发明领域

本发明涉及采用DNAzyme抑制再狭窄的起病。所述DNAzyme 通过切割编码c-myc的mRNA达到这一目的，而在血管平滑肌细胞 中c-mcy的表达是再狭窄的发生所需要的。

发明背景 再狭窄

再狭窄是一种严重的内科疾病，它经常在血管成形术之后发生。 这种疾病折磨了所有血管成形术患者的30％-60％。

人们认为再狭窄是由(至少部分是由)在血管形成术过程中发生的 血管损伤之后平滑肌细胞(“SMC’s”)过分增殖而引起的。认为几种生 物调节剂有助于这种SMC的增殖。这些调节剂包括血小板衍生生长 因子(“PDGF”)、成纤维细胞生长因子(“FGF”)和胰岛素样生长因子 (“IGF”)(Ross；Banscota；Libby；Gay)。这些调节剂对SMC增殖的诱导 作用经由许多重要基因的胞内反式激活作用而发生(Kindy；Gadeau)。 这些基因包括c-myc、c-myb、c-fos和PCNA(增殖细胞核抗原)，且 一般是细胞周期特异性的。

具体地说，在血管损伤30分钟至2小时内，c-myc在SMC’s中 过量表达，且表达在此后12小时内降低至正常水平。也就是说，血 管成形术引起血管SMC损伤，后者引起c-myc在损伤后30分钟至2 小时开始过量表达，而在损伤后12小时结束。

目前采用放射疗法和药理学疗法治疗再狭窄。放射疗法包括放 射性植入物或将放射性组合物传递到正在治疗的位点上。尽管放射 治疗已经显示出一些有希望的成果，却产生了内冠状放射的长期副 作用。关于药理学疗法，到此为止使用的抗-thrombotin和抗增殖的 方法一般都没有效果(Bennet)。

DNAzvme

在人类基因治疗中，反义核酸技术已经是选择用于使那些表达 引起疾病并因此不希望有的基因失活的主要方法之一。所述反义的 方法使用一种核酸分子，它互补于编码不希望有的基因的mRNA分 子，并因此与之杂交。这种杂交导致了基因表达的抑制。

反义技术有某些缺点。反义杂交的结果是DNA/目标mRNA异 源双链体的形成。该异源双链体作为RNA酶H介导的降解目标mRNA 成分的底物。在此，所述DNA反义分子以被动方式作用，因为它仅 仅有助于内源RNA酶H的所需切割。这种对RNAse H的依赖在反 义分子的化学性质和与其目标mRNA形成稳定异源双链体的能力方 面，限制了反义分子的设计。反义DNA分子也有与非特异性活性的 相关问题，在较高浓度下甚至有与毒性相关问题。

作为反义分子的替代物，催化核酸分子已表明有希望作为用于 抑制基因表达的治疗剂，且在文献中广泛讨论(Haseloff；Breaker(1994)； Koizumi；Otsuka；Kashani-Sabet；Raillard；和Carmi)。这样，不同于常 规的反义分子，催化核酸分子通过真正切割它的目标mRNA分子而 不是仅仅与之结合而起作用。如果目标序列满足某些最低需要，则 催化核酸可以只切割目标核酸序列。所述目标序列必须互补于催化 核酸的杂交区域，并且该目标必须在切割位点包含特异序列。

有许多资料记载了催化RNA分子(“核酶”)(Haseloff；Symonds； 和Sun)，并且已经表明它们既能够切割RNA分子(Haseloff)又能够切 割DNA分子(Raillard)。事实上，在体外选择和进化技术的发展已经 使采用已知核酶的随机变体或随机序列RNA作为起始点而获得针对 已知底物的新核酶成为可能(Pan；Tsang；和Breaker(1994))。

