技术领域
[0001] 本
发明涉及一种显微镜，该显微镜具有保持器，其用于保持样品；物镜，其用于对由所述保持器保持的样品的至少一部分进行成像；检测模
块，其位于物镜的下游且具有用于记录样品的由物镜(5)成像的一部分的第一检测器；控制单元，其用于将物镜的焦点
位置设置在第一方向上，以用于通过检测模块进行记录；以及聚焦模块，其位于物镜的下游且用于维持物镜的设定焦点位置。
背景技术
[0002] 这样的显微镜是已知的，例如，从WO 2007/144197A1。聚焦模块可以包括控制单元，第二检测器和第一聚焦光学器件，并且可以切换到焦点保持模式，在该焦点保持模式中，经由第一聚焦光学器件和物镜将强度调制物体成像到样本中，并且通过第二检测器记录成像物体的图像，并且另外，控制单元基于第二检测器的记录，将物镜的焦点位置保持在设定焦点位置上。
[0003] 在这种显微镜的情况下，虽然可以深入地聚焦到样品中，但是在这种情况下，不再能够实现聚焦模块的焦点保持模式，因为成像物体的图像不再被入射在第二个检测器上。
发明内容
[0004] 从此出发，本发明的目的是开发一种在文章开头所述类型的显微镜，从而可以补救所描述的困难。
[0005] 根据本发明，在开始时提到的类型的显微镜的情况下，能够实现目的原因在于：第一聚焦光学器件具有可调节焦距。因此，可以通过在第一方向上调整第一聚焦光学器件本身的焦距来在第一方向上使得捕获范围移位，该捕获范围存在于第一聚焦光学器件的设定焦距的情况下，结果整体地存在更大的总捕获范围。在设定焦距被期望的情况下，，尤其是，通过捕获范围，可以通过第一聚焦光学器件保持位于捕获范围内的设定焦点位置，并且不能保持位于捕获范围之外的设定焦点位置。
[0006] 在根据本发明的显微镜的情况下，可以在第一方向上并且在与第一方向相反的方向上执行捕获范围的移位，以使得位于捕获范围之上或之下的设定焦点位置位于捕获范围中。与捕获范围不能移位的情况相比，可提供显著更高的捕获范围。
[0007] 在根据本发明的显微镜的情况下，聚焦模块可以形成为，使得其可切换到搜索模式，在该搜索模式中，如果不能利用第二检测器记录到成像物体的图像，那么在物镜的焦点位置被保持的情况下，改变第一聚焦光学器件的焦距，直到第二检测器记录到成像物体的图像。在这种情况下，聚焦模块然后可以被切换回焦点保持模式，结果可以执行设定焦点位置的所需保持。
[0008] 在根据本发明的显微镜的情况下，聚焦模块可以切换到焦点设定模式，在该焦点设定模式中，在第一步骤中，通过改变物镜与保持器之间的距离，使得成像物体的图像在第二检测器上的位置与对应于物镜的待被设定焦点位置的预
定位置相一致，并且其中在第一步骤之后的第二步骤中，聚焦模块被切换到焦点保持模式。因此，朝向焦点位置的定向移动是可能的。
[0009] 特别地，对于第一步骤，成像物体的焦点位置可以被设置为使得其位于比物镜的焦点位置更远的距离处，并且在第二步骤中，第一聚焦光学器件的焦距可以改变，使得成像物体的焦点位置与物镜的焦点位置重合。
[0010] 因此，在待被设定的焦点位置的设定中，可以可靠地防止物镜朝向样品移动，因为有效地为设定操作预定了较大的工作距离。然后在第二步骤中再次调整该工作距离，使得两个焦点位置重合。
[0011] 此外，在根据本发明的显微镜的情况下，聚焦模块可以切换到第一z堆叠模式，在该第一z堆叠模式中，在焦点保持模式打开的情况下，连续地设置第一聚焦光学器件的各个焦距，结果，物镜的焦点位置因此被设定到在第一方向上被分配给各个焦距的位置。然后可以在相应焦点位置执行所需的记录，结果总体来说可以获得z堆叠记录。
