发明领域
[0001] 本发明涉及含有松柏(coniferous)树脂酸的含水抗微生物组合物、其制备方法以及其作为抗微生物剂在医学和非医学领域中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 松柏树脂，通常来源于松树(pine)或
云杉(spruce)，已经被广泛用于自然疗法和传统医学，用于
治疗皮肤创伤和皮肤感染。在实践中，该树脂通常混入动物脂肪中。
[0004] 松柏树脂是多种化合物的混合物，主要由树脂酸、木酚素、
脂肪酸和挥发性萜烯化合物组成。除了术语‘树脂(resin)’之外，术语如‘松脂(rosin)’、‘松脂胶(rosingum)’或‘松香(colophonium)’被广泛用作松柏树中天然存在的树脂的同义词。
[0005] 文献中广泛描述了松柏树脂的抗微生物特性，例如抗
真菌和抗细菌特性，甚至是抗病毒特性。特别是显示树脂的树脂酸具有抗微生物潜
力。例如，松柏树脂具有广谱的对抗病原革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗微生物特性。事实上，市场上存在基于脂肪的树脂
软膏，其有效用于治疗皮肤创伤和真菌指甲感染。这些软膏是通过将树脂溶于
乙醇中而制备的。
[0006] WO2011/042613A2描述了含有在醇溶液中的松柏树脂酸和/或它们的衍生物的抗微生物组合物。
[0007] 松柏树脂，并且特别是其中含有的树脂酸，难溶于水。松柏树脂作为抗微生物剂在多种材料和产品中的广泛用途是不可能的，除非可以提供树脂的水溶液。
[0008] 发明概述
[0009] 目前我们发现了松柏树脂的稳定的、均匀分散的水溶液可以借助分散剂而制备。我们惊讶地发现这种水溶液表现出抗微生物特性，即使含有少量的松柏树脂酸。树脂酸的水溶液可以有利地引入到治疗
哺乳动物所用的其它含水组合物中，例如药物制剂、盐水溶液、糖溶液、含水输液和注射液、冲洗液、灌洗液、可水稀释的软膏、洗液和化妆产品，以及引入到非医学领域所用的其它产品中，而不会损失其抗微生物效果。
[0010] 本发明的一个目的是提供含有松柏树脂酸、分散剂和含水介质的含水抗微生物组合物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供制备含有松柏树脂酸的含水抗微生物组合物的方法，该方法包括下列步骤：
[0012] -提供松柏树脂酸，
[0013] -将树脂酸溶于分散剂中，以提供混合物，
[0014] -用含水介质稀释混合物，以提供含水抗微生物组合物。
[0015] 本发明的抗微生物组合物可以自身用作抗微生物剂或作为制剂中的添加剂用于人医学和
兽医学。这些制剂可以包含
治疗有效量的或适合防腐目的量的本发明组合物。本发明的抗微生物组合物还可以用于工业材料和产品以及食品。
[0016] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物，其自身用作抗微生物剂或作为药物制剂和产品中的添加剂用于人和/或兽医学。
[0017] 本发明的另一个目的是提供含有本发明的含水抗微生物组合物和可药用稀释剂、载体和/或赋形剂的药物制剂。
[0018] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其自身用作抗微生物剂或作为药物制剂和产品中的添加剂用于人和/或兽医学。
[0019] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其自身或作为添加剂用于治疗哺乳动物的
炎症和/或感染。
[0020] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其用于制备治疗哺乳动物的炎症和/或感染的药物。
[0021] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物，其用于治疗哺乳动物的炎症和/或感染。
[0022] 本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物的炎症和/或感染的方法，该方法包括施用治疗有效量的本发明的含水抗微生物组合物。