然而，核酶在它们进行作用的细胞中对酶水解作用是高度敏感 的。这本身又限制了它们的药学应用。

近来，创造了一类新的名为“DNAzyme”的催化分子(Breaker (1995)；Santoro)。DNAzyme是单链的，切割RNA(Breaker(1994)； Santoro)，也切割DNA(Carmi)。已经提出了DNAzyme的一般模型， 称为“10-23”模型。按照“10-23”模型的DNAzyme，也简称为“10-23 DNAzyme”，它包含一个15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧翼为两 个分别含7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别域。体外分析表明，这种 类型的DNAzyme能在生理条件下在嘌呤：嘧啶连接处有效地切割它 的底物RNA(Santoro)。

DNAzyme表明有希望成为治疗药物。然而，DNAzyme成功对 抗由于已知mRNA的存在而导致的疾病是不可预料的。这种不可预 料性部分归因于两个因素。首先，某些mRNA二级结构可能阻碍 DNAzyme结合并切割其目标mRNA的能力。其次，表达目标mRNA 的细胞对DNAzyme的吸入可能不够有效地提供有治疗意义的结果。 由于这些原因，仅仅知道疾病和它的成因目标mRNA序列不能单独 允许人们合理地预料针对目标mRNA的DNAzyme的治疗成功，因 为缺少一个发明性步骤。

发明概述

本申请提供特异性切割c-myc mRNA的DNAzyme，其包含(a)一 个催化域，它具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA，并在朝着它 的任何嘌呤：嘧啶切割位点切割，(b)邻接催化域5’末端的一个结合域， 和(c)邻接催化域3’末端的另一个结合域；其中所述结合域分别地互 补于侧翼紧接c-myc mRNA中需要DNAzyme催化切割的切割位点的 嘌呤残基的两个区域，并因此与之杂交，且其中每个结合域长度至 少为6个核苷酸，两个结合域结合的总长至少为14个核苷酸。

本发明也提供了用于抑制再狭窄起病的药用组合物，它包含所 述DNAzyme和适用于局部给药的药用可接受的载体。

本发明还提供用于抑制再狭窄起病的血管成形术斯滕特固定 模，它包括可操作地涂上预防有效剂量的所述药用组合物的血管成 形术斯滕特固定模。

本发明还提供了用于抑制经受血管成形术的受治疗者中再狭窄 起病的方法，它包括在血管成形术时前后一般给予所述受治疗者预 防有效剂量的所述药用组合物。

最后，本发明提供用于抑制经受血管成形术的受治疗者中再狭 窄起病的方法，它包括在血管成形术时前后局部给予所述受治疗者 所述的血管成形术斯滕特固定模。

附图简述

图1显示Santoro中描述的“10-23”DNAzyme的结构。由X和 Y之间的星号表示切割位点。由N’s表示底物-结合域。

图2显示c-myc RNA-切割DNAzyme的设计。c-myc DNAzyme 的切割位点选在人类c-myc mRNA(第二个外显子)的AUG起始子密 码子。如图所示，切割发生在A和U之间。

图3显示最佳化的DNAzyme臂长和化学修饰。基于“10-23” 型设计了具有不同臂长的c-myc-切割DNAzyme。由阴影C或G(3’ INV)表示在3’端的3’-3’末端碱基倒置。

图4显示多转换(multiple turnover)动力学。图A显示16％聚丙 烯酰胺凝胶的光密度测量图象，它是采用磷光成像器(PhosphorImager) (Molecular Dynamics)而获得的，显示在多转换条件下对合成的c-myc mRNA的切割。所有的反应均用200pM DNAzyme和2nM、4nM、 8nM、16nM和32nM的底物mRNA(如所示)进行。每个反应的温育 时间在0-60分钟之间，在每道的顶端注明。图B显示每个底物浓度 的DNAzyme切割进程(nM)曲线。这些数据是从图A所示的切割条 带的光密度测定中得到的。

图5显示体外c-myc mRNA的切割。在有32P-UTP的情况下从 PGEM载体中转录1.5kb c-myc mRNA底物。切割反应于10mM MgCl2、50mM Tris.HCl pH7.5、37℃下进行60分钟。

