抗补体D因子抗体及其应用
阅读：92发布：2023-01-31
专利汇可以提供抗补体D因子抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种分离的抗补体D因子 抗体 或其 片段 、其 氨 基酸序列、核酸序列，及与上述抗体相关的细胞、组合物等。更具体的，本发明涉及通过 噬菌体 筛选平台获取抗人补体D因子抗体，得到它们的核酸和氨基酸序列；通过 转染 293细胞 收获 蛋白；通过ELISA以及细胞活性模型来检测抗人补体D因子抗体的 生物 学活性。上述抗体与补体D因子有较高的亲和 力 ，并且有较高的溶血抑制率。上述抗体可用于旁路激活途径紊乱所引起的 疾病 的诊断、 预防 和 治疗 。，下面是抗补体D因子抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种分离的抗补体D因子的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含：
(a)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；
(b)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:8所示的VH CDR2；
(c)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；
(d)如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或者SEQ ID NO:18所示的VL CDR1；
(e)如SEQ ID NO:19或者SEQ ID NO:20所示的VL CDR2；和/或
(f)如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或者SEQ ID NO:26所示的VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区VH，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或者SEQ ID NO:32所示，或者与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:
29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或者SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％同源。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区LH，所述LH的氨基酸序列如SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38所示，或者与SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少90％同源。
4.一种分离的抗补体D因子的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含：
如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1，
如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2，
如SEQ ID NO:11所示的VH CDR3，
如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1，
如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2，或
如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。
5.根据权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区VH，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少
90％同源。
6.根据权利要求4或者5所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:35所示，或者与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少90％同源。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段的EC50小于150ng/ml，或者所述抗体的EC50小于30ng/ml，或者所述抗体的EC50小于15ng/ml。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是IgG同种型，其选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型、或者IgG4同种型。
9.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-8中任一项所述的抗体或其片段。
10.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求9所述的核酸。
11.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1～8任一项所述的抗体或其片段和药学上可接受的载体。
12.权利要求1-8任一项所述的抗体或其片段或权利要求11所述的组合物在制备治疗旁路激活途径紊乱所引起的疾病的药物或试剂盒中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病为眼科疾病。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述眼科疾病包括黄斑变性或糖尿病性视网膜病。
抗补体D因子抗体及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 补体系统包括30余种组分，广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。血浆中补体成分在被激活前无生物学功能。多种微生物成分、抗原-抗体复合物以及其它外源性或内源性物质可循三条既独立又交叉的途径，通过启动一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应而激活补体，所形成的活化产物具有调理吞噬、溶解细胞、介导炎症、调节免疫应答和清除免疫复合物等生物学功能。补体不仅是机体天然免疫防御的重要部分，也是抗体发挥免疫效应的重要机制之一，并对免疫系统的功能具有调节作用。补体缺陷、功能障碍或过度活化与多种疾病的发生和发展过程密切相关。
[0003] 补体系统由补体固有成分、补体受体、血浆及细胞膜补体调节蛋白等蛋白组成。其中，补体固有成分是存在于血浆及体液中、构成补体基本组成的蛋白质，包括：a.经典激活途径的C1q、C1r、C1s、C2、C4；b.旁路激活途径的B因子、D因子和备解素(properidin，P因子)；c.甘露聚糖结合凝集素激活途径(MBL途径)的MBL、MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)；d.补体活化的共同组分C3、C5、C6、C7、C8、C9。
[0004] 补体固有成分以非活化形式存在于体液中，通过级联酶促反应而被激活，产生具有生物学活性的产物。已发现三条补体激活途径，它们有共同的终末反应过程。