[0012] 此外，聚焦模块可以切换到第二z堆叠模式，在该第二z堆叠模式中，针对焦点保持模式连续预定各个设定点值，结果是由此设置物镜的对应焦点位置。在这种情况下，也可以在相应的焦点位置执行z堆叠的期望记录。
[0013] 此外，可以在第二z堆叠模式中改变第一聚焦光学器件的焦距，以便能够扫描较大的z堆叠范围。
[0014] 在根据本发明的显微镜的情况下，强度调制物体可以是特别是直列光栅。此外，强度调制物体可以通过例如借助于LCD模块的二维成像器产生。
[0015] 优选地，通过第二检测器执行成像物体的记录，使得由第二检测器记录的图像平面与设定焦点位置(或由检测模块记录的样本平面)相交。换句话说，检测器可以相对于物镜的光轴倾斜，因此呈现除90度以外的
角度。自然地，也可以实现所记录的图像和焦点位置的期望取向，因为强度调制物体被成像到样本中，使得强度调制物体的成像与焦平面相交。
[0016] 第二检测器尤其是区域检测器。特别地，利用第二检测器记录空间分辨强度
信号。该强度信号例如通过控制单元可以被转换成
对比度信号。特别地，光栅对比度信号的包络线可用于评估。在这种情况下，特别地，可以考虑包络线的最大值或质心。焦点保持模式的测量原理可以以与WO 2007/144197 A1中相同的方式实现。WO 2007/144197 A1的相应内容在此被包括在本
申请中。
[0017] 通过第二检测器对成像物体的记录优选通过物镜和第一聚焦光学器件进行。特别地，在这种情况下，整个瞳孔被用于记录成像物体。
[0018] 聚焦模块可以将强度调制物体，特别是无穷远成像，结果可以通过物镜将其成像到样本中。特别地，在强度调制物体的成像中，可以进行1：1的成像。
[0019] 在根据本发明的显微镜的情况下，由于设置了两个检测器，所以可以在保持设定焦点位置的同时进行图像的记录。
[0020] 聚焦模块的控制单元可以特别地执行第二检测器的读出。此外，控制单元可以评估第二检测器上的光栅包络线的位置，并将其用于焦点位置的z位置(在第一方向上)的位置校正。此外，为了进行焦点校正，控制单元可以控制物镜的z
驱动器。自然地，改变焦点的z-位置的任何其他方式也是可能的。此外，控制单元可以设置并调整第一聚焦光学器件的焦距。此外，控制单元可以评估
输入信号，以便选择聚焦模块的相应模式，然后实现相应的模式。
[0021] 在下文中，第一聚焦光学器件也称为第一管式光学器件。
[0022] 显微镜可以形成为宽
视野显微镜或激光扫描显微镜。此外，显微镜可以形成为反射光显微镜或
透射光显微镜。显微镜的其他类型的设计也是可能的。
[0023] 应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，不仅在所述的组合中，而且以其它组合或单独方式，可以使用上述特征和下面将要说明的特征。
附图说明
[0024] 以下参考附图以示例的方式更详细地解释本发明，附图还公开了本发明所必需的特征，其中：
[0025] 图1是根据本发明的显微镜1的第一
实施例的示意图；
[0026] 图2是图1的线式透射光栅17的示意性俯视图；
[0027] 图3是用于说明图1的检测模块6的光束路径和聚焦模块14的光束路径的放大示意图；
[0028] 图4是成像到样品中的光束透射光栅17的记录的光栅对比度的包络线M的示意图；
[0029] 图5是用于说明图1的检测模块6的光束路径和聚焦模块14的光束路径的放大示意图；
[0030] 图6是成像到样品中的光束透射光栅17的记录的光栅对比度的包络线M的示意图；
[0031] 图7是用于说明图1的检测模块6的光束路径和聚焦模块14的光束路径的放大示意图；
[0032] 图8-10根据图3用于说明朝向各个z位置的移动的示意图；
