结合铜绿假单胞菌PCRV的单可变结构域抗体
阅读：321发布：2021-02-18
专利汇可以提供结合铜绿假单胞菌PCRV的单可变结构域抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供能够显著抑制和/或中和 铜 绿假单胞菌(P aeruginosa)的多肽。所述多肽包含两种以上针对铜绿假单胞菌的PcrV蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。，下面是结合铜绿假单胞菌PCRV的单可变结构域抗体专利的具体信息内容。
1.多肽，其包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成，其中至少一个“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对PcrV上的第一表位，和至少一个“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对不同于PcrV上的第一表位的PcrV上的第二表位。
2.根据权利要求1所述的多肽，其在使用MOI为12的P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中，能够以100％的功效和以5.0x10-10M或更低的IC50中和PcrV。
3.根据权利要求1或2任一项所述的多肽，对于其，在存在铜绿假单胞菌
(P.aeruginosa)弹性蛋白酶(3ug/ug多肽)的条件下，24小时后效力减少最大5倍(例如，
5倍、3倍、2倍或以下)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，对于其，在存在人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(1-2ug/ug多肽)条件下，24小时后的效力减少最大15倍(例如，10倍、5倍、3倍、2倍或以下)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)组成或由重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或者由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)组成,由"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH)组成。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域由部分或完全人源化的纳米抗体或部分或完全人源化的VHH组成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中，在至少一种所述免疫球蛋白单可变结构域中，所述CDR序列与具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种选自SEQ ID NOs:1-19。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多肽，其中两种免疫球蛋白单可变结构域都是权利要求9-13任一项中限定的免疫球蛋白单可变结构域。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述两种针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种属于不同的表位库。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域不交叉阻断所述第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合和/或其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合不被所述第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中：
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库
2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库
3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库
1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；或
-第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库
2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断。
18.根据权利要求16所述的多肽，其中：
-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求47-53中任一项的多肽[表位库1]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求40-46中任一项的多肽[表位库2]；
-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求47-53中任一项的多肽[表位库1]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求54-60中任一项的多肽[表位库3]；
-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求40-46中任一项的多肽[表位库2]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求47-53中任一项的多肽[表位库1]；
-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求40-46中任一项的多肽[表位库2]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求54-60中任一项的多肽[表位库3]；
-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求54-60中任一项的多肽[表位库3]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求47-53中任一项的多肽[表位库1]；或-第一免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求54-60中任一项的多肽[表位库3]；并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求40-46中任一项的多肽[表位库2]。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:124-141中的任一种。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域为SEQ ID NO:12。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中第二免疫球蛋白单可变结构域选自SEQ ID NOs:1和10中的任一种。
22.根据权利要求21所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:129和134中的任一种。
23.根据权利要求1-19中任一项所述的多肽，其中第二免疫球蛋白单可变结构域为SEQ ID NO:1。
24.根据权利要求23所述的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域选自SEQ ID NOs:3和12中的任一种。
25.根据权利要求24所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:129和137中的任一种。
26.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域属于相同的表位库。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合和/或其中第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
28.根据权利要求27所述的多肽，其中：
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；或
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库
3]中的至少一种交叉阻断。
29.根据权利要求27所述的多肽，其中：
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求47-53中任一项的多肽[表位库
1]；
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求40-46中任一项的多肽[表位库
2]；或
-第一和第二免疫球蛋白单可变结构域选自权利要求54-60中任一项的多肽[表位库
3]。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:118-123中的任一种。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的多肽，其中至少一种免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:3。
32.根据权利要求31所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:118,120和121中的任一种。
33.根据权利要求26-30中任一项所述的多肽，其中至少一种免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:1。
34.根据权利要求33所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:122和123中的任一种。
35.基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
37.根据权利要求35或36任一项所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
38.针对PcrV的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:1-19中的任一种。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的多肽，其属于表位库2。
41.根据权利要求40所述的多肽，其与全长PcrV(SEQ ID NO:159)结合并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(30-90％)或不结合。
42.根据权利要求40或41任一项所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
45.针对PcrV的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:1和2。
47.根据权利要求35-39中任一项所述的多肽，其属于表位库1。
48.根据权利要求47所述的多肽，其与全长PcrV(SEQ ID NO:159)结合并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(30-90％)或不结合。
49.根据权利要求47或48任一项所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
52.针对PcrV的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:3-10中的任一种。
54.根据权利要求35-39中任一项所述的多肽，其属于表位库3。
55.根据权利要求54所述的多肽，其与全长PcrV(SEQ ID NO:159)结合并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)的减少的结合(30-90％)或不结合。
56.根据权利要求54或55任一项所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
59.针对PcrV的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的多肽，其选自SEQ ID NOs:11和12中的任一种。
61.根据权利要求35-60中任一项所述的多肽，其基本上由选自轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)和重链可变结构域序列(例如，VH-序列)的免疫球蛋白单可变结构域组成。
62.根据权利要求35-61中任一项所述的多肽，其基本上由选自来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列和来源于重链抗体的重链可变结构域序列的免疫球蛋白单可变结构域组成。
63.根据权利要求35-62中任一项所述的多肽，其基本上由选自以下的免疫球蛋白单可变结构域组成：结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)，"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(包括但不限于VHH或人源化的VHH)。
64.根据权利要求35-63中任一项所述的多肽，其基本上由部分或完全人源化的纳米抗体组成，如由部分或完全人源化的VHH组成。
65.根据权利要求35-64中任一项所述的多肽在制备权利要求1-34中任一项所述的多肽中的应用。
66.根据权利要求35-64中任一项所述的多肽作为结合结构域或结合单元在制备权利要求1-34中任一项所述的多肽中的应用。
67.根据权利要求1-64中任一项所述的多肽，其还包含任选地通过一个或多个肽接头连接的一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元。
68.根据权利要求67所述的多肽，其中所述一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元选自由以下组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸，"dAb’s”，适合用作dAb的氨基酸，或纳米抗体。
69.根据权利要求67或68任一项所述的多肽，其与权利要求1-64中任一项所述的相应的多肽本身相比具有增加的半衰期。
70.根据权利要求69所述的多肽，其中，与权利要求1-64中任一项所述的相应的多肽本身相比，所述一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。
71.根据权利要求70所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元选自由以下组成的组：血清蛋白或其片段，能够结合血清蛋白的结合单元，Fc部分，以及能够结合血清蛋白的小蛋白或肽。
72.根据权利要求70或71任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。
73.根据权利要求70或71任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一种或多种其他结合单元选自由能够结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的结合单元组成的组。
74.根据权利要求73所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一种或多种其他结合单元选自由以下组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸，”dAb”’s，适合用作dAb的氨基酸，或能够结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的纳米抗体。
75.根据权利要求70-74中任一项所述的多肽，其具有的血清半衰期是权利要求1-64中任一项所述的相应的多肽本身的半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多于20倍。
76.根据权利要求70-75中任一项所述的多肽，与权利要求1-64中任一项所述的相应的多肽本身相比，其血清半衰期增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时。
77.根据权利要求70-76中任一项所述的多肽，其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。
78.编码权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽的核酸或核苷酸序列。
79.根据权利要求78所述的核酸或核苷酸序列，其为遗传构建体的形式。
80.根据权利要求78所述的核酸或核苷酸序列在制备编码权利要求1-34中任一项所述的多肽的遗传构建体中的应用，所述核酸或核苷酸序列编码权利要求35-64中任一项所述的多肽。
81.宿主或宿主细胞，其表达或者其在适当的情况下能够表达权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽；和/或其包含权利要求78所述的核酸或核苷酸序列或权利要求79所述的遗传构建体。
82.包含至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽或权利要求78和79中任一项所述的核酸或核苷酸序列的组合物。
83.根据权利要求82所述的组合物，其是药物组合物。
84.根据权利要求83所述的组合物，其是药物组合物，其还包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，并且其任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
85.根据权利要求84所述的组合物，其包含：至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽或权利要求78和79中任一项所述的核酸或核苷酸序列，以及适于肺部递送的载体。
86.适于肺部递送至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽或权利要求
78和79中任一项所述的核酸或核苷酸序列的药物装置，其包含至少一种权利要求1-64和
67-77中任一项所述的多肽，或权利要求78和79中任一项所述的核酸或核苷酸序列。
87.根据权利要求86所述的药物装置，其选自用于液体(例如，精细固体颗粒或液滴的混悬液)的吸入器，喷雾器，定量吸入器，气雾剂和干粉剂吸入器。
88.用于制备权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达系统中，表达权利要求
78所述的核酸或核苷酸序列或权利要求79所述的遗传构建体；
任选地接着：
b)分离和/或纯化这样获得的权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽。
89.用于制备权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在下述条件下培养和/或维持权利要求80所述的宿主或宿主细胞，所述条件是这样的，以使所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽；
任选地接着：
b)分离和/或纯化这样获得的权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽。
90.用于制备权利要求1-34中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括将两种以上权利要求35-64中任一项所述的多肽以及任选地一种或多种接头连接的步骤。
91.用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染的方法，所述方法包括：
向有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽，和/或权利要求83和84中任一项所述的组合物。
92.根据权利要求90所述的方法，其用于预防和/或治疗在以下的至少一种中的铜绿假单胞菌感染：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症，所述方法包括：向有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽，和/或权利要求83和84中任一项所述的组合物。
93.根据权利要求91所述的方法，其用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染，所述方法包括：向有此需要的受试者的肺部组织施用药物活性量的至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽，和/或权利要求83-85中任一项所述的组合物。
94.用于预防和/或治疗在以下的至少一种中的铜绿假单胞菌感染的方法：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症，所述方法包括：向有此需要的受试者的肺部组织施用药物活性量的至少一种权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽，和/或权利要求83-85中任一项所述的组合物。
95.权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽和/或权利要求83-85中任一项所述的组合物在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染；和/或用于权利要求91-94所述的方法中的一种或多种。
96.权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽和/或权利要求83和85中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗在以下的至少一种中的铜绿假单胞菌感染的药物组合物中的应用：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症。
97.根据权利要求1-64和67-77中任一项所述的多肽和/或根据权利要求83-85中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染。
98.根据权利要求1-67和67-77中任一项所述的多肽和/或根据权利要求83-85中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗以下的至少一种中的铜绿假单胞菌感染：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症。
结合铜绿假单胞菌PCRV的单可变结构域抗体
发明领域
[0001] 本发明涉及结合铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PcrV蛋白的多肽。更具体地，本发明涉及结合PcrV并且中和铜绿假单胞菌的多互补位多肽(在本发明中还称为“本发明的多互补位多肽”)。本发明还涉及用作制备本发明的多互补位多肽的结构单元的单价多肽(在本发明中还称为“本发明的单价多肽”)。
[0002] 本发明还涉及编码所述多肽的核酸(在本发明中还称为“本发明的核酸”)；涉及制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包括所述多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物；并且涉及多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防和/或治疗目的，如本发明所提及的预防和/或治疗目的的应用。
[0003] 本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述中变得清楚。
背景技术
[0004] 铜绿假单胞菌是一种与人类中的广谱感染相关的环境革兰氏阴性细菌。其具有代谢上非常灵活的非常庞大的基因组，这解释了为何其可以存在于非常多样化的环境中。这种机会性病原体能够通过III型分泌系统(TTSS)递送外毒素而引起急性肺损伤和死亡。
[0005] 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的III型分泌系统(TTSS)是穿过完整细胞壁的复杂的多蛋白结构。其是仅分泌TTSS蛋白和致病性相关的毒素的特化的中空针样分子结构。许多不同的蛋白形成TTSS，在细菌细胞质一侧和外部都形成。在外部，只有单一的‘桶状’同聚物形成蛋白和‘针尖’蛋白是抗体可及的。认为针状蛋白PcrV在针尖上形成环型结构。
TTSS复合物可以将由细菌产生的多种外毒素直接注射到宿主细胞的细胞质中。
TTSS复合物可以将由细菌产生的多种外毒素直接注射到宿主细胞的细胞质中。
[0006] 由于事实上表达TTSS而非毒素的突变体也是细胞毒性的，所以，该易位装置在发病机制中的参与可能不限于转运外毒素(Lee等.Infect.Immun.(传染病免疫学)73:1695-1705,2005)。易位孔本身足以引起宿主细胞死亡，其通过孔介导的膜渗透性增加直接引起，或通过激活广泛的细胞防御反应而间接引起。细菌外表面上的TTSS毒力机制允许铜绿假单胞菌通过杀死白血细胞和表皮细胞和引发组织损伤性炎症而避开人免疫防御。
[0007] 在正常情形下，细菌是完全无害的。然而，在特定情形下，细菌可以在免疫系统减弱的宿主中定殖。认为其是与免疫受损的和有免疫能力的患者中的侵入性装置、机械通气、烧伤或外科手术相关的医院菌血症(nosocomial bacteremia)和感染的主要原因(Giamarellou和Kanellakopoulou Crit.Care Clin.24:261-278,2008)，所述患者如骨髓移植患者(Velasco等.Clin.Microbiol.Infect.(临床微生物感染)10:542-549,2004)。铜绿假单胞菌典型地引起肺道、尿道、(烧伤)伤口的医院感染以及败血症(sepsis)。
[0008] 在囊性纤维化(Cystic Fibrosis，CF)患者中，铜绿假单胞菌感染按照在低龄儿童中充分建立的复发性肺部感染的模式，这在较大的CF患者中导致慢性感染的建立，在该情形中，其是导致呼吸衰竭的肺功能进展性减退和疾病恶化的主要促成因素(FitzSimmons J.Pediatr.122:1-9,1993；Kerem 等 .J.Pediatr.116:714-719,1990；Lyczak 等 .Clin.Microb.Rev.(临床微生物学综述)15:194-222,2002)。一旦建立慢性铜绿假单胞菌肺部感染，则利用现有治疗法根除该生物体似乎是不可能的(Lee Chronic Respiratory Disease(慢性呼吸道疾病)6:99-107,2009)。
[0009] 铜绿假单胞菌在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的建立中具有一些不同的表现。该生物体是这样的定殖菌落：其被快速清除，引起急性恶化，并且在患有COPD的成年人亚群中还可以引起慢性感染(Murphy Curr.Opin.Pulm.Med.(肺部医学现代观点)15:138-142,2009)。
[0010] Giamarellou和Kanellakopoulou(Crit.Care Clin.24:261-278,2008),Malcolm和Heim(Curr.Opin.Pharmacol.( 药 理 学 当 前 观 点)9:558-565,2009),El Solh 和Alhajhusain(J.Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)64:229-238,2009)以及 Roux和Ricard(Infectious Disorders–Drug Targets(传 染病 症–药 物 靶标)11:389-394,2011)给出了关于当前铜绿假单胞菌肺炎治疗的良好的综述。当前用于患者的治疗仍然依赖于抗生素。四种主要结构种类的抗生素用于针对铜绿假单胞菌感染(Giamarellou和Kanellakopoulou Crit.Care Clin.24:261-278,2008)。重要的是，一旦已经建立铜绿假单胞菌定殖群集，则由于生物膜形成的原因，使用抗生素不可能成功地将其清除。生物膜限制某些抗生素进入膜的较深层(扩散限制性)。更重要的是，生物膜的较深层包含许多铜绿假单胞菌细菌，所述铜绿假单胞菌细菌是活的，但是由于缺少营养物进入几乎完全没有活性。不同种类的抗生素作用于细胞分裂或高活性代谢途径，因此不能杀死这些休眠的细菌。一旦治疗倒退或停止，这些细胞就迅速地重新在患者中定殖。
[0011] 此外，铜绿假单胞菌具有逃避新抗微生物疗法并且发展抗性的能力，一方面针对多种药物是固有抗性的，另一方面通过多种机制快速获得抗性(Malcolm和Heim Curr.Opin.Pharmacol.(现代药理学观点)9:558-565,2009)。由于铜绿假单胞菌基因组的多样性和大的尺寸，所以可能同时存在多种抗性机制，引起针对一些抗假单胞菌药剂的交叉抗性(Giamarellou和Kanellakopoulou Crit.Care Clin.24:261-278,2008)。正在开发基于相同基本抗生素结构的新型变体，并且其可以在某种程度上减轻目前的抗性，但是当广泛临床应用时非常可能引起新的抗性。已知没有新种类的抗生素进行临床开发。由于新种类抗生素的开发远远落后于我们对此类药物的日益增长的需求，所以我们正面临着具有有限的抗击这些感染的能力的抗生素后时代(post-antibiotic era)。
[0012] 已有抗生素的局部给药(例如，妥布霉素(tobramycin)或多黏菌素E(colistin)的气雾剂给药)已经用于递送更高局部浓度的抗生素，而不需要使患者暴露于可能对所述患者有毒性的高系统水平(Luyt等.Curr.Opin.Infect.Dis.(现代传染病观点)22:154-158,2009)。然而，关于其功效以及潜在的抗性的出现引起持续的关注(El Solh和Alhajhusain J.Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)64:229-238,2009；Roux和 Ricard Infectious Disorders-Drug Targets( 传染 病症-药物靶标)11:389-394,2011)。
[0013] 随着新抗微生物药剂渠道的日渐干涸，铜绿假单胞菌的治疗持续依赖于组合疗法的理论优点和先前由于严重的毒性弃之不用的旧药(如多黏菌素(polymyxin))的再度使用(Giamarellou和Kanellakopoulou Crit.Care Clin.24:261-278,2008；El Solh和Alhajhusain J.Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)64:229-238,2009)。然而，随着非常令人烦恼的最新的抗性率和具有多药抗性或甚至泛抗性表型的假单胞菌菌属(Pseudomonas)菌株的出现，迅速出现了针对这样的治疗的抗性(Malcolm和Heim Curr.Opin.Pharmacol.(药理学现代观点)9:558-565,2009)。基于报道的抗性监视数据，明显的是，当前用于铜绿假单胞菌感染的治疗方法正日益接近其极限(Giamarellou和Kanellakopoulou Crit.Care Clin.24:261-278,2008)。
[0014] 目前市场上尚没有基于非抗生素的治疗。然而，有多种候选药正在开发中。
[0015] 已经描述了各种单克隆抗体，其主要针对铜绿假单胞菌鞭毛蛋白或菌株特异性的LPS。大部分没有进入临床阶段。一种LPS-反应性IgM(Kenta(Berna/Crucell)被列为处于活性II期研发过程中。然而，该抗体的血清型特异性强调了对于在医院设置中确定传染剂的血清型的快速测定和开发特异性针对其他临床相关的血清型的抗体的需求(Roux和Ricard Infectious Disorders-Drug Targets(传染病症-药物靶标)11:389-394,2011)。
[0016] Frank等.(J.Infect.Dis.(传染病杂志)186:64-73,2002)和Faure等(J.Immune based Therapies and Vaccines(基于免疫的治疗和疫苗杂志)1:2,2003)已经描述了在小鼠和大鼠假单胞菌菌属感染模型中具有有效的中和活性的小鼠单克隆抗-PcrV抗体，单克隆抗体(Mab)166。WO 2009/073631A2和Baer等.(Infection and Immunity(感染和免疫性)77:1083-1090)描述了一些改造的对铜绿假单胞菌PcrV蛋白特异性的人抗体Fab片段(其中有Fab1A8)，并且其与MAb166竞争结合PcrV上的相同表位。这些Fabs表现出有TM力的针对铜绿假单胞菌III型分泌系统的中和活性。KB001(KaloBios,US)是Humaneered抗-PcrV PEG化的抗体Fab’片段(Anti-PcrV Program Fact Sheet,KaloBios)，其在细胞的细胞毒性测定中显示出有力的III型分泌系统(TTSS)中和活性。正在开发KB001用于预防Pa通风器相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia，VAP)和用于治疗CF。初步的活性和安全性证据已在KaloBios进行的1/2期试验中在两种适应证中得到证实。然而，其仍然需要确定当施用给患者时针对这种单特异性单克隆抗体是否会发展逃逸突变体。
[0017] 综上所述，特定类型的感染中增加的发病率、医院中侵入性装置的增加的使用以及多抗性假单胞菌菌属菌株增加的频率已经明显地导致用于医院假单胞菌菌属感染的治疗选择的匮乏。尽管有上述尝试，但是铜绿假单胞菌感染的管理对于危重患者医疗医师来说代表着困难的治疗挑战(El Solh和Alhajhusain J.Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)64:229-238,2009)。对于具有多药抗性菌株的患者，存在非常少的临床选择。因此，认为发现并开发新型抗假单胞菌菌属的药物来填补临床医生的抗菌医疗设备的危险空缺是急需的(Malcolm和Heim Curr.Opin.Pharmacol.(现代药理学观点)9:558-565,2009)。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明提供与现有技术氨基酸序列和抗体相比，除具有其他有利特性(诸如例如，改善的制备容易性、良好的稳定性和/或减少的商品成本)外还具有改善的预防、治疗和/或药理学特性的多肽。更具体地，本发明提供包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域的多价多肽，与现有技术中所述的PcrV中和分子相比，其表现出改善的中和PcrV的特性。本发明人令人惊讶地观察到，与单价PcrV-结合结构单元单独的PcrV中和能力相比，包含两种不同的PcrV-结合免疫球蛋白单可变结构域的二互补位多肽表现出PcrV-中和功效的显著增加。对于这一目的，本发明另外还使得特异性结合PcrV和/或能够显著抑制或中和PcrV的多种高度有利的免疫球蛋白单可变结构域(即，单价多肽)成为可用的。这些PcrV-结合免疫球蛋白单可变结构域和包含其的多肽形成本发明的其他方面。
[0020] 因此，本发明提供包含两种以上特异性结合铜绿假单胞菌的PcrV蛋白(本文称为“PcrV”)的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上特异性结合铜绿假单胞菌的PcrV蛋白(本文称为“PcrV”)的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽。所述多肽在本文中还称为“本发明的多价多肽”。所述两种以上的免疫球蛋白单可变结构域可以任选地通过一种或多种肽接头连接。
[0021] 优选地，多肽多肽包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域，其中“第一”针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域和“第二”针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。所述多肽在本文中还称为“本发明的多互补位多肽”。因此，本发明涉及包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，其中“第一”针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域和“第二”针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。所述多肽包含两种以上针对PcrV上不同表位的免疫球蛋白单可变结构域或由两种以上针对PcrV上不同表位的免疫球蛋白单可变结构域组成。更具体地，所述多肽包含至少一种针对PcrV上第一表位的“第一”免疫球蛋白单可变结构域和至少一种针对不同于PcrV上第一表位的PcrV上第二表位的“第二”免疫球蛋白单可变结构域。优选地，本发明的这些多互补位多肽是二互补位的或三互补位的多肽(在本发明中还称为“本发明的二互补位多肽”和“本发明的三互补位多肽”)，如本文进一步所定义。
[0022] 与现有技术中所述的PcrV中和分子相比，本文所述的多互补位(如二互补位或三互补位)多肽表现出改善的中和PcrV的特性。本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽在细胞毒性测定中(诸如例如，在使用MOI为12的P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中)能够以100％的功效中和PcrV。除此之外和/或另外，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽在细胞毒性测定中(诸如例如，在使用MOI为12的P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中)能够以5.0x10-10M以下的IC50中和PcrV。除此之外和/或另外，在存在铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(3ug/ug多肽)时，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽在24小时后具有最大5倍(例如，5倍、3倍、2倍或以下)的效力减少。除此之外和/或另外，在存在人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(1-2ug/ug多肽)时，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽在24小时后具有最大15倍(例如，10倍、5倍、3倍、2倍或以下)的效力减少。
[0023] 本发明优选的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域组成，其中至少一种免疫球蛋白单可变结构域由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中(见表A-6)：
[0024] -CDR1选自由以下组成的组：
[0025] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0026] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0027] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0028] 和/或
[0029] -CDR2选自由以下组成的组：
[0030] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0031] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0032] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0033] 和/或