[0005] 经典激活途径指激活物与C1q结合，顺序活化C1r、C1s、C2、C4、C3，形成C3转化酶和C5转化酶的级联酶促反应过程。
[0006] MBL途径又称凝集素激活途径，指由血浆中甘露聚糖结合凝集素直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP1、MASP2、C4、C2、C3，形成(与经典途径相同的)C3转化酶与C5转化酶的级联酶促反应过程。
[0007] 旁路激活途径又称替代激活途径，其不依赖于抗体，乃微生物或外源异物直接激活C3，有B因子、D因子和备解素参与，形成C3与C5转化酶的级联酶促反应过程。
[0008] 通过利用噬菌体库筛选抗体的方式，获得抗人补体D因子的抗体，通过将筛选到的序列构建成全抗的形式，通过蛋白表达收获抗体。对抗体进行结合实验和生物学活性验证试验，验证了我们筛选得到的抗体的初步功能验证。结果表明，我们筛选得到的抗体生物学功能明显。
[0009] D因子是旁路激活途径重要丝氨酸蛋白酶，其裂解与C3(H2O)结合的B因子，将B因子裂解为Ba和Bb，Bb与C3(H2O)结合为起始C3转化酶，起始C3转化酶极不稳定。有研究表明D因子是旁路激活途径激活的限速酶(J.E.Volanakis et al.,New Eng.J.Med.,1985；312:395-401)，可作为靶蛋白，开发抗体用于治疗旁路激活途径紊乱所引起的疾病。
发明内容
[0010] 本发明提供一种分离的抗补体D因子的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：
[0011] (a)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；
[0012] (b)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:8所示的VH CDR2；
[0013] (c)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；
[0014] (d)如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或者SEQ ID NO:18所示的VL CDR1；
[0015] (e)如SEQ ID NO:19或者SEQ ID NO:20所示的VL CDR2；和/或
[0016] (f)如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或者SEQ ID NO:26所示的VL CDR3。
[0017] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区VH，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或者SEQ ID NO:32所示，或者与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或者SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％同源。
[0018] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链可变区LH，所述LH的氨基酸序列如SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38所示，或者与SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少90％同源。
[0019] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：
[0020] 如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1，
[0021] 如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2，
[0022] 如SEQ ID NO:11所示的VH CDR3，
[0023] 如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1，
[0024] 如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2，或
[0025] 如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。
[0026] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区VH，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少90％同源。
[0027] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:35所示，或者与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少90％同源。
[0028] 在一些实施方案中，所述抗体或其片段的EC50小于150ng/ml，或者所述抗体的EC50小于30ng/ml，或者所述抗体的EC50小于15ng/ml。
[0029] 在一些实施方案中，所述抗体是IgG同种型，其选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型、或者IgG4同种型。
[0030] 另一方面，本发明还提供一种分离的核酸，所述核酸编码上述的抗体或其片段。
[0031] 另一方面，本发明还提供一种分离的细胞，所述细胞包含上述的核酸。
[0032] 另一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含上述的抗体或其片段和药学上可接受的载体。
[0034] 另一方面，本发明还提供上述的抗体或其片段或上述的组合物在制备治疗旁路激活途径紊乱所引起的疾病的药物或试剂盒中的应用。
[0035] 在一些实施方案中，所述疾病为眼科疾病。
[0036] 在一些实施方案中，所述眼科疾病包括黄斑变性或糖尿病性视网膜病。
[0037] 在一些实施方案中，所述疾病还包括心肺体外循环期间的补体激活，由急性心机梗塞、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克、肠局部缺血或引起局部缺血的其它事件后的缺血-再灌注而引起的补体激活；还包括补体激活与炎性疾病有关，如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰刀型红细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎；还包括自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海莫氏病和多发性硬化。
[0039] 图1描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D抗体全抗的SDS-PAGEA的胶图；图1A为SDS-PAGE非还原胶图；图1B为SDS-PAGE还原胶图。
[0040] 图2描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D因子全抗的与抗原人补体D因子的ELISA结合曲线图。
[0041] 图3描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D因子全抗的溶血抑制实验结果。
