发明领域

本发明涉及用于将含有白蛋白的制剂灭菌，以降低其中一种或多 种活性生物污染物或病原体的含量的方法，所述活性生物污染物或病 原体是例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、 尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、 真菌、朊病毒或单独或联合引起TSE的类似物和/或单细胞或多细胞寄 生物。本发明特别涉及用辐射法将含有白蛋白的制剂例如血浆蛋白组 分(PPF)产品灭菌的方法。

                      发明背景

白蛋白是高度溶解的椭圆体状蛋白质(MW66,500)，其构成血浆 胶体渗透压的70-80％。因此，白蛋白对于调节循环血液的容量相当 重要。当静脉内注射时，5％的白蛋白将会使循环血浆容量增加约相当 于所输注的体积。这种外加的液体降低了血浓度，并使血液粘度得以 降低。容量扩大的程度和持续时间取决于初始血容量。当治疗血容量 减少的患者时，所输注的白蛋白的作用可以持续多个小时。在具有正 常血容量的个体中，血液稀释持续很短的时间。

白蛋白还是一种输送蛋白质，并在循环中结合天然存在的、治疗 性的、和有毒的物质。

白蛋白遍布于细胞外的水中，并且身体白蛋白总量的60％以上位 于血管外流体隔室中。在一个体重70千克的人中，全部的白蛋白约是 350克；其具有15-20天的循环生命期，每天约更新15克。

阻止或逆转外周水肿所必需的最小血清白蛋白水平是未知的。虽 然毫无疑问它在患者之间是有差异的，有若干证据表明，其每分升减 少接近2.5克。这种浓度造成了20mmHg的血浆胶体渗透压(相当于 5.2g/dL的总蛋白质浓度)。

治疗上经常将含有白蛋白，包括血浆蛋白组分的制剂提供给人和 动物。例如，将含有白蛋白的制剂频繁给药于患有一种或多种下列适 应症的人：伴随或不伴随休克的血容量减少；低白蛋白血症，其可由 下述原因引起：白蛋白产生不足(起因于营养不良、烧伤、严重损伤、 先天性白蛋白缺乏血症、肝病、感染、恶性肿瘤或内分泌失调)、过 度分解代谢(起因于烧伤、严重损伤、胰腺炎、甲状腺毒症、天疱疮 或肾病)、身体白蛋白损失(起因于出血、肾排泄过度、烧伤渗出物、 渗出性肠病或表皮脱落性皮肤病)和/或体内白蛋白再分配(起因于严 重损伤、腹水肝硬化或各种炎症)；心肺旁路手术之前或期间；和用 于烧伤或肝硬化的治疗。

多种不同的用于治疗的含有白蛋白的制剂可以或已经可以从市场 上买到，包括例如Albuminar(Centeon/Aventis Behring)、 Buminate(Baxter Laboratories)、Plasbumin(Bayer Biological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、白蛋白(人) (Immuno-U.S.)、Albumarc(American Red Cross)和人血清白蛋白 (Swiss Red Cross)。各种血浆蛋白组分产品也可以或已经可以从市场 上买到，包括，例如Plasma-Plex(Centeon/Aventis Behring)、 Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。

白蛋白也在治疗用的天然或重组蛋白质的制剂中用做稳定剂。例 如，最近，在含有用于血友病A的因子VIII(例如得自 Baxter-Hyland/Immuno的Recombinate)、用于多发性硬化的β-1b 干扰素(例如得自Berlex Laboratories的Betaseron)、用于贫 血的红细胞生成素(例如得自Amgen的Epogeng)、用于Gaucher’s 病的阿糖脑苷酶—一种改性形式的β-葡糖脑苷脂酶(例如得自 Genzyme的Ceredase)和用于遗传缺陷的抗凝血酶III(例如得自 Bayer的Thrombate或得自Pharmacia & UpJohn的Atnativ)的治 疗制剂中，白蛋白作为稳定剂存在。在这样的制剂中，白蛋白占全部 蛋白质含量的99％以上。

白蛋白也在疫苗制剂中用作稳定剂，所述疫苗制剂是例如蜱传脑 炎(TBE)病毒疫苗和麻疹、流行性腮腺炎和风疹病毒疫苗(例如得自 Merck的MMRII)、狂犬病疫苗(例如得自Evans/Medeva的Evans Polio Vaccine)。在这样的制剂中，白蛋白也占全部蛋白质含量的99％以 上。

含有白蛋白的制剂也在细胞培养用的培养基中用做营养剂，包括 细胞(重组等)培养物生产所要求的产品和疫苗生产。这样的制剂可以 例如从Sigma-Aldrich、Irvine Scientific、Intergen和Valley Biomedical购得。

很多为人、兽医、诊断和/或试验使用而制备的含有白蛋白的制剂 会含有有害的和具有潜在危险的生物污染物或病原体，例如病毒、细 菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、 nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病 毒或单独或联合引起TSE的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。所 以，在产品使用前将任何生物污染物或病原体进行灭活是极为重要的。 当将物质直接给药于患者，例如在输血、血液因子替代治疗、器官移 植和通过静脉内、肌内或其它形式的注射或输注来进行的人治疗中， 这是尤其关键的。对于含有各种血浆和/或血浆衍生物的在培养基中制 备的或者经由细胞或重组细胞培养制备的生物材料或可能遭受支原体 菌属、朊病毒、细菌、病毒和其它生物污染物或病原体污染的生物材 料来说，也是很关键的。

大多数生产生物材料的操作涉及将生物材料进行关于一种或多种 特定生物污染物或病原体的筛选或测试，而不是将污染物或病原体从 材料中除去或将之灭活。仅不使用对生物污染物或病原体测试呈阳性 的材料。筛选操作的实例包括对来自献血者的人血中的特定病毒进行 测试。然而，这样的操作并不总是可靠的，并且不能探测到某些病毒 的存在，特别是以非常低的数目存在的病毒。鉴于与假阴性结果所带 来的后果，这降低了测试的价值或确定性。在某些情况下，例如在获 得性免疫缺乏综合症(爱滋病)情况下，假阴性结果能够对生命构成 威胁。此外，在某些情况下，即使不需要数月，也需要数周才能确定 物质是否被污染。因此，在制备生物学材料的过程中或之后，需要使 用一定的技术将污染物或病原体杀死或灭活。

而且，迄今为止，没有用于鉴定生物学材料内的朊病毒的、适于 筛选出潜在供体或感染材料的可靠测试或测定。这使得对于将朊病毒 消灭于生物学材料内，同时仍然保持所要求的材料活性的有效方法的 需要提高了。

在进行测定灭活病毒的技术能力中，很少使用有关的确切病毒。 这是由于对进行试验的工作人员的安全考虑以及与容器设备和废物的 处理有关的困难和费用。在此场所，使用相同科和纲的模型病毒。

一般说来，最难灭活的病毒是那些具有由蛋白质形成的外壳的病 毒，而它们当中最难灭活的又是那些具有最小尺寸的病毒，这是大家 公认的。这在γ辐射和大多数其它形式的辐射中已经得到证明，之所以 如此是因为这些病毒的极小尺寸与很小的基因组有关。辐射到分子上 的直接效果的大小与分子大小成正比，就是说，目标分子越大，效果 就越好。作为必然的结果，在γ辐射中已经被证实，病毒的基因组越小， 灭活病毒所需要的辐射剂量就越高。

在关系到得自人和动物的生物学材料的病毒当中，最小的因而也 就是最难灭活的病毒属于细小病毒(Parvoviruses)和稍大的包被蛋 白质的肝炎(Hepatitis)病毒。在人中，细小病毒属B19和甲型肝炎 病毒是所担心的病毒。在得自猪的材料中，相应的最小病毒是猪细小 病毒。因为这种病毒对人无害，所以经常被选择作为人B19细小病毒 的模型病毒。这种模型细小病毒病毒的灭活例证被看作这样的充分证 据，即所使用的方法也会杀死人B19病毒和甲型肝炎病毒，并且通过 引申，该方法也会杀死较大的和硬度较弱的病毒如HIV、CMV、乙型和 丙型肝炎病毒以及其它病毒。

最近的努力集中在将产品中的污染物除去或将之灭活的方法上。 这样的方法包括加热处理、过滤和向产品中加入化学灭活剂或增敏剂。

目前的美国食品和药品监督管理局的标准要求是，含有白蛋白的 制剂的加热处理应当在约60℃加热最少10个小时，而这会对敏感的 生物学材料造成损害。事实上，加热灭活能够破坏某些生物学材料的 生物学活性的50％或更多。

过滤涉及对产品进行过滤以便用物理方式除去污染物。遗憾的是， 这种方法也会将具有高分子量的产品除去。而且，在某些情况下，小 的病毒用过滤器还是除不掉。

化学增敏操作涉及加入与病毒的DNA/RNA结合并通过UV或者其它 辐射激活的有毒物质。辐射产生反应中间体和/或自由基，其与病毒的 DNA/RNA结合，将DNA/RNA骨架中的化学键打破，和/或将其交联或复 合，使得病毒不再能够复制。该操作需要将未结合的增敏剂从产品中 洗出来，因为增敏剂是有毒性的，否则将由于诱变和致癌作用而不能 施用给患者，

用γ射线照射产品是将产品灭菌的另一种方法。当给予高总剂量 时，γ射线能够有效地消灭病毒和细菌(Keathly等人，“辐射后还有 生物吗？第2部分”BioPharm 1993，七月至八月，和Leitman，“USe of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease”，Transfusion Science 10：219-239 (1989))。然而，本领域发表的文献告戒，γ辐射会损害对辐射敏感 的产品，例如血液、血液产品、蛋白质和含蛋白质的产品。特别是， 已经证明，高辐射剂量对红细胞、血小板和粒细胞是有害的(Leitman)。 美国专利4,620,908揭示，为了保持蛋白质产品的活力，辐射之前必 须将蛋白质产品冷冻。该专利认为，“如果使用γ辐射而同时蛋白质材 料处于例如室温，该材料也将会遭到彻底的破坏，就是说，材料的活 性会变得如此低以至于事实上是无效的”。遗憾的是，很多敏感的生 物材料，例如单克隆抗体(Mab)，如果为了辐射目的而经受冷冻然后在 给药患者之前融化，就会丧失活力和活性。

鉴于上述的困难，仍然需要能够有效地降低活性生物污染物或病 原体的水平而同时对制剂不造成不利影响的、将含有白蛋白的制剂灭 菌的方法。

                      发明概述

因此，本发明的目的是提供通过降低活性生物污染物或病原体的 水平而同时对制剂不造成不利影响来将含有白蛋白的制剂灭菌的方 法。本发明的其它目的、特征和优点将在随后的优选实施方案的详细 描述中加以阐明，并且通过该描述将会部分地显而易见或通过本发明 的实施来获悉。本发明的这些目的和优点可通过说明书和权利要求书 中特别指出的组合物和方法来实现和达到。

