用于核酸产生和递送的方法和产品
阅读：788发布：2021-04-06
专利汇可以提供用于核酸产生和递送的方法和产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 部分地涉及核酸，包括编码 蛋白质 的核酸；包含核酸的 治疗 剂以及美容剂；用于将核酸递送至细胞、组织、器官以及患者的方法；使用核酸诱导细胞表达蛋白质的方法；用于 转染 、基因编辑以及重编程细胞的方法、 试剂 盒 以及装置；以及使用这些方法、试剂盒以及装置产生的细胞、 生物 体、治疗剂以及美容剂。描述用于改变细胞的DNA序列的方法和产品，还描述使用合成RNA分子诱导细胞(包括体内存在的细胞)表达蛋白质的方法和产品。还描述包含编码基因编辑蛋白的核酸的治疗剂。，下面是用于核酸产生和递送的方法和产品专利的具体信息内容。
1.一种用于诱导细胞体内表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使细胞体内与核酸接触，其中所述核酸包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
2.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向所述患者施用核酸，其中所述核酸包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
3.如权利要求1所述的方法，其进一步引起所述患者中治疗有效量的所述所关注的蛋白质的表达。
4.如权利要求2所述的方法，其进一步包括向所述患者施用以下组的成员：免疫抑制剂、类固醇、抗生素以及抗霉菌剂。
5.一种合成RNA分子，其编码所关注的蛋白质且包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
6.一种包含核酸和递送媒介物的治疗组合物，其中所述核酸包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
7.一种包含核酸和递送媒介物的美容组合物，其中所述核酸包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为以下组的成员：细胞外基质蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、赖氨酰基氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、肌原纤维蛋白、微纤维缔合糖蛋白、赖氨酰基氧化酶样蛋白、循环蛋白、促红细胞生成素、达贝泊汀、血小板源性生长因子、脂肪酶、解偶联蛋白、产热素、参与色素产生的蛋白质、酪氨酸酶、黑皮质素1受体以及透明质酸合酶。
9.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送一系列剂量的编码一种或多种蛋白质的一种或多种核酸，其中第一剂量在第一时间点给予且第二剂量在第二时间点给予，且其中在所述第二时间点在所述患者中的所述一种或多种蛋白质中的至少一种的量大于在所述第一时间点所述蛋白质的量，以引起所述蛋白质在所述患者中的积聚。
10.一种用于治疗营养不良性大疱性表皮松解症患者的方法，所述方法包括体内或离体向营养不良性大疱性表皮松解症患者递送编码VII型胶原蛋白的合成RNA，以引起所述营养不良性大疱性表皮松解症患者的症状中的一种或多种的改善。
11.一种用于治疗营养不良性大疱性表皮松解症患者的方法，所述方法包括体内或离体向营养不良性大疱性表皮松解症患者递送编码靶向COL7基因的基因编辑蛋白的合成RNA，以引起所述营养不良性大疱性表皮松解症患者的症状中的一种或多种的改善。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述方法改善以下一种或多种病征或症状：所述患者的皮肤的光损伤、老化(包括老化皮肤)、疤痕形成、皮肤松弛症、贫血、埃-当二氏综合征、大疱性表皮松解症(包括营养不良性大疱性表皮松解症)、骨关节炎、牛皮癣、毛发角化病或弹性假黄瘤，诱导皮肤变褐色，均匀肤色，增强疤痕组织的色 素沉着，减少与白癜风相关的色素沉着的损失，促进脂肪减少，减少HIV水牛背，减少油性皮肤，减少痤疮和/或促进伤口愈合。
13.一种药物组合物，其包含有效量的RNA，所述RNA包含不会诱导显著细胞免疫反应且不会大致上减少蛋白质表达的一种或多种非典型核苷酸；和药学上可接受的载体。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述一种或多种非典型核苷酸包括5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
15.一种用于在患者的细胞群中表达蛋白质的方法，所述方法包括：将RNA引入所述细胞群中，所述RNA包含不会诱导显著细胞免疫反应且不会大致上减少蛋白质表达的一种或多种非典型核苷酸，并且所述非典型核苷酸为5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、
5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种。
16.如权利要求15所述的方法，其中至少50％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及
5-甲酰基尿苷。
17.如权利要求16所述的方法，其中至少75％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及
5-甲酰基尿苷。
18.如权利要求17所述的方法，其中至少90％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及
5-甲酰基尿苷。
19.如权利要求18所述的方法，其中至少95％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、 5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
20.如权利要求19所述的方法，其中100％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述RNA包含一种或多种额外非典型核苷酸。
22.如权利要求15-21中任一项所述的方法，其中至少50％的胞苷残基为选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷的非典型核苷酸。
23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中至少75％或至少90％的胞苷残基为选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷的非典型核苷酸。
24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，其中至少50％的尿苷残基为选自5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷的非典型核苷酸。
25.如权利要求15-24中任一项所述的方法，其中至少75％或至少90％的尿苷残基为选自5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷的非典型核苷酸。
26.如权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述RNA包含5’帽结构。
27.如权利要求15-26中任一项所述的方法，其中所述RNA5’-UTR包含Kozak共有序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述RNA 5’-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且所述5’-UTR可包括α-球蛋白或β- 球蛋白5’-UTR。
29.如权利要求15-28中任一项所述的方法，其中所述RNA3’-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且所述3’-UTR可包括α-球蛋白或β-球蛋白3’-UTR。
30.如权利要求15-29中任一项所述的方法，其中所述RNA包含3’多聚腺苷酸尾。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述3’多聚腺苷酸尾的长度为约20个核苷酸至约
250个核苷酸。
32.如权利要求15-31中任一项所述的方法，其中所述RNA编码弹性蛋白。
33.如权利要求15-32中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
34.如权利要求15-33中任一项所述的方法，其中所述方法改善所述患者的皮肤的光损伤。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法改善老化皮肤的症状。
36.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法减少疤痕形成。
37.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法促进伤口愈合。
38.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法改善皮肤松弛症。
39.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法改善弹性假 黄瘤。
40.如权利要求15-39中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
41.如权利要求15-40中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述RNA编码胶原蛋白，所述胶原蛋白任选地为胶原蛋白1、3或7中的一种或多种。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法改善所述患者的皮肤的光损伤。
46.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法改善老化皮肤的症状。
47.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法减少疤痕形成。
48.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法促进伤口愈合。
49.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法改善埃-当二氏综合征。
50.如权利要求43或44所述的方法，其中所述方法改善大疱性 表皮松解症，所述大疱性表皮松解症任选地为营养不良性大疱性表皮松解症。
51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
52.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
53.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
54.如权利要求15-53中任一项所述的方法，其中所述RNA编码透明质酸合酶。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
56.如权利要求54或55所述的方法，其中所述方法改善所述患者的皮肤的光损伤。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述方法改善老化皮肤的症状。
58.如权利要求55或56所述的方法，其中所述RNA被递送至关节。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述RNA改善骨关节炎。
60.如权利要求54-59中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
61.如权利要求54-60中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，其中RNA分两次、 至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
63.如权利要求15-62中任一项所述的方法，其中所述RNA编码酪氨酸酶。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述方法诱导皮肤变褐色或均匀肤色。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述方法增强疤痕组织的色素沉着。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述方法减少与白癜风相关的色素沉着的损失。
68.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
69.如权利要求63-68中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
71.如权利要求15-70中任一项所述的方法，其中所述RNA编码促黑素细胞激素(MSH)。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述方法诱导皮肤变褐色或均匀肤色。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述方法增强疤痕组织的色素沉着。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述方法减少与白癜风相关的色素沉着的损失。
76.如权利要求71-75中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
77.如权利要求71-76中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
78.如权利要求71-77中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
79.如权利要求15-78中任一项所述的方法，其中所述RNA编码脂肪酶或解偶联(UCP)家族蛋白。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述细胞群包括脂肪细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述方法促进脂肪减少。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述方法减少HIV水牛背。
83.如权利要求79-82中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
84.如权利要求15-83中任一项所述的方法，其中所述RNA编码视黄醇脱氢酶，所述视黄醇脱氢酶任选地为视黄醇脱氢酶10。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述细胞群包括皮肤细胞。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述方法减少油性皮肤或痤疮。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述方法改善牛皮癣。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述方法改善毛发角化病。
89.如权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括角质层的去除或破坏。
90.如权利要求84-89中任一项所述的方法，其中所述RNA通过施加瞬态电场被引入细胞中。
91.如权利要求84-90中任一项所述的方法，其中RNA分两次、至少三次、至少五次或至少十次被引入所述患者的细胞中。
92.一种药物组合物，其包含有效量的RNA，所述RNA包含不会诱导显著细胞免疫反应且不会大致上减少蛋白质表达的一种或多种非典型核苷酸；和药学上可接受的载体，并且所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种。
93.如权利要求92所述的药物组合物，其中至少50％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
94.如权利要求93所述的药物组合物，其中至少75％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
95.如权利要求94所述的药物组合物，其中至少90％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
96.如权利要求95所述的药物组合物，其中至少95％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰 基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
97.如权利要求96所述的药物组合物，其中100％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
98.如权利要求92-97中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA包含一种或多种额外非典型核苷酸。
99.如权利要求92-98中任一项所述的药物组合物，其中至少50％的胞苷残基为选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷的非典型核苷酸。
100.如权利要求99所述的药物组合物，其中至少75％或至少90％的胞苷残基为选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷的非典型核苷酸。
101.如权利要求92-100中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA包含5’帽结构。
102.如权利要求92-101中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA5’-UTR包含Kozak共有序列。
103.如权利要求92-102中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA5’-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且所述5’-UTR可包括α-球蛋白或β-球蛋白5’-UTR。
104.如权利要求92-103中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA3’-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且所述3’-UTR可包括α-球蛋白或β-球蛋白3’-UTR。
105.如权利要求92-104中任一项所述的药物组合物，其中所述 RNA包含3’多聚腺苷酸尾。
106.如权利要求105所述的药物组合物，其中所述3’多聚腺苷酸尾的长度为约20个核苷酸至约250个核苷酸。
107.如权利要求92-106中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码弹性蛋白。
108.如权利要求92-107中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码胶原蛋白，所述胶原蛋白任选地为胶原蛋白1、3或7。
109.如权利要求92-108中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码透明质酸合酶。
110.如权利要求92-109中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码酪氨酸酶。
111.如权利要求92-110中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码促黑素细胞激素(MSH)。
112.如权利要求92-111中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码脂肪酶或解偶联(UCP)家族蛋白。
113.如权利要求92-112中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA编码视黄醇脱氢酶，所述视黄醇脱氢酶任选地为视黄醇脱氢酶10。
114.如权利要求113所述的药物组合物，其中所述视黄醇脱氢酶为视黄醇脱氢酶10。
115.如权利要求92-114中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物适用于皮肤病学或美容治疗 。
116.一种核酸递送贴片，其包括：
a.柔性膜；和
b.多根针；
其中所述多根针附接至所述柔性膜。
117.如权利要求116所述的贴片，其进一步包括核酸。
118.如权利要求117所述的贴片，其中所述核酸存在于溶液中。
119.如权利要求116-118中任一项所述的贴片，其中所述多根针包括一根或多根具有管腔的针。
120.如权利要求116-119中任一项所述的贴片，其进一步包括第二柔性膜。
121.如权利要求120所述的贴片，其中所述柔性膜和所述第二柔性膜经布置形成空腔。
122.如权利要求116-121中任一项所述的贴片，其中所述空腔含有核酸。
123.如权利要求116-122中任一项所述的贴片，其进一步包括所述膜中的一个或多个孔，核酸可通过所述孔。
124.如权利要求123所述的贴片，其中所述一个或多个孔和一根或多根具有管腔的针经布置以允许含有核酸的溶液通过所述一个或多个孔中的至少一个并且通过所述一根或多根具有管腔的针中的至少一根。
125.一种包括多根针的核酸递送贴片，其中至少一根针包括管腔，并且其中至少两根针形成高压电路的一部分。
126.如权利要求125所述的贴片，其中所述高压电路产生大于10V的电压。
127.如权利要求125-126所述的贴片，其中所述高压电路产生大于的电压。
128.如权利要求125-127中任一项所述的贴片，其中在所述针中的两根之间产生电场。
129.如权利要求125-128中任一项所述的贴片，其中所述电场的量值为至少100V/cm。
130.如权利要求125-129中任一项所述的贴片，其中所述电场的量值为至少200V/cm。
131.如权利要求125-130中任一项所述的贴片，其经配置以将核酸递送至表皮。
132.如权利要求125-131中任一项所述的贴片，其经配置以将核酸递送至真皮。
133.如权利要求125-132中任一项所述的贴片，其经配置以将核酸递送至皮下组织。
134.如权利要求125-133中任一项所述的贴片，其经配置以将核酸递送至肌肉。
135.一种核酸递送贴片，其包括：
a.柔性膜；和
b.多个电极；
其中所述多个电极附接至所述柔性膜。
136.一种核酸递送贴片，其包括：
(a)刚性结构；和
(b)多个电极；
其中所述多个电极附接至所述刚性结构。
137.一种用于将核酸体内递送至细胞的方法，所述方法包括：
(a)体内向含有所述细胞的组织施用所述核酸；和
(b)在所述细胞附近施加瞬态电场；
以引起所述细胞体内内化所述核酸。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子包括合成RNA分子。
139.如权利要求137-138中任一项所述的方法，其进一步引起所述细胞内化治疗或美容有效量的所述核酸。
140.如权利要求137-139中任一项所述的方法，其中所述细胞是皮肤细胞。
141.如权利要求137-140中任一项所述的方法，其中所述细胞是真皮成纤维细胞。
142.如权利要求137-141中任一项所述的方法，其中所述细胞是角化细胞。
143.如权利要求137-142中任一项所述的方法，其中所述细胞是成肌细胞。
144.如权利要求137-143中任一项所述的方法，其中所述核酸编码所关注的蛋白质。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为以下组的成员：荧光蛋白和细胞外基质蛋白。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、赖氨酰基氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、肌原纤维蛋白、微纤维缔合糖蛋白、赖氨酰基氧化酶样蛋白、血小板源性生长因子、脂肪酶、解偶联蛋白、产热素以及参与色素产生的蛋白质。
147.如权利要求137-146中任一项所述的方法，其进一步包括将所述核酸递送至表皮。
148.如权利要求137-147中任一项所述的方法，其进一步包括将所述核酸递送至真皮。
149.如权利要求137-148中任一项所述的方法，其进一步包括在真皮下方递送所述核酸。
150.如权利要求137-149中任一项所述的方法，其中所述递送是通过注射进行。
151.如权利要求137-150中任一项所述的方法，其中所述递送是通过使用微针阵列注射进行。
152.如权利要求137-151中任一项所述的方法，其中所述核酸存在于溶液中。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述溶液进一步包含生长因子。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述生长因子为以下一种：成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。
155.如权利要求152所述的方法，其中所述溶液进一步包含胆 固醇。
156.一种用于体内诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使细胞体内与包含以下的溶液接触：
胆固醇；和
一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码所关注的蛋白质；
以引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。
157.如权利要求156所述的方法，其进一步引起所述细胞表达治疗或美容有效量的所述所关注的蛋白质。
158.一种用于用核酸分子体内转染细胞的方法，所述方法包括使细胞体内与包含以下的溶液接触：
用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白；和
核酸分子；
以引起所述细胞内化所述核酸分子。
159.如权利要求158所述的方法，其进一步引起所述细胞内化治疗或美容有效量的所述核酸分子。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述核酸分子包括以下至少一种：dsDNA分子、ssDNA分子、dsRNA分子、ssRNA分子、质粒、寡核苷酸、合成RNA分子、miRNA分子、mRNA分子以及siRNA分子。
161.一种用于诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使细胞与合成RNA分子接触，其中所述合成RNA分子包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基 胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
162.一种用于用合成RNA分子转染细胞的方法，所述方法包括使细胞与包含一种或多种合成RNA分子的溶液接触，其中所述一种或多种合成RNA分子中的至少一种包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
163.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向所述患者施用合成RNA分子，所述合成RNA分子包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。
164.如权利要求163所述的方法，其引起所述患者的皮肤中所述所关注的蛋白质的表达。
165.如权利要求164所述的方法，其进一步包括类固醇的施用。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述类固醇为氢化可的松。
167.如权利要求163-166中任一项所述的方法，其进一步包括施用抗生素。
168.如权利要求163-167中任一项所述的方法，其进一步包括施用抗霉菌剂。
169.如权利要求163-168中任一项所述的方法，其进一步包括施用RNA酶抑制剂。
170.一种用于体内将核酸递送至细胞的方法，所述方法包括：
破坏所述角质层；和
使所述细胞与所述核酸接触；
以引起所述细胞内化所述核酸。
171.一种用于体内诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括：
破坏所述角质层；和
使所述细胞与编码所关注的蛋白质的核酸接触；
以引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。
172.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括：
破坏患者的所述角质层；和
向所述患者施用核酸。
173.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括：
破坏所述角质层；和
向所述患者施用编码所关注的蛋白质的核酸；
以引起所述患者中所述所关注的蛋白质的表达。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述患者需要所述所关注的蛋白质。
175.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送包含以下的组合物：
用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白；和
一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一 种编码所关注的蛋白质；
以引起所述患者中所述所关注的蛋白质的表达。
176.如权利要求175所述的方法，其进一步引起所述患者的皮肤中所述所关注的蛋白质的表达。
177.如权利要求175-176中任一项所述的方法，其进一步引起所述患者中治疗有效量的所述所关注的蛋白质的表达。
178.如权利要求175-177中任一项所述的方法，其进一步包括类固醇的施用。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述类固醇为氢化可的松。