具体实施方式
[0042] 本发明提供了特异性结合补体D因子(包括人补体D因子)的单克隆抗体。本文中，这些抗体被统称作补体D因子抗体。
[0043] 本文所述抗体的一些特性包括：a)与补体D因子特异性结合；b)与补体D因子具有较高的亲和力；c)具有较高的溶血抑制率。
[0044] 因此，本文所述抗体在治疗多种癌症中占据重要地位。
[0045] 本发明的抗体与补体D因子表位结合的半数有效浓度(EC50)小于等于0.2μg/ml，例如小于等于0.126μg/ml，优选小于等于0.026μg/ml，优选小于等于0.024μg/ml，更优选小于等于0.014μg/ml。例如，本文所提供的补体D因子抗体表现出范围大致介于小于等于0.2μg/ml至约0.01μg/ml之间的EC50值。
[0046] 定义
[0047] 除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学以及蛋白质纯化使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和细胞培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。
[0048] 本文所用术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“发生免疫反应”或“针对”是指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应且不与其它多肽反应，或者以很低亲和力与其它多肽结合。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab-和F(ab')2片段、Fv、scFvs和Fab表达库。
[0049] 已知基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分限定了一个恒定区，主要负责效应子功能。一般来讲，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG1、IgG2、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。
[0050] “分离的核酸分子”为被鉴定并与至少一种污染性核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的核酸分子与在其天然细胞中存在的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括在如常表达抗体的细胞中所含的核酸分子，例如，所述核酸分子所处的染色体位置不同于天然细胞的染色体位置。
[0051] 如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指一群这样的抗体分子：其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
[0052] 一般来讲，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG1、IgG2、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。
[0053] 术语“抗原结合位点”或“结合部分”指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。该抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。因此“VH”表示重链可变区，“VL”表示轻链可变区。重链和轻链的V区中三个高度分化的分支(被称作“高变区”)位于更保守的侧翼分支(被称作“框架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”表示免疫球蛋白中在天然情况下存在于高变区之间或邻近高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中以相对彼此的位置排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”(三个高变区分别为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”)。每个结构域氨基酸的比对与KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest《( 免疫学感兴趣蛋白的序列》)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National InstitutesofHealth)(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等，Nature342:878-
883(1989)的定义一致。
883(1989)的定义一致。
[0054] 本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。当解离常数小于等于1μM(例如小于等于100nM、优选小于等于10nM且更优选小于等于1nM)时，即可称抗体特异性结合抗原。
[0055] “分离的”抗体是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是将妨碍抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素、以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将被纯化为：(1)按所述抗体重量计大于95％，并最优选按重量计多于99％，如由Lowry方法所测；(2)足以通过使用转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE使用考马斯蓝或优选银染色测出为均相。分离抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为不存在抗体的天然环境中的至少一种组分。通常，分离抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0056] 本文所用术语“多肽”是一个普通术语，表示天然蛋白质、片段或多肽序列的类似物，因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属中的种。
[0057] 术语“序列同一性”指的是：在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即基于核苷酸对核苷酸或残基对残基是相同的)。术语“序列同一性百分比”通过如下方式计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即窗口尺寸)，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。如本文所述，术语“基本上相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的一种特性，其中当与参考序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，经常是在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗口上比较时，多核苷酸或氨基酸包含具有至少85％序列同一性，优选至少90至95％序列同一性，更通常至少99％序列同一性的序列，其中通过在比较窗上比较参考序列和可能包含缺失或添加的序列计算出序列同一性百分比，这些序列可包括的缺失或添加总计为参考序列的20％或更少。参考序列可以是较大序列的子集。