[0034] -CDR3选自由以下组成的组：
[0035] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0036] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0037] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0038] 更具体地，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域组成，其中至少一种免疫球蛋白单可变结构域由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0039] -CDR1选自由以下组成的组：
[0040] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0041] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0042] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0043] 和
[0044] -CDR2选自由以下组成的组：
[0045] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0046] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0047] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0048] 和
[0049] -CDR3选自由以下组成的组：
[0050] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0051] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0052] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0053] 本发明优选的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域组成，其中，在至少一种所述免疫球蛋白单可变结构域中，CDR序列与具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中至少一种的CDR序列(表A-4)具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
[0054] 在一个优选的方面中，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域组成，其中至少一种所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0055] 在一个优选的方面中，在本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽中存在的所述两种以上的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种如上文定义。本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽的实例是SEQ ID NOs118-151(表A-5)。
[0056] 在一个优选的方面中，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽的两种以上的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种(其针对PcrV)属于不同的表位库(epitope bin)。因此，本发明涉及包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，其中所述两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种属于不同的表位库。通过定义，属于不同表位库的免疫球蛋白单可变结构域彼此不交叉竞争与靶标PcrV的结合。因此，本发明涉及包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域不交叉阻断第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合，和/或其中第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合不被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
[0057] 在本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽中存在的免疫球蛋白单可变结构域的优选的组合可以包括下述的任一种：
[0058] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；
[0059] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；
[0060] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；
[0061] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；
[0062] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；或
[0063] -第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断；并且第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断。
[0064] 本发明优选的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽可以包含下述免疫球蛋白单可变结构域的组合中的一种或基本上由下述免疫球蛋白单可变结构域的组合中的一种组成：
[0065] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库1的多肽，并且选自下述任一种：
[0066] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0067] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0068] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0069] ○是SEQ ID NOs:3-10中的任一种的多肽；
[0070] 并且第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库2的多肽，并且选自下述任一种：
[0071] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0072] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0073] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0074] ○是SEQ ID NOs:1和2中的任一种的多肽；
[0075] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库1的多肽，并且选自下述任一种：
[0076] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0077] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0078] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0079] ○是SEQ ID NOs:3-10中的任一种的多肽；
[0080] 并且第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库3的多肽，并且选自下述任一种：
[0081] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0082] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0083] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0084] ○是SEQ ID NOs:11和12中的任一种的多肽；
[0085] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库2的多肽，并且选自下述任一种：
[0086] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0087] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0088] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0089] ○是SEQ ID NOs:1和2中的任一种的多肽；
[0090] 并且第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库1的多肽，并且选自下述任一种：
[0091] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0092] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0093] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其被与PcrV的结合具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0094] ○是SEQ ID NOs:3-10中的任一种的多肽；
[0095] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库2的多肽，并且选自下述任一种：
[0096] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0097] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0098] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0099] ○是SEQ ID NOs:1和2中的任一种的多肽；
[0100] 并且第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库3的多肽，并且选自下述任一种：
[0101] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0102] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0103] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0104] ○是SEQ ID NOs:11和12中的任一种的多肽；
[0105] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库3的多肽，并且选自下述任一种：
[0106] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0107] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0108] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0109] ○是SEQ ID NOs:11和12中的任一种的多肽；
[0110] 并且第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库1的多肽，并且选自下述任一种：
[0111] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0112] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0113] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0114] ○是SEQ ID NOs:3-10中的任一种的多肽；或者
[0115] -第一免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库3的多肽，并且选自下述任一种：
[0116] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0117] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0118] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0119] ○是SEQ ID NOs:11和12中的任一种的多肽；
[0120] 第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库2的多肽，并且选自下述任一种：
[0121] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0122] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0123] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0124] ○是SEQ ID NOs:1和2中的任一种的多肽。
[0125] 本发明优选的多肽选自SEQ ID NOs:124-141(表A-5)中的任一种。
[0126] 在一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域为SEQ ID NO:12。在另一个优选的方面中，本发明涉及一种多肽，其中第二免疫球蛋白单可变结构域选自SEQ ID NOs:1和10中的任一种。在另一个优选的方面中，本发明涉及选自SEQ ID NOs:129和134中任一种的多肽。在另一个优选的方面中，本发明涉及一种多肽，其中第二免疫球蛋白单可变结构域为SEQ ID NO:1。在另一个优选的方面中，本发明涉及一种多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域是选自SEQ ID NOs:3和12中的任一种。在另一个优选的方面中，本发明涉及选自SEQ ID NOs:129和137中的任一种的多肽。
[0127] 在另一方面中，本发明的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽的两种以上的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种(其针对PcrV)属于相同的表位库。因此，本发明还涉及包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，其中所述两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域中的每一种属于相同的表位库。通过定义，属于相同的表位库的免疫球蛋白单可变结构域彼此交叉竞争与靶标PcrV的结合。因此，本发明涉及包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，其中第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合，和/或其中第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
[0128] 在本发明所述的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽中存在的免疫球蛋白单可变结构域的优选的组合可以包括下述的任一种：
[0129] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域[表位库1]中的至少一种交叉阻断；
[0130] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-2的免疫球蛋白单可变结构域[表位库2]中的至少一种交叉阻断；或
[0131] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种与PcrV的结合和/或第一和第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11-12的免疫球蛋白单可变结构域[表位库3]中的至少一种交叉阻断。
[0132] 本发明所述的优选的多互补位(诸如二互补位或三互补位)多肽可以包含下述免疫球蛋白单可变结构域组合中的一种或基本上由下述免疫球蛋白单可变结构域组合中的一种组成：
[0133] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库1的多肽，并且选自下述任一种：
[0134] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0135] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0136] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0137] ○是SEQ ID NOs:3-10中的任一种的多肽；
[0138] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库2的多肽，并且选自下述任一种：
[0139] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0140] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0141] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0142] ○是SEQ ID NOs:1和2中的任一种的多肽；或者
[0143] -第一和第二免疫球蛋白单可变结构域是属于表位库3的多肽，并且选自下述任一种：
[0144] ○这样的多肽，所述多肽结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，并且表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的结合(与全长PcrV相比，30-90％)或没有结合；
[0145] ○这样的多肽，其中CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0146] ○这样的多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；和
[0147] ○是SEQ ID NOs:11和12中的任一种的多肽。
[0148] 在一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其选自SEQ IDNOs:118-123(表A-5)中的任一种。
[0149] 在另一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:3。在另一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其选自SEQ ID NOs:118,120和121中的任一种。在另一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:1。在另一个优选的方面中，本发明涉及上文定义的多肽，其选自SEQ ID NOs:122和123中的任一种。
[0150] 在本发明的多肽中存在的两种以上的免疫球蛋白单可变结构域可以由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)组成或由重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成。它们可以由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或者由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。它们可以由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)组成,由"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH)组成。在一个优选的方面中，所述两种以上的免疫球蛋白单可变结构域由部分或完全人源化的纳米抗体或部分或完全人源化的VHH组成。
[0151] 本发明的多价(如多互补位)多肽通常可以通过适当地连接(任选地通过适当的接头)或组合两种以上(单价)免疫球蛋白单可变结构域(或通过适当地连接或组合编码所述(单价)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列以提供编码所需要的多价构建体的核酸，然后适当地表达所述多价构建体)而提供(并且特别地，有目的地设计用于特定的生物学作用)。因此，清楚的是，本发明不仅使得本文所述的多价(优选多互补位)多肽成为可用的，而且通过使得本文所述的单价多肽成为可用的而为技术人员提供各种各样的不同的“结合结构域”或“结合单元”，所述“结合结构域”或“结合单元”可以用作“结构单元”，从而通过使用本文所述的适当的“结构单位”来提供各种各样的不同的多价(优选多互补位(具体地是二互补位和三互补位))多肽(其可以具有不同的结合亲和力、抗体亲抗原性、特异性、效力和/或功效)。
[0152] 从而，本发明的各种的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(和/或编码其的核苷酸序列和/或核酸)及其作为“结构单元”在制备多价和/或多互补位多肽(或编码其的核苷酸序列/核酸)中或用于制备其的应用形成本发明的重要方面。
[0153] 因此，在另一个方面中，本发明还涉及包含选自由以下组成的组的至少一种氨基酸残基片段(stretch)的多肽(在本文中也称为“本发明的单价多肽”)：
[0154] -CDR1序列：
[0155] a)SEQ ID NOs:20-37；
[0156] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0157] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段；
[0158] 和/或
[0159] -CDR2序列：
[0160] d)SEQ ID NOs:38-56；
[0161] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0162] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段；
[0163] 和/或
[0164] -CDR3序列：
[0165] g)SEQ ID NOs:57-75；
[0166] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0167] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段。
[0168] 包含上述指定的氨基酸残基片段中的一种或多种的单价多肽表现出改善的特性，诸如例如，改善的结合特征(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，k结合-速率和/或k解离-速率，或备选地为IC50值，如本文进一步所述)，改善的亲和性和/或改善的针对PcrV的抗体亲抗原性和/或改善的中和PcrV的功效和/或效力。
[0169] 例如，在使用平均MOI为2.8的P3X63细胞作为靶标的TTSS-依赖性细胞毒性测定中，本发明的单价多肽可以具有1nM-10000nM，5nM-1000nM，优选5nM-500nM，更优选5nM-200nM，如5nM-50nM或更小的IC50值。
[0170] 除此之外和/或另外，在所述TTSS-依赖性细胞毒性测定中，本发明的单价多肽可以具有50％以上、优选90％以上、如100％的功效(％抑制；参见实施例4.4)。
[0171] 在 一 个 优 选 的 方 面 中，本 发 明 的 单 价 多 肽 具 有 结 构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1,CDR2和CDR3如本文关于本发明的单价多肽所定义，并且FR1,FR2,FR3和FR4为构架序列。因此，本发明还涉及基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的单价多肽，其中：
[0172] -CDR1选自由以下组成的组：
[0173] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0174] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0175] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0176] 和/或
[0177] -CDR2选自由以下组成的组：
[0178] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0179] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0180] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0181] 和/或
[0182] -CDR3选自由以下组成的组：
[0183] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0184] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0185] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0186] 优选的单价多肽基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0187] -CDR1选自由以下组成的组：
[0188] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0189] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0190] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0191] 和
[0192] -CDR2选自由以下组成的组：
[0193] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0194] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0195] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0196] 和
[0197] -CDR3选自由以下组成的组：
[0198] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0199] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0200] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0201] 在本发明的优选的单价多肽中，所述CDR序列与具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性。
[0202] 本发明还涉及针对PcrV的单价多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0203] 本发明优选的多肽选自SEQ ID NOs:1-19中的任一种。
[0204] 本发明人还观察到属于特定的表位库的免疫球蛋白特别适用于结合PcrV，中和铜绿假单胞菌和/或作为制备多互补位(诸如例如二互补位或三互补位)多肽的结合单元。优选的免疫球蛋白属于表位库1、2或3(如本文进一步定义)。
[0205] 因此，在另一个方面中，本发明涉及属于表位库1的免疫球蛋白，并且其具有下述特征中的一种或多种：
[0206] ·其交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合；
[0207] ·其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；
[0208] ·其结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时表现出与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)结合；
[0209] ·其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0210] -CDR1选自由以下组成的组：
[0211] a)SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列；
[0212] b)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0213] c)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0214] 和
[0215] -CDR2选自由以下组成的组：
[0216] d)SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列；
[0217] e)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0218] f)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0219] 和
[0220] -CDR3选自由以下组成的组：
[0221] g)SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列；
[0222] h)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0223] i)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0224] ·其CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性；或者
[0225] ·其选自SEQ ID NOs:3-10中的任一种。
[0226] 在另一个方面中，本发明涉及属于表位库2的免疫球蛋白，并且其具有下述特征中的一种或多种：
[0227] ·其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合；
[0228] ·其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；
[0229] ·其结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时表现出与嵌合体7(SEQ ID NO:205)减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)结合；
[0230] ·其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0231] -CDR1选自由以下组成的组：
[0232] a)SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列；
[0233] b)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0234] c)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0235] 和
[0236] -CDR2选自由以下组成的组：
[0237] d)SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列；
[0238] e)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0239] f)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0240] 和
[0241] -CDR3选自由以下组成的组：
[0242] g)SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列；
[0243] h)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0244] i)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0245] ·其CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；或者
[0246] ·其选自SEQ ID NOs:1和2中的任一种。
[0247] 在另一个方面中，本发明涉及属于表位库3的免疫球蛋白，并且其具有下述特征中的一种或多种：
[0248] ·其交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合；
[0249] ·其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断；
[0250] ·其结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时表现出与嵌合体2(SEQ ID NO:200)减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)结合；
[0251] ·其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0252] -CDR1选自由以下组成的组：
[0253] a)SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列；
[0254] b)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0255] c)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0256] 和
[0257] -CDR2选自由以下组成的组：
[0258] d)SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列；
[0259] e)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0260] f)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0261] 和
[0262] -CDR3选自由以下组成的组：
[0263] g)SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列；
[0264] h)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0265] i)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0266] ·其CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性；
[0267] ·其选自SEQ ID NOs:11和12中的任一种。
[0268] 本发明的单价多肽可以基本上由选自轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)和选自重链可变结构域序列(例如，VH-序列)的免疫球蛋白单可变结构域组成。本发明的单价多肽可以基本上由选自来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列和来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。本发明的单价多肽可以基本上由选自以下的免疫球蛋白单可变结构域组成：结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)，"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸)，或纳米抗体(包括但不限于VHH)。在一个优选的方面中，本发明的单价多肽基本上由部分或完全人源化的纳米抗体，如部分或完全人源化的VHH组成。
[0269] 如上文所述，本发明还涉及本文所述的单价多肽在制备本发明的多价、优选多互补位多肽中的应用。因此，本发明涉及本发明的单价多肽作为结合结构域或结合单元在制备本发明的多价多肽中的应用。
[0270] 本发明还涉及包含一种或多种单价多肽或一种或多种本发明的多价、优选多互补位多肽或基本上由一种或多种单价多肽或一种或多种本发明的多价、优选多互补位多肽组成的多肽(在本文中还称为“本发明的多肽”)，并且任选地还包含一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元，其任选地通过一个或多个肽接头连接。如技术人员应该从本文进一步的公开内容中清楚的，所述其他基团、残基、结构部分、结合单元或氨基酸序列可以为或可以不为本发明的单价或多价、优选多互补位多肽提供其他官能性，并且可以改变或可以不改变本发明的单价或多价多肽的特性。
[0271] 本发明还涉及编码本发明的多肽的核酸或核苷酸序列。所述核酸在本文中还称为“本发明的核酸”，并且例如，可以以遗传构建体的形式存在，如本文进一步所述。因此，本发明还涉及以遗传构建体形式存在的核酸或核苷酸序列。
[0272] 编码本发明的单价多肽的核酸可以连接起来以获得编码本发明的多价、优选多互补位多肽的核酸。因此，本发明还涉及编码本发明的单价多肽的核酸或核苷酸序列用于制备编码本发明的多价、优选多互补位多肽的遗传构建体的应用。
[0273] 本发明还涉及表达(或在适宜的环境下能够表达)本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文的进一步描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选但非限制性的实例将变得清楚。
[0274] 本发明还涉及一种组合物，所述组合物含有或包含至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的核酸以及任选地所述组合物的本身已知的一种或多种其他成分，即，这取决于所述组合物的目的应用。例如，所述组合物可以是药物组合物(如本文所述)或兽医用组合物。通过本文的进一步描述，所述组合物的一些优选但非限制性的实例将变得清楚。
[0275] 本发明还涉及用于制备本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
[0276] 本发明还涉及本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的的应用和用途，以及方法。通过本文的进一步描述，一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。