180.一种合成RNA分子，其编码所关注的蛋白质且包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及
5-甲酰基尿苷。
181.一种美容组合物，其包含：
用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白；和
核酸分子。
182.一种美容治疗物品，其包含如权利要求181所述的组合物，所述组合物容纳于经配置以将所述组合物递送至患者的装置中。
183.如权利要求181所述的美容组合物，其中所述核酸分子编码以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、酪氨酸酶、黑皮质素1受体以及透明质酸合酶。
184.一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送一系列剂量的编码一种或多种蛋白质的合成RNA，其中第一剂量在第一 时间点给予且第二剂量在第二时间点给予，且其中在所述第二时间点在所述患者中的所述一种或多种蛋白质中的至少一种的量大于在所述第一时间点所述蛋白质的量，以引起所述蛋白质在所述患者中的积聚。
185.一种包含编码一种或多种蛋白质的合成RNA分子的治疗组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种为细胞外基质蛋白。
186.一种包含编码一种或多种蛋白质的合成RNA分子的美容组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种为细胞外基质蛋白。
187.一种用于治疗色素沉着病症的方法，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的合成RNA。
188.一种用于改变患者的色素沉着的方法，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的合成RNA。
189.一种美容组合物，其包含编码酪氨酸酶的合成RNA。
190.一种治疗组合物，其包含编码酪氨酸酶的合成RNA。
191.一种用于增加患者的皮肤的紫外线吸收的方法，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的合成RNA，以引起所述患者的皮肤的紫外线吸收的增加。
192.一种用于减少个体的皮肤在暴露于紫外光时的光损伤的方法，所述方法包括向个体递送编码酪氨酸酶的合成RNA，以引起所述个体的皮肤在暴露于紫外光时的光损伤的减少。
193.一种用于治疗着色性干皮病患者的方法，所述方法包括向着色性干皮病患者递送编码酪氨酸酶的合成RNA，以引起所述着色性干皮病患者的症状中的一种或多种的改善。
194.一种用于治疗色素沉着病症的方法，所述方法包括：a.使细 胞与编码酪氨酸酶的合成RNA接触，和b.向患有色素沉着病症的患者递送所述细胞，以引起所述患者的症状中的一种或多种的改善。
195.一种用于治疗营养不良性大疱性表皮松解症患者的方法，所述方法包括向营养不良性大疱性表皮松解症患者递送编码VII型胶原蛋白的合成RNA，以引起所述营养不良性大疱性表皮松解症患者的症状中的一种或多种的改善。
196.一种用于改变患者的色素沉着的方法，所述方法包括向患者递送编码黑皮质素1受体的合成RNA，以引起所述患者的色素沉着的改变。
197.一种用于治疗干燥病的方法，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的合成RNA，以引起所述患者的症状中的一种或多种的改善。
198.如权利要求197所述的方法，其中所述患者经诊断患有异位性皮炎。
199.如权利要求197所述的方法，其中所述患者经诊断患有鱼鳞病。
200.一种用于诱导组织愈合的方法，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的合成RNA，以引起组织愈合。
201.如权利要求200所述的方法，其中所述患者已进行白内障手术。
202.一种治疗、预防或改善皮肤病学疾病、病症和/或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含RNA的药物组合物，所述RNA包含一种或多种非典型核苷酸，其中：
所述皮肤病学疾病、病症和/或病况为以下一种或多种：寻常痤 疮、夏令痤疮、聚合性痤疮、美容痤疮、爆发性痤疮、项部疤痕疙瘩性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、光化性角化病、寻常痤疮、夏令痤疮、聚合性痤疮、美容痤疮、爆发性痤疮、项部疤痕疙瘩性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、急性荨麻疹、过敏性接触性皮炎、斑秃、血管性水肿、脚癣、异位性皮炎、自体湿疹化、婴儿痤疮、渐秃、芽生菌病、黑头粉刺、胎记和其它皮肤色素沉着问题、疖子、挫伤、臭虫叮咬、灼伤、蜂窝组织炎、恙螨、氯痤疮、胆碱能性或压力荨麻疹、慢性荨麻疹、寒冷性荨麻疹、融合性网状乳头状瘤病、鸡眼、囊肿、头皮屑、疱疹样皮炎、皮肤划痕症、出汗障碍性湿疹、尿布疹、干性皮肤、出汗障碍、外胚层发育不良(如少汗性外胚层发育不良和X联锁少汗性外胚层发育不良)、湿疹、疣状表皮发育不良、结节性红斑、剥脱性痤疮、运动诱发的过敏症毛囊炎、过量皮肤油、毛囊炎、雀斑、冻疮、真菌指甲、毛发密度、毛发生长速率、卤素痤疮、脱发、痱子、血肿、单纯疱疹感染(例如非生殖器)、化脓性汗腺炎、麻疹、多汗症、色素沉着过多、少汗性外胚层发育不良、色素沉着不足、脓疱病、毛发内生、热型荨麻疹、嵌甲、婴儿痤疮或新生儿痤疮、发痒、刺激性接触性皮炎、股癣、疤痕瘤、毛发角化病、扁平苔癣、硬化性苔癣、面部播散性粟粒性狼疮、黑斑病、黑痣、传染性软疣、指甲生长速率、指甲健康状况、神经性皮炎、钱币状湿疹、职业性痤疮、油性痤疮、甲癣、物理性荨麻疹、潜毛性囊肿、玫瑰糠疹、变色性皮癣、毒葛、香膏剂痤疮、须部假性毛囊炎或项部疤痕疙瘩性痤疮、牛皮癣、牛皮癣关节炎、压力或延迟压力荨麻疹、刺伤(如割伤与擦伤)、皮疹、罕见或水性荨麻疹、鼻成形术、轮癣、酒糟鼻、罗-汤二氏综合征、皮肤松弛、疥疮、疤痕、皮脂溢、皮脂溢性皮炎、带状疱疹、皮肤癌、皮垂、太阳型荨麻疹、蜘蛛咬伤、妊娠纹、晒斑、焦油痤疮、热带痤疮、皮肤变薄、鹅口疮、花斑癣、短暂性棘层松解皮肤病、混合型脱发或粟粒坏死性痤疮、不均匀肤色、静脉曲张、静脉性湿疹、振动性血管性水肿、白癫风、疣、韦-克二氏病、皱纹、x联锁少汗性外胚层发育不良、干燥性湿疹、酵母菌感染以及老化的一 般征兆，和
所述非典型核苷酸为5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种。
用于核酸产生和递送的方法和产品
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2014年1月31日提交的美国临时申请号61/934,397、2014年8月18日提交的美国临时申请号62/038,608和2014年10月28日提交的美国临时申请号62/069,667的优先权，所述临时申请的完整内容由此以引用的方式全文并入。
[0003] 本申请与2012年5月7日提交的美国申请号13/465,490、2012年12月5日提交的国际申请号PCT/US2012/067966、2013年6月28日提交的美国申请号13/931,251和2013年11月1日提交的国际申请号PCT/US2013/068118有关，所述申请的完整内容由此以引用的方式全文并入。
发明领域
发明领域
[0004] 本发明部分地涉及用于产生核酸和将核酸递送至细胞、组织、器官以及患者的方法、组合物以及产品，用于在细胞、组织、器官以及患者中表达蛋白质的方法，以及使用这些方法、组合物以及产品产生的细胞、治疗剂以及美容剂。
[0005] 以电子方式递交的文本文件的描述
[0006] 随同以电子方式递交的文本文件的内容以引用的方式全文并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：FAB-008PC SequenceListing.txt；记录的日期：2015年1月30日；文件大小：929KB)。
[0007] 背景
[0008] 合成RNA和核酸治疗剂
[0009] 核糖核酸(RNA)普遍存在于原核细胞和真核细胞中，其中其以信使RNA形式编码遗传信息，以转运RNA形式结合并且转运氨基酸，以核糖体RNA形式将氨基酸组装成蛋白质，并且执行多种其它功能，包括以微RNA和长链非编码RNA形式的基因表达调控。RNA可通过包括直接化学合成和体外转录在内的方法以合成方式产生，并且可针对治疗用途施用于患者。然而，先前描述的合成RNA分子不稳定并且在人细胞中触发强力的先天免疫反应。另外，先前尚未描述用于体内将核酸有效非病毒递送至患者、器官、组织以及细胞的方法。用于核酸递送的现有合成RNA技术和方法的多种缺陷使其不合乎治疗或美容用途的需要。
[0010] 细胞重编程和基于细胞的疗法
[0011] 细胞可通过使其暴露于特定细胞外诱化源和/或通过特定蛋白质、微RNA等的异位表达来进行重编程。虽然先前已经描述了数种重编程方法，但依赖异位表达的大多数方法需要引入外源DNA，所述外源DNA可携带突变风险。已经报道了基于重编程蛋白质的直接递送的无DNA重编程方法。然而，这些方法对于商业用途来说过于低效和不可靠。另外，已经描述了基于RNA的重编程方法(参见例如Angel.MIT Thesis.2008.1-56；Angel等人PLoS ONE.2010.5,107；Warren等人Cell Stem Cell.2010.7,618-630；Angel.MIT Thesis.2011.1-89；以及Lee等人Cell.2012.151,547-558；其内容均由此以引用的方式并入)。然而，现有的基于RNA的重编程方法在对成体细胞执行时费时、不可靠并且低效，需要多次转染(引起显著费用和误差机会)，可仅重编程有限数目的细胞类型，可仅将细胞重编程为有限数目的细胞类型，需要使用免疫抑制剂，并且需要使用多种人源性组分，包括血源性HSA和人成纤维细胞供给者。先前公开的基于RNA的重编程方法的多种缺陷使其不合乎体内用途的需要。
[0012] 基因编辑
[0013] 数种天然存在的蛋白质含有可识别特定DNA序列的DNA结合结构域，例如锌指(ZF)和转录活化因子样效应子(TALE)。含有这些DNA结合结构域中的一者或多者和FokI核酸内切酶的裂解结构域的融合蛋白可用于在细胞中的所需DNA区域中产生双链断裂(参见例如美国专利申请公布号US 2012/0064620、美国专利申请公布号US 2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公布号US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公布号US 2011/0301073、美国专利申请公布号US 2011/0145940、美国专利号8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432以及美国专利申请公布号2013/
0122581，其内容均由此以引用的方式并入)。然而，用于基因编辑细胞的当前方法低效并且携带不受控诱变的风险，使其不合乎研究和治疗用途的需要。先前尚未探索用于体细胞的无DNA基因编辑的方法，也未探索用于体细胞的同时或依序基因编辑和重编程的方法。另外，先前尚未探索用于在患者中(即，体内)直接基因编辑细胞的方法，并且所述方法的发展已经受限于可接受的靶标的缺乏、低效递送、基因编辑蛋白的低效表达、所表达的基因编辑蛋白的低效基因编辑(部分地归因于DNA结合结构域的不良结合)、过量脱靶效应(部分地归因于FokI裂解结构域的非定向二聚化和DNA结合结构域的不良特异性)以及其它因素。最后，先前尚未探索基因编辑在抗细菌、抗病毒以及抗癌治疗中的用途。
0122581，其内容均由此以引用的方式并入)。然而，用于基因编辑细胞的当前方法低效并且携带不受控诱变的风险，使其不合乎研究和治疗用途的需要。先前尚未探索用于体细胞的无DNA基因编辑的方法，也未探索用于体细胞的同时或依序基因编辑和重编程的方法。另外，先前尚未探索用于在患者中(即，体内)直接基因编辑细胞的方法，并且所述方法的发展已经受限于可接受的靶标的缺乏、低效递送、基因编辑蛋白的低效表达、所表达的基因编辑蛋白的低效基因编辑(部分地归因于DNA结合结构域的不良结合)、过量脱靶效应(部分地归因于FokI裂解结构域的非定向二聚化和DNA结合结构域的不良特异性)以及其它因素。最后，先前尚未探索基因编辑在抗细菌、抗病毒以及抗癌治疗中的用途。
[0014] 因此，仍需要用于核酸产生和将核酸递送至细胞、组织、器官以及患者的改进方法和组合物。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明部分地提供用于将核酸递送至细胞、组织、器官以及患者的组合物、方法、物品以及装置，用于诱导细胞表达蛋白质的方法，用于产生这些组合物、方法、物品以及装置的方法、物品以及装置，以及使用这些组合物、方法、物品以及装置产生的组合物和物品，包括细胞、生物体、美容剂和治疗剂。不同于先前报道的方法，本发明的某些实施方案不涉及使细胞暴露于外源DNA或同种异体或动物源性材料，从而使得根据本发明方法产生的产品适用于治疗和美容应用。
[0017] 在一些方面，提供一种用于在患者的细胞群中表达蛋白质的方法，所述方法包括将RNA引入所述细胞群中，所述RNA包含不会诱导显著细胞免疫反应且不会大致上减少蛋白质表达的一种或多种非典型核苷酸。在一些实施方案中，至少50％或至少75％或至少90％的所述非典型核苷酸选自5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种，或在一些实施方案中选自5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷中的一种或多种。其它实施方案涉及所述RNA的额外元件，例如5'帽结构、3'多聚腺苷酸尾以及5'-UTR和/或3'-UTR，所述5'-UTR和/或3'-UTR任选地包含Kozak共有序列、增加体内RNA稳定性的序列(举例说明，如α-球蛋白或β-球蛋白5’-UTR)中的一种或多种。
[0019] 一方面，本发明提供用于治疗人的疾病和病况的方法和组合物，包括但不限于预防性治疗、用于罕见疾病(包括但不限于皮肤病学罕见疾病)的治疗以及用于医学皮肤病学和美容医学的治疗。另一方面，本发明提供包含核酸的美容剂。其它方面涉及用于改变色素沉着，例如用于治疗色素沉着病症的方法和组合物。其它方面涉及用于增强愈合，包括但不限于响应于伤口或手术的愈合的方法和组合物。其它方面涉及包含一种或多种非典型核苷酸的核酸。一方面，本发明提供包含例如5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种，或在一些实施方案中选自5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷和/或5-甲酰基胞苷中的一种或多种的核酸。
[0020] 本发明的组合物可改变、修改和/或变化受试者的外皮系统的成员(如但不限于皮肤、毛发以及指甲)的外观。所述改变、修改和/或变化可在如本文所述的治疗方法和/或治疗用途的情形下，举非限制性的实例，所述治疗方法和/或治疗用途包括皮肤病学治疗和美容程序。
[0021] 在一些方面，提供具有低毒性和高翻译效率的合成RNA分子。一方面，提供用于细胞的高效率体内转染、重编程以及基因编辑的细胞培养基。其它方面关于用于产生编码重编程蛋白质的合成RNA分子的方法。其它方面关于用于产生编码基因编辑蛋白的合成RNA分子的方法。
[0022] 一方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶裂解结构域的高效率基因编辑蛋白。另一方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶裂解结构域的高保真度基因编辑蛋白。其它方面涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高效率基因编辑蛋白。其它方面关于包含工程改造的DNA结合结构域的高保真度基因编辑蛋白。其它方面涉及包含工程改造的重复序列的基因编辑蛋白。一些方面涉及通过用基因编辑蛋白转染细胞或诱导细胞表达基因编辑蛋白来改变细胞的DNA序列的方法。其它方面涉及用于改变存在于体外培养物中的细胞的DNA序列的方法。其它方面涉及用于改变体内存在的细胞的DNA序列的方法。
[0023] 在一些方面，本发明提供用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸。一方面，所述基因编辑蛋白能够改变癌症相关基因的DNA序列。另一方面，所述癌症相关基因为BIRC5基因。其它方面涉及包含核酸和/或细胞的治疗剂和使用包含核酸和/或细胞的治疗剂来治疗例如1型糖尿病、心脏病(包括缺血性心肌病和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊肿性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、重症联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默氏病、癌症以及传染病(包括肝炎和HIV/AIDS)的方法。在一些方面，所述核酸包括合成RNA。在其它方面，使用病毒将所述核酸递送至细胞。在一些方面，所述病毒为具有复制能力的病毒。在其它方面，所述病毒为不具有复制能力的病毒。
[0024] 本发明的细节陈述于以下伴随描述中。尽管类似于或等效于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明，但现在描述说明性方法和材料。本发明的其它特征、目标以及优点将根据描述并且根据权利要求为显而易知的。在本说明书和随附权利要求书中，除非上下文清楚地另外指示，否则单数形式还包括复数。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明本领域的技术人员通常所理解相同的含义。
[0027] 图2描绘用图1的RNA转染的原代成人皮肤成纤维细胞。
[0028] 图3描绘使用靶向人弹性蛋白的抗体对图2的原代成人皮肤成纤维细胞进行的免疫细胞化学分析的结果。
[0029] 图4描绘用包含胞苷、5-甲基胞苷(“5mC”)、5-羟基甲基胞苷(“5hmC”)、5-羧基胞苷(“5cC”)或5-甲酰基胞苷(“5fC”)并且编码Oct4蛋白的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞。固定细胞并且在转染后24小时对Oct4蛋白染色。
[0030] 图5描绘用包含5-羟基甲基胞苷并且编码绿色荧光蛋白(“GFP”)的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞。在转染后24小时对细胞成像。
[0031] 图6描绘用包含5-羟基甲基胞苷(“5hmC”)并且编码GFP的合成RNA处理的健康、33岁、男性人受试者的腹侧前臂区域。箭头指示荧光细胞。
[0032] 图7描绘用包含5-羟基甲基胞苷(“5hmC”)并且编码GFP的合成RNA处理的健康、33岁、男性患者的腹侧前臂区域。上部图显示相同前臂上的未处理区域，而底部图显示在处理区域内的两个视野。荧光细胞(用箭头指示)在底部图中清楚可见。
[0033] 图8描绘用包含5-甲基尿苷和5-羟基甲基胞苷并且编码所指示的蛋白质的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞。固定细胞并且在转染后48小时使用靶向所指示的蛋白质的抗体进行染色。
[0034] 图9描绘用包含5-甲基尿苷和5-羟基甲基胞苷并且编码人酪氨酸酶的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞。固定细胞并且在转染后24小时使用靶向人酪氨酸酶的抗体进行染色。
[0035] 图10描绘原代人表皮黑素细胞。
[0036] 图11描绘用包含5-羟基甲基胞苷并且编码所指示的蛋白的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞。
[0037] 图12描绘用包含5-羟基甲基胞苷并且编码人酪氨酸酶的合成RNA每天转染的原代人皮肤成纤维细胞。各样品上方显示转染次数。在最终转染后48小时对细胞成像。
[0038] 图13描绘用包含所指示的核苷酸并且编码人酪氨酸酶的合成RNA每天转染的原代人皮肤成纤维细胞。在转染后48小时对细胞成像。
[0039] 图14描绘用包含所指示的核苷酸并且编码人酪氨酸酶的合成RNA转染的原代人皮肤成纤维细胞中的IFNB1表达和色素产生。将值针对用仅包含典型核苷酸(“A、G、U、C”)的合成RNA转染的样品标准化。GAPDH用作上样对照。误差条指示标准误差(n＝2)。
[0040] 图15描绘如图14中测量的所指示的基因的表达。
[0041] 图16描绘用包含5-甲基尿苷和5-羟基甲基胞苷并且编码人酪氨酸酶的合成RNA处理的健康、33岁、男性人受试者的腹侧前臂区域(上部图)，和相同受试者的腹侧前臂上的雀斑(底部图)。对于两个图像使用相同的放大率。
[0042] 图17描绘用包含5-羟基甲基胞苷并且编码胶原蛋白I(A1)的合成RNA(“+COL1RNA”)转染的原代人皮肤成纤维细胞。在转染后24小时与72小时之间，固定细胞并且使用靶向胶原蛋白I的抗体进行染色。关于以下每一者显示两个代表性视野：转染的细胞和未转染的细胞(“阴性”)。箭头指示胶原蛋白I的细胞外沉积物。
[0043] 图18描绘用包含5-羟基甲基胞苷并且编码胶原蛋白VII(A1)的合成RNA(“+COL7RNA”)转染的原代人皮肤成纤维细胞。在转染后24小时与72小时之间，固定细胞并且使用靶向胶原蛋白I的抗体进行染色。关于以下每一者显示代表性视野：转染的细胞和未转染的细胞(“阴性”)。
[0044] 发明详述
[0045] 定义
[0046] “分子”意指分子实体(分子、离子、复合物等)。
[0047] “RNA分子”意指包含RNA的分子。
[0048] “合成RNA分子”意指使用生物工程改造在细胞外部产生的RNA分子或在细胞内部产生的RNA分子，举非限制性实例，在体外转录反应中产生的RNA分子、通过直接化学合成产生的RNA分子或在基因工程改造的大肠杆菌(E.coli)细胞中产生的RNA分子。
[0049] “转染”意指使细胞与分子接触，其中分子被细胞内化。
[0050] “转染时”意指转染期间或转染后。
[0052] “基于试剂的转染”意指使用转染试剂转染。
[0053] “细胞培养基”意指可用于细胞培养的培养基，举非限制性实例，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或DMEM+10％胎牛血清(FBS)，无论所述培养基体外或体内使用。
[0054] “复合培养基”意指向其中添加转染试剂和待转染的分子的培养基，并且其中转染试剂与待转染的分子缔合。
[0055] “转染培养基”意指可用于转染的培养基，举非限制性实例，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F12、生理盐水或水，无论所述培养基体外或体内使用。
[0057] “脂质载体”意指可增加脂质或脂溶性分子在水溶液中的溶解度的物质，举非限制性实例，人血清白蛋白或甲基-β-环糊精。
[0058] “Oct4蛋白”意指由POU5F1基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或其融合构建体，举非限制性实例，人Oct4蛋白(SEQ ID NO:8)、小鼠Oct4蛋白、Oct1蛋白、由POU5F1假基因2编码的蛋白质、Oct4蛋白的DNA结合结构域或Oct4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:8具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。或在其它实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。
[0059] “Sox2蛋白”意指由SOX2基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，举非限制性实例，人Sox2蛋白(SEQ ID NO:9)、小鼠Sox2蛋白、Sox2蛋白的DNA结合结构域或Sox2-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含与SEQ ID NO:9具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:9具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。或在其它实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。
[0060] “Klf4蛋白”意指由KLF4基因编码的蛋白或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，举非限制性实例，人Klf4蛋白(SEQ ID NO:10)、小鼠Klf4蛋白、Klf4蛋白的DNA结合结构域或Klf4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:10具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。或在其它实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。
[0061] “c-Myc蛋白”意指由MYC基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，举非限制性实例，人c-Myc蛋白(SEQ ID NO:11)、小鼠c-Myc蛋白、l-Myc蛋白、c-Myc(T58A)蛋白、c-Myc蛋白的DNA结合结构域或c-Myc-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含与SEQ ID NO:11具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:11具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸。或在其它实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。
[0062] “重编程”意指引起细胞的表型变化，举非限制性实例，引起β-细胞祖细胞分化为成熟β-细胞，引起成纤维细胞去分化为多能干细胞，引起角化细胞转分化为心脏干细胞，引起细胞端粒变长或引起神经元的轴突生长。
[0063] “重编程因子”意指当细胞与分子接触和/或细胞表达分子时，可单独或与其它分子组合引起重编程的分子，举非限制性实例，Oct4蛋白。
[0064] “供给者”意指可用于调节培养基或以另外的方式支持培养的其它细胞的生长的细胞。
[0065] “调节”意指使一个或多个供给者与培养基接触。
[0066] “脂肪酸”意指包含具有至少两个碳原子的脂族链的分子，举非限制性实例，亚油酸、α-亚麻酸、辛酸、白三烯、前列腺素、胆固醇、糖皮质激素、消退素、保护素、血栓烷、脂氧素、玛尔桑(maresin)、鞘脂、色氨酸、N-乙酰基色氨酸或其盐、甲酯或衍生物。
[0067] “短链脂肪酸”意指包含具有介于2个与30个之间碳原子的脂族链的脂肪酸。
[0068] “白蛋白”意指在水中高度可溶的蛋白质，举非限制性实例，人血清白蛋白。
[0069] “缔合分子”意指与另一分子非共价结合的分子。
[0070] “白蛋白的缔合分子组分”意指与白蛋白多肽结合的一种或多种分子，举非限制性实例，与白蛋白多肽结合的脂质、激素、胆固醇、钙离子等。
[0071] “经处理的白蛋白”意指经处理以减少、去除、替换或以另外的方式灭活白蛋白的缔合分子组分的白蛋白，举非限制性实例，在升高的温度下孵育的人血清白蛋白、与辛酸钠接触的人血清白蛋白或与多孔材料接触的人血清白蛋白。
[0072] “离子交换树脂”意指当与含有离子的溶液接触时可用一个或多个不同的离子替换一个或多个所述离子的材料，举非限制性实例，可用一个或多个钠离子替换一个或多个钙离子的材料。
[0073] “生殖细胞”意指精细胞或卵细胞。
[0074] “多能干细胞”意指可体内分化成具有所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的细胞。
[0075] “体细胞”意指不是多能干细胞或生殖细胞的细胞，举非限制性实例，皮肤细胞。
[0076] “葡萄糖反应性胰岛素产生细胞”意指当暴露于某一浓度的葡萄糖时可产生和/或分泌不同于(小于或大于)当细胞暴露于不同浓度的葡萄糖时细胞产生和/或分泌的胰岛素的量的一定量的胰岛素的细胞，举非限制性实例，β-细胞。
[0077] “造血细胞”意指血细胞或可分化成血细胞的细胞，举非限制性实例，造血干细胞或白细胞。
[0078] “心脏细胞”意指心脏细胞或可分化成心脏细胞的细胞，举非限制性实例，心脏干细胞或心肌细胞。
[0079] “视网膜细胞”意指视网膜的细胞或可分化成视网膜的细胞的细胞，举非限制性实例，视网膜色素上皮细胞。
[0080] “皮肤细胞”意指常见于皮肤中的细胞，举非限制性实例，成纤维细胞、角化细胞、黑素细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或血细胞。
[0081] “Wnt信号传导激动剂”意指可执行蛋白的Wnt家族的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，举非限制性实例，Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。
[0082] “IL-6信号传导激动剂”意指可执行IL-6蛋白的一种或多种生物功能的分子，举非限制性实例，IL-6蛋白或IL-6受体(又称为可溶性IL-6受体、IL-6R、IL-6R α等)。
[0083] “TGF-β信号传导激动剂”意指可执行蛋白质的TGF-β超家族的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，举非限制性实例，TGF-β1、TGF-β3、活化素A、BMP-4或Nodal。
[0085] “单链断裂”意指单链或双链DNA的区域，其中连接核苷酸的一个或多个共价键已经在一个或两个链之一中断裂。
[0086] “双链断裂”意指双链DNA的区域，其中连接核苷酸的一个或多个共价键已经在两个链中的每一者中断裂。
[0088] “核苷”意指核苷酸或其片段或衍生物，举非限制性实例，核碱基、核苷、核苷酸-三磷酸等。
[0089] “基因编辑”意指改变细胞的DNA序列，举非限制性实例，通过用引起细胞的DNA中的突变的蛋白质转染细胞。