根据这些和其它的目的，本发明的第一个实施方案涉及用于将含 有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至 少一种稳定剂以有效保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害的量加 到含有白蛋白的制剂中；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含 有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的 制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的残 余溶剂含量降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平； 和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将 含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的 制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的温 度降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和(ii) 用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋 白的制剂有效灭菌的时间。

本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的 制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加 至少一种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的 残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中； 和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用适宜的射线以 有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭 菌的时间，其中所述稳定化处理和辐射速率一起有效地保护所述含有 白蛋白的制剂免受辐射损害。

本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的 制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加 至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的 残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中； 和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用适宜的射线以 有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭 菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行，并且 一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。

本发明还提供了包含白蛋白和一定量的至少一种稳定剂的含白蛋 白制剂，其中所述量的稳定剂能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实 现其预期应用。

本发明还提供了包含白蛋白的制剂，其中残余溶剂含量已被降至 能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平。

本发明还提供了包含白蛋白和一定量的至少一种稳定剂的含白蛋 白制剂，其中残余溶剂的含量已被降低，并且其中所述量的稳定剂和 所述水平的残余溶剂含量一起有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现 其预期应用。

本发明还提供了包含白蛋白的制剂，其中制剂的总蛋白浓度能有 效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平。

                    附图简述

附图1A、1B和1C显示了在不同水平的残余溶剂含量以及在或不 在挥发性稳定剂存在下照射的血浆蛋白组分。

附图2A-2F显示了进行了辐射和用于瘙痒病感染性分析的人白蛋 白(25％)，所述白蛋白用得自具有改变瘙痒病的仓鼠(263K株)的10 ％脑匀浆以1∶100比例感染。

附图3A和3B显示了以10或40kGy的总剂量照射的冻干白蛋白 (含有5％尿激酶)。

附图4A-4B显示了预先用或未用氩气吹扫的照射的白蛋白样本。

附图5A-5F显示了以18.1、23和30.4kGy的总剂量照射，通过 用于聚集和裂解的SDS-PAGE和用于二聚和聚合的HPLSEC进行分析的 白蛋白溶液(25％)样本。

附图6A是表明γ辐射后掺入PPV的血浆蛋白质组分中病毒载量减 少的图。附图6B-6C是表明照射的血浆蛋白组分的SDS-PAGE分析结 果的凝胶。

附图7是表明含有白蛋白和因子VIII的制剂在γ照射后因子VIII 的活性的图。

                优选实施方案的详细描述

A.定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技 术人员所通常理解的相同含义。

除非另有说明，本文所用的单数形式“a”、“an”和“the”包 括复数含义。

本文所用术语“含有白蛋白的制剂”意指任何由活的生物体衍生 或获得的制剂，其含有血液蛋白质白蛋白、重组白蛋白或转基因白蛋 白，重组白蛋白和转基因白蛋白都具有天然序列或改性序列，或其变 型或衍生物。含有白蛋白的制剂的实例包括但不限于Albuminar (Centeon/Aventis Behring)、Buminate(Baxter Laboratories)、 Plasbumin(Bayer Biological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、 白蛋白(人)(Immuno-U.S.)和Albumarc(American Red Cross) 以及血浆蛋白组分产品，包括例如Plasma-Plex(Centeon/Aventis Behring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate (Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。

本文所用术语“灭菌”意指将在依据本发明处理的含有白蛋白的 制剂中发现的至少一种活性生物污染物或病原体的水平降低。

本文所用术语“生物材料”意指任何由活的生物体衍生或获得的 物质。生物材料的实例包括但不限于下列：细胞；组织；血液或血液 组分；蛋白，包括重组蛋白或转基因蛋白，以及蛋白质性质的材料； 酶，包括消化酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾 杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；免疫球蛋白，包括单和多免疫球蛋白；植物药 材；食品等。优选的生物材料包括但不限于下列：韧带；腱；神经； 骨，包括去除矿物质的骨基质、移植物、关节、股骨、股骨头等；牙 齿；皮移植片；完整或加工过的骨髓，包括骨髓细胞悬浮液；心脏瓣 膜；软骨；角膜；动脉和静脉；器官，包括移植器官，例如心脏、肝、 肺、肾、肠、胰腺、肢和指；脂质；碳水化合物；胶原，包括天然的、 无纤维的(afibrillar)、atelomeric、可溶的和不可熔的、重组和转 基因的胶原，二者具有天然序列或改性序列；壳多糖及其衍生物，包 括NO-羧基脱乙酰壳多糖(NOCC)；干细胞、朗罕氏细胞岛以及其它移 植细胞，包括基因改变的细胞；红细胞；白细胞，包括单核细胞；和 血小板。

本文所用术语“生物污染物或病原体”意指这样的生物污染物或 病原体，其在直接或间接与含有白蛋白的制剂接触时，可以对含有白 蛋白的制剂或其接受者产生有害的作用。这样的其它的生物污染物或 病原体包括本领域技术人员已知的通常存在于或感染含白蛋白制剂的 各种各样的病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、 尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、 真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的物质和/或单细胞或多细胞寄 生物。其它生物污染物或病原体的实例包括但不限于下列：病毒，例 如人免疫缺陷病毒和其它的逆转录病毒、疱疹病毒、线状病毒、 circoviruses、副粘液病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲型、乙 型和丙型肝炎病毒及其它们的变种)、痘病毒、披膜病毒、Ebstein-Barr 病毒和细小病毒；细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、链球菌属(Streptococcus) 以及葡糖球菌属(Staphalococcus)；nanobacteria；寄生虫，例如锥 虫属和疟疾寄生虫，包括疟原虫属类；酵母；霉菌；真菌；支原体和 尿原体属、衣原体属；立克氏体，例如Coxiella burnetti；和朊病 毒以及已知在哺乳动物中单独或联合引起传播性海绵状脑病(TSEs)， 例如瘙痒病、传播性貂脑病、慢性消耗病(通常见之于骡、鹿和麋鹿)、 猫海绵状脑病、牛海绵状脑病(疯牛病)、Creutzfeld-Jakob病(包 括变异的CJD)、致命性家族失眠症、 Gerstmann-Straeussler-Scheinker综合症、kuru和Alpers综合症 的类似物。本文所用术语“活性生物污染物或病原体”意指这样的生 物污染物或病原体，其能够单独或与另一种因子，例如另一种生物污 染物或病原体或天然蛋白(野生型或突变型)、或抗体联合在含有白 蛋白制剂和/或其接受者中产生有害的作用。

本文所用术语“血液组分”意指可以从全血中分离出来的一种或 多种组分，包括但不限于下列：细胞血液组分，例如红细胞、白细胞 和血小板；血液蛋白，例如血液凝固因子、酶、白蛋白、纤溶酶原、 纤维蛋白原和免疫球蛋白；以及液态血液组分，例如血浆、血浆蛋白 组分(PPF)、冷凝蛋白、血浆组分和含血浆组合物。

本文所用术语“细胞血液组分”意指全血的一种或多种组分，包 括细胞，例如红细胞、白细胞、干细胞和血小板。

本文所用术语“血液蛋白”意指通常在全血中发现的一种或多种 蛋白。在哺乳动物，包括人中发现的血液蛋白的实例包括但不限于下 列：凝血蛋白，包括维生素K依赖型，例如因子VII和因子IX，和非 维生素K依赖型，例如因子VIII和von Willebrands因子；白蛋白； 脂蛋白，包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；补体蛋白；球蛋白，例 如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE；等。优选的一组血液蛋白包括 因子I(纤维蛋白原)、因子II(前凝血酶)、因子III(组织因子)、 因子V(前促凝血球蛋白)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(转 变加速因子前体，血清凝血酶原转变)、因子VIII(抗血友病因子A)、 因子IX(抗血友病因子B)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子 XI(血浆促凝血酶原激酶前体)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII (protransglutamidase)、yon Willebrands因子(vWF)、因子Ia、 因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、 因子Ixa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。另一组优选 的血液蛋白包括在红细胞内部发现的蛋白，例如血红蛋白和各种各样 的生长因子，以及这些蛋白的衍生物。还有一组优选的血液蛋白类包 括在市售的血浆蛋白组分产品例如Plasma-Plex(Centeon/Aventis Behring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate (Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)中发现的 蛋白。

本文所用术语“液态血液组分”意指全血的一种或多种液态非细 胞组分，例如血浆(在凝固前发现的人或动物全血的液态非细胞部分) 和血清(在凝固后发现的人或动物全血的液态非细胞部分)。

本文所用术语“生物相容溶液”意指这样的溶液，含有白蛋白的 制剂可以暴露于其中，例如通过悬浮或溶解来暴露于其中，并保持活 性，即保持其本质的生物或生理特性。

本文所用术语“生物相容缓冲液”意指具有适于维持其中的材料 完整性的pH和渗透特性(例如张力、重量摩尔渗透压浓度和/或胶体 渗透压)的生物相容溶液。适宜的生物相容缓冲液具有4-8.5的pH 值，并且是等渗的或仅仅适度低渗或高渗的。对于本领域技术人员来 说，生物相容缓冲液是已知和容易获得的。