[0058] 如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland7Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。
[0059] 类似地，除非另外指明，否则单链多核苷酸序列的左手末端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。新生的RNA转录物的5’至3’的添加方向被称为转录方向；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物5’端5’的序列区被称为“上游序列”；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物3’端3’的序列区被称为“下游序列”。当应用于多肽时，术语“基本上相同”是指两个肽序列在诸如通过GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。
[0060] 优选地，不相同的残基位置区别在于保守氨基酸取代。
[0061] “保守”氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0062] 如本文所讨论的那样，预期抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的变化保持至少75％、更优选至少80％、90％、95％并最优选99％。具体地，预期保守氨基酸置换。保守置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸不对所得分子的结合或特性有重要影响，如果该置换不涉及框架位点内的氨基酸尤其如此。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。所述测定在本文进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端存在于功能结构域的边界附近。可通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库来鉴定结构和功能结构域。优选地，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或在其它已知结构和/或功能的蛋白中存在的预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的(Bowie等人Science 253:164(1991))。因此，上述示例展示，本领域技术人员可以识别可用于界定与本公开一致的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
[0063] 优选的氨基酸取代是如下那些：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。
[0064] 本文所用术语“半数有效浓度”，或称EC50，是指引起50％实验对象产生某一特定反应时药物所需浓度。半数有效浓度，也可以指能引起最大反应强度的浓度的一半。对于抗体或药物来说，EC50越小，其亲和力越高。
[0065] 本文所用术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。
[0066] 如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。如本文所用，术语“药剂或药物”是指当适当施用于患者时能够诱导期望治疗效果的化合物或组合物。
[0067] 本发明的单克隆抗体具有结合补体D因子的能力。所述抗补体D因子抗体指以抑制或基本上降低补体激活的方式特异性结合补体D因子抗体。
[0068] 本发明的示例性全抗抗体包括抗体BAT-1.57、抗体BAT-2.10、抗体BAT-2.12、抗体BAT-2.21、抗体BAT-2.56和抗体BAT-2.84，以及其他的类似的具有相同或者相似是CDR区域的抗体。
[0069] 除了上述全抗外，本发明的示例性抗体还包括scFv抗体。其中，scFv抗体包括CFD-1.57、CFD-2.10、CFD-2.12、CFD-2.21、CFD-2.56和CFD-2.84。
[0070] 在一些实施方式中，上述抗体的重或其片段链CDR有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:8所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:14所示的VH CDR3。
[0071] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或者SEQ ID NO:18所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19或者SEQ ID NO:20VL CDR2；如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或者SEQ ID NO:26所示的VL CDR3。
[0072] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:9所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19VL所示的CDR2；以及如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。
[0073] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。
[0074] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:11所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。
[0075] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:6所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:17所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。
[0076] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:13所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:25所示的VL CDR3。
[0077] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链CDR有如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的轻链CDR有如SEQ ID NO:18所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:20所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:26所示的VL CDR3。