[0090] “基因编辑蛋白”意指可单独或与一种或多种其它分子组合改变细胞的DNA序列的蛋白质，举非限制性实例，核酸酶、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、大范围核酸酶、切口酶、成簇的规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)缔合蛋白或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体。
[0091] “修复模板”意指含有与在基因编辑蛋白的靶标位点的10kb内的序列具有至少约70％同源性的区域的核酸。
[0092] “重复序列”意指存在于蛋白质中的超过一个拷贝中以在至少约10％同源性内的氨基酸序列，举非限制性实例，转录活化因子样效应子的单体重复序列。
[0093] “DNA结合结构域”意指能够与DNA分子结合的分子区域，举非限制性实例，包含一个或多个锌指的蛋白结构域、包含一个或多个转录活化因子样(TAL)效应子重复序列的蛋白结构域或能够与DNA分子结合的小分子的结合口袋。
[0094] “结合位点”意指能够由基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体识别的核酸序列或对基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体具有高亲和力的核酸序列，举非限制性实例，在人BIRC5基因的外显子1中的约20个碱基对的DNA序列。
[0095] “靶标”意指含有结合位点的核酸。
[0096] 其它定义陈述于美国申请号13/465,490、美国临时申请号61/664,494、美国临时申请号61/721,302、国际申请号PCT/US12/67966、美国临时申请号61/785,404、美国临时申请号61/842,874、国际申请号PCT/US13/68118、美国临时申请号61/934,397、美国申请号14/296,220、美国临时申请号62/038,608以及美国临时申请号62/069,667中，所述申请的内容由此以引用的方式全文并入。
[0097] 糖化和糖基化是使一个或多个糖分子与蛋白质结合的过程。现在已经发现，改变糖化和糖基化位点的数目或位置可增加或降低蛋白质的稳定性。某些实施方案因此针对具有一个或多个糖化或糖基化位点的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质经工程改造以具有比蛋白质的天然变体多的糖化或糖基化位点。在另一实施方案中，蛋白质经工程改造以具有比蛋白质的天然变体少的糖化或糖基化位点。在另一实施方案中，蛋白质具有增加的稳定性。在另一实施方案中，蛋白质具有降低的稳定性。
[0098] 已经进一步发现在某些情况下，在转染培养基中包括一种或多种类固醇和/或一种或多种抗氧化剂可增加体内转染效率、体内重编程效率和体内基因编辑效率。某些实施方案因此针对使细胞或患者与糖皮质激素接触，所述糖皮质激素如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松或倍他米松。其它实施方案针对一种通过使细胞与含有类固醇的培养基接触并且使细胞与一种或多种核酸分子接触来诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述核酸分子包括合成RNA。在另一实施方案中，所述类固醇为氢化可的松。在另一实施方案中，氢化可的松以约0.1uM与约10uM之间或约1uM的浓度存在于培养基中。其它实施方案针对一种通过使细胞与含有抗氧化剂的培养基接触并且使细胞与一种或多种核酸分子接触来诱导细胞体内表达所关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸。在另一实施方案中，抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸以约0.5mg/L与约500mg/L之间(包括约50mg/L)的浓度存在于培养基中。其它实施方案针对一种通过使细胞与含有类固醇和/或抗氧化剂的培养基接触并且使细胞与一种或多种核酸分子接触来体内重编程和/或基因编辑细胞的方法，其中所述一种或多种核酸分子编码一种或多种重编程蛋白和/或基因编辑蛋白。在某些实施方案中，细胞存在于生物体中，并且类固醇和/或抗氧化剂被递送至生物体。
[0099] 已经报道了在某些情况下将转铁蛋白添加至复合培养基中来增加质粒转染的效率。现在已经发现，将转铁蛋白添加至复合培养基中还可增加用合成RNA分子体内转染的效率。因此，某些实施方案针对一种通过将一种或多种合成RNA分子和转染试剂添加至含有转铁蛋白的溶液中来诱导细胞体内表达所关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，转铁蛋白以约1mg/L与约100mg/L之间(如约5mg/L)的浓度存在于溶液中。在另一实施方案中，所述转铁蛋白为重组的。
[0100] 细胞、组织、器官以及生物体(包括但不限于人)具有数种可抑制或防止核酸的递送的特征，包括例如角质层，其可充当外来生物体和核酸的屏障。这些特征可因此抑制包含核酸的治疗剂和美容剂的效果。现在已经发现这些特征中的多种可使用包含柔性膜和多根针的贴片来回避或克服，并且所述贴片可充当用于核酸的递送的有效并且安全物品。某些实施方案因此针对核酸递送贴片。在一个实施方案中，所述核酸递送贴片包括柔性膜。在另一实施方案中，所述核酸递送贴片包括多根针。在另一实施方案中，所述多根针附接至所述柔性膜。在一些实施方案中，所述贴片包括核酸。在一个实施方案中，所述核酸存在于溶液中。在一个实施方案中，所述多根针包括一根或多根具有管腔的针。在另一实施方案中，所述贴片进一步包含第二柔性膜。在另一实施方案中，所述柔性膜和所述第二柔性膜经布置以形成空腔。在另一实施方案中，所述空腔含有核酸。在另一实施方案中，所述膜包含一个或多个孔，核酸可通过所述孔。在另一实施方案中，一个或多个孔和一根或多根具有管腔的针经布置以允许含有核酸的溶液通过所述一个或多个孔中的至少一个并且通过所述一根或多根具有管腔的针中的至少一根。在一些实施方案中，所述贴片经配置以递送溶液至皮肤。在一个实施方案中，所述溶液包含核酸。在另一实施方案中，所述溶液包含媒介物。在另一实施方案中，所述媒介物为脂质或利匹哆异德(lipidoid)。在另一实施方案中，所述媒介物为基于脂质的转染试剂。
[0101] 细胞膜可充当外来核酸的屏障。现在已经发现组合本发明的贴片与电场可增加核酸递送的效率。因此，某些实施方案针对一种包括多根针的核酸递送贴片，其中至少两根针形成高压电路的一部分。在一个实施方案中，所述高压电路产生大于约10V的电压。在另一实施方案中，所述高压电路产生大于约20V的电压。在另一实施方案中，在所述针中的两根之间产生电场。在另一实施方案中，所述电场的量值为至少约100V/cm。在另一实施方案中，所述电场的量值为至少约200V/cm。在一些实施方案中，所述贴片经配置以递送核酸至表皮。在其它实施方案中，所述贴片经配置以递送核酸至真皮。在其它实施方案中，所述贴片经配置以递送核酸至皮下组织。在其它实施方案中，所述贴片经配置以递送核酸至肌肉。某些实施方案针对一种包含多个电极的核酸递送贴片。在一个实施方案中，所述多个电极附接至柔性膜。其它实施方案针对一种包含刚性结构的核酸递送贴片。在一个实施方案中，多个电极附接至所述刚性结构。
[0102] 其它实施方案针对一种用于体内将核酸递送至细胞的方法，所述方法包括体内向含有细胞的组织施用核酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在所述细胞附近施加瞬态电场。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞体内内化所述核酸。在另一实施方案中，所述核酸包括合成RNA。在另一实施方案中，所述方法进一步引起所述细胞内化治疗或美容有效量的所述核酸。在一个实施方案中，所述细胞为皮肤细胞。在另一实施方案中，所述细胞为肌细胞。在另一实施方案中，所述细胞为皮肤成纤维细胞。在另一实施方案中，所述细胞为角化细胞。在另一实施方案中，所述细胞为成肌细胞。在一些实施方案中，所述核酸包含所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述所关注的蛋白质为荧光蛋白。在另一实施方案中，所述所关注的蛋白质为细胞外基质蛋白。在另一实施方案中，所述所关注的蛋白质为以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、赖氨酰基氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、肌原纤维蛋白、微纤维缔合糖蛋白、赖氨酰基氧化酶样蛋白、血小板源性生长因子、脂肪酶、解偶联蛋白、产热素以及参与色素产生的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将核酸递送至表皮。在其它实施方案中，所述方法进一步包括将核酸递送至真皮。在其它实施方案中，所述方法进一步包括在真皮下方递送所述核酸。在一个实施方案中，所述递送是通过注射进行。在另一实施方案中，所述递送是通过使用微针阵列注射进行。在另一实施方案中，所述递送是通过局部施用进行。在另一实施方案中，所述递送包括组织的一部分的破坏或去除。在另一实施方案中，所述递送包括角质层的破坏或去除。在一些实施方案中，所述核酸存在于溶液中。在一个实施方案中，所述溶液包含生长因子。在另一实施方案中，所述生长因子为以下组的成员：成纤维细胞生长因子和转化生长因子。在另一实施方案中，所述生长因子为以下组的成员：碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。在其它实施方案中，所述溶液包含胆固醇。
[0103] 在另一实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与一种或多种核酸分子接触。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞表达治疗或美容有效量的所述所关注的蛋白质。
[0104] 在另一实施方案中，使所述细胞与核酸分子接触。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞内化所述核酸分子。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞内化治疗或美容有效量的所述核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸编码所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述核酸分子包括以下组的成员：dsDNA分子、ssDNA分子、dsRNA分子、ssRNA分子、质粒、寡核苷酸、合成RNA分子、miRNA分子、mRNA分子以及siRNA分子。
[0105] 仅包含典型核苷酸的合成RNA可与模式识别受体结合，可被识别为病原体相关分子模式，并且可在细胞中触发有效的免疫反应，所述免疫反应可引起翻译块、炎性细胞因子分泌以及细胞死亡。现在已经发现包含某些非典型核苷酸的合成RNA可规避天然免疫系统的检测，并且可以高效率翻译成蛋白质。已经进一步发现包含以下组的至少一个成员的合成RNA可规避天然免疫系统的检测：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷，并且可以高效率翻译成蛋白质。因此，某些实施方案针对一种用于诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使细胞与合成RNA接触。其它实施方案针对一种用合成RNA转染细胞的方法，所述方法包括使细胞与包含一种或多种合成RNA分子的溶液接触。其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向所述患者施用合成RNA。在一个实施方案中，所述合成RNA包含以下组的至少一个成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。在另一实施方案中，所述合成RNA编码所关注的蛋白质。示例性RNA可含有如本文中别处所述的非典型和非典型核苷酸的组合和水平，包括相对于本文所述的任何所关注的蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法引起所关注的蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者的皮肤中所述所关注的蛋白质的表达。
[0106] 现在已经进一步发现使细胞与类固醇接触可抑制对外来核酸的天然免疫反应，并且可增加核酸递送和翻译的效率。因此，某些实施方案针对使细胞与类固醇接触。其它实施方案针对向患者施用类固醇。在一个实施方案中，所述类固醇为氢化可的松。在另一实施方案中，所述类固醇为地塞米松。其它实施方案针对向患者施用以下组的成员：抗生素、抗霉菌剂以及RNA酶抑制剂。
[0107] 其它实施方案针对一种用于体内将核酸至递送细胞的方法。其它实施方案针对一种用于体内诱导细胞表达所关注的蛋白质的方法。其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括破坏角质层。在另一实施方案中，所述方法包括使细胞与核酸接触。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞内化所述核酸。在另一实施方案中，所述方法引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者中所述所关注的蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者的症状中的一种或多种的改善。在另一实施方案中，所述患者需要所述所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述患者缺乏所述所关注的蛋白质。
[0108] 其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白。在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种核酸分子。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起所述患者的皮肤中所述蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者中治疗或美容有效量的所述所关注的蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法包括施用类固醇。在另一实施方案中，所述类固醇为以下组的成员：氢化可的松和地塞米松。
[0109] 某些实施方案针对合成RNA分子。在一个实施方案中，所述合成RNA分子编码所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述合成RNA分子包含以下组的成员：5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷。其它实施方案针对一种美容组合物。在一个实施方案中，所述美容组合物包含白蛋白。在另一实施方案中，所述白蛋白用离子交换树脂或木炭处理。在另一实施方案中，所述美容组合物包含核酸分子。在另一实施方案中，所述美容组合物包含白蛋白和核酸分子。其它实施方案针对一种包含美容组合物的美容治疗物品，所述组合物容纳于经配置以将所述组合物递送至患者的装置中。其它实施方案针对一种经配置以将美容组合物递送至患者的装置。在一个实施方案中，所述核酸分子编码以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、酪氨酸酶、黑皮质素1受体以及透明质酸合酶。
[0110] 某些蛋白具有长半衰期，并且可存留于组织中达数小时、数天、数周、数月或数年。现在已经发现某些治疗患者的方法可引起一种或多种蛋白质的积聚，包括例如一种或多种有益的蛋白质。因此，某些实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送一系列剂量的编码一种或多种蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包括合成RNA。在另一实施方案中，第一剂量在第一时间点给予。在另一实施方案中，第二剂量在第二时间点给予。在另一实施方案中，在所述第二时间点在所述患者中的所述一种或多种蛋白质中的至少一种的量大于在所述第一时间点所述蛋白质的量。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者中所述蛋白质的积聚。
[0111] 其它实施方案针对一种包含编码一种或多种蛋白质的核酸分子的治疗组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种为细胞外基质蛋白。其它实施方案针对一种包含编码一种或多种蛋白质的核酸分子的美容组合物，其中所述一种或多种蛋白种中的至少一种为细胞外基质蛋白。
[0112] 色素沉着病症可在患者中引起严重症状。现在已经发现色素沉着病症可通过向患者递送编码酪氨酸酶的核酸来治疗。因此，某些实施方案针对一种用于治疗色素沉着病症的方法。其它实施方案针对一种用于改变患者的色素沉着的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。其它实施方案针对一种包含编码酪氨酸酶的核酸的美容组合物。其它实施方案针对一种包含编码酪氨酸酶的核酸的治疗组合物。其它实施方案针对一种用于增加患者的皮肤的紫外线吸收的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者的皮肤的紫外线吸收的增加。其它实施方案针对一种用于减少个体的皮肤在暴露于紫外光时的光损伤的方法。在一个实施方案中，所述方法引起所述个体的皮肤在暴露于紫外光时的光损伤的减少。其它实施方案针对一种用于治疗着色性干皮病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。其它实施方案针对一种用于治疗大疱性表皮松解症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码VII型胶原蛋白的核酸。在另一实施方案中，所述方法包括向患者递送编码黑皮质素1受体的核酸。其它实施方案针对一种用于治疗干燥病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的核酸。在另一实施方案中，所述患者经诊断患有异位性皮炎。在另一实施方案中，所述患者经诊断患有鱼鳞病。某些实施方案针对一种用于治疗美容病况的方法。其它实施方案针对一种用于诱导组织愈合的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的核酸。在另一实施方案中，所述美容病况为以下组的成员：皱纹、松弛皮肤、薄皮肤、脱色以及干性皮肤。在另一实施方案中，所述患者已进行白内障手术。在一些实施方案中，所述核酸为合成RNA。在其它实施方案中，所述方法引起所述患者的症状中的一种或多种的改善。其它实施方案针对一种通过向细胞或患者递送编码蛋白质或肽的核酸来治疗适应症的方法。其它实施方案针对一种包含编码蛋白质或肽的核酸的组合物。可使用本发明的方法和组合物治疗的适应症和可由本发明的组合物编码的蛋白质和肽陈述于表1中，并且举例而非通过限制给出。在一个实施方案中，所述适应症选自表1。在另一实施方案中，所述蛋白质或肽选自表1。在另一实施方案中，所述适应症和所述蛋白质或肽选自表1的同一行。在另一实施方案中，所述所关注的蛋白质为以下组的成员：UCP1、UCP2和UCP3。其它实施方案针对用于诱导细胞表达多种所关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述所关注的蛋白质包括以下组的至少两个成员：脂肪酶、UCP1、UCP2和UCP3。在另一实施方案中，所述所关注的蛋白质包括脂肪酶和以下组的成员：UCP1、UCP2和UCP3。在另一实施方案中，所述蛋白质为基因编辑蛋白。在另一实施方案中，所述基因编辑蛋白靶向至少部分地是疾病表型的原因的基因。在另一实施方案中，所述基因编辑蛋白靶向编码选自表1的蛋白质的基因。在另一实施方案中，所述基因编辑蛋白单独或与一种或多种其它分子或基因编辑蛋白组合校正或消除至少部分地是疾病表型的原因的突变。
[0113] 表1.说明性适应症
[0114]
[0115]
[0116] 本发明的额外说明性靶标包括国际专利公布号WO 2013/151671的表6中列出的美容靶标，所述公布的内容由此以引用的方式全文并入。
[0117] 此外，本发明组合物和方法可用于改变生物和/或生理过程以例如减少皮肤松弛，增加皮肤厚度，增加皮肤体积，减少皱纹数目、皱纹长度和/或皱纹深度，增加皮肤紧致性、坚实性、色调和/或弹性，增加皮肤水合作用和保持水分、水流和渗透平衡的能力，增加皮肤脂质的含量；增加细胞外基质和/或粘附和通信多肽；增加皮肤能量产生；利用和保存；改进氧气利用；提高皮肤细胞寿命；改进皮肤细胞免疫防御、热冲击应力反应、抗氧化剂防御能力以中和自由基、和/或毒性防御；改进紫外线的防护和恢复；改进皮肤细胞通信和皮肤细胞神经支配；改进细胞内聚/粘附；改进钙矿物质和其它矿物质代谢；改进细胞更新；和改进细胞昼夜节律。
[0118] 此外，在一些实施方案中，本发明组合物可用于治疗疾病、病症和/或病况和/或可改变、修改或变化患有疾病、病症和/或病况的受试者的外皮系统的成员的外观，所述疾病、病症和/或病况如但不限于寻常痤疮、夏令痤疮、聚合性痤疮、美容痤疮、爆发性痤疮、项部疤痕疙瘩性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、光化性角化病、寻常痤疮、夏令痤疮、聚合性痤疮、美容痤疮、爆发性痤疮、项部疤痕疙瘩性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、急性荨麻疹、过敏性接触性皮炎、斑秃、血管性水肿、脚癣、异位性皮炎、自体湿疹化、婴儿痤疮、渐秃、芽生菌病、黑头粉刺、胎记和其它皮肤色素沉着问题、疖子、挫伤、臭虫叮咬、灼伤、蜂窝组织炎、恙螨、氯痤疮、胆碱能性或压力荨麻疹、慢性荨麻疹、寒冷性荨麻疹、融合性网状乳头状瘤病、鸡眼、囊肿、头皮屑、疱疹样皮炎、皮肤划痕症、出汗障碍性湿疹、尿布疹、干性皮肤、出汗障碍、外胚层发育不良(如少汗性外胚层发育不良和X联锁少汗性外胚层发育不良)、湿疹、疣状表皮发育不良、结节性红斑、剥脱性痤疮、运动诱发的过敏症毛囊炎、过量皮肤油、毛囊炎、雀斑、冻疮、真菌指甲、毛发密度、毛发生长速率、卤素痤疮、脱发、痱子、血肿、单纯疱疹感染(例如非生殖器)、化脓性汗腺炎、麻疹、多汗症、色素沉着过多、少汗性外胚层发育不良、色素沉着不足、脓疱病、毛发内生、热型荨麻疹、嵌甲、婴儿痤疮或新生儿痤疮、发痒、刺激性接触性皮炎、股癣、疤痕瘤、毛发角化病、扁平苔癣、硬化性苔癣、面部播散性粟粒性狼疮、黑斑病、黑痣、传染性软疣、指甲生长速率、指甲健康状况、神经性皮炎、钱币状湿疹、职业性痤疮、油性痤疮、甲癣、物理性荨麻疹、潜毛性囊肿、玫瑰糠疹、变色性皮癣、毒葛、香膏剂痤疮、须部假性毛囊炎或项部疤痕疙瘩性痤疮、牛皮癣、牛皮癣关节炎、压力或延迟压力荨麻疹、刺伤(如割伤与擦伤)、皮疹、罕见或水性荨麻疹、鼻成形术、轮癣、酒糟鼻、罗-汤二氏综合征(rothmund-thomson syndrome)、皮肤松弛、疥疮、疤痕、皮脂溢、皮脂溢性皮炎、带状疱疹、皮肤癌、皮垂、太阳型荨麻疹、蜘蛛咬伤、妊娠纹、晒斑、焦油痤疮、热带痤疮、皮肤变薄、鹅口疮、花斑癣、短暂性棘层松解皮肤病、混合型脱发(tycoon'scap)或粟粒坏死性痤疮、不均匀肤色、静脉曲张、静脉性湿疹、振动性血管性水肿、白癫风、疣、韦-克二氏病(Weber-Christian disease)、皱纹、x联锁少汗性外胚层发育不良、干燥性湿疹、酵母菌感染以及老化的一般征兆。
[0119] 在一些实施方案中，提供用本发明组合物治疗干性皮肤的方法。在一些实施方案中，丝聚合蛋白原(转化为丝聚合蛋白的蛋白质)为所关注的蛋白质(例如，当治疗寻常性鱼鳞病时)。
[0120] 在一些实施方案中，提供治疗多种类型的牛皮癣(例如瘟疫牛皮癣、滴状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、皮褶牛皮癣以及红皮性牛皮癣)中的任一种的方法。在各个实施方案中，所述所关注的蛋白质为牛皮癣易感性基因1至9(PSORS1-PSORS9)的产物中的任一种。
[0121] 各个实施方案涉及湿疹(例如异位性皮炎、钱币状湿疹、出汗障碍性湿疹、皮脂溢性皮炎、刺激性接触性皮炎、过敏性接触性皮炎、出汗障碍、静脉性湿疹、疱疹样皮炎、神经性皮炎、自体湿疹化以及干燥性湿疹)的治疗并且任选地，可靶向以下一种或多种：丝聚合蛋白；已经与湿疹相关的三种遗传变体，ovo样1(OVOL1)、肌动蛋白样9(ACTL9)以及驱动蛋白家族成员3A(KIF3A)；以及基因脑源性神经营养因子(BDNF)和速激肽前体1(TAC1)。
[0122] 麻疹或荨麻疹(包括但不限于急性荨麻疹、慢性荨麻疹以及血管性水肿、物理性荨麻疹、压力或延迟压力荨麻疹、胆碱能性或压力荨麻疹、寒冷性荨麻疹、热型荨麻疹、太阳型荨麻疹、罕见或水性荨麻疹、振动性血管性水肿、运动诱发的过敏症以及皮肤划痕症)可用本发明组合物通过例如靶向PLCG-2来治疗。
[0123] 各个实施方案涉及红斑痤疮的治疗，所述红斑痤疮包括但不限于红斑血管扩张红斑痤疮、丘疹脓疱性红斑痤疮、增生肉芽肿红斑痤疮以及眼红斑痤疮。任选地，组织蛋白酶抑制素抗微生物肽(CAMP)和/或激肽释放酶相关肽酶5(还称作角质层胰蛋白酶(SCTE))为所关注的蛋白质。
[0124] 在一些实施方案中，提供用本发明组合物治疗痤疮的方法。例如，痤疮可包括但不限于痤疮状发疹、夏令痤疮、聚合性痤疮、美容痤疮、爆发性痤疮、项部疤痕疙瘩性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、婴儿痤疮、黑头粉刺、氯痤疮、剥脱性痤疮、卤素痤疮、婴儿痤疮或新生儿痤疮、面部播散性粟粒性狼疮、职业性痤疮、油性痤疮、香膏剂痤疮、焦油痤疮、热带痤疮、混合型脱发或粟粒坏死性痤疮、须部假性毛囊炎或疤痕疙瘩性痤疮以及化脓性汗腺炎。在这些实施方案中，所述所关注的蛋白质可为一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)，例如基质金属蛋白酶-1(MMP-1或间质胶原酶)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。
[0125] 在其它实施方案中，白癫风用本发明组合物治疗，例如其中靶向NLR家族含pyrin结构域1基因(NALP1)基因。
[0126] 在一些实施方案中，本发明组合物可用于少汗性外胚层发育不良(HED)的治疗，例如经由外异蛋白A基因(EDA)、受体(EDAR)以及受体相关死亡结构域(EDARADD)。
[0127] 在一些实施方案中，本发明组合物可用于渐秃或头发稀疏(例如男性型秃发或雄激素性秃发(AGA))的治疗并且任选地，以下一种或多种可为所关注的蛋白质：雄激素受体(AR)、外异蛋白A2受体(EDA2R)以及溶血磷脂酸受体6(P2RY5)。
[0128] 本发明组合物也可用于治疗疤痕和妊娠纹(条痕)的方法，例如经由胶原蛋白、核糖体s6激酶、分泌磷蛋白1(还称作骨桥蛋白)或转化生长因子β3。
[0129] 疣状表皮发育不良(还称作Lutz-Lewandowsky表皮发育不良)是一种罕见的常染色体隐性基因遗传皮肤病症，也可用本发明组合物治疗，例如通过靶向跨膜通道样6(EVER1)或跨膜通道样8(EVER2)基因。
[0130] 在一些实施方案中，皮肤松弛、变薄或起皱纹可用本发明组合物治疗，例如通过靶向一种或多种所关注的蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、成纤维细胞生长因子7、TIMP金属肽酶抑制剂、基质金属肽酶、超氧化物歧化酶以及其它细胞外基质蛋白和蛋白聚糖。
[0131] 其它实施方案用于皮肤变褐色，如经由促黑素细胞激素和/或阿黑皮素原。
[0132] 在一些实施方案中，本发明组合物可用于伤口治疗。在一些实施方案中，用本发明组合物治疗伤口的方法包括例如清洁创面以促进伤口愈合和闭合的额外步骤，包括但不限于：清创术、尖锐清创术(从伤口手术去除坏死或感染组织)，任选地包括化学清创剂(如酶)以去除坏死组织；伤口敷料以向伤口提供潮湿、温暖环境并且促进组织修复和愈合(例如，包含水凝胶(例如 )、水胶体(例如
)、泡沫(例如 )以及海藻酸盐(例如
)的伤口敷料；施用生长因子以刺激细胞分裂和增殖并且促进伤口愈合，例
如贝卡普勒明；以及(iv)软组织伤口覆盖，皮肤移植物可为必需的以获得清洁、非愈合伤口的覆盖(例如自体皮肤移植物、尸体皮肤移植物、生物工程改造的皮肤替代物(例如，))。
)、泡沫(例如 )以及海藻酸盐(例如
)的伤口敷料；施用生长因子以刺激细胞分裂和增殖并且促进伤口愈合，例
如贝卡普勒明；以及(iv)软组织伤口覆盖，皮肤移植物可为必需的以获得清洁、非愈合伤口的覆盖(例如自体皮肤移植物、尸体皮肤移植物、生物工程改造的皮肤替代物(例如，))。
[0133] 在各个实施方案中，多种癌症用本发明组合物治疗(例如，结肠直肠癌、胆囊癌、肺癌、胰腺癌以及胃癌)。在一些实施方案中，皮肤癌用本发明组合物治疗。例如，基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)以及黑素瘤。在一些实施方案中，本发明组合物辅佐完整周向周边和深缘评估、Mohs手术、辐射(例如外部光束放射疗法或近距放射疗法)、化学疗法(包括但不限于局部化学疗法，例如用咪喹莫特或5-氟尿嘧啶)以及冷冻疗法使用。本发明组合物也可用于治疗癌症的多种分期，所述癌症包括皮肤癌(例如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)以及黑素瘤)，如美国癌症联合委员会(AJCC)TNM系统(例如TX、T0、Tis、T1、T1a、T1b、T2、T2A、T2B、T3、T3a、T3b、T4、T4a、T4b、NX、N0、N1、N2、N3、M0、M1a、M1b、M1c中的一种或多种)和/或分期系统(例如0期、IA期、IB期、IIA期、IIB期、IIC期、IIIA期、IIIB期、IIIC期、IV期)的分期。
[0134] 在各个实施方案中，一种或多种罕见疾病用本发明组合物治疗，包括例如红细胞生成性原卟啉病、家族性良性天疱疮、大疱性表皮松解症(EB)、着色性干皮病、埃-当二氏综合征、皮肤松弛症、蛋白C和蛋白S缺乏、奥尔波特综合征、纹状掌跖角化病、致命性棘层松解性大疱性表皮松解症、弹性假黄瘤(PXE)、寻常性鱼鳞病、寻常性天疱疮以及基底细胞痣综合征。
[0135] 在某些情况下，可需要用非动物源性和/或重组组分替换动物源性组分，部分是因为非动物源性和/或重组组分可以高于动物源性组分的一致性程度产生，并且部分是因为非动物源性和/或重组组分携带低于动物源性组分的受到毒性物质和/或致病物质污染的风险。因此，某些实施方案针对非动物源性和/或重组蛋白。其它实施方案针对一种培养基，其中所述培养基的一些或所有组分为非动物源性和/或重组的。