[0277] 由此，本发明的多肽和组合物可以用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染。对铜绿假单胞菌感染敏感的患者组是技术人员所清楚的，并且例如，包括(但不限于)通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，进行手术的患者，患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患者，患有支气管扩张(bronchiectasis)的患者，患有败血症的患者和患有癌症相关的中性粒细胞减少症(cancer-associated neutropenia)的患者。
[0278] 因此，本发明还涉及用于预防和/或治疗下述中的至少一种中的铜绿假单胞菌感染的方法：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种本发明的多肽或本发明的组合物。
[0279] 本发明还涉及本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗下述至少一种中的铜绿假单胞菌感染的药物组合物中的应用：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症；和/或用于本文所述的一种或多种方法中的应用。
[0280] 本发明还涉及本发明的多肽或本发明的组合物，其用于预防和/或治疗下述至少一种中的铜绿假单胞菌感染：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症。
[0281] 通过本发明的进一步公开，本发明的多肽和组合物的其他应用和用途将为技术人员所清楚。
[0283] 图1A-1D:在如实施例5所述的使用P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中分析单价抗-PcrV纳米抗体。
[0284] 图2A-2B:在如实施例7所述的使用P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中分析二价/双互补位抗-PcrV纳米抗体。
[0285] 图3:用于表位绘图的分子的示意图。PcrV-LcrV嵌合体设计是基于一级序列和结构(特别是二级结构)信息。通过引入七种长度为17-47个氨基酸残基的LcrV片段(透明长方块)替代PcrV的结构对应副本(黑色长方块)而设计七种不同的嵌合分子。也产生了Frank等.(The Journal of infectious diseases(传染病杂志)186:64-73,2002和US6,827,935)所述的PcrV片段(氨基酸144-257)。长方块上方和下方的数字分别表示PcrV或LcrV的氨基酸残基数目。不同构建体的氨基酸序列在表A-7中给出。
[0286] 图4A-4B:在急性铜绿假单胞菌感染小鼠模型中接种纳米抗体339,360和376后获得的存活曲线。每组7至8只C57Bl/6小鼠用预先与铜绿假单胞菌混合的纳米抗体、Fab13.37或缓冲液单独的预混合物鼻内攻击。在96小时或125小时内监测小鼠的存活。
[0287] 图5A-5C:肺炎症参数和细菌负担。每组3至5只C57Bl/6小鼠用预先与铜绿假单胞菌混合的纳米抗体、Fab13.37或缓冲液单独的预混合物鼻内攻击。另一组i.p.接受10mg/kg妥布霉素(Tobramycin)作为阳性对照。在感染后24小时处死所有小鼠，之后评估髓过氧化物酶活性(A)、细菌负担(B)和肺重量相对于总体重的百分比(C)。结果表示为平均数±SEM。使用具有post-hoc Bonferroni’s多重比较检验的单向ANOVA进行统计学。
<0.05的P-值认为是统计学显著的。
<0.05的P-值认为是统计学显著的。
[0288] 图6:相对体重减轻。每组7-8只C57Bl/6小鼠用预先与铜绿假单胞菌混合的纳米抗体、Fab13.37或缓冲液单独的预混合物鼻内攻击。监测小鼠5天，并且每天在1pm记录体重。结果表示为平均数±SEM。
[0289] 图7.在雾化之前和之后纳米抗体样品的OD500值。多肽339,360,354和376(在具有和不具有吐温80的D-PBS中)通过 APIXNEB喷雾器系统(Activaero)雾化。雾化实验一式两份进行。 样品通过具有4um膜的筛网喷雾器连续雾化。气雾
剂收集在100mL玻璃瓶中，然后进行分析。
剂收集在100mL玻璃瓶中，然后进行分析。
[0290] 详述
[0291] 定义
[0292] 除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版)Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，1989)，F.Ausubel等.(Current protocols in molecular biology(现代分子生物学方法)，Green Publishing&Wiley Interscience，New York，1987)，Lewin(Genes II(基因II)，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1985)，Old等.(Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering(基因操作原理：基因工程导言)(第2版)University of California Press，Berkeley，CA，1981)；Roitt等.(Immunology(免疫学)(第6版)Mosby/Elsevier，Edinburgh，2001)，Roitt等.(Roitt’s Essential Immunology(Roitt基础免疫学)(第10版)Blackwell Publishing，UK，2001)，和Janeway等.(Immunobiology(免疫生物学)(第6版)Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，New York，2005)，以及本发明所引用的一般背景技术。
[0293] 熟练的技术人员应该清楚，除非另外指明，没有特别详细描述的所有方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经以本身已知的方式进行。例如，同样参考标准手册和本文提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考文献；以及 例 如 下 述 综 述：Presta(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56，2006)，Levin 和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57，2006)，Irving等.(J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)248(1-2):31-45，2001)，Schmitz等.(Placenta21Suppl.A:S106-12，2000)，Gonzales等.(Tumour Biol.(肿瘤生物学)26(1):31-43，2005)，其描述了用于蛋白质工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的技术。
[0294] 术语“序列”用在本文中(例如，在如“免疫球蛋白序列”，“抗体序列”，“可变结构域序列”，“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包含相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更局限的解释。
[0295] 氨基酸残基按照标准的三字母或一字母氨基酸密码表示。参考见WO08/020079第48页的表A-2。
[0296] 核酸或氨基酸被认为是“(以)基本上分离的(形式存在)”――例如，与其从中获得的反应介质或培养基相比――此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其他成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且高达1000倍或更多时，认为核酸或氨基酸是“(基本上)分离的”。当使用适当的技术，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术确定时，“以(基本上)分离的形式存在”的核酸或氨基酸优选地基本上是均质的。
[0297] 当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含核苷酸或氨基酸残基的片段，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管最先提及的序列实际上是怎样产生或获得的(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的多肽包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可以意指所述免疫球蛋白单可变结构域序列已经结合在本发明的多肽的序列内，但是更通常地，这一般意指本发明的多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不管本发明所述的多肽是怎样产生或获得的。此外，当认为核酸或核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核酸或核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核酸或核苷酸序列相同的阅读框内)。
[0298] “基本上由……组成”意指用于本发明方法中的免疫球蛋白单可变结构域与本发明的多肽完全相同，或者与本发明的多肽相对应，其具有添加到所述免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端的有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，
5或6个氨基酸残基。
5或6个氨基酸残基。
[0299] 出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加――与第一核苷酸序列相比――都视作在单一核苷酸(位置)的差异。备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBI Blast v2.0。例如，在WO 04/037999,EP 0967284,EP 1085089,WO 00/55318,WO00/78972,WO 98/49185和GB 2357768中描述了用于确定序列同一性程度的一些其他的技术、计算机算法和设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列。
[0300] 出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一缺失、插入、取代或添加――与第一氨基酸序列相比――都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
[0301] 此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB 335768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其他参考文献的相关教导而选择此类取代的(优选)类型和/或组合。
[0302] 所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基:His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基:Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基:Phe，Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
[0303] 用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等(“Principles of Protein Structure(蛋白质结构原理)”,Springer-Verlag,1978)研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman(Biochemistry(生物 化 学)13:211,1974；Adv.Enzymol.(高 级 酶 学),47:45-149,1978)研 究 的 结 构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等(Proc.Nad.Acad Sci.USA(美国国家科学院 学 报)81:140-144,1984)，Kyte 和 Doolittle(J.Molec.Biol.(分 子 生 物 学 杂志).157:105-132,1981),以及Goldman等(Ann.Rev.Biophys.Chem.(生物物理化学年度综述)15:321-353,1986)研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等(Nature Structural Biology(自然结构生物学),3：803，1996)，Spinelli等(Natural Structural Biology(自然结构生物学)，
3：752-757，1996)和Decanniere等(Structure(结构),7(4):361,1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其他信息可以在上文引用的现有技术中找到。
3：752-757，1996)和Decanniere等(Structure(结构),7(4):361,1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其他信息可以在上文引用的现有技术中找到。
[0304] 如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本发明所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”。
[0305] 当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本发明的氨基酸序列和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指，分别与a),d)或g)的CDR序列相比，在c),f)或i)所指定的CDR序列的位置的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解为，分别与a),d)或g)的CDR序列相比，c),f)和i)的CDR序列可以包含一个、两个或最多三个这样的氨基酸差异。
[0306] “氨基酸差异”可以是任意一个、两个或最多三个取代、缺失或插入，或其任意组合，其改善本发明的多肽的特性或者其至少不使本发明的多肽的理想的特性或理想的特性的平衡或组合减少太多。在这一方面，与包含所述一个或多个CDR序列而没有所述一个、两个或最多三个取代、缺失或插入的多肽相比，所产生的本发明的多肽应该至少以相同的、大约相同的或更高的亲和力结合PcrV，所述亲和力通过表面等离子体共振测量。
[0307] 在这一方面，c),f)和/或i)所述的氨基酸序列可以分别是通过使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术进行亲和力成熟而来源于a),d)和/或g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0308] 例如，并且取决于用来表达本发明的多肽的宿主生物体，可以以这样的方式设计所述缺失和/或取代，即，去除一个或多个翻译后修饰的位点(如一个或多个糖基化位点)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
[0309] 术语“表位”和“抗原决定簇”可以互换使用，是指诸如多肽或蛋白的大分子由抗原结合分子识别的部分，所述抗原结合分子诸如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，并且更具体地是由所述分子的抗原结合位点识别的部分。表位限定免疫球蛋白的最少的结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性靶标。
[0310] 抗原结合分子(诸如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)识别表位的部分称为“互补位”。
[0311] 认为能够“结合”或“特异性结合”、对特定表位、抗原或蛋白(或者对其至少一部分、片段或表位)“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽(如本发明的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽、或通常是抗原结合分子或其片段)是“针对”(“抗(against)”或“针对(directed against)”)所述表位、抗原或蛋白的或关于所述表位、抗原或蛋白是“结合”分子，或者认为是“抗”-表位、“抗”-抗原或“抗”-蛋白的(例如，“抗”-PcrV的)。
[0312] 术语“特异性”具有在WO 08/020079第53-56页段落n)中给出的意思；并且如其中提及的，是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性而确定，如WO 08/020079(通过引用结合于此)第53-56页所述，其还记述了用于测量抗原-结合分子(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)与相关抗原之间的结合的一些优选的技术。典型地，抗原-结-5 -12合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)将以10 -10 摩尔/升或更-7 -12 -8 -12
小、并且优选地10 -10 摩尔/升或更小并且更优选地10 -10 摩尔/升的解离常数(KD)
5 12 7 12 8 12
(即，以10-10 升/摩尔或更大、并且优选地10-10 升/摩尔或更大、且更优选地10-10
4
升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于10 摩尔/升的KD值(或任何小
4 -1
于10M 的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价多肽将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如10至5nM或更小的亲和力与目标抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方式确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其他技术。本领域技术人员应该清楚，并且如WO 08/020079第53-56页所述，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法是技术人员所清楚的，并且例如，包括WO 08/020079第53-56页所提及的技术。
小、并且优选地10 -10 摩尔/升或更小并且更优选地10 -10 摩尔/升的解离常数(KD)
5 12 7 12 8 12
(即，以10-10 升/摩尔或更大、并且优选地10-10 升/摩尔或更大、且更优选地10-10
4
升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于10 摩尔/升的KD值(或任何小
4 -1
于10M 的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价多肽将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如10至5nM或更小的亲和力与目标抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方式确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其他技术。本领域技术人员应该清楚，并且如WO 08/020079第53-56页所述，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法是技术人员所清楚的，并且例如，包括WO 08/020079第53-56页所提及的技术。
[0313] 当免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽以是所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第二靶标或抗原结合的亲和力的至少10倍，如至少100倍，并且优选至少1000倍，并且多至10000倍以上的亲和力(如上文所述，并且适当地表示为KD值,KA值,K解离速率和/或K结合速率)结合第一抗原时，与第二靶标或抗原相比，认为所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽是“特异性针对”第一靶标或抗原。例如，所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽可以以比所述所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第二靶标或抗原结合的KD少至少10倍，诸如少至少100倍，优选少至少1000倍，诸如少10000倍或甚至更少的KD值结合第一靶标或抗原。优选地，与第二靶标或抗原相比，当免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽“特异性针对”第一靶标或抗原时，其针对(如本文定义)所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。
[0314] 术语“(交叉)阻断((cross)-block)”、“被(交叉)阻断((cross)-blocked)”、“(交叉)阻断((cross)-blocking)”、“竞争性结合”、“(交叉)竞争((cross)-compete)”、“(交叉)竞争((cross)-competing)”和“(交叉)竞争((cross)-competition)”在本文可以互换使用，用来意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂与给定靶标的结合的能力。免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种对靶标的结合的程度，且因此其能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂之间对于它们与所述靶标的结合的竞争。
[0315] 以下概括描述用于确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否交叉阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的Biacore测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂一起使用。按照供应商的建议使用Biacore机器(例如，Biacore3000)。因此，在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将靶蛋白(例如PcrV)偶联到CM5Biacore芯片上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上(易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。将两种待检测它们彼此交叉阻断的能力的测试结合试剂(称为A*和B*)以结合位点1：1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设结合试剂的分子量是所述结合试剂的总分子量除以所述结合试剂上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每种结合试剂的浓度应该足够高，足以易于饱和所述结合试剂关于捕获在Biacore芯片上的靶标分子的结合位点。在所述混合物中的结合试剂处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述浓度典型地为1.00–1.5微摩尔(基于结合)。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中和相同的浓度。将测试混合物通过靶标-包被的Biacore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的结合试剂。典型地，这通过用30mM HCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。再次处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的结合试剂。然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合，并且是每种结合试剂在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则认为这两种结合试剂是彼此交叉阻断的。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是一种将在上述Biacore交叉阻断测定法中与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂的最大理论结合(正如上文定义)的80％-0.1％(例如，80％-4％)，特别地是最大理论结合的75％-0.1％(例如，75％-4％)，且更特别地是最大理论结合的70％-0.1％(例如，70％-4％)。上述Biacore测定法是用来确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否是按照本发明彼此交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5Biacore芯片上的靶标结合(这通常在靶标上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在这样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式确定。以这种特定的形式，抗-His抗体将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表面，并被所述抗-His抗体捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后，新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His抗体包被的表面上。除了使用N端His-标记的靶标给出的实例之外，可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，HA标记和抗-HA抗体；FLAG标记和抗-FLAG抗体；生物素标记和链霉抗生物素蛋白)。
[0316] 以下概括描述用于确定针对靶标(例如PcrV)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否交叉阻断或如本文所定义那样能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂中的任一种一起使用。本测定法的一般原理是使得针对所述靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂包被到ELISA平板的孔上。将过量的量的第二潜在的交叉阻断的、抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂添加到溶液中(即，不与ELISA平板结合)。然后向孔中加入有限量的靶标。所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂和溶液中的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂竞争与有限量的靶标分子的结合。洗涤平板，以去除未与包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂结合的过量的靶标，且还去除第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂以及在所述第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂与靶标之间形成的任何复合物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的条件下所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂将能够引起所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第一免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂如Ab-X作为固定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的量的第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂即Ab-Y添加到该ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板的过程中，每孔Ab-Y靶标结合位点的摩尔是每孔所用的Ab-X靶标结合位点的摩尔至少10倍高。然后，加入靶标，以致每孔加入的靶标的摩尔比用于包被每孔的Ab-X靶标结合位点的摩尔低至少25倍。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标的试剂，以测量由所述包被的抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂(在该情形中为Ab-X)特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂(在该情形中为Ab-X)、第二溶液相免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂(在该情形中为Ab-Y)、仅有靶标缓冲剂(即，无靶标)和靶标检测试剂的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂(在该情形中为Ab-X)、仅有第二溶液相免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂缓冲剂(即，无第二溶液相免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂)、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂用作包被免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂和哪种用作第二(竞争剂)免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂导致的任何假象(例如，Ab-X与Ab-Y之间对于靶标的显著不同的亲和力)，该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂，Ab-Y是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂，Ab-X是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的条件下(即，阳性对照孔)获得的靶标检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂能够引起靶标检测信号(即，由所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂结合的靶标的量)减少60％-100％,特别地70％-100％,且更特别地80％-100％，则Ab-X和Ab-Y被定义为是交叉阻断的。
[0317] 用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否如本文定义那样交叉阻断、能够交叉阻断、竞争性结合或是交叉竞争性的其他方法记述在，例如，Xiao-Chi Jia等.(Journal of Immunological Methods(免疫学方法杂志)288:91–98，2004)，Miller等.(Journal of Immunological Methods(免疫学方法杂志)365:118–125，2011)中，和/或是本文中记述的方法(例如，参见实施例5.4)。
[0318] “表位库并(Epitope binning)”是指使用竞争性结合测定或交叉结合测定来鉴定能够或不能够同时结合靶标(例如，PcrV)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的成对物，由此鉴定结合靶标上相同的或重叠的表位的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂。
[0319] 因此，“表位库”用在本说明书中是具有相同或重叠结合特异性的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂的家族。如上文所述，免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂向表位库的分选是基于所述免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂对抗原结合的交叉-竞争(交叉-阻断)。所述交叉-竞争(交叉-阻断)测定分析所述免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂与抗原的同时结合(配对)并且将具有相似的配对模式(profile)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂分组在一起。具有相似模式(即，属于同一表位库)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂可以结合相同的、紧密相关的和/或重叠的表位。
[0320] 如果它对于两种不同的抗原或抗原决定簇是特异性的(如本文定义)，则认为氨基酸序列对于这两种不同的抗原或抗原决定簇(诸如例如，来源于两种不同的哺乳动物物种的血清白蛋白，诸如例如，人血清白和食蟹猴(cyno)血清白蛋白，诸如，例如，来源于不同的铜绿假单胞菌菌株的PcrV)是“交叉反应性的”。
[0321] 术语“PcrV”用在本文中是指在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的III型分泌系统(TTSS)中存在的针状蛋白PcrV。
[0322] 术语本发明的多肽的“功效”用在本文中是发生其特定的作用所需要的本发明的多肽的量的函数。其简单地测量为所述多肽的IC50的倒数(inverse)。其是指本发明所述的多肽中和铜绿假单胞菌的能力；诸如调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌的传染性，调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌对宿主的定殖，调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌的TTSS毒力机制，调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌向宿主细胞注入各种外毒素，调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌诱导的宿主细胞膜渗透性的孔-介导的增加，调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌诱导的宽泛的细胞防御反应和/或调节、抑制和/或防止铜绿假单胞菌诱导的组织-损伤性炎症的引发。功效可以通过本领域已知的或本文所述的任意适当的测定来测量，诸如，例如，体外细胞毒性测定(例如，如Frank等.,The Journal of infectious diseases(传染病杂志)186:64-73,2002；Vance等.Infection and Immunity(传染和免疫性)73:1706-1713,2005；El Solh等.Am.J.Respir.Crit.Care Med.178:513-519,2008；和/或实施例部分所述的细胞毒性测定)和/或体内测定(例如，Secher等.,Journal of Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)66:1100-1109,2011所述的急性小鼠模型)。
[0323] 与之相反，本发明的多肽的“功效”测量在饱和的多肽浓度下效果本身的最大强度。功效表示可由本发明的多肽获得的最大响应。其是指多肽产生需要的(治疗)作用的能力。
[0324] 本发明的多肽的“半衰期”通常可以如WO 08/020079中第57页段o)中所述和如本文提及那样定义，是指所述多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述多肽的降解和/或通过天然机制对所述多肽的清除或螯合(sequestration)导致减少。本发明的多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物代谢动力学分析确定。适当的技术对于本领域技术人员应该是清楚的，并且例如，可以通常如WO08/020079中第57页段o)中所述。在WO 08/020079中第57页段o)中还提到，半衰期可以用参数如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如，参考标准手册，如Kenneth等 .(Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists( 药物的化学稳定性：药剂师手册)，John Wiley&Sons Inc，1986)以及M Gibaldi和D Perron("Pharmacokinetics(药物代谢动力学)"，Marcel Dekker，第2修订版，1982)。术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO 08/020079中第57页段o)中定义，并且特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0325] 除非另外指明，术语“免疫球蛋白”－－不管其在本文中用来指重链抗体还是常规的4-链抗体－－用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。
[0326] 术语(多肽或蛋白的)“结构域”用在本文中是指折叠的蛋白结构，其具有独立于所述蛋白的其余部分保持其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白的独立的功能特性，并且在多种情形中可以添加、去除或转移到其他蛋白上，而不失去所述蛋白的其余部分和/或所述结构域的功能。
[0327] 术语“免疫球蛋白结构域”用在本文中是指抗体链(诸如例如，常规4-链抗体或重链抗体的链)的球状区域，或是基本上由所述球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于，其保留抗体分子特有的免疫球蛋白折叠，其由以两个β-折叠排列的约七个反向平行的β-链的两层夹心组成，任选地通过保守的二硫键稳定。
[0328] 术语“免疫球蛋白可变结构域”用在本文中意指基本上由四个“构架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述四个构架区在本领域和本文下文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区通过三个“互补补决定区”或“CDRs”中断，所述互补补决定区在本领域和本文下文中分别称为“互补补决定区1”或“CDR1”；“互补补决定区2”或“CDR2”；和“互补补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