[0078] 在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:27所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:33所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:28所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:34所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:29所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:35所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:30所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:36所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:31所示；
上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:37所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:32所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:38所示。
上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:37所示。在一些实施方式中，上述抗体或其片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:32所示；上述抗体或其片段的轻链可变区VL如SEQ ID NO:38所示。
[0079] 在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:51所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:57所示。在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:52所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:58所示。在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:53所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:59所示。在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:54所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:60所示。在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:55所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:61所示。在一些实施方式中，上述抗体的重链如SEQ ID NO:56所示；上述抗体的轻链如SEQ ID NO:62所示。
[0080] 特别地，示例性抗体包括表1所提供的抗体，还有与表1中的序列有合适的序列等同性的序列。比如共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。在有些实施例里面，这些有同一性的序列至少CDR不会变。
[0081] 除了CDR的变化外，框架区的氨基酸也可以有适当的改变。IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG1、IgG2、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。
[0082] 在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其中该抗体对D因子的亲和力(例如该抗体作为Fab片段对D因子的亲和力)较高。
[0083] 在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其中该抗体或其片段对D因子的亲和力较高。较高的亲和力表现出交底的EC50值。抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.02μg/ml-0.2μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.01μg/ml-0.13μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml-0.126μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml-0.026μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml-0.024μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml-0.022μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml-0.021μg/ml。在一个实施方案中，抗体或其片段与补体D因子结合的EC50约为0.014μg/ml。
[0084] 在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，具有较高的溶血抑制百分率。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为60％-100％。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为72％-99％。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为80％-99％。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为85％-99％。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为90％-99％。在一个实施方案中，本发明提供了抗补体D因子抗体或其片段，其溶血抑制百分率约为99％。
[0085] 如本领域公认的，可利用任何各种测定法测定配体对其受体的结合亲和力，并且通过各种定量值表示。因此，在一个实施方案中，结合亲和力(bindingaffinity)可以表示为Kd值并且反映固有的结合亲和力(例如具有最小化的活动性(avidity)影响)。通常并且优选在体外测量结合亲和力，可以用无细胞的或细胞相关的装置。如此处更详细描述的，可通过人源化抗体的单价结合亲和力值(例如，以Fab形式)与对照/比较抗体(例如具有供者高变区序列的小鼠抗体)的单价结合亲和力值(例如，以Fab形式)的比例对结合亲和力的倍数差异进行定量，其中所述结合亲和力值在类似的测定条件下测定。在一个实施方案中，可以通过测定EC50值来评价。
[0086] 本文所述抗体包括完全人抗体或人源化抗体。这些抗体适用于给人施用，而不会造成人对所施用的免疫球蛋白产生免疫应答。