[0136] 其它实施方案针对一种用于体内转染细胞的方法。在一个实施方案中，用一种或多种核酸转染体内细胞，并且使用转染试剂(如基于脂质的转染试剂)执行转染。在一个实施方案中，所述一种或多种核酸包括至少一种RNA分子。在另一实施方案中，用一种或多种核酸转染细胞，并且所述一种或多种核酸编码以下至少一者：p53、TERT、细胞因子、分泌蛋白、膜结合蛋白、酶、基因编辑蛋白、染色质修饰蛋白、DNA结合蛋白、转录因子、组蛋白脱乙酰酶、病原体相关分子模式以及肿瘤相关抗原或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员。在另一实施方案中，重复地转染细胞，如在连续约10天期间至少约2次，或在连续约7天期间至少约3次，或在连续约6天期间至少约4次。
[0137] 重编程可通过用一种或多种编码一种或多种重编程因子的核酸转染细胞来执行。重编程因子的实例包括但不限于：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、l-Myc蛋白、TERT蛋白、Nanog蛋白、Lin28蛋白、Utf1蛋白、Aicda蛋白、miR200微小RNA、miR302微小RNA、miR367微小RNA、miR369微小RNA以及其生物活性片段、类似物、变体和家族成员。因此，某些实施方案针对一种用于体内重编程细胞的方法。在一个实施方案中，体内细胞是通过用一种或多种编码一种或多种重编程因子的核酸转染细胞来重编程。在一个实施方案中，所述一种或多种核酸包括编码Oct4蛋白的RNA分子。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸还包括一种或多种编码Sox2蛋白、Klf4蛋白和c-Myc蛋白的RNA分子。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸还包括编码Lin28蛋白的RNA分子。在一个实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且人皮肤细胞被重编程为多能干细胞。在另一实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且人皮肤细胞被重编程为葡萄糖反应性胰岛素产生细胞。可重编程的其它细胞和细胞可重编程生成的其它细胞的实例包括但不限于：皮肤细胞、多能干细胞、间充质干细胞、β-细胞、视网膜色素上皮细胞、造血细胞、心脏细胞、气道上皮细胞、神经干细胞、神经元、神经胶质细胞、骨细胞、血细胞以及牙髓干细胞。在一个实施方案中，细胞与支持重编程的细胞的培养基接触。在一个实施方案中，所述培养基也支持所述细胞。
[0138] 重要地，已经报道了用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒感染皮肤细胞、与在支持心肌细胞生长的培养基中培养细胞组合可引起皮肤细胞重编程为心肌细胞，而没有首先将皮肤细胞重编程为多能干细胞(参见Efs等人Nat Cell Biol.2011；13:215-22，所述参考文献的内容由此以引用的方式并入)。在某些情况下，直接重编程(重编程一种体细胞为另一种体细胞而没有首先重编程所述体细胞为多能干细胞，又称为“转分化”)可为需要的，部分是因为培养多能干细胞可为耗时并且昂贵的，在建立和表征稳定的多能干细胞系中所涉及的额外处理可携带增加的污染风险，并且与首先产生多能干细胞相关的培养中的额外时间可携带增加的基因组不稳定性和获得突变的风险，包括点突变、拷贝数变化以及核型异常。因此，某些实施方案针对一种用于体内重编辑体细胞的方法，其中细胞重编程为体细胞，并且其中不产生表征的多能干细胞系。
[0139] 已经进一步发现在某些情况下，根据本发明方法重编程细胞可比根据其它方法需要较少的总转染。因此，某些实施方案针对一种用于体内重编程细胞的方法，其中在连续约20天期间执行介于约1次与约12次之间的转染，或在连续约15天期间执行介于约4次与约10次之间的转染，或在连续约10天期间执行介于约4次与约8次之间的转染。认识到当细胞与含有核酸分子的培养基接触时，细胞可能同时或在不同时间接触和/或内化超过一个核酸分子。细胞可因此与核酸接触超过一次，例如重复地，甚至当细胞仅与含有核酸的培养基接触一次时。
[0140] 值得注意的是，核酸可含有一个或多个非典型或“经修饰的”残基(例如除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及胞嘧啶以外的残基或其标准核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸衍生物)。特别值得注意的是，假尿苷-5'-三磷酸可在体外转录反应中取代尿苷-5'-三磷酸以产生合成RNA，其中所述合成RNA的多达100％的尿苷残基可用假尿苷残基置换。体外转录可产生具有残留免疫原性的RNA，甚至当假尿苷和5-甲基胞苷分别完全取代尿苷和胞苷时(参见例如Angel.Reprogramming Human Somatic Cells to Pluripotency Using RNA[Doctoral Thesis].Cambridge,MA:MIT；2011，其内容由此以引用的方式并入)。
出于这个原因，当用RNA转染细胞时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中是常见的。在某些情况下，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可能不是合意的，部分是因为最常见用于这个目的的重组免疫抑制剂B18R可为昂贵的并且难以制造。现在已经发现，体内细胞可根据本发明方法转染和/或重编程而不使用B18R或任何其它免疫抑制剂。已经进一步发现根据本发明方法重编程体内细胞而不使用免疫抑制剂可为快速、有效并且可靠的。因此，某些实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。其它实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。在某些情况下，例如当使用高细胞密度时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可为有益的。因此，某些实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。其它实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。在一个实施方案中，免疫抑制剂为B18R或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员或地塞米松或其衍生物。在一个实施方案中，转染培养基不含有免疫抑制剂，并且选择核酸剂量以防止过量毒性。在另一实施方案中，核酸剂量小于约1mg/cm2组织或小于约1mg/100,000个细胞或小于约10mg/kg。
出于这个原因，当用RNA转染细胞时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中是常见的。在某些情况下，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可能不是合意的，部分是因为最常见用于这个目的的重组免疫抑制剂B18R可为昂贵的并且难以制造。现在已经发现，体内细胞可根据本发明方法转染和/或重编程而不使用B18R或任何其它免疫抑制剂。已经进一步发现根据本发明方法重编程体内细胞而不使用免疫抑制剂可为快速、有效并且可靠的。因此，某些实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。其它实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。在某些情况下，例如当使用高细胞密度时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可为有益的。因此，某些实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。其它实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。在一个实施方案中，免疫抑制剂为B18R或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员或地塞米松或其衍生物。在一个实施方案中，转染培养基不含有免疫抑制剂，并且选择核酸剂量以防止过量毒性。在另一实施方案中，核酸剂量小于约1mg/cm2组织或小于约1mg/100,000个细胞或小于约10mg/kg。
[0141] 根据本发明的某些实施方案产生的重编程的细胞适合用于治疗和/或美容应用，因为其不含有外源DNA序列，并且其不暴露于动物源性或人源性产品，所述产品可为不明确的，并且所述产品可含有毒性污染物和/或致病污染物。此外，本发明的某些实施方案的高速度、效率和可靠性可减少获得和积聚突变和其它染色体异常的风险。本发明的某些实施方案可因此用于产生具有适合在治疗和/或美容应用中使用的安全性特征的细胞。例如，使用本发明的RNA和培养基重编程细胞(其中培养基不含有动物源性或人源性组分)可产生尚未曝露于异源材料的细胞。因此，某些实施方案针对一种具有所需安全性特征的重编程的细胞。在一个实施方案中，所述重编程的细胞具有正常核型。在另一实施方案中，相对于患者基因组，重编程的细胞具有小于约5个拷贝数变化(CNV)，如相对于患者基因组小于约3个拷贝数变化，或相对于患者基因组没有拷贝数变化。在另一实施方案中，相对于患者基因组，重编程的细胞在编码区中具有正常核型和小于约100个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区中具有小于约50个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区中具有小于约10个单核苷酸变体。
[0142] 内毒素和核酸酶可共同纯化和/或变得与其它蛋白(如血清白蛋白)缔合。具体来说，重组蛋白可经常具有高水平的缔合内毒素和核酸酶，部分地由于在其产生期间可发生的细胞溶解。内毒素和核酸酶可通过本发明的许多方法减少、去除、置换或以其它方式失活，所述方法包括例如通过乙酰化；通过添加如辛酸钠的稳定剂，接着热处理；通过将核酸酶抑制剂添加至白蛋白溶液和/或培养基中；通过结晶；通过与一种或多种离子交换树脂接触；通过与木炭接触；通过制备型电泳；或通过亲和色谱法。现在已经发现，从培养基和/或从培养基的一种或多种组分中部分地或完全地减少、去除、置换内毒素和/或核酸酶或以其它方式使内毒素和/或核酸酶失活可增加可转染和重编程细胞的效率。因此，某些实施方案针对一种用一种或多种核酸转染体内细胞的方法，其中转染培养基经处理以部分地或完全地减少、去除、置换一种或多种内毒素和/或核酸酶或以其它方式使一种或多种内毒素和/或核酸酶失活。其它实施方案针对一种引起核酸的最小程度降解的培养基。在一个实施方案中，培养基含有小于约1EU/mL、或小于约0.1EU/mL或小于约0.01EU/mL。
[0143] 在某些情况下，基于蛋白质的脂质载体(如血清白蛋白)可用基于非蛋白质的脂质载体(如甲基-β-环糊精)置换。本发明的培养基还可在没有脂质载体的情况下使用，例如当使用可不需要或可不受益于脂质载体的存在的方法，例如使用一种或多种基于脂质的转染试剂、基于聚合物的转染试剂或基于肽的转染试剂或使用电穿孔执行转染时。许多蛋白质缔合分子(如金属)可对体内细胞具高度毒性。这种毒性可引起降低的存活力以及获得突变。因此，某些实施方案具有产生不含毒性分子的细胞的额外益处。
[0144] 蛋白质的缔合分子组分可通过将蛋白质悬浮于溶液中并且测量溶液的电导率来测量。因此，某些实施方案针对一种含有蛋白质的培养基，其中所述蛋白于质水中的约10％溶液具有小于约500μmho/cm的电导率。在一个实施方案中，所述溶液具有小于约50μmho/cm的电导率。在另一实施方案中，所述蛋白质的干重的小于约0.65％包含脂质和/或所述蛋白的干重的小于约0.35％包含游离脂肪酸。
[0145] 可增加递送至体内细胞的核酸的量以增加核酸的所需效果。然而，增加递送至体内细胞的核酸的量超过某一点可引起细胞的存活力降低，部分地由于转染试剂的毒性。现在已经发现，当将核酸递送至固定体积中的体内细胞群(例如，组织区域中的细胞)时，递送至各细胞的核酸的量可取决于递送至细胞群的核酸的总量和细胞的密度，其中较高细胞密度引起递送至各细胞的核酸较少。在某些实施方案中，体内细胞用一种或多种核酸转染超过一次。在某些条件下，例如当细胞正在增殖时，细胞密度可从一次转染至下一次转染之间变化。因此，某些实施方案针对一种用核酸转染体内细胞的方法，其中细胞转染超过一次，并且其中对于两次转染来说递送至细胞的核酸的量不同。在一个实施方案中，细胞在两次转染之间增殖，并且对于两次转染，第二次递送至细胞的核酸的量大于第一次。在另一实施方案中，细胞转染超过两次，并且对于三次转染，第二次递送至细胞的核酸的量大于对于相同的三次转染中的第一次，并且对于相同的三次转染，第三次递送至细胞的核酸的量大于对于相同的三次转染中的第二次。在另一实施方案中，细胞转染超过一次，并且对于至少两次连续的转染来说，在每次转染期间递送至细胞的核酸的最大量足够低以产生至少约80％存活力。
[0146] 现在已经发现，调节一系列转染中递送至体内增殖细胞群的核酸的量可引起增加的核酸效果和增加的细胞存活力。已经进一步发现在某些情况下，当在一系列转染中使体内细胞与一种或多种编码一种或多种重编程因子的核酸接触时，对于所述系列的转染的至少部分来说，当在后面的转染中递送的核酸的量大于在前面的转染中递送的核酸的量时，重编程的效率可增加。因此，某些实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中在一系列转染中将一种或多种核酸重复地递送至细胞，并且对于至少一次后面的转染，递送至细胞的核酸的量大于对于至少一次前面的转染。在一个实施方案中，细胞被转染介于约2次与约10次之间，或介于约3次与约8次之间，或介于约4次与约6次之间。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸包括至少一种RNA分子，细胞被转染介于约2次与约10次之间，并且在每次转染中递送至细胞的核酸的量与先前最近转染中递送至细胞的核酸的量相同或比其2
更大。在另一实施方案中，在第一次转染中递送至细胞的核酸的量介于约20ng/cm 与约
250ng/cm2之间，或介于100ng/cm2与600ng/cm2之间。在另一实施方案中，细胞以介于约12小时与约48小时之间的间隔被转染约5次，并且对于第一次转染，递送至细胞的核酸的量为约
25ng/cm2，对于第二次转染为约50ng/cm2，对于第三次转染为约100ng/cm2，对于第四次转染为约200ng/cm2，并且对于第五次转染为约400ng/cm2。在另一实施方案中，细胞在第五次转染之后被进一步转染至少一次，并且递送至细胞的核酸的量为约400ng/cm2。
更大。在另一实施方案中，在第一次转染中递送至细胞的核酸的量介于约20ng/cm 与约
250ng/cm2之间，或介于100ng/cm2与600ng/cm2之间。在另一实施方案中，细胞以介于约12小时与约48小时之间的间隔被转染约5次，并且对于第一次转染，递送至细胞的核酸的量为约
25ng/cm2，对于第二次转染为约50ng/cm2，对于第三次转染为约100ng/cm2，对于第四次转染为约200ng/cm2，并且对于第五次转染为约400ng/cm2。在另一实施方案中，细胞在第五次转染之后被进一步转染至少一次，并且递送至细胞的核酸的量为约400ng/cm2。
[0147] 某些实施方案针对一种用核酸转染体内细胞的方法，其中核酸的量通过测量细胞密度并且基于细胞密度的测量选择核酸的量来转染而确定。在一个实施方案中，细胞密度通过光学手段测量。在另一实施方案中，细胞被重复地转染，细胞密度在两次转染之间增加，并且对于两次转染中的第二次，转染的核酸的量大于对于两次转染中的第一次。
[0148] 现在已经发现，在某些情况下，与本发明的培养基接触的细胞的体内转染效率和存活力可通过调节培养基来改进。因此，某些实施方案针对一种用于调节培养基的方法。其它实施方案针对一种经过调节的培养基。在一个实施方案中，供给者为成纤维细胞，并且培养基被调节持续大约24小时。其它实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基经过调节。其它实施方案针对一种用于重编程和/或基因编辑体内细胞的方法，其中培养基经过调节。在一个实施方案中，例如通过暴露于化学品(如丝裂霉素-C)或通过暴露于γ辐射使供给者有丝分裂失活。在某些实施方案中，仅使用自体材料以部分地(例如并且不希望受理论约束)避免从供给者至细胞或患者的疾病传播的风险可为有益的。因此，某些实施方案针对一种用于转染体内细胞的方法，其中转染培养基经过调节，并且其中供给者来源于与被转染的细胞相同的个体。其它实施方案针对一种用于重编程和/或基因编辑体内细胞的方法，其中培养基经过调节，并且其中供给者来源于与正进行重编程和/或基因编辑的细胞相同的个体。
[0149] 数种分子可通过调节添加至培养基中。因此，某些实施方案针对一种补充有一种或多种存在于经调节的培养基中的分子的培养基。在一个实施方案中，培养基补充有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在另一实施方案中，培养基补充有TGF-β或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在另一实施方案中，体内细胞根据本发明的方法重编程，其中培养基未补充TGF-β持续介于约1天与约5天之间，并且然后补充TGF-β持续至少约2天。在另一实施方案中，培养基补充有IL-6、IL-6R或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在另一实施方案中，培养基补充有鞘脂或脂肪酸。在另一实施方案中，所述鞘脂为溶血磷脂酸、溶血神经鞘氨酯(lysosphingomyelin)、鞘氨醇-1-磷酸或其生物活性类似物、变体或衍生物。
[0150] 除了使细胞有丝分裂失活外，在某些条件下，辐射可使细胞的基因表达变化，从而引起细胞产生较少的某些蛋白质和较多的非照射细胞的某些其它蛋白质，例如蛋白质的Wnt家族的成员。另外，蛋白质的Wnt家族的某些成员可促进细胞的生长和转化。现在已经发现，在某些情况下，可通过使体内细胞与使用经照射的供给者而经非丝裂霉素-c处理的供给者调节的培养基接触来极大地增加重编程的效率。已经进一步发现，当使用经照射的供给者时观察到的重编程效率的增加部分地由所述供给者分泌的Wnt蛋白引起。因此，某些实施方案针对一种用于重编程体内细胞的方法，其中细胞与Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、家族成员或激动剂接触，包括Wnt蛋白的下游靶标的激动剂和/或模拟Wnt蛋白的一种或多种生物效应的试剂，例如2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。
[0151] 由于许多基于DNA的重编程方法的低效率，这些方法可能难以或不可能与来源于患者样品的细胞一起使用，所述患者样品可能仅含有少量的细胞。相比之下，本发明的某些实施方案的高效率可允许少量细胞(包括单个细胞)的可靠重编程。某些实施方案针对一种用于重编程少量细胞的方法。其它实施方案针对一种用于重编程单个细胞的方法。在一个实施方案中，所述细胞与一种或多种酶接触。在另一实施方案中，所述酶为胶原酶。在另一实施方案中，所述胶原酶无动物组分。在一个实施方案中，胶原酶以介于约0.1mg/mL与约10mg/mL之间、或介于约0.5mg/mL与约5mg/mL之间的浓度存在。在另一实施方案中，所述细胞为血细胞。在另一实施方案中，细胞与含有一种或多种来源于患者的血液的蛋白质的培养基接触。在另一实施方案中，细胞与包含以下的培养基接触：DMEM/F12+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+介于约5％与约25％之间的患者来源的血清或介于约10％与约20％之间的患者来源的血清或约20％患者来源的血清。
[0152] 现在已经发现在某些情况下，使用本发明的培养基用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的RNA的混合物转染体内细胞可引起细胞的增殖速率增加。当递送至细胞的RNA的量太低而不能确保所有细胞被转染时，仅一部分细胞可显示增加的增殖速率。在某些情况下，如当产生个性化治疗剂时，增加细胞的增殖速率可为需要的，部分是因为这样做可减少产生治疗剂所必需的时间，并且因此可减少治疗剂的成本。因此，某些实施方案针对一种用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的RNA的混合物转染体内细胞的方法。在一个实施方案中，细胞展现增加的增殖速率。在另一实施方案中，所述细胞经重编程。
[0153] 许多疾病与一种或多种突变相关。突变可通过使细胞与编码蛋白质的核酸接触来校正，所述蛋白质单独或与其它分子组合校正突变(基因编辑的实例)。所述蛋白质的实例包括：锌指核酸酶和TALEN。因此，某些实施方案针对一种用核酸转染体内细胞的方法，其中所述核酸编码蛋白质，所述蛋白单独或与其它分子组合在DNA分子中产生单链或双链断裂。在一个实施方案中，所述蛋白质为锌指核酸酶或TALEN。在另一实施方案中，所述核酸为RNA分子。在另一实施方案中，所述单链或双链断裂在选自以下组的基因的转录起始位点的约
5,000,000个碱基内：CCR5、CXCR4、GAD1、GAD2、CFTR、HBA1、HBA2、HBB、HBD、FANCA、XPA、XPB、XPC、ERCC2、POLH、HTT、DMD、SOD1、APOE、PRNP、BRCA1和BRCA2或其类似物、变体或家族成员。
在另一实施方案中，通过在单链或双链断裂的区域中引起DNA序列的插入或通过在单链或双链断裂的区域中引起DNA序列以另外方式变化来用充当修复模板的核酸转染细胞。在另一实施方案中，细胞经重编程，并且随后细胞经基因编辑。在另一实施方案中，细胞经基因编辑，并且随后细胞经重编程。在另一实施方案中，基因编辑和重编程在彼此约7天之内执行。在另一实施方案中，基因编辑和重编程同时或在同一天发生。在另一实施方案中，细胞为皮肤细胞，所述皮肤细胞经基因编辑以破坏CCR5基因，所述皮肤细胞经重编程为造血干细胞，因此产生用于HIV/AIDS的治疗剂，并且所述治疗剂用于治疗患有HIV/AIDS的患者。在另一实施方案中，所述皮肤细胞来源于使用所述治疗剂治疗的同一患者。
5,000,000个碱基内：CCR5、CXCR4、GAD1、GAD2、CFTR、HBA1、HBA2、HBB、HBD、FANCA、XPA、XPB、XPC、ERCC2、POLH、HTT、DMD、SOD1、APOE、PRNP、BRCA1和BRCA2或其类似物、变体或家族成员。
在另一实施方案中，通过在单链或双链断裂的区域中引起DNA序列的插入或通过在单链或双链断裂的区域中引起DNA序列以另外方式变化来用充当修复模板的核酸转染细胞。在另一实施方案中，细胞经重编程，并且随后细胞经基因编辑。在另一实施方案中，细胞经基因编辑，并且随后细胞经重编程。在另一实施方案中，基因编辑和重编程在彼此约7天之内执行。在另一实施方案中，基因编辑和重编程同时或在同一天发生。在另一实施方案中，细胞为皮肤细胞，所述皮肤细胞经基因编辑以破坏CCR5基因，所述皮肤细胞经重编程为造血干细胞，因此产生用于HIV/AIDS的治疗剂，并且所述治疗剂用于治疗患有HIV/AIDS的患者。在另一实施方案中，所述皮肤细胞来源于使用所述治疗剂治疗的同一患者。
[0154] 可根据本发明的方法编辑以产生本发明的治疗剂的基因包括可经编辑以恢复正常功能的基因以及可经编辑以减少或消除功能的基因。所述基因包括但不限于：β珠蛋白(HBB)，其中的突变可引起镰状细胞疾病(SCD)和β-地中海贫血；早发性乳腺癌1(BRCA1)和早发性乳腺癌2(BRCA2)，其中的突变可增加对乳腺癌的易感性；C-C趋化因子受体型5(CCR5)和C-X-C趋化因子受体型4(CXCR4)，其中的突变可赋予HIV感染抗性；囊肿性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)，其中的突变可引起囊肿性纤维化；肌营养不良蛋白(DMD)，其中的突变可引起肌营养不良(包括假肥大型肌营养不良和贝克氏肌营养不良)；谷氨酸脱羧酶1和谷氨酸脱羧酶2(GAD l、GAD2)，其中的突变可防止β-细胞的自身免疫破坏；血红蛋白α1、血红蛋白α2和血红蛋白δ(HBA1、HBA2和HBD)，其中的突变可引起地中海贫血；亨廷顿病(HTT)，其中的突变可引起亨廷顿氏病；超氧化物歧化酶1(SOD1)，其中的突变可引起肌萎缩性侧索硬化(ALS)；XPA、XPB、XPC、XPD(ERCC6)和聚合酶(DNA指导)η(POLH)，其中的突变可引起着色性干皮病；富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)，其中的突变可引起帕金森氏病和范科尼贫血；互补组A、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、P(FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCP)以及RAD51同系物C(酿酒酵母(S.cerevisiae))(RAD51C)，其中的突变可引起范科尼贫血。
[0155] 某些实施方案针对一种包含核酸的治疗剂。在一个实施方案中，所述核酸编码一种或多种基因编辑蛋白。其它实施方案针对一种治疗剂，其包含一个或多个根据本发明的方法体内转染、重编程和/或基因编辑的细胞。在一个实施方案中，细胞经转染、重编程和/或基因编辑，并且转染、重编程和/或基因编辑的细胞被引入到患者中。在另一实施方案中，从其中引入转染、重编程和/或基因编辑的细胞的同一患者中收集细胞。可用本发明的治疗剂治疗的疾病的实例包括但不限于阿尔兹海默氏病、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化、囊肿性纤维化、心脏病(包括缺血性心肌病和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、亨廷顿氏病、糖尿病、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、着色性干皮病、肌营养不良、重度联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、癌症以及HIV/AIDS。在某些实施方案中，所述治疗剂包含美容剂。在一个实施方案中，从患者中收集细胞，所述细胞经重编程并且扩增为大量的脂肪细胞以产生美容剂，并且将所述美容剂引入到所述患者中。在另一实施方案中，所述美容剂用于组织重建。
[0156] 虽然本文提供用于产生具体类型的细胞和用于产生包含具体类型的细胞的治疗剂的详细实施例，但应该认识到本发明的方法可例如通过根据本发明的方法重编程细胞并且通过提供与发育期间存在于细胞微环境中的条件类似的条件在模拟发育的一个或多个方面的条件下培养细胞而用于产生许多其它类型的细胞和产生包含许多其它类型的细胞中的一种或多种的治疗剂。
[0157] 某些实施方案针对具有多种人白细胞抗原(HLA)类型的细胞文库(“HLA-匹配的文库”)。HLA-匹配的文库可为有益的，部分是因为其可提供治疗剂的快速产生和/或分布而不会使患者必须等待待从患者的细胞中产生的治疗剂。这样一种文库可对美容剂的产生并且对心脏病和血液和/或免疫系统的疾病的治疗特别有益，针对这些疾病，患者可受益于治疗剂或美容剂的立即获得。
[0158] 当并入到合成RNA分子中时，某些非典型核苷酸可部分地通过干扰检测外源核酸的蛋白质(例如蛋白激酶R、Rig-1和蛋白质的寡腺苷酸合成酶家族)的结合来减少合成RNA分子的毒性。已经报道当并入合成RNA分子中时减少合成RNA分子的毒性的非典型核苷酸包括：假尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷以及其某些组合。然而，可使非典型核苷酸降低合成RNA分子的体内毒性的非典型核苷酸的化学特征直到此时仍未知。此外，并入大量的大多数非典型核苷酸(例如，5-甲基尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞苷以及N6-甲基腺苷)可降低合成RNA分子可翻译成蛋白质的效率，从而在需要蛋白质表达的应用中限制含有这些核苷酸的合成RNA分子的效用。另外，虽然在合成RNA分子中假尿苷可完全取代尿苷而不降低合成RNA分子可翻译成蛋白质的效率，但在某些情况下，例如当执行频繁的重复转染时，仅含有腺苷、鸟苷、胞苷和假尿苷的合成RNA分子可展现过量毒性。
[0159] 现在已经发现，含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非典型核苷酸的合成RNA分子可比仅含有典型核苷酸的合成RNA分子毒性小，部分是由于这些位置上的取代干扰由检测外源核酸的蛋白质识别合成RNA分子的能力，并且此外，在这些位置上的取代可对合成RNA分子可翻译成蛋白质的效率具有最小的影响，部分是由于缺乏这些位置上的取代对碱基配对和碱基堆积相互作用的干扰。
[0160]
[0161] 在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的非典型核苷酸的实例包括但不限于：2-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、假尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基-5-氮杂尿苷、5-氨基-5-氮杂尿苷、5-羟基-5-氮杂尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基假尿苷、4-硫代-5-氮杂尿苷、4-硫代假尿苷、4-硫代-5-甲基尿苷、4-硫代-5-氨基尿苷、4-硫代-5-羟基尿苷、4-硫代-5-甲基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-氨基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-羟基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-甲基假尿苷、4-硫代-5-氨基假尿苷、4-硫代-5-羟基假尿苷、2-硫代胞苷、
5-氮杂胞苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、N4-氨基胞苷、N4-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-氨基胞苷、5-羟基胞苷、5-甲基-5-氮杂胞苷、5-氨基-5-氮杂胞苷、5-羟基-5-氮杂胞苷、5-甲基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-羟基假异胞苷、N4-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代-5-氮杂胞苷、2-硫代假异胞苷、2-硫代-N4-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基胞苷、2-硫代-N4-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、2-硫代-5-氨基胞苷、2-硫代-5-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基-