正是免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原-结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。
正是免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原-结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。
[0329] 术语“免疫球蛋白单可变结构域”可与“单可变结构域”互换使用，其定义这样的分子，其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域中并且由单个免疫球蛋白结构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规的”免疫球蛋白或其片段分开，在“常规的”免疫球蛋白或其片段中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点。典型地，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这一情形中，VH与VL二者的互补性决定区(CDRs)将促成抗原结合位点，即，总共有6个CDRs将参与抗原结合位点的形成。
[0330] 考虑到上述定义，常规4-链抗体(如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子；本领域中是已知的)或来源于所述常规4-链抗体的Fab片段，F(ab')2片段，Fv片段，如二硫键连接的Fv或scFv片段，或双抗体(均为本领域已知的)的抗原-结合结构域通常不被认为是免疫球蛋白单可变结构域，原因在于，在这些情形中，与抗原的各个表位结合通常不通过一个(单个)免疫球蛋白结构域发生，而是通过一对(缔合的)免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域发生，即，通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对发生，它们共同结合所述各个抗原的表位。
[0331] 相反，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的条件下特异性结合抗原的表位。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDRs形成。
[0332] 因此，所述单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其适当的片段；只要其能够形成单抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，以使所述单抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单元)。
[0333] 在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或是来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
[0334] 例如，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适于用作(单)结构域抗体的氨基酸)，"dAb"或dAb(或适于用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文定义，并且包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任意一种的任何适当的片段。
[0335] 特别地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是纳米抗体 (如本文定义)或其适当的片段。[注意：纳米抗体 ( ),纳米抗体 ( )和纳米克隆 ( )为埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标]。关
于纳米抗体的一般描述，参考下文的进一步描述，以及本文引用的现有技术，如例如，在WO
08/020079(第16页)中所述。
于纳米抗体的一般描述，参考下文的进一步描述，以及本文引用的现有技术，如例如，在WO
08/020079(第16页)中所述。
[0336] “VHH结构域”，还称为VHHs，VHH结构域，VHH抗体片段，和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“缺乏轻链的抗体”；Hamers-Casterman等.Nature(自然)363:446-448，1993)的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域。已经选择术语“VHH结构域”来将这些可变结构域与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“VH结构域”或“VH结构域”)区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“VL结构域”或“VL结构域”)区分。关于VHH’s和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述论文(Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74:277-302，
2001)，以及参考下述作为一般背景技术提到的专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO
02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020(＝EP1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867，WO 04/041862，WO
04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司的其他公布的专利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术，特别是在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。如在这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。关于纳米抗体的进一步的描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合体”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性的实例)和增加纳米抗体的半衰期的不同的修饰以及其制剂，例如，可见于WO 08/101985和WO 08/142164。关于纳米抗体的进一步的一般描述，参考本文引用的现有技术，如例如，记述在WO 08/020079(第16页)中。
2001)，以及参考下述作为一般背景技术提到的专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO
02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020(＝EP1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867，WO 04/041862，WO
04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司的其他公布的专利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术，特别是在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。如在这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。关于纳米抗体的进一步的描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合体”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性的实例)和增加纳米抗体的半衰期的不同的修饰以及其制剂，例如，可见于WO 08/101985和WO 08/142164。关于纳米抗体的进一步的一般描述，参考本文引用的现有技术，如例如，记述在WO 08/020079(第16页)中。
[0337] “结构域抗体(Domain antibodies)”，还称为"Dab"s，“结构域抗体(Domain Antibodies)”，和“dAbs”(术语“结构域抗体”和“dAbs”被GlaxoSmithKline集团公司(GlaxoSmithKline group of companies)用作商标)已经记述在，例如，EP0368684，Ward等.(Nature(自然)341:544-546，1989)，Holt等.(Tends in Biotechnology(生物技术趋势)21:484-490，2003)和WO 03/002609中，以及在，例如WO 04/068820，WO 06/030220，WO 06/003388中，和在Domantis Ltd.的其他公布的专利申请中。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物、特别是人4-链抗体的VH或VL结构域。为了结合作为单抗原结合结构域的表位，即，不分别与VL或VH结构域配对，需要对所述抗原结合特性的特异性选择，例如，通过使用人单VH或VL结构域序列的文库进行。如同VHHs，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且，如果来源于完整的人序列，对于例如在人中的治疗应用，不需要人源化。
[0338] 还应该注意到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的而在本发明的情形中较不优选，但是单可变结构域可以来源于某些鲨鱼(shark)物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”,参见例如WO 05/18629)。
[0339] 因此，在本发明的意思内，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源的多肽，优选来源于骆驼科动物的多肽，优选骆驼重链抗体。其可以被人源化，如之前所述。并且，该术语包括来源于非骆驼科动物来源的多肽，例如来源于小鼠或人的多肽，其已被“骆驼源化”，如例如，记述在Davies和Riechmann(FEBS339:285-290，1994；Biotechnol.(生物技术)13:475-479，1995；Prot.Eng.(蛋白质工程)9:531-537，
1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)231:25-38，
1999)中。
1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)231:25-38，
1999)中。
[0340] VHH结构 域 的氨 基 酸残 基 按照Kabat等 (“Sequence of proteins of immunological interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)”,美国公众健康服务中心(US Public Health Services),NIH Bethesda,MD,出版No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，如例如在Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)231:25-38，1999)的图2所示，这种编号方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域。本领域中已知用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法，所述方法也可以以类似的方式用于VHH结构域。然而，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另外指明，遵循用于上述VHH结构域的根据Kabat的编号方式。
[0341] 应该注意——如关于VH结构域和VHH结构域在本领域是公知的——每个CDRs中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与Kabat编号方式所示的氨基酸残基的总数相对应(即，在实际序列中，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不被占据，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。VH结构域和VHH结构域中氨基酸残基的总数通常在110-120的范围内，通常在112-115的范围内。然而，应该注意，更短或更长的序列也可以适用于本文所述的目的。
[0342] CDR区的确定也可以按照不同的方法进行。在Kabat所述的CDR确定中，VHH的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49的氨基酸，VHH的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
[0343] 然 而，在 本 申 请 中，CDR序 列 按 照 Kontermann和 Dübel(编 ,Antibody Engineering(抗 体 改 造),vol2,Springer Verlag Heidelberg Berlin,Martin,第 3章,pp.33-51,2010)确定。按照这种方法，FR1包含位置1-25的氨基酸残基，CDR1包含位置26-35的氨基酸残基，FR2包含位置36-49的氨基酸，CDR2包含位置50-58的氨基酸残基，FR3包含位置59-94的氨基酸残基，CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，并且FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
[0344] 免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域)可以进行人源化。特别地，人源化的免疫球蛋白单可变结构域，如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是通常如前述段落中定义的免疫球蛋白单可变结构域，但是其中存在至少一个是人源化取代(如本文定义)和/或对应于人源化取代的氨基酸残基(特别地，在至少一个构架残基中)。可以这样确定潜在有用的人源化取代：通过比较天然存在的VHH序列的构架区的序列与一种或多种密切相关的人VH序列的相对应的构架序列，之后可以向所述VHH序列中引入这样确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以检测所得到的人源化的VHH序列针对靶标的亲和力，稳定性，表达的容易性和水平，和/或其他需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试验和误差程度，熟练的技术人员可以确定其他适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，免疫球蛋白单可变结构域，诸如纳米抗体(包括VHH结构域)(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。
[0345] 免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化的VHH结构域)，还可以通过在一个或多个CDRs的氨基酸序列中引入一个或多个改变而进行亲和力成熟，与各自的母体分子相比，所述改变使得所产生的免疫球蛋白单可变结构域针对其各自的抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单可变结构域分子可以通过本领域已知的方法制备，例如，如Marks等.(Biotechnology(生物技术)10:779-783，1992)，Barbas等.(Proc.Nat.Acad.Sci，USA(美国国家科学院学报)91:3809-3813，
1994)，Shier 等 .(Gene( 基 因 )169:147-155，1995)，Yelton 等 .(Immunol.( 免 疫学 )155:1994-2004，1995)，Jackson 等 .(J.Immunol.( 免 疫 学 杂 志 )154:3310-9，
1995)，Hawkins等.(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)226:889896，1992)，Johnson与Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display(使用噬菌体展示的抗体亲和力成熟)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，1996)所述。
1994)，Shier 等 .(Gene( 基 因 )169:147-155，1995)，Yelton 等 .(Immunol.( 免 疫学 )155:1994-2004，1995)，Jackson 等 .(J.Immunol.( 免 疫 学 杂 志 )154:3310-9，
1995)，Hawkins等.(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)226:889896，1992)，Johnson与Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display(使用噬菌体展示的抗体亲和力成熟)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，1996)所述。
[0346] 由免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体或纳米抗体起始设计/选择和/或制备多肽的方法在本文中还称为“格式化(formatting)”所述免疫球蛋白单可变结构域；并且组成多肽的一部分的免疫球蛋白单可变结构域被认为是“格式化的”或采用所述多肽的“格式”。基于本发明的公开内容，熟练的技术人员将清楚免疫球蛋白单可变结构域可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的另一个方面。
[0347] 例如，并且非限制性地，一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以用作“结合单元”、“结合结构域”或“结构单元”(这些术语可互换使用)来制备多肽，所述多肽任选地可以包含一个或多个可以作为结合单元的其他免疫球蛋白单可变结构域(即，针对PcrV上同一个的或另一个表位和/或针对一个或多个不同于PcrV的其他抗原、蛋白或靶标)。
[0348] 单价多肽仅包含一个结合单元(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)或基本上仅由一个结合单元(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)组成。包含两个以上结合单元(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)的多肽在本文中还称为“多价”多肽，并且存在于所述多肽中的结合单元/免疫球蛋白单可变结构域在本文中还称为是“单价形式”的。例如，“二价”多肽可以包含两个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过一个接头序列连接，而“三价”多肽可以包含三个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过两个接头序列连接；等等。
[0349] 在多价肽中，所述两个以上的免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的，并且可以是针对相同的抗原或抗原决定簇(例如，针对相同的部分或表位或针对不同的部分或表位)，或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任意适当的组合。包含至少两个结合单元的多肽(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)，其中至少一个结合单元是针对第一抗原(即，PcrV)并且至少结合单元是针对第二抗原(即，不同于PcrV)，也称为“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的所述结合单元(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)在本文中也称为是“多特异性格式”的。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，PcrV)的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第二抗原(即，不同于PcrV)的其他免疫球蛋白单可变结构域，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，PcrV)的免疫球蛋白单可变结构域，至少一个针对第二抗原(即，不同于PcrV)的其他免疫球蛋白单可变结构域，和至少一个针对第三抗原(即，不同于PcrV和第二抗原)的其他免疫球蛋白单可变结构域；等等。
[0350] “多互补位多肽”，诸如，例如，“二互补位多肽”或“三互补位多肽”，包含两个以上分别具有不同的互补位(其如本文进一步所述；参见本发明的多价多肽章节)的结合单元或基本上由两个以上分别具有不同的互补位(其如本文进一步所述；参见本发明的多价多肽章节)的结合单元组成。
[0351] 本发明的单价多肽
[0352] 本发明提供特别适于结合PcrV的氨基酸残基的片段(SEQ ID NOs:20-37,SEQ ID NOs:38-56和SEQ ID NOs:57-75；表A-6)。这些氨基酸残基的片段可以存在于，和/或可以结合在本发明的多肽中，特别是以它们形成本发明的多肽的抗原结合位点(的一部分)的形式进行。这些氨基酸残基片段已经产生为针对PcrV的重链抗体或VHH序列的CDR序列。这些氨基酸残基片段在本文中还称为“本发明的CDR序列”(即，分别称为“本发明的CDR1序列”、“本发明的CDR2序列”和“本发明的CDR3序列”)。
[0353] 然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上不限于这些氨基酸残基片段可能在本发明的多肽中具有的特定的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基片段允许本发明的多肽以特定的亲和力和效力(如本文定义)结合PcrV。因此，通常，本发明在其最广泛意义上提供这样的单价多肽(在本文中还称为“本发明的单价多肽”)，其能够以特定指定的亲和力、抗体亲抗原性、功效和/或效力结合PcrV，并且其包含一种或多种本文所述的CDR序列，并且特别是两种以上所述CDR序列的组合，所述CDR序列通过一个或多个其他的氨基酸序列适当地彼此连接，以使整个多肽形成能够与PcrV结合的结合结构域和/或结合单元。然而，还应该注意，在本发明的单价多肽中仅存在一个所述CDR序列可能本身已经足以为本发明的单价多肽提供与PcrV结合的能力；例如，同样参考WO 03/050531中所述的所谓“加速片段(Expedite fragments)”。
[0354] 因此，在一个具体而非限制性方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基片段：
[0355] -CDR1序列：
[0356] a)SEQ ID NOs:20-37；
[0357] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0358] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段；
[0359] 和/或
[0360] -CDR2序列：
[0361] d)SEQ ID NOs:38-56；
[0362] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0363] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段；
[0364] 和/或
[0365] -CDR3序列：
[0366] g)SEQ ID NOs:57-75；
[0367] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列的片段；
[0368] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列的片段。
[0369] 包含一个或多个上文指定的氨基酸残基片段的单价多肽显示出改善的特性，诸如例如，改善的结合特征(适当地测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，k结合-速率和/或k解离-速率，或备选地表示为IC50值，如本文进一步所述)，改善的亲和力和/或改善的针对PcrV的抗体亲抗原性和/或改善的中和PcrV的功效和/或效力。
[0370] 更具体地，本发明的包含一个或多个上文指定的氨基酸残基片段的单价多肽可以以这样的亲和力(适当地测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，k结合-速率和/或k解离-速率，或备选地表示为IC50值，如本文进一步所述)结合蛋白PcrV，优选地以使其：-以1000nM-1nM或更小，优选100nM-1nM或更小，更优选15nM-1nM，或甚至10nM-1nM或更小的解离常数(KD)与PcrV结合；
[0371] 和/或以使其：
[0372] -以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1或更大的k结合-速率与PcrV结合；
[0373] 和/或以使其：
[0374] -以10-2s-1(t1/2＝0.69s)至10-4s-1(提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合-3 -1 -4 -1体),优选10 s 至10 s 或更低的k解离速率与PcrV结合。
[0375] 关于本发明的单价多肽与PcrV结合的一些优选的IC50值通过本文进一步的描述和实施例而变得清楚。
[0376] 确定IC50的测定包括在ELISA中的结合，或更优选地，在细胞毒性测定中，如在Frank等.(The Journal of infectious diseases(传染病杂志)186:64-73,2002),Vance等.(Infection and Immunity(传染和免疫性)73:1706-1713,2005),El Solh等.(Am.J.Respir.Crit.Care Med.178:513-519,2008)所述的TTSS-依赖性的细胞毒性测定中，在这些测定的修改版本(诸如例如在实施例4.4中所述)，或在如实施例7.2所述的使用人肺表皮细胞(A549细胞)的细胞毒性测定中及其修改版本中的结合。
[0377] 例如，在使用平均MOI为2.8的P3X63细胞作为靶标的TTSS-依赖性细胞毒性测定中，本发明的单价多肽可以具有1nM至10000nM，5nM至1000nM，优选5nM至500nM，更优选5nM至200nM，诸如5nM至50nM或更小的IC50值。
[0378] 在所述TTSS-依赖性细胞毒性测定中，本发明的单价多肽可以具有50％以上，优选90％以上，如100％的功效(％抑制；参见实施例4.4)。
[0379] 特别地，本发明的单价多肽可以是包含一个抗原结合位点的单价多肽，其中所述抗原结合位点包含至少一个选自由上述CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或其任意适当的组合)组成的组的氨基酸残基片段。然而，在一个优选的方面中，本发明的单价多肽包含多于一个，诸如两个以上选自由以下组成的组的氨基酸残基片段：本发明的CDR1序列，本发明的CDR2序列，和/或本发明的CDR3序列。优选地，本发明的单价多肽包含三个分别选自由以下组成的组的氨基酸残基片段：本发明的CDR1序列，本发明的CDR2序列，和本发明的CDR3序列。本文提及关于本发明的单价多肽是优选的CDR’s的组合列在表A-6中。
[0380] 应该注意，本发明不限制本发明的单价多肽的来源(或用于表达其的本发明的核酸的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的单价多肽或核酸的方式。因此，本发明的单价多肽可以是天然存在的单价多肽(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的单价多肽。
[0381] 此外，技术人员还应该清楚，可以将上文提及的一个或多个CDR's“移植”到其他“支架”上，所述支架包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。用于所述CDR移植的适当的支架和技术是技术人员所清楚的，并且在本领域中是公知的，例如，参见US7,180,370,WO01/27160,EP0605522,EP0460167,US7,054,297,Nicaise等.(Protein Science(蛋白质科学)13:1882-1891,2004),Ewert等.(Methods(方法)34:184-199,2004),Kettleborough等 .(Protein Eng.( 蛋 白 质 工 程 )4:773-783,1991),O’Brien 和 Jones(Methods Mol.Biol.( 分 子 生 物 学 方 法 )207:81-100,2003),Skerra(J.Mol.Recognit.( 分子 识 别 杂 志)13:167-187,2000) 和Saerens 等.(J.Mol.Biol.( 分 子 生 物 学 杂志)352:597-607,2005)以及其中引用的其他参考文献。例如，用于将小鼠或大鼠CDR’s移植到人构架和支架上的本身已知的技术可以以类似的方式使用，以提供包含一种或多种本文关于本发明的单价多肽定义的CDR序列和一种或多种人构架区或序列的嵌合蛋白。用于呈递氨基酸序列的适当的支架是技术人员所清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即，不同于本文已经描述的免疫球蛋白序列)，来源于蛋白TM
A结构域的蛋白支架(诸如Affibodies )，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等.Nat.Biotech.(自然生物技术),23:1257,2005)，和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等.Comb.Chem.High Throughput Screen(组合化学高通量筛选)9:619-32,2006)。
A结构域的蛋白支架(诸如Affibodies )，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等.Nat.Biotech.(自然生物技术),23:1257,2005)，和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等.Comb.Chem.High Throughput Screen(组合化学高通量筛选)9:619-32,2006)。
[0382] 在本发明所述的单价多肽中，所述CDR’s可以连接到其他氨基酸序列上和/或可以通过氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸序列优选是构架序列或者是作用为构架序列的氨基酸序列，或者一起形成呈递所述CDR’s的支架。
[0383] 按照一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的单价多肽包含连接到至少两个构架序列上的至少三个CDR序列，其中优选地，所述三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，其余两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，并且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。按照一个特别优选的但非限制性的实施方案，本发明的单价多肽具有结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1、CDR2和CDR3如本文关于本发明的单价多肽定义，并且FR1、FR2、FR3和FR4是构架序列。在所述本发明的单价多肽中，所述构架序列可以是任意适当的构架序列，并且适当的构架序列的实例将是技术人员所清楚的，例如，基于标准手册和本文提及的进一步的公开内容和现有技术。
[0384] 因此，本发明还涉及针对PcrV的单价多肽，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0385] -CDR1选自由以下组成的组：
[0386] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0387] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0388] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0389] 和/或
[0390] -CDR2选自由以下组成的组：
[0391] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0392] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0393] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0394] 和/或
[0395] -CDR3选自由以下组成的组：
[0396] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0397] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0398] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0399] 具体地，按照该优选的但非限制性的方面，本发明涉及针对PcrV的单价多肽，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
[0400] -CDR1选自由以下组成的组：
[0401] a)SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列；
[0402] b)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0403] c)与SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0404] 和
[0405] -CDR2选自由以下组成的组：
[0406] d)SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列；
[0407] e)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0408] f)与SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0409] 和
[0410] -CDR3选自由以下组成的组：
[0411] g)SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列；
[0412] h)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0413] i)与SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0414] 本发明还涉及这样的单价多肽，其中所述CDR序列与SEQ ID NOs:1-19的氨基酸序列中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至(基本上)100％的氨基酸同一性。
[0415] 在一个具体的但非限制性的方面，本发明的单价多肽可以是包含免疫球蛋白折叠的单价多肽或者是在适当的条件下(诸如生理条件下)能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的单价多肽。尤其参考Halaby等.(J.Protein Eng.(蛋白工程杂志)12:563-71,1999)的综述。优选地，当正确折叠形成免疫球蛋白折叠时，氨基酸残基片段可以能够正确形成结合PcrV的抗原结合位点。
[0416] 因此，所述构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或已经来源免疫球蛋白构架序列的构架序列(例如，通过序列优化，诸如人源化或骆驼源化)(的适当的组合)。例如，所述构架序列可以是来源于免疫球蛋白单可变结构域(诸如轻链可变结构域(例如，VL-序列))和/或来源于重链可变结构域(例如，VH-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面，所述构架序列是来源于VHH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地被部分或完全人源化)或是已被骆驼源化的(如本文定义)常规VH序列。
[0417] 所述构架序列可以优选地是这样的，以使本发明的单价多肽是免疫球蛋白单可变结构域，诸如结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)；是"dAb"(或是适合用作dAb的氨基酸)；或是纳米抗体(包括但不限于VHH)。同样地，适当的构架序列应该是技术人员所清楚的，例如，基于标准手册和本文提及的进一步的公开和现有技术。
[0418] 具体地，在本发明的单价多肽中存在的构架序列可以包含一种或多种标志残基(如WO 08/020079中定义(表A-3至A-8))，以使本发明的单价多肽是纳米抗体。所述构架序列(适当的组合)的一些优选的但非限制性的实例通过本文进一步公开将变得清楚(例如，参见表A-6)。通常，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别特征在于在一个或多个构架序列中存在一种或多种“标志残基”(如例如，在WO08/020079第61页第24行至第98页第3行进一步所述)。
[0419] 更具体地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽：
[0420] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0421] 其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
[0422] i)与SEQ ID NOs:1-19(参见表A-4)的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的目的，忽视形成CDR序列的氨基酸残基。在这一方面，还参考表A-6，其列出了SEQ ID NOs:1-19(参见表A-4)的免疫球蛋白单可变结构域的构架1序列(SEQ ID NOs:76-80),构架2序列(SEQ ID NOs:81-93),构架3序列(SEQ ID NOs:94-112)和构架4序列(SEQ ID NOs:113-117)；或
[0423] ii)表A-6所述的构架序列的组合；
[0424] 并且其中：
[0425] iii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的一个或多个氨基酸残基选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中提及的标志残基。
