一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法
阅读：121发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于一种特异性 抗体 的用途、一种植入医疗器械及制备方法。其用途为造血干细胞标记物的特异性抗体在制备促进内皮修复的药物中的应用。所述植入医疗器械表面负载有造血干细胞标记物的特异性抗体。所述制备方法包括将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。本发明提供的技术方案创造性的用造血干细胞标记物的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物 副作用 小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。，下面是一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种特异性抗体的用途，其特征在于，所述特异性抗体是造血干细胞标记物的特异性抗体，用途为在制备促进内皮修复的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述特异性抗体的用途，其特征在于，所述造血干细胞标记物的特异性抗体为Clone AC133。
3.一种植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械表面负载有Clone AC133。
4.根据权利要求4所述植入医疗器械，其特征在于，所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一个面。
5.根据权利要求4所述植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械为人工血管、人工瓣膜的膜、人工瓣膜支架、左心耳封堵器膜、左心耳封堵器支架、心脏封堵器膜、心脏封堵器支架或人工补片。
6.根据权利要求5所述植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械为左心耳封堵器膜或心脏封堵器膜。
7.根据权利要求3-6任一项所述的植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械表面单位面积上所述造血干细胞标记物的特异性抗体的浓度范围是：10～1000μg/mm2。
8.权利要求3-6任一项所述的植入医疗器械的制备方法，其特征在于，包括将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序或将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
9.根据权利要求8所述植入医疗器械的制备方法，其特征在于，所述造血干细胞标记物的特异性抗体通过直接涂覆法、化学接枝法和/或静电吸附法法负载到所述植入医疗器械的表面。
10.根据权利要求9所述植入医疗器械的制备方法，其特征在于，所述造血干细胞标记物的特异性抗体通过化学接枝法与静电自组装法相结合的方法负载到所述植入医疗器械的表面。
一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 1997年Yin等人证实AC133是造血干细胞的标志物。2000年，在英国Harrogate举行的第7届人类白细胞分化抗原国际工作会议上AC133被正式命名为CD133。CD133抗原可被3种CD133抗体识别：克隆AC133、293C3和AC141。克隆AC133直接与CD133/1糖基化抗原表位结合，可用于从外周血、骨髓、脐带血及其它组织中分析和分选CD133阳性细胞。单克隆抗体293C3和AC141识别抗原表位CD133/2，主要用于MACS分选后CD133+细胞的荧光染色。
[0003] 左心耳是从左心房伸出的耳状小囊，属于左心房的一部分，它是左心房主要组成部位。左心耳封堵术由波士顿科学研发，于2006年在欧洲获批上市，2013年12月31日，正式获得中国国家食品药品监督管理总局上市批准，并于2014年3月在中国正式上市。通过这种介入手术闭合了房颤病人血栓发生的根源部位——左心耳，由此可降低房颤病人中风的风险。封堵器表面覆盖的是可扩张的聚四氟乙烯膜，同一般植入医疗器械类似也需要负载一些对损伤组织进行修复的药物，以防止手术带来的不良后果。
[0004] 目前促进内皮修复医疗器械一般都是在医疗器械表面负载小分子化合物或组合物来实现的，都是基于促进细胞生长的机理，但一般特异性差，促进内皮生长的同时也促进包括平滑肌、纤维细胞等其他细胞的生长，造成血管再狭窄、血栓等不良后果，这种方式药物副作用大，会带来其他不良影响。
发明内容