[0087] 补体D因子抗体例如通过噬菌体展示方法使用仅包含人序列的抗体来产生。在该方法中，使用天然或重组补体D因子来源或其片段来筛选携带有随机的轻链和重链对的噬菌体的组合库。此外，另一种方法，补体D因子抗体可通过这样的方法产生：至少一个方法步骤包括用人补体D因子蛋白质免疫转基因非人动物。在此类方法中，该异基因的非人动物的内源性重链和/或κ轻链基因座中的一些已失效，并且不能发生产生编码响应于抗原的免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已被稳定转染到动物中。因此，响应于所施用的抗原，人基因座重排以提供编码对抗原具有免疫特异性的人可变区的基因。因此，在免疫时，转基因鼠产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。
[0088] 抗体片段如Fv、F(ab')2和Fab可通过裂解完整的蛋白质来制备，例如通过蛋白酶或者化学裂解。另选地，设计截短基因。例如，编码F(ab')2片段的一部分的嵌合基因将包含编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，然后是翻译终止密码子以产生截短的分子。
[0089] H和LJ区的共有序列可用于设计用作引物的寡核苷酸，以便在J区内引入有用的限制性位点，用于随后将V区片段连接于人C区片段。C区cDNA可通过定点诱变修饰，以在人序列的类似位置放置一个限制性位点。
[0090] 表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。便利的载体通常是这样一种载体，它编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，并带有工程化的适当限制性位点以使得可以容易地插入和表达任何VH或VL序列。在此类载体中，剪接通常发生在被插入的J区中的剪接供体位点与人C区域前面的剪接受体位点之间，并且还发生在人CH外显子内存在的剪接区域处。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点处。所得的嵌合抗体可以连接于任何强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等人Mol.Cell.Bio.3:280(1983))、劳氏(Rous)肉瘤病毒LTR(Gorman等人P.N.A.S.79:6777(1982))和莫洛尼氏(moloney)鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人Cell 41:885(1985))。另外，如将知道的那样，可使用天然Ig启动子等。
[0091] 另外，可通过展示型技术产生人抗体或来自其它物种的抗体，所述技术包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，并且所得分子可经历另外成熟，诸如亲和力成熟。如果展示技术用于产生非人抗体，则此类抗体可以如上所述进行人源化。
[0092] 本文所述补体D因子抗体可以由包含编码上述单链抗体的核酸片段的载体表达。这些可包括载体、脂质体、裸露DNA、佐剂-辅助DNA、基因枪、导管等。载体包括如WO93/64701所述的化学缀合物，其具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配基)和核酸结合部分(例如多聚赖氨酸)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、例如PCT/US95/02140(WO95/22618)所述的融合蛋白，这种融合蛋白为包含靶部分(例如对靶细胞具有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)、质粒、噬菌体等的融合蛋白。载体可为染色体、非染色体或合成载体。
[0093] 在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:39-50中的一条或多条核酸；或者选用SEQ ID NO:39-50中的一条或多条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:39-44中的一条核酸，以及SEQ ID NO:45-50中的另一条核酸；或者上述核酸选用SEQ ID NO:39-44中的一条核酸中的部分核酸，以及SEQ ID NO:45-50中的另一条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:46两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:46两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:47两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:47两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:48两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:48两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。在一些实施方案中，上述核酸选用SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50两条核酸；或者选用选用SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50两条核酸中的部分核酸，例如编码抗体CDR区的部分核酸。
[0094] 在一些实施方案中，上述载体可用于表达大量的可以各种方式使用的抗体。例如，用于检测样品中补体D因子的存在。
[0095] 可采用产生对本文所述抗原蛋白具有特异性的单链抗体的技术。此外，可采用构建Fab表达库的方法(参见Huse等人，1989Science 246:1275-1281)，以允许快速有效地鉴定对蛋白或其衍生物、片段、类似物或同系物具有期望特异性的单克隆Fab片段。含有蛋白抗原的特异基因型的抗体片段可以通过本领域已知的技术制备，包括但不限于：(i)用胃蛋白酶消化抗体分子得到F(ab')2片段；(ii)通过还原F(ab')2片段的二硫键得到Fab片段；(iii)用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成Fab片段，以及(iv)Fv片段。因此，设想所述实施方案的变型形式，其包括Fv、Fab、Fab'和F(ab')2补体D因子片段、单链补体D因子抗体、单结构域抗体(例如纳米抗体或VHH)、双特异性补体D因子抗体、以及异源偶联补体D因子抗体。
[0096] 在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型。在一些实施方式中，对人IgG1恒定区上的氨基酸进行修饰以避免抗体的糖基化。在一些实施方式中，对抗体恒定区上的氨基酸进行修饰以改变Fc受体相互作用。
[0097] 针对补体D因子的抗体的使用
[0098] 应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化学工作者已知的药典中：Remington's Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1975))。这些制剂包括例如粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本发明的治疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药途径。
