缺点是各个位置必须以时间连续被瞄准。必须通过聚焦(例如，物镜内部聚焦)或通过样品的相应移动来执行轴向定位。另一个缺点是在目标位置下方和上方的区域在轴向上被完全穿透，其中，根据强度，与样品的相互作用也可能发生在实际聚焦区域之外。使用适当的光学单元，还可以实现多点扫描器，其中多个点被同时瞄准。

[0010] 为了产生二维强度图案，例如可以使用数字微镜阵列(DMD阵列)，所述数字微镜阵列布置在照明光学单元的中间图像平面中。可以打开或关闭各个单独的像素，并直接限定样品中的被照射区域。这例如在2013年发表于Neuroscience Research 75(1)第76页的S.Tsuda等人的文章“Probing the function of neuronal populations:combining micromirror-based optogenetic photo-stimulation with voltage-sensitive dye imaging”中被描述。代替DMD阵列，可以在传输中使用LCD阵列，尽管在这种情况下会发生输入光功率的高损耗。代替DMD，还可以使用LED阵列，所述LED阵列然后可以直接用于照明，并且照明的幅值以基于像素的方式被调制，如在DMD中那样。相对于DMD阵列的优点是在MHz范围内的更高的调制频率，而在DMD阵列中的调制频率在kHz范围内。例如，在2010年发表于“Journal of Neural Engineering”中7(1)第016004页的N.Grossman等人的文章“Multi-site optical excitation using ChR2and micro-LED array”中描述了使用LED阵列来构造照明光。

[0011] 空间光调制器(SLM)的使用允许在空间扩展区域中进行光激励，换句话说，不仅在例如垂直于检测或照射方向的平面中，而且在该方向上轴向地进行光激励。为此，空间光调制器布置在操纵光路的光瞳平面中，并且将相位图案压印在该光瞳平面上，这因此改变了用于操纵的光的相位。然后成像产生期望的强度分布。这方法例如在2011年发表于Proceedings of the National Academy of Sciences中的108(49)第19504ff页的F.Anselmi等人的文章“Three-dimensional imaging and photo-stimulation by remote-focusing and holographic light patterning”中被描述。这里，强度分布被指定，所述强度分布可以例如基于样品结构由自先前记录的概览图像或由空间概览扫描来确定。使用基于逆傅里叶变换的算法，由所述指定的强度分布迭代地计算要被压印在SLM上的所需的相位图案。该过程例如在2005年发表于New Journal of Physics中7第117页的G.Whyte等人的文章“Experimental demonstration of holographic three-dimensional light shaping using a Gerchberg-Saxton algorithm”中被描述。然而，由于该过程的复杂性和通常基于液晶元件的空间光调制器的较低帧速率，图案在这里可以仅以非常缓慢的时间连续而变化，例如，以几十赫兹的频率变化。与二维构造相比，这些方法慢大约一百倍。

[0012] 通过多光子激发的概念，也可以实现对空间中的大致点状区域的光学操纵的特别好的局部限制。这里，仅在焦点中具有极高强度的激光脉冲被成像到该区域中。这种脉冲可以例如用飞秒激光器产生。选择该激光器的波长，以使得样品中存在的任何染料不会被激发成荧光。波长通常在近红外线内。然而，焦点中的光强度很高，以至于两个或更多个光子同时被吸收并触发相应的荧光激发跃迁的可能性特别高。仅在焦平面中的目标激发可以这种方式进行，而不是在焦平面之上或之下，如在单光子激发中的情况一样，这是因为强度在所述情况下太低。当使用具有多光子激发的扫描系统时，成像期间的穿透深度也可以增加。由于使用近红外范围内的更多波长，因此该方法特别有利于活体生物样品。用于多光子激发的方法可以与点式扫描相结合，但也可以与样品在许多点中同时被照射的多点照明相结合。这可以例如通过操纵光路中的空间光调制器来实现，其中迭代计算的相位图案已经被压印到所述操纵光路上。在双光子激发的背景下的这种方法例如在2008年12月19日发表于杂志Frontiers in Neural Circuits第2(5)卷第1页的V.Nikolenko等人的文章“SLM microscopy:scanless two-photon imaging and photo-stimulation with spatial light modulators”中被描述。

[0013] 虽然在点扫描器的情况下很容易使用多光子激发(尤其是双光子激发)以通过激发的二次强度依赖性结合该平面中的强聚焦产生深度辨别，但是在没有进一步辅助装置的情况下，这在宽场成像中是不可能的。然而，如果使用衍射光学元件(例如，光栅)，则短激光脉冲可以在光谱上被分开。然后通过显微镜物镜将所述衍射光学元件成像到样品中。随后，照明光的脉冲的不同光谱元素采用不同的光路，并且仅在焦平面中再次相遇以在此形成初始的非常短的激光脉冲。以这种方式，脉冲的峰值功率仅在焦平面中最大，这与已经提到的双光子激发的二次强度依赖性相结合，即使在宽场照明中也产生期望的深度辨别。这种方法(也被称为“时间聚焦”)例如在2005年发表于杂志Optics Express中13(5)第14687页的D.Oron等人的文章“Scanningless depth-resolved microscopy”中被描述。