5-氮杂胞苷、2-硫代-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-甲基假异胞苷、2-硫代-5-氨基假异胞苷、2-硫代-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氮杂胞苷、
2-硫代-N4-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-甲基胞苷、N4-甲基-5-氨基胞苷、N4-甲基-5-羟基胞苷、N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-氨基假异胞苷、N4-甲基-5-羟基假异胞苷、N4-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-甲基胞苷、N4-氨基-5-氨基胞苷、N4-氨基-5-羟基胞苷、N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-甲基假异胞苷、N4-氨基-5-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、N4-羟基-5-羟基胞苷、N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-甲基假异胞苷、N4-羟基-5-氨基假异胞苷、N4-羟基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-
5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基假异胞苷、N6-甲基腺苷、N6-氨基腺苷、N6-羟基腺苷、7-脱氮腺苷、8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮腺苷、N6-甲基-
8-氮杂腺苷、7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮腺苷、N6-氨基-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-羟基腺苷、N6-羟基-7-脱氮腺苷、N6-羟基-8-氮杂腺苷、N6-羟基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷。应注意，针对某些非典型核苷酸存在替代的命名方案。例如，在某些情况下，5-甲基假尿苷可称为“3-甲基假尿苷”或“N3-甲基假尿苷”或“1-甲基假尿苷”或“N1-甲基假尿苷”。
5-氮杂胞苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、N4-氨基胞苷、N4-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-氨基胞苷、5-羟基胞苷、5-甲基-5-氮杂胞苷、5-氨基-5-氮杂胞苷、5-羟基-5-氮杂胞苷、5-甲基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-羟基假异胞苷、N4-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代-5-氮杂胞苷、2-硫代假异胞苷、2-硫代-N4-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基胞苷、2-硫代-N4-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、2-硫代-5-氨基胞苷、2-硫代-5-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基-
5-氮杂胞苷、2-硫代-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-甲基假异胞苷、2-硫代-5-氨基假异胞苷、2-硫代-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氮杂胞苷、
2-硫代-N4-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-甲基胞苷、N4-甲基-5-氨基胞苷、N4-甲基-5-羟基胞苷、N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-氨基假异胞苷、N4-甲基-5-羟基假异胞苷、N4-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-甲基胞苷、N4-氨基-5-氨基胞苷、N4-氨基-5-羟基胞苷、N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-甲基假异胞苷、N4-氨基-5-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、N4-羟基-5-羟基胞苷、N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-甲基假异胞苷、N4-羟基-5-氨基假异胞苷、N4-羟基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-
5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基假异胞苷、N6-甲基腺苷、N6-氨基腺苷、N6-羟基腺苷、7-脱氮腺苷、8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮腺苷、N6-甲基-
8-氮杂腺苷、7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮腺苷、N6-氨基-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、N6-羟基腺苷、N6-羟基-7-脱氮腺苷、N6-羟基-8-氮杂腺苷、N6-羟基-7-脱氮-8-氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷。应注意，针对某些非典型核苷酸存在替代的命名方案。例如，在某些情况下，5-甲基假尿苷可称为“3-甲基假尿苷”或“N3-甲基假尿苷”或“1-甲基假尿苷”或“N1-甲基假尿苷”。
[0162] 含有前缀“氨基”的核苷酸可指含有与核苷酸的指定位置上的原子结合的氮原子的任何核苷酸，例如5-氨基胞苷可指5-氨基胞苷、5-甲基氨基胞苷以及5-硝基胞苷。类似地，含有前缀“甲基”的核苷酸可指含有与核苷酸的指定位置上的原子结合的碳原子的任何核苷酸，例如5-甲基胞苷可指5-甲基胞苷、5-乙基胞苷以及5-羟基甲基胞苷，含有前缀“硫代”的核苷酸可指含有与核苷酸的给定位置上的原子结合的硫原子的任何核苷酸，并且含有前缀“羟基”的核苷酸可指含有与核苷酸的给定位置上的原子结合的氧原子的任何核苷酸，例如5-羟基尿苷可指5-羟基尿苷和具有与氧原子结合的甲基的尿苷，其中所述氧原子与所述尿苷的5C位置上的原子结合。
[0163] 因此，某些实施方案针对一种合成RNA分子，其中所述合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核苷酸。其它实施方案针对一种治疗剂，其中所述治疗剂含有一种或多种合成RNA分子，并且其中所述一种或多种合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核苷酸。在一个实施方案中，所述治疗剂包含转染试剂。在另一实施方案中，所述转染试剂包括阳离子脂质、脂质体或胶束。在另一实施方案中，脂质体或胶束包含叶酸盐并且治疗组合物具有抗癌活性。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、6-硫代鸟苷以及6-硫代-7-脱氮鸟苷中的至少一种。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷以及5-氨基假尿苷中的至少一种和假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷以及5-甲基假异胞苷中的至少一种。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷和5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷中的至少一种和假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷和5-甲基假异胞苷中的至少一种以及7-脱氮鸟苷、6-硫代鸟苷和6-硫代-7-脱氮鸟苷中的至少一种。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸还包括假尿苷或4-硫代尿苷或5-甲基尿苷或5-氨基尿苷或4-硫代假尿苷或
5-甲基假尿苷或5-氨基假尿苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸还包括7-脱氮腺苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮鸟苷以及4-硫代尿苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷或7-脱氮鸟苷和假尿苷。
在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假尿苷或5-甲基假尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮鸟苷以及假尿苷。在一个实施方案中，所述合成RNA分子存在于体内。
5-甲基假尿苷或5-氨基假尿苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸还包括7-脱氮腺苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮鸟苷以及4-硫代尿苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷或7-脱氮鸟苷和假尿苷。
在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假尿苷或5-甲基假尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮鸟苷以及假尿苷。在一个实施方案中，所述合成RNA分子存在于体内。
[0164] 通过通常用于体外转录的RNA聚合酶，某些非典型核苷酸可比其它非典型核苷酸更有效地并入到合成RNA分子中，部分是由于这些特定非典型核苷酸参与标准碱基配对相互作用和碱基堆积相互作用并且以类似于对应的典型核苷酸与RNA聚合酶相互作用的方式的方式与RNA聚合物相互作用的趋势。因此，含有一种或多种非典型核苷酸的某些核苷酸混合物可为有益的，部分是因为含有这些核苷酸混合物的体外转录反应可产生大量的合成RNA。因此，某些实施方案针对一种核苷酸混合物，其含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核苷酸。核苷酸混合物包括但不限于(每种核苷酸前面的数字指示体外转录反应中非典型核苷酸三磷酸的示例性部分，例如0.2假异胞苷是指含有腺苷-5'-三磷酸、鸟苷-5'-三磷酸、尿苷-5'-三磷酸、胞苷-5'-三磷酸以及假异胞苷-5'-三磷酸的反应，其中假异胞苷-5'-三磷酸以大约等于存在于所述反应中的假异胞苷-5'-三磷酸+胞苷-5'-三磷酸的总量的0.2倍的量存在于所述反应中，其中量是基于摩尔或质量而测量的，并且其中核苷酸前面的多于一个数字指示示例性部分的范围)：1.0假尿苷、0.1-0.8 2-硫代尿苷、0.1-0.8 5-甲基尿苷、0.2-1.0 5-羟基尿苷、0.1-1.0 5-氨基尿苷、0.1-1.0 4-硫代尿苷、0.1-1.0 2-硫代假尿苷、0.1-1.0 4-硫代假尿苷、0.1-1.0 5-羟基假尿苷、0.2-1 5-甲基假尿苷、0.1-1.0
5-氨基假尿苷、0.2-1.0 2-硫代胞苷、0.1-0.8假异胞苷、0.2-1.0 5-甲基胞苷、0.2-1.0 5-羟基胞苷、0.1-1.0 5-氨基胞苷、0.2-1.0N4-甲基胞苷、0.2-1.0 5-甲基假异胞苷、0.2-1.0
5-羟基假异胞苷、0.2-1.0 5-氨基假异胞苷、0.2-1.0N4-甲基假异胞苷、0.2-1.0 2-硫代假异胞苷、0.2-1.0 7-脱氮鸟苷、0.2-1.0 6-硫代鸟苷、0.2-1.0 6-硫代-7-脱氮鸟苷、0.2-
1.0 8-氮杂鸟苷、0.2-1.0 7-脱氮-8-氮杂鸟苷、0.2-1.0 6-硫代-8-氮杂鸟苷、0.1-0.5 7-脱氮腺苷以及0.1-0.5N6-甲基腺苷。
5-氨基假尿苷、0.2-1.0 2-硫代胞苷、0.1-0.8假异胞苷、0.2-1.0 5-甲基胞苷、0.2-1.0 5-羟基胞苷、0.1-1.0 5-氨基胞苷、0.2-1.0N4-甲基胞苷、0.2-1.0 5-甲基假异胞苷、0.2-1.0
5-羟基假异胞苷、0.2-1.0 5-氨基假异胞苷、0.2-1.0N4-甲基假异胞苷、0.2-1.0 2-硫代假异胞苷、0.2-1.0 7-脱氮鸟苷、0.2-1.0 6-硫代鸟苷、0.2-1.0 6-硫代-7-脱氮鸟苷、0.2-
1.0 8-氮杂鸟苷、0.2-1.0 7-脱氮-8-氮杂鸟苷、0.2-1.0 6-硫代-8-氮杂鸟苷、0.1-0.5 7-脱氮腺苷以及0.1-0.5N6-甲基腺苷。
[0165] 在各个实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物(例如，其可通过体外转录制备)大致上或完全含有在遗传密码中具有腺嘌呤或“A”的位置上的典型核苷酸。术语“大致上”在这方面是指至少90％。在这些实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物可进一步含有(例如，由以下组成)在遗传密码中具有“G”的位置上的7-脱氮鸟苷以及对应的典型核苷酸“G”，并且在具有G的位置上的典型和非典型核苷酸可介于5:1至
1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在这些实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物可进一步含有(例如，由以下组成)在遗传密码中具有“C”的位置上的5-羟基甲基胞苷、5-羟基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷中的一种或多种(例如二种、三种或四种)以及典型核苷酸“C”，并且在具有C的位置上的典型和非典型核苷酸可在5:
1至1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在一些实施方案中，在具有“C”的位置上的非典型核苷酸的水平如前一段落中所描述。在这些实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物可进一步含有(例如，由以下组成)在遗传密码中具有“U”的位置上的5-羟基甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种(例如二种、三种或四种)以及典型核苷酸“U”，并且在具有“U”的位置上的典型和非典型核苷酸可在
5:1至1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在一些实施方案中，在具“U”的位置上的非典型核苷酸的水平如前一段落中所描述。
1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在这些实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物可进一步含有(例如，由以下组成)在遗传密码中具有“C”的位置上的5-羟基甲基胞苷、5-羟基胞苷、5-羧基胞苷以及5-甲酰基胞苷中的一种或多种(例如二种、三种或四种)以及典型核苷酸“C”，并且在具有C的位置上的典型和非典型核苷酸可在5:
1至1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在一些实施方案中，在具有“C”的位置上的非典型核苷酸的水平如前一段落中所描述。在这些实施方案中，所述合成RNA组合物或合成聚核苷酸组合物可进一步含有(例如，由以下组成)在遗传密码中具有“U”的位置上的5-羟基甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-羧基尿苷以及5-甲酰基尿苷中的一种或多种(例如二种、三种或四种)以及典型核苷酸“U”，并且在具有“U”的位置上的典型和非典型核苷酸可在
5:1至1:5范围内，或在一些实施方案中在2:1至1:2范围内。在一些实施方案中，在具“U”的位置上的非典型核苷酸的水平如前一段落中所描述。
[0166] 现在已经发现，组合某些非典型核苷酸可为有益的，部分是因为非典型核苷酸对降低合成RNA分子的毒性的贡献可以是叠加的。因此，某些实施方案针对一种核苷酸混合物，其中所述核苷酸混合物含有超过一种上文所列出的非典型核苷酸，例如所述核苷酸混合物含有假异胞苷和7-脱氮尿苷或所述核苷酸混合物含有N4-甲基胞苷和7-脱氮尿苷等。在一个实施方案中，所述核苷酸混合物含有超过一种上文所列出的非典型核苷酸，并且所述非典型核苷酸中的每一种以上文所列出的部分存在于所述混合物中，例如所述核苷酸混合物含有0.1–0.8假异胞苷和0.2–1.0 7-脱氮尿苷或所述核苷酸混合物含有0.2–1.0N4-甲基胞苷和0.2–1.0 7-脱氮尿苷等。
[0167] 在某些情况下，例如当可不必要或需要使体外转录反应的产率最大化时，可使用并非以上给出的那些的核苷酸部分。上文所列出的示例性分数和分数的范围涉及具有典型纯度(大于90％纯度)的核苷酸-三磷酸溶液。这些和其它核苷酸的更大分数可通过使用具有更大纯度的核苷酸-三磷酸溶液而使用，所述更大纯度例如大于约95％纯度或大于约98％纯度或大于约99％纯度或大于约99.5％纯度，所述纯度可例如通过使用如高压液相色谱法(HPLC)的现有化学纯化技术或通过其它方式纯化核苷酸三磷酸溶液来实现。在一个实施方案中，纯化具有多种异构体的核苷酸以富集所需异构体。
[0168] 其它实施方案针对一种通过使细胞与合成RNA分子接触来诱导细胞体内表达所关注的蛋白质的方法，所述合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非典型核苷酸。其它实施方案针对一种通过使细胞与合成RNA分子接触来体内转染、重编程和/或基因编辑细胞的方法，所述合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非典型核苷酸。在一个实施方案中，所述合成RNA分子通过体外转录产生。在一个实施方案中，所述合成RNA分子编码一种或多种重编程因子。在另一实施方案中，所述一种或多种重编程因子包括Oct4蛋白。在另一实施方案中，细胞还与编码Sox2蛋白的合成RNA分子接触。在另一实施方案中，细胞还与编码Klf4蛋白的合成RNA分子接触。在另一实施方案中，细胞还与编码c-Myc蛋白的合成RNA分子接触。在另一实施方案中，细胞还与编码Lin28蛋白的合成RNA分子接触。
[0169] 在含有典型核苷酸和非典型核苷酸的体外转录反应中，如T7 RNA聚合酶的酶可优先并入典型核苷酸。因此，含有某一分数的非典型核苷酸的体外转录反应可产生含有与存在于所述反应中的非典型核苷酸的分数不同(通常更低)的分数的非典型核苷酸的RNA。在某些实施方案中，提到核苷酸并入分数(例如，“含有50％假异胞苷的合成RNA分子”或“0.1-0.8假异胞苷”)因此可指含有指定分数的核苷酸的RNA分子和在含有指定分数的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如核苷酸-三磷酸)的反应中合成的RNA分子，即使这样一种反应可产生含有与存在于所述反应中的非典型核苷酸的分数不同的分数的核苷酸的RNA。
[0170] 不同的核苷酸序列可通过使用替代的密码子来编码相同蛋白质。在某些实施方案中，提到核苷酸并入分数因此可指含有指定分数的核苷酸的RNA分子和与不同的RNA分子编码相同蛋白质的RNA分子，其中所述不同的RNA分子含有指定分数的核苷酸。
[0171] 某些实施方案针对一种试剂盒，其含有实践本发明所需的一种或多种材料。在一个实施方案中，所述试剂盒含有一种或多种合成RNA分子。在一个实施方案中，所述试剂盒含有一种或多种编码一种或多种重编程因子和/或基因编辑蛋白的合成RNA分子。在另一实施方案中，所述一种或多种合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非典型核苷酸。在另一实施方案中，所述试剂盒含有以下一种或多种：转染培养基、转染试剂、复合培养基以及基质溶液。在一个实施方案中，所述基质溶液含有纤维连接蛋白和/或玻璃粘连蛋白或重组纤维连接蛋白和/或重组玻璃粘连蛋白。在一个实施方案中，所述试剂盒的一种或多种组分呈多个等分试样存在。在一个实施方案中，所述试剂盒含有核酸转染-试剂复合物的等分试样。在另一实施方案中，所述试剂盒含有以固体形式，例如呈冷冻或冷冻干燥的沉淀提供的核酸转染-试剂复合物的等分试样。在另一实施方案中，所述试剂盒含有培养基的等分试样，其中每个等分试样含有通过化学处理或通过冷冻稳定化的转染试剂-核酸复合物。
[0172] 一般说来转染和具体说来重编程可为困难并且耗时的技术，所述技术可为重复的并且易于出错。然而，这些技术经常由于缺乏自动化转染设备而手动地执行。因此，某些实施方案针对一种可以自动化或半自动化方式转染、重编程和/或基因编辑体内细胞的系统。
[0173] 现在已经发现5-甲基胞苷脱甲基化途径的非典型核苷酸成员当并入至合成RNA中时可增加所述合成RNA可体内翻译成蛋白质的效率，并且可降低所述合成RNA的体内毒性。这些非典型核苷酸包括例如：5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷以及5-羧基胞苷(又称作“胞苷-5-羧酸”)。某些实施方案因此针对一种核酸。在一些实施方案中，所述核酸存在于体内。在一个实施方案中，所述核酸为合成RNA分子。在另一实施方案中，所述核酸包含一种或多种非典型核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸包含5-甲基胞苷脱甲基化途径的一种或多种非典型核苷酸成员。在另一实施方案中，所述核酸包含以下至少一种：5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷以及5-羧基胞苷或其衍生物。在另一实施方案中，所述核酸包含以下至少一种：假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、
5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷以及7-脱氮尿苷或其衍生物。
5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷以及7-脱氮尿苷或其衍生物。
[0174] 5-甲基胞苷脱甲基化途径
[0175]
[0176] 某些实施方案针对一种蛋白质。其它实施方案针对一种编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述蛋白质为所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述蛋白质选自：重编程蛋白和基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述核酸为质粒。在另一实施方案中，所述核酸存在于病毒或病毒载体中。在另一实施方案中，所述病毒或病毒载体不具有复制能力。在另一实施方案中，所述病毒或病毒载体具有复制能力。在一个实施方案中，所述病毒或病毒载体包括以下至少一种：腺病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或其天然或工程改造的变体，以及工程改造的病毒。
[0177] 还已经发现非典型核苷酸的某些组合可尤其有效地增加合成RNA可体内翻译成蛋白质的效率，并且降低合成RNA的体内毒性，例如组合：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷；5-羟基尿苷和5-甲基胞苷；5-羟基尿苷和5-羟基甲基胞苷；5-甲基尿苷和7-脱氮鸟苷；5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷；5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷；以及5-甲基尿苷、5-羟基甲基胞苷和
7-脱氮鸟苷。某些实施方案因此针对一种核酸，所述核酸包含以下至少两种：5-甲基尿苷、
5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种核酸，所述核酸包含以下至少三种：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种核酸，所述核酸包含以下全部：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。在一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-甲基胞苷残基以及一个或多个7-脱氮鸟苷残基或一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-羟基甲基胞苷残基以及一个或多个7-脱氮鸟苷残基。
7-脱氮鸟苷。某些实施方案因此针对一种核酸，所述核酸包含以下至少两种：5-甲基尿苷、
5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种核酸，所述核酸包含以下至少三种：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种核酸，所述核酸包含以下全部：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷以及7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。在一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-甲基胞苷残基以及一个或多个7-脱氮鸟苷残基或一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-羟基甲基胞苷残基以及一个或多个7-脱氮鸟苷残基。
[0178] 已经进一步发现含有某些分数的某些非典型核苷酸和其组合的合成RNA分子可展现尤其高的翻译效率和低的体内毒性。某些实施方案因此针对一种核酸，所述核酸包含以下至少一种：一个或多个尿苷残基、一个或多个胞苷残基以及一个或多个鸟苷残基，并且包含一种或多种非典型核苷酸。在一个实施方案中，介于约20％与约80％之间的尿苷残基为5-甲基尿苷残基。在另一实施方案中，介于约30％与约50％之间的尿苷残基为5-甲基尿苷残基。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基。在一个实施方案中，介于约60％与约80％之间的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，介于约80％与约
100％之间的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，介于约20％与约80％之间的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，介于约40％与约60％之间的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，介于约20％与约80％之间或介于约30％与约60％之间或约40％的胞苷残基为N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基。在另一实施方案中，各胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基和/或5-羟基甲基胞苷残基和/或N4-甲基胞苷残基和/或N4-乙酰基胞苷残基和/或其一种或多种衍生物。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基并且约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为5-羟基尿苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一些实施方案中，小于100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在其它实施方案中，小于100％的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，所述合成RNA分子中的各尿苷残基为假尿苷残基或5-甲基假尿苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。