[0426] 在一个优选的方面中，本发明提供选自SEQ ID NOs:1-19中任一种的免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽。
[0427] 本发明还提供与具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的任一种属于同一表位库的单价多肽。因此，本发明还涉及针对PcrV的单价多肽，其交叉阻断具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1-19的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0428] 同样地，所述单价多肽可以是以任何适当的方式来源于任意适当的来源的免疫球蛋白单可变结构域，并且例如，可以是天然存在的VHH序列(即，来源于骆驼科(Camelid)的适当的物种)或是合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于，“人源化的”(如本文定义)纳米抗体或VHH序列，“骆驼源化的”(如本文定义)免疫球蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列)，以及已经通过下述技术获得的纳米抗体：诸如亲和力成熟(例如，由合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、镶合术(veneering)、组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段,利用重叠的引物进行的PCR组装,以及专业技术人员公知的改造免疫球蛋白序列的相似技术；或如本文进一步所述的前述任一项的任何适当的组合。此外，当免疫球蛋白单可变结构域包含VHH序列时，所述免疫球蛋白单可变结构域可以被适当地人源化，如本文进一步所述，以提供一种或多种本发明的进一步(部分或完全)人源化的免疫球蛋白单可变结构域。类似地，当免疫球蛋白单可变结构域包含合成的或半合成的序列(诸如部分人源化的序列)时，所述免疫球蛋白单可变结构域可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述，同样提供一种或多种本发明进一步(部分或完全)人源化的免疫球蛋白单可变结构域。
[0429] 本发明的这些单价多肽，并且特别是包含本发明的CDR序列的免疫球蛋白单可变结构域，特别适合用作结构单元或结合单元用于制备多价多肽。
[0430] 因此，本发明的结合PcrV的单价多肽可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在，或者其可以形成蛋白或多肽的一部分，其可以包含一个或多个结合PcrV的单价多肽或基本上由其组成，并且其可以任选地进一步包含一个或多个其他氨基酸序列(所有任选地通过一个或多个适当的接头连接)。本发明还涉及包含或基本上由一种或多种本发明的单价多肽(或其适当的片段)组成的蛋白或多肽。
[0431] 所述一种或多种本发明的单价多肽由此用作所述蛋白或多肽中的结合单元或结构单元，以分别提供本发明的单价、多价或多互补位多肽，均如本文所述。因此，本发明还涉及这样的多肽，其是包含或基本上由一种本发明的单价多肽组成的单价构建体。本发明由此还涉及这样的多肽，其是包含或基本上由两种以上本发明的单价多肽组成的多价多肽，诸如例如二价或三价多肽(关于包含一种或多种VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参考Conrath等.,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276:7346-7350,2001,以及参考，例如，WO 96/34103,WO 99/23221和WO2010/115998)。
[0432] 属于优选的表位库的免疫球蛋白
[0433] 此外，本发明人发现属于特定表位库的免疫球蛋白特别适合与PcrV结合、中和铜绿假单胞菌和/或作为用于制备本发明的多互补位(诸如例如二互补位或三互补位)多肽的结合单元。优选的免疫球蛋白包括属于表位库1、2或3(如进一步定义)的免疫球蛋白(诸如重链抗体，常规4-链抗体(如IgG,IgM,IgA,IgD或IgE分子),Fab片段,F(ab')2片段,Fv片段，如二硫键连接的Fv或scFv片段，或来源于所述常规4-链抗体的双抗体，其单条链，以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于，抗原结合结构域或片段，如免疫球蛋白单可变结构域)，本发明的单价多肽或其他结合试剂)。
[0434] 因此，在第一方面，本发明涉及属于表位库1的免疫球蛋白。表位库1包括基于免疫球蛋白的交叉竞争(交叉阻断)具有相同或重叠的结合特异性的免疫球蛋白的家族(包括本发明的单价多肽)。更具体地，属于表位库1的免疫球蛋白交叉阻断具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0435] 预测属于表位库1的免疫球蛋白结合相同的、紧密相关的和/或重叠的表位。更具体地，属于表位库1的免疫球蛋白结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时表现出减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)与嵌合体4(SEQ ID NO:202)和嵌合体6(SEQ ID NO:204)的结合。
[0436] 优选的属于表位库1的免疫球蛋白包括本发明的单价多肽(如上文定义)，其中：
[0437] -CDR1选自由以下组成的组：
[0438] a)SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列；
[0439] b)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0440] c)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0441] 和/或
[0442] -CDR2选自由以下组成的组：
[0443] d)SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列；
[0444] e)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0445] f)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0446] 和/或
[0447] -CDR3选自由以下组成的组：
[0448] g)SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列；
[0449] h)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0450] i)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0451] 更具体地，单价多肽，其中：
[0452] -CDR1选自由以下组成的组：
[0453] a)SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列；
[0454] b)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0455] c)与SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0456] 和
[0457] -CDR2选自由以下组成的组：
[0458] d)SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列；
[0459] e)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0460] f)与SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0461] 和
[0462] -CDR3选自由以下组成的组：
[0463] g)SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列；
[0464] h)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0465] i)与SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0466] 更具体地，本发明涉及属于表位库1的本发明的单价多肽，其中所述单价多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:3-10的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至(基本上)100％的氨基酸同一性。
[0467] 本发明优选的属于表位库1的单价多肽选自SEQ ID NOs:3-10中的任一种。
[0468] 在另一个方面中，本发明涉及属于表位库2的免疫球蛋白。表位库2包括基于免疫球蛋白的交叉竞争(交叉阻断)具有相同或重叠的结合特异性的免疫球蛋白的家族(包括本发明的单价多肽)。更具体地，属于表位库2的免疫球蛋白交叉阻断具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0469] 预测属于表位库2的免疫球蛋白结合相同的、紧密相关的和/或重叠的表位。更具体地，属于表位库2的免疫球蛋白结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时其表现出减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)与嵌合体7(SEQ ID NO:205)的结合。
[0470] 优选的属于表位库2的免疫球蛋白包括本发明的单价多肽(如上文定义)，其中：
[0471] -CDR1选自由以下组成的组：
[0472] a)SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列；
[0473] b)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0474] c)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0475] 和/或
[0476] -CDR2选自由以下组成的组：
[0477] d)SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列；
[0478] e)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0479] f)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0480] 和/或
[0481] -CDR3选自由以下组成的组：
[0482] g)SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列；
[0483] h)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0484] i)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0485] 更具体地，单价多肽，其中：
[0486] -CDR1选自由以下组成的组：
[0487] a)SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列；
[0488] b)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0489] c)与SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0490] 和
[0491] -CDR2选自由以下组成的组：
[0492] d)SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列；
[0493] e)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0494] f)与SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0495] 和
[0496] -CDR3选自由以下组成的组：
[0497] g)SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列；
[0498] h)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0499] i)与SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0500] 更具体地，本发明涉及属于表位库2的本发明的单价多肽，其中所述单价多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:1和2的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至(基本上)100％的氨基酸同一性。
[0501] 本发明优选的属于表位库2的单价多肽选自SEQ ID NOs:1和2中的任一种。
[0502] 在另一个方面中，本发明涉及属于表位库3的免疫球蛋白。表位库3包括基于免疫球蛋白的交叉竞争(交叉阻断)具有相同或重叠的结合特异性的免疫球蛋白的家族(包括本发明的单价多肽)。更具体地，属于表位库3的免疫球蛋白交叉阻断具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种与PcrV的结合和/或其与PcrV的结合被具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种交叉阻断。
[0503] 预测属于表位库3的免疫球蛋白结合相同的、紧密相关的和/或重叠的表位。更具体地，属于表位库3的免疫球蛋白结合全长PcrV(SEQ ID NO:159)，同时其表现出减少的(与全长PcrV相比，30-90％)或没有(与全长PcrV相比，低于30％)与嵌合体2(SEQ ID NO:200)的结合。
[0504] 优选的属于表位库3的免疫球蛋白包括本发明的单价多肽(如上文定义)，其中：
[0505] -CDR1选自由以下组成的组：
[0506] a)SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列；
[0507] b)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0508] c)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0509] 和/或
[0510] -CDR2选自由以下组成的组：
[0511] d)SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列；
[0512] e)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0513] f)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0514] 和/或
[0515] -CDR3选自由以下组成的组：
[0516] g)SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列；
[0517] h)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0518] i)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0519] 更具体地，单价多肽，其中：
[0520] -CDR1选自由以下组成的组：
[0521] a)SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列；
[0522] b)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0523] c)与SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0524] 和
[0525] -CDR2选自由以下组成的组：
[0526] d)SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列；
[0527] e)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0528] f)与SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
[0529] 和
[0530] -CDR3选自由以下组成的组：
[0531] g)SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列；
[0532] h)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0533] i)与SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0534] 更具体地，本发明涉及属于表位库3的本发明的单价多肽，其中所述单价多肽的CDR序列与具有SEQ ID NOs:11和12的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至(基本上)100％的氨基酸同一性。
[0535] 本发明优选的属于表位库3的单价多肽选自SEQ ID NOs:11和12中的任一种。
[0536] 本发明的多价多肽
[0537] 本发明还涉及包含或(基本上)由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域(或其适当的片段)组成的多价多肽(还称为“本发明的多价多肽”)。本发明的多价多肽优选地是多互补位多肽(在本文中还称为“本发明的多互补位多肽”)，诸如例如，“本发明的二互补位多肽”或“本发明的三互补位多肽”。术语“多互补位”(抗原-)结合分子或“多互补位”多肽用在本文中应该意指包含至少两种(即，两种以上)免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对PcrV，并且“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对PcrV，并且其中这些“第一”和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，所述多互补位多肽包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成，其中至少一种“第一”免疫球蛋白单可变结构域是针对PcrV上的第一表位，并且至少一种“第二”免疫球蛋白单可变结构域是针对PcrV上不同于PcrV上第一表位的第二表位。
[0538] 在一个优选的方面中，本发明的多肽是二互补位多肽。术语“二互补位”(抗原-)结合分子或“二互补位”多肽用在本文中应该意指包含针对PcrV的“第一”免疫球蛋白单可变结构域和针对PcrV的“第二”免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中这些“第一”和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，所述二互补位多肽包含两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或由两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成，“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对PcrV上的第一表位，“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对PcrV上不同于PcrV上第一表位的第二表位。
[0539] 本发明的二互补位多肽表现出改善的特性，诸如例如，改善的结合特征(适当地测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，k结合-速率和/或k解离-速率，或备选地表示为IC50值，如本文进一步所述)，改善的亲和力和/或改善的针对PcrV的抗体亲抗原性和/或改善的中和PcrV的功效和/或效力。
[0540] 更具体地，本发明的二互补位多肽可以以这样的亲和力(适当地测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，k结合-速率和/或k解离-速率，或备选地表示为IC50值，如本文进一步所述)结合PcrV，优选地以使其：
[0541] -以1000nM-1nM或更小，优选100nM-1nM或更小，更优选15nM-1nM，或甚至10nM-1nM或更小的解离常数(KD)与PcrV结合；
[0542] 和/或以使其：
[0543] -以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1或更大的k结合-速率与PcrV结合；
[0544] 和/或以使其：
[0545] -以10-2s-1(t1/2＝0.69s)至10-4s-1(提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合-3 -1 -4 -1体),优选10 s 至10 s 或更低的k解离速率与PcrV结合；
[0546] 关于本发明的二互补位多肽与PcrV结合的一些优选的IC50值通过本文进一步的描述和实施例而变得清楚。
[0547] 确定IC50的测定包括在ELISA中的结合，或更优选地，在细胞毒性测定中，如在Frank等.(The Journal of infectious diseases(传染病杂志)186:64-73,2002),Vance等.(Infection and Immunity(传染和免疫性)73:1706-1713,2005),El Solh等.(Am.J.Respir.Crit.Care Med.178:513-519,2008)所述的TTSS-依赖性的细胞毒性测定中，在该测定的修改版本(诸如例如在实施例4.4中所述)，或在如实施例7.2所述的使用人肺表皮细胞(A549细胞)的细胞毒性测定中及其修改版本中的结合。
[0548] 例如，在使用平均MOI为12的P3X63细胞作为靶标的TTSS-依赖性细胞毒性测定中，本发明的二互补位多肽可以具有0.01nM至50nM，0.01nM至10nM，优选0.01nM至5nM，更优选0.01nM至1nM，诸如0.01nM至0.1nM或更小的IC50值。
[0549] 除此之外和/或另外，在所述TTSS-依赖性的细胞毒性测定中，本发明的二互补位多肽具有100％的功效(％抑制；参见实施例4.4)。
[0550] 此外，本发明的二互补位多肽在存在弹性蛋白酶时表现为稳定的并且保持功能性。
[0551] 在存在铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的条件下24小时后，本发明的二互补位多肽功效上可以具有最大10倍、优选最大5倍、如3倍、2倍、1倍或更低的减少。在存在人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的条件下24小时后，本发明的二互补位多肽功效上可以具有最大100倍、优选最大30倍、如15倍、10倍、5倍、3倍、2倍或更低的减少。
[0552] 在另一个优选的方面中，本发明的多肽是三互补位多肽。术语“三互补位”(抗原-)结合分子或“三互补位”多肽用在本文中应该意指包含针对PcrV的“第一”免疫球蛋白单可变结构域，针对PcrV的“第二”免疫球蛋白单可变结构域，进而针对PcrV的“第三”免疫球蛋白单可变结构域，其中这些“第一”、“第二”和“第三”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，所述三互补位多肽包含三种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域或由三种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域组成，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域是针对PcrV上的第一表位，“第二”免疫球蛋白单可变结构域是针对PcrV上不同于PcrV上第一表位的第二表位，并且“第三”免疫球蛋白单可变结构域是针对PcrV上不同于PcrV上第一和第二表位的第三表位。
[0553] 在本发明的多互补位多肽中存在的两种以上的免疫球蛋白单可变结构域可以由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)组成或由重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成；其可以由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或者由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。在一个优选的方面中，其由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)组成,由"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH)组成。所述两种以上的免疫球蛋白单可变结构域由部分或完全人源化的纳米抗体或部分或完全人源化的VHH组成。在本发明的优选方面中，包含在本发明的多互补位多肽中的免疫球蛋白单可变结构域是一种或多种本发明的单价多肽，如本文定义。
[0554] 在本发明的优选方面中，在本发明的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中存在的第一免疫球蛋白单可变结构域和第二免疫球蛋白单可变结构域彼此不(交叉)竞争与PcrV的结合，并且因此，属于不同的表位库。因此，本发明涉及包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽，其中每种免疫球蛋白单可变结构域属于不同的表位库。因此，本发明这一优选的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的第一免疫球蛋白单可变结构域不交叉阻断本发明的这一优选的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合和/或第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合不被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
[0555] 已经在本发明的单价多肽中鉴定了不同的表位库(1至3)(见表B-4和B-10)。因此，本发明涉及包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域的多互补位多肽，其中每种免疫球蛋白单可变结构域属于本文定义的不同的表位库。在一个优选的方面中，在本发明的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中考虑下述两种以上免疫球蛋白单可变结构域的组合：
[0556]
[0557] 用于本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中的优选的免疫球蛋白单可变结构域是属于相应的表位库的本发明的单价多肽(如上文所述)。在另一个优选的方面中，本发明的多互补位多肽选自SEQ ID NOs:124-141中的任一种。
[0558] 用于本发明的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中的免疫球蛋白单可变结构域的优选的组合为：
[0559] -属于表位库1和2的免疫球蛋白单可变结构域；
[0560] -属于表位库3和1的免疫球蛋白单可变结构域；
[0561] -属于表位库3和2的免疫球蛋白单可变结构域。
[0562] 用于本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的优选的免疫球蛋白单可变结构域是属于相应的表位库的本发明的单价多肽(如上文所述)。在优选的方面中，第一免疫球蛋白单可变结构域属于表位库3，并且优选是SEQ ID NO:12。在另一个优选的方面中，第二免疫球蛋白单可变结构域属于表位库2，并且优选是SEQ ID NO:1。在另一个优选的方面中，本发明的多互补位多肽选自SEQ ID NOs:129,134和137中的任一项。
[0563] 在另一方面，在本发明的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中存在的第一免疫球蛋白单可变结构域和第二免疫球蛋白单可变结构域属于相同的表位库。因此，本发明涉及包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域的多互补位(优选二互补位或三互补位)的多肽，其中两种免疫球蛋白单可变结构域属于相同的表位库。尽管这些免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位，但是，这些免疫球蛋白单可变结构域结合紧密相关的和/或重叠的表位，并且，因此，彼此(交叉)竞争与PcrV的结合。因此，本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的第一免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的第二免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合和/或第一免疫球蛋白单可变结构域与PcrV的结合被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
[0564] 在优选方面中，在本发明所述的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽中存在的免疫球蛋白单可变结构域属于本文定义的表位库(1-3)(参见表B-4和B-10)。因此，本发明涉及包含两种以上免疫球蛋白单可变结构域的多互补位多肽，其中两种免疫球蛋白单可变结构域属于本文定义的相同的表位库。
[0565] 用于本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的优选的免疫球蛋白单可变结构域是本发明属于相应的表位库的单价多肽(如先前所述)。在另一个优选的方面中，本发明的多互补位多肽选自SEQ ID NOs:118-123中的任一种。
[0566] 用于本发明的多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的优选的组合为：
[0567] -两种属于表位库1的免疫球蛋白单可变结构域；
[0568] -两种属于表位库2的免疫球蛋白单可变结构域。
[0569] 用于本发明的这些多互补位(优选二互补位或三互补位)多肽的优选的免疫球蛋白单可变结构域是本发明属于相应的表位库的单价多肽(如先前所述)。在一个优选的方面中，在本发明的多互补位多肽中存在的两种免疫球蛋白单可变结构域属于表位库1，并且所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域中的一种优选是SEQ ID NO:3。本发明优选的多互补位多肽包括SEQ ID NOs:118,120和121。在另一个优选的方面中，在本发明的多互补位多肽中存在的两种免疫球蛋白单可变结构域属于表位库2，并且所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域中的一种优选是SEQ ID NO:1。本发明优选的多互补位多肽包括SEQ ID NOs:122和123。
[0570] 本发明的多肽
[0571] 本发明的单价多肽和本发明的多价(多互补位)多肽可以进一步包含或可以不进一步包含一种或多种其他基团、残基、结构部分或结构单位(这些单价多肽以及多价(多互补位)多肽(具有或不具有另外的基团、残基、结构部分或结合单元)均称为“本发明的多肽”)。如果存在，所述其他基团、残基、结构部分或结合单元可以为或可以不为所述免疫球蛋白单可变结构域(和/或为其存在于其中的多肽)提供其他的官能性，并且可以改变或可以不改变所述免疫球蛋白单可变结构域的特性。
[0572] 例如，所述其他基团、残基、结构部分或结合单元可以是一个或多个额外的氨基酸序列，以致所述多肽是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单元是选自由下列各项组成的组的免疫球蛋白单可变结构域：结构域抗体，适合于用作结构域抗体的氨基酸，单结构域抗体，适合于用作单结构域抗体的氨基酸，“dAb”’s，适合于用作dAb的氨基酸序列或纳米抗体(诸如例如，VHH，人源化的VHH)。
[0573] 如上文所述，可以连接另外的结合单元，诸如具有不同抗原特异性的免疫球蛋白单可变结构域，以形成多特异性多肽。通过组合两种以上特异性的免疫球蛋白单可变结构域，可以形成双特异性的、三特异性的构建体等。例如，本发明所述的多肽可以包含一种、两种以上针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域，和一种针对另一种靶标的免疫球蛋白单可变结构域。本领域技术人员容易想到的所述构建体及其修饰均包括在本文所用的术语“本发明的多肽”内。
[0574] 在上述多肽中，所述一种、两种以上免疫球蛋白单可变结构域和所述一种或多种基团、残基、结构部分或结合单元可以直接彼此连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔臂连接。例如，当所述一种或多种基团、氨基、结构部分或结合单元是氨基酸序列时，所述接头也可以是氨基酸序列，由此所产生的多肽是融合(蛋白)或融合(多肽)。
[0575] 所述一种或多种其他基团、残基、结构部分或结合单元可以是任意适当的和/或需要的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以转变、改变或另外影响或可以不转变、改变或另外影响本发明的多肽的(生物学)特性，并且可以为或可以不为本发明的多肽增加另外的官能性。优选地，所述另外的氨基酸序列是这样的，以致其赋予本发明的多肽一种或多种需要的特性或官能性。
[0576] 此类氨基酸序列的实例是技术人员所清楚的，并且通常可以包括用在基于常规抗体及其片段(包括，但不限于，ScFv’s和单结构域抗体)的肽融合体中的所有的氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson的综述(Nature Biotechnology(自然生物技术)23:1126-1136，2005)。
[0577] 例如，此类氨基酸序列可以是与本发明的多肽本身相比增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少免疫原性或毒性，消除或减弱不理想的副作用，和/或赋予其他有利的特性和/或减少不理想的特性的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白(例如，参见WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，例如，参见WO 98/22141)。
[0578] 在本发明的一个具体的方面中，制备与相对应的本发明的多肽相比具有增加的半衰期的多肽。包含此类延长半衰期的结构部分的本发明的多肽的实例例如包括但不限于，这样的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(如(人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个能够与血清蛋白结合的结合单元(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸，“dAb”’s，适合用作dAb的氨基酸，或纳米抗体)，其可以结合血清蛋白(如血清白蛋白(如人血清白蛋白))、血清免疫球蛋白(如IgG)、转铁蛋白或WO 04/003019中列出的其他血清蛋白中的一种；包括这样的多肽，其中免疫球蛋白单可变结构域连接Fc部分(如人Fc)或其适当的部分或片段；或包括这样的多肽，其中所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如，但不限于，WO 91/01743，WO 01/45746或WO 02/076489中所述的蛋白和肽)。也参考WO 03/002609和WO 04/003019中所述的dAb’s和Harmsen等(Vaccine(疫苗)23:4926-42，2005)；参考EP0368684，以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 08/028977、WO 08/043821、WO08/043822，和WO 08/068280。
[0579] 按照本发明的一个具体的而非限制性的方面，除了所述两个以上本发明的针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽之外，本发明的多肽可以包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米抗体。这些针对人血清白蛋白的纳米抗体可以如上文引用的埃博灵克斯股份有限公司的申请中一般所述(例如，参见WO 04/062551)。提供增加的半衰期并且可以用在本发明的多肽中的一些特别优选的纳米抗体包括WO 06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表II和III)，其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO:62)是特别优选的，以及WO 2012/175400中公开的纳米抗体(WO 2012/175400中的SEQ ID NOs:1-11)。
[0580] 例如，本发明的多肽可以是三价、双特异性多肽，其包含两种针对PcrV的免疫球蛋白单可变结构域，优选本发明的单价多肽，和针对(人)血清白蛋白的第三免疫球蛋白单可变结构域，其中所述第一、第二和第三免疫球蛋白单可变结构域可以任选地通过一个或多个、并且特别是两个接头序列连接。
[0581] 按照一个具体的方面，本发明的一种或多种多肽可以与一个或多个恒定结构域(例如，2个或3个可以用作Fc部分的一部分和/或形成Fc部分的恒定结构域)、Fc部分和/或一个或多个抗体部分、片段或结构(其赋予本发明的多肽一种或多种效应子功能和/或可以赋予结合一种或多种Fc受体的能力)连接(任选地通过适当的接头或铰链区)。例如，为了这一目的，并且不限于此，所述一种或多种其他氨基酸序列可以包含抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，诸如来源于重链抗体(如本文所述)，并且更优选地来源于常规4链抗体；和/或可以形成Fc区(的部分)和Fc区，例如，来源于IgG(例如，来源于IgG1,IgG2,IgG3或IgG4)，来源于IgE或来源于另一种人Ig，诸如IgA,IgD或IgM。例如，WO 94/04678记述了包含骆驼科动物VHH结构域或其人源化衍生物(即，纳米抗体)的重链抗体，其中骆驼科动物CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域替代，以提供由2条重链组成的免疫球蛋白，其中每条重链包括纳米抗体和人CH2与CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由所述CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在无需任何轻链的存在下行使功能。专业技术人员应该清楚可以适当与本发明的多肽连接以提供效应子功能的其他氨基酸序列，并且可以基于所需要的效应子功能进行选择。
例如，参考WO 04/058820,WO 99/42077，WO 02/056910和WO 05/017148,以及Holliger和Hudson,同前所述的综述；和参考WO 09/068628。与相对应的本发明的多肽相比，本发明的多肽与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。专业技术人员应该清楚具有增加的体内半衰期的包括一个或多个本发明的多肽和一个或多个恒定结构域的其他适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域连接的多肽，其任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