[0014] 所有上述用于温和光激励的方法在很大程度上尚未用于光片显微镜。然而，US 8,547,634B2提出了用于在光学片显微镜中光操纵样品的各种布置。所有这些布置在这里始终还包括经由照明光路的操纵，其中操纵光同样被成形为光片，其中可以使用用于产生光片的光源或专用操纵光源。以这种方式不可能进行轴向局部限制的光激励。US8,547,634B2另外描述了除了通过光片的第一操纵照明之外还使用第二操纵光学单元的选项，在所述第二操纵光学单元中，操纵光经由检测光学单元被引导到样品上。在这方面提出的是使用激光扫描显微镜作为第二操纵光学单元。利用该第二操纵光学单元，原则上仅在光片平面中进行操纵是可能的，但是第二光源的操纵光通常在更大的区域中沿着光片的法线方向穿透样品，或者在更大的区域中进入所述样品。利用操纵光的操纵或照明也在光片平面中沿着光片的整个范围在照明光中轴向地实现。

发明内容

[0015] 因此，本发明的目的是开发一种在介绍部分中所述类型的光片显微镜，以使得可以进行样品的样品保存观察。

[0016] 该目的是在介绍部分中提到的类型的光片显微镜中实现的，所述光片显微镜被设计成特别用于对样品进行反向观察，其中光片显微镜仅包括一装置，所述装置独立于光片生成，并用于在所述光片平面中的大致点状区域中或在至少暂时包括所述光片平面的指定的空间中通过至少一个操纵光路将光强度施加在所述样品上。

[0017] 由于对大致点状区域的限制，也就是说对下述区域的限制，所述区域尤其在横向上被限制，例如——尽管不是唯一的——在平面中操纵的情况下，但是优选地相对于样品的整个体积也轴向地被限制，所述区域的尺寸当然取决于不同的因素，例如横向和轴向聚焦、所使用的激发机构、操纵装置本身等，但是可以获得特别的样品保存操纵。在这里，大致点状的区域可以在二维和三维空间中在“感兴趣区域”(ROI)的意义上限定更大的区域，其中多个相互独立且非连续的ROI可以被限定在要被操纵的空间中。术语“点”在这里不应该在数学意义上理解，而是旨在表明要选择和操纵的区域应该尽可能小。

[0018] 这里，操纵和观察/照明原则上彼此独立。例如，光片可以用于观察空间的一个区域或ROI，而操纵在不同的区域中进行。所述其他区域仅随后被光片照射。因此，进行操纵的空间或大致点状区域不需要被定位在光片平面中，同时强度被沉积在所述光片平面中。所述区域仅在随后的指定时间之后被光片捕获。

[0019] 光片显微镜的照明光学单元通常便利地包括照明物镜，并且检测光学单元包括检测物镜，其中照明和检测也可以通过相同的物镜实现，即，照明物镜可以与检测物镜相同。照明和检测也可以在光路中共享各个光学元件，例如校正元件。用于操纵的装置可以包括操纵光路中的单独的操纵物镜，但是也可以通过照明物镜或通过检测物镜进行操纵。在这些情况下，操纵物镜与照明物镜或检测物镜相同。这两种变形例具有不需要额外物镜的优点，但与使用专用操纵物镜相比，该配置稍微不那么灵活。特别优选地，通过检测物镜进行操纵，这是因为检测物镜通常垂直于光片布置，这使得在光片平面中或在光片平面周围的空间中的区域覆盖操纵更加容易。

[0020] 因此，操纵可以通过所提到的三个物镜中的每一个来实现，并且补充用于操纵的装置的元件(下面详细解释)通常可以用在三个物镜中的每一个中，即，可以耦合到照明光路，耦合到检测光路中，或耦合到专用操纵光路中。当使用照明光路时，操纵和照明共享光学元件，但这是彼此独立地完成的，并且彼此不相互影响。特别地，用于操纵的光不会被成形为光片。

[0021] 在易于实现的实施例中，用于操纵的装置包括用于将光强度以时间顺序的方式施加在样品的各个单独的大致点状区域上的点扫描器，或者用于将光强度以时间顺序的方式施加在样品的多个大致点状区域上的多点扫描器，其中相应数量的所述区域能够同时被施加有光强度。多点扫描器的构造类似于点扫描器；例如，微透镜阵列可以用于多点生成。

[0022] 使用第一空间光调制器，指定的强度分布也可以被施加在样品上，这基本上以恒定的幅值实现。为了还将指定的幅值分布压印到指定的强度分布上，用于操纵的装置可以包括第二空间光调制器。

[0023] 在另一种配置中，用于操纵的装置包括数字微镜阵列(DMD)，所述数字微镜阵列用于在一平面中产生指定的强度分布，所述平面优选地平行于所述光片平面，特别优选地位于所述光片平面中。在取向平行于光片平面的情况下，通过检测物镜或单独的操纵物镜方便地实现所述操纵。

[0024] 上述用于操纵的装置可以在特别优选的配置中被组合以增加操纵速度，这是因为DMD可以比空间光调制器更快地被切换。在优选的配置中，光片显微镜因此还包括切换装置，优选地包括用于在第一空间光调制器、数字微镜阵列或两者的组合之间切换的切换镜。除了第一空间光调制器之外，还可以使用第二空间光调制器。以这种方式，例如，空间光调制器可以用于利用相应的相位图案来限定多个空间区域，所述多个空间区域然后可以通过DMD单独快速地被接通和断开。