[0023] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其作为工业材料和产品以及食品中的抗微生物剂。
[0025] 图1A和1B显示琼脂
扩散板试验中本发明的含水抗微生物组合物对抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗微生物效果。
[0026] 图2显示Brucella琼脂板中本发明的含水抗微生物组合物对抗幽
门螺杆菌(Helicobacter pylori)的抗微生物效果。
[0027] 发明详述
[0028] 本发明的一个目的是提供含有松柏树脂酸、分散剂和含水介质的含水抗微生物组合物。该组合物是稳定的，可均匀地分散到含水介质中以及可用含水介质稀释。
[0029] 本发明的含水抗微生物组合物的松柏树脂含量范围为约1至约100ppm。在一个实施方案中，含量为约1至约50ppm。在另一个实施方案中，含量为约1至约10ppm。
[0030] 在一个实施方案中，松柏树脂酸选自脱氢枞酸、7β-羟基脱氢枞酸、7α-羟基脱氢枞酸、15-羟基脱氢枞酸、7β,15-二羟基脱氢枞酸、7α,15-二羟基脱氢枞酸、18-羟基脱氢枞酸、脱氢枞酸的其它羟基化衍生物及其混合物。
[0031] 在一个实施方案中，松柏树脂酸是以松柏树的纯化的“愈合组织(callus)”树脂提供的。在另一个实施方案中，松柏树脂酸是以从松柏树的
硫酸盐浆(kraft pulping)获得的浮油的树脂酸馏分提供的。松柏树脂酸可以以溶液或粉末或颗粒形式提供。
[0032] 分散剂选自多羟基脂环醇、多羟基脂肪族醇、二甲亚砜、丙
酮、含
蛋白质的含水液体、含糖的含水液体、血清、
血浆、细胞和组织培养中所用的液体，例如琼脂、血清、人工培养基及其混合物。在本发明的上下文中，术语“多羟基醇”表示分子中具有两个或更多个羟基的醇。在一个实施方案中，多羟基脂肪族醇选自甘油、单丙二醇(monopropylene glycol)、木糖醇、甘露醇和山梨醇。在本发明的一个实施方案中，分散剂是甘油。
[0033] 含水介质可以是任何适合的含水溶液。在一个实施方案中，含水介质是生理盐水溶液。当抗微生物组合物用于人和兽医学领域时，优选生理盐水溶液。在另一个实施方案中，含水介质是水。
[0034] 本发明组合物的抗微生物效果可以通过用含水介质稀释组合物来调节。
[0035] 本发明组合物不含高
挥发性有机化合物，例如乙醇。
[0036] 一方面，本发明提供了制备本发明的含水抗微生物组合物的方法，该方法包括下列步骤：
[0037] -提供松柏树脂酸，
[0038] -将树脂酸溶于分散剂中，以提供混合物，
[0039] -用含水介质稀释混合物，以提供含水抗微生物组合物。
[0040] 分散剂可以包含一定量的含水介质，只要仍能维持分散剂的分散能力。在一个实施方案中，分散剂包含至多约50％的含水介质。在一个实施方案中，分散剂包含至多约30％的含水介质。
[0041] 如果需要，在与分散剂混合前树脂酸可以萃取在挥发性载体物质中，例如乙醇。在组合物进一步使用组合物前将挥发性物质从组合物
蒸发。可以使用加热以增强蒸发。
[0042] 如果需要，在搅拌和/或加热下进行溶解，以增加树脂酸的
溶解度。
[0043] 在用含水介质稀释树脂酸和分散剂的混合物过程中，形成不溶性树脂的沉积。如果需要例如通过过滤除去
沉积物。最后，获得均匀分散且稳定的胶体分散液。该分散液可以进一步用含水溶液稀释，而不会形成任何沉淀或沉积。
[0044] 广泛的多种细菌，例如幽门螺杆菌，会导致胃感染(慢性胃炎)，其可以用本发明的抗微生物组合物治疗。胃黏膜的慢性胃炎是最重要胃部障碍的主要原因，所述的胃部障碍例如胃癌或消化性溃疡、萎缩性胃炎和胃酸过少。众所周知抗幽门螺杆菌疗法是有问题的，其通常需要多个重复治疗和很多抗生素。幽门螺杆菌感染通常还用胶体铋组合物治疗，其局部(胃内)杀死在胃黏膜表面生长和复制的细菌。
[0045] 本发明的含水抗微生物组合物可以自身用作水溶液或其可以被配制成适合的药物可水稀释的制剂，适用于治疗哺乳动物炎症和/或感染。这些制剂可以包含药物制剂中通常所用的其它成分，例如赋形剂、填充剂、矫味剂等。
[0046] 药物产品可以是例如绷带、敷药、膏药、毛巾纸(tissue towel)等。
[0047] 本发明组合物可以例如用于如下的医学领域：