本文所用术语“稳定剂”意指将接受辐射的含有白蛋白的制剂的 损害降低至不足以妨碍材料的安全和有效使用的水平。稳定剂的实例 包括但不限于下列：抗氧化剂；自由基清除剂，包括自旋捕获剂；联 合稳定剂，即能有效猝灭I型和II型光动力反应的稳定剂；和能够稳 定结合于其上的分子的配体，例如肝素。稳定剂的优选实例包括但不 限于下列：乙醇；丙酮；脂肪酸，包括6，8-二巯基-辛酸(硫辛酸) 及其衍生物和类似物(α，β，二氢，二去甲和四去甲硫辛酸)，硫辛 酸、6，8-二巯基-辛酸、二氢硫辛酸酯(DL-6，8-二巯基辛酸甲酯)、硫 辛酰胺、二去甲甲酯和四去甲二氢硫辛酸、呋喃脂肪酸、油酸和亚油 酸以及棕榈酸及其盐和衍生物；黄酮类、phenylpropaniods、和 flavenols，例如栎精、芸香苷及其衍生物、芹黄素、氨基黄酮、儿茶 素、橙皮苷和柚皮苷；胡萝卜素，包括β-胡萝卜素；Co-Q10；叶黄素； 多元醇，例如甘油、甘露醇；糖，例如木糖、葡萄糖、核糖甘露糖、 果糖和海藻糖；氨基酸及其衍生物，例如组氨酸、N-乙酰半胱氨酸 (NAC)、谷氨酸、色氨酸、辛酸钠、N-乙酰色氨酸和蛋氨酸；叠氮化物， 例如叠氮化钠；酶，例如超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶；尿酸及 其衍生物，例如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；别嘌醇；硫醇，例如 谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽和半胱氨酸；微量元素，例如硒；维生素， 例如维生素A、维生素C(包括其衍生物和盐，例如抗坏血酸纳和棕 榈酰抗坏血酸)和维生素E(及其衍生物和盐，例如生育酚乙酸酯和 α-tocotrienol)；色满醇-α-C6；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2- 甲酸(Trolox)和衍生物；体外蛋白，例如明胶和白蛋白；三-3-甲基-1- 苯基-2-吡唑啉-5-酮(MCI-186)；西替沃酮；puercetin；柯因；二甲 亚砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧沙林(MOPS)；1，2- 二噻烷-4，5-二醇；还原物质，例如丁化羟基茴香醚(BHA)和丁化羟基 甲苯(BHT)；胆固醇；普罗布考；吲哚衍生物；硫汞撒；拉扎碱和甲磺 酸替拉扎特；proanthenols；proanthocyanidins；硫酸铵； Pegorgotein(PEG-SOD)；N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)；4-羟基 -2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇(-oxyl)(Tempol)；抗坏血酸盐、尿酸盐 和Trolox C的混合物(Asc/尿酸盐/Trolox C)；蛋白质和肽，例如甘 氨酰基甘氨酸和肌肽，其中每一氨基酸可以呈D或L形式；地奥司明； pupurogalin；五倍子酸及其衍生物，包括但不限于五倍子酸丙酯、甲 醛次硫酸钠和水飞蓟素。特别优选的实例包括能有效猝灭I型和II型 光动力反应的单一稳定剂或稳定剂的联合，以及能够被作为气体施用 和/或易于通过蒸发、低压和类似的方法除去的挥发性稳定剂。

本文所用术语“残余溶剂含量”意指含有白蛋白的制剂中的可自 由利用的液体的量或部分。可自由利用的液体意思是存在于被灭菌的 含有白蛋白的制剂中的、没有结合到或与含有白蛋白的制剂一种或多 种非液体组分络合的液体，例如水或有机溶剂(例如乙醇、异丙醇、 丙酮、聚乙二醇等)。可自由利用的液体包括细胞内的水。本文中作 为水提及的残余溶剂含量是指通过FDA批准、改进的Karl Fischer 方法(Meyer和Boyd，Analytical Chem.，31：215-219，1959；May， 等人，J.Biol.Standardization，10：249-259，1982；Centers for Biologics Evaluation and Research，FDA，Docket No. 89D-0140，83-93；1990)或近红外线光谱法测定的水平。其它溶剂的 残余水平的定量测定可以用本领域众所周知的方法来进行，这取决于 所使用的溶剂。残余溶剂与溶质的比例也可以看作是溶质在溶剂内浓 度的反映。当如此表示时，溶质的浓度越高，则残余溶剂的量就越低。

本文所用术语“增敏剂”意指这样的物质，其可以选择性地针对 病毒、细菌、朊病毒和/或寄生性污染物，使它们对于辐射灭活更加敏 感，因此与没有增敏剂相比，就使得有可能使用较低的辐射速度或较 低的辐射剂量和/或较短的辐射时间。适宜的增敏剂的实例包括但不限 于下列：补骨脂素及其衍生物和类似物(包括3-乙氧羰基补骨脂素)； inactines及其衍生物和类似物；含有卤素取代基和增加水溶性的基 团例如季铵离子或磷离子的当归根素、凯林和香豆素；结合核酸的化 合物；溴化血卟啉；酞菁染料；红紫素；卟啉；二血卟啉酯的卤化或 由金属原子取代的衍生物、血卟啉衍生物；苯并卟啉衍生物、氢化二 苯并卟啉二马来酰胺、氢化二苯并卟啉、二氰基二砜、四乙酯基氢化 二苯并卟啉和四乙酯基氢化二苯并卟啉二丙酰胺；阿霉素和柔红霉素， 其可以用卤素或金属原子进行修饰；力确兴；BD肽、S2肽；S-303 (ALE化合物)；染料，例如金丝桃素、亚甲蓝、曙红、荧光素(及 其衍生物)、黄素、份菁染料540；光敏化合物，例如佛手内酯；和 SE肽。另外，也可以使用结合到朊病毒并因此增加它们的辐射灭活的 敏感性的原子。这样的原子的实例是铜离子，其结合到朊病毒蛋白是， 并且由于蛋白中Z数目高于其它原子，在辐射特别是γ辐射期间，增加 了朊病毒蛋白吸收能量的概率。

本文所用术语“蛋白质性质的材料”意指，由活生物体产生或获 得的包含至少一种蛋白质或肽的任何材料。蛋白质性质的材料可以是 呈其自然状态，或加工/纯化和/或衍生化后的天然材料，或者是人工 制得的材料，其由化学合成或重组/转基因技术制得，并任选经过加工 /纯化和/或衍生化。蛋白质性质的材料的实例包括但不限于下列：从 细胞培养物制得的蛋白质和肽；奶和其它奶制品；腹水；激素；生长 因子；从动物组织提取或分离的材料，包括药物，例如肝素和胰岛素， 或植物物质；血浆，包括新鲜的、冷冻的和冻干的血浆，以及血浆蛋 白组分；纤维蛋白原及其衍生物、血纤蛋白、血纤蛋白I、血纤蛋白 II、可溶性血纤蛋白和血纤蛋白单体、和/或血纤蛋白密封产品；全血； 蛋白质C；蛋白质S；α-1抗-胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制剂)；丁基- 胆碱酯酶；抗凝血剂，例如香豆素(华法林)；链激酶；组织血纤维 蛋白溶酶原活化剂(tPA)；红细胞生成素(EPO)；尿激酶；neupogen； 抗-凝血酶-3；α-葡糖苷酶；(胎)牛血清/马血清；肉；免疫球蛋白， 包括抗血清、单克隆抗体、多克隆抗体和通过基因工程或制得的抗体； 白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；补体蛋白；和 干扰素。

本文所用术语“辐射”意指辐射足够的能量，以将被辐射的含白 蛋白制剂中的至少一些组分灭菌。辐射的类型包括但不限于下列：(i) 粒子辐射(亚原子粒子如中子、电子和/或质子流)；(ii)电磁辐射 (发生于各种电磁场，例如无线电波，可见(单色和多色)和不可见 光，红外线、紫外线，X-射线，以及γ射线及其混合物)；和(iii) 声音和压力波。这样的射线经常被称做电离(在被辐射的材料中能够 产生离子)射线，例如γ射线，和非离子射线，例如可见光。这样的射 线源可以是多种多样的，通常，对具体的辐射源的选择并没有严格要 求，只要在适当的时间以适当的速度发出足够的辐射来实现灭菌即可。 在实践中，γ射线通常由钴和铯的同位素产生，而UV和X射线则分别 由辐射UV和X-射线的机器产生，电子通常用于在经由机器产生被称 做“E-射线”辐射的方法中灭菌材料。单色和多色的可见光都由机器 产生，并且在实践中与由相同或不同机器产生的不可见光，例如红外 线和UV联合使用。

本文所用术语“保护”意指将接受照射的含有白蛋白的制剂的任 何损害减至不足以妨碍在辐射后安全和有效使用材料的水平。也就是 说，与没有存在该物质或方法相比，如果存在的该物质或进行该方法 使得材料受到较小的辐射损害，则该物质或方法“保护”含有白蛋白 的制剂免受辐射损害。因此，在“保护”材料的物质存在或保护材料 的方法被实施的情况下，在辐射后可以安全和有效地使用含有白蛋白 的制剂，但是在同等情况下，如果没有该物质或未实施该方法，辐射 后含有白蛋白的制剂就不能安全和有效地使用。

B.特别优选的实施方案

本发明的第一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：用适宜的射线以有效地灭菌材 料和保护材料免受辐射损害的速率将含有白蛋白的制剂辐射能将材料 有效灭菌的时间。

本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至少一种稳定剂以有效 保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害的量加到含有白蛋白的制剂 中；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将材 料有效灭菌的时间。

本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂 的残余溶剂含量降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水 平；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含 有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂 的温度降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和 (ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋 白的制剂有效灭菌的时间。

本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂 施加选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余 溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和 (c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用射线以有效速率 将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时 间，其中所述稳定化处理和辐射速率一起有效地保护所述含有白蛋白 的制剂免受辐射损害。

本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋 白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂 施加至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制 剂的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制 剂中；和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用射线以 有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭 菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行，并且 一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。

按照本发明的一些方法，在用射线照射含有白蛋白的制剂之前将 稳定剂加入。优选将该稳定剂以有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射 损害的量加到含有白蛋白的制剂中。适宜的稳定剂的量，可以根据所 使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根据所使用的特定的 稳定剂和/或接受辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征和/或其 预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。

按照本发明的一些方法，在用射线照射含有白蛋白的制剂之前将 含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低。优选将残余溶剂的含量降至 能有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平。残余溶剂的适宜 的水平可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根 据接受辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征和/或其预期应用 而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。对于有些含有白 蛋白的制剂，要求将残余溶剂含量保持在一个特定范围内，而不是一 个具体的值。

当溶剂是水，特别是当一种或多种消化酶的制剂是固相时，残余 溶剂含量一般小于约15％，典型地小于约10％，更典型地小于约9％， 甚至更典型地小于约8％，通常小于约5％，优选小于约3.0％，更优 选小于约2.0％，甚至更优选小于约1.0％，还更优选小于约0.5％， 还甚至更优选小于约0.2％，而最优选小于约0.08％。

溶剂可以优选为非水溶剂，更优选在辐射下不易于形成自由基的 非水溶剂，而最优选为在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或 没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气体的非水溶剂。挥发 性非水溶剂是特别优选的，甚至更优选的是其为稳定剂的非水溶剂， 例如乙醇和丙酮。

在本发明的某些实施方案里，溶剂可以是水与非水溶剂例如乙醇 和/或丙酮的混合物。在这样的实施方案中，非水溶剂优选为在辐射下 不易于形成自由基的非水溶剂，而最优选为在辐射下不易于形成自由 基，并且具有很少或没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气 体的非水溶剂。挥发性非水溶剂是特别优选的，甚至更优选的是其为 稳定剂的非水溶剂，例如乙醇和丙酮。

在优选的实施方案中，当残余溶剂是水时，通过把含有白蛋白的 制剂溶解或悬浮于能够溶解水的非水溶剂中，来降低含有白蛋白的制 剂的残余溶剂的含量。优选地，这样的非水溶剂在辐射下不易于形成 自由基，并且具有很少或没有溶解氧或在辐射下易于形成自由基的其 它气体。

当含有白蛋白的制剂是液相时，残余溶剂的含量的降低可以通过 多种方法来实现，例如通过增加溶质的浓度。以这种方法，溶解于溶 剂内的含有白蛋白的制剂的蛋白质浓度可以增加至一般至少约0.5％， 典型地至少约1％，通常至少约5％，优选至少约10％，更优选至少 约15％，甚至更优选至少约20％，还甚至更优选至少约25％，而最 优选至少约50％。