[0025] 如果操纵物镜与检测物镜相同，则第一或第二空间光调制器可以以特别优选的配置使用，以用于操纵样品和校正像差。为此，空间光调制器中的一个空间光调制器的第一区域被实施为用于将指定的强度或幅值分布施加在样品上并且作为校正元件，并且空间光调制器的第二区域仅被实施为检测光路中的校正元件。这可以通过适当控制SLM来实现。这里设置偏转装置，所述偏转装置将待检测光偏转到第二区域上并将用于操纵的光偏转到第一区域上。如果操纵通过照明物镜实现，即，如果照明物镜与操纵物镜相同，则这也可以利用照明物镜等效地实现，或者如果需要也通过操纵物镜实现。

[0026] 以这种方式，可以降低成本，这是因为不需要为检测光路或照明光路提供单独的校正元件。附加地或替代地，当然也可以使用现有技术中已知的校正元件，例如所谓的Alvarez板，其中所述Alvarez板是两个可移位的大致板式元件，其中校正像差的相应的表面结构被压印在所述板式元件上，并且所述板式元件可以相对于彼此横向移位。表面结构可以是自由表面，这些板具有波前调制器的功能。举例来说，在DE 10 2014 104 977 A1中描述了这种校正元件。校正元件可以附加地或替代地也可以被配置为光学传递系统(所谓的虚拟继电器)，例如在DE 10 2013 112 600 A1中所描述的。所述校正元件的尺寸可以被形成为使得该校正元件既可以用于照明物镜又可以用于检测物镜，并且可以放置在这些物镜与分离层系统之间。同样可单独使用或与已经提到的所述元件组合使用的另外的校正元件包括可变形镜或如已经提到的空间光调制器。

[0027] 偏转装置优选地包括具有有源光学表面的二向色元件，所述有源光学表面相对于彼此平行布置并且优选地垂直于空间光调制器的有源光学表面，其中光路被引导以使得用于操纵的和待被检测的光在每种情况下被引导到二向色元件上两次，并且通过二向色元件的厚度实现在相应区域上的偏转。在这种情况下，二向色元件不一定必须如所描述的那样垂直布置，但是如果二向色元件相应地倾斜，则该二向色元件可能需要更厚。

[0028] 具有被分成被不同地照射的两个区域的SLM的配置可以类似地转移到照明光路，其中这里一个区域用于光片生成，而另一个区域用于操纵照明。另外，SLM在两个区域中也可以承担校正元件的功能。

[0029] 特别有利的是，操纵光的光源、波长和强度被设计以用于激发两个或更多个光子跃迁，因此可以在局部非常高度空间受限的区域中实现特别是样品保存操纵。为了沿着操纵光路(即例如检测物镜)的轴线轴向定位用于操纵的光的强度，优选地设置时间聚焦机构，所述时间聚焦机构优选地包括具有用于控制群速度色散的控制器的飞秒脉冲激光器。

[0030] 不言而喻，在不背离本发明的范围的情况下，上述特征和下面还要说明的特征不仅可以以指定的组合使用，而且可以以其他组合或单独使用。附图说明

[0031] 下面例如基于附图更详细地说明本发明，附图还公开了对本发明必不可少的特征。在图中：

[0032] 图1显示了样品保存光片显微镜的总体设置；

[0033] 图2显示了通过检测物镜进行操纵的第一种配置；

[0034] 图3a)和图3b)显示了通过检测物镜进行操纵的另外两种配置；

[0035] 图4示出了通过检测物镜进行操纵的第四种配置；

[0036] 图5示出了通过检测物镜进行操纵的第五种配置，

[0037] 图6a)-图6c)显示了通过单独的操纵物镜进行的操纵的配置；

[0038] 图7a)和图7b)显示了通过照明物镜进行操纵的两种可能情况；

[0039] 图8示出了通过照明物镜进行操纵的光片显微镜的第一种配置；

[0040] 图9示出了通过照明物镜进行操纵的第二种配置；

[0041] 图10示出了通过照明物镜进行操纵的第三种配置；

[0042] 图11显示了使用光片的时间聚焦；

[0043] 图12显示了从两个方向操纵的原理图；

[0044] 图13示出了用于多光子操纵的布置；以及

[0045] 图14显示了用于操纵和成像的过程。

[0046] 附图标记列表

[0047] 1样品

[0048] 2样品载体

[0049] 3平坦参考面

[0050] 4,5光轴

[0051] 6,7波前操纵装置

[0052] 8光传输系统

[0053] 9操纵光束

[0054] 10样品台控制器

[0055] 11照明激光器

[0056] 12光束整形单元

[0057] 13光片扫描器

[0058] 14管透镜

[0059] 15二向色分束器

[0060] 16管透镜

[0061] 17相机

[0062] 18激励激光器

[0063] 19激励扫描器

[0064] 20镜子

[0065] 21激光器

[0066] 22管透镜

[0067] 23第一空间光调制器(SLM)

[0068] 24透镜

[0069] 25望远镜

[0070] 26偏振元件

[0071] 27数字微镜阵列(DMD)