[0048] -作为抗微生物治疗剂(片剂、胶囊剂、输注和注射液体、软膏、滴剂、凝胶剂、栓剂等)
[0049] -作为静脉内或动脉内输注，用于治疗败血病
[0050] -作为抗微生物
流体注射进入组织、关节、腔体、组织或脓肿
[0051] -作为抗微生物溶液用于清洗组织腔体(
口腔、上颌窦、
耳道、
腹腔、
胸膜腔、膀胱和泌尿道或
阴道、瘘管、裂缝或管道等)
[0052] -作为抗微生物组合物治疗皮肤溃疡、疮、烧伤或感染
[0053] -作为绷带、包扎、毛巾纸或产品中的抗微生物添加剂，用于治疗皮肤溃疡、疮、烧伤或感染
[0054] -作为抗微生物组合物用于真菌指甲或皮肤感染
[0055] -作为滴眼剂、眼软膏或洗眼剂
[0056] -作为漱口剂
[0057] -作为vagitorium、软膏、乳膏剂或溶液剂用于治疗妇科感染或
疾病(细菌和真菌感染)
[0058] -作为可水稀释的软膏、乳膏剂、溶液剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、肥皂或药物中的添加剂，用于治疗、消毒或清洗皮肤、皮肤创伤、皮肤损伤或感染
[0059] -作为
化妆品或卫生产品、面巾纸、肥皂或洗发水中的抗微生物添加剂[0060] -作为抗微生物添加剂用于医学防腐
[0061] -作为抗微生物剂用于治疗哺乳动物的外表面，例如皮肤、毛发、足
蹄和乳房[0062] -作为抗微生物添加剂，用于清洗和保护哺乳动物的外表面，例如皮肤、毛发、足蹄和乳房。
[0063] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物，其自身用作抗微生物剂或作为药物制剂和产品中的添加剂用于人和/或兽医学。
[0064] 本发明的另一个目的是提供含有本发明的含水抗微生物组合物和可药用稀释剂、载体和/或赋形剂的药物制剂。
[0065] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其自身作为抗微生物剂或作为药物制剂和产品中的添加剂用于人和/或兽医学。
[0066] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物的用途，其自身或作为添加剂用于治疗哺乳动物的炎症和/或感染。
[0067] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物在制备治疗哺乳动物的炎症和/或感染的药物中的用途。
[0068] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物，其用于治疗哺乳动物的炎症和/或感染。
[0069] 本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物的炎症和/或感染的方法，该方法包括施用治疗有效量的本发明的含水抗微生物组合物。
[0070] 本发明的组合物可以
吸附到固体载体上，例如明胶、
纤维素、
淀粉等。如果需要，可以通过蒸发组合物的含水组分，例如通过加热或温热将载体中树脂酸的量增至高于100ppm的量。
[0071] 本发明的组合物可以用药物载体例如软膏基质或含水溶液稀释至所需的浓度，从而提供药物制剂。在一个实施方案中，本发明的组合物是与含水药膏(ointment)/软膏(slave)基质组合的，以提供眼用药膏或软膏。眼用软膏或滴剂中松柏树脂的含量通常范围为约1至约30ppm。
[0072] 含有所述组合物的本发明的含水抗微生物组合物或制剂可以包含一种或多种药用活性剂，例如氢化可的松、可的松、葡糖胺和右泛醇。
[0073] 本发明的组合物或制剂可以口服、静脉内、动脉内、皮下、肌内、局部施用，以注射或输注施用。
[0074] 本发明的另一个目的是提供本发明的含水抗微生物组合物，其用作非医学领域中的抗微生物剂，例如用于工业材料和产品以及食品。在非医学领域的目的中，本发明的组合物可以如下使用：
[0075] -作为涂料、瓷漆、油漆、蜡或多种其它掩盖材料中的抗微生物添加剂[0076] -作为抗微生物组合物，用于保护纸、硬纸板、卡纸板、皮革、纺织品、布料、
毛皮、玻璃、金属、
橡胶、木材或塑料
[0077] -作为医疗器械例如
导管、
假体、
植入物等中的抗微生物组合物