[0099] 在一个实施方式中，包括本发明的单克隆抗体的本发明的抗体可用作治疗剂。这类试剂通常用于诊断、预后、监控、治疗、缓和和/或预防对象中异常补体D因子表达、活性和/或信号转导相关的疾病或病变。通过使用标准方法鉴定患有异常补体D因子表达、活性和/或信号转导相关的疾病或病症(如癌症或其他肿瘤病症)，或有疾病发展风险的对象(如人类患者)，可实施治疗方案。给予对象一种抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的制剂，由于其与靶标的结合该制剂通常具有效果。抗体的给药可消除或抑制或干扰靶标(如补体D因子)的表达、活性和/或信号转导功能。抗体的给药可消除或抑制或干扰靶标(如补体D因子)与其天然状态下结合的内源性配体的结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或干扰补体D因子的表达、活性和/或信号转导。
[0100] 作为非限制性示例，涉及异常的补体D因子表达、活性和/或信号转导的疾病或病症包括眼科疾病(如黄斑变性，糖尿病性视网膜病)，心肺体外循环期间的补体激活，由急性心机梗塞、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克、肠局部缺血或引起局部缺血的其它事件后的缺血-再灌注而引起的补体激活；还包括补体激活与炎性疾病有关，如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰刀型红细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎；还包括自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海莫氏病和多发性硬化。
[0101] 本发明的抗体的治疗有效量通常涉及达到治疗目标所需的量。如上所述，在某些情况下，抗体及其靶抗原之间的相互作用会干扰靶标的功能。给药所需的量进一步取决于抗体对其特异抗原的结合亲和力，还取决于在接受给药的对象中给予的抗体从自由体积耗尽的速率。作为非限制性示例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见为从约0.25mg/眼、约0.5mg/眼、约1.25mg/眼或任意两个剂量之间的范围值，或更高的剂量；并将本上述剂量的抗体给予对象。常用的剂量频率是每4-8周一次。
[0102] 在另一个实施方案中，针对补体D因子的抗体可用于本领域中已知的与补体D因子定位和/或定量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的补体D因子的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。在一个给定实施方案中，对补体D因子或其衍生物、片段、类似物或同系物具有特异性的、包含源于抗体的抗原结合结构域的抗体，被用作药物学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
[0103] 在另一个实施方案中，可通过标准技术例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，使用对补体D因子具有特异性的抗体来分离补体D因子多肽。针对补体D因子蛋白质的抗体(或其片段)可用于检测生物样品中的蛋白质。在一些实施方案中，在生物样品中可检测补体D因子作为临床测试过程的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可有利于检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白，并且合适放射性材料的示例包括125I、131I、35S或3H。
[0104] 补体D因子抗体的治疗性施用和制剂
[0105] 可将本文所述抗体和其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences:The Science And Practice OfPharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro等人编辑)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，第4卷),1991,M.Dekker,New York。
[0106] 此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。当使用抗体片段时，与靶蛋白结合结构域特异性结合的最小抑制片段可为优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。
[0107] 如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
[0108] 待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤实现。
[0109] 将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
[0110] 适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
[0111] 根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将抗体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。
[0113] 还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
[0114] 还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。
[0115] 在一个实施方案中，所述抗体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0116] 例如，这些活性成分可胶囊包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如分别在胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊剂)或大乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
[0117] 可制备缓释制剂。适宜的缓释制剂的示例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品形式例如膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚脂、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的注射用微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子100天以上，但是一些水凝胶释放蛋白质的时间却较短。
[0118] 所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
[0119] 本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述抗体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。
[0121] 实施例1：通过噬菌体库筛选获取抗人补体D因子ScFv序列