[0005] 本发明提供一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及制备方法，用以提供一种全新的促进内皮修复的方式。
[0006] 本发明提供了一种特异性抗体的用途，所述特异性抗体是造血干细胞标记物的特异性抗体，用途为在制备促进内皮修复的药物中的应用。造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。根据需求诱导造血干细胞原位分化为所需要的细胞类型，可实现促进内皮修复的目的。
[0007] 可选地，所述造血干细胞标记物的特异性抗体为AC133抗体。多数情况下CD133/1和CD133/2识别同种细胞，只是有表达强度的差别，但是在骨髓增生异常综合征和某些急性髓性白血病中发现CD133/1和CD133/2表达不同，或者正常表达强度紊乱，故认为AC133为原始造血细胞群标志。
[0008] 可选地，所述AC133抗体为Clone AC133(AC133单克隆抗体)。Clone AC133购于德国美天旎生物科技有限公司。
[0009] 本发明还提供了一种植入医疗器械，所述植入医疗器械表面负载有造血干细胞标记物的特异性抗体。造血干细胞标记物的特异性抗体可在血液中捕获造血干细胞，进一步诱导造血干细胞向内皮细胞分化，可完善器械的治疗和组织修复效果。
[0010] 可选地，所述造血干细胞标记物的特异性抗体为AC133抗体。
[0011] 可选地，所述AC133抗体为Clone AC133。
[0012] 可选地，所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一个面。
[0014] 可选地，所述植入医疗器械表面单位面积上所述造血干细胞标记物的特异性抗体的浓度范围是：10～1000μg/mm2。浓度过低，抗体在血液中很快被溶解，浓度达到一定程度抗体结合位点饱和，效果不再增加。
[0015] 本发明还提供了上述植入医疗器械的制备方法，包括将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将所述造血干细胞标记物的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
[0016] 可选地，所述造血干细胞标记物的特异性抗体通过直接涂覆法、化学接枝法和/或静电吸附法法负载到所述植入医疗器械的表面。
[0018] 其中化学接枝法可以是对抗体分子进行化学改性，使其能够和器械表面或器械涂层表面发生化学连接。也可以是通过使用抗体连接剂或交联剂将抗体分子和器械表面结合。
[0019] 其中静电吸附法是在器械表面涂覆带相反电荷的涂层，使得抗体分子通过静电吸附力涂覆到器械表面。
[0020] 本发明提供的技术方案创造性的用造血干细胞标记物的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物副作用小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。附图说明
[0022] 图2是实施例5细胞捕获实验中负载造血干细胞标记物的特异性抗体的样本捕获血液中的细胞，对细胞进行特异性抗体荧光染色的荧光图，其中(1)～(4)依次为对应实施例1～4中的样品；
[0023] 图3是实施例5动物实验中负载AC133抗体的支架和药物支架植入兔髂动脉14天后SEM表征图，左侧为实施例1的支架样品，中间为实施例2的支架样品，右侧为对照组的支架样品；
[0024] 图4是实施例5动物实验中负载AC133抗体的膜缝织在左心耳封堵器支架植入体内14天后SEM表征图，左侧为实施例3的样品，中间为实施例4的样品，右侧为未处理的膜。
具体实施方式
[0025] 为了便于理解，下面结合实施例阐述所述造血干细胞标记物的特异性抗体的用途，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0026] 本发明中所用的原材料及器械，如无特别指出，均为可市购商品。
[0027] 本发明中所涉及的“医疗器械”可以是植入体内的器械。该器械可以短期暂时使用，或者长期永久性植入。在某些实施方式中，合适的器械是那些通常用于为心律失调、心力衰竭、瓣膜性疾病、血管病、糖尿病、神经疾病和失调症、整型外科、神经外科、肿瘤学、眼科学和ENT手术提供医疗和/或诊断的器械。本发明所涉及的医疗器械包括但不限于以下设备：支架、支架移植物、吻合连接器、合成贴片、引线、电极、针、导线、导管、传感器、手术仪器、血管成形球、创口引流管、分流管(shunt)、管子、输液套简(infusion sleeve)、尿道插管、小球、植入物、血液充氧发生器、泵、脉管移植物、埋入式介入药盒(vascular access port)、心瓣膜、瓣环成形术环、缝合线、手术夹、手术钉、起博器、可植入去纤颤器、神经刺激器、整型外科器械、脑脊髓液分流管、可植入药泵、椎笼、人造椎间盘、髓核的替代器械、耳管、眼内晶状体和在介入手术中使用的任何管。优选地，本发明所涉及的医疗器械尤其是：支架、球囊、封堵器、瓣膜或人工血管。