[0078] -作为清洁组合物或装置、消毒剂和化妆品(toiletry)例如洗发水、肥皂、防臭剂、嗽口剂和牙膏中的抗微生物添加剂
[0079] -作为化妆品中的抗微生物添加剂
[0080] -作为抗微生物添加剂，用于溶液例如
饮用水的灭菌
[0081] -作为无水坑、下水道、游泳池中的抗微生物组合物
[0082] -作为食品中的抗微生物添加剂。
[0083] 本发明的组合物可以通过涂层、喷雾、浸渍、刷、撒布、润湿等施用于产品。食物产品可以例如通过在食品表面喷雾本发明的组合物或通过将组合物掺入食物产品中而得到保护。如果需要，组合物可以在使用前从食物产品上清洗掉。
[0084] 下列
实施例用于进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例
[0085] 实施例1
[0086] 将10g粉末形式的纯化的固体松柏树脂溶于100mL纯甘油中达3周。将产生的甘油溶液用盐水稀释，得到50％含水胶体分散液。然后过滤分散液。得到澄清分散液，作为储备液，其进一步用含水介质稀释，而不会形成任何沉淀物。
[0087] 储备液的多种树脂酸的量是通过GC/MS方法分析的。树脂酸的量是三种不同分析方法的平均值。在计算树脂酸的量时，校准是针对十七酸和异海松酸标准品进行的。
[0088] 表1公开了树脂酸及其含量。
[0089] 表1
[0090]溶解的树脂酸 含量(mg/L)(ppm)
脱氢枞酸 0.70
7β-羟基枞酸 1.49
7α-羟基脱氢枞酸 3.00
15-羟基脱氢枞酸 12.08
7β,15-羟基脱氢枞酸 5.43
7α,15-羟基脱氢枞酸 15.30
[0091]
[0092] 将储备液进一步用盐水溶液稀释用于下面描述的微生物试验。图1B说明了组合物的抗微生物特性，其中储备液是以1:1体积比和1:3体积比用生理盐水溶液稀释的。在表2中，储备液是用生理盐水溶液以1:1-1:100体积比范围稀释的。
[0093] 例如，储备液可以用生理盐水溶液稀释至25％溶液，例如可以用作例如抗微生物注射剂用于发炎的关节，例如
膝关节，或用作体腔或脓肿中的抗微生物注射剂或
清洗剂。溶液可以包含其它适合的药用活性剂，例如可的松或葡糖胺。
[0094] 实施例2
[0095] 储备液如实施例1中所描述的制备，除了工业来源的松脂(其是Forchem Oy的90s，具有高含量的枞酸型松脂酸)替换云杉愈合组织树脂应用。表2和图2中显示了储备液的抗微生物效果。
[0096] 储备液进一步用
自来水以不同比例稀释，用于下面描述的微生物试验。表3给出的结果是用其中储备液用自来水以1:1体积比稀释的溶液获得的。表4显示了不同稀释度的溶液的抗微生物效果。
[0097] 实施例3
[0098] 储备液如实施例1所描述的制备，除了将纯的单丙二醇(MPG)用作分散剂。储备液是用生理盐水溶液以1:1体积比和1:3体积比稀释，用于下面描述的微生物试验(图1A)。
[0099] 抗微生物组合物可以与制剂混合，适合用作抗微生物剂治疗皮肤疾病，或作为化妆品、肥皂、洗发水或清洗剂中的抗微生物添加剂。分散液还可以包含例如氢化可的松、可的松或右泛醇。
[0100] 实施例4
[0101] 储备液如实施例1所描述的制备，除了将木糖醇用作分散剂。溶液可以用盐水稀释，以提供具有1至50ppm树脂酸的抗微生物组合物。组合物可以用作嗽口剂和溶液，用于
预防和治疗龋齿。分散液可以用治疗活性剂和赋形剂例如矫味剂补充。分散液适合用作口服液体制剂或固体片剂，其中组合物被吸附到固相载体(例如明胶、琼脂)上，用治疗幽门螺杆菌(H.pylori)感染。
[0102] 实施例5
[0103] 将粉末形式的纯化的松柏愈合组织树脂溶于甘油水溶液(70％)中达数周，从而得到分散液。分散液随后用盐水以1:2体积比稀释。产生的溶液为25％甘油。形成不溶性树脂沉淀物并且过滤。得到黄色、澄清粘稠溶液。表1描述了它的树脂酸含量，并且表2显示了抗微生物特性。
[0104] 实施例6
[0105] 将松柏愈合组织树脂溶于乙醇，得到65％溶液。将40mL该乙醇溶液与200mL纯的甘油混合1天，得到混合物。混合物用240mL盐水(1:1体积比)稀释。形成不溶性树脂酸沉淀物并且过滤除去。滤液为胶体分散液。将滤液在室温放置过夜，以从滤液中蒸发乙醇。组合物可以进一步用含水介质稀释，而没有沉淀。
[0106] 实施例7