[0072] 28,28a光源

[0073] 29第一区域

[0074] 30第二区域

[0075] 31二向色元件

[0076] 32,33平面镜

[0077] 34,35透镜

[0078] 36光源切换镜

[0079] 37透镜

[0080] 38切换镜

[0081] 38a合束器

[0082] 39样品体积

[0083] 40二向色分束器

[0084] 41空间光调制器

[0085] 42操纵区域

[0086] 43光片生成区域

[0087] 44二向色合束器

[0088] 45,46二向色分束器

[0089] 47又一个二向色分束器

[0090] 48中间图像平面

[0091] 49光瞳平面

[0092] 50第一光学单元

[0093] 51第二光学单元

[0094] 52扫描透镜

[0095] 53二向色合束器

[0096] 54光纤

[0097] 55焦点

[0098] 56飞秒激光器

[0099] 57透镜

[0100] 58衍射光栅

[0101] 59 4f装置

[0102] 60,61透镜

[0103] 62相位元件

[0104] O1照明物镜

[0105] O2检测物镜

[0106] O3操纵物镜

具体实施方式

[0107] 首先，图1显示了可以用于具有同时操纵的样品保存光片显微镜的大体设置。样品1被布置在样品载体2上。使用光片显微镜的检查在此以反向配置进行；照明物镜O1和检测物镜O2布置在样品载体2下方，样品载体2是分离层系统的一部分。样品载体2平行于平坦参考表面3，该平坦参考表面3可以例如对应于样品载体2的底侧。样品1可以被嵌入在介质中，所述介质在这里未单独示出。使用照明物镜O1，样品1通过光片经由照明光路被照射，其中所述光片具有光片平面，这里所述光片平面对应于照明物镜O1的光轴4，所述光轴4与参考平面的法线一起形成不为零的照明角度。检测物镜O2是具有检测光路的检测光学单元的一部分，所述检测光学单元具有光轴5，该光轴5在样品载体2的区域中与参考表面3的法线一起形成不为零的检测角度。光轴5在这里对应于检测物镜O2的光轴。为了校正或减少由于待检测的光或用于通过分离层系统的界面照射样品1的光倾斜通过而发生的像差，光片显微镜包括至少一个校正元件，在当前情况下包括多个校正元件，其中所述分离层系统包括样品载体2和位于该样品载体2下方的空气层。首先，照明物镜O1包括具有波前操纵器6形式的校正元件，而检测物镜O2包括具有另一个波前操纵器7形式的校正元件；波前操纵器6和7由具有自由表面的板形成，所述板可相对于光轴4和5相对于彼此横向移位；这些板也称为Alvarez板。此外，具有虚拟继电器(relay)形式的另一个校正元件(即，物镜O1和O2共用的光学传输系统8)被布置在物镜与样品载体2的底侧之间。举例来说，出于说明的目的，这里使用单独的操纵物镜O3以用于进行操纵。使用该物镜-或者使用另外两个物镜-可以优选地仅获得与光片产生无关的用于经由至少一个操纵光路将光强度施加在样品上的装置，优选地仅在光片的大致点状区域中或者在至少暂时包括光片平面的指定空间中进行施加。在图
1中在右侧，在由虚线框表示的部分中，示出了两个操纵光线9，所述操纵光线9的端部位于光片中并因此位于检测物镜O2的焦平面中，并且指定强度被射在所述操纵光线上。

[0108] 下面将参考各种示例性实施例更详细地说明用于将光强度施加在样品1上的装置。

[0109] 图2示出了光片显微镜的一个实施例，其中通过检测物镜O2进行操纵，也就是说，操纵物镜与检测物镜O2相同。具有样品载体2的样品台在此设有样品台控制器10以用于在所有三个空间方向上空间定位样品1。通过用于光片显微镜的典型装置进行照射。照明激光器11发射具有照射波长的光。在光束成形单元12中，光束被成形，并被引导到光片扫描器13，该光片扫描器13用于准静态光片生成和光片的定位。通过管透镜14和物镜O1，光片被成像到样品1中。光束成形单元12用于例如根据高斯分布或贝塞尔光束在光束上压印期望的强度分布，然后所述光束通过扫描也被压印在横截面垂直于光片平面的光片上。

[0110] 待检测的光穿过检测物镜O2，穿过二向色分束器15，并经由管透镜16被成像到区域扫描检测器，该区域扫描检测器例如是相机17的一部分。检测到的信号随后被进一步处理和/或呈现。

[0111] 为了操纵，使用激励激光器18，其中所述激励激光器18的光被引导到激励扫描器19，所述激励扫描器19在此具有点扫描器的形式，所述激励扫描器与具有镜子20形式的偏转元件互连，这仅仅用于保持装置的结构紧凑。通过又一个透镜21和对应于透镜16的管透镜22，操纵光经由二向色分束器15耦合到检测光路中。

[0112] 在图2所示的光片显微镜的实施例的情况下，实现样品的点状操纵，其中焦点可以被设置到光片平面，或被设置到光片平面上方和下方的区域中，使得可以进行有效地空间操纵，但原则上只能连续地用于各个单独的点。为了将该焦点位移到光片平面之外的区域，可以将另一个可调节光学单元(例如，准直器)插入到激励激光器18与激励扫描器19之间的光路中，以使得操纵焦点可以独立于检测焦点被调节。利用激励激光器18和操纵光学单元的相应配置，图2中所示的实施例还可以用于多光子激发。通过在激励激光器18与激励扫描器19之间引入一个或多个另外的光学元件(例如，微透镜阵列)，其中激光束在微透镜阵列之前被扩束并且在之后被再次准直，结合图2使用的点扫描器可以被转换成多点扫描器。这里没有示出。