100％之间的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，介于约20％与约80％之间的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，介于约40％与约60％之间的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，介于约20％与约80％之间或介于约30％与约60％之间或约40％的胞苷残基为N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基。在另一实施方案中，各胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基和/或5-羟基甲基胞苷残基和/或N4-甲基胞苷残基和/或N4-乙酰基胞苷残基和/或其一种或多种衍生物。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基并且约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为5-羟基尿苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在另一实施方案中，约40％的尿苷残基为5-甲基尿苷残基，介于约20％与约100％之间的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。在一些实施方案中，小于100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基。在其它实施方案中，小于100％的胞苷残基为5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，所述合成RNA分子中的各尿苷残基为假尿苷残基或5-甲基假尿苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基。在另一实施方案中，约100％的尿苷残基为假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基，约100％的胞苷残基为5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基为7-脱氮鸟苷残基。
[0179] 可替代或组合5-甲基胞苷使用的其它非典型核苷酸包括但不限于：假尿苷、5-羟基尿苷以及5-甲基假尿苷(又称作“1-甲基假尿苷”，又称作“N1-甲基假尿苷”)或其一种或多种衍生物。可替代或组合5-甲基胞苷和/或5-羟基甲基胞苷使用的其它非典型核苷酸包括但不限于：假异胞苷、5-甲基假异胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷或其一种或多种衍生物。在某些实施方案中，例如当仅执行单一转染、注射或递送时或当所转染、注射或递送的细胞、组织、器官或患者并未对转染相关毒性或天然免疫信号传导特别敏感时，非典型核苷酸的分数可降低。降低非典型核苷酸的分数可为有益的，部分是因为降低非典型核苷酸的分数可降低核酸的成本。在某些情况下，例如当需要所述核酸的最小免疫原性时，非典型核苷酸的分数可增加。
[0180] 在含有典型核苷酸和非典型核苷酸的体外转录反应中，如T7RNA聚合酶的酶可优先并入典型核苷酸。因此，含有某一分数的非典型核苷酸的体外转录反应可产生含有与存在于所述反应中的非典型核苷酸的分数不同(通常更低)的分数的非典型核苷酸的RNA。在某些实施方案中，提到核苷酸并入部分(例如，“50％5-甲基尿苷”)因此可指含有指定分数的核苷酸的核酸和在含有指定分数的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如核苷酸-三磷酸)的反应中合成的核酸，即使这样一种反应可产生含有与存在于所述反应中的非典型核苷酸的分数不同的分数的核苷酸的核酸。另外，不同的核苷酸序列可通过使用替代的密码子来编码相同蛋白质。在某些实施方案中，提到核苷酸并入分数因此可指含有指定分数的核苷酸的核酸和与不同的核酸编码相同蛋白质的核酸，其中所述不同的核酸含有指定分数的核苷酸。
[0181] 细胞的DNA序列可通过使细胞与基因编辑蛋白接触或通过诱导细胞表达基因编辑蛋白来改变。然而，先前公开的基因编辑蛋白遭受低结合效率和过度脱靶活性，其可在细胞的DNA中引入非所需突变，从而严重地限制其体内用途，例如在治疗和美容应用中，其中患者的细胞中引入非所需突变可能引起癌症发展。现在已经发现包含StsI核酸内切酶裂解结构域(SEQ ID NO:1)的基因编辑蛋白可展现大致上低于先前公开的基因编辑蛋白的体内脱靶活性，同时维持高水平的体内靶向活性。还已经发现当用作基因编辑蛋白的核酸酶结构域时可展现高的体内靶向活性、低的体内脱靶活性、小尺寸、溶解性以及其它所需特征的其它新型的工程改造的蛋白：StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)以及StsI-UHF(SEQ ID NO:7)。StsI-HA、StsI-HA2(高活性)、StsI-UHA以及StsI-UHA2(超高活性)可展现高于野生型StsI和野生型FokI的体内靶向活性，部分是因为N端区域内在34和61位置上的特异性氨基酸取代，而StsI-HF(高保真度)和StsI-UHF(超高保真度)可展现低于野生型StsI和野生型FokI的体内脱靶活性，部分是因为C端区域内在141和152位置上的特异性氨基酸取代。
[0182] 某些实施方案因此针对一种蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质存在于体内。在其它实施方案中，所述蛋白质包含核酸酶结构域。在一个实施例中，所述核酸酶结构域包含以下一种或多种：FokI核酸内切酶的裂解结构域(SEQ ID NO:53)、StsI核酸内切酶的裂解结构域(SEQ ID NO:1)、StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)以及StsI-UHF(SEQ ID NO:7)或其生物活性片段或变体。
[0183] 还已经发现包含包括某些新型重复序列的DNA结合结构域的工程改造的基因编辑蛋白可展现低于先前公开的基因编辑蛋白的体内脱靶活性，同时维持高水平的体内靶向活性。这些工程改造的基因编辑蛋白中的某些可提供优于先前公开的基因编辑蛋白的数种优势，包括例如连接重复序列的连接子区域的增加的柔性，其可引起增加的结合效率。因此，某些实施方案针对一种包含多种重复序列的蛋白质。在一个实施方案中，所述重复序列中的至少一者含有氨基酸序列：GabG，其中“a”和“b”各自表示任何氨基酸。在一个实施方案中，所述蛋白质为基因编辑蛋白。在另一实施方案中，所述重复序列中的一者或多者存在于DNA结合结构域中。在另一实施方案中，“a”和“b”各自独立地选自以下组：H和G。在另一实施方案中，“a”和“b”分别为H和G。在一个实施方案中，所述氨基酸序列存在于所述重复序列的C端的约5个氨基酸内。在另一实施方案中，所述氨基酸序列存在于所述重复序列的C端。在一些实施方案中，氨基酸序列GabG中的一个或多个G用除G外的一种或多种氨基酸(例如A、H或GG)置换。在一个实施方案中，所述重复序列具有介于约32个与约40个氨基酸之间或介于约33个与约39个氨基酸之间或介于约34个与38个氨基酸之间或介于约35个与约37个氨基酸之间或约36个氨基酸或大于约32个氨基酸或大于约33个氨基酸或大于约34个氨基酸或大于约35个氨基酸的长度。其它实施方案针对一种包含一个或多个转录活化因子样效应子结构域的蛋白质。在一个实施方案中，所述转录活化因子样效应子结构域中的至少一者包含重复序列。其它实施方案针对一种包含多个重复序列的蛋白质，所述蛋白质通过在转录活化因子样效应子结构域的至少两个重复序列之间插入一个或多个氨基酸而产生。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸插入距至少一个重复序列的C端约1个或约2个或约3个或约4个或约5个氨基酸处。其它实施方案针对一种包含多个重复序列的蛋白质，其中大约所有其它重复序列均具有不同于恰在所述重复序列前面或后面的重复序列的长度。在一个实施方案中，所有其它重复序列均为约36个氨基酸长。在另一实施方案中，所有其它重复序列均为36个氨基酸长。其它实施方案针对一种包含多个重复序列的蛋白质，其中所述多个重复序列包含至少两个各自为至少36个氨基酸长的重复序列，并且其中所述至少36个氨基酸长的重复序列中的至少两者由至少一个小于36个氨基酸长的重复序列分隔。一些实施方案针对一种蛋白质，所述蛋白质包含一个或多个选自例如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59以及SEQ ID NO:60的序列。
[0184] 其它实施方案针对一种包含DNA结合结构域的蛋白质。在一些实施方案中，所述DNA结合结构域包含多个重复序列。在一个实施方案中，所述多个重复序列使得能够高特异性识别靶标DNA分子中的结合位点。在另一实施方案中，所述重复序列中的至少两者具有彼此至少约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约98％、或约99％同源性。在另一实施方案中，所述重复序列中的至少一者包含一个或多个能够与靶标DNA分子中的结合位点结合的区域。在另一实施方案中，所述结合位点包含长度介于约1个至约5个碱基之间的确定序列。在一个实施方案中，所述DNA结合结构域包含锌指。在另一实施方案中，所述DNA结合结构域包含转录活化因子样效应子(TALE)。在另一实施方案中，所述多个重复序列包括至少一个与TALE具有至少约50％或约60％或约70％或约80％或约90％或约95％或约98％或约99％同源性的重复序列。在另一实施方案中，所述基因编辑蛋白包含成簇的规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)缔合蛋白。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含核定位序列。在另一实施方案中，所述核定位序列包含氨基酸序列：PKKKRKV。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含线粒体定位序列。在另一实施方案中，所述线粒体定位序列包含氨基酸序列：LGRVIPRKIASRASLM。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含连接子。在另一实施方案中，所述连接子连接DNA结合结构域至核酸酶结构域。在另一实施方案中，所述连接子为介于约1个与约10个氨基酸之间长。在一些实施方案中，所述连接子为约1个、约2个、或约3个、或约4个、或约5个、或约6个、或约7个、或约8个、或约9个、或约10个氨基酸长。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白能够在靶DNA分子中产生缺口或双链断裂。
[0185] 某些实施方案针对一种用于体内修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括体内向细胞中引入编码非天然存在融合蛋白的核酸分子，所述非天然存在融合蛋白包含含有36个氨基酸长的一个或多个重复单元的人工转录活化因子样(TAL)效应子重复结构域和核酸内切酶结构域，其中所述重复结构域经工程改造用于预定核苷酸序列的识别，并且其中所述融合蛋白识别所述预定核苷酸序列。在一个实施方案中，所述细胞为真核细胞。在另一实施方案中，所述细胞为动物细胞。在另一实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一实施方案中，所述细胞为人细胞。在一个实施方案中，所述细胞为植物细胞。在另一实施方案中，所述细胞为原核细胞。在一些实施方案中，所述融合蛋白在细胞的核酸中引入内切核苷酸裂解，由此修饰所述细胞的基因组。
[0186] 某些实施方案针对一种用于体内改变细胞的DNA序列的组合物，所述组合物包含核酸，其中所述核酸编码基因编辑蛋白。其它实施方案针对一种用于体内改变细胞的DNA序列的组合物，所述组合物包含核酸混合物，其中所述核酸混合物包含：编码第一基因编辑蛋白的第一核酸，和编码第二基因编辑蛋白的第二核酸。在一个实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点存在于同一靶标DNA分子中。在另一实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点由少于约50个碱基、或少于约40个碱基、或少于约30个碱基或少于约20个碱基、或少于约10个碱基、或介于约10个碱基与约25个碱基之间或约15个碱基分隔。在一个实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的核酸酶结构域和所述第二基因编辑蛋白的核酸酶结构域能够形成二聚体。在另一实施方案中，所述二聚体能够在靶标DNA分子中产生缺口或双链断裂。
[0187] 某些实施方案针对一种治疗组合物。其它实施方案针对一种美容组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含修复模板。在另一实施方案中，所述修复模板为单链DNA分子或双链DNA分子。
[0188] 其它实施方案针对一种用于合成蛋白质或编码蛋白质的核酸的制品。在一个实施方案中，所述物品为核酸。在另一实施方案中，所述蛋白质包含DNA结合结构域。在另一实施方案中，所述核酸包含编码DNA结合结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述蛋白质包含核酸酶结构域。在另一实施方案中，所述核酸包含编码核酸酶结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述蛋白质包含多个重复序列。在另一实施方案中，所述核酸编码多个重复序列。在另一实施方案中，所述核酸酶结构域选自：FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF以及StsI-UHF或其天然或工程改造的变体或生物活性片段。在一个实施方案中，所述核酸包含RNA聚合酶启动子。在另一实施方案中，所述RNA聚合酶启动子为T7启动子或SP6启动子。在另一实施方案中，所述核酸包含病毒启动子。在一个实施方案中，所述核酸包含未翻译区域。在另一实施方案中，所述核酸为体外转录模板。
[0189] 其它实施方案针对一种用于体内诱导细胞表达蛋白质的方法。其它实施方案针对一种用于体内改变细胞的DNA序列的方法，所述方法包括用基因编辑蛋白体内转染细胞或诱导细胞体内表达基因编辑蛋白。其它实施方案针对一种用于体内减少细胞中所关注的蛋白质的表达的方法。在一个实施方案中，诱导所述细胞表达基因编辑蛋白，其中所述基因编辑蛋白能够在靶标DNA分子中产生缺口或双链断裂。在另一实施方案中，所述缺口或双链断裂引起基因的失活。其它实施方案针对一种用于体内产生非活性、减少活性或显性阴性形式的蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述蛋白质为生存素。其它实施方案针对一种用于体内修复细胞中的一种或多种突变的方法。在一个实施方案中，所述细胞与修复模板接触。在另一实施方案中，所述修复模板为DNA分子。在另一实施方案中，所述修复模板不含基因编辑蛋白的结合位点。在另一实施方案中，所述修复模板编码由包含基因编辑蛋白的结合位点的DNA序列编码的氨基酸序列。
[0190] 其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者施用治疗或美容有效量的蛋白质或编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述治疗引起所述患者的症状中的一种或多种改善。某些实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括：a.通过用编码所关注的蛋白质的核酸体内转染细胞来诱导细胞表达所关注的蛋白质和/或b.体内重编程所述细胞。在一个实施方案中，所述细胞经重编程为较低分化状态。在另一实施方案中，细胞是通过用一种或多种编码一种或多种重编程蛋白的合成RNA分子转染细胞来重编程。在另一实施方案中，所述细胞分化。在另一实施方案中，所述细胞分化为以下一种：皮肤细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞、视网膜细胞、肾细胞、神经细胞、基质细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌细胞、卵母细胞以及精细胞。其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括：a.通过用编码基因编辑蛋白的核酸体内转染细胞来诱导细胞表达基因编辑蛋白和/或b.体内重编程所述细胞。
[0191] 其它实施方案针对一种复合培养基。在一个实施方案中，所述复合培养基具有大于约7、或大于约7.2、或大于约7.4、或大于约7.6、或大于约7.8、或大于约8.0、或大于约8.2、或大于约8.4、或大于约8.6、或大于约8.8、或大于约9.0的pH。在另一实施方案中，所述复合培养基包含转铁蛋白。在另一实施方案中，所述复合培养基包含DMEM。在另一实施方案中，所述复合培养基包含DMEM/F12。其它实施方案针对一种用于形成核酸-转染试剂复合物的方法。在一个实施方案中，将所述转染试剂与复合培养基孵育。在另一实施方案中，所述孵育在混合步骤之前发生。在另一实施方案中，所述孵育步骤介于约5秒与约5分钟之间或介于约10秒与约2分钟之间或介于约15秒与约1分钟之间或介于约30秒与约45秒之间。在一个实施方案中，所述转染试剂选自表2。在另一实施方案中，所述转染试剂为脂质或利匹哆异德。在另一实施方案中，所述转染试剂包含阳离子。在另一实施方案中，所述阳离子为多价阳离子。在另一实施方案中，所述转染试剂为N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(又称作MVL5)或其衍生物。
[0192] 某些实施方案针对一种通过使细胞与核酸体内接触来诱导细胞表达蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一实施方案中，所述细胞为人细胞或啮齿动物细胞。其它实施方案针对使用一种或多种本发明方法产生的细胞。在一个实施方案中，所述细胞存在于患者中。在另一实施方案中，所述细胞从患者分离。其它实施方案针对一种筛选文库，所述文库包含使用一种或多种本发明方法产生的细胞。在一个实施方案中，所述筛选文库用于以下至少一者：毒性筛选(包括：心脏毒性筛选、神经毒性筛选以及肝脏毒性筛选)、功效筛选、高通量筛选、高含量筛选以及其它筛选。
[0193] 其它实施方案针对一种含有核酸的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒含有递送试剂(又称作“转染试剂”)。在另一实施方案中，所述试剂盒为重编程试剂盒。在另一实施方案中，所述试剂盒为基因编辑试剂盒。其它实施方案针对一种用于产生核酸的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒含有以下至少两者：假尿苷-三磷酸、5-甲基尿苷三磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟基甲基胞苷三磷酸、N4-甲基胞苷三磷酸、N4-乙酰基胞苷三磷酸以及
7-脱氮鸟苷三磷酸或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种包含核酸的治疗剂或美容剂。在一个实施方案中，所述治疗剂或美容剂为药物组合物。在另一实施方案中，配制所述药物组合物。在另一实施方案中，所述制剂包含脂质体的水性悬浮液。实例脂质体组分陈述于表2中，并且举例而非通过限制给出。在一个实施方案中，所述脂质体包括一个或多个聚乙二醇(PEG)链。在另一实施方案中，所述PEG为PEG2000。在另一实施方案中，所述脂质体包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。在一个实施方案中，所述治疗剂包含一种或多种配体。在另一实施方案中，所述治疗剂包含以下至少一者：雄激素、CD30(TNFRSF8)、细胞穿透肽、CXCR、雌激素、表皮生长因子、EGFR、HER2、叶酸盐、胰岛素、胰岛素样生长因子-I、白细胞介素-13、整合素、孕酮、基质衍生因子-1、凝血酶、维生素D以及转铁蛋白或其生物活性片段或变体。其它实施方案针对一种治疗剂或美容剂，其包含使用一种或多种本发明方法产生的细胞。在一个实施方案中，向患者施用所述治疗剂来治疗以下至少一者：1型糖尿病、心脏病(包括缺血性心肌病和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊肿性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、重症联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默氏病、癌症以及传染病(包括：肝炎和HIV/AIDS)。
7-脱氮鸟苷三磷酸或其一种或多种衍生物。其它实施方案针对一种包含核酸的治疗剂或美容剂。在一个实施方案中，所述治疗剂或美容剂为药物组合物。在另一实施方案中，配制所述药物组合物。在另一实施方案中，所述制剂包含脂质体的水性悬浮液。实例脂质体组分陈述于表2中，并且举例而非通过限制给出。在一个实施方案中，所述脂质体包括一个或多个聚乙二醇(PEG)链。在另一实施方案中，所述PEG为PEG2000。在另一实施方案中，所述脂质体包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。在一个实施方案中，所述治疗剂包含一种或多种配体。在另一实施方案中，所述治疗剂包含以下至少一者：雄激素、CD30(TNFRSF8)、细胞穿透肽、CXCR、雌激素、表皮生长因子、EGFR、HER2、叶酸盐、胰岛素、胰岛素样生长因子-I、白细胞介素-13、整合素、孕酮、基质衍生因子-1、凝血酶、维生素D以及转铁蛋白或其生物活性片段或变体。其它实施方案针对一种治疗剂或美容剂，其包含使用一种或多种本发明方法产生的细胞。在一个实施方案中，向患者施用所述治疗剂来治疗以下至少一者：1型糖尿病、心脏病(包括缺血性心肌病和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊肿性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、重症联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默氏病、癌症以及传染病(包括：肝炎和HIV/AIDS)。
[0194] 表2.说明性生物相容性脂质
[0195]
[0196]
[0197] 在一些实施方案中，本发明涉及美国专利号5,711,964；5,891,468；6,316,260；6,413,544；6,770,291；以及7,390,780中所述的一种或多种施用技术，所述专利的完整内容由此以引用的方式全文并入。
[0198] 某些实施方案针对一种包含5'-帽结构的核酸，所述5'-帽结构选自帽0、帽1、帽2以及帽3或其衍生物。在一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个UTR。在另一实施方案中，所述一个或多个UTR增加所述核酸的稳定性。在另一实施方案中，所述一个或多个UTR包括α-球蛋白或β-球蛋白5'-UTR。在另一实施方案中，所述一个或多个UTR包括α-球蛋白或β-球蛋白3'-UTR。在另一实施方案中，所述合成RNA分子包含α-球蛋白或β-球蛋白5'-UTR以及α-球蛋白或β-球蛋白3'-UTR。在一个实施方案中，所述5'-UTR包含大致上类似于Kozak共有序列的Kozak序列。在另一实施方案中，所述核酸包含3'-多聚腺苷酸尾。在另一实施方案中，所述3'-多聚腺苷酸尾为介于约20nt与约250nt之间或介于约120nt与约150nt之间长。在另一实施方案中，所述3'-多聚腺苷酸尾为约20nt、或约30nt、或约40nt、或约50nt、或约
60nt、或约70nt、或约80nt、或约90nt、或约100nt、或约110nt、或约120nt、或约130nt、或约
140nt、或约150nt、或约160nt、或约170nt、或约180nt、或约190nt、或约200nt、或约210nt、或约220nt、或约230nt、或约240nt、或约250nt长。
60nt、或约70nt、或约80nt、或约90nt、或约100nt、或约110nt、或约120nt、或约130nt、或约
140nt、或约150nt、或约160nt、或约170nt、或约180nt、或约190nt、或约200nt、或约210nt、或约220nt、或约230nt、或约240nt、或约250nt长。
[0199] 其它实施方案针对一种用于体内重编程细胞的方法。在一个实施方案中，细胞通过使所述细胞与一种或多种核酸接触来重编程。在一个实施方案中，使细胞与编码以下至少一者的多种核酸接触：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白或其生物活性片段、变体或衍生物。在另一实施方案中，使细胞与编码包括以下的多种蛋白质的多种核酸接触：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白以及c-Myc蛋白或其一种或多种生物活性片段、变体或衍生物。其它实施方案针对一种用于体内基因编辑细胞的方法。在一个实施方案中，细胞通过使所述细胞与一种或多种核酸接触来进行基因编辑。
[0200] 当体内递送时，核酸(包括含有核酸的脂质体制剂)可积聚于肝和/或脾中。现在已经发现编码蛋白质的核酸可调节肝和脾中的蛋白质表达，并且以这种方式使用的核酸可构成用于治疗肝和脾疾病的有效治疗剂。因此，某些实施方案针对一种通过向患者递送编码所关注的蛋白质的核酸来治疗肝和/或脾疾病的方法。其它实施方案针对一种用于治疗肝和/或脾疾病的治疗组合物，所述组合物包含编码所关注的蛋白质的核酸。可治疗的肝和/或脾疾病和病况包括但不限于：肝炎、酒精诱导的肝病、药物诱导的肝病、埃巴病毒感染、腺病毒感染、巨细胞病毒感染、弓形体病、落基山斑疹热、非酒精性脂肪肝疾病、血色素沉着病、威尔逊氏病、吉尔伯特氏病以及肝和/或脾癌症。
[0201] 某些实施方案针对一种用于诱导体内细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使体内细胞与包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和一种或多种核酸分子的溶液接触，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一者编码所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。在另一实施方案中，所述一种或多种核酸分子包括合成RNA分子。在一个实施方案中，所述细胞为皮肤细胞。在另一实施方案中，所述细胞为肌细胞。在另一实施方案中，所述细胞为皮肤成纤维细胞。在另一实施方案中，所述细胞为成肌细胞。在一个实施方案中，所述所关注的蛋白为质细胞外基质蛋白。在另一实施方案中，所述所关注的蛋白质选自：弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、赖氨酰基氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、肌原纤维蛋白、微纤维缔合糖蛋白、赖氨酰基氧化酶样蛋白以及血小板源性生长因子。在一个实施方案中，将所述溶液递送至真皮。在另一实施方案中，所述递送是通过注射进行。在另一实施方案中，所述递送是通过使用微针阵列注射进行。在一个实施方案中，所述溶液进一步包含生长因子。在另一实施方案中，所述生长因子选自：成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。在另一实施方案中，所述溶液进一步包含胆固醇。
[0202] 其它实施方案针对一种用于诱导体内细胞表达所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使体内细胞与包含胆固醇和一种或多种核酸分子的溶液接触，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一者编码所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起所述细胞表达所述所关注的蛋白质。其它实施方案针对一种用核酸分子转染体内细胞的方法，所述方法包括使体内细胞与包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和核酸分子的溶液接触。在一个实施方案中，所述方法引起所述细胞由所述核酸分子转染。在另一实施方案中，所述核酸分子为以下一者：dsDNA分子、ssDNA分子、dsRNA分子、ssRNA分子、质粒、寡核苷酸、合成RNA分子、miRNA分子、mRNA分子、siRNA分子。其它实施方案针对一种用于治疗患者的方法，所述方法包括向患者递送包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和一种或多种核酸分子的组合物，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一者编码所关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起所述患者中所述所关注的蛋白质的表达。在另一实施方案中，所述方法引起所述患者的真皮中所述所关注的蛋白质的表达。
[0203] 某些实施方案针对一种包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和核酸分子的美容组合物。其它实施方案针对一种美容治疗物品。在一个实施方案中，所述美容治疗物品包含经配置以将组合物递送至患者的装置。在另一实施方案中，所述核酸分子编码弹性蛋白或胶原蛋白。其它实施方案针对一种用于转染体内细胞的溶液，所述溶液包含胆固醇或胆固醇类似物和一种或多种核酸分子。在一个实施方案中，所述胆固醇或胆固醇类似物与所述一种或多种核酸分子中的至少一者共价结合。在另一实施方案中，所述胆固醇类似物为氧固醇。在另一实施方案中，所述胆固醇类似物包括以下一者或多者：A环取代、B环取代、D环取代、侧链取代、胆甾烷酸、胆甾烯酸、多不饱和部分、氘化部分、氟化部分、磺化部分、磷酸化部分以及荧光部分。在另一实施方案中，所述方法包括用以下一者或多者治疗患者：真皮填充剂、神经毒素(例如钠通道抑制剂(例如，河豚毒素)、钾通道抑制剂(例如，四乙基铵)、氯离子通道抑制剂(例如，氯毒素和箭毒)、钙通道抑制剂(例如，芋螺毒素)、突触小泡释放抑制剂(例如，肉毒杆菌毒素和破伤风毒素)以及血脑屏障抑制剂(例如铝和汞))以及修复诱导治疗。
[0204] 例如，A型肉毒杆菌毒素已由美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration；FDA)批准用于治疗年龄超过12岁的患者的特发性眼睑痉挛、斜视和半面痉挛、颈部肌张力障碍、眉间纹(面部)皱纹和用于治疗多汗并且B型肉毒杆菌毒素已被批准用于治疗颈部肌张力障碍。本发明组合物可在这些疾病的治疗中与这些毒素组合。
[0205] 此外，前述毒素中的任一种的组合均可与本发明组合物组合用于各种美容程序，包括不限于面部皱纹、运动过度皮纹、眉间纹、鱼尾纹、木偶纹、皮肤病症、鼻唇沟皱褶、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛以及出汗病症。或者，本发明组合物可作为单药疗法用于这些美容程序。
[0206] 某些实施方案针对一种组合疗法，所述组合疗法包含一种或多种本发明的治疗或美容组合物和一种或多种辅佐疗法或美容治疗。在某些实施方案中，将一种或多种本发明的治疗或美容组合物施用于正用一种或多种辅佐疗法或美容治疗治疗的受试者。实例辅佐疗法和美容治疗陈述于美国临时申请号61/721,302(其内容由此以引用的方式并入)的表3和表5中，并且举例而非通过限制给出。