在本发明的某些实施方案中，可以发现，特定含有白蛋白的制剂 的残余溶剂含量是在一个范围内，而不是一个具体值。对于特定含有 白蛋白的制剂的优选残余溶剂含量，这样的范围可以由本领域技术人 员凭借经验确定。

虽然不想受敷于任何可操作性理论，但是据信，残余溶剂含量的 降低，降低了含有白蛋白的制剂的自由度，降低了用于自由基产生的 目标数目，并限制了这些自由基的溶解度。因此，通过将含有白蛋白 的制剂温度降至低于它的低共熔点或低于它的冰点，或通过玻璃化同 样降低含有白蛋白的制剂的自由度，也可以达到类似的结果。与其它 可以接受的结果相比，这些结果可以容许使用更高的辐射速率和/或剂 量。因此，本文所述方法可以在任何不导致含有白蛋白的制剂受到不 可接受的损害，即会妨碍安全和有效使用含有白蛋白的制剂的温度下 实施。优选地，本文所述方法在室温或低于室温，例如低于被辐射的 含有白蛋白的制剂的低共熔点或冰点的温度下进行。

按照本发明的方法，损害的“可以接受的水平”可以根据所使用 的本发明特定方法的某些特征，例如特定含有白蛋白的制剂的性质和 特征，和/或所使用的二肽类稳定剂，和/或被照射的含有白蛋白的制 剂的预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。因 此，损害的：“不可接受的水平”是将会妨碍安全和有效使用被辐射的 含有白蛋白的制剂的损害水平。在给定的含有白蛋白的制剂中，损害 的特定水平可以用任何本领域技术人员已知的方法和技术确定。

可以用本领域技术人员已知的，用于从含有白蛋白的制剂中降低 溶剂，不给含有白蛋白的制剂造成不可接受的损害水平的任何方法和 技术，将含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低。这样的方法包括但 不限于蒸发、浓缩、离心浓缩、玻璃化和喷雾干燥。

特别优选的降低含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量的方法是冻干 法。

另一特别优选的降低含有白蛋白的制剂中残余溶剂的方法是玻璃 化法，其可以用本领域技术人员已知的方法和技术来进行，包括添加 溶质和/或附加溶质例如蔗糖，以提高含有白蛋白的制剂的低共熔点， 然后逐渐降低含有白蛋白的制剂的压力，以便除去残余的溶剂例如水。 所得玻璃状材料将具有降低的残余溶剂含量。

按照本发明的某些方法，可以用任何本领域技术人员已知且可采 用的方法，将被灭菌的含有白蛋白的制剂固定于固体表面上。例如， 可以将被灭菌的含有白蛋白的制剂作为生物或非生物基质上的包衣或 表面提供。

在本发明方法中，所使用的辐射可以是任何将被处理的含有白蛋 白的制剂有效灭菌的辐射。该辐射可以是粒子辐射，包括E-射线辐射。 优选地，该辐射是电磁辐射，包括X-射线、红外线、可见光、UV光和 各种波长电磁射线的混合物。特别优选的射线形式是γ射线。

按照本发明方法，对含有白蛋白的制剂的辐射，是用有效灭菌含 有白蛋白的制剂，而同时不产生对该材料造成不可接受的损害水平的 速率的射线进行的。射线的适宜速率可以根据所使用的本发明方法的 某些特征而变化，例如根据被辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和 特征，有关射线的特定形式和/或被灭活的特定的生物污染物或病原体 而变化。射线的适宜速率可以由本领域技术人员凭借经验确定。优选 地，辐射速率在灭菌过程中是恒定的。当该速率不切实际或不符合要 求时，可以使用变动的或不连续的辐射。

按照本发明方法，可以将辐射速率进行优化以产生产品收率和完 成操作所需时间的最有利组合。在本文所述方法中，使用低(＜3kGy/ 小时)和高(＞3kGy/小时)速率都可以达到这样的结果。对辐射速 率进行优选以优化含有白蛋白的制剂的收率，而同时仍然使含有白蛋 白的制剂得以灭菌。虽然降低辐射速率可减小对含有白蛋白的制剂的 损害，但其也会导致为达到特定要求的总剂量而需要较长的辐射时间。 因此，在某些情况下可以优选较高剂量的速率，以例如将后勤问题和 成本减到最小，并且当按照本文所述方法使用时，可保护含有白蛋白 的制剂免受辐射损害。

按照本发明特别优选的实施方案，辐射速率不高于约3.0kGy/小 时，更优选为约0.1kGy/小时-3.0kGy/小时，甚至更优选为约0.25 kGy/小时-2.0kGy/小时，还甚至更优选为约0.5kGy/小时-1.5kGy/ 小时，最优选为约0.5kGy/小时-1.0kGy/小时。

按照本发明另一个特别优选的实施方案，辐射速率为至少约3.0 kGy/小时，更优选为至少约6kGy/小时，甚至更优选为至少约16kGy/ 小时，甚至更优选为至少约30kGy/小时，而最优选为至少约45kGy/ 小时或更高。

按照本发明方法，被灭菌的含有白蛋白的制剂是用射线对其辐射 能有效将含有白蛋白的制剂灭菌的时间。与辐射速率相联合，适宜的 辐射时间产生施用于含有白蛋白的制剂的适当辐射剂量。适宜的辐射 时间可以根据有关辐射的特定形式和速率和/或特定含有白蛋白的制 剂的性质和特征而变化。适宜的辐射时间可以由本领域技术人员凭借 经验确定。

按照本发明的方法，将被灭菌的含有白蛋白的制剂用射线照射至 能有效地将含有白蛋白的制剂灭菌，而同时不给该材料造成不可接受 水平的损害的总剂量。辐射的适宜总剂量可以根据所使用的本发明方 法的某些特征而变化，例如根据被灭菌的特定含有白蛋白的制剂的性 质和特征，有关照射的特定形式和/或被灭活的特定生物污染物或病原 体而变化。辐射的适宜总剂量可以由本领域技术人员凭借经验确定。 优选地，辐射的总剂量为至少25kGy，更优选为至少45kGy，甚至更 优选为至少75kGy，而还更优选为至少100kGy或更高，例如150kGy 或200kGy或更高。

被辐射的含有白蛋白的制剂的特定几何形状，例如厚度和离辐射 源的距离可以由本领域技术人员凭借经验确定。

按照本发明的某些方法，在照射之前，可以任选将有效量的至少 一种增敏剂加到含有白蛋白的制剂中，以例如提高辐射对含有白蛋白 的制剂中的生物污染物和病原体的作用效果，同时用本文所述方法将 辐射对含有白蛋白的制剂的有害作用降至最小。适宜的增敏剂是本领 域技术人员已知的，包括补骨脂素及其衍生物和inactines及其衍生 物。

按照本发明的方法，含有白蛋白的制剂的辐射可以在对被辐射的 含有白蛋白的制剂无害的任何温度进行。按照一个优选的实施方案， 将含有白蛋白的制剂在室温下进行照射。依据另一个优选的实施方案， 将含有白蛋白的制剂在低温下，即低于室温的温度下，例如在0℃、 -20℃、-40℃、-60℃、-78℃或-196℃温度下进行照射。按照本发明 的该实施方案，优选在含有白蛋白的制剂的冰点或低共熔点温度下或 低于所述冰点或低共熔点的温度下对含有白蛋白的制剂进行辐射。按 照另一个优选的实施方案，在高温下，即高于室温的温度下，例如在 37℃、60℃、72℃或80℃下对含有白蛋白的制剂进行辐射。虽然不希 望受敷于任何理论，但是据信，使用高温可以增强辐射对生物污染物 或病原体的作用效果，并因此可以使用较低的辐射总剂量。

最优选地，含有白蛋白的制剂的辐射在保护制剂免受辐射损害的 温度下进行。适宜的温度可以由本领域技术人员凭借经验确定。

在本发明的某些实施方案中，进行辐射的温度可在一个范围内， 而不是在一个具体值上。对于特定含有白蛋白的制剂的辐射来说，这 样的优选温度范围可由本领域技术人员凭借经验确定。

按照本发明的方法，含有白蛋白的制剂的照射可以在不对被灭菌 的含有白蛋白的制剂造成损害的任何压力下进行。按照一个优选的实 施方案，将一种或多种消化酶的制剂在高压下进行照射。更优选地， 将含有白蛋白的制剂在由于施用声波或使用挥发物而造成的高压力下 进行照射。虽然不希望受敷于任何理论，但是据信，使用高压可增强 辐射对生物污染物或病原体的作用效果和/或增强由一种或多种稳定 剂提供的保护作用，并因此可以使用较低总剂量的辐射。适宜的压力 可由本领域技术人员凭借经验确定。

一般地，按照本发明方法，进行灭菌的含有白蛋白的制剂的pH值 为约7。然而，在本发明的某些实施方案中，含有白蛋白的制剂可以 具有小于7，优选小于或等于6，更优选小于或等于5，甚至更优选小 于或等于4，最优选小于或等于3的pH值。在另外的本发明实施方案 中，含有白蛋白的制剂可以具有大于7，优选大于或等于8，更优选大 于或等于9，甚至更优选大于或等于10，最优选大于或等于11的pH 值。按照本发明的某些实施方案，进行灭菌的制剂的pH值在包含于制 剂中的酶的等电点或接近等电点。适宜的pH水平可由本领域技术人员 凭借经验确定。

同样地，按照本发明方法，含有白蛋白的制剂的辐射可以在不对 被处理的含有白蛋白的制剂造成损害的任何气氛下进行。按照一个优 选的实施方案，将含有白蛋白的制剂置于低氧或惰性气氛下。当使用 惰性气氛时，该气氛优选由稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量 稀有气体，最优选氩组成。按照另一个优选的实施方案，在辐射时将 含有白蛋白的制剂置于真空下。按照本发明特别优选的实施方案，在 照射之前将含有白蛋白的制剂(冻干的、液体的或冷冻的)贮藏在真 空或惰性气氛(优选稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量稀有气 体，最优选氩)下。按照本发明另一优选的实施方案，在辐射前，将 含有白蛋白的液体制剂置于低压下，以减少溶于液体中的气体特别是 氧气的量，同时采用或不采用减少溶剂的先前步骤例如冻干。这样的 除气法可以使用本领域技术人员已知的方法进行。

在另一个优选的实施方案中，当含有白蛋白的制剂包含有溶解于 其中或与之结合的氧或其它气体时，可以用任何本领域技术人员已知 的方法和技术，例如通过有控制地降低装有被处理制剂的容器(刚性 或柔性)内的压力，或者通过将制剂置于大致相等体积的容器中，将 制剂内的或与制剂结合的这些气体的量降低。