[0028] 实施例1
[0029] 100μg AC133单克隆抗体Clone AC133(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于10mL抗体稀释液中，配制成浓度为10μg/mL的抗体溶液。聚电解质透明质酸钠(HA)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，聚电解质壳聚糖(CS)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，基础涂层聚电解质聚酰亚胺(PEI)5mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中。
[0030] 将血管支架用H2SO4:H2O2(30％,v/v)＝3:1溶液浸泡30分钟，用纯化水漂洗3次，氮气吹干。首先浸于聚乙酰亚胺(PEI)溶液中得到PEI层；将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠(HA)溶液中得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖(CS)溶液中得到CS外层。重复上述HA/CS静电组装过程7次，得到透明质酸钠/壳聚糖自组装多层膜，记为PEI(HA/CS)7。将支架浸泡在抗体溶液中30min，取出N2吹干。完成AC133抗体负载支架制备。支架表面单位面积的AC133抗体的浓度为19μg/mm2。
[0031] 实施例2
[0032] 100μg AC133单克隆抗体Clone AC133(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液中，配制成浓度为100μg/mL的抗体溶液。将血管支架用H2SO4:H2O2＝3:1溶液浸泡30分钟，用纯化水漂洗3次，氮气吹干。浸于抗体溶液中，静置30分钟后取出，自然晾干，4℃条件保存。完成AC133抗体负载支架制备。经称重计算，最终测得支架表面单位面积2
的AC133抗体的浓度为71μg/mm。
的AC133抗体的浓度为71μg/mm。
[0033] 实施例3
[0034] 1mg AC133单克隆抗体Clone AC133(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液中，配制成浓度为1mg/mL的抗体溶液。用超声喷涂仪将抗体溶液喷涂到左心耳封堵器膜表面，自然晾干，4℃条件保存。完成AC133抗体负载支架制备。经称重计算，最终测得膜表面单位面积的AC133抗体的浓度为690μg/mm2。
[0035] 实施例4
[0036] 1mg AC133单克隆抗体Clone AC133(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液中，配制成浓度为1mg/mL的抗体溶液。聚电解质透明质酸钠(HA)1mg/mL溶于
0.1％的NaCl溶液中，聚电解质壳聚糖(CS)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，基础涂层聚电解质聚酰亚胺(PEI)5mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中。抗体连接剂NHS(100mM)/EDC(400mM)溶解于0.1％的NaCl溶液中。
0.1％的NaCl溶液中，聚电解质壳聚糖(CS)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，基础涂层聚电解质聚酰亚胺(PEI)5mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中。抗体连接剂NHS(100mM)/EDC(400mM)溶解于0.1％的NaCl溶液中。
[0037] 将左心耳封堵器膜洗净。首先浸于PEI溶液中，得到PEI层；将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠溶液中，得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖溶液中得到CS外层。重复上述HA/CS静电组装过程7次，得到透明质酸钠/壳聚糖自组装多层膜，记为PEI(HA/CS)7。将膜浸泡在抗体连接剂NHS(100mM)/EDC(400mM)溶液中，取出放入抗体溶液中，取出N2吹干。完成AC133抗体负载膜制备。经称重计算，最终测得膜表面单位面积的AC133抗体的浓度为956[0038] μg/mm2。
[0039] 实施例5