图6显示人类血清中3’-倒置DNAzyme的稳定性分析。DNAzyme 与AB型人类血清(Sigma)一起温育。在所示的不同时间点收集样品， 并用32P标记。该标记的DNAzyme在16％聚丙烯酰胺凝胶中分析。 这里显示了未修饰的DNAzyme的典型凝胶带型(上右角)和3’-倒置的 DNAzyme的典型凝胶带型(下右角)。

图7显示在SV-LT-SMC’s中对c-myc mRNA切割DNAzyme的 测试。生长停滞的SMC’s用10％FBS-DME(包含0.5％牛胎血清的 Dulbecco改进的Eagle培养基)在有以下物质的情况下刺激：10mM 称为Rs-6的抗-c-myc mRNA DNAzyme(下述)、10mM对照寡核苷酸 (与Rs-6相同的臂序列，含倒置催化核心序列)或单独的脂质体 (DOTAP；即N-[1-(2,3-二油酰氧基)]-N,N,N-三甲铵-甲基硫酸盐)。数 据以均值±SD表示。

图8显示SMC’s中Rs-6 DNAzyme的剂量-反应实验。该实验详 述按照图7。数据以对照的百分数表示。

图9显示在DNAzyme处理的SMC’s中c-myc的表达。如实施 例7所述用35S-甲硫氨酸标记细胞，并进行免疫沉淀法以确定 DNAzyme处理的SMC’s中c-myc蛋白的表达水平。

图10显示人类c-myc基因的基因组DNA序列(外显子1和2)。

发明详述

本发明目的在于采用DNAzyme技术抑制再狭窄起病。所述疾 病的起病，是在血管成形术过程中由动脉平滑肌的物理性损伤而触 发的，其特征是在此后不久c-myc过量表达几个小时。这种c-myc过 量表达导致SMC过度增殖，而抑制这种过量表达本身又抑制再狭窄 起病。本发明通过在血管成形术时的前后应用c-myc mRNA特异性 DNAmye于损伤区而利用这个c-myc过量表达的“时机窗口”，因 此而切割mRNA并抑制再狭窄起病。

更具体的说，本申请提供了特异性切割c-myc mRNA的 DNAzyme，其包含(a)一个催化域，它具有核苷酸序列 GGCTAGCTACAACGA，并在朝着它的任何嘌呤：嘧啶切割位点切 割，(b)邻接催化域5’末端的一个结合域，和(c)邻接催化域3’末端的 另一个结合域；其中所述结合域分别地互补于侧翼紧接c-myc mRNA 中需要DNAzyme催化切割的切割位点的嘌呤残基的两个区域，并因 此与之杂交，且其中每个结合域长度至少为6个核苷酸，两个结合 域结合的总长至少为14个核苷酸。

这里所用的“DNAzyme”是指特异性识别并切割特殊的目标核 酸序列的DNA分子，它可以是DNA或RNA。所述DNAzyme切割 RNA分子，如图1所示它是“10-23”型的，如此命名是由于历史原 因。在Santoro中描述了这种类型的DNAzyme。10-23 DNAzyme需 要的RNA目标序列是由NNNNNNNR*YNNNNNN、 NNNNNNNNR*YNNNNN或NNNNNNR*YNNNNNNN构成的任何 RNA序列，其中R*Y是切割位点，R是A或G,Y是U或C,N是 任意的G、U、C或A。

在本发明的参量中，结合域的长度(这里也称为“臂长”)可以任 意变更，可以相同或不同。预想了各种变更如7+7、8+8和9+9，且 在后面的实施例中更全面地列举。已经很好地证实了结合域的长度 更长，那么它与互补的mRNA序列就结合得更紧。因此，在优选的 实施方案中，每个结合域的长度为9个核苷酸。在一个实施方案中， 所述DNAzyme具有 TGAGGGGCAGGCTAGCTACAACGACGTCGTGAC序列(在此也称 为“Rs-6”)。