在本发明的某些实施方案中，当被处理的含有白蛋白的制剂是组 织时，按照任何本领域技术人员已知的方法和技术，将至少一种稳定 剂引入其中，包括把组织在含有稳定剂的溶液中浸泡，优选在压力、 高温和/或在渗透促进剂例如二甲亚砜存在下进行浸泡。将至少一种稳 定剂引入组织内的其它方法包括但不限于施加含有稳定剂的气体，优 选在压力和/或高温度下施加；将稳定剂或含有稳定剂的溶液直接注射 到组织中；把组织置于低压下，然后引入含有稳定剂的气体或溶液； 以及两种或多种这些方法的组合。按照这样的方法，可以将一种或多 种稳定剂引入到组织内。

应当理解，本文所描述的一个或多个特征的组合的使用，会进一 步将由辐射所造成的对含有白蛋白的制剂的有害作用减至最小，而同 时保持辐射操作对生物污染物或病原体的充分作用效果。例如，除了 使用稳定剂以外，在辐射之前，还可以把含有白蛋白的特定制剂冻干， 置于降低的温度下和贮存于真空中，以便进一步使有害作用减至最小。

特定生物污染物或病原体对射线的敏感性一般是通过确定灭活或 杀死样本中约37％的目标物所需的剂量来计算的，其称为D37值。含有 白蛋白的制剂的所需组分也可以被看作具有与消除约37％其所需生物 和生理特征所需的辐射剂量相等的D37值。

按照本发明的某些优选方法，含有白蛋白的制剂的灭菌，是在导 致生物污染物或病原体的D37值下降，而同时不降低含有白蛋白的制剂 的D37值的条件下进行的。按照本发明的其它优选方法，含有白蛋白的 制剂的灭菌是在导致含有白蛋白的制剂的D37值增加的条件下进行的。 按照本发明的最优选方法，含有白蛋白的制剂的灭菌是在导致生物污 染物或病原体的D37值降低，而同时含有白蛋白的制剂的D37值增加的 条件下进行的。

                        实施例

下面的实施例是对本发明的举例说明而不是限制。其它适当的修 正和改进是本领域技术人员所通常遇见的变化，并完全在本发明的实 质和范围内。除非另有说明，否则全部辐射皆使用60Co源来实现。

实施例1

在本试验中，在不同水平的残余溶剂含量以及有或没有挥发性稳 定剂存在下，将血浆蛋白组分照射(45kGy，1.9kGy/小时，室温)。

方法

在玻璃小瓶中，配制市售血浆蛋白组分(2mg/ml)样本，其具有 含少量乙醇和丙酮的9％的水，或基本上不含乙醇或丙酮的1％的水。 将样本用γ射线照射(45kGy总剂量，1.9kGy/小时和室温)，然后 进行结构完整性分析。用SDS-PAGE、HPLSEC和反相HPLC测定结构完 整性。

对于SDS-PAGE，按照以下方法制备三份12.5％凝胶：将4.2ml丙 烯酰胺；2.5ml 4X-Tris(pH8.8)；3.3ml水；100微升10％APS 溶液；和10μl TEMED置于具有1×Running Buffer(15.1g Tris基 质；72.0g甘氨酸；在1升水中的5.0g SDS，稀释5倍)的电泳装 置中。将被照射的和对照样本(1mg/ml)在Eppindorf管中用样本缓 冲液(+/-β-ME)稀释，然后离心数分钟。分析20μl每一稀释样本(～ 10μg)。

对于反相HPLC，把每一样本溶解在水中至10mg/ml的终浓度。然 后把这些溶液连续稀释到0.1％三氟乙酸中以达到所需要的浓度。将 10μg每一样本负载到Aquapore RP-300(C-8)2.1×30mm Microbore HPLC上：Applied Biosystems 130A Separation System，流速为0.2 ml/分钟。溶剂A：0.1％三氟乙酸；溶剂B：70％乙腈，30％水，0.085 ％三氟乙酸。

对于HPLSEC，将每一样本稀释至0.4μg/μl，将50μl负载到用 于浓度分析的20μg Phenomenex-Biosep S3000(分子范围5kDa- 700kDa)上：20μl 2mg/ml贮备液+80μl洗脱缓冲液(50mM NaPi+ 100mM NaCl pH6.7)；流速为1ml/分钟。

结果

在辐射至45kGy时，两个样本都显示出了白蛋白的某些破坏，而 与含有较少的水和基本上不含挥发性稳定剂的样本相比，具有含少量 乙醇和丙酮的9％水的样本显示出较轻的破坏和较高的结构复原率。 然而，对于白蛋白的随后使用来说，两个样本的结构复原率都是足够 的。

更具体来说，如附图1A所示，SDS-PAGE分析表明了具有含少量乙 醇和丙酮的9％水的样本具有较好的白蛋白单体复原率。同样地，如 附图1B所示，HPLSEC也表明了具有含少量乙醇和丙酮的9％水的样本 具有较少的聚集。如附图1C所示，反相HPLC显示了辐射的样本和对 照样本之间的并不显著的差异。

实施例2

将人白蛋白(25％)用得自具有改变瘙痒病的仓鼠(263K株)的10 ％脑匀浆以1∶100比例感染。通过涡旋将该样本混合，并把4份6-ml 等份试样的瘙痒病感染的白蛋白分配到10-ml血清小瓶中。将一个小 瓶作为冷冻对照在-80℃贮藏。把三个小瓶放入市售辐射设备中。将一 个小瓶(0kGy对照)冷藏以防止细菌生长。将其余小瓶在室温(20 -25℃)以0.4kGy/小时的速率照射至总剂量为26或50kGy。辐射 剂量用附在每一个小瓶上的辐射剂量计和置放于接近小瓶的外部辐射 剂量计确定。测定被照射的样本和0kGy对照样本的瘙痒病感染性。

通过把0.05ml样本接种到12只仓鼠脑内，然后将其喂养6个月 加以观察来测定感染性。评价三个临床终点：抖动、不能饲养和死亡。 与未辐射的对照组比较，在用以较高剂量处理的样本接种的组中，每 一临床症状的出现迟延了至少8-10天。将数据与列线图进行比较， 所述列线图是用关于大量以极限稀释系列方式感染的动物的潜伏时间 的剂量反应建立的(R.Rowher，未出版数据)。该列线图表示了疾病开 始的天数(通过抖动表明的)与接种的log10 LD50之间的关系。

辐射对生物材料(白蛋白)的作用效果通过如下所述的SDS-PAGE凝 胶电泳和高效尺寸排阻色谱法测定。

在Mighty Small Mini-Vertical Unit SE250/SE260内，在8％ 聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。将样本在PBS中进行1∶100稀释， 然后在含有或不含有5％β-巯基乙醇的Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad)中进行1∶1稀释。样本负载量是12.5μg/道。分子量标志 物是Low-Range Standard(Bio-Rad)。电泳在125伏特进行30分钟。 在50％甲醇、10％乙酸中用0.1％Coomassie Brilliant Blue R-250 将凝胶染色，然后用5％甲醇、9％乙酸脱色。

在130A Separation System(Applied Biosystems)内，在7.8×300 mm Biosep SEC柱(Phenomenex，Torrence，CA)上进行HPSEC。在使 用之前，用0.22μm滤器将0.05M磷酸钠、0.1M氯化钠的洗脱剂缓 冲液(pH6.7)过滤。在洗脱剂缓冲液中，将白蛋白溶液稀释至终浓度 为1.25mg/ml，注射25μl(31.25μg蛋白)。流速1ml/分钟。通 过在280nm的吸收度进行检测。

结果

对于未被照射的对照样本，疾病发作(抖动)的中值潜伏时间是 75天。对于被辐射的样本，将样本辐射至总剂量25kGy和50kGy， 疾病发作的中值潜伏时间分别是88天和90天。与列线图比较给出的 估计值是，对于未被照射的对照样本，log10效价为6.5，而对于被照 射至总剂量25kGy和50kGy的样本，则分别是4.8和4.6。根据这 些估计值，对于被照射至总剂量25kGy和50kGy的样本，中值减少 因数分别是1.7和1.9。这些数据给出了中值减少值的估计值，但是 没有给出通过该试验预测的最大可能减少。为了给出这种最大可能减 少，应当将对照组的95％置信区间(CI)的最小值与辐射处理组的95 ％CI的最大值进行比较。该计算将获得位于95％CI内的效价的最大 减少因数。对于50kGy组，该值为3.5对数减少。

生物污染物或病原体对射线的敏感性通常用其D37值表示。这表示 将活性生物污染物或病原体的数目降至其辐射前数目的37％所需的辐 射剂量。因此，D37值越低，特定生物污染物或病原体对辐射作用的敏 感性就越高。实验测定的瘙痒病朊病毒的D37值约为47kGy(Rohwer， Nature，308，5960，pp.658-662，1984)。利用本文所述方法，出 乎意料的发现，瘙痒病朊病毒的D37仅为4.5kGy。因此，使用本实验 中所采用的方法和制剂降低了朊病毒的D37值。这样，就实现了增加对 瘙痒病朊病毒的杀伤力，而同时保持了本实验使用的生物材料—一种 市售治疗用25％人白蛋白溶液的完整性。

实现了增加对瘙痒病朊病毒的杀伤力，而同时保持了被处理的、 含有白蛋白的制剂的本质生物和生理特征。在用γ射线照射至25、50 和100kGy的总剂量之前和之后，对这种特定生物材料-25％人白蛋 白溶液进行检查。如凝胶电泳(附图2A-2B)所示，在最高达50kGy 的辐射剂量下，白蛋白大部分是完整的，只有少量的裂解和聚集，以 及单体形式白蛋白的量仅有轻微减少。对于所有白蛋白样本，都获得 了类似结果而与是否含有任何抗坏血酸盐和/或仓鼠无关。在较高剂量 时，在白蛋白样本中发现较小的变化，主要形式是白蛋白的聚合增加。

更为详细的分析是用HPSEC进行的。如附图2C-2F所示，在照射 时，白蛋白单体的量减少(在10.5分钟为峰值)，二聚物的量增加 (9分钟)以及聚合物的量增加(7.2分钟)。这些变化在抗坏血酸盐 存在的情况下都减小了。其余在12.6和15.3分钟的峰值分别是抗坏 血酸盐和N-乙酰基色氨酸稳定剂的峰值。

实施例3

在本试验中，在约4℃，以1.847kGy/小时的速率将冻干的白蛋 白(含有5％尿激酶)照射至总剂量为10和40kGy。

使用TSK凝胶G4000SWx130cm×7.8mm柱通过凝胶过滤分析样本， 分离范围是20kDa-7,000kDa，洗脱缓冲液是0.1M磷酸钠/0.1M 硫酸钠(pH6.5)，流速是1ml/分钟。