[0207] 表3.说明性辅佐疗法
[0208]
[0209]
[0210]
[0211] 医药制剂可另外包含递送试剂(又称作“转染试剂”)和/或赋形剂。医药学上可接受的递送试剂、赋形剂和其制备和使用方法(包括用于制备和施用医药制剂至患者(又称作“受试者”)的方法)为本领域中众所周知的，并且陈述于多个公布中，包括例如美国专利申请公布号US 2008/0213377，其全部内容以引用的方式并入本文。
[0212] 例如，本发明组合物可呈医药学上可接受的盐形式。所述盐包括例如J.Pharma.Sci.66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Verlag,Zurich(Switzerland)2002中列出的那些，所述参考文献由此以引用的方式全文并入。医药学上可接受的盐的非限制性实例包括：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、反丁烯二酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、o-乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二甲酸盐、己炔-1,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐、碱金属(如钠、钾以及锂)的氢氧化物；碱土金属(如钙和镁)的氢氧化物；其它金属(如铝和锌)的氢氧化物；氨，和有机胺，如未取代或羟基取代的单-、二-或三-烷基胺、二环己胺；
三丁胺；吡啶；N-甲胺、N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-OH-低碳烷基胺)，如单-、双-或三-(2-羟基乙基胺)、2-羟基-叔丁胺或三-(羟基甲基)甲胺；N,N-二-低碳烷基-N-(羟基-低碳烷基)-胺，如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等。
三丁胺；吡啶；N-甲胺、N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-OH-低碳烷基胺)，如单-、双-或三-(2-羟基乙基胺)、2-羟基-叔丁胺或三-(羟基甲基)甲胺；N,N-二-低碳烷基-N-(羟基-低碳烷基)-胺，如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等。
[0213] 本发明药物组合物可包含赋形剂，包括液体，如水和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。所述医药赋形剂可为例如生理盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶状二氧化硅、尿素等。另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，医药学上可接受的赋形剂当施用于受试者时为无菌的。合适的医药赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。本文所述的任何试剂必要时还可包含微量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。
[0214] 在各个实施方案中，本文所述的组合物可以例如约1mg/kg至约100mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、或约5mg/kg至约25mg/kg的有效剂量施用。将被视为有效剂量的剂量的精确确定可基于各患者的独特因素，包括其体型、年龄和疾病类型。剂量可由本领域的技术人员根据本公开和本领域中的知识容易地确定。例如，剂量可参考Physicians’Desk Reference,第66版,PDR Network；2012版(2011年12月27日)确定，所述参考文献的内容以引用的方式全文并入。
[0215] 本发明的活性组合物可包括典型医药制剂。根据本发明的这些组合物的施用可经由任何常用途径，只要靶组织可经由所述途径达到。这种途径包括口服、鼻或颊。或者，施用可通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射至癌症组织中。本文所公开的试剂还可通过导管系统施用。所述组合物通常将作为如本文所述的医药学上可接受的组合物施用。
[0216] 在配制时，溶液可以可与剂量制剂相容的方式并且以如治疗有效的量施用。所述制剂可容易地以多种剂型施用，所述剂型如可注射溶液、药物释放胶囊等。关于以水溶液肠胃外施用，举例来说，所述溶液一般经适当缓冲并且液体稀释剂首先使得用例如充足生理盐水或葡萄糖等张。所述水溶液可例如用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选地，如本领域的技术人员已知，尤其根据本公开使用无菌水性介质。
[0217] 示例性受试者或患者是指任何脊椎动物，包括不限于人和其它灵长类动物(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，狗和猫)、实验动物(例如，啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)和禽类(例如，家养、野生和猎禽，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者为人。
[0218] 本文所述的组合物的施用可例如通过注射、局部施用、眼睛施用以及鼻内施用。所述注射可包括如但不限于皮内、皮下以及肌肉内的注射。在一些实施方案中，所述注射可连接至电动力(例如，电穿孔，包括使用可用于电化学疗法的装置(例如CLINIPORATOR,IGEASrl,Carpi[MO],Italy))。所述表面施用可为但不限于乳膏、洗液、软膏、凝胶、喷雾剂、溶液等。所述局部施用可进一步包括渗透增强剂，如但不限于表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、非螯合非表面活性剂、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、与胆汁酸和/或盐组合的脂肪酸和/或盐、与月桂酸、癸酸和UDCA组合的钠盐等。所述局部施用也可包括香料、着色剂、遮光剂、抗细菌剂和/或保湿剂。本文所述的组合物可施用于至少一个位点，如但不限于前额、头皮、毛囊、头发、上眼睑、下眼睑、眉毛、睫毛、眶下区域、眶周区域、太阳穴、鼻、鼻梁、面颊、舌头、鼻唇沟皱褶、嘴唇、眼周(periobicular)区域、下颚线、耳朵、颈、乳房、前臂、上臂、手掌、手、手指、指甲、背部、腹部、侧面、臀部、大腿、小腿、脚、脚趾等。
[0219] 序列
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224] 本发明进一步通过以下非限制性实施例说明。实施例
[0225] 实施例1 RNA合成
[0226] 编码绿色荧光蛋白或人蛋白弹性蛋白、酪氨酸酶、黑皮质素1受体、透明质酸合酶1、透明质酸合酶2、透明质酸合酶3、III型胶原蛋白a1、VII型胶原蛋白a1、白细胞介素10、P-选择素糖蛋白配体-1、α-(1,3)-岩藻糖基转移酶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)以及Lin28或靶向人基因XPA、CCR5、TERT、MYC以及BIRC5的TALEN并且包含经典和非经典核苷酸的多种组合的RNA是由DNA模板使用T7高产率RNA合成试剂盒和具有mRNA帽2'-O-甲基转移酶的Vaccinia Capping System试剂盒(均来自New England Biolabs,Inc.)，根据制造商的说明书和本发明人先前公开的发明(美国申请号13/465,490(现为美国专利号8,497,
124)、国际申请号PCT/US12/67966、美国申请号13/931,251以及国际申请号PCT/US13/
68118，其内容均由此以引用的方式全文并入)合成的(表4)。所述RNA接着用无核酸酶的水稀释至介于100ng/μL与1000ng/μL之间。关于某些实验，以1μL/100μg的RNA的浓度添加RNA酶抑制剂(Superase·In,Life Technologies Corporation)。在4C下存储RNA溶液。关于重编程实验，以3:1:1:1:1的摩尔比混合编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA。
124)、国际申请号PCT/US12/67966、美国申请号13/931,251以及国际申请号PCT/US13/
68118，其内容均由此以引用的方式全文并入)合成的(表4)。所述RNA接着用无核酸酶的水稀释至介于100ng/μL与1000ng/μL之间。关于某些实验，以1μL/100μg的RNA的浓度添加RNA酶抑制剂(Superase·In,Life Technologies Corporation)。在4C下存储RNA溶液。关于重编程实验，以3:1:1:1:1的摩尔比混合编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA。
[0227] 表4.RNA合成
[0228]
[0229]
[0230]
[0231] “A”是指腺苷-5'-三磷酸，“G”是指鸟苷-5'-三磷酸，“U”是指尿苷-5'-三磷酸，“C”是指胞苷-5'-三磷酸，“5mC”是指5-甲基胞苷-5'-三磷酸，“5hmC”是指5-羟基甲基胞苷-5'-三磷酸，“5cC”是指5-羧基胞苷-5'-三磷酸，“5fC”是指5-甲酰基胞苷-5'-三磷酸，“psU”是指5-假胞苷-5'-三磷酸，“5mU”是指5-甲基尿苷-5'-三磷酸，“5hU”是指具有与结合于尿苷的5C位置的氧原子结合的甲基的尿苷5'-三磷酸，并且“7dG”是指7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸。
[0232] 实施例2用合成RNA转染细胞
[0233] 关于6孔板中的转染，2μg RNA和6μL转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX,Life Technologies Corporation)首先分别在复合培养基(Opti-MEM,Life Technologies Corporation或DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺)中稀释至各60μL总体积。根据转染试剂制造商的说明书，接着混合稀释的RNA和转染试剂并且在室温下孵育15min。然后将复合物添加至培养的细胞中。将12μL与240μL之间的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。轻轻振荡板以使复合物分布在整个孔中。将细胞与复合物孵育细胞持续4小时至过夜，接着用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基。放大体积规模用于在24孔板和96孔板中转染。或者，介于0.5μg与5μg之间的RNA和每μg RNA2-3μL的转染试剂(Lipofectamine 2000,Life Technologies Corporation)首先分别在复合培养基(Opti-MEM,Life Technologies Corporation或DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺)中稀释至各在5μL与100μL之间的总体积。接着混合稀释的RNA和转染试剂并且在室温下孵育10min。然后将复合物添加至培养的细胞中。将介于10μL与200μL之间的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。在某些实验中，DMEM+10％FBS或DMEM+50％FBS替代转染培养基使用。轻轻振荡板以使复合物分布在整个孔中。将细胞与复合物孵育持续4小时至过夜。在某些实验中，所述培养基在转染后4h或24h用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换。
[0234] 实施例3.含有非典型核苷酸的合成RNA的毒性和蛋白质翻译
[0235] 原代人成纤维细胞根据实施例2使用根据实施例1合成的RNA转染。在使用针对Oct4的抗体转染后20-24h，固定细胞并且染色。通过评估固定时的细胞密度来确定所述RNA的相对毒性。
[0236] 实施例4转染培养基配制
[0237] 开发细胞培养基以支持细胞使用核酸的有效转染和有效重编程(“转染培养基”)：
[0238] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物+4μg/mL胆固醇+1μM氢化可的松+25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。
[0239] 开发这种培养基的变化形式以支持多种细胞类型的稳固、长期培养，所述细胞类型包括多能干细胞(“维持培养基”)：
[0240] DMEM/F12+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物+20ng/mL bFGF+2ng/mL TGF-β1。
[0241] 除非另外注明，否则使用以下转染培养基作为本文所述的所有实施例中的转染培养基，在所述转染培养基中通过添加32mM辛酸钠，接着在60C下加热4h，接着在室温下用离子交换树脂(AG501-X8(D),Bio-Rad Laboratories,Inc.)处理6h，接着在室温下用葡聚糖涂布的活性炭(C6241,Sigma-Aldrich Co.LLC.)处理过夜，接着离心、过滤、用无核酸酶的水调节至10％溶液，接着添加至所述培养基的其它组分中来处理所述处理过的人血清白蛋白。关于重编程实验，除非另外注明，否则细胞在DMEM+10％-20％血清中涂于未涂布的板上或在转染培养基中涂于纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白涂布的板上。除非另外注明，否则所述转染培养基不经调节。认识到，可调节所述转染培养基的配制来满足所培养的具体细胞类型的需要。进一步认识到，处理过的人血清白蛋白可用其它处理过的白蛋白，例如处理过的牛血清白蛋白替换，而不会不利地影响所述培养基的性能。进一步认识到，其它谷氨酰胺来源可替代L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺或除了L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺以外使用，例如L-谷氨酰胺，其它缓冲系统可替代HEPES或除了HEPES以外使用，例如磷酸盐、碳酸氢盐等，硒可呈替代亚硒酸钠或除了亚硒酸钠以外的其它形式提供，例如亚硒酸，其它抗氧化剂可替代L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯或除了L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯以外使用，例如L-抗坏血酸，其它表面活性剂可替代聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯或除了聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯以外使用，例如Pluronic F-68和/或Pluronic F-127，其它基础培养基可替代DMEM/F12或除了DMEM/F12以外使用，例如MEM、DMEM等，并且所述培养基的组分可例如通过第0天至第5天使用无TGF-β的培养基，并且然后在第5天之后使用含有2ng/mL TGF-β的培养基而随时间变化，而不会不利地影响所述培养基的性能。进一步认识到，其它成分可以适当浓度添加，而不会不利地影响所述培养基的性能，例如脂肪酸、溶血磷脂酸、溶血神经鞘氨酯、鞘氨醇-1-磷酸、其它鞘脂、ROCK抑制剂(包括Y-27632和噻唑维文(thiazovivin))、蛋白质的TGF-β/NODAL家族成员、IL-6、蛋白质的Wnt家族成员等，并且已知促进或抑制具体细胞类型的生长的成分和/或已知促进或抑制具体细胞类型的生长的蛋白质或其它分子的激动剂和/或拮抗剂可以适当浓度添加至所述培养基中，此时其与那些细胞类型一起使用而不会不利地影响所述培养基的性能，例如鞘氨醇-1-磷酸和多能干细胞。本发明同样涉及作为纯化的化合物添加的成分，作为明确混合物的部分添加的成分，作为复合物或不明确混合物的部分添加的成分，例如动物油或植物油，以及通过生物过程(例如调节)添加的成分。所述组分的浓度可不同于将对于本领域的技术人员明显的范围内所列出的值，而不会不利地影响所述培养基的性能。
所述培养基的无动物组分的形式是通过使用所有蛋白质成分的重组形式和所有其它组分的非动物源性形式来产生，包括半合成植物源性胆固醇(Avanti Polar Lipids,Inc.)。
所述培养基的无动物组分的形式是通过使用所有蛋白质成分的重组形式和所有其它组分的非动物源性形式来产生，包括半合成植物源性胆固醇(Avanti Polar Lipids,Inc.)。
[0242] 实施例5转染培养基配制
[0243] 开发培养基来支持细胞的有效转染、重编程以及基因编辑：
[0244] DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。
[0245] 还开发了这种培养基的变化形式以便当与具体转染试剂、具体核酸和具体细胞类型一起使用时提供改进的性能：DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+4.5μg/mL胆固醇+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白，DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+1μM氢化可的松+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白，以及DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+4.5μg/mL胆固醇+1μM氢化可的松+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。
[0246] 在某些实验中添加至细胞培养基中的额外组分的实例(与实例浓度一起列出)包括：15mM HEPES、2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、2μg/mL乙醇胺、10μg/mL脂肪酸、10μg/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)、25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯、1-50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物、200ng/mL B18R以及0.1％Pluronic F-68。
[0247] 针对其中调节所述培养基的某些实验，使用了以下变化形式：
[0248] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+4.5μg/mL胆固醇+10μg/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)+25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+1μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物+0.1％Pluronic F-68+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。
[0249] 针对其中未调节所述培养基的某些实验，使用了以下变化形式。
[0250] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+4.5μg/mL胆固醇+1μM氢化可的松+0-25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。
[0251] 为了制备这些变化形式，通过添加32mM辛酸钠，接着在60C下加热4h，接着在室温下用离子交换树脂(AG501-X8(D))处理6h，接着在室温下用葡聚糖涂布的活性炭(C6241,Sigma-Aldrich Co.LLC.)处理过夜，接着离心、过滤、用无核酸酶的水调节至10％溶液，接着添加至所述培养基的其它组分中来处理所述处理过的人血清白蛋白。关于其中调节所述培养基的某些实验，对照射过的人新生儿成纤维细胞供给者调节所述培养基，持续24h。除非另外注明，否则将细胞涂于纤维连接蛋白涂布的板或纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白涂布的板上。
[0252] 可调节所述培养基的配制来满足所培养的具体细胞类型的需要。此外，在某些情况下，处理过的人血清白蛋白可用其它处理过的白蛋白(例如处理过的牛血清白蛋白)替换，其它谷氨酰胺来源可替代L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺或除了L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺以外使用，例如L-谷氨酰胺，其它缓冲系统可替代HEPES或除了HEPES以外使用，例如磷酸盐、碳酸氢盐等，硒可呈替代亚硒酸钠或除了亚硒酸钠以外的其它形式提供，例如亚硒酸，其它抗氧化剂可替代L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯或除了L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯以外使用，例如L-抗坏血酸，其它表面活性剂可替代聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和/或Pluronic F-68或除了聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和/或Pluronic F-68以外使用，例如Pluronic F-127，其它基础培养基可替代DMEM/F12或除了DMEM/F12以外使用，例如MEM、DMEM等，并且所述培养基的组分可例如通过第0天至第5天使用无TGF-β的培养基，并且然后在第5天之后使用含有2ng/mL TGF-β的培养基而随时间变化。在某些情况下，其它成分可以适当浓度添加，例如脂肪酸、溶血磷脂酸、溶血神经鞘氨酯、鞘氨醇-1-磷酸、其它鞘脂、蛋白质的TGF-β/NODAL家族成员、IL-6、蛋白质的Wnt家族成员等，并且已知促进或抑制具体细胞类型的生长的成分和/或已知促进或抑制具体细胞类型的生长的蛋白质或其它分子的激动剂和/或拮抗剂可以适当浓度添加至所述培养基中，此时其与那些细胞类型一起使用，例如鞘氨醇-1-磷酸和多能干细胞。成分可采用纯化的化合物、明确混合物的部分、复合物或不明确混合物的部分(例如动物油或植物油)的形式，并且可通过生物过程(例如调节)来添加。所述组分的浓度可不同于将对于本领域的技术人员明显的范围内所列出的值。
[0253] 实施例6用合成RNA转染细胞
[0254] 关于6孔板中的转染，2μg RNA和6μL转染试剂(LipofectamineTMRNAiMAX,Life Technologies Corporation)首先分别在复合培养基(Opti- Life Technologies Corporation)中稀释至各60μL总体积。根据转染试剂制造商的说明书，接着混合稀释的RNA和转染试剂并且在室温下孵育15min。然后将复合物添加至培养的细胞中。将介于30μL与
240μL之间的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。接着轻轻振荡板以使复合物分布在整个孔中。将细胞与复合物孵育持续2小时至过夜，接着用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基。放大体积规模用于在24孔板和96孔板中转染。在使用针对Oct4的抗体转染后20-24h，固定细胞并且染色。对细胞核染色并且计数以确定RNA的相对毒性。
240μL之间的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。接着轻轻振荡板以使复合物分布在整个孔中。将细胞与复合物孵育持续2小时至过夜，接着用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基。放大体积规模用于在24孔板和96孔板中转染。在使用针对Oct4的抗体转染后20-24h，固定细胞并且染色。对细胞核染色并且计数以确定RNA的相对毒性。
[0255] 实施例7分析未处理的人血清白蛋白制剂支持核酸转染和RNA重编程的能力
[0256] 在具有或不具有5mg/mL HSA的培养基中培养原代人新生儿成纤维细胞。筛选Cohn Fraction V(A6784,Sigma-Aldrich Co.LLC.)和四种不同的重组HSA制剂(A6608、A7736、A9731和A9986，均来自Sigma-Aldrich Co.LLC.)。细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA转染。虽然未转染的细胞在含有任何HSA制剂的培养基中生长良好，但在转染的孔中，每种HSA制剂产生显著不同的细胞形态和细胞密度，并且没有一种产生指示重编程的形态变化。
[0257] 实施例8产生辛酸盐处理的人血清白蛋白
[0258] 将HSA的10％溶液与22mM氯化钠和16mM辛酸钠(Sigma-Aldrich Co.LLC)预孵育，并且在完全培养基的组装之前在37C下孵育3小时。
[0259] 实施例9使用离子交换色谱法处理人血清白蛋白
[0260] 通过在室温下在轻轻搅拌下将2g HSA溶解于10mL无核酸酶的水中来制备在毕赤酵母(Pichia pastoris)(A7736，Sigma-Aldrich Co.LLC.)中产生的重组HSA的20％溶液。然后通过首先添加1g的混合床去离子树脂(AG 501-X8(D),Bio-Rad Laboratories,Inc.)并且在室温下摇动1h来使所述HSA溶液去离子化。然后将所述HSA溶液倾析至含有5g新鲜树脂的管中，并且在室温下摇动4h。最后，倾析去离子化的HSA溶液，用无核酸酶的水调节至
10％总蛋白质含量，使用0.2μm PES-膜过滤器过滤消毒，并且存储于4C下。
10％总蛋白质含量，使用0.2μm PES-膜过滤器过滤消毒，并且存储于4C下。
[0261] 实施例10分析在含有辛酸盐处理的人血清白蛋白的培养基中培养的细胞的转染效率和存活力
[0262] 在含有根据实施例8和/或实施例9处理的重组HSA或含有处理过的血源性HSA(Bio-Pure HSA,Biological Industries)的培养基中培养原代人新生儿成纤维细胞。在第
0天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染。在第3天拍摄照片。在含有辛酸盐的孔中观察到经历类似于间充质向上皮转化的形态变化的细胞的若干小区域，指示了增加的转染效率。在含有处理过的血源性HSA的样品中观察到类似于间充质向上皮转化的形态变化的许多大区域。在这两种情况下，形态变化为重编程的特征。
0天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染。在第3天拍摄照片。在含有辛酸盐的孔中观察到经历类似于间充质向上皮转化的形态变化的细胞的若干小区域，指示了增加的转染效率。在含有处理过的血源性HSA的样品中观察到类似于间充质向上皮转化的形态变化的许多大区域。在这两种情况下，形态变化为重编程的特征。
[0263] 实施例11使用含有辛酸盐处理的人血清白蛋白的培养基重编程人成纤维细胞[0264] 原代人新生儿成纤维细胞在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中以5000个细胞/孔的密度涂于6孔板中。6小时后，用含有辛酸盐处理的HSA的转染培养基替换所述培养基。在第0天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染。到第5天，孔含有展现出与重编程一致的形态的细胞的若干区域。这个实验不包括使用供给者或免疫抑制剂。
[0265] 实施例12分析在含有离子交换树脂处理的人血清白蛋白的培养基中培养的细胞的转染效率和存活力
[0266] 在第0天开始，原代人新生儿成纤维细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA转染。在第2天拍摄照片。与含有处理过的血源性HSA或离子交换树脂处理的重组HSA的孔相比，在含有未处理的HSA的孔中的细胞展现出低存活力。
[0267] 实施例13使用离子交换树脂处理的人血清白蛋白重编程人成纤维细胞
[0268] 原代人新生儿成纤维细胞在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中以10,000个细胞/孔的密度涂于6孔板中的供给者上。在第0天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染。在第4天执行具有1:20分裂比的传代。在第10天拍摄照片。孔含有展现出与重编程一致的形态的细胞的许多大集落。在暴露于含有未处理的HSA的细胞培养基的孔中没有观察到集落。
[0269] 实施例14不使用供给者或免疫抑制剂重编程人成纤维细胞
[0270] 原代人成纤维细胞在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中以20,000个细胞/孔的密度涂于6孔板中。6小时后，用含有处理过的HSA并且不含有免疫抑制剂的转染培养基替换所述培养基，并且细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染，除了RNA的剂量减少至1μg/孔并且总共执行5次转染。在第7天拍摄照片。早在第5天，展现出与重编程一致的形态的细胞的小集落即变得可见。在第7天，用在照射过的小鼠胚胎成纤维细胞上调节24小时的DMEM/F12+20％KnockoutTM血清替代品(Life Technologies Corporation)+1X非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺替换所述培养基，并且然后用20ng/mL bFGF和10μM Y-