例如，参考WO 04/058820,WO 99/42077，WO 02/056910和WO 05/017148,以及Holliger和Hudson,同前所述的综述；和参考WO 09/068628。与相对应的本发明的多肽相比，本发明的多肽与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。专业技术人员应该清楚具有增加的体内半衰期的包括一个或多个本发明的多肽和一个或多个恒定结构域的其他适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域连接的多肽，其任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
[0582] 在另一个具体的但非限制性的方面中，本发明的多肽可以与具有减少的(或基本上没有)自我缔合成二聚体的倾向(即，与在常规4-链抗体中天然存在的恒定结构域相比较)的天然存在的、合成的或半合成的恒定结构域(或其类似物、变体、突变体、部分或片段)连接(任选地通过适当的接头或铰链区)。所述单体(即，无自我缔合的)Fc链变体，或其片段，是专业技术人员所清楚的。例如，Helm等(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271:7494,1996)描述了可以用于本发明的多肽链中的单体Fc链变体。
[0583] 此外，所述单体Fc链变体优选是这样的，以致它们仍然能够结合补体或相关的Fc受体(取决于它们所来源的Fc部分)，和/或是这样的，以致它们仍然具有它们所来源的Fc部分的一些或全部的效应子功能(或处于仍然适用于目的用途的减少的水平)。备选地，在这样的本发明的多肽链中，单体Fc链可以用来赋予所述多肽链增加的半衰期，在这种情形中，所述单体Fc链还可以不具有或基本上不具有效应子功能。
[0584] 一般地，具有增加的半衰期的本发明的多肽优选地具有是相对应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多于20倍的半衰期。
[0585] 一般地，与相对应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身相比较，所述具有增加的半衰期的本发明的多肽优选具有增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
[0586] 在另一个优选而非限制性方面中，本发明的此类多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
[0587] 所述其他氨基酸残基可以转变、改变或者另外影响或者可以不转变、改变或者另外影响本发明的多肽的其他(生物学)特性，并且可以为或者可以不为本发明的多肽添加另外的官能性。例如，所述氨基酸残基：
[0588] a)可以包括N-端Met残基，例如，由于在异源宿主细胞或宿主生物体内表达所致；
[0589] b)可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述多肽从宿主细胞中分泌(例如，取决于用于表达本发明的多肽的宿主细胞，提供本发明的多肽的前-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式)。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与本发明的多肽的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
[0590] c)可以形成“标签”，例如允许或促进所述多肽的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供所述多肽(为了这一目的，所述标签可以任选地通过可裂解的接头序列与所述氨基酸序列或多肽序列连接或包含可裂解的基序)。此类残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽残基以及myc-标签如AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQ ID NO:206)；
[0591] d)可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
[0592] 本发明的多价(如二互补位或三互补位)多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法至少包括将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽适当与本发明的一种或多种其他的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽连接的步骤(任选地通过一种或多种适当的接头)，以提供本发明的多价多肽。本发明的多肽也可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，并且回收所表达的本发明的多肽。所述方法可以以本身已知的方式进行，所述方式是技术人员所清楚的，例如，基于本文进一步所述的方法和技术。
[0593] 用于制备本发明的多互补位多肽的方法可以至少包括下述步骤：以适当的方式将两种以上本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽和例如一种或多种接头连接在一起。本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(以及接头)可以通过本领域已知的和本领域进一步所述的任何方法偶联。优选的技术包括连接编码本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(以及接头)的核酸序列，从而制备表达所述多互补位多肽的遗传构建体。用于连接氨基酸或核酸的技术是技术人员所清楚的，并且同样参考标准手册，如上文提及的Sambrook等和Ausubel等，以及下述实施例。
[0594] 因此，本发明还涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽在制备本发明的多价、优选多互补位多肽中的应用。用于制备多价多肽的方法包括将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽与本发明的至少一种其他免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽连接(任选地通过一种或多种接头连接)。然后，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽用作结合结构域或结合单元以提供和/或制备包含两个(例如，二价多肽)、三个(例如，三价多肽)或更多个(例如，多价多肽)结合单元的多价、优选多互补位多肽。在这一方面，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽可以用作结合结构域或结合单元以提供和/或制备包含两个、三个或更多个结合单元的本发明的多价(优选多互补位)如二价(优选二互补位)或三价(优选三互补位)多肽。
[0595] 因此，本发明还涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或特别是单价多肽(如本文所述)在制备多价、优选多互补位多肽中的应用。用于制备所述多价、优选多互补位多肽的方法包括将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽与本发明的至少一种其他免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽连接(任选地通过一个或多个接头连接)。
[0596] 用于本发明的多价、优选多互补位多肽的适当的间隔体或接头是技术人员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任意的接头或间隔体。优选地，所述接头或间隔体适于用于构建意欲药用的多肽。
[0597] 一些特别优选的间隔体包括本领域中用来连接抗体片段或抗体结构域的间隔体和接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提到的接头，以及例如，本领域用来构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该具有某种长度、某种程度的柔性以及允许相关的VH和VL结构域靠近在一起形成完整的抗原-结合位点的其他特性，但是，由于每一免疫球蛋白单可变结构域本身形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特别的限制)。
[0598] 例如，接头可以是适当的氨基酸序列，并且特别是1-50、优选1-30、诸如1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如，(glyxsery)z型的，诸如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO 99/42077中所述，铰链样区域如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列(如在WO 94/04678中所述)。
[0599] 一些其他特别优选的接头在表A-8中提及，其中GS40(SEQ ID NO:193)是特别优选的。
[0600] 其他适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)结构部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
[0601] 下列情形也包括在本发明范围内，所用的接头的长度、柔性程度和/或其他特性(尽管不是关键的，由于它通常是用在ScFv片段中的接头)可以对本发明最终的多肽的特性具有一些影响，所述特性包括但不限于针对PcrV或针对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
[0602] 下列情形也在本发明范围内：所用的接头赋予本发明的多肽一种或多种其他有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的多肽的衍生物所述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水特性，而形成或包含小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
[0603] 最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
[0604] 通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽将是线性多肽。然而，本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，当本发明的多肽包括三个或更多个氨基酸序列或纳米抗体时，可以利用具有三个或更多个“臂”的接头连接它们，所述每个“臂”与氨基酸序列或纳米抗体连接，以提供“星形”的构建体。尽管通常较不优选，但是还可以使用环形的构建体。
[0605] 本发明还包括融合的免疫球蛋白序列，其包含标签或其他功能性结构部分，例如，毒素、标记、放射性化学试剂等。
[0606] 备选地，例如，所述另外的基团、残基、结构部分或结合单元可以是化学基团、残基，其本身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以与所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽连接，以提供本发明的多肽的“衍生物”。
[0607] 因此，本发明在其最广泛意义上还包括本发明的多肽的衍生物。所述衍生物通常可以通过修饰、特别是通过化学和/或生物学(例如，酶促)修饰本发明的多肽和/或形成本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基而获得。
[0608] 专业技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及多肽序列中可以以这样的方式(即，在蛋白骨架上但是优选地在侧链上)修饰的氨基酸残基的实例，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。
[0609] 例如，所述修饰可以包括向本发明的多肽中或向本发明的多肽上引入(例如，通过共价连接或以任何其他适当的方式)一个或多个官能团、残基或结构部分，并且，特别是引入一个或多个赋予本发明的多肽一种或多种需要的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或结构部分。专业技术人员应该清楚所述官能团的实例。
[0610] 例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其他适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的多肽的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的多肽的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽其他的有利特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性；或者两种或更多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为专业技术人员清楚，并且通常可以包括上文引用的综合背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考Remington(Pharmaceutical Sciences(药物科学),第16版,Mack出版公司,Easton,PA，1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的多肽上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂连接，这也为专业技术人员所清楚。
[0611] 一个具体的实例是本发明的衍生物多肽，其中本发明的多肽已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化)。这是用于增加药物蛋白的半衰期和/或减少免疫原性的最广泛应用的一种技术，并且包括连接适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考Chapman(Nat.Biotechnol.(自然生物技术)54：531-545，2002)；Veronese和Harris(Adv.Drug Deliv.Rev.(高级药物递送综述)54：453-456，
2003),Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.(自然药物发现综述)2:214-221,2003)以及在WO 04/060965。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治疗公司(Nektar Therapeutics)购得。
2003),Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.(自然药物发现综述)2:214-221,2003)以及在WO 04/060965。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治疗公司(Nektar Therapeutics)购得。
[0612] 优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等(Protein Engineering(蛋白工程)16:761-770,2003)。例如，为了这一目的，PEG可以附着到在本发明的多肽中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的多肽可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包含一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的多肽的N-和/或C-端，这些均使用本身为专业技术人员所了解的蛋白工程技术。
[0613] 优选地，对于本发明的多肽，使用具有分子量大于5000，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的PEG。
[0614] 另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为表达本发明的多肽所用的宿主细胞。
[0615] 另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其他信号-产生基团或结构部分，其取决于所标记本发明的多肽的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是专业技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺152
和荧光金属诸如 Eu或其他来自镧系的金属)，磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓(acridinium)酯、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、
3 125 32 35 14 51 36 57
二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性-同位素(诸如 H, I, P, S, C, Cr, Cl, C
58 59 75 99m 123 111
o, Co, Fe和 Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如 Tc, I, In,
131 97 67 67 68
I, Ru, Cu, Ga和 Ga，或其他特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属
157 55 162 52 56
阳离子，诸如( Gd, Mn, Dy, Cr和 Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他适宜的标记为专业技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的结构部分。
和荧光金属诸如 Eu或其他来自镧系的金属)，磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓(acridinium)酯、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、
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二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性-同位素(诸如 H, I, P, S, C, Cr, Cl, C
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o, Co, Fe和 Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如 Tc, I, In,
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I, Ru, Cu, Ga和 Ga，或其他特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属
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阳离子，诸如( Gd, Mn, Dy, Cr和 Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他适宜的标记为专业技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的结构部分。
[0616] 例如，取决于特定的标记的选择,这样标记的本发明的多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如ELISA,RIA,EIA和其他“夹心式检测”等)，以及体内诊断和成像目的。
[0617] 专业技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
[0618] 另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的多肽与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的多肽可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的本发明的多肽可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的多肽与载体结合，所述载体包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh(Journal of Drug Targetting(药物靶向杂志)8:257,2000)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的多肽结合。
[0619] 专业技术人员应该清楚其他潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考Lundblad和Bradshaw(Biotechnol.Appl.Biochem.(生物技术和应用生物化学),26:143-151,1997)。
[0620] 优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本文限定的(即，如关于本发明的多肽所限定的)亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的),KA-值(实际的或表观的),k结合-速率和/或k解离-速率,或备选地为IC50值,如本发明进一步所述)与PcrV结合。所述衍生物通常还具有本文定义的PcrV中和功效和/或效力。
[0621] 所述本发明的多肽及其衍生物还可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在。
[0622] 本发明还涉及用于制备本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
[0623] 本发明的多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，专业技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
[0624] 用于制备本发明的多肽的方法通常包括下述步骤：
[0625] -在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，[0626] 任选地接着：
[0627] -分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
[0628] 特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
[0629] -在下述条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以使所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的多肽；
[0630] 任选地接着：
[0631] -分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
[0632] 因此，本发明还涉及编码本发明的多肽的核酸或核苷酸序列(还称为“本发明的核酸”)。本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
[0633] 根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。本发明的核酸还可以是载体的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
[0634] 基于本文给出的关于本发明的多肽的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，和/或可以从适当的天然来源分离。此外，专业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少两种编码本发明的免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
[0635] 用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动化DNA合成；位点定向诱变；将两个以上天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使用一个或多个“错配”引物的PCR反应引入突变。这些以及其他技术应该是专业技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
[0636] 本发明的核酸还可以是遗传构建体的形式，存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与一个或多个本身已知的遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子等等)和本文提到的其他遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
[0637] 本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
[0638] 在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括：
[0639] a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
[0640] b)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
[0641] 并且任选地还有
[0642] c)一个或多个本身已知的其他遗传构建体元件；
[0643] 其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其他元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其他适宜的元件对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体的类型；要用的宿主细胞或宿主生物体；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
[0644] 优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其他元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
[0645] 优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其他元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
[0646] 例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列――例如，编码序列――的转录和/或表达。
[0647] 一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
[0648] 选择标记应该是这样的，即，其允许――即，在适当的选择条件下――已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
[0649] 前导序列应该是这样的，以致――在要用的宿主细胞或宿主生物体中――其允许理想的翻译后修饰和/或以使其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上相似的方式使用。
[0650] 表达标记或报道基因应该是这样的，即，――在宿主细胞或宿主生物体中――其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列或多肽融合的蛋白融合体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白，如GFP。
[0651] 适宜的启动子、终止子和其他元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本文提及的那些和/或在下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其他元件的一些(其他)非限制性的实例――诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子――参考上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO 95/07463,WO 96/23810,WO95/07463,WO95/21191,WO 97/11094,WO 97/42320,WO 98/06737,WO98/21355,US7,207,410,US5,693,4
92和EP1085089中给出的实例。其他实例对于专业技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其他参考文献。
92和EP1085089中给出的实例。其他实例对于专业技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其他参考文献。
[0652] 本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其他元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
[0653] 通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。
[0654] 本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的多肽。适当的宿主或宿主细胞是专业技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或(非人)真核的生物体，例如：
[0655] -细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株,例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
[0656] -真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌属(Neurospora),例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪 壳 属(Sordaria),例 如 大 孢 粪 壳 (Sordaria macrospora)；曲 霉 菌(Aspergillus),例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其他丝状真菌；
[0657] -酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例 如 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)；裂 殖 酵 母 属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula,例如Arxula adeninivorans；亚罗酵母属(Yarrowia)，例如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；
[0658] -两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
[0659] -昆虫来源的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
[0661] -哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
[0662] 以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其他宿主细胞或(非人)宿主，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等(Res Immunol.(免疫学研究)149:589-99，1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，同 前 所 述；van der Linden(J.Biotechnol.(生 物 技 术 杂志)80:261-70，2000)；Joosten等.(Microb.Cell Fact.2:1，2003)；Joosten等 .(Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物生物技术)66:384-92，2005)；以及本文所引用的其他参考文献。
[0663] 本发明的多肽也可以表达为所谓的“内抗体(intrabodies)”，如例如在WO 94/02610，WO 95/22618和 US7,004,940；WO 03/014960中 所 述；在 Cattaneo 和Biocca(“Intracellular Antibodies:Development and Applications(细胞内抗体：开发和应用)”Landes和Springer-Verlag，1997)中；以及在Kontermann(Methods(方法)34:163-170，2004)中所述。
[0664] 例如，本发明的多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如
US6,741,957,US6,304,489和US6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中。
US6,741,957,US6,304,489和US6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中。
[0665] 此外，本发明的多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是专业技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
[0666] 优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是专业技术人员所清楚的。专业技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
[0667] 对于工业规模的生产，用于免疫球蛋白单可变结构域或包含免疫球蛋白单可变结构域的多肽治疗剂的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是专业技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala,瑞典)获得。
[0668] 备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
[0669] 具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含免疫球蛋白单可变结构域的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，专业技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统都可以用于本发明，这取决于要获得的理想的多肽。
[0670] 因此，根据本发明的一个非限制性的实施方案，本发明的多肽被糖基化。根据本发明的另一个非限制性的实施方案，本发明的多肽未被糖基化。
[0671] 根据本发明的一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
[0672] 根据本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
[0673] 根据本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
[0674] 当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的多肽时，本发明的多肽可以在细胞内产生(例如，在胞质中，在周质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的多肽的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到周质空间。周质生产相对于胞质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，与在细胞质中相比，在周质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在周质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于周质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于胞质中或在周质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠过程。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，专业技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的多肽。
[0675] 因此，根据本发明的一个非限制性的实施方案，本发明的多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的多肽。根据本发明的另一个非限制性的实施方案，本发明的多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的多肽。
[0676] 与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括:
[0677] -用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其他T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵基因序列；
[0678] -用于在酿酒酵母中表达：组成型:ADH1(醇脱氢酶1),ENO(烯醇化酶),CYC1(细胞色素c异-1),GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶),PYK1(丙酮酸激酶)；调节型:GAL1,10,7(半乳糖代谢酶),ADH2(醇脱氢酶2),PHO5(酸性磷酸酶),CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型:CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
[0679] -用于在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达:AOX1启动子(醇氧化酶I)；
[0680] -用于在哺乳动物细胞中表达:人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以使所述启动子可以受Tet抑制剂调节；单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