[0033] 图11是第二检测器23的示意图，以用于说明朝向各个z位置移动的替代可能性；
[0034] 图12是第二检测器23的示意图，以用于说明朝向各个z位置移动的替代可能性；以及
[0035] 图13至15是物镜5的透镜部分和第一管式光学器件19的透镜部分，以说明可调节焦距。
具体实施方式
[0036] 在如图1所示的实施例的情况下，根据本发明的显微镜1包括用于保持样品3的保持器2。这里，样品3是通过保持器2保持在培养皿4中的
水样品3。
[0037] 显微镜1还包括物镜5和检测模块6，所述检测模块6位于物镜5的下游且具有检测光学器件7和第一检测器8。物镜5和检测模块6具有共同的光轴OA1。
[0038] 显微镜1还具有照明模块9，其照明光或其照射
辐射经由第一分束器10耦合到检测光学器件7(其也可以称为管式光学器件7)和物镜5之间的光束路径中，使得样品3的期望照射通过物镜5实现。待成像的样品3或样品3的待成像的一部分例如直接位于培养皿4的基部11上或位于该培养皿4的基部11附近。照明模块9可以具有对应的
光源12和照明光学器件
13，以便能够实现所需的照明。
[0039] 通过物镜5和检测光学器件7，样品3的所需部分成像到检测器8上。浸渍介质(未示出)(诸如水，油或甘油)可以设置在物镜5和培养皿4的基部11之间。替代地，也可以省略浸渍介质。在这种情况下，在物镜5和培养皿4的基部11之间存在例如空气。样品3中的通过物镜5和检测光学器件7而明显地成像在检测器8上的平面在下文中也称为样品平面或视觉焦点位置。
[0040] 此外，根据本发明的显微镜1包括聚焦模块14，通过该聚焦模块可以维持检测模块6的预定焦点位置或设定视觉焦点位置，如以下详细描述的。
[0041] 聚焦模块14包括：LED 15，其发射
波长质心为850nm的辐射；照明光学器件16，其在LED 15的下游并且用于均匀地照射如图2的俯视图所示的线式透射光栅17，该线式透射光栅17位于照明光学器件16的下游。沿着这个顺序，位于线式透射光栅17下游的是分束器18(例如50％分束器)，具有可调节焦距的第一管式光学器件19，和光束组合器20，其中光束组合器20被布置在检测模块6和物镜5之间。第一管式光学器件19在下文中也被称为第一聚焦光学器件19。此外，聚焦模块14包括屏障滤光器21，第二管式光学器件22和第二检测器23。
[0042] 显微镜1还具有控制单元24，其连接到第二检测器23，第一管式光学器件19和物镜5的z-驱动器25。控制单元24可以是聚焦模块14的一部分。
[0043] 在操作期间，用户可以通过沿着光轴OA1(如双箭头P1示意性所示)移动物镜5来设置检测模块6的视觉焦点位置，并因此设置样品平面。例如，样品平面可以位于培养皿4的基部11和水样品3之间的边界表面26处。物镜5可以通过z-驱动器25或借助于另外的驱动器(未示出)来移动。
[0044] 为了在预定时间段内自动维持该设定样品平面，聚焦模块14(其在下文中也称为焦点保持件)如下文所述实现
稳定性。也可以说聚焦模块14被切换成焦点保持模式。通过LED 15和照明光学器件16尽可能均匀地被照射的线式透射光栅17经由分束器18和第一管式光学器件19被成像到无穷远，并且经由光束组合器20被耦合到检测光学器件7和物镜5之间的光束路径，结果是经由物镜5将直列光栅(ruled grating)成像在焦平面(以下也称为焦点保持平面)中。在边界表面26处发生直列光栅的图像的反射，结果反射的