如附图3A所示，当冻干然后照射至10kGy或40kGy总剂量时， 在白蛋白中没有发生变化。相反，如附图3B所示，当照射至40kGy 总剂量时，液体白蛋白样本表示出显著降解。

实施例4

在该试验中，制备白蛋白溶液(25％)的样本并将样本的一半用 氩气喷雾。

将样本以0.91、0.92或1.01kGy/小时的速率分别辐射至总剂量 18.1、23和30.4kGy。用SDS-PAGE对被辐射的样本进行聚集和裂 解分析，用HPLSEC对其进行二聚作用和聚合作用分析。

如附图4A-4B所示，即使对于被辐射至总剂量30.4kGy的样本， SDS-PAGE也仅显示了少量的裂解(在减少的凝胶上在66kDa谱带下 的双峰)和聚集(在未减少的凝胶上的116kDa谱带)。

HPLSEC显示了如下峰值：   总剂量   (kGy)    聚合物    (w/Ar)    二聚体    (w/Ar)    聚合物    (无氩)    二聚体    (无氩)  0(对照)     4.0％     1.8％     4.4％     2.7％  18.1     5.1％     5.6％     5.1％     6.6％  23     6.2％     7.0％     6.0％     8.7％  30.4     7.2％     8.3％     7.3％     9.8％

如HPLSEC所示，在辐射前用氩气喷雾的样本中看到较轻的二聚作用。

实施例5

本试验中，在-20℃将血浆蛋白组分辐射至不同总辐射剂量(10、 30或50kGy)。

方法

在玻璃小瓶中，配制市售血浆蛋白组分样本，其具有含少量乙醇 和丙酮的9％水的低溶剂水平。在-20℃以1.608kGy/小时的速率用γ 射线将样本辐射至10、30或50kGy的总剂量，然后进行结构完整性 分析。结构完整性用SDS-PAGE和HPLSEC确定。

对于SDS-PAGE，按照以下方法制备四份12.5％凝胶：将4.2ml 丙烯酰胺；2.5ml 4X-Tris(pH8.8)；3.3ml水；100μl 10％APS 溶液；和10μl TEMED置于具有1×Running Buffer(15.1g Tris基 质；72.0g甘氨酸；在1升水中的5.0g SDS，稀释5倍)的电泳装 置中。将被辐射的和对照样本(1mg/ml)在Eppindorf管中用样本缓 冲液(+/-β-ME)稀释，然后离心数分钟。分析20μl每一稀释样本(～ 10μg)。

对于HPLSEC，在Applied Biosystems 130A Separation System 内，将31μl每一样本负载到Biosep SECS3000 7.7×300mm柱，在 50mM Na2HPO4(pH6.7)，100mM NaCl中，流速为1ml/分钟。

结果

如附图5A-5B所示，SDS-PAGE分析表明了来自被辐射的样本，甚 至达到50kGy辐射总剂量的样本的白蛋白单体的定量回收率。同样地， 如附图5C-5F所示，HPLSEC表明，在任何被辐射的样本，甚至达到 50kGy射线总剂量的样本中，聚集作用没有增加。

实施例6

在本试验中，让得自American Type Culture Collection的幼仓 鼠肾(BHK)细胞在含有20％(体积/体积)胎牛血清(FBS)的培养 基中生长，并让它们慢慢地适应生长环境，以最终能够在仅具有0.25 ％FBS的情况下生长(其为它们的正常FBS需要量的5％)。然后减少 FBS，用未被辐射或在-20℃、以1.608kGy/小时辐射至50kGy总辐 射剂量的市售血浆蛋白组分补充该培养基，以使血浆蛋白组分为培养 基(600mg)的0.3％重量/体积。

结果

在生长于含有未被辐射的血浆蛋白组分的培养基上的BHK细胞与 生长于含有已被辐射至50kGy总剂量的血浆蛋白组分的培养基上的 BHK细胞之间没有可观察到的差别。

实施例7

在本试验中，将含有猪细小病毒(PPV)的血浆蛋白组分在-80℃ 温度下辐射至不同的总辐射剂量。

方法

使用20％PEG8000在2.5M NaCl中的溶液制备PPV贮备液#7。将 用PEG沉淀的病毒团重悬在PEG缓冲液(0.1M NaCl，0.01M Tris(pH 7.4)，1mM EDTA)中。

方法1

将50μl PK-13培养基或PPV贮备液#7加到2ml Wheaton小瓶 中，并在40℃干燥过夜。一旦液体已被干燥，即加入50mg市售血浆 蛋白组分，并把小瓶塞住，然后在-80℃、以5.202kGy/小时的速率 将其辐射至10、30或45kGy的总剂量。

方法2

将50mg市售血浆蛋白组分置于2ml Wheaton小瓶中，然后与 150μl PK-13培养基或150μl稀释的PPV贮备液#7(100μl PK-13 培养基+50μl PPV)混合直到溶解。将小瓶塞住，然后在-80℃、 以5.202kGy/小时的速率将其辐射至10、30或45kGy的总剂量。

TCID50分析

将850μl PK-13培养基(DMEM ATCC#3020002，10％FBS Gibco #26140079，1％Pen/Step/L-Glutamine Gibco#10378016)加到每个 小瓶中，使其体积达到1ml。用13mm滤器(Becton Dickenson#4454) 和3ml注射器将样本过滤灭菌。

在96-孔平板中感染的前一天，将PK-13细胞(ATCC#CRL-6489)保 持在PK-13生长培养基中，在40％铺满时接种。当细胞达到70-80 ％铺满时，向4个孔中加入50μl所需的辐射过的样本(含有PK-13 培养基或稀释的PPV贮备液#7)。

SDS-PAGE

辐射后，在HPLC水中制备样本的贮备液(10mg/ml)，然后稀释 (2mg/ml)。将样本用2×样本缓冲剂(含有或不含有DTT)进行1∶1 稀释，然后负载到凝胶上：5μg(10μl)用于得自方法1的样本，10 μg(10μl)用于得自方法2的样本。

结果

按照方法1在-80℃下用45kGy的总剂量辐射的PPV处理的血浆 蛋白组分表现出3.9log的病毒杀灭(0.084log/kGy)。按照方法2 在-80℃辐射的PPV处理的血浆蛋白组分表现出5.54log的病毒杀灭 (0.123log/kGy)。这些结果以图表形式显示于附图6。被辐射的血 浆蛋白组分在PK-13细胞中没有引起任何细胞病变效应。

还使用SDS-PAGE测定在-80℃辐射的PPV处理的血浆蛋白组分。 这些结果如附图6B-6C所示。

实施例8

在本试验中，将含有白蛋白和因子VIII的冷冻制剂进行辐射。

方法

将含有白蛋白和因子VIII的样本冷冻，然后用γ射线辐射至45kGy 的总剂量。

结果

如附图7所示，在对照(未被辐射的)样本的FVIII活性与冷冻 并用γ射线辐射至45kGy的样本的FVIII活性之间没有差别。

实施例9

在本试验中，将血浆蛋白组分(含有95-98％人血清白蛋白)在 不同的条件下进行辐射。

方法

使用差示扫描量热法(DSC)对PPF结构完整性和稳定性进行分析， DSC是用于测定生物大分子的短期和长期稳定性的最为敏感和直接的 方法。通过将被辐射的PPF与未被辐射的样本(移动对照)在等同溶 剂条件/配方下进行比较，来评价辐射对这些物理化学特性的影响。该 结果为选择对PPF产品造成最低损害的最理想γ辐射处理条件提供了 热动力学和结构基础。可以按照在被辐射的和未被辐射的PPF之间的 差别来选择γ辐射的最佳条件(pH、离子强度、温度、剂量、剂量速率) 以获得所需结果。

在稳定剂(4mM N-乙酰基色氨酸(AT)或4mM辛酸盐(CA)或 4mM AT和4mM CA的组合)存在下，将5％PPF溶液在60℃进行10 小时加热巴氏灭菌。在所需加热期间，将稳定剂加到未被辐射的和被 辐射的PPF(在γ辐射后加入)中以提高PPF的稳定性。在-80℃，用 5kGy/小时的剂量速率将辐射进行至50kGy的总剂量。被辐射的PPF 含有约1％的水分。

通过下述方法监测作为热稳定性指标的白蛋白聚集体形成：(i) 在370nm进行光散射；(ii)在减少和未减少的条件下进行SDS PAGE； 和(iii)HPLC。把PPF粉末溶解在1×PBS缓冲剂中，将pH值调节至 7.0，并把蛋白浓度调节至50mg/ml。在恒温水浴内，将样本在塞住 的聚丙烯管里于60℃加热。使用扫描量热法，通过比较在巴氏灭菌之 前和之后，被辐射与未被辐射的PPF的变性温度(Tmax)和变性焓(Δ Hcal)来确定PPF的结构稳定性和完整性。

结果

被辐射的与未被辐射的PPF的结构稳定性的比较

在降低(a)和未降低(b)的条件下被辐射的与未被辐射的PPF的 SDS PAGE表明，就γ射线所导致的白蛋白降解和/或与聚合有关的巯基 而言，在未被辐射的与被辐射至50kGy的材料之间没有显著不同(仅 在PAGE谱带强度方面有轻微改变)。

在得自DSC试验的量热特性中观察到的差别表明了被辐射样本在 第三级结构稳定性方面的变化。应当提及的主要差别与同未辐射材料 相比被辐射的PPF的变性跃迁的协同性降低及其变性焓下降有关。

被辐射和未被辐射的PPF的过度热容量的解卷曲比较分析表明， 最大变性跃迁的温度下降与在结构稳定性方面与它们不同的另外的白 蛋白分子群体有关。蛋白的高稳定性和低稳定性部分的产生似乎是由 于变性跃迁的协同性下降所致，其通常是由于稳定天然蛋白三级结构 的内部相互作用网络的减少而造成的。被辐射的PPF的变性跃迁的协 同性下降改变了量热性质(相对于未辐射的PPF)，其不应当被视为全 体天然分子的分子间损害，而是应当看作是辐射靶目标的一些分子的 稳定性改变。虽然被辐射的PPF的变性跃迁的去协同不意味着分子的 严重损害，但是白蛋白的去稳定化在加热巴氏灭菌方面变得重要，即 必须保护热稳定性(Td)小于60℃的白蛋白分子的去稳定化部分以不被 热处理变性。

γ辐射后PPF粉末中的水分含量对白蛋白复原率的影响

在-20℃下，以45kG、1.8kGy/小时辐射的具有不同水分含量的 PPF粉末的量热扫描显示，当PPF粉末中的水分含量从8.6％增加至液 体状态时，量热曲线下的面积减小，其被解释为在γ辐射后具有天然结 构的白蛋白分子数目减少了。在液体状态下被辐射的PPF表现出最严 重的损害。