在应用基于DNAzyme的治疗中，DNAzyme在胞内环境下抗降 解而尽可能地稳定是重要的。达到这一目的的一个方法是通过在所 示DNAzyme的一个或更多个末端加入一个3’-3’-倒置。更具体地说， 3’-3’-倒置(在此也简称为“倒置”)是指末端核苷酸及与其相邻的核 苷酸的3’碳原子间的共价磷酸键合。这种类型的键合与相邻核苷酸 的3’和5’碳原子间的一般磷酸键合反向，从而有“倒置”一词。因 此，在优选的实施方案中，3’末端核苷酸残基在邻接催化域3’末端的 结合域中倒置。除倒置外，所述DNAzyme还可以包含修饰的核苷酸。 修饰的核苷酸包括如N3’-P5’磷酰胺(phosphoramidate)键和肽-核酸 键。这些在本领域是众所周知的(Wagner)。

在本发明中，在c-myc mRNA中的任何邻接的嘌呤：嘧啶核苷酸 对都可以作为切割位点。在优选的实施方案中，嘌呤：尿嘧啶是希望 的嘌呤：嘧啶切割位点。

包含所述切割位点的c-myc mRNA区域可以是任何区域。例如， c-myc mRNA中需要DNAzyme-催化切割的位置可以是翻译起始位 点、剪接识别位点、5’非翻译区和3’非翻译区。在一个实施方案中， 切割位点位于翻译起始位点。

人类c-myc mRNA序列和/或编码所述序列的DNA是众所周知 的(Bernard)。如这里所用的“c-myc mRNA”是指由图10所示的人类 c-myc DNA序列或由其任何自然存在的多态形式编码的任何mRNA 序列。c-myc mRNA包括成熟mRNA和不成熟mRNA。在本发明的 参量中，确定c-myc mRNA切割位点、每个结合域的所需序列和因 此确定完整DNAzyme序列可以按照众所周知的方法进行。

本发明也提供了用于抑制再狭窄起病的药用组合物，它包含所 述DNAzyme和适用于局部给药的药用可接受载体。

在本发明中，局部给予所述药用组合物可以采用本领域技术人 员已知的任何不同方法和传递系统实现或完成。例如，局部给予可 以经由导管和局部注射和经由如下讨论的涂层斯滕特固定模完成。

用于局部给予的药用载体在本领域中广为人知，将所述载体与 待传递的活性剂混合的方法也是广为人知。以下使用许多常规使用 的载体的传递系统，只是许多预想用于给予所述组合物的实施方案 的代表。

局部传递系统包括如凝胶和溶液，并可以包含赋形剂如增溶剂、 渗透增强剂(如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪族醇和氨基酸)，和亲水聚合 物(如polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在优选实施方案中，所述药 学上可接受的载体是脂质体或生物可降解的聚合物。可以用于本发 明的脂质体的例子包括如下：(1)CellFectm，阳离子类脂N,NⅠ,NⅡ,NⅢ- 四甲基-N,NⅠ,NⅡ,NⅢ-四棕榈基(palmityl)精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)(GIBCO BRL)的1∶1.5(M/M)脂质体制剂；(2)Cytofectin GSV，一种阳离子类脂和DOPE的2∶1(M/M)脂质体制剂(Glen Research)；(3)DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-N,N,N-三甲基铵-甲基 硫酸盐](Boehringer Manheim)；(4)Lipofectamine，聚阳离子类脂 DOSPA和中性类脂DOPE的3∶1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)。

本发明还提供用于抑制再狭窄起病的血管成形术斯滕特固定 模，它包括可操作涂上预防有效剂量的所述药用组合物的血管成形 术斯滕特固定模。

血管成形术斯滕特固定模，也叫其它名称如“血管内斯滕特固 定模”或简单的“斯滕特固定模”，它们是本领域中众所周知的。 它们经常用于阻止由物理性异常引起的血管闭合，如外科损伤引起 的不希望有的血管组织向内生长的。它们经常含有一个与它们的功 能相称的管状的、膨胀的格栅型结构，并且可选择地可被生物降解。