[0681] 与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
[0682] -用于在哺乳动物细胞中表达的载体:pMAMneo(Clontech),pcDNA3(Invitrogen),pMC1neo(Stratagene),pSG5(Stratagene),EBO-pSV2-neo(ATCC37593),pBPV-1(8-2)(ATCC37110),pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224),pRSVgpt(ATCC37199),pRSVneo(ATCC37198),pSV2-dhfr(ATCC37146),pUCTag(ATCC37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
[0683] -用于在细菌细胞中表达的载体:pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
[0684] -用于在酵母或其他真菌细胞中表达的载体:pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
[0685] -用于在昆虫细胞中表达的载体:pBlueBacII(Invitrogen)和其他杆状病毒载体；
[0686] -用于在植物或植物细胞中表达的载体:例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
[0687] 与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
[0688] -用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB,Bla,OmpA,OmpC,OmpF,OmpT,StII,PhoA,PhoE,MalE,Lpp,LamB等；TAT信号肽,溶血素C-端分泌信号；
[0689] -用于酵母:α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)，磷酸酶(pho1),转化酶(Suc),等；
[0690] -用于哺乳动物细胞:在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenous signal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
[0691] 用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对专业技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
[0692] 转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的多肽的步骤，例如，使用特异性抗体进行。
[0693] 转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
[0694] 优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
[0695] 为了生产/获得本发明的多肽的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对专业技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
[0696] 一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由专业技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的多肽可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
[0697] 专业技术人员还应该清楚，本发明的多肽可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
[0698] 然后，本发明的多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的多肽的抗体)进行。
[0699] 本发明的组合物
[0700] 本发明还涉及一种产品或组合物，其包含或包括至少一种本发明的多肽，和/或至少一种本发明的核酸，以及任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其他成分，即，这取决于所述组合物的目的应用。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或用于诊断应用的产品或组合物(也如本文所述)。通过本文的进一步描述，所述产品或组合物的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
[0701] 通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。所述适宜的给药形式――取决于给药的方式，其可以是固体、半固体或液体――以及制备其所用的方法和载体，对专业技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
[0702] 因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的多肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及任选地一种或多种其他活性物质。在具体的方面中，本发明涉及包含选自SEQ ID NOs:118-141中的任一项的本发明的多肽和至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)和任选地一种或多种其他活性物质的药物组合物。
[0703] 通常，本发明的多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术(并且特别参见WO 04/041862,WO04/041863,WO 04/041865，WO 04/041867和WO08/020079)，以及参见标准手册，诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),第18版,Mack出版公司,美国(1990)，Remington,the Science and Practice of Pharmacy(制药科学和实践),第21版,Lippincott Williams和Wilkins(2005)；或治疗性抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(例如，参见第252-255页)。
[0704] 例如，本发明的多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其他药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于专业技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)的制剂。
[0705] 例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于WO 08/020079第143页提到的那些。通常，水溶液或混悬液是优选的。
[0706] 本发明的多肽可以通过输注或注射静脉内或腹膜内给药。本发明的多肽的溶液可以在水中制备，任选地与非毒性的表面活性剂混合。还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精以及它们的混合物和在油中制备分散液。在普通存储和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
[0707] 适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌水溶液或分散液或无菌粉剂，所述活性成分适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散液，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，最终剂型在制备和存储条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体或赋形剂(vehicle)可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)，植物油，无毒甘油酯，以及它们的适当的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散液的情形中通过维持所需要的粒度，或通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过多种抗细菌和抗真菌剂获得。例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
[0708] 无菌注射溶液通过将需要量的本发明的多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的几种其他成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何另外的需要的成分的粉剂。
[0709] 在一个优选的方面中，本发明的多肽和/或包含其的组合物施用至肺部组织。在本发明的情形中，“肺部组织”与肺组织或肺等价用于本发明的目的。肺包括2个不同的区：传导和呼吸区，在其内部存在呼吸和血管隔室(例如，参见“Pulmonary Drug Delivery(肺部药物递送)”,由Karoline Bechtold-Peters和Henrik Luessen编,ISBN978-3-87193-3
22-6pp.16-28,2007)。
22-6pp.16-28,2007)。
[0710] 对于肺部递送，本发明的多肽可以以纯的形式应用，即，当其为液体或干粉时。然而，应该优选地将其作为包含本发明的多肽和适于肺递送的载体的组合物或制剂施用至肺部组织。因此，本发明还涉及包含本发明的多肽和适于肺部递送的载体的药物组合物。适于肺部递送的载体在本领域中是已知的。
[0711] 本发明的多肽还可以作为纯药物的微粒或纳米粒进行施用，其具有有利于肺部递送的粒度和分布。
[0712] 因此，本发明还涉及适于肺部递送本发明的多肽和适于包含其的组合物的使用的药物装置。该装置可以是用于包含本发明的多肽的液体的吸入器(例如，精细固体颗粒或小滴的混悬液)。优选地，该装置是包含本发明的多肽的气雾剂、喷雾器定量吸入器。所述装置还可以是包含干粉形式的本发明的多肽的干粉吸入器。
[0713] 在优选的方法中，肺部组织的给药通过吸入以气雾剂雾状物形式存在的本发明的多肽和/或包含其的组合物而进行。按照本发明，吸入气雾剂雾状物可以通过吸入器装置进行。该装置应该在哺乳动物吸入循环的适当时刻由包含本发明的多肽(和/或包含其的组合物)的制剂产生需要粒度(分布)的气雾剂雾状物，所述气雾剂雾状物包含正确剂量的本发明的多肽(“Pulmonary drug delivery(肺部药物递送)”，Bechtold-Peters和Luessen编,ISBN978-3-87193-322-6,第125页,2007)。
[0714] 在本发明的情形中，“气雾剂”表示精细固体颗粒或液态液滴(或它们的组合)在气体中的混悬物，其中，为了本发明的目的，所述颗粒和/或液滴包含本发明的多肽。
[0715] 所述装置应该在哺乳动物吸入循环的适当时刻由所述制剂产生需要粒度(分布)的气雾剂雾状物，所述气雾剂雾状物包含正确剂量的本发明的多肽。
[0716] 例如，在综述(“Pulmonary drug delivery(肺部药物递送)”，Bechtold-Peters和Luessen编，同前所述)第129-148页记述了多种吸入系统，并且其包括，但不限于，喷雾器，定量吸入器，定量液体吸入器，和干粉吸入器。也可以使用考虑优化的和个体化的呼吸模式而用于可控的吸入操作法的装置(参见“Pulmonary drug delivery(肺部药物递送)”，Bechtold-Peters和Luessen编，同前所述，第157页上的 技术)。
[0717] 然而，不仅装置对于本发明多肽的肺部递送是重要的，而且正确的制剂对于获得有效的递送也是关键的。原则上，这可以通过使用下述方法实现：
[0718] -向鼻腔内施用包含本发明的多肽的水溶液或混悬剂(例如，滴鼻剂)；
[0719] -喷雾包含本发明的多肽的水溶液或混悬剂；
[0720] -通过液化的推进剂雾化；和
[0721] -分散干粉剂。
[0722] 因此，本发明的多肽的制剂必须适合所选的吸入装置或针对所选的吸入装置进行调节。适当的制剂，即，除了本发明的多肽之外的赋形剂，例如，记述在“Pulmonary drug delivery(肺部药物递送)”，Bechtold-Peters和Luessen编，同前所述，第IV章中。在这一方面，还参考WO2010/081856。
[0723] 用于治疗所需要的本发明的多肽的量不仅随所选的特定的多肽而变化，而且随给药途径、治疗的病症的性质和患者的年龄及状况而变化，并且最终由主治医生或临床医生斟酌确定。并且，本发明的多肽的剂量也将是变化的。
[0724] 需要的剂量可以便利地以单次剂量或作为以适当时间间隔给药的分开的剂量存在，例如，作为每天两次、三次、四次或更多次的分剂量(sub-dose)。所述分剂量本身可以进一步细分，例如，细分成多次不连续松散间隔的给药；诸如从吸入器多次吸入。
[0725] 给药方案可以包括长期的、日常治疗。“长期”意指至少两周，并且优选是指数周、数月或数年的持续时间。这一剂量范围的必要的修改可以由本领域普通技术人员仅使用本文的教导给出的常规实验来确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)(Martin,E.W.,ed.4),Mack Publishing Co.,Easton,PA。剂量也可以由个别的医生在任何并发症的情形中进行调整。
[0726] 本发明的多肽的应用
[0727] 本发明还涉及本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。一些优选的但非限制性的应用和用途将通过本文进一步的描述而变得清楚。
[0728] 本发明的多肽和组合物通常可以用于中和铜绿假单胞菌；诸如调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌的传染性，调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌对宿主的定殖，调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌的TTSS毒力，调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌向宿主细胞注入各种外毒素，调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌诱导的宿主细胞膜渗透性的孔介导的增加，调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌诱导的广泛的细胞防御反应和/或调节、抑制和/或预防铜绿假单胞菌诱导的组织损伤性炎症的引发。
[0729] 在一个方面中，与在不存在本发明的多肽的相同条件下的铜绿假单胞菌的传染性相比，本发明的多肽和组合物可以中和至少1％，优选至少5％，如至少10％或至少25％，优选少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％或更多，如100％的铜绿假单胞菌传染性，这以本身已知的任何适当的方式测量，例如，使用本文所述的测定法中的一种(诸如实施例部分所述的TTSS-依赖性的细胞毒性测定)。
[0730] 本发明还涉及用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽，和/或包含其的药物组合物。
[0731] 因此，本发明的多肽和组合物可以用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染。基于本文的公开内容，技术人员应该清楚易受铜绿假单胞菌感染的患者组的实例，并且，例如，其包括(不限于)下述患者组：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，进行手术的患者，患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患者，患有支气管扩张的患者，患有败血症的患者和患有癌症相关的中性粒细胞减少症的患者。
[0732] 因此，本发明还涉及用于预防和/或治疗在下述中的铜绿假单胞菌感染的方法：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种本发明的多肽或本发明的组合物。
[0733] 本发明还涉及本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物组合物中的应用，所述铜绿假单胞菌感染包括但不限于，在下述中的铜绿假单胞菌感染：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症；和/或在制备用于一种或多种本文所述的方法中的药物组合物中的应用。
[0734] 本发明还涉及本发明的多肽或包含其的组合物，其用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染，诸如包括(但不限于)下述中的铜绿假单胞菌感染：在通风器相关性肺炎(VAP)、烧伤受害者、机械通气的患者、囊性纤维化(CF)患者、造血细胞移植患者、骨髓移植患者、手术、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管扩张、败血症、癌症相关的中性粒细胞减少症中的铜绿假单胞菌感染。
[0735] 在本发明的情形中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗感染，而且通常包括减缓或逆转感染的进程，减少感染的严重性和/或持续时间和/或防止感染严重性的进一步增加，以及通常对治疗的患者有益的任意药理学作用。
[0736] 在另一方面中，本发明涉及用于免疫治疗的方法，特别是用于被动免疫治疗的方法，所述方法包括向患有铜绿假单胞菌感染或处于铜绿假单胞菌感染的危险中的受试者施用药物活性量的本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。
[0737] 待治疗的受试者可以是任意温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有铜绿假单胞菌感染或者处于铜绿假单胞菌感染的危险中的人，包括但不限于，易受本文提及的铜绿假单胞菌感染的患者组。
[0738] 因此，通常，本发明所述的多肽和/或包含其的组合物可以以任意适合的方式给药。例如(但不限于)，本发明所述的多肽和包含其的组合物可以鼻内、气管内、通过吸入和/或通过任意其他适当的肺部递送形式进行给药。技术人员知晓用于肺部递送、鼻内递送、气管内和/或通过吸入递送本发明的多肽的方法，并且例如，记述在手册“Drug Delivery:Principles and Applications(药物递送：原理和应用)”(2005)，Binghe Wang,Teruna Siahaan 和 Richard Soltero(Eds.Wiley Interscience(John TMWiley&Sons))；在“Pharmacology PreTest Self-Assessment and Review( 药 理 学TM
PreTest 自我评价和综述)”(第11版)，Rosenfeld G.C.,Loose-Mitchell D.S.；和在“Pharmacology(药 理 学 )”(第 3版 )，Lippincott Williams&Wilkins,New York；
Shlafer M.McGraw-Hill Medical Publishing Division,New York；Yang K.Y.,Graff L.R.,Caughey A.B.Blueprints Pharmacology,Blackwell Publishing中。
PreTest 自我评价和综述)”(第11版)，Rosenfeld G.C.,Loose-Mitchell D.S.；和在“Pharmacology(药 理 学 )”(第 3版 )，Lippincott Williams&Wilkins,New York；
Shlafer M.McGraw-Hill Medical Publishing Division,New York；Yang K.Y.,Graff L.R.,Caughey A.B.Blueprints Pharmacology,Blackwell Publishing中。
[0739] 因此，本发明还涉及用于施用有效量的本发明的多肽和/或包含其的组合物的方法，其中所述方法包括向肺部组织施用所述多肽和/或包含其的组合物的步骤。以这样的方法，所述多肽和/或包含其的组合物可以通过本领域已知的用于肺部递送的方法进行施用，诸如例如，通过使用吸入器(气雾剂、定量吸入器、喷雾器)或鼻内递送装置施用。
[0740] 在本发明的优选方面中，所述多肽结合和/或中和肺部组织中存在的铜绿假单胞菌。优选地，以这样的肺部递送的方法，至少5％，优选至少10％，20％，30％，40％，更优选至少50％，60％，70％，甚至更优选至少80％或更多的本发明的多肽在肺部组织中稳定至少12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时。
[0741] 因此，本发明涉及用于向受试者的肺部组织递送本发明的多肽而不被灭活的方法，所述方法包括向所述受试者肺部施用所述本发明的多肽的步骤。
[0742] 本发明还涉及用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者的肺部组织施用药物活性量的本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。
[0743] 更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗在下述中的铜绿假单胞菌感染的方法：通风器相关性肺炎(VAP)，烧伤受害者，机械通气的患者，囊性纤维化(CF)患者，造血细胞移植患者，骨髓移植患者，外科手术，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，支气管扩张，败血症，癌症相关的中性粒细胞减少症，所述方法包括向有此需要的受试者的肺部组织施用药物活性量的本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。
[0744] 按照适于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的治疗方案施用本发明的多肽和/或包含其的组合物。取决于诸如待治疗的患者组、感染的严重性和/或其症状的严重性、要用的本发明的具体的多肽、具体的给药途径和要用的药物制剂或组合物、患者的年龄、性别、体重、饮食、一般状况的因素以及临床医生公知的类似的因素，临床医生通常能够确定适合的治疗方案。
[0745] 通常，治疗方案包括以一次或多次药物有效的量或剂量施用一种或多种本发明的多肽或一种或多种包含其的组合物。要施用的具体的量或剂量可以由临床医生确定，这同样基于上文提及的因素来确定。
[0746] 通常，为了预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染，并且取决于待治疗的具体的患者组，要用的本发明的多肽的效力，具体的给药途径和所用的具体的药物制剂或组合物，本发明的多肽通常以1克-1微克/kg体重/天的量，优选0.1克-10微克/kg体重/天，更优选0.01克-100微克/kg体重/天，诸如约0.1,0.5,1,2,5或10毫克/kg体重/天的量，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)，或者在一天内作为多次分剂量施用。包含半衰期延长结构部分的本发明的多肽可以以约1毫克-100毫克/kg体重的量，优选1毫克-50毫克/kg体重，诸如约10,15,20或30毫克/kg体重的量每月施用一次或两次。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断，临床医生可以选择偏离这些量。
[0747] 当向肺部组织施用所述多肽和/或包含其的组合物时，治疗方案可以是每天一次或两次，优选每天一次，或每2,3,4,5,6或7天一次。
[0748] 通常，在上述方法中，使用单一的本发明的多肽。然而，组合使用两种以上本发明的多肽也在本发明的范围内。
[0749] 本发明的多肽还可以与一种或多种其他药物活性化合物或成分(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以引起或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其他化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
[0750] 特别地，本发明的多肽可以与其他药物活性化合物或成分组合应用，所述其他药物活性化合物或成分用于或者能够用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染，结果可以获得或可以不获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的，并且包括(不限于)：氨基糖苷类(Aminoglycosides)(妥布霉素(tobramycin),庆大霉素(gentamicin),西梭霉素(sisomycin),阿米卡星(amikacin),奈替米星(netilmicin)),荧光喹诺酮类(Fluoroquinolones)(西他沙星(sitafloxacin),环丙沙星(ciprofloxacin),左氧氟沙星(levofloxacin),氧氟沙星(ofloxacin)),多黏菌素(Polymyxins)(多黏菌素A,多黏菌素B,多黏菌素C,多黏菌素D,多黏菌素E(粘菌素(colistin)；可利迈仙(colimycin))),UDP-N-乙酰葡糖胺-3-烯醇丙酮酰转移酶(UDP-N-acetylglucosamine-3-enolpyruvyltransferase)(NAM；MurA)抑制剂(磷霉素(fosfomycin)),大环内酯类(Macrolides)(阿奇霉素(azithromycin)),噁唑烷酮类(Oxazolidinones)(利奈唑胺(linezolid)),青霉素类(Penicillins)(甲氧西林(methicillin)；羧基青霉素类(Carboxypenicillins):替卡西林(ticarcillin)；脲基类青霉素(Ureidopenicillins):哌拉西林(piperacillin),阿洛西林(azlocillin)),卡巴配能类(Carbapenems)(多利培南(doripenem),比阿培南(biapenem),亚胺培南(imipenem),美罗培南(meropenem),topopenem),头孢菌素类(Cephalosporins)
(头孢他啶(ceftazidime),头孢吡肟(cefepime),氨曲南(aztreonam),头孢比罗
(ceftobiprole),CXA-101(Calixa)),或其他β-内酰胺酶抑制剂，诸如克拉维酸盐(clavulanate),以及β-内酰胺酶抑制剂组合(哌拉西林与三唑巴坦(tazobactam)的组合，替卡西林(ticarcillin)与克拉维酸(clavulanic acid)的组合，亚胺培南与西司他丁(cilastatin)的组合)；或它们任意的组合。
(头孢他啶(ceftazidime),头孢吡肟(cefepime),氨曲南(aztreonam),头孢比罗
(ceftobiprole),CXA-101(Calixa)),或其他β-内酰胺酶抑制剂，诸如克拉维酸盐(clavulanate),以及β-内酰胺酶抑制剂组合(哌拉西林与三唑巴坦(tazobactam)的组合，替卡西林(ticarcillin)与克拉维酸(clavulanic acid)的组合，亚胺培南与西司他丁(cilastatin)的组合)；或它们任意的组合。
[0751] 当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的给药途径或者通过不同的给药途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照交替方案)施用。当所述物质或成分通过相同的给药途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
[0752] 此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以引起或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍然获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍然获得理想的药物或治疗效果。
[0753] 按照本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或病症的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
[0754] 通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。
[0755] 基于本文的公开内容，技术人员应该清楚本发明的多肽、核酸、遗传构建体和宿主和宿主细胞的其他应用。例如，并且不限于，本发明的多肽可以与适当的载体或固体支持物连接，以提供这样的介质，所述介质可以本身已知的方式用于从组合物和包含其的制剂中纯化来自铜绿假单胞菌的PcrV蛋白。包含适当的检测标记的本发明的多肽的衍生物也可以用作标记来确定(定性或定量)铜绿假单胞菌的PcrV蛋白在组合物或制剂中的存在。
[0756] 现在，通过下述非限制性优选的方面、实例和附图的方式进一步描述本发明。
[0757] 贯穿本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考、授权的专利、公布的专利申请和同时待审的专利申请)的全部内容通过引用清楚地结合于此，特别是关于上文提及教导。实施例
[0758] 实施例1材料和方法
[0759] 1.1产生重组PcrV蛋白(rPcrV)
[0760] 将编码参比菌株PAO1的全长PcrV蛋白(氨基酸残基1-294，见表A-1)的基因克隆到内部pUC119来源的表达载体中。该载体包含LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点和pel B前导序列。与rPvrV编码序列符合阅读框，该载体编码C端His6标签。在大肠杆菌(TG-1)中转化后，使表达培养物生长并且通过加入1mM IPTG诱导表达，并允许在37℃持续4小时。通过离心收获细胞，并且通过超声处理裂解细胞沉淀物。通过离心分离胞质部分。在HisTrap FF粗提1ml柱上通过固定化的金属亲和层析(IMAC)从粗提取物中纯化重组蛋白，并且缓冲液交换至D-PBS(HiPrep 26/10柱)中，然后使用Source15Q(2ml CV)柱进行离子交换层析，最后使用Superdex7510/300GL柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)进行凝胶过滤。通过SDS-PAGE和分析型大小排阻验证蛋白的纯度和同质性。
[0761] 1.2产生GST-PcrV蛋白
[0762] 将来自菌株PAO1的PcrV编码序列(氨基酸残基1-294，见表A-1)克隆至表达载体pET42a(+)(EMBBiosciences,Darmstadt,德国)中，产生GST-PcrV遗传融合体。将得到的载体转化至大肠杆菌BL21DE3细胞(Invitrogen)中。按下述由大肠杆菌(BL21DE3)表达并纯化GST-rPcrV融合蛋白。使1升表达GST-PcrV的大肠杆菌培养物批料生长，并且通过加入1mM IPTG诱导表达。在37℃进一步生长3小时后，通过离心沉淀细菌细胞，并且通过超声处理裂解。通过离心澄清裂解物后，使其流过谷胱甘肽琼脂糖柱(GSTrap FF)，然后进行脱盐步骤(HiPrep26/10柱)和使用Source15Q柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)进行另外的离子交换层析步骤。通过SDS-PAGE验证该蛋白的纯度(>90％)和同质性。
[0763] 1.3产生PcrV序列变体
[0764] 为了确定抗-PcrV疗法是否普遍适用于各种铜绿假单胞菌临床分离株，Lynch(Microbial pathogenesis(微生物发病机制)48:197-204,2010)通过对从3个不同的地理区域收集的90个临床分离株的PcrV进行测序确定了PcrV的遗传异质性。以这种方式，他们鉴定了14个不同的PcrV变体(参见表A-1，PcrV变体01–PcrV变体15)。
[0765] 使用相似的方法，将207个临床分离株——在地理上非常广泛的区域收集(Vaneechoutte教授,UGent,比利时)——用来提供另外的关于PcrV的遗传异质性的信息。以这种方式鉴定了八个新型PcrV序列变体(参见表A-1，PcrV变体16–PcrV变体23)。
[0766] 为了产生所有的PcrV序列变体，将编码23个不同的PcrV变体(氨基酸残基1-294，见表A-1)的基因与编码His6标签的基因一起克隆至pET42a(+)载体
(EMBBiosciences,Darmstadt,德国)中，以产生GST–PcrV-His6遗传融合体。按下述，由转化了pET42a(+)-PcrV-His6的大肠杆菌(BL21DE3)表达并纯化GST–PcrV-His6融合蛋白。
培养1升培养物，并且通过加入1mM IPTG诱导表达。在37℃进一步培养3小时后，通过离心沉淀细菌细胞，并且通过超声处理裂解。通过离心使裂解物变清澈后，使其流过GSTrap FF柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)，并且缓冲液交换至D-PBS，之后获得纯蛋白(>90％)。
(EMBBiosciences,Darmstadt,德国)中，以产生GST–PcrV-His6遗传融合体。按下述，由转化了pET42a(+)-PcrV-His6的大肠杆菌(BL21DE3)表达并纯化GST–PcrV-His6融合蛋白。
培养1升培养物，并且通过加入1mM IPTG诱导表达。在37℃进一步培养3小时后，通过离心沉淀细菌细胞，并且通过超声处理裂解。通过离心使裂解物变清澈后，使其流过GSTrap FF柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)，并且缓冲液交换至D-PBS，之后获得纯蛋白(>90％)。
[0767] 1.4产生抗-PcrV Fab分子
[0768] 将编码来自3种Fab分子(即，Fab13.37(WO 2009/073631；SEQ ID NOs:13和37),Fab26.24(WO 2009/073631；SEQ ID NOs:26和24)和Fab35.36(WO 2009/073631；SEQ ID NOs:35和36))的VL和VH的基因片段克隆至内部人IgG1/κFab表达载体中。该载体包含LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、在pelB(轻链)或基因3(重链)前导序列之后的两个分开的克隆位点。与重链编码序列符合阅读框，所述表达载体编码C-端HA标签和His6标签。在大肠杆菌中表达Fab片段，并且在天然、非还原条件下在HisTrap FF粗提
1ml(GE healthcare,Buckinghamshire,英国)上通过固定化的金属亲和层析(IMAC)进行纯化，然后是针对人Fabκ轻链(CaptureSelect LC-kappa(Hu),BAC)的亲和层析和在Superdex7510/300GL柱(GE Healthcare GE healthcare,Buckinghamshire,英国)上进行大小排阻层析或者通过Zeba离心柱(Pierce,Rockford,IL,USA)脱盐。3种Fabs的可变重链和可变轻链的氨基酸序列显示在表A-2中。恒定重链和恒定轻链的氨基酸序列显示在表A-3中。
1ml(GE healthcare,Buckinghamshire,英国)上通过固定化的金属亲和层析(IMAC)进行纯化，然后是针对人Fabκ轻链(CaptureSelect LC-kappa(Hu),BAC)的亲和层析和在Superdex7510/300GL柱(GE Healthcare GE healthcare,Buckinghamshire,英国)上进行大小排阻层析或者通过Zeba离心柱(Pierce,Rockford,IL,USA)脱盐。3种Fabs的可变重链和可变轻链的氨基酸序列显示在表A-2中。恒定重链和恒定轻链的氨基酸序列显示在表A-3中。
[0769] 实施例2：用rPcrV蛋白免疫美洲驼，克隆仅有重链的抗体片段所有组成成分(repertoires)以及噬菌体的制备
[0770] 2.1免疫
[0771] 在兽医医学学院的伦理委员会(University Ghent,比利时)核准后，4头美洲驼(命名为No.504,505,506和507)用4次配制在Stimune(Prionics,Lelystad,荷兰)中的rPcrV蛋白的肌内注射(25或10ug/剂量，两周的时间间隔)免疫。
[0772] 2.2克隆仅有重链的抗体片段的所有组成成分和制备噬菌体
[0773] 在最后一次免疫原注射后，对每头动物收集两份150-mL血液样品，在最后一次抗原注射后4和8天收集。使用Ficoll-Hypaque按照供应商的使用说明(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)从所述血液样品制备外周血单核细胞(PBMCs)。从所述PBMCs提取总RNA，并且用作RT-PCR的起始材料以扩增编码VHH/纳米抗体的DNA片段。通过特定的限制性位点将该PCR-扩增的VHH所有组成成分克隆至设计为促进VHH文库的噬菌体展示的载体中。该载体来源于pUC119，并且包含LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄青霉素或羧苄西林的抗性基因、多克隆位点和杂化的gIII-pelB前导序列。与VHH/纳米抗体编码序列符合阅读框，该载体编码C-端三联Flag标签和His6标签。按照标准流程(例如，参见WO 04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551,WO05/044858以及本文引用的其他现有技术和由埃博灵克斯股份有限公司提交的申请)制备噬菌体，并且在过滤除菌后保存在4℃备用。
[0774] 实施例3：通过噬菌体展示选择PcrV特异性的VHHs
[0775] 以两种选择策略使用获自所有美洲驼并且克隆在噬菌体文库中的VHH所有组成成分。在第一种选择策略中，将rPcrV蛋白(内部制备的，参见实施例1，1.1节)以15ug/ml的浓度固定在Nunc Maxisorp平板上，挨着0ug/ml抗原的阴性对照。在用噬菌体文库温育并彻底洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合的噬菌体。扩增洗脱的噬菌体并且用于在10ug/ml rPcrV和0ug/ml(对照)上的第二轮选择。
[0776] 在第二种选择策略中，50nM和5nM生物素酰化的rPcrV蛋白(bio-rPcrV；按 照 供 应商 的 使 用 说 明 使 用 硫 代-NHS-LC-生 物 素 (Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce,Rockford,IL,USA)生物素酰化)捕获在中性抗生物素蛋白(neutravidin)包被的(1ug/ml)Nunc Maxisorp平板上，挨着仅有中性抗生物素蛋白(1ug/ml)的阴性对照。在用噬菌体文库温育并彻底洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体用来感染大肠杆菌。感染的大肠杆菌细胞用于制备用于在5nM,0.5nM,0.05nM,0.005nM bio-rPcrV和对照(中性抗生物素蛋白1ug/ml)上进行下一轮选择的噬菌体，或涂布在琼脂平板(LB+amp+葡萄糖2％)上用于分析个体VHH克隆。