[0107] 将纯化的松柏愈合组织树脂溶于纯水达2小时。根据EN13697进行微生物挑战性试验。溶液显示在28天没有对抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、
铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Ps.putida)、
肺炎杆菌(KI.pneumoniae)、白色念珠菌(C.ablicans)和黑曲霉菌(Aspergillus niger)的抗微生物效果。该实施例表明使用分散剂(例如甘油)增加特定树脂酸在水中的溶解，产生由ppm量的分散剂、水和特定
水溶性树脂酸组成的抗微生物分散液。
[0108] 微生物试验
[0109] 图1-2和表2-4说明了本发明的组合物的抗微生物效果。在图1-2中，抗微生物效果是通过扩散试验测试的。在该试验中，本发明的抗微生物组合物作为试验溶液放入在平板基质上钻的小孔(例如2mm)中。当试验溶液从孔分散到平板上的培养基中时，如果溶液是抗微生物的，那么它会防止细菌生长。在孔周围的细菌生长的可视抑制区(“环”)看作抗微生物效果。抑制区越大，试验溶液的抗微生物活性越高。
[0110] 在图1A和1B中，实施例1和3制备的本发明组合物在琼脂分散平板试验中分别测试了对抗金黄色葡萄球菌，该微生物通常用作抗微生物效应的标准靶标。图1A和1B显示本发明的组合物对抗金黄色葡萄球菌的抗菌性。
[0111] 在图2中，实施例1制备的本发明的组合物在Brucella琼脂平板中试验了对抗幽门螺杆菌。图2显示本发明的组合物对抗该微生物的明显抗微生物性。
[0112] 本发明的组合物的抗微生物效果还用挑战性试验测试。试验是根据欧洲药典微生物挑战性试验(EN13697)进行的。在试验中，将特定数量的试验细菌接种在试验抗微生物特性的特定体积的溶液中。接种后，在特定时间间隔从溶液中取样并且在特定细菌培养基中培养。通过这种设置，溶液的抗微生物活性可以通过在特定时间单位内试验溶液杀死多少(如何有效)接种的细菌的指数来计算。在24小时内菌落形成单位中细菌数量减少超过1×log10(4logs)被认为具有很好的抗微生物活性。
[0113] 在表2中，实施例1和2中制备的本发明的组合物试验了对抗金黄色葡萄球菌(MRSA菌株)。试验样品是在温育24小时后分析。生长减少为1表示抗微生物效果较差。4
生长减少为>4logs表示微生物的数量减少超过1×10log，并且表明很好的抗微生物效果。
试验显示含水甘油(70％)没有抗微生物性。实施例1制备的本发明的组合物在盐水稀释度达1:9中具有抗微生物性。实施例2制备的本发明的组合物具有抗微生物性。
[0114] 表2.
[0115]组合物 稀释度 MRSA生长减少
含水甘油(70％) 1
甘油+树脂+盐水(实施例1) 50％储备液 >4log
1:1 >4log
1:2 >4log
1:3 >4log
1:4 >4log
1:5 >4log
1:9 >4log
1:15 1
1:100 1
甘油+松脂+盐水(实施例2) 50％储备液 >4 log
[0116]
[0117] 本发明的组合物的抗微生物效果还根据EN 13697中ISO标准20645/20743挑战性试验在
钢板上试验了对抗金黄色葡萄球菌。试验是在用组合物清洗钢板一周后进行的。试验样品是在温育24小时后分析的。表3和4显示了实施例2制备的组合物的抗微生物效果。
[0118] 表3.微生物生长的减少
[0119]
[0120] *金黄色葡萄球菌
[0121] 结果显示70％乙醇没有显示出抗微生物效果，而实施例2的组合物显示出很好的抗微生物效果。
[0122] 表4.金黄色葡萄球菌生长的减少
[0123]组合物 稀释度 生长减少
100％甘油 1
1:1 1
1:3 1
1:9 1
1:16 1
1:33 1
实施例2 50％储备液 >log4
1:1 >log4
1:3 >log4
1:9 >log4
1:16 1:33
[0124]
[0125] 结果显示100％甘油没有显示出抗微生物效果，而实施例2的组合物显示出很好的抗微生物效果。
[0126] 对于本领域技术人员显而易见的是，作为技术进步，本发明构思可以以多种方式实现。本发明及其实施方案没有限制于上述实施例，但可在
权利要求的范围内变化。