光栅图像传输通过物镜5，并通过光束组合器20在第一管式光学器件19的方向上耦合出来，以及然后经由分束器18，屏障滤光器21和第二管式光学器件22入射在第二检测器23上。借助于屏障滤光器21(例如阻挡波长小于800nm的辐射并传播波长至少为800nm的辐射)，可以确保将反射的光栅图像成像到第二检测器23上，并且照明模块9的反射辐射没有入射在第二检测器23上。第二检测器23相对于聚焦模块14的光轴OA2是倾斜的(检测器23与光轴OA2形成90度以外的角度)，因此相对于检测模块6的光轴OA1也是倾斜的，结果是通过第二检测器23记录的光栅对比度在z方向上具有高斯分布，其中该分布的最大值对应于在边界表面26处的反射，并且在第二检测器23上的最大值的位置对应于焦平面(或焦点保持平面)在z方向上的位置。测量原理与WO 2007/144197 A1中相同，本发明也参考其测量内容或原理。
[0045] 在图3中以示意图示出了检测模块6的光束路径和聚焦模块14的光束路径被协调，使得样品平面与焦点保持平面重合。在成像光束路径被聚焦到边界表面26上的情况下(如果样品平面位于边界表面26中)，聚焦模块14的焦平面同样位于边界表面26中。由于光栅图像在边界表面26处的反射通过第二检测器23被检测到，所以边界表面26也称为聚焦模块14的参考平面。边界表面26的位置由图3中的z1表示，并且在图3中，检测模块6的光束路径由实线L1表示，并且聚焦模块14的光束路径由虚线L2表示。
[0046] 在图4中示出了，成像在第二检测器23上的光栅对比度的相应包络线M，其中沿图4中的x轴绘制z位置，沿图4中的Y轴上绘制第二检测器23上的光栅对比度。图4中的两个轴都被标准化为1，其中图4中的x轴的从0到1的范围是沿图1中z轴(因此沿着检测模块6的光轴OA1)的范围，其中样品平面可以位于该z轴或光轴OA1，并且在第二检测器23上仍然有可评估的对比度图像。
[0047] 如果样品平面移动到样品3(图1中向上)中，那么图4所示的包络线M例如向左移位。这样的运动对应于样品平面的位置在+z方向上的移位。如图5所示，样品平面然后可以位于z2处。样品平面的这种改变的位置可以是例如显微镜1的不期望的热漂移引起的。由于两个光束路径彼此协调，如上所述，所以由于在边界表面26处的反射，光栅图像现在被成像在样品平面的前面，这导致了包络线M在第二检测器23上向左移位，如图6所示。如果在根据图4的焦点状态的情况下，聚焦模块14切换到稳定模式，通过控制单元24评估包络线M的这种移位，控制单元24然后控制z-驱动器25，使得样本平面再次与边界表面26重合。因此，z驱动器25的控制实现为，使得包络线M再次处于根据图4的位置。因此，通过聚焦模块14，样品平面的位置一旦设定可以持续地被保持。自然地，也可以是如下的情况：在聚焦模块14关闭的情况下，用户有意地选择如图5所示的样品平面的位置，因为对于用户而言，这是样本3的感兴趣的部分所位于的位置。一旦他选择了该位置，用户就开启聚焦模块14，结果是该聚焦模块14将包络线M保持在图6所示的位置，由此将样品平面持续地保持在z2中。
[0048] 因此，在z方向上存在所谓的捕获范围，其包含可由聚焦模块14保持的在z方向上的所有可能的样品平面位置。
[0049] 如果从根据图5和图6的样品平面的位置开始，进一步地聚焦到样品3中，那么图6中的包络线M的最大值将进一步向左移动，并且从某一点开始将不再被成像到第二检测器23上。在这种情况下，由于其已经有效地离开了捕获范围，所以不能再保持设定焦点。