[0113] 图3在图a)和b)中示出了光片显微镜的另外两个实施例，其中通过检测物镜实现操纵。图3b)中所示的模块可以交换为图3a)中所示的模块；两者都在相同位置处耦合到光路中，其特征在于二向色分束器15。在这里，结构不一定必须是模块化的。相反，可以生成两个独立的光片显微镜，所述光片显微镜不能彼此合并。虽然在图2所示的布置中，在点扫描器的情况下，样品的大致点状区域在时间上依次被施加有光强度，或者在多点扫描器的情况下，多个这样的点状区域在时间上依次被施加有光强度，其中在所述点状区域中的一些被同时施加有光强度的每种情况下，图3a)、图3b)中所示的布置使得可以在样品中对强度模式进行空间生成，也就是说，图3a)、图3b)中所示的布置可以将光强度同时施加在多个大致点状区域上，其中每个点都可以独立于其他点而被照射，并且这些点不仅可以分布在平面中，而且也可以在空间上分布在一空间中。

[0114] 在图3a)所示的实施例中，用于操纵的装置包括第一空间光调制器23，用于使指定的强度分布照射在样品上。所使用的光源再次是激励激光器18。由于使用空间光调制器23改变光的相位，因此空间光调制器(SLM)23必须布置在光瞳平面中；因此，需要宽透镜24进行成像。此外，该装置还包括望远镜25，利用该望远镜可以调整光瞳或SLM 23的照明。为了适应偏振，可选地，可以在光路中布置偏振元件26，例如偏振器或半波板。在图3b)的情况下，代替SLM 23，使用数字微镜阵列(DMD)27，在这种情况下可以省去透镜24，这是因为强度被直接操纵，且为此目的，DMD 27被布置在操纵光路的中间图像平面中。在这种情况下使用的光源也可以是激励激光器18，尽管原则上也可以使用非相干光源28，例如典型的灯-特别是在UV范围内，或LED。DMD 27用于产生强度图案，即在一平面中的指定强度分布，优选地是平行于光片平面或在光片平面中的平面。

[0115] 除了图3a)之外，用于操纵的装置可以包括第二空间光调制器(这里未示出)，用于在指定的强度分布上赋予指定的幅值分布。

[0116] 图4示出了用于光片显微镜的另一种配置，其中通过检测光路实现操纵。在该实施例中，空间光调制器23包括第一区域29和第二区域30，第一区域29被实施用于将指定强度或幅值分布照射在样品上并作为校正元件，第二区域30被实施为在检测光路中的校正元件。在此设置用于将待检测的光偏转到第二区域30上和将用于操纵的光偏转到第一区域29上的偏转装置。在这种情况下，可以省去检测物镜O2中的波前操纵器7。在这种情况下，专用于校正由光倾斜穿过分离层系统与样品载体2的光线引起的像差的相位图案在第二区域30中被压印在SLM 23上；用于操纵的光没有入射在所述第二区域30上，而是偏转经过所述第二区域30。将要施加在样品中的空间强度分布的相位图案被压印在SLM 29的第一区域29上，并且另外与用于校正倾斜光通过的相位图案一样。在图4中示出了光束行进。待检测的光以虚线示出，激励激光器18的操纵光用实线示出。这里的偏转装置包括二向色元件31，所述二向色元件31的有源光学表面相对于彼此平行，优选地垂直于空间光调制器23的有源光学表面设置。两个平面镜32,33用于引导光路，以使得用于操纵的和待检测的光在每种情况下被两次引导到二向色元件31上，其中所述两个平面镜32,33的镜面同样平行于二向色元件31的有源光学表面设置。使用二向色元件31，可实现到第一区域29上和到第二区域30上的偏转，其中所述二向色元件的厚度根据SLM上的部分光路的必要光束偏移被确定，其中光束偏移本身取决于SLM的有效表面的尺寸。另外，另两个透镜34和35位于检测光路中，其产生4f成像，以使得产生用于容纳额外的部件(即，偏转装置)的空间。

[0117] 在图5中示出了光片显微镜的特别优选的配置，其中通过检测光学单元实现操纵。这里的操纵装置包括具有激励激光器18的SLM 23和具有两个光源28,28a的DMD 27，其中所述两个光源28,28a可以任选地通过光源切换镜36耦合到用于照射DMD 27的光路中。在DMD光路的情况下，伸缩系统25仅由透镜表征，所述透镜旨在表征聚光器。在DMD 27与管透镜22之间布置另一透镜37，该另一透镜37将DMD 27成像为中间像平面，所述中间像平面位于透镜37与管透镜22之间。在根据图5的实施例中，光片显微镜还包括切换装置，特别是切换镜
38，所述切换装置通过光路中的相应调节/旋转用作中心元件以用于选择操纵装置：仅DMD
27或仅SLM 23作为操纵装置被连接，或DMD 27和SLM 23组合。特别是在DMD 27和SLM 23组合的配置中，其中SLM 23和DMD 27使用合束器38a同时耦合到光路中，是否可以增加操纵速度，因为频率约为1kHz的DMD比有效的LCoS SLM更快，所述LCoS SLM可以以大约60Hz的频率被切换。使用相应的相位图案，SLM 23则可以将例如多个空间定界区域定义为ROI(感兴趣区域)，所述ROI然后可以通过DMD 27快速且单独地被接通和断开。

[0118] 另一种可能性(未示出)还包括通过SLM或DMD或多个SLM和DMD产生所需图案，以及使用扫描系统在图案之间进行快速切换。

[0119] 在图5所示的示例中，光源切换镜36用于选择两个光源中的一个，DMD 27在此可以通过所述光源被照射。如果意图仅在两个光源之间进行选择，例如激光器和传统灯，则在使用DMD 27以产生强度分布的情况下，如果光源和DMD 27相对于彼此定位在指定位置，则可以省去这种光源切换镜36：DMD 27具有微镜阵列，所述微镜阵列在两个固定角度之间切换，例如在第一状态“接通”的-12°的角度与第二状态“断开”的+12°的角度之间切换，所述角度在每种情况下从上面布置有微镜的DMD 27的基区的法线测量。如果光源或其光束转向被布置成使得DMD 27在处于“接通”状态下被一个光源照射，而在处于“断开”状态下被另一个光源照射，并且又一个操纵光路最初沿着DMD 27的基区的法线方向，则光源切换镜36不是必需的。然而，与一个或多个光源切换镜的组合可以增加可能的光源的选择，如图5中所示的变形例的情况。