在本发明中，所述斯滕特固定模可以采用任何适合的本领域所 知的方法可操作地涂上所述药用组合物。在此，“可操作地涂上” 斯滕特固定模是指以这样的方式涂布：一旦给予所述涂布的斯滕特 固定模，则允许适时释放所述药用组合物于待治疗的周围组织。这 种涂布方法，例如，可以采用聚合物聚吡咯(polypyrrole)。斯滕特固 定模、用于涂上上述物质的方法和组合物在美国序列号60/091,217 中详细讨论。

确定所述药用组合物的预防有效剂量可以采用常规计算方法基 于动物数据完成。在一个实施方案中，所述预防有效剂量包含在约 0.1mg和约1g之间的所述DNAzyme。在另一个实施方案中，预防有 效剂量包含在约1mg和100mg之间的所述DNAzyme。在再一实施 方案中，所述预防有效剂量包含在约10mg和50mg之间的所述 DNAzyme。在又一实施方案中，所述预防有效剂量包含约25mg的 所述DNAzyme。

本发明还提供了抑制经受血管成形术的受治疗者中再狭窄起病 的方法，所述方法包括在血管成形术时的前后局部给予受治疗者有 效剂量的所述药用组合物。如这里所用的，在血管成形术时的“前 后”给予所述药用组合物，可以在该手术期间或紧随之前或之后进 行。给予可以按照已知的方法进行，如导管传递。“抑制”再狭窄 起病是指减弱发生于血管成形术之后的再狭窄的严重性，或完全阻 止再狭窄起病。在优选的实施方案中，抑制再狭窄起病是指完全阻 止再狭窄起病。

最后，本发明提供了抑制经受血管成形术的受治疗者中再狭窄 起病的方法，所述方法包括在血管成形术时局部给予受治疗者所述 血管成形术斯滕特固定模。

通过参考以下的实施例将更好地理解本发明，但是本领域技术 人员将易于理解，它们只是说明如后面的权利要求书中更全面描述 的本发明。另外，本申请中列举了不同的文献。这些文献的内容通 过引用结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的技术状 况。 实施例

实施例1 抗-c-myc DNAzyme的体外特性鉴定

DNAzyme的体外效力是通过在测量多转换条件下RNA切割的 速率而确定的。关于这些实验，采用底物的浓度范围以使[S]≥10 倍[E],[E]固定在200pM。所述DNAzyme和32P-标记的合成RNA 底物分别于37℃在50mM Tris.HCl pH 7.5、10mM MgCl2和0.01％SDS 中预平衡10分钟。在时间零时，将DNAzyme和底物混合在一起开 始反应。然后在反应过程后分析在不同时间点按顺序所取并在90％ 甲酰胺、20mM EDTA和加样染料中猝灭的等分试样。在这些样品 中的产物碎片和没有反应的底物通过在16％的变性聚丙烯酰胺凝胶 中电泳分离。每个时间点的反应程度通过由磷光成像器(Molecular Dynamics)产生的凝胶图象的光密度测定确定。采用kobs的值(由这些 时程实验的斜率而来的)以产生在改进的Eadie-Hofstee曲线中最佳拟 合的的线(kobs对kobs/[S])。以这种方法，Km和kcat的值分别的以回归 线的负斜率和y截距给出。

采用多转换动力学检测合成的短c-myc RNA序列的体外 DNAzyme催化切割的效力(图4)。含对称的7、8和9个碱基对底物 结合臂的三种修饰的DNAzyme和它们未修饰对照与过量的32P-标记 的合成c-myc RNA一起温育。根据kobs值确定动力学参量Km和kcat(表 1)。