[0050] 然而，在根据本发明的显微镜1的情况下，第一管式光学器件19具有可变的焦距，结果是例如，在由用户选择的样本平面位置超过根据图6的位置的情况下，所述焦距被改变，使得包络线M的最大值再次位于根据图4的位置。光栅图像被有效地拉回参考平面或边界表面26，如图7所示。在这种情况下，在检测模块6和聚焦模块14的两个光束路径之间(或者在样品平面的位置与焦点保持平面的位置之间)之间存在偏移。然而，由于这种偏移，在聚焦模块14接通的情况下，能够保持根据图7的样品平面的设定焦点或设定位置。
[0051] 因此，可以通过根据本发明的显微镜1能够在z方向上为样品平面位置提供更大的捕获范围或更大的范围。
[0052] 第一管式光学器件19可以配备有
编码器(未示出)，通过该编码器可以设置焦距。如果例如所需的偏移是已知的(由于所需的聚焦(因此样品平面的位置)由操作者来预先设定)，控制单元24可以通过校准知识来设置第一管式光学器件19的焦距(参考平面的位置和样本平面的位置之间的依赖关系)，使得焦点保持信号或包络线M的质心位于第二检测器23上，并因此位于焦点保持件的捕获范围内。
[0053] 也可以形成显微镜1，使得其执行光栅成像的自主搜索。为此，将聚焦模块切换到搜索模式，其中在该搜索模式中，第一管式光学器件19的焦距在其调节范围内被横移，直到第二检测器23检测到光栅图像。如果控制单元24考虑到样品平面的先前的z位置，则经常可以确定是要在正z方向上(并且因此在图1中向上)或在负z方向上执行搜索。这导致更高的控制效率。
[0054] 根据本发明的显微镜还可以以焦点设定模式操作，使得检测模块6聚焦到预定的z位置上。如结合图3至图6所解释的，包络线M的最大值(或包络线M的质心)的每个位置对应于样本平面的z-位置。因此，可以通过经由z驱动器25将物镜5调整到期望值来设定包络线M的最大值(或包络线M的质心)的位置。在这个过程中，如果物镜5的工作距离相对较小则可能存在撞击培养皿4的
风险。为了避免这种情况，聚焦模块14的焦点位置(或焦点保持平面的位置)可以通过具有可变焦距的第一管式光学器件19被设置为比检测模块6的焦点位置并且因此比检测模块6的样品平面更加远离物镜5的前侧。
[0055] 因此，用于检测焦点保持光束路径的光学和机械工作距离增加，并且因此可以在明显更少地限制朝向培养皿4的距离的情况下，可以搜索焦点位置。当已经发现光栅信号时，可以设置到根据图4或图6的所需的焦点位置。然而，检测光学器件6的视觉焦点位置以及因此焦点位置尚未与焦点保持位置协调。通过焦点保持件的主动控制(或者如果聚焦模块14已经切换到稳定状态)，则具有可变焦距的第一管式光学器件19然后可以被移动到编码器值，该编码器值对应于焦点保持件的可比较成像状态。这意味着焦点保持件(或聚焦模块14)的焦点位置和视觉成像(或检测模块6)的焦点位置重叠。在焦点保持件14的控制被打开的情况下，z位置因此被自动地移动到视觉成像的焦点。
[0056] 具有可变焦距的第一管式光学器件19也可用于搜索视觉焦点位置。在焦点保持件14失去其在第二检测器23上的光栅信号(这可以发生，例如，如果焦点保持件14已经被关闭或者如果显微镜1由于热漂移而失去其焦点位置)的情况下，可以通过调整第一管式光学器件19的焦距而在视觉焦点位置周围改变光栅焦点位置的距离，而不移动z驱动器25。光栅可以在第二检测器23上的成像中被发现到。在相应的校准的情况下，可以基于第一管式光学器件19的编码器设置来推导物镜5的z行进路径，以便返回到视觉焦点位置。
[0057] 可以进一步控制显微镜1，使得z堆叠记录被执行，其中各个z位置的控制
精度非常高(聚焦模块14的第一z堆叠模式)。