[0120] 操纵装置还可以包括专用操纵物镜，所述专用操纵物镜则设置在样品上方，即，设置在样品载体2的另一侧上。在图6a)-6c)中的原理图中示出了这样的示例。操纵物镜O3在这里被设置成该操纵物镜的光轴平行于参考表面3的法线。但是，这不是强制性的；操纵物镜O3可以相对于所述法线以任何所需的角度被设置，特别是所述操纵物镜可以被定向成使得所述操纵物镜的光轴平行于照明物镜O1的光轴4或检测物镜O2的光轴5，其中操纵物镜O3的光轴也可以与照明物镜O1或检测物镜O2的两个光轴中的一个重合。图6a)示出了专用操纵物镜O3与具有类似于图2的点扫描器一起使用，并且关于其中所示的配置所作的陈述可以大致转移到该配置。类似地，图6b)中所示的具有SLM 23的实施例对应于图3a)中的实施例，并且图6c)中所示的具有DMD 27的实施例对应于图3b)。在此，也可以类似于结合图5描述的用于检测物镜的组合的多个操纵可能性组合。除非使用被盖玻片封闭的样品容器并且操纵物镜相对于参考表面的法线以不等于零的角度定向，否则在上述操纵的情况下可以省去校正元件。

[0121] 对于操纵，原则上必须区分两种情况，这将在下面基于上述操纵通过专用操纵物镜O3来描述，但同样适用于通过检测物镜或照明物镜进行的操纵。在体积的快速成像的情况下，其中操纵强度施加在大致点状区域上，通过光片系统，可以通过体积来限定操纵和成像的顺序。在这种情况下，还可以在所述体积成像的时间尺度上观察由操纵装置产生的光分布在样品体积中的影响。然后可以在光片平面和体积区域中类似于结合通过检测物镜O2的操纵所述的操纵来执行操纵。然而，如果观察到操纵照射的影响的时间尺度太短以至于必须在相机帧内(即，在通过照明物镜O1产生并由检测物镜O2检测到的光片内)直接观察操纵，必须确保通过操纵物镜O3压印在样品上的强度分布位于光片平面中，如图6a)中的虚线框所示。在图6a)的情况下，这可以通过点扫描器的快速聚焦来实现，例如通过操纵物镜O3的内部聚焦，通过管镜22的位移，通过使用可快速变形的透镜(例如，Optotune的镜头EL-10-30)，或通过自适应光学元件(例如，可变形镜)。在SLM的情况下，可以指定位于光片平面中的相应空间强度分布。

[0122] 操纵也可以通过照明物镜O1实现，其中照明物镜的数值孔径通常低于检测物镜O2的数值孔径。然而，一些方法(例如，FRAP(光漂白后的荧光恢复))不需要更大的NA，并且可以使用照明物镜O1用于操纵。正如在使用专用操纵物镜O3进行操纵的情况下，必须再次区分两种情况。在第一种情况下，通过光片系统进行的体积成像是如此之快以至于可以通过体积来限定操纵和成像的顺序。还可以在所述体积的成像的时间尺度上观察由操纵装置在样品体积中产生的光分布的影响。这种情况在图7a)中被示出。在选定的样品体积39中，在指定的时间点，光强度施加在样品的空间分布的大致点状区域上，例如，使用逆傅里叶变换算法被转换成压印在空间光调制器上的相位图案的指定的强度分布。这可以例如使用如结合图8所述的光片显微镜来实现。

[0123] 在第二种情况下，观察操纵辐射的影响的时间尺度是如此之短，以至于必须在相机帧内(即，在通过照明物镜O1产生并通过检测物镜O2检测的光片内)观察该时间尺度。这在图7b)中被示出，其中点状区域可以被看作光片的线，同时在图7a)中，所述点状区域以十字形的形式被分布在空间中。

[0124] 如已经指出的，图8示出了光片显微镜，其中操纵物镜与照明物镜O1相同。除了相关的光生成和成像光学单元之外，这里的操纵装置还包括SLM 23。通过二向色分束器40实现耦合到照明光路中的输入。

[0125] 空间光调制器是昂贵且技术复杂的部件。由于这个原因，有利的是通过照明物镜O1进行操纵以使用同一个SLM来产生光片以及通过宽场全息方法指定强度分布。在优选配置中，如图9和图10所示，其中操纵物镜与照明物镜O1相同，照明光学单元包括空间光调制器41，用于使指定强度分布或幅值分布施加在样品上的相位图案被在操纵区域42上被压印到所述空间光调制器41上，并且形成光片的相位图案在光片生成区域43上被压印到所述空间光调制器41上。两个区域可彼此独立地驱动，即，即使使用相同的元件，光片也不会依赖于操纵而继续生成，这不是绝对必要的。类似于结合图4描述的布置，SLM 41可以再次用作校正元件，即，用于校正由于倾斜光通过而产生的像差的相应相位图案可以被另外地压印在所述SLM 41上。为了将用于操纵的光专门仅引导到操纵区域(42)以及将用于光片生成的光仅引导到光片生成区域(43)，照明光学单元包括相应的偏转装置，所述偏置装置也可以执行光谱分解，这是因为通常在每种情况下不同的波长用于光片生成和用于操纵。