[0040] 本实施例是实施例1、2、3、4中的负载抗体的样品的体内外功能评价。
[0041] 5.1抗体负载结果评价
[0042] 将AC133抗体负载样品用TRITC标记抗小鼠IgG二抗进行荧光染色，鉴定抗体是否负载成功。如图1所示，样品负载后可以被染成荧光色。说明抗体能够成功的被负载到在样品表面。
[0043] 5.2细胞捕获实验
[0044] 采集兔静脉血液5mL，用PBS进行1:1稀释混匀；将稀释血液缓慢铺加到Ficoll淋巴细胞分离液表面，体积比为1:1；2500g速度离心30分钟；吸取中间云雾层至干净离心管中，加入5mL PBS，吸管吹打混匀，2000g速度离心10分钟；吸去上层澄清液，再加入5mL PBS，吸管吹打混匀，2000g速度离心10分钟，弃上清获得底部细胞，盖好离心管盖，转移到无菌操作台内。打开离心管盖，向瓶底加入6mL EGM-2培养基，吹打混匀。选用铺好纤粘连蛋白的6孔板，将实施例1、2、3、4中的负载AC133抗体的支架分别置于不同的6孔板孔内。取混匀的细胞，每孔加入2mL细胞悬浮液。将六孔板置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱内摇晃培养。2小时后，取出6孔板，固定细胞，用接枝藻红蛋白荧光基团的抗体染料(AC133-PE)对细胞进行染色，鉴定细胞表现。
[0045] 由于AC133捕获的细胞一定表达AC133。因此用AC133对应的抗体荧光染料AC133-PE染料可以对捕获细胞进行荧光标记。如图2所示，样品表面捕获的细胞可以被藻红蛋白荧光染料染成荧光色，说明负载了抗体的样品，可以成功捕获到造血干细胞。
[0046] 5.3动物实验
[0047] (一)支架制备
[0048] 按照实施例1、2、3、4中的方法制备AC133抗体负载支架或膜。制备过程中使用的工具和试剂均需事前灭菌，制备工艺全程在无菌环境内完成。获得的支架在无菌环境内压握、吹塑、包装、在4℃温度下保存，待用。获得的膜缝织在左心耳封堵器支架表面，灭菌、包装、在4℃温度下保存，待用。
[0049] (二)支架植入
[0050] 准备体重为2.2-2.6kg的新西兰大白兔9只，动物体重与年龄相匹配。实验组为实施例1和2中两种不同的细胞捕获支架，对照组为雷帕霉素药物支架，每组3只动物。每只动物在左右髂动脉各植入1枚支架作为平行样。器械按照目标支架:动脉尺寸＝1.10:1.0～1.20:1.0的比例进行植入。支架植入前将通过血管造影术对目标血管进行评价。支架植入后所有目标血管也将再次进行血管造影术评价。
[0051] (三)封堵器植入
[0052] 准备体重为30kg左右的比格犬9只。实验组实施例3、4中的膜制成的样本，对照组为未处理的膜制成的左心耳封堵器，实验组和对照组每组3只动物。实验组左心耳膜负载抗体，对照组左心耳膜未处理。动物麻醉后，在X射线透视环境下进行房间隔穿刺，穿刺成功后，推送穿刺鞘进入左心房，撤出穿刺针，沿扩张器插入超硬导丝，交换左心耳封堵器鞘管，沿鞘管送入6F猪尾导管至左心耳，进行造影，观察左心耳形状并测量左心耳开口宽度及深度，选择合适规格封堵器植入左心耳，造影观察封堵效果并牵拉测试封堵稳固性。封堵效果良好封堵器稳固则解脱封堵器。撤出鞘管，进行手术收尾工作，完成左心耳封堵器植入手术。
[0053] (四)实验结果
[0054] 支架植入14天后，取出植入支架段，沿血管轴向剖开，用含肝素的生理盐冲洗1分钟，然后将血管转移到2.5％戊二醛中固定，24小时后取出脱水、干燥进行扫描电镜观察内皮覆盖情况。支架样品植入兔髂动脉14天后通过SEM表征，图3从左到右依次为实施例1、2的SEM表征图，最右边的为对照组的支架样品的SEM表征图，可以发现实施例1和2的支架样品14天后，血管内皮有完整的内皮组织覆盖，内皮细胞形态良好。对照组药物支架血管内壁图，血管内壁有大量的纤维蛋白覆盖，内皮不良。结果表明，所制备的干细胞捕获支架可以达到更好的促内皮修复效果。
[0055] 封堵器植入14天后，对动物实施安乐死，解剖取出左心耳封堵器，将左心耳封堵器膜从支架上取下。固定、脱水后用SEM观察膜表面的内皮化情况。如图4所示，左侧为实施例3的样品，中间为实施例4的样品，右侧为未处理的膜，左侧和中间的两个样品，膜表面被内皮细胞完整覆盖，右侧未处理的膜表面有大量纤维蛋白和血液细胞沉积。说明，使用负载抗体的膜的左心耳封堵器可迅速实现内皮化。
[0056] 本发明提供的技术方案创造性的用造血干细胞标记物的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物副作用小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。
[0057] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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