[0122] 将人补体D因子蛋白，按照50μg/ml的浓度包被在聚乙烯板中，加入ScFv噬菌体文库与之反应。经过PBST洗涤，未结合的噬菌体被洗掉，有亲和力的噬菌体被俘获，俘获的噬菌体经洗脱后再感染大肠杆菌进行扩增。这样一种“吸附-洗涤-扩增”的富集过程称为淘选。在进行2轮淘选，其中抗原人补体D因子蛋白的浓度逐级降低，分别为25μg/ml和10μg/ml。将最后得到的30个噬菌斑，分别进行DNA的提取，通过PCR对ScFv扩增，测序，进过DNAMAN软件分析，30条序列中，除开重复序列，共发现6条不同的DNA序列。这6种抗体分别命名为CFD-1.57，CFD-2.10，CFD-2.21，CFD-2.84，CFD-2.12，CFD-2.56。
[0123] 上述6条抗体的重链CDR序列(CFD-1.57-H，CFD-2.10-H，CFD-2.21-H，CFD-2.84-H，CFD-2.12-H，CFD-2.56-H)如表1所示；上述6条序列的轻链CDR序列(CFD-1.57-L，CFD-2.10-L，CFD-2.21-L，CFD-2.84-L，CFD-2.12-L，CFD-2.56-L)如表2所示。
[0124] 表1抗补体D因子抗体的重链CDR序列
[0125]
[0126]
[0127] 表2抗补体D因子抗体的轻链CDR序列
[0128]
[0129] 上述6条抗体的氨基酸序列如表3所示，核苷酸序列如表4所示。
[0130] 表3抗补体D因子抗体的氨基酸序列
[0131]
[0132]
[0133] 表4抗补体D因子抗体的核苷酸序列
[0134]
[0135]
[0136] 实施例2：通过转染293F细胞获取抗人补体D因子全抗
[0137] 将得到的6条序列经过分子克隆的手段，分别构建到pcDNA3.1载体中，将质粒构建到DH5α大肠杆菌中，进行菌种的保存和质粒的提取。按照脂质体转染的技术手段，分别转染293F细胞。
[0138] 按照100万293F细胞对应1μg的质粒，3μl的PEI的比例进行转染，每种抗体转染293F的终体积200ml，细胞密度150万每毫升，需要质粒300μl，转染试剂PEI的体积为900μl。
在摇床中培养12天，对细胞上清进行亲和层析Protein A柱进行纯化，得到抗人补体D因子全抗，分别对应命名为BAT-1.57，BAT-2.10，BAT-2.21，BAT-2.84，BAT-2.12，BAT-2.56。抗补体D因子抗体BAT-1.57，BAT-2.10，BAT-2.21，BAT-2.84，BAT-2.12和BAT-2.56的序列如表5所示。
在摇床中培养12天，对细胞上清进行亲和层析Protein A柱进行纯化，得到抗人补体D因子全抗，分别对应命名为BAT-1.57，BAT-2.10，BAT-2.21，BAT-2.84，BAT-2.12，BAT-2.56。抗补体D因子抗体BAT-1.57，BAT-2.10，BAT-2.21，BAT-2.84，BAT-2.12和BAT-2.56的序列如表5所示。
[0139] 表5抗补体D因子抗体的序列
[0140]
[0141]
[0142]
[0143] 实施例3：通过SDS-PAGE蛋白胶对抗人补体D因子全抗进行分析
[0144] 对进行蛋白表达，已经纯化好的6种抗人补体D因子抗体进行SDS-PAGE蛋白胶的鉴定，样品分别制备2份，一份用于还原胶，另一份用于非还原你胶的鉴定。每孔上样的总蛋白量为8微克，上样体积20μl。跑SDS-PAGE蛋白胶的电压分别为在浓缩胶中的电压80V，在分离胶中的电压120V。跑胶结束后用考马斯亮蓝R250染色液对胶进行染色，然后进行脱色，拍照。其中图1A和图1B描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D抗体全抗的SDS-PAGE非还原(图1A)和还原(1B)胶图。
[0145] 结果显示，SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，脱色后的胶上的条带显示，目的蛋白的轻链和重链均得到正确的表达，其中轻链的相对分子质量25kD，重链的相对分子质量为50kD。
[0146] 实施例4：通过ELISA的方式检测抗人补体D因子抗体与人补体D因子的结合[0147] 首先，对人补体D因子进行包被ELISA板，浓度为1μg/ml，每孔100μl，4度，过夜，第二天3％的BSA在37℃封闭2个小时。对6种筛选到的抗人补体D因子抗体进行稀释，起始浓度2μg/ml，按照二分之一进行稀释，共10个梯度，每孔100μl，37度孵育2个小时。将ELISA板中的液体弃掉，用PBST清洗5次，每孔加入100μl的，按照1:5000进行稀释的抗人Fc的带HRP标记的二抗，37度孵育1个小时。将ELISA板中液体弃掉，用PBST清洗8次，每孔加入100μl的显色底物TMB，15分钟后，每孔加入50μl的2M硫酸进行终止反应。酶标仪，450nm波长进行结果读取，以及结果分析。
[0148] 结果显示，6种筛选到的抗人补体D因子抗体均可以同其抗原进行结合，但是，不同的抗体与其抗原结合的EC50有差异，分别为:
[0149]抗体 BAT-1.57 BAT-2.10 BAT-2.21 BAT-2.84 BAT-2.12 BAT-2.56
EC50 0.126 0.022 0.014 0.026 0.021 0.024
EC50 0.126 0.022 0.014 0.026 0.021 0.024
[0150] 通常来讲，EC50的值越低，亲和力越高，从上表的结果显示，BAT-2.21抗体的亲和力在6种抗体中与补体D因子的亲和力最高。BAT-2.10，BAT-2.84，BAT-2.12和BAT-2.56与补体D因子的亲和力略低于BAT-2.21。
[0151] 图2描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D因子全抗的与抗原人补体D因子的ELISA结合曲线图。
[0152] 实施例5：通过溶血抑制实验检测抗人补体D因子抗体的生物学功能
[0153] 1×GVB-Mg-EGTA溶液的配制：取10ml的5×巴比妥缓冲液，2ml的浓度为500mM的MgSO4，200mM的EGTA溶液和38ml的ddH2O，共50ml，上下颠倒混匀。取0.5ml的新鲜制备的兔红血细胞(RRBC)加入到9.5ml的1×GVB-Mg-EGTA溶液，1,300rpm，3min。弃上清，用5ml的1×GVB-Mg-EGTA溶液清洗2次，最后用1.5ml的1×GVB-Mg-EGTA溶液重悬，置于冰上。取保存于-80℃冰箱的人血清1支，取480μl的人血清加入20μl的浓度为500mM的MgSO4，200mM的EGTA溶液，吹打混匀，置于冰上。20％浓度人血清的制备：取200μl的已加入Mg2+和EGTA的人血清，加入800μl的1×GVB-Mg-EGTA溶液，吹打混匀，置于冰上。将通过噬菌体库筛选获取的6株抗体BAT-1.57，BAT-2.10，BAT-2.12，BAT-2.21，BAT-2.56，BAT-2.84分别取4μg的蛋白，按照二分之一进行稀释，共12个梯度，加入到20％浓度人血清中，37℃，7min。每管中分别加入30μl的RRBC，37℃，7min水浴。2,000rpm，2min，取70μl的上清到ELISA板，415nm酶标仪进行扫描。
[0154] 结果显示，BAT-2.21抗体的溶血抑制百分率最高为99％，其次是BAT-2.56，溶血抑制百分率为90％。6种抗体的各自的溶血抑制百分率分别为：
[0155]
[0156] 本次试验表明，通过噬菌体库筛选到的CFD-2.21抗体可以很好的抑制兔血红细胞的溶解，为进行一步抗体的开法提供了生物学的证据。
[0157] 图3描述了通过噬菌体筛选到抗人补体D因子全抗的溶血抑制实验结果。
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