[0126] 在图9和10中示出了其中SLM 41用于生成光片和强度分布的光片显微镜的两个示例。激励激光器18发射与照射激光器11不同的波长是先决条件，这是因为这用于光束分离。首先，两个光源的光通过二向色合束器44组合，随后通过图9中的二向色分束器45或图10中的二向色分束器46分开，其中在图9所示的配置中，类似于结合图4描述的布置，二向色分束器45的厚度用于偏转目的。用于照明的光被转向到光片生成区域43上，用于产生指定强度分布的激励激光器18的操纵光被转向到SLM 41的操纵区域42上。接下来，两个光束如图9所示被组合，或者如图10所示以平行方式被引导到另一个二向色分束器47上。在SLM 41的照射的情况下，激光束通过相应的透镜组合(未示出)被扩束，以使得所述激光束均匀地照射SLM 41上的相应区域。在进一步成像的情况下，SLM 41的包括用于光片成形的相位图案的区域(即，光片生成区域43)必须位于照明物镜O1的成像的中间像平面48中。另一方面，操纵区域42必须位于照明物镜O1的成像的光瞳平面49中。因此，SLM 41的两个区域必须被不同地实施，这可以通过另一个二向色分束器47来实现，该二向色分束器再次对用于操纵光和照明光的光路进行分束。通过使用第一光学单元50，操纵区域42被成像到照明物镜O1的光瞳平面49中。光片生成区域43仅通过第二光学单元51经由光片扫描器13和扫描透镜52被成像到照明物镜O1的中间像平面48中，其中通过所述第二光学单元51，操纵区域42也被成像。
再次使用二向色光束组合器53叠加两个波长。

[0127] 根据图9和图10的实施例基本上仅在颜色分离的方式上不同。图9示出了类似于图4的解决方案，其中光束总是重叠，但是在相对较厚的基板上需要二向色分束器45以便能够在空间光调制器41上获得足够的分离。激光器的不同波长例如可以通过公共光纤54被引导，其中也可以使用一个以上的光波长来进行操纵和/或光片生成。相反，图10示出了沿光路在不同路径上的不同波长的其他典型分离。

[0128] 还可以省去将操纵区域42成像到光瞳平面49中，即，还可以使用被成像到中间平面48中的SLM 41进行操纵。先决条件是操纵区域42与光片生成区域43在光谱上分离。另一种可能性是允许操纵依序快速地进行，在这种情况下，仅需要在指定的强度分布与用于光片生成的图案之间以时间同步的方式通过切换相应的激光波长来进行切换。然而，在这种方式中，样品中可产生的强度分布在数量上受到相当大的限制。

[0129] 原则上也可以使用SLM 41通过检测物镜O2进行操纵，其中所述SLM 41被分成两个区域：光片生成区域43和操纵区域42，然而，与通过照明物镜O1进行操纵的情况下相比较，光束引导稍微复杂一些。

[0130] 如在图2的通过检测物镜O2进行操纵的情况下或在图6a的情况下在通过专用操纵物镜O3进行操纵的情况下，操纵装置可以包括用于即使在照明物镜与操纵物镜相同的情况下也能够将光强度分布暂时顺序地施加在样品的单独的大致点状区域上的点扫描器。然而，这种点扫描器依序操作，并且在非常快速的光片成像的情况下，在曝光顺序内仅覆盖光片中的非常有限数量的位置，特别是因为强度分布的定位必须在轴向上进行，即，沿着照明物镜O1的光轴4并且因此通过重新聚焦来进行。因此有利的是，在检查样品的情况下，首先顺序地沉积操纵辐射，即，沿着光轴将强度分布依序沿光片沉积在指定点处，然后通过光片对样品1的大致平坦空间进行成像。由于光片扫描器13和激励扫描器19彼此独立地操作，因此在光片成像期间还可以在光片之前或之后以期望的时间和/或空间间隔执行操纵。

[0131] 特别地，在此有利的是，操纵光的光源、波长和强度被设计用于激发双光子和多光子跃迁；以这种方式，可以将样品上的相应强度的施加限制到相应焦点，这是因为在完全线性激发的情况下并在一些情况下点扫描器的高斯光束沿着照明物镜O1的光轴4交互地穿透样品1。

[0132] 当使用具有多光子激发的点扫描器时，也可以使用时间聚焦来实现沿着操纵轴线的轴向限制。这针对例如图11中的光片显微镜被显示。这里在光片中执行时间聚焦，所述时间聚焦通过扫描产生。通过在光学片中的扫描横向地实现被施加有操纵强度的位置的控制，其在图11中被从上面示出。使用SLM并且通过使用激励激光器18的群速度色散控制的时间聚焦来确定焦点沿着光片轴线的位置(即，沿着照明物镜O1的光轴4的位置)。以这种方式，可以例如将强度顺序地沉积在图11中从上面示出的光片中的三个焦点55处。