以不同的剂量速率(1.8kGy/小时或6.5kGy/小时)和水分含量(9 ％或1％)进行γ辐射后，白蛋白结构的复原率作为辐射温度(-80℃、 -20℃或20℃)的函数而变化。白蛋白复原率的定量值可以计算为被 辐射的与未被辐射的PPF的焓的比值。变性作用的整体焓的降低表明 具有较高水分含量的PPF粉末的辐射降低了分子的复原率。这些结果 表明，在这些条件下的γ辐射对PPF的损害可能与源自自由基生成的继 发效应有关。

γ辐射后温度对白蛋白复原率的影响

白蛋白结构的复原率强烈地取决于PPF辐射的温度，其随着辐射 温度的降低而增加。在-80℃时，低水分样本的结构复原率好于较高水 分的样本。

市售稳定剂对PPF的影响

用差示扫描量热法、SDS PAGE和尺寸排阻色谱法来确定CA和AT 对人PPF的热稳定性的影响。

在4mM AT存在下，发生白蛋白变性的温度(Tm)从65.4℃增加至 67.6℃。同样地，在4mM CA存在下，最大热容量的温度(Tmax)从65.4℃ 增加至72.03℃。然而，在既有4mM AT也有4mM CA存在的情况下， 白蛋白热稳定性仅有4.6℃的增加，其Tm从65.4℃变为70.5℃。

CA和AT对被辐射的PPF具有类似稳定作用，虽然在同等溶剂条件 下幅度稍微偏低。CA和AT在4mM阻止了大量蛋白的变性，但对于被 辐射的蛋白，当加热至最高达60℃时，却不能够避免带来浑浊的高分 子量聚集体的10-15％的低聚反应。

把CA的浓度增加到8mM导致白蛋白热稳定性显著增加，即在82℃ 变性，而在4mM CA浓度下，是在65.4℃变性。这表明，在高于4mM 的浓度下，辛酸盐具有显著的稳定白蛋白的能力，使白蛋白在60℃能 够抵抗变性，而60℃通常是抗病毒巴氏灭菌法所使用的温度。

HPLC分析表明，巴氏灭菌之前，在CA存在下被辐射的和未被的 PPF基本上是单体。对于被辐射的PPF，加热后由加热产生的高分子量 聚集体的量高于未被辐射的材料。在既有CA又有AT存在的情况下， 被辐射的PPF中所引起的聚集体的百分比比只有CA时低几乎两倍，这 表明虽然在PPF中除了CA以外还有AT时不能够显著地增加它的热稳 定性，但在60℃加热10小时期间，却能抑制白蛋白的聚集。PPF中由 加热引起的白蛋白的聚集在未缓冲的PPF溶液中比在PBS缓冲液中更 为明显。

为测试所产生的聚集体的降解和性质而在减少的条件下进行的 SDS PAGE显示，与高分子量聚集体相对应的谱带消失了。这表明将γ 照射的白蛋白暴露在60℃热处理10小时后，形成了分子间S-S键， 从而产生了稳定的蛋白复合物。通过让其经由0.22μm滤器过滤不能 将聚集的分子与天然单体形式分离开。分子间聚集发生的程度取决于 PPF溶液的pH值和离子强度以及它的浓度。

在巴氏灭菌之前，当通过加入盐酸使蛋白溶液降低pH值(6.5- 4.5)时，或当PPF溶液没有被适当地调节至pH7.0时，蛋白溶液在 暴露于60℃的第一个十分钟期间逐渐聚合。虽然pH值从7.0降低到 5.5时CA结合白蛋白的亲和力稍微增加，但其在60℃的必需加热期间， 在给定的稳定剂浓度下(4mM)，不足以将蛋白的变化减至最小。

在巴氏灭菌(在60℃)之前和之后进行的，关于在-20℃和-80℃ 被辐射的样本的PPF的温度记录图显示，当PPF粉末在-80℃被辐射时， 两种处理(γ辐射和巴氏灭菌)后的白蛋白分子的损害都降低了。

实施例10

在本试验中，将血浆蛋白组分(含有95-98％人血清白蛋白)在 不同的条件下进行辐射。

方法

PPF冻干粉末的γ辐射条件是：-80℃、50kGy、5.02kGy/小时。

结果

在减少的和未减少的条件下的SDS PAGE显示，与没有抗坏血酸盐 的被辐射的材料相比，将抗坏血酸盐以100mM的浓度加到PPF中，使 被γ辐射的材料的谱带强度得到显著改善。这表明，在抗坏血酸盐存在 下，因γ辐射引起的蛋白降解比没有抗坏血酸盐时要轻。

在100mM抗坏血酸盐存在下，在巴氏灭菌之前对被辐射的和未被 辐射的材料所做的HPLC分析显示，被辐射的和未被辐射的蛋白在多肽 链的化学完整性以及单体和多体形式数量方面几乎是相同的。

使用在有(a)和没有(b)以及只有(c)抗坏血酸盐存在的情况下，未 被辐射和被辐射的PPF的量热扫描来评价这些形式的热稳定性。PPF 的量热测定是在PBS缓冲液，pH7.0中进行的，用于全部试验的蛋白 浓度为4.4mg/ml。在100mM抗坏血酸盐存在下，未被辐射的和被辐 射的PPF的量热扫描的比较显示，在γ辐射后的其复原率方面得到了显 著改善。虽然在抗坏血酸盐存在下由热引起的变性作用的量热特性与 没有抗坏血酸盐存在下是不同的，但其对于被辐射的和未被辐射的PPF 却是非常地相似。

所得结果表明：(a)浓度为100mM的抗坏血酸盐在γ辐射期间保 护白蛋白免于结构损坏；(b)在加热到70℃并有催化氧化反应的金 属存在的情况下，抗坏血酸盐表现出化学变化(假设是氧化)；和(c) 在辐射期间抗坏血酸盐发生了变化，这可能是与自由基的相互作用引 起的，这种变化可通过量热分析定量评价，并且使得可精确地确定保 护蛋白免受自由基损害所需的最佳抗坏血酸盐浓度。

在有和没有抗坏血酸盐存在下巴氏灭菌的γ辐射与未辐射的PPF的 SDS-PAGE谱带强度的比较表明，与没有抗坏血酸盐存在的情况相比， 当在100mM抗坏血酸盐存在下进行辐射和巴氏灭菌时，白蛋白发生较 少的降解。

在含有100mM抗坏血酸盐的100mM钠同等物溶液，pH7.0中， 对未加热(a)和巴氏灭菌(b)的PPF进行的量热扫描表明，将被辐射的 PPF在60℃加热10小时没有引起蛋白结构发生任何改变，这与在加热 巴氏灭菌后未被辐射的白蛋白类似。对于这两种蛋白，最大变性跃迁 的温度是相同的，这意味着它们具有类似的结构稳定性。对于被辐射 和未被辐射的白蛋白，它们在巴氏灭菌之前和之后的例如量热图形状 都有小的差异，这是由于在抗坏血酸盐存在下，蛋白在高温下的稳定 性提高了所致。在抗坏血酸盐存在下，蛋白抗热变性的稳定性提高了 3.8℃。该稳定性给蛋白结构提供了抗在60℃长时间加热的另外的保 护作用。

被辐射与未被辐射的材料之间的主要差别是热容量的最大放热峰 的温度。放热效应与在γ辐射作用下抗坏血酸盐转化成氧化形式有关。 在被γ辐射的抗坏血酸盐中，由加热引起的转化过程是在43℃进行，而 在未被辐射的抗坏血酸盐中，该过程在50℃达到最大。这意味着，通 过暴露于γ辐射，抗坏血酸盐在其化学结构方面发生了变化，使得被辐 射的抗坏血酸盐比未被辐射的抗坏血酸盐更容易转化成氧化形式。

如下所述通过比较变性跃迁的焓来定量评估被辐射和未被辐射的 白蛋白的结构完整性，结果表明它们之间的差别小于15％。结构完整 性比在没有抗坏血酸盐存在下观察的结果好得多，其中在巴氏灭菌后 被辐射的PPF的复原率接近70％。

在有和没有抗坏血酸盐存在下进行的巴氏灭菌之后，被辐射和未 被辐射的HPLC分析能够定量评估巴氏灭菌后PPF中的单体/聚集体数 量，其表明，在没有抗坏血酸盐存在的情况下，将未被辐射的PPF在 60℃巴氏灭菌10.5小时导致产生了接近12.4％的聚集体。在将γ辐射 的PPF巴氏灭菌后，聚集体的数量增加至36.3％。在100mM抗坏血 酸盐存在下PPF的巴氏灭菌将S-S交联的聚集体的数目减少了几乎14 ％-22.8％。

实施例11

在本试验中，将得自糊的人血清白蛋白在不同的条件下进行照射。

方法

将主要含有白蛋白的Fraction V糊沉淀在水中重新配制和加工以 获得人白蛋白。最终的溶液在pH7.0的未缓冲溶液中含有20mg/ml 蛋白，蛋白中白蛋白的含量是97％。从重新配制的糊获得白蛋白的收 率是约30-35％。在密封的玻璃小瓶中，在-80℃将Fraction V糊沉 淀以1.8kGy/小时的速率辐射至50kGy的总剂量。把移动对照样本 在等同的条件下贮藏。按照操作，用丙氨酸辐射剂量计测定辐射剂量 并用温度因子校正。在巴氏灭菌之前，将市售稳定剂辛酸盐(CA)和 N-乙酰色氨酸(AT)加到白蛋白溶液中至4mM的浓度。通过在60℃连 续加热10小时来进行巴氏灭菌。

结果

由糊纯化得到的白蛋白的SDS PAGE表明，在有或没有稳定剂存在 的情况下，纯化的白蛋白具有～96％的纯度。达到50kGy的γ辐射产 生了高和低分子量的白蛋白分子，这是由于多肽链的降解和其转化成 S-S交联聚集体而产生的。在减少的条件下，后者转化成低MW片段。 两者的数目都是相当少，为全部蛋白的～8％。巴氏灭菌没有改变谱带 的强度，这表明在10个小时的加热期间没有发生化学降解。对于被γ 辐射的蛋白，巴氏灭菌最显著的结果是，它引起了分子间交联，表现 为在凝胶上的高分子量聚集体。对于未被辐射的蛋白，没有观察到聚 集状态。

在AT和CA存在下，巴氏灭菌之前和之后，γ辐射后的白蛋白样本 的HPLC分析显示，辐射导致二聚体和多聚体稍微增加，而单体形式稍 微减少。在HPLC的未减少的条件下，多聚体是通过多肽的裂解形成的 (见SDS PAGE)，并通过S-S交联而稳定。在被辐射的白蛋白中，在 60℃进行10个小时的巴氏灭菌导致白蛋白的分子质量向形成高分子 量聚集体的方向显著重排。