通过kat/Km的比率测定的每个DNAzyme的总催化效率在修饰的 种类和未修饰的种类之间明显不同。在短臂DNAzyme(7+7bp)中， 包含一个倒置碱基的修饰产生kcat/Km的3倍减小。与这种切割活性 的负相应相反，长臂种类(9+9bp)由于有倒置碱基修饰，相对效率增 强了10倍。中间长度(8+8bp)的结合臂DNAzyme受修饰作用的影响 最小，显示kcat/Km值增加2倍。因此，3’-倒置末端碱基的影响根据 底物结合臂的长度而不同。在短臂(7+7bp)DNAzyme中，发现修饰 作用对催化效率有害。然而，在长臂(9+9bp)分子中，它的确改善催 化活性。未修饰的DNAzyme的活性以8bp底物结合臂最佳。在短 臂(7bp)DNAzyme中，其总效率主要由于较高的Km(3.4-23nM)而较 低。在臂长超过8bp(如9bp)的DNAzyme中，由于Km的相对升高 (3.4-7nM)和kcat的减小(0.11-0.06min-1)，总活性减小。

这样，对于c-myc mRNA切割DNAzyme而言，发现未修饰型式 的最佳切割效率是含8bp臂的型式。根据各自的kcat/Km值，未修饰 的c-myc DNAzyme的7bp和9bp的型式总效率较低。

这三种不同大小的c-myc切割分子的动力学型式由于包含3’-末 端核苷酸倒置而明显地改变。这种DNA修饰作用对c-myc RNA切割 动力学的影响在短的7bp臂DNAzyme中特别明显。与未修饰型对 比，这种分子按照它的kcat/Km值基本上没有效率。然而这种催化效 率的减弱通过在8bp修饰型中添加另外两个核苷酸而恢复甚至增 强。这表明短DNAzyme活性的减弱是由于DNA/RNA相互作用的一 些干扰(由核苷酸倒置而引起的)引起的，它可以通过增加臂长度至8 bp而得到恢复。通过进一步增加修饰型DNAzyme的长度至9bp， 发现催化效率的另一个轻微改进。这与未修饰型DNAzyme的情况形 成对照，未修饰型DNAzyme的情况证明当从8bp增加臂的长度至9bp 时发现活性急剧下降。

这些结果证明8bp是未修饰型DNAzyme对c-myc RNA切割的 最佳长度。在3’-倒置型DNAzyme中9bp的臂长度好象提供了最佳 催化切割活性。含9bp臂的未修饰型DNAzyme中所见的催化效率 的下降部分反映酶转换率的减弱，表现为较低的kcat值。这种较低的 转换率可能是由于所述DNAzyme对反应物亲和力增强的结果，亲和 力本身又减慢产物的解离。在通过末端碱基倒置修饰的DNA中避免 了这种活性的减弱，这可能是对酶-产物相互作用的去稳定作用的结 果。

                                 表1

                      c-myc-切割DNAzyme的动力学   DNAzyme   臂长      修饰 kcat(min-1)  Km(nM)     kcat/Km  (pM-1·min-1)    Rs-1   7+7      无     0.25    23     10.8    Rs-2   7+7    3’-倒置     0.16    50      3.2    Rs-3   8+8      无     0.11    3.4       32    Rs-4   8+8    3’-倒置     0.24     4       60    Rs-5   9+9      无     0.06     7      8.6    Rs-6   9+9    3’-倒置     0.26     4       65

分析三种不同长度、都针对起始子的DNAzyme(修饰的和未修 饰的)的c-myc RNA切割的动力学。反应在有10mM MgCl2和50mM Tris·HCl pH7.5的情况下，在含至少10倍过量的底物的多转换条件 下进行。

实施例2 全长c-myc mRNA的体外切割

全长c-myc mRNA用于进一步测试DNAzyme在刺激的生理条件 下(10mM MgCl2,pH7.5,37℃)切割不同型式的c-myc mRNA的能 力。切割反应在单转换条件下进行，采用10nM长底物(c-myc mRNA) 和50nMDNAzyme。

图5显示了所有的DNAzyme以20-50％的切割速率有效地切割 c-myc mRNA。如所预料的，较长臂的DNAzyme更有效地切割底物。 3’-倒置碱基的修饰作用减小了7+7臂DNAzyme的切割效率，但增 强了9+9臂DNAzyme的切割效率。有趣的是，预热和不预热的 DNAzyme之间的DNAzyme切割效率没有不同。这种结果表明c-myc mRNA中的切割位点的可及性不受mRNA二级结构的影响。 实施例3 DNAzyme的化学修饰和稳定性