[0133] 当然，同样可以在不仅从一个方向而且从多个方向的区域中对样品施加强度，如图12所示，其中所有的三个物镜：操纵物镜O3、检测物镜O2和照明物镜O1用于将光强度施加在样品上。然后可以从不同方向使用不同的操纵方法和/或不同的波长。例如，可以使用DMD和第一波长通过检测物镜O2同时产生二维区域，并且可以使用SLM通过操纵物镜O3顺序地产生空间分布区域。DMD可以承担光片平面中的快速操纵；也可以通过具有例如在UV范围内的波长的非相干光源来实现，这些光源几乎不可用作激光源。SLM然后可以以其他波长依序操纵空间区域，其中所述SLM的相位图案作为强度分布由操纵物镜O3被压印在样品上。

[0134] 具有两个或更多个操纵物镜的光片装置还提供了相干叠加操纵辐射的可能性，即，所述辐射用于从两个或三个方向在基本上点状区域中对样品施加光强度。在这种情况下，如果例如检测物镜O2和操纵物镜O3具有共同的光轴可能是有利的，这是因为在这种情况下，相对的波前可以干扰光片平面中的强度分布的最小可能范围。操纵物镜O3可以为此例如浸入样品溶液(图12中未示出)中，其中样品位于样品溶液中。对于相干叠加，必须在用于检测物镜O2和操纵物镜O3的相应光路上划分共同使用的激励激光器18。

[0135] 如果使用不具有共同光轴的物镜对，则也可以使用泵浦-样品方法(pump-sample method)，例如CARS；泵浦辐射和样品辐射在这里可以被引导通过该装置的不同物镜。由于期望的相互作用仅发生在泵浦辐射和样品辐射的重叠区域中，因此可以实现对区域的额外限制。

[0136] 如已经提到的，可以使用多光子激发非常有利地设置对用于操纵的物镜的光轴方向上的强度分布的限制，特别是当使用点扫描器来将相应的光强度施加在样品上时，这是因为这里始终存在聚焦光束。在基于使用空间光调制器和/或DMD的宽视场中的显微镜方法中，取决于期望的操纵图案，存在比使用点扫描器时更少聚焦的光束，然而，还可以使用时间聚焦来限制在宽视场中沿传播方向的操纵和强度分布。以这种方式，在点扫描双光子显微镜的情况下，由于激发的二次强度依赖性与强聚焦结合而发生的深度辨别的效果也可以在宽场成像中实现。

[0137] 图13示出了相应的布置，其中多光子激发用于通过检测物镜O2进行操纵。这里使用飞秒短脉冲激光器56作为操纵光源。例如，可以使用钛蓝宝石激光器。使用望远镜25时，该望远镜的光束相应地被扩束，以尽可能完全地照射SLM23。将相应的空间相位图案压印在SLM 23上，以在样品中产生指定的强度分布。相位图案的第一傅立叶变换经由透镜57被成像到相应实施的衍射光栅58上。衍射光栅58位于检测光路中的中间像平面中，并通过管透镜22和检测物镜O2使用校正元件(这里是波前操纵器7)被成像到样品中。由于衍射光栅58处的脉冲的光谱分解，由于时间聚焦而发生照射的轴向限制，其被限于样品中期望的点状区域。

[0138] 代替单独的透镜57，SLM 23的相位图案也可以通过具有两个透镜60和61的4f装置59被成像到光栅上。该4f装置59的光瞳平面中的相位元件62导致将零级衍射的相位相对于衍射辐射移位π，反之亦然。以这种方式，在4f成像之后，相位图案被直接转换成衍射光栅58上的强度分布。

[0139] 在上述光片显微镜的情况下的成像通常可以以两种方式进行：

[0140] 在所谓的样品扫描中，照明物镜O1和检测物镜O2位置固定，并且光片经由光片扫描器13被定位在检测物镜O2的焦平面中。然后，样品通过样品台控制器10沿图1中虚线图像部分所示的方向被引导。

[0141] 在所谓的光片扫描中，样品1保持位置固定，但必须扫描光片以进行成像。为了确保光片不会移出焦点，必须调节检测物镜O2，并且同样调节照明物镜O1，以使得光片的光束腰保持在像场的中心处。可选地，也可以通过不同类型的聚焦(例如，内部聚焦等)来调节光束腰。

[0142] 图14显示了操纵和成像的不同时间和空间序列。图14a)示出了在光片平面中的同时的操纵和成像。用于操纵的光强度在这里在给定时间点t处被沉积在光片平面中，并且可以在该平面中立即观察其效果。在样品扫描的情况下和在光片扫描的情况下，使用平面操纵，例如利用DMD，通过检测物镜O2(即，例如使用如图3或图4所示的装置)，该过程可以被最佳地实现。

[0143] 图14b)显示了空间和时间的操纵和成像的序列。首先，指定的空间强度分布在观察的空间中被沉积在期望的大致点状区域(由十字形表示)，然后由该样品中的矩形框所示的观察空间被可以多次成像，以观察操纵效果的时间进展。该过程既可以在样品扫描的情况下使用，也可以在光片扫描的情况下使用，原则上所有先前提到的变形例允许空间操纵，这是因为顺序序列对操纵没有施加约束。

[0144] 在图14c)所示的混合过程中，操纵辐射在成像光片扫描期间被引入在光片中的期望时间点和/或期望位置处，在光片前面和/或光片后面。此外，还有可能在对体积进行成像的同时连续调整空间操纵体积，以便以这种方式补偿样品中非常快速的形状变化，或者为光片位置产生两个不同的空间以用于沉积操纵强度。

[0145] 利用上述用于光片显微镜的布置，可以在同时操纵的情况下对样品进行特别温和的观察。

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单平面照明显微镜

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