[0058] 这是通过改变视觉成像的焦平面(以及因此样品平面)与焦点保持成像的焦平面(以及焦点保持平面)之间的距离来实现的。这可以由可变焦距的第一管式光学器件19实现。如果第一管式光学器件19上的调整值是已知的，为了实现z方向上的限定变化(并且因此改变限定的Δz)，在聚焦模块14的控制系统被激活的情况下，可以通过横移第一管式光学器件19的焦距来确定位置变化。如果第一管式光学器件19的编码器值用视觉成像的焦平面和焦点保持成像的焦平面之间的距离校准，则在第一管式光学器件19的焦距已经被预定义的情况下，可以朝向各个焦平面移动，并且在该控制中连续地保持焦点控制件，因为焦点保持件将光栅成像保持在参考平面中。该方法的准确性主要由第一管式光学器件19的焦距设置的精度来确定，该焦距被相应地设计。
[0059] 如图8所示，在z堆叠行程开始时(样品平面位于z1)，第一管式光学器件19的焦距(以及因此相应的编码器设置)位于焦点保持光束路径的焦点调整中和显微镜光束路径(或检测模块光束路径)的焦点调整中。
[0060] 然后设置第一管式光学器件19的焦距，使得在z方向上的期望距离(Δz)(其中在该期望距离Δz中，希望到达或移向下一个最高焦平面1(此处为z2))位于视觉成像的焦点和焦点保持成像的焦点之间(图9)。焦点保持件14的主动控制将立即作出反应并将光栅成像拉回到参考平面(图10)。结果，视觉成像(或样品平面)已经到达偏移Δz的第二平面z2。可以根据需要在具有可变焦距的第一管式光学器件19的控制范围内重复该过程，直到已经到达样品3的所有焦平面(此处为z3，z4和z5)。
[0061] 在第二检测器23上在第二检测器23上的光栅位置的对应距离内还可以限定用于z叠层的隔开的z-平面(例如等距z平面)的设定点位置，如在图11中示意性地示出(聚焦模块14的第二z堆叠模式)。在图11中，通过由相关联的样品平面位置z1至z9表示的垂直线来标识用于最大包络线M的对应位置。
[0062] 为了扫描各个z平面，聚焦模块14在位置z1，z2，z3...zn处连续地接收命令以保持样品平面的z位置。这里，n是大于1的整数，并且在所述实施例的情况下，n＝9。如果焦点保持件位于位置z1并且接收到将样本平面的z位置保持在z2的命令，那么朝这个位置移动是自动的。因此可以连续地移动到期望的z平面。
[0063] 使用该程序，可以仅移动到位于捕获范围内的z位置(此处为z1至z9)。如果需要通过较高的z-堆叠，则可以以限定的方式调整第一管式光学器件19的焦距，以便能够朝向下一个z平面移动(图12)。调整焦距的效果有效地对应于第二检测器23的加宽，因此在图12中表示为第二检测器23'(其对应于图11的设置)，以及第二检测器23，其具有样品平面位置的进一步z位置z9至z16。
[0064] 这里需要注意第一管式光学器件19的焦距的准确的横移路径，以便在下一个路径中存在期望的定位精度。如果该偏移被移动，则通过第一管式光学器件19的这种设置，可以注意到第二检测器23上的z的最后设定位置，并且在第一管式光学器件19的焦距的横移之后，可以注意到第二检测器23上的相同位置的新值。差异产生在新路径中必须考虑的偏移量。因此，可以以两倍的精度工作。该过程可以重复多次。
[0065] 该过程中的限制源自于第一管式光学器件19的焦距的最大横移路径以及通过聚焦模块14如何能够准确地向z位移动的限制。这取决于物镜5，结果是可以以取决于物镜的精度向z堆叠移动。
[0066] 也可以组合描述的聚焦模块14的操作类型或模式。
[0067] 在图13中示出了具有可变焦距的第一管式光学器件19的可能设计。第一管式光学器件19包括三个透镜L1，L2和L3，其中中间透镜L2可以相对于两个外透镜L1和L3移动，如图14和15所示。这改变了第一管式光学器件19的总焦距。透镜L2可以配备有包括位置编码器(未示出)的
电机驱动器，结果可以通过电机装置以定向方式来设置焦距。