以下方法分析在100％人类AB血清中DNAzyme的稳定性。简 要的说，将150μM未标记的DNAzyme在37℃培养于100μl 100％的 人类血清中温育，在时间点0、2、4、8、24、48和72小时取出重 复样品5μl。取样时，立即将295μl TE(10mM Tris·HCl,pH7.5,1ml EDTA)加入到5μl的等分样品中，且进行酚/氯仿提取。每个时间点 的所有样品用γ-32P-ATP末端标记，并且没有进一步纯化或沉淀就直 接在16％PAGE凝胶中跑电泳，这样显示了所有完整的DNAzyme 和降解产物。结果表明在3’-末端的3’-3’倒置大大地改善了DNAzyme 在人类血清中的稳定性(t1/2=20小时)，而未修饰的DNAzyme显示半 衰期＜2小时(图6)。

实施例4 DNAzyme介导的抑制SMC的增殖

在血管SV40LT(猿猴病毒40大T抗原)平滑肌细胞(Simons)中测 试抗-c-myc DNAzyme的活性。在0.5％FBS-DMEM中生长停滞后， 通过加入10％的FBS-DMEM将SMC’s从G0中释放。同时将细胞暴 露于由DOTAO传递的DNAzyme或对照寡核苷酸(即含倒置催化核 心序列的9/9臂DNAzyme)中。在传递之后72小时检测DNAzyme 的生长-抑制能力。图7所示的不同DNAzyme的数据显示SMC数量 减少的范围在30％-80％之间，而采用对照的没有发现减少。基于这 些分析结果，最有效的分子Rs-6(含3’-倒置碱基的9/9臂)的活性在 剂量-反应分析(图8)中进一步检测。与对照相比，Rs-6在低至50nM 的浓度下明显抑制SMC的生长。 实施例5 抗-c-myc DNAzyme对SMC细胞周期的影响

DNAzyme对SMC增生的影响也采用两个独立的技术评定，即 DNA细胞周期分析和有丝分裂指数的确定。DNA直方图在血清刺激 后72小时产生。在这72小时的间隔后，与只有65％的刺激细胞保 持在G0/G1相比，74％的未刺激细胞保持在G0/G1。然而，由于加入 DNAzyme Rs-6，保持在G0/G1期的刺激细胞的比例增加至71％。对 比之下，未激活的DNAzyme对照(Rs-8)对SMC周期没有影响。通 过确定刺激后72小时SMC群体的有丝分裂指数(即每1000个细胞中 有丝分裂的数值，用显微镜确定)证明这些结果。

                                  表2

         抗-c-myc DNAzyme对血清-刺激的平滑肌细胞增殖的影响    G0/G1(％)    S(％)    G2/M(％)  有丝分裂指数     (％)    未刺激     DOTAP     Rs-6  Rs-8(对照)     73.66     65.24     70.81     67.81     8.56    12.59     9.93    12.33     13.39     16.62     14.12     15.19      0.5      1.9      0.3      2.2 实施例6 DNAzyme转染的SMC’s中c-myc蛋白的表达

为了在分子水平上说明抗-c-myc DNAzyme的效力，采用免疫沉 淀法分析DNAzyme处理的SMC’s中c-myc蛋白的表达。简单地说， SMC’s在没有血清的培养基中停滞72小时，然后在无met-free培养 基(包含5％的透析胎牛血清)中于37℃培养1小时。除去培养基后， 为细胞更换含5％的透析胎牛血清、100mCi/ml 35S-Met和5mM DNAzyme的met-free培养基，并另外培养2小时。采用如所描述的 方法制备细胞溶胞产物，并采用琼脂糖结合的抗-c-myc抗体检测c-myc 蛋白。如图9所示，如通过代谢标记材料的免疫沉淀法确定，用抗- c-myc DNAzyme处理SMC’s明显地抑制c-myc蛋白的合成。SMC与 对照寡核苷酸(Rs-8)一起温育对c-myc的表达没有影响。

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