27632补充。早在第8天，具有重编程形态的大集落即变得可见。在第10天挑取集落，并且涂于用基底膜提取物( Human BME Trevigen Inc.)涂布的孔中。细胞快
速生长，并且传代以建立系。建立的系针对多能干细胞标记物Oct4和SSEA4染色呈阳性。重复整个方案，并且获得类似结果。
27632补充。早在第8天，具有重编程形态的大集落即变得可见。在第10天挑取集落，并且涂于用基底膜提取物( Human BME Trevigen Inc.)涂布的孔中。细胞快
速生长，并且传代以建立系。建立的系针对多能干细胞标记物Oct4和SSEA4染色呈阳性。重复整个方案，并且获得类似结果。
[0271] 实施例15来自人皮肤活组织检查组织的细胞的有效、快速衍生化和重编程
[0272] 根据批准的方案，对健康的31岁志愿者执行全层皮穿孔活组织检查。简单地说，通过局部涂敷2.5％利多卡因使左上臂上的皮肤区域麻醉。用70％异丙醇对所述范围消毒，并且使用1.5mm直径穿孔器执行全层皮活组织检查。组织用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)冲洗，并且放在含有250μL TrypLETMSelect CTSTM(Life Technologies Corporation)的1.5mL管TM中，并且在37C下孵育30min。然后将组织转移至含有250μL DMEM/F12-CTS (Life
Technologies Corporation)+5mg/mL胶原酶的1.5mL管中，并且在37C下孵育2h。使用镊子去除表皮，并且以机械方式剥离组织。细胞用DMEM/F12-CTSTM冲洗两次并且涂于24孔板和96孔板的纤维连接蛋白涂布的孔中。还对同一志愿者执行了静脉切开术，并且将静脉血收集于 SSTTM管(Becton,Dickinson and Company)中。根据制造商的方案分离血
TM
清。通过混合DMEM/F12-CTS +2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)+
20％人血清来制备等基因涂板培养基。将来自真皮组织样品的细胞涂于转染培养基或等基因涂板培养基中。2天后，冲洗各孔，并且用转染培养基替换所述培养基。具有成纤维细胞形态的许多细胞附着并且到第2天开始扩增。在第2天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA转染，其中放大所有体积的规模以适应更小的孔。到第5天，观察到具有与重编程一致的形态的细胞的区域。
Technologies Corporation)+5mg/mL胶原酶的1.5mL管中，并且在37C下孵育2h。使用镊子去除表皮，并且以机械方式剥离组织。细胞用DMEM/F12-CTSTM冲洗两次并且涂于24孔板和96孔板的纤维连接蛋白涂布的孔中。还对同一志愿者执行了静脉切开术，并且将静脉血收集于 SSTTM管(Becton,Dickinson and Company)中。根据制造商的方案分离血
TM
清。通过混合DMEM/F12-CTS +2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)+
20％人血清来制备等基因涂板培养基。将来自真皮组织样品的细胞涂于转染培养基或等基因涂板培养基中。2天后，冲洗各孔，并且用转染培养基替换所述培养基。具有成纤维细胞形态的许多细胞附着并且到第2天开始扩增。在第2天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA转染，其中放大所有体积的规模以适应更小的孔。到第5天，观察到具有与重编程一致的形态的细胞的区域。
[0273] 实施例16使用含有非典型核苷酸的合成RNA重编程人成纤维细胞
[0274] 原代人成纤维细胞在转染培养基中以20,000个细胞/孔的密度涂于用重组人纤维连接蛋白和重组人玻璃粘连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，细胞如实施例2中用根据实施例1合成的RNA转染，除了RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔以及第3天2μg/孔。在第4天拍摄照片。在第4天，展现出与重编程一致的形态的细胞的小集落为可见的。
[0275] 实施例17用未调节的转染培养基重编程人成纤维细胞
[0276] 原代人成纤维细胞在转染培养基中以20,000个细胞/孔的密度涂于用重组人纤维连接蛋白和重组人玻璃粘连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，细胞如实施例2中用根据实施例1合成的RNA转染，除了RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔、第3天2μg/孔、第4天2μg/孔以及第5天4μg/孔。早在第5天，展现出与重编程一致的形态的细胞的小集落即变得可见。在第7天，用在照射过的小鼠胚胎成纤维细胞上调节24小时的DMEM/F12+20％KnockoutTM血清替代品(Life Technologies Corporation)+1X非必需氨基酸+2mML-谷氨酰胺替换所述培养基，并且然后用20ng/mL bFGF和10μM Y-27632补充。早在第8天，具有重编程形态的大集落即变得可见。在第10天挑取集落，并且涂于用基底膜提取物( Human BME Trevigen
Inc.)涂布的孔中。细胞快速生长，并且传代以建立系。
Inc.)涂布的孔中。细胞快速生长，并且传代以建立系。
[0277] 实施例18使用含有非典型核苷酸的合成RNA重编程人成纤维细胞
[0278] 原代人新生儿成纤维细胞在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂于用重组人纤维连接蛋白和重组人玻璃粘连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，并且在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，细胞如实施例2中使用含有A、0.5 7dG、0.5 5mU以及5mC的RNA转染，并且RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔、第3天2μg/孔、第
4天2μg/孔以及第5天4μg/孔。早在第5天，展现出与重编程一致的形态的细胞的小集落即变得可见。在第6天，用维持培养基替换所述培养基。将细胞使用针对Oct4的抗体染色。展现出与重编程一致的形态的细胞的Oct4阳性集落在孔中为可见的。
4天2μg/孔以及第5天4μg/孔。早在第5天，展现出与重编程一致的形态的细胞的小集落即变得可见。在第6天，用维持培养基替换所述培养基。将细胞使用针对Oct4的抗体染色。展现出与重编程一致的形态的细胞的Oct4阳性集落在孔中为可见的。
[0279] 实施例19使用合成RNA对原代成人成纤维细胞进行无供给者、无传代、无免疫抑制剂、无调节重编程
[0280] 6孔板的孔在室温下用重组人纤维连接蛋白和重组人玻璃粘连蛋白(在DMEM/F12中1μg/mL、1mL/孔)的混合物涂布1h。原代成人成纤维细胞在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂于经涂布的孔中。细胞维持于37C、5％CO2以及5％O2下。在第二天开始，细胞根据实施例2用根据实施例1合成的RNA每天转染，持续5天。在所述5天中的每一天转染的RNA的总量分别为0.5μg、0.5μg、2μg、2μg以及4μg。由第四次转染开始，所述培养基一天替换两次。在最后一次转染的第二天，所述培养基用补充有10μM Y-27632的转染培养基替换。或者，在每一天转染的RNA的总量分别为0.25μg、0、0.5μg、0.5μg以及0.5μg或分别为0.25μg、0、0.25μg、0.25μg、0.25μg以及0.25μg。在某些实验中，转染培养基每天仅在转染时更换一次。到第4天，具有重编程的形态的细胞的密集集落在每一个转染的孔中可见。
[0281] 实施例20来自成人皮肤活组织检查组织的细胞的有效、快速衍生化和重编程[0282] 根据批准的方案，对健康的31岁志愿者执行全层皮穿孔活组织检查。简单地说，通过局部涂敷2.5％利多卡因使左上臂上的皮肤区域麻醉。用70％异丙醇对所述范围消毒，并且使用1.5mm直径穿孔器执行全层皮活组织检查。组织用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)冲洗，放在含有250μL TrypLE Select CTS(Life Technologies Corporation)的1.5mL管中，并且在37C下孵育30min。然后将组织转移至含有250μL DMEM/F12-CTS(Life Technologies Corporation)+5mg/mL胶原酶的1.5mL管中，并且在37C下孵育2h。使用镊子去除表皮，并且以机械方式剥离组织。细胞在DMEM/F12-CTS中冲洗两次。还对同一志愿者执行了静脉切开术，并且将静脉血收集于Vacutainer SST管(Becton,Dickinson and Company)中。根据制造商的说明书分离血清。通过混合DMEM/F12-CTS+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)+20％人血清来制备等基因涂板培养基。来自真皮组织样品的细胞在等基因涂板培养基中涂于6孔板的纤维连接蛋白涂布的孔中。具有成纤维细胞形态的许多细胞附着并且到第2天开始扩增。细胞扩增并且在Synth-a-Freeze(Life Technologies Corporation)中冷冻。
[0283] 细胞以5,000个细胞/孔的密度传代至6孔板中。第二天，所述培养基用转染培养基替换，并且细胞如实施例2中使用含有A、0.5 7dG、0.4 5mU以及5mC的RNA转染，并且RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔、第3天2μg/孔、第4天2μg/孔以及第5天2μg/孔。某些孔在第6天和第7天接受额外2μg/孔转染。另外，某些孔从第4天开始接受2ng/mL TGF-β1。在第6天，用维持培养基替换所述培养基。在介于第5天与第10天之间，展现出与重编程一致的形态的细胞的集落变得可见。集落快速生长，并且许多展现类似于胚胎干细胞集落的形态的形态。挑取集落并且涂于用重组人纤维连接蛋白和重组人玻璃粘连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，并且在室温下孵育1h)涂布的孔中。细胞快速生长，并且传代以建立系。
[0284] 实施例21通过使用RiboSlice的重复转染进行高效率基因编辑
[0285] 原代人成纤维细胞如实施例19中涂板。第二天，细胞如实施例2中用根据实施例1合成的RNA转染。第二天，一个孔中的细胞第二次进行转染。在第二次转染之后两天，使用突变特异性核酸酶测定来测量基因编辑的效率。
[0286] 实施例22用含有非典型核苷酸的合成RNA和编码修复模板的DNA转染细胞
[0287] 关于6孔板中的转染，1μg编码靶向人APP基因的外显子16的基因编辑蛋白的RNA、1μg含有不存在于靶标细胞中的PstI限制位点的单链修复模板DNA和6μL转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX,Life Technologies Corporation)首先分别在复合培养基(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)中稀释至120μL总体积。根据转染试剂制造商的说明书，接着混合稀释的RNA、修复模板和转染试剂并且在室温下孵育15min。将复合物添加至培养的细胞中。将大约120μL的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。轻轻振荡板以使复合物分布在整个孔中。将细胞与复合物孵育细胞持续4小时至过夜，接着用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基。第二天，所述培养基更换为DMEM+
10％FBS。在转染之后两天，分离并且纯化基因组DNA。将所述APP基因内的区域通过PCR扩增，并且扩增的产物用PstI消化并且通过凝胶电泳分析。
10％FBS。在转染之后两天，分离并且纯化基因组DNA。将所述APP基因内的区域通过PCR扩增，并且扩增的产物用PstI消化并且通过凝胶电泳分析。
[0288] 实施例23体内RiboSlice安全性研究
[0289] 对40只雌性NCr nu/nu小鼠皮下注射在50％Matrigel(BD Biosciences)中的5x 106个MDA-MB-231肿瘤细胞。细胞注射体积为0.2mL/小鼠。在研究开始时小鼠的年龄为8至
12周。进行配对匹配，并且当肿瘤达到100-150mm3的平均尺寸时将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。每天测量体重持续最初5天，并且接着每两周一次测量至研究结束。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000,Life Technologies Corporation)复合的RiboSlice BIRC5-1.2组成。为了制备用于每一组的给药溶液，将308μL复合缓冲液(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)吸移至两个无菌、无RNA酶1.5mL管中的每一者中。将22μLRiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)添加至这两个管中的一者中，并且通过吸移来混合所述管的内容物。22μL媒介物添加至第二个管中。混合所述第二个管的内容物，并且接着转移至第一个管，并且通过吸移与第一个管的内容物混合物以形成复合物。将复合物在室温下孵育10min。在孵育期间，装载注射器。对动物静脉内或肿瘤内以60μL总体积/动物注射1μg RNA/动物的总剂量。给予总计5次治疗，其中每隔一天执行注射。剂量未针对体重加以调节。
追踪动物持续17天。未观察到平均体重的显著降低，证明RiboSlice基因编辑RNA的体内安全性。
12周。进行配对匹配，并且当肿瘤达到100-150mm3的平均尺寸时将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。每天测量体重持续最初5天，并且接着每两周一次测量至研究结束。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000,Life Technologies Corporation)复合的RiboSlice BIRC5-1.2组成。为了制备用于每一组的给药溶液，将308μL复合缓冲液(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)吸移至两个无菌、无RNA酶1.5mL管中的每一者中。将22μLRiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)添加至这两个管中的一者中，并且通过吸移来混合所述管的内容物。22μL媒介物添加至第二个管中。混合所述第二个管的内容物，并且接着转移至第一个管，并且通过吸移与第一个管的内容物混合物以形成复合物。将复合物在室温下孵育10min。在孵育期间，装载注射器。对动物静脉内或肿瘤内以60μL总体积/动物注射1μg RNA/动物的总剂量。给予总计5次治疗，其中每隔一天执行注射。剂量未针对体重加以调节。
追踪动物持续17天。未观察到平均体重的显著降低，证明RiboSlice基因编辑RNA的体内安全性。
[0290] 实施例24筛选用于将核酸递送至细胞的试剂
[0291] 筛选包括聚乙烯亚胺(PEI)、各种商业上基于脂质的转染试剂、基于肽的转染试剂(N-TER,Sigma-Aldrich Co.LLC.)以及数种基于脂质和基于固醇的递送试剂在内的递送试剂的体内转染效率和毒性。递送试剂与RiboSlice BIRC5-1.2复合，并且将复合物递送至培养的HeLa细胞。通过分析在转染后24h的细胞密度来评估毒性。通过分析形态变化来评估转染效率。所测试的试剂展现出广泛范围的毒性和转染效率。含有较高比例的酯键的试剂展现出低于含有较低比例的酯键或不含酯键的试剂的毒性。
[0292] 实施例25高浓度脂质体RiboSlice
[0293] 通过混合在500ng/μL下的1μg RNA与3μL复合培养基(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)和在2.5μL复合培养基下每μg RNA 2.5μL转染试剂来制备高浓度脂质体RiboSlice。接着混合稀释的RNA和转染试剂并且在室温下孵育10min以形成高浓度脂质体RiboSlice。或者，使用含有DOSPA或DOSPER的转染试剂。
[0294] 实施例26体内RiboSlice功效研究-皮下神经胶质瘤模型
[0295] 40只雌性NCr nu/nu小鼠皮下注射1x 107个U-251肿瘤细胞。细胞注射体积为0.2mL/小鼠。在研究开始时小鼠的年龄为8至12周。进行配对匹配，并且当肿瘤达到35-
50mm3的平均尺寸时将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。每天测量体重持续最初
5天，并且接着每两周一次测量至研究结束。每两周进行测径器测量，并且计算肿瘤尺寸。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000,Life Technologies Corporation)复合的RiboSlice BIRC5-2.1组成。为了制备给药溶液，将294μL复合缓冲液(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)吸移至含有196μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)的管中，并且通过吸移来混合所述管的内容物。245μL复合缓冲液吸移至含有245μL媒介物的管中。混合所述第二个管的内容物，并且接着转移至第一个管，并且通过吸移与第一个管的内容物混合物以形成复合物。将复合物在室温下孵育10min。在孵育期间，装载注射器。对动物以20μL或50μL总体积/动物肿瘤内注射2μg或5μg RNA/动物的总剂量。给予总计5次治疗，其中每隔一天执行注射。剂量未针对体重加以调节。追踪动物持续25天。
50mm3的平均尺寸时将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。每天测量体重持续最初
5天，并且接着每两周一次测量至研究结束。每两周进行测径器测量，并且计算肿瘤尺寸。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000,Life Technologies Corporation)复合的RiboSlice BIRC5-2.1组成。为了制备给药溶液，将294μL复合缓冲液(Opti-MEM,Life Technologies Corporation)吸移至含有196μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)的管中，并且通过吸移来混合所述管的内容物。245μL复合缓冲液吸移至含有245μL媒介物的管中。混合所述第二个管的内容物，并且接着转移至第一个管，并且通过吸移与第一个管的内容物混合物以形成复合物。将复合物在室温下孵育10min。在孵育期间，装载注射器。对动物以20μL或50μL总体积/动物肿瘤内注射2μg或5μg RNA/动物的总剂量。给予总计5次治疗，其中每隔一天执行注射。剂量未针对体重加以调节。追踪动物持续25天。
[0296] 实施例27脂质体配制和核酸封装
[0297] 使用以下配方制备脂质体：3.2mg/mL N-(羰基-乙氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-DSPE)、9.6mg/mL完全氢化磷脂酰胆碱、3.2mg/mL胆固醇、2mg/mL硫酸铵以及作为缓冲液的组氨酸。使用氢氧化钠控制pH并且使用蔗糖维持等张性。为了形成脂质体，脂质混合于有机溶剂中，干燥，在搅拌下水合，并且通过经由具有800nm平均孔径的聚碳酸酯过滤器挤压来定尺寸。通过每1μg核酸组合10μg脂质体制剂并且在室温下孵育5分钟来封装核酸。
[0298] 实施例28叶酸靶向的脂质体制剂
[0299] 根据实施例62制备脂质体，除了将0.27mg/mL 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](FA-MPEG5000-DSPE)添加至脂质混合物中。
[0300] 实施例29包含脂质体蛋白编码RNA的疗法
[0301] 根据实施例27或实施例28制备封装根据实施例1合成的编码治疗蛋白的合成RNA的脂质体。所述脂质体通过注射或静脉内输注来施用。
[0302] 实施例30弹性蛋白ivT-RNA模板的产生
[0303] 使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN GmbH)，根据制造商的说明书从新生儿人皮肤成纤维细胞提取总RNA。使用MonsterScriptTM反转录酶(Epicentre Biotechnologies)和以下引物制备编码人弹性蛋白的cDNA：AAAAAAACCGGT TCATTTTCTCTTCCGGCCAC。由cDNA通过使用以下引物对弹性蛋白编码序列(CDS)进行PCR扩增来制备体外转录(ivT)模板：F：AAAAAAGCTAGCATGGCGGGTCTGACG，和R：AAAAAAACCGGTTCATTTTCTCTTCCGGCCAC。PCR产物接着使用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENGmbH)进行纯化并且克隆至含有人β球蛋白(HBB)5'和3'非翻译区和强Kozak序列的载体中。所述载体在RNA合成之前进行扩增，纯化并且线性化。
[0304] 实施例31弹性蛋白RNA的合成
[0305] 使用实施例30的DNA模板和T7高产率RNA合成试剂盒(New England Biolabs,Inc.)，根据制造商的说明书合成编码人弹性蛋白的RNA(表4)。通过琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的样品以评估RNA的质量(图1)。所述RNA接着稀释至200ng/μL并且以1μL/200μg的RNA的浓度添加RNA酶抑制剂(Superase·InTM,Life Technologies Corporation)。在4C下存储RNA溶液。
[0306] 实施例32辛酸盐处理的人血清白蛋白的产生
[0307] 将HSA的10％溶液与16mM辛酸钠(Sigma-Aldrich Co.LLC)预孵育，并且在完全培养基的组装之前在37C下孵育3小时。
[0308] 实施例33用于核酸的体内递送的制剂
[0309] 通过在合适缓冲液(例如，水、DMEM/F12、复合培养基、Opti-MEM等)中组合根据实施例31合成的RNA和根据实施例8、9和/或32处理的人血清白蛋白来制备用于核酸的体内递送的制剂。
[0310] 实施例34通过经由注射器经皮注射处理过的白蛋白和编码弹性蛋白的RNA来增加皮肤中的弹性蛋白产生
[0311] 将实施例33的制剂装载至具有28号0.5英寸针的胰岛素注射器中并且通过表皮递送至患者的真皮中。必要时施用额外剂量。
[0312] 实施例35通过经由电动微针阵列皮内注射处理过的白蛋白和编码弹性蛋白的RNA来增加皮肤中的弹性蛋白产生
[0313] 将实施例33的制剂装载至设定至约0.1mm的穿透深度的电动微针阵列室中。所述微针阵列经由表皮将所述制剂递送至患者的真皮中。
[0314] 实施例36通过经皮注射处理过的白蛋白和编码胶原蛋白的RNA来增加皮肤中的胶原蛋白产生
[0315] 使用编码人I型和/或III型胶原蛋白的RNA制备实施例33的制剂。所述制剂如实施例34或35进行递送。
[0316] 实施例37通过肌肉内注射处理过的白蛋白和编码肌动蛋白的RNA来增加骨骼肌中的肌动蛋白产生
[0317] 使用编码骨骼α肌动蛋白的RNA制备实施例33的制剂。所述制剂经由肌肉内注射递送至患者。
[0318] 实施例38伤口愈合治疗
[0319] 使用编码碱性成纤维细胞生长因子的RNA制备实施例33的制剂。所述制剂如实施例34或35进行递送。
[0320] 实施例39抗疤痕治疗
[0321] 使用编码胶原酶的RNA制备实施例33的制剂。所述制剂如实施例34或35进行递送。
[0322] 实施例40酪氨酸酶ivT-RNA模板的产生
[0323] 使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN GmbH)，根据制造商的说明书从人表皮黑素细胞提取总RNA。使用MonsterScriptTM反转录酶(Epicentre Biotechnologies)制备编码人酪氨酸酶的cDNA。由cDNA通过对酪氨酸酶编码序列(CDS)进行PCR扩增来制备体外转录(ivT)模板。PCR产物接着使用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH)进行纯化并且克隆至含有人β球蛋白(HBB)5'和3'非翻译区和强Kozak序列的载体中。所述载体在RNA合成之前进行扩增，纯化并且线性化。
[0324] 实施例41酪氨酸酶RNA的合成
[0325] 根据实施例1，使用实施例40的DNA模板和T7高产率RNA合成试剂盒(New England Biolabs,Inc.)，根据制造商的说明书合成编码人酪氨酸酶的RNA(表4)。通过琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的样品以评估RNA的质量。将所述RNA接着稀释至1μg/μL。在4C下存储RNA溶液。
[0326] 实施例42辛酸盐处理的人血清白蛋白的产生
[0327] 将HSA的10％溶液与16mM辛酸钠(Sigma-Aldrich Co.LLC)预孵育，并且在完全培养基的组装之前在37C下孵育3小时。
[0328] 实施例43通过经由注射器经皮注射编码酪氨酸酶的RNA来增加皮肤中的黑色素产生
[0329] 将实施例41的RNA装载至注射器中并且在约30秒的过程中递送至健康33岁男性患者的腹侧前臂的真皮中。
[0330] 实施例44通过组合的编码酪氨酸酶的RNA的递送和电穿孔来增加皮肤中的黑色素产生
[0331] 使用电连接至电容器的两电极阵列将实施例43中处理的皮肤区域暴露于介于10V与155V之间的电脉冲并且介于大约10毫秒与大约1秒之间。所述患者在所有电压和穿透深度下均报告刺痛感。所述处理过的区域在24-48小时之后变得更黑(参见图16)。重复所述实验数次，具有类似结果。
[0332] 实施例45通过局部或经皮涂敷编码酪氨酸酶的RNA来增加皮肤中的黑色素产生[0333] 使用每平方厘米一微克或更少的剂量将实施例41的RNA或实施例29的脂质体直接涂敷于皮肤，伴有或不伴有角质层的破坏，或皮内注射。任选地，如实施例44中或使用表面接触贴片施加电场以增强所述RNA的递送。
[0334] 实施例46通过经皮递送编码弹性蛋白的RNA来增加皮肤中的弹性蛋白产生
[0335] 根据实施例1制备编码弹性蛋白的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0336] 实施例47通过经皮递送编码胶原蛋白的RNA来增加皮肤中的胶原蛋白产生
[0337] 根据实施例1制备编码胶原蛋白的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0338] 实施例48包括编码促红细胞生成素或达贝泊汀(Darbepoetin)的RNA的递送的贫血疗法
[0339] 根据实施例1制备编码达贝泊汀α的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0340] 实施例49通过肌肉内递送编码肌动蛋白的RNA来增加骨骼肌中的肌动蛋白产生[0341] 根据实施例1制备编码肌动蛋白的RNA。所述RNA如实施例43、44或45中经由肌肉内注射递送至患者，其中使用或不使用电场。
[0342] 实施例50伤口愈合治疗
[0343] 根据实施例1制备编码碱性成纤维细胞生长因子的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0344] 实施例51抗疤痕治疗
[0345] 根据实施例1制备编码胶原酶的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0346] 实施例52肉毒杆菌毒素的产生
[0347] 根据实施例1制备编码肉毒杆菌毒素的RNA。将所述RNA如实施例43、44或45进行递送。
[0348] 实施例53通过用编码胶原蛋白I的RNA转染来增加皮肤细胞中的胶原蛋白产生[0349] 根据实施例1合成包含人COL1A1基因的编码序列的RNA。将原代人皮肤成纤维细胞涂于24孔板的孔中，并且根据实施例2进行转染。在转染后24小时与72小时之间，固定细胞并且使用靶向胶原蛋白I的抗体进行染色。胶原蛋白的许多细胞外沉积物在转染的孔中可见(图17)。
[0350] 实施例54通过用编码胶原蛋白VII的RNA转染来增加皮肤细胞中的胶原蛋白产生[0351] 根据实施例1合成包含人COL7基因的编码序列的RNA。将原代人皮肤成纤维细胞涂于24孔板的孔中，并且根据实施例2进行转染。在转染后24小时与72小时之间，固定细胞并且使用靶向胶原蛋白VII的抗体进行染色。与未转染的对照组相比，转染的细胞展现出高水平的胶原蛋白VII(图18)。
[0352] 实施例55通过经由注射器经皮注射编码胶原蛋白I或胶原蛋白VII的RNA来增加皮肤中的胶原蛋白产生
[0353] 根据实施例1合成包含人COL1A1基因或人COL7基因的编码序列的RNA。将所述RNA装载至注射器中并且在大约30秒的过程中或如实施例43、44或45中递送至患者的真皮。
[0354] 实施例56通过组合的编码胶原蛋白I或胶原蛋白VII的RNA的递送和电穿孔来增加皮肤中的胶原蛋白产生
[0355] 使用电连接至电源的多电极阵列将实施例55中处理的皮肤区域暴露于介于10V与155V之间的电脉冲并且在大约50微秒与大约1秒之间。
[0356] 等效方案
[0357] 本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文具体描述的具体实施方案的许多等效方案。所述等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。
[0358] 以引用的方式并入
[0359] 本文所引用的所有专利和出版物均由此以引用的方式全文并入。
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