[0777] 分析所有轮的选择的输出的富集因数(相对于对照，在洗脱物中存在的噬菌体的数目)，并且选择最好的选择条件用于后续分析。为了筛选用于特异性结合剂的选择输出，从琼脂平板上挑取单菌落，并且在1mL96-深孔平板中培养。通过加入IPTG(1mM终浓度)在不存在葡萄糖的条件下诱导LacZ-控制的VHH表达。按照标准流程(例如，参见WO03/035694,WO 04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551以及本文引用的其他现有技术和埃博灵克斯股份有限公司提交的申请)制备周质提取物(体积为～80uL)。
[0778] 实施例4：筛选用于功能性阻断纳米抗体的周质提取物
[0779] 4.1在ELISA中筛选
[0780] 在第一步，通过结合ELISA检测周质提取物与bio-rPcrV的结合。简言之，将10nM bio-rPcrV蛋白捕获在中性抗生物素蛋白(2ug/ml)包被的96孔MaxiSorp平板
(Nunc,Wiesbaden,德国)上。孔用酪蛋白溶液(1％)封闭。在加入周质提取物的10倍稀释液后，使用小鼠抗-Flag-HRP缀合物(Sigma)以及随后在存在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)的条件下的酶反应来检测纳米抗体结合。
认为显示出高于背景>2-倍的ELISA信号的克隆编码阳性PcrV结合纳米抗体。
(Nunc,Wiesbaden,德国)上。孔用酪蛋白溶液(1％)封闭。在加入周质提取物的10倍稀释液后，使用小鼠抗-Flag-HRP缀合物(Sigma)以及随后在存在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)的条件下的酶反应来检测纳米抗体结合。
认为显示出高于背景>2-倍的ELISA信号的克隆编码阳性PcrV结合纳米抗体。
[0781] 4.2序列测定
[0782] 测定阳性克隆的DNA序列。抗-PcrV纳米抗体的氨基酸序列显示在表A-4中。
[0783] 4.2解离-速率确定
[0784] 在ProteOn仪器(BioRad)上通过表面等离子体共振进行所有独特的PcrV-结合纳米抗体的解离-速率分析。为了这一目的，重组PcrV蛋白通过在一个配体通道上的胺偶联共价结合在GLC ProteOn传感器芯片上，之后将其余的反应性基团灭活。将由表达抗-PcrV纳米抗体的大肠杆菌细胞制备的周质提取物稀释10倍，并且以45uL/min的流速在2分钟内注入，用于结合固定化的rPcrV。在样品注入之间，将表面用ProteOn磷酸溶液，0.85％再生。通过将1:1相互作用模型(Langmuir模型)拟合到单个解离曲线上而确定解-5 -1 -2 -1
离-速率。确定的解离-速率在低于检测界限3x10 s 至4x10 s 的范围内，其中绝大部-3 -4 -1
分克隆具有1x10 –1x10 s 范围内的解离-速率。
离-速率。确定的解离-速率在低于检测界限3x10 s 至4x10 s 的范围内，其中绝大部-3 -4 -1
分克隆具有1x10 –1x10 s 范围内的解离-速率。
[0785] 4.4在TTSS-依赖性细胞毒性测定中进行分析
[0786] 为了鉴定能够预防铜绿假单胞菌TTSS-介导的感染的纳米抗体，在使用P3-X63-Ag8(P3X63)小鼠骨髓瘤细胞(ECACC细胞系)作为靶标的TTSS-依赖性细胞毒性测定中检测代表性的克隆。例如，铜绿假单胞菌细胞毒性的实例提供在Frank等.(The Journal of infectious diseases(传染病杂志)186:64-73,2002),Vance等.(Infection and Immunity(传染和免疫性)73:1706-1713,2005),El Solh等.(Am.J.Respir.Crit.Care
5
Med.178:513-519,2008)中。将总共2×10 个P3X63细胞/孔接种96孔平板中。将包含PcrV结合纳米抗体的周质提取物(1/4稀释)用铜绿假单胞菌菌株PA103(其在钙耗尽的条件下生长(LB培养基+5mM EGTA；Kim,Microbiology 151:3575-3587,2005))预先温育，以诱导TTSS表达。在预先温育后，将周质提取物和细菌的混合物加入到P3X63细胞中，在37℃3小时的温育步骤后，用碘化丙啶(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)染色P3X63细胞，并且用2％甲醛(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)固定。通过用FACS阵列(Becton Dickinson,USA)和FCS Express软件(Denovo,USA)监测死细胞对碘化丙啶的摄取而量化防止铜绿假单胞菌感染和介导细胞死亡的能力。用菌株PA103感染是以8个细菌：1个骨髓瘤细胞的平均感染复数(MOI)(范围在6:1–10:1)进行。使用Prism5软件(Graphpad)分析数据。细胞毒性针对未处理的样品中的死细胞标准化，并且标准化数据按照下式用来计算％抑制：
5
Med.178:513-519,2008)中。将总共2×10 个P3X63细胞/孔接种96孔平板中。将包含PcrV结合纳米抗体的周质提取物(1/4稀释)用铜绿假单胞菌菌株PA103(其在钙耗尽的条件下生长(LB培养基+5mM EGTA；Kim,Microbiology 151:3575-3587,2005))预先温育，以诱导TTSS表达。在预先温育后，将周质提取物和细菌的混合物加入到P3X63细胞中，在37℃3小时的温育步骤后，用碘化丙啶(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)染色P3X63细胞，并且用2％甲醛(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)固定。通过用FACS阵列(Becton Dickinson,USA)和FCS Express软件(Denovo,USA)监测死细胞对碘化丙啶的摄取而量化防止铜绿假单胞菌感染和介导细胞死亡的能力。用菌株PA103感染是以8个细菌：1个骨髓瘤细胞的平均感染复数(MOI)(范围在6:1–10:1)进行。使用Prism5软件(Graphpad)分析数据。细胞毒性针对未处理的样品中的死细胞标准化，并且标准化数据按照下式用来计算％抑制：
[0787]
[0788] 其中：
[0789] y＝与不相关的对照纳米抗体温育的PA103处理的孔的平均数(％死细胞)
[0790] z＝与不相关的对照纳米抗体温育的未处理的孔的平均数(％死细胞)
[0791] x＝评估的数据点的％死细胞
[0792] 表B-1中给出了周质提取物筛选数据的总结。
[0793] 表B-1：筛选包含表达的抗-PcrV纳米抗体的周质提取物
[0794]
[0795] 实施例5：表征纯化的单价抗-PcrV纳米抗体
[0796] 5.1制备所选的纳米抗体
[0797] 进一步表征由实施例4所述的筛选选择的克隆。将所选的纳米抗体亚克隆至内部pUC119来源的表达载体中。该载体包含LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点和pel B前导序列。在与纳米抗体编码序列符合阅读框的情况下，该载体编码C-端三联Flag和His6标签。在大肠杆菌(TG-1)中转化后，培养表达培养物并且通过加入1mM IPTG诱导表达并允许在37℃持续4小时。离心细胞培养物后，通过冷冻-解冻沉淀物然后离心而制备周质提取物。然后将这些提取物用作起始物质，在HisTrap FF粗提1ml柱(GE healthcare,Buckinghamshire,英国)上通过IMAC、然后通过Zeba离心柱(Pierce,Rockford,IL,USA)脱盐进行纯化，产生通过SDS-PAGE评估的95％的纯度。
[0798] 5.2在细胞毒性测定中评估PcrV阻断纳米抗体
[0799] 在使用P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中检测所述纳米抗体防止铜绿假单胞菌TTSS-诱导的细胞毒性的能力。简言之，将纯化的纳米抗体的连续稀释液与在TTSS诱导条件下培养(LB培养基+5mM EGTA；Kim,Microbiology151:3575-3587,2005)的铜绿假单胞菌PA103预先温育。将混合物加入到P3X63细胞中，并且如实施例4.4那样分析细胞介导的死亡。感染以2.8个细菌：1个骨髓瘤细胞的平均MOI(范围在4:1–1.5:1)进行。数据总结在图1和表B-2中。
[0800] 表B-2：在P3X63细胞毒性测定中评估单价抗-PcrV纳米抗体
[0801]
[0802] 5.3亲和力确定
[0803] 在Biacore T100仪器上使用表面等离子体共振(SPR)确定纳米抗体子集的动力学结合参数。为了这一目的，用EDC和NHS通过胺偶联将重组GST-PcrV固定在CM5芯片上。将纯化的纳米抗体以不同的浓度(1-1000nM)注入2分钟，并且允许以45ul/min的流速解离20分钟。在样品注入之间，将表面用10mM甘氨酸pH1.5和100mM HCl再生。HBS-N(Hepes缓冲液pH7.4)用作运行缓冲液。使用BIAEvaluation软件(1:1相互作用)由传感图计算动力学常数。6种抗-PcrV纳米抗体的亲和力在0.5-5nM范围内(表B-3)。
[0804] 表B-3：纯化的纳米抗体针对重组GST-PcrV的亲和力KD(nM)
[0805]纳米抗体 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(nM)
2B10 5.10×10+05 2.50×10-04 0.5
3E10 2.70×10+06 3.90×10-03 1
4G10 1.40×10+05 6.50×10-04 5
5E02 1.80×10+05 6.80×10-04 4
5H01 1.60×10+05 1.40×10-04 1
7C10 1.20×10+06 1.80×10-03 2
2B10 5.10×10+05 2.50×10-04 0.5
3E10 2.70×10+06 3.90×10-03 1
4G10 1.40×10+05 6.50×10-04 5
5E02 1.80×10+05 6.80×10-04 4
5H01 1.60×10+05 1.40×10-04 1
7C10 1.20×10+06 1.80×10-03 2
[0806] 5.4表位库并
[0807] 为了将纳米抗体分类为不同的表位库，进行竞争性结合ELISA测定。在第一次实验中，将1ug/mL GST-PcrV蛋白包被在96-孔MaxiSorp平板(Nunc,Wiesbaden,德国)中。在存在1nM Fab13.37(SEQ ID NOs:142和143)的条件下，温育纯化的纳米抗体在包含0.1％酪蛋白和0.05％吐温20(Sigma)中的系列稀释物(浓度范围为100nM–6.4pM)。使用小鼠抗-HAIgG(Zymed Laboratories,South San Francisco,California)，然后是辣根过氧化物酶(HRP)缀合的兔抗小鼠IgG(Dako,Glostrup,Denmark)，随后在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)的存在下的酶反应，检测Fab13.37(SEQ ID NO:142和143)对GST-PcrV残余的结合。
[0808] 在第二次实验中，将2nM生物素酰化的rPcrV蛋白捕获在包被有2ug/ml中性抗生物素蛋白的96-孔MaxiSorp平板(Nunc,Wiesbaden,德国)上。温育周质提取物和来自不同纳米抗体的纳米抗体-噬菌体颗粒的混合物(二者均按照标准流程制备，例如，参见本文引用的现有技术和埃博灵克斯股份有限公司提交的申请)，并且使用单克隆抗-M13-HRP缀合物(GE healthcare,Buckinghamshire,英国)以及随后在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)存在下的酶反应，来检测噬菌体对生物素酰化的rPcrV蛋白的残余的结合。基于来自这两种方法的结果，将纳米抗体分成不同的表位库(见表B-4)。
[0809] 表B-4：抗-PcrV纳米抗体的表位库
[0810]纳米抗体 纳米抗体表位库并 Fab表位库并 表位库
1E11 库1 非竞争性 库1
2B02 库1 非竞争性 库1
2B10 库1 非竞争性 库1
2G09 库1 非竞争性 库1
3B11 ND 非竞争性 ND/NC
3E10 ND 竞争性 ND/C
4C03 ND 非竞争性 ND/NC
4G10 ND 非竞争性 ND/NC
5E02 ND 竞争性 ND/C
5H01 库2 竞争性 库2
6B05 库1 非竞争性 库1
7C10 库2 竞争性 库2
7E09 库3 非竞争性 库3
10C05 库1 非竞争性 库1
11B09 库1 非竞争性 库1
12B02 ND 非竞争性 ND/NC
13F07 库3 非竞争性 库3
14B10 ND 非竞争性 ND/NC
14E10 库1 非竞争性 库1
1E11 库1 非竞争性 库1
2B02 库1 非竞争性 库1
2B10 库1 非竞争性 库1
2G09 库1 非竞争性 库1
3B11 ND 非竞争性 ND/NC
3E10 ND 竞争性 ND/C
4C03 ND 非竞争性 ND/NC
4G10 ND 非竞争性 ND/NC
5E02 ND 竞争性 ND/C
5H01 库2 竞争性 库2
6B05 库1 非竞争性 库1
7C10 库2 竞争性 库2
7E09 库3 非竞争性 库3
10C05 库1 非竞争性 库1
11B09 库1 非竞争性 库1
12B02 ND 非竞争性 ND/NC
13F07 库3 非竞争性 库3
14B10 ND 非竞争性 ND/NC
14E10 库1 非竞争性 库1
[0811] ND＝未确定的
[0812] NC＝非竞争性的
[0813] 实施例6：产生并筛选多价PcrV阻断纳米抗体
[0814] 6.1构建二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体文库
[0815] 按下述构建二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体文库。通过PCR在两个单独的反应中扩增18种单价抗-PcrV纳米抗体的编码序列(表A-4)：N-端结构单元
(5’-GAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGGG-3’；SEQ ID NO:
(5’-GAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGGG-3’；SEQ ID NO:
[0816] 150和5’-ACCGCCTCCGGAGGAGACCGTGACCAGGGT-3’；SEQ ID NO:151)和C-端结构单元
[0817] (5’-TCTTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG-3’；SEQ ID NO:152 和5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’；SEQ ID NO:153)。对于纳米抗体5H01，不同的引物组用于N-端结构单元PCR
[0818] (5’-GAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGGG-3’；SEQ ID NO:154和
[0819] 5’-ACTTGAAGACCTCCGGAGGAGACCGTGACCAGGGT-3’；SEQ ID NO:155)和C-端结构单元PCR
[0820] (5’-ACTTGAAGACTGGATCCGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGG-3’；SEQ ID NO:156 和5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’；SEQ ID NO:157)。将19种抗-PcrV纳米抗体的N-端结构单元PCR汇集物克隆到表达载体中，在柔性甘氨酸-丝氨酸接头的编码信息(40GS:
[0821] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO:193)的上游并与其符合阅读框，而19种抗-PcrV纳米抗体的C-端汇集物克隆在40GS接头编码序列的下游并与其符合阅读框。
[0822] 所述表达载体来源于pUC119，包含驱动转基因表达的LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点和OmpA前导序列。与多价纳米抗体编码序列符合阅读库并在其下游，所述载体编码C端三联Flag标签和His6标签。将得到的携带二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体文库(理论多样性为19x19＝361)的质粒汇集物转化到大肠杆菌TG1细胞中，并且涂布在琼脂平板(LB+Km+2％葡萄糖)上。从琼脂平板上挑取864个单克隆(表示预测的>90％的文库完整性)。如上文所述制备周质提取物。
[0823] 6.2筛选二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体文库
[0824] 二价/二互补位文库的周质提取物用于筛选方案中来选择最有力的功能性阻断抗-PcrV纳米抗体。为了这一目的，在使用P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定(如实施例4.4所述)中检测所述周质提取物(最终稀释度1/150)防止TTSS-诱导的铜绿假单胞菌感染的能力。来自864个(13％)文库克隆中的48个最有效的克隆的筛选结果(％抑制)总结在表B-5中。表B-5记录了作为其N端和C端结构单元的函数的所有361种潜在的二价/二互补位组合，其按实施例5.4确定的其相对表位库分组。
[0825] 确定48种最有效的文库克隆的相应的序列，如表A-5所示。序列分析揭示下述观察：在所述48种最有效的构建体中，(i)没有(0/48)单特异性的二价纳米抗体(由两个相同的纳米抗体结构单元组成)存在，(ii)大部分(42/48个克隆)由来自两个不同的表位库的结构单元组成。筛选后，选择24种独特的二互补位纳米抗体(SEQ ID NO:118-141)进行进一步表征。
[0826]
[0827] 实施例7：表征二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体
[0828] 7.1制备所选择的纳米抗体
[0829] 将来自所选的二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体的编码序列克隆至内部构建的质粒中，允许在巴斯德毕赤酵母中表达并且分泌到培养基中。表达载体来源于TM
pPICZa(Invitrogen)，并且包含用于密切调节的甲醇诱导的表达的AOX1启动子、Zeocin抗性基因、多克隆位点和α-因子分泌信号。在与纳米抗体编码序列符合阅读框的情况下，所述载体编码C端GlyAlaAla序列，其后是三联Flag标签和His6标签。转化后，培养表达培养物，并且通过加入甲醇诱导纳米抗体表达，并且允许在30℃持续48小时。将澄清的TM
上清用作起始材料用于使用HisTrap 柱(GE Healthcare)进行固定化的金属离子亲和层析(IMAC)。使用20mM至250mM的咪唑逐级梯度从柱上洗脱纳米抗体。在下一步中，使用TM
HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)将纳米抗体缓冲液更换至D-PBS(Invitrogen)。
pPICZa(Invitrogen)，并且包含用于密切调节的甲醇诱导的表达的AOX1启动子、Zeocin抗性基因、多克隆位点和α-因子分泌信号。在与纳米抗体编码序列符合阅读框的情况下，所述载体编码C端GlyAlaAla序列，其后是三联Flag标签和His6标签。转化后，培养表达培养物，并且通过加入甲醇诱导纳米抗体表达，并且允许在30℃持续48小时。将澄清的TM
上清用作起始材料用于使用HisTrap 柱(GE Healthcare)进行固定化的金属离子亲和层析(IMAC)。使用20mM至250mM的咪唑逐级梯度从柱上洗脱纳米抗体。在下一步中，使用TM
HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)将纳米抗体缓冲液更换至D-PBS(Invitrogen)。
[0830] 7.2在细胞毒性测定中评估二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体
[0831] 在使用MOI为12的P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中检测二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体防止TTSS诱导的铜绿假单胞菌感染的能力(如5.2节所述)。图2所-11 -09示的结果表明，所有的纳米抗体都能够防止铜绿假单胞菌感染，具有1.3x10 至3.7x10 M范围内的IC50值，如表B-6所总结的。
[0832] 表B-6：在使用P3X63细胞作为靶标的细胞毒性测定中二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体的性能
[0833]
[0834] 还建立了使用人肺上皮细胞(A549细胞)作为靶标的另外的细胞毒性测定，并且用来表征格式化的纳米抗体。为了这一目的，向96孔E平板(Roche Cat No05232368001)中加入6x104个A549(ABL161-ATCC:CCL-185)细胞/孔，并且置于xCELLigence RTCA工作站(Roche Analyser Model W380)于37℃6-8小时。将在诱导TTSS表达的条件下生长的铜绿假单胞菌(菌株PA103)与10种不同浓度的纯化的纳米抗体在37℃预温育1小时，然后加入到A549细胞中并且再在37℃温育24小时。在处理的孔的细胞指数下降到细胞指数窗口的75％-90％时的时间点，分析数据。将数据针对向所述细胞中加入PA103接种物的时间点进行标准化。将来自三次独立进行的实验的测试的二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体的效力表示为相对于参比分子Fab13.37的效力的比率(表B-7)。
[0835] 表B-7：在使用A549细胞作为靶标的细胞毒性测定中二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体的性能
[0836]
[0837] *比率＝Fab13.37的IC50值/纳米抗体的IC50值
[0838] 7.3针对PcrV临床变体的交叉反应性
[0839] 通过结合ELISA，评估二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体针对23种PcrV序列变体(见表A-1)的交叉反应性。为了这一目的，将微量滴定平板用1ug/ml每种PcrV变体在4℃包被过夜。纳米抗体作为在包含0.1％酪蛋白和0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：5nM–4pM)使用。使用小鼠抗-Flag-HRP缀合物(Sigma)，以及随后在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)存在下的酶反应来检测纳米抗体结合。所有的纳米抗体均能够以与其与来自菌株PAO1的PcrV参比物的结合非常相似的程度结合所有不同的PcrV变体。关于每种纳米抗体获得的针对不同的PcrV变体和参比菌株PAO1的EC50值的范围显示在表B-8中。
[0840] 表B-8：二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体与PcrV临床变体的结合
[0841]纳米抗体 EC50范围(M)
256 7×10-11-1×10-10
257 7×10-11-9×10-11
259 1×10-11-2×10-11
261 6×10-11-7×10-11
271 6×10-11-1×10-10
-10 -10
275 6×10 -9×10
277 7×10-11-1×10-10
285 1×10-10-1×10-10
319 8×10-11-1×10-10
335 7×10-11-9×10-11
256 7×10-11-1×10-10
257 7×10-11-9×10-11
259 1×10-11-2×10-11
261 6×10-11-7×10-11
271 6×10-11-1×10-10
-10 -10
275 6×10 -9×10
277 7×10-11-1×10-10
285 1×10-10-1×10-10
319 8×10-11-1×10-10
335 7×10-11-9×10-11
[0842] 7.4纳米抗体针对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的稳定性
[0843] 在体外通过用HNE或铜绿假单胞菌弹性蛋白酶温育所述纳米抗体以及随后通过结合ELISA分析降解产物来检测在病原体来源的蛋白酶(铜绿假单胞菌弹性蛋白酶)和宿主细胞来源的蛋白酶(人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE))存在时的稳定性和功能性的维持。
[0844] 为了这一目的，将纳米抗体用在Tris pH7.8,150mM NaCl；10mMCaCl2缓冲液中的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(1-2U弹性蛋白酶/ug纳米抗体)或铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(3ug/ug纳米抗体)在37℃温育不同的时间间隔(2hr,4hr,24hr和48hr)。对于样品分析，将1ug/mL重组PcrV蛋白在96-孔MaxiSorp平板(Nunc,Wiesbaden,德国)中在4℃固定过夜。孔用酪蛋白溶液(1％)封闭，并且样品作为在包含0.1％酪蛋白和0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释物应用。采用未处理的纳米抗体作为参比。使用多克隆兔抗-VHH抗体(Ablynx N.V.)，然后使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗-兔IgG(Dako,Glostrup,丹麦)，以及随后在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)存在下的酶反应，来检测纳米抗体结合。
[0845] 结果总结在表B-9中。
[0847]
[0848] *效力降低的倍数＝处理的样品的EC50值/未处理的样品的EC50值
[0849] 实施例8：表位绘图
[0850] 使用基于嵌合分子的策略来绘制所选的单价抗-PcrV纳米抗体的构象结合表位。为了这一目的，PcrV的不连续的溶剂-暴露的部分用其LcrV对应物替代，LcrV是来自耶尔森菌属(Yersinia)物种的PcrV同系物。(Sato等.Frontiers in Microbiology(微生物学前沿)2:142,2011)。总共产生覆盖PcrV蛋白的绝大部分序列范围的7个嵌合分子(见图3；表A-7)。
[0851] 将嵌合分子以及全长PcrV蛋白(氨基酸1-294,见表A-1)克隆至来源于pUC119的内部表达载体中，所述载体包含LacZ启动子、卡那霉素抗性基因和多克隆位点。在与嵌合体编码序列符合阅读框的情况下，所述载体编码C-端c-myc标签和His6标签。另外，描述为PcrV封闭表位(Frank等.J.Inf.Dis.(传染病杂志)186:64-73,2002；US6,827,935)的小的PcrV片段(氨基酸144-257,见图3)也被克隆到表达载体中。在大肠杆菌(TG-1)中转化时，培养表达培养物，并且通过加入1mM IPTG诱导表达，并允许在37℃持续4小时。在离心细胞培养物后，通过冷冻-解冻沉淀物然后离心来制备周质提取物。将剩余的细胞沉淀物重悬并通过超声处理裂解。通过离心分离胞质级分，并且与周质提取物汇集在一起。
使用Ni-琼脂糖6快速流动珠子(GE Healthcare,Uppsala,瑞典)通过固定化的金属亲和层析(IMAC)，然后使用Zeba脱盐离心柱(Thermo Scientific)脱盐，纯化重组蛋白。
使用Ni-琼脂糖6快速流动珠子(GE Healthcare,Uppsala,瑞典)通过固定化的金属亲和层析(IMAC)，然后使用Zeba脱盐离心柱(Thermo Scientific)脱盐，纯化重组蛋白。
[0852] 为了评估所选的单价抗-PcrV纳米抗体能否结合小的PcrV片段和7种嵌合分子，进行结合ELISA。简言之，将纳米抗体在96-孔MaxiSorp平板(Nunc,Wiesbaden,德国)中以3ug/mL在4℃包被过夜。孔用酪蛋白溶液(在PBS中1％)封闭。施加PcrV蛋白(1/10)，并且使用生物素酰化的小鼠抗-myc抗体(Serotec)，然后使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)以及随后在底物esTMB(3,3’,5,5’-tetramentylbenzidine)(SDT,Brussels,比利时)存在下的酶反应，来检测结合。采用Fab13.37(在
96孔平板中9ug/ml包被)作为参比。由于所有检测的纳米抗体以与全长PcrV相似的结合水平结合7种嵌合分子中的至少5种，并且每种嵌合分子被7种纳米抗体中的至少3种以与全长PcrV相似的结合水平结合，所以可以推断仅PcrV蛋白的不连续部分被其LcrV对应物替代，并且，与全长PcrV分子相比，嵌合分子的整体三级结构未受显著影响。抗-PcrV纳米抗体与不同PcrV分子的结合模式的比较揭示3个主要表位组(见表B-10)。这些数据与由实施例5.4所述的表位库并实验检索的数据一致。来自库1的纳米抗体结合具有氨基酸156-177和氨基酸195-211的PrcV区，来自库3的纳米抗体识别具有氨基酸57-91的PcrV区，来自库2的纳米抗体结合氨基酸209-249。尤其如此，这一实验进一步描绘了Fab13.37(Frank等.J.Inf.Dis.(传染病杂志)186:64-73,2002和US6,827,935)的氨基酸
144-257至氨基酸209-249的提议的结合表位。3个不同的PcrV封闭表位区的示意图显示在图3中。
96孔平板中9ug/ml包被)作为参比。由于所有检测的纳米抗体以与全长PcrV相似的结合水平结合7种嵌合分子中的至少5种，并且每种嵌合分子被7种纳米抗体中的至少3种以与全长PcrV相似的结合水平结合，所以可以推断仅PcrV蛋白的不连续部分被其LcrV对应物替代，并且，与全长PcrV分子相比，嵌合分子的整体三级结构未受显著影响。抗-PcrV纳米抗体与不同PcrV分子的结合模式的比较揭示3个主要表位组(见表B-10)。这些数据与由实施例5.4所述的表位库并实验检索的数据一致。来自库1的纳米抗体结合具有氨基酸156-177和氨基酸195-211的PrcV区，来自库3的纳米抗体识别具有氨基酸57-91的PcrV区，来自库2的纳米抗体结合氨基酸209-249。尤其如此，这一实验进一步描绘了Fab13.37(Frank等.J.Inf.Dis.(传染病杂志)186:64-73,2002和US6,827,935)的氨基酸
144-257至氨基酸209-249的提议的结合表位。3个不同的PcrV封闭表位区的示意图显示在图3中。
[0853] 表B-10：抗-PcrV纳米抗体的表位绘图
[0854]
[0855] B：结合:结合信号＝针对全长PcrV蛋白的结合信号
[0856] NB：没有结合:结合信号＝背景信号
[0857] RB：减少的结合:结合信号＝与针对全长PcrV蛋白的结合信号相比，30-90％的减少
[0858] 实施例9：本发明的多肽的雾化
[0859] 9.1材料和方法
[0860] 取决于预计的表达水平，使用巴斯德毕赤酵母X33标准发酵设置以2L或10L发酵罐规模，制备纳米抗体339,354,360和376(分别是纳米抗体256(SEQ ID NO:129),319(SEQ ID NO:138),259(SEQ ID NO:137)和258(SEQ ID NO:134)的无标签形式)。发酵后，使用常用的正切流动过滤步骤澄清所有四种纳米抗体，并且通过树脂层析使用捕获步骤、精制步骤和制备级大小排阻层析进一步纯化。然后，将纳米抗体浓缩至在D-PBS和D-PBS+0.01％吐温80中约50mg/ml。
[0861] 也将参比纳米抗体(SEQ ID NO:207；
[0862] DVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS；WO 2011/098552中的SEQ ID NO:2)平行地雾化。这种参比纳米抗体在10mM NaH2PO4/Na2HPO4+0.13M NaCl,pH7.0中以55.2mg/mL使用。
[0863] 样品的雾化顺序是基于对不同的纳米抗体从搅拌和冷冻/解冻实验获得的OD500数据：最稳定的多肽最先雾化，在搅拌或F/T应力下表现更多浑浊的多肽稍后雾化。参比纳米抗体在之前、之间和之后雾化作为对照。在第1天，所有样品按照表B-11的顺序(1-11)雾化。在第2天重复相同的实验。
[0864] 多肽通过 APIXNEB喷雾器系统(Activaero)按照供应商的使用说明进行雾化。雾化实验一式两份进行。500ul样品通过具有4μm膜的筛孔喷雾器连续雾化。将气雾剂收集在100mL玻璃瓶中，然后进行分析。
[0865] 通过浊度测量(OD 500)和SE-HPLC分析，评估雾化之前和之后的样品。
[0866] 9.2浊度测量
[0867] 测量OD500作为浊度参数。使用D-PBS进行空白设置。对于参比样品(雾化之前)和雾化的样品(第1天和第2天)测量的OD500值显示在表B-11中。
[0868] 表B-11：雾化之前和之后的OD500值总结
[0869]
[0870] 样品至雾化之前和之后的OD500值进一步显示在图7中。
[0871] 9.3SE-HPLC分析
[0872] SE-HPLC测定由下述组成：BioSEC-5,7.8x300mm,5um,Agilent,5190-2521(SEC85)柱，由0.3M精氨酸.HCl+磷酸缓冲液pH6组成的移动相，和A280nm的UV检测。特定蛋白杂质的相对量表示为相对面积％，并且通过将与特定的蛋白或蛋白杂质对应的峰面积除以总的积分面积来计算。注入10ug样品。该方法旨在用于定量在层析时作为前锋洗脱下来的较高分子量的物质(HMW’s)。
[0873] SE-HPLC积分数据的总结在表B-12中给出。对于参比纳米抗体已知(见WO2011/098552)，雾化诱导前锋(HMW’s)的增加。在所有雾化的本发明的多肽中没有观察到这一现象。雾化不影响高分子量分子的形成。向样品中加入吐温80似乎并不必要。在最后的柱上，给出SE-HPLC上相对于注入的样品的浓度的总峰面积。对于任一种样品在雾化之前和之后的集合面积(group area)之间没有观察到显著差异，这表明浓度上没有损失。
[0874] 表B-12：多肽和参比纳米抗体在雾化之前和之后的SE-HPLC积分数据总结[0875]
[0876]
[0877] 实施例10：抗-PcrV纳米抗体的体内功效
[0878] 急性铜绿假单胞菌感染小鼠模型用于评估3种纳米抗体(即，339,360和376)的体内功效。该模型如Secher等.(Journal of Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化疗杂志)66:1100-1109,2011)所述进行。简言之，铜绿假单胞菌菌株PA2310.55血清型O1在补充有10nM次氮基三乙酸(Sigma)的BHI培养基(Brain Heart Infusion)中在37℃以7
150rpm振荡生长过夜。在指数生长期后，通过将铜绿假单胞菌稀释至5x10cfu/ml制备接种物。纳米抗体或Fab13.37在D-PBS中稀释至适当的浓度，并且随后与铜绿假单胞菌培养物以1:1的比率预先混合。使用超细吸管端将预混合物(40μl)立即鼻内施用至8-10周龄的麻醉的C57Bl/6小鼠。
150rpm振荡生长过夜。在指数生长期后，通过将铜绿假单胞菌稀释至5x10cfu/ml制备接种物。纳米抗体或Fab13.37在D-PBS中稀释至适当的浓度，并且随后与铜绿假单胞菌培养物以1:1的比率预先混合。使用超细吸管端将预混合物(40μl)立即鼻内施用至8-10周龄的麻醉的C57Bl/6小鼠。
[0879] 监测感染的小鼠达4或5天，在研究过程中每天记录存活和体重(每组7-8只动物)。另外，在感染后24小时，每组处死3-5只动物。在这些动物中，称重右肺、和左肺的其他肺叶(除大肺叶之外)，并且使用无菌一次性匀浆系统Dispomix(Medic Tools AG,6300-Zug,瑞士)在1.5mL等渗盐水溶液中匀浆。将在等渗盐水溶液中制备的肺匀浆物的十倍连续稀释液涂布在BHI琼脂平板上，以确定肺中的活细菌(cfu)。在用于CFU确定的肺匀浆后，随后将肺匀浆物离心，弃去上清，并将沉淀物重悬在1mL包含0.5％的十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)和5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS中。离心后，将100μL上清置于检测管中，检测管中已有200μL PBS-HTAB-EDTA，1mL Hanks’平衡的盐溶液(HBSS)，100μL邻-二茴香胺二盐酸盐(o-dianisidine dihydrochloride)(1.25mg/mL)和100μL H2O20.05％。在搅拌器中在37℃温育15分钟后，用100μL NaN31％终止反应。以460nm下针对培养基的吸光度，确定髓过氧化物酶活性。
[0880] 在这一模型中检测低剂量(0.028μg/小鼠)和高剂量(10μg/小鼠)的每种纳米抗体。图4所示的存活曲线表明所有检测的抗-PcrV纳米抗体在10μg/小鼠的剂量下完全防止小鼠免受铜绿假单胞菌感染-相关的致死性。与之相反，不相关的纳米抗体处理的动物和缓冲液处理的动物均在感染后最初的48小时内死亡。以0.028μg/小鼠的较低的剂量，所有三种纳米抗体仍然提供完全的(A339)或接近完全的(A360和A376)保护作用。
[0881] 相对于感染的缓冲液处理的小鼠或感染的不相关的纳米抗体处理的小鼠，感染的纳米抗体处理的或Fab13.37处理的小鼠的延长的存活与肺部炎症参数的降低相关。更具体地，通过在肺部匀浆物中的髓过氧化物酶活性测量的嗜中性粒细胞肺部浸润(图5A)和相关的肺部重量(图5C)明显地被所有低至0.028μg/小鼠的剂量的抗-PcrV纳米抗体减少。除了这些关于肺部炎症的阳性效果之外，24小时的细菌负荷也被减少达多于
1.4log10CFUs(图5B)。相反地，不相关的对照纳米抗体对这些参数没有影响，这表明所观察到的效果是抗-PcrV纳米抗体相关的。
1.4log10CFUs(图5B)。相反地，不相关的对照纳米抗体对这些参数没有影响，这表明所观察到的效果是抗-PcrV纳米抗体相关的。
[0882] 最后，还分析了重量减轻的百分比。A339处理的小鼠(图6)具有仅为8.3％的最大的平均重量减轻百分比，并且在感染后第1天已经达到该最小值。用0.028μg/小鼠剂量的A376和A360或0.05μg/小鼠剂量的Fab13.37处理的小鼠分别表现出11.9％、14.1％和13.5％的平均体重减轻百分比，其仅在感染后第2天达到最小值。
[0883] 表
[0884] 表A-1：PcrV变体的氨基酸序列(1-294)
[0885]
[0886]
[0887] 表A-2：在3种抗-PcrV Fab分子中存在的VH和VL区的氨基酸序列(WO2009/073631)
[0888]
[0889] 表A-3：来自恒定重链和轻链的序列(WO 2009/073631)
[0890]
[0891] 表A-4：单价抗-PcrV纳米抗体的SEQ ID NOs和氨基酸序列
[0892]
[0893] 表A-5：所选的二价/二互补位抗-PcrV纳米抗体的氨基酸序列
[0894]
[0895]
[0896]
[0897] 表A-7：来自用于表位绘制的PcrV片段(氨基酸144-257)和嵌合体分子的氨基酸序列
[0898]
[0899] 表A-8：接头序列
[0900]
[0901] 等价物
[0902] 认为以上书面说明书足以允许本领域技术人员实施本发明。由于实施例旨在举例说明本发明的某些方面和实施方案，所以，本发明不应该在范围上受到所提供的实施例的限制。其他功能性等价的实施方案也在本发明的范围内。除了本文显示的和记述的那些之外，通过前文的描述，本领域技术人员应该清楚本发明的各种改进，并且落入后附权利要求的范围之内。本发明的优点和目的不一定要被本发明的每个实施方案所涵盖。
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