在没有AT和CA存在的情况下，被辐射和未被辐射的白蛋白的DSC 分析显示，被辐射的白蛋白的主要部分与未被辐射的蛋白的热稳定性 是类似的。然而，被辐射的白蛋白具有某些分子，其与天然白蛋白相 比具有较低的稳定性。

被辐射的和未被辐射的白蛋白的过度热容量函数的解卷曲分析表 明了下述内容。虽然未被辐射的白蛋白的热容量函数符合简单的变性 跃迁二态模型，但是未被辐射的白蛋白表现出更复杂的行为。其由至 少两个独立群体的热稳定性不同的白蛋白分子组成。一个群体是其热 稳定性类似于未辐射蛋白的分子，另一个群体与去稳定化分子有关。 最后一部分被辐射的白蛋白在巴氏灭菌温度下(60℃)对变性最敏感， 并且可能是它们形成了S-S交联的聚集体。加入市售稳定剂AT和CA 增加了被辐射和未被辐射的白蛋白的稳定性。

在稳定剂存在下，90％以上的未被辐射的分子具有高于60℃的热 稳定性，因此，在60℃巴氏灭菌时能够避免热损害。虽然大多数被辐 射的分子在CA和AT存在下也是稳定的，但是有一部分(10-15％) 分子还是具有低于60℃的稳定性。这部分分子在巴氏灭菌时预计会发 生不可逆的变性。

在巴氏灭菌之前和之后被辐射的和未被辐射的白蛋白的DSC分析 显示，具有低于60℃的热稳定性的部分在加热过程中转化成了变性的 形式。被辐射的白蛋白的变性跃迁峰在巴氏灭菌后变得更加协同，这 表明富含天然结构，而转化成变性形式的低稳定性白蛋白分子则很少。

使用HPLC来测定γ辐射和巴氏灭菌后白蛋白的质量复原率。使用 Peak Fit程序，由这些形式的峰百分比来评估单体、多聚体和低分子 量碎片数量。辐射后质量的损失主要与少量聚合物(～2％)的形成有 关。

以作为蛋白结构完整性标志的稳定焓的DSC分析为基础，来确定γ 辐射和巴氏灭菌后白蛋白的三级结构复原百分比。得自被γ辐射的糊的 白蛋白的复原率为81-82％，其接近于先前对得自被辐射的PPF粉末 的白蛋白所评估的78-80％。当把市售稳定剂CA和AT以4mM的浓 度分别或组合加入时，在白蛋白的复原百分率方面没有观察到显著的 差别。

被γ辐射的白蛋白的巴氏灭菌导致蛋白结构的额外约10％的损失， 这时由于在60℃加热10个小时期间，去稳定化的分子群体的变性所 致。

在巴氏灭菌以及随后在pH4.9、10mM Na-Ac缓冲液中为通过沉 淀而除去受损分子所进行的透析之后，被辐射的白蛋白的HPLC分析显 示，在透析和通过离心除去不溶材料之后，由巴氏灭菌导致的交联聚 集体的量显著减少了。然而，这种方法的缺点在于，尽管可以优先除 去70％聚集的材料，但是在pH4.9的透析期间，有相当数量的完整 蛋白也被除去了。

保护性添加剂的选择是以它们的清除能力和乙醇/水溶解性为基 础。添加剂在有机和水溶液中具有不同溶解度的能力是必需的，这样 在它们是实质可溶的时，能够保护糊(有机母液)中的蛋白，而当不 溶时，在水溶液中重新配制时就有助于它们的除去。

为了均匀分布并溶解在有机环境中，在0℃将清除剂和稳定剂加到 白蛋白糊中。将含有添加剂的糊冷冻以为在-80℃下为辐射做准备。然 后从被辐射的和未被辐射的糊中纯化出白蛋白。

在不同清除剂存在下于-72℃被辐射至50kGy(4.6kGy/小时)的 得自糊的白蛋白的SDS PAGE表明，辐射导致了全部材料的约10％发 生裂解，其在清除剂存在下并没有被改善。

根据DSC比较在不同稳定剂存在下的Fraction V白蛋白的结构复 原率表明，在月桂酸(91％)和维生素E(87.3％)存在下观察到了最佳 的白蛋白复原率。然而，虽然白蛋白的复原率看上去很高，但是这些 数据没有反映出完整情况，因为在所有情况下，与没有清除剂存在相 比，蛋白的总收率是约40％。存在的添加剂显著改变了白蛋白的溶解 度，朝着形成不溶性聚集体的方向改变。

实施例12

在本试验中，在有或没有SDS存在下对白蛋白进行辐射。

结果

存在的100μM SDS提高了在PBS缓冲液(pH7.0)中于64-80.5℃ 测定的白蛋白的热稳定性。在这样的低浓度下，众所周知是强变性剂 的SDS对白蛋白结构有相反影响，将其稳定了20℃以上。这表明SDS 对白蛋白有特异结合亲和力，与脂肪酸例如月桂酸相差不大。

将SDS加到在没有SDS的情况下进行辐射的白蛋白中，仅稳定了 没有被γ辐射损害的白蛋白。正如所看到的那样，在γ辐射之后，78％ 的蛋白保持其结合SDS的能力，而25％的分子失去了这种能力并且不 能被稳定。配体结合测试使得易于将未被辐射损害的天然分子与失去 其天然结合性质的分子鉴别开和分离出来。失去其天然结合性质的白 蛋白分子在60℃的热处理下不能存活，因此在巴氏灭菌后产生变性的 材料。巴氏灭菌的材料的热容量峰缺乏在巴氏灭菌之前观察到的低稳 定性群体，在形状上与未被辐射的蛋白的热容量峰类似。该观察还证 实了，在巴氏灭菌之后，通过能将天然白蛋白与变性形式白蛋白区别 开的方法(例如仅与天然形式相互作用的配体结合基质)可将天然白蛋 白与被辐射的部分分离来。

在没有和有100μM SDS存在下被辐射的白蛋白的DSC表明，在部 分热容量的预变性值方面有显著差别，这意味着在辐射期间，存在的 SDS保护蛋白不转化成变性状态。依据该热动力学标准，与在SDS存 在下相比，在没有SDS存在的情况下被辐射的白蛋白含有更多的变性 材料。

在巴氏灭菌之前和之后，在没有SDS存在的情况下被辐射的相同 白蛋白样本的HPLC分析表明，在60℃将这些样本(在没有SDS的情况 下被辐射的)巴氏灭菌10.5小时导致出现了交联的聚集体。这些高MW 聚集体得自在辐射期间已经变性，并且在巴氏灭菌期间热稳定性低于 60℃的分子群体。在γ辐射期间没有被损害，因此能够被SDS稳定的白 蛋白分子在热巴氏灭菌期间可以保持其完整性。

这些样本的SDS PAGE分析表明，如果白蛋白被γ辐射损害，并且 转化成变性形式，则变性的分子在10小时的巴氏灭菌期间形成S-S交 联聚集体。主要呈天然形式的未被辐射的白蛋白在巴氏灭菌期间不表 现出聚集。

本试验证实，存在的SDS不仅在巴氏灭菌期间可提高白蛋白复原 率(当其把白蛋白热稳定性提高至60℃以上时)，而且在辐射期间也 能提高其在γ辐射之后的复原率。

为了确定对白蛋白有最大保护作用，同时不将白蛋白变性的最佳 SDS浓度，在两个冷冻和冷冻干燥的制剂中测定在不同浓度的SDS下 蛋白的复原率。使用下列辐射条件：50kGy，4kGy/小时，-72℃。

如下所述制备含有SDS的样本：将SDS加到由Fraction V糊中纯 化的白蛋白中。根据SDS(288.38Da)和白蛋白(66470Da)的MW计算摩 尔比。将样本在-53℃冷冻干燥至水分含量约为10％(未预先测定)。 在冰浴(-72℃)上，将冷冻干燥的样本以1.42kGy/小时的速率辐射至 50kGy，辐射后，将粉末在PBS缓冲液，pH7.0中重新配制。根据该 试验的特定目的，将重新配制的样本稀释至特定生物物理测定或用PBS 缓冲液透析所需的浓度。

用5％白蛋白进行另一组试验。除了在浓度分别为4mM的市售稳 定剂AT和CA存在下，该白蛋白与得自糊的白蛋白的结构特征方面没 有表现出任何差别。将SDS加到产品中，将样本在干冰上以冷冻状态 辐射至50kGy，1.415kGy/小时。

在巴氏灭菌之前和之后，在有和没有SDS存在下的5％白蛋白的被 辐射和对照样本的SDS PAGE分析表明，以1∶10的摩尔比存在的SDS 使得S-S交联聚集体消失，其可用于在没有SDS存在的情况下在巴氏 灭菌之后观察，以1∶1的摩尔比存在的SDS不足以保护蛋白不形成聚 集体。

被辐射的白蛋白样本的HPLC分析表明，γ辐射仅导致二聚体和多 聚体含量的少量增加，而在60℃的热处理导致经由分子间S-S交联生 成了大量高MW聚集体。在1∶10摩尔比的SDS存在下的白蛋白的HPLC 分析表明，该浓度的SDS白蛋白完全保护了被辐射的白蛋白不发生聚 集，使得其不能与未被辐射的蛋白区别开。

在没有和有SDS存在下在液体制剂中被辐射的白蛋白的DSC分析 表明，存在的SDS不仅在辐射期间提高了白蛋白的热稳定性，更重要 的是，其显著提高了在辐射后的蛋白结构复原率。与在没有SDS存在 的情况下被辐射的白蛋白相比，在SDS存在下的蛋白复原率提高了90 ％。在量热曲线上的被辐射的白蛋白的吸热峰的位置表明，有90％以 上的被辐射的分子具有60℃以上的稳定性，预计这对于在60℃进行巴 氏灭菌时保护蛋白是很重要的。

巴氏灭菌后，被辐射和未被辐射的白蛋白的DSC分析表明，在没 有SDS存在的情况下，巴氏灭菌使得被辐射的样本几乎有20％的白蛋 白发生了变性，而在SDS存在下，巴氏灭菌不影响蛋白结构。SDS对 白蛋白结构的稳定作用保护了被辐射的蛋白在巴氏灭菌期间不被损 害。

在不同量SDS存在下的γ辐射和巴氏灭菌之后的白蛋白的结构复原 率表明，以1∶1蛋白/SDS摩尔比存在的SDS仅轻微地提高了在辐射期 间的蛋白复原率。然而，在该浓度下，在巴氏灭菌期间其不保护被辐 射的白蛋白不发生变性。相反，当蛋白/SDS摩尔比增加至1∶10时， 其提高了保护蛋白免受γ辐射和巴氏灭菌损害的稳定性。

虽然已充分描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，可在 不背离本发明范围或其任何实施方案的情况下，用宽且等同的条件、 制剂以及其它参数范围来实施本发明方法。

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