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多孔组织 支架

阅读：820发布：2020-09-27

专利汇可以提供多孔组织支架专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种形成多孔组织材料的方法。，下面是多孔组织支架专利的具体信息内容。

权利要求

1.从包含生物相容性聚合物的液体溶液制造多孔材料的方法，所述方法包括：
a.将所述生物相容性聚合物溶液引入到具有导热表面的绝热容器中；
b.通过将所述容器在冷却装置中冷却到所述生物相容性聚合物的熔点(Tm)至25℃范围内的温度，任选地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分胶凝；
c.通过以下方法经由所述导热表面以受控方式使所述生物相容性聚合物凝胶/溶液冷冻：
(i)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速下降到-10℃与-50℃之间，以便在所述导热表面上形成生物相容性聚合物凝胶/溶液的冷冻薄层；
(ii)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速上升到接近于但仍低于所述生物相容性聚合物的Tm的温度；
(iii)使所述冷却装置的温度逐渐降低，以便诱发从步骤c(i)中形成的所述冷冻薄层引发的冰晶在所述生物相容性聚合物凝胶/溶液中有恒定单向生长率；
d.冷冻干燥步骤c(iii)的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔材料是多孔组织支架。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在冷冻干燥之后，将对应于步骤c(i)中形成的所述冷冻薄层并且不具有柱状孔隙的材料移除。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在冷冻干燥之后，所述多孔材料被交联。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述多孔材料通过包括化学交联的方法被交联。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述多孔材料通过包括脱氢加热交联的方法被交联。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液在使用之前经脱气。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液基本上不含颗粒。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液在使用之前经过滤法灭菌。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液包含重组明胶样蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组明胶样蛋白包含至少一个RGD基序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述重组明胶样蛋白中，RGD基序相对于氨基酸总数目的百分比是至少0.4％，并且如果所述重组明胶样蛋白包含350个或更多氨基酸，那么每个含350个氨基酸的区段含有至少一个RGD基序。
13.根据权利要求11所述的方法，其中在所述重组明胶样蛋白中，RGD基序相对于氨基酸总数目的百分比是至少0.6％。
14.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其提供一种制备多孔组织支架材料的方法，所述方法包含以下步骤：
a.使所述生物相容性聚合物溶解于溶剂或溶剂混合物中；
b.使所述生物相容性聚合物溶液脱气；
c.将所述生物相容性聚合物溶液引入到具有单个导热表面的绝热容器中，任选地添加添加剂；
d.通过将所述容器冷却到所述生物相容性聚合物的熔点Tm至25℃范围内的温度，任选地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分胶凝；
e.通过将所述容器暴露于利用包括至少三个步骤的温度分布的冷却装置使所述生物相容性聚合物在控制冷冻速率的情况下单向冷冻：
(i)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速下降到-10℃与-50℃之间，以便在所述导热表面上形成生物相容性聚合物凝胶/溶液的冷冻薄层；
(ii)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速上升到接近于但仍低于所述生物相容性聚合物的Tm的温度；
(iii)使所述冷却装置的温度逐渐降低，以便诱发从步骤e(i)中形成的所述冷冻薄层引发的冰晶在所述生物相容性聚合物凝胶/溶液中有层状生长；
f.在减压下冷冻干燥步骤e中获得的所述材料；
g.任选地移除对应于步骤e(i)中形成的所述冷冻薄层并且不具有柱状孔隙的材料；和h.使步骤g中获得的所述材料交联。
15.多孔材料，其通过根据权利要求1到14中任一项所述的方法获得，其平均柱状孔隙ECD为100至500微米。
16.根据权利要求15所述的多孔材料，其是多孔组织支架。
17.体外细胞培养系统，其包含根据权利要求16所述的多孔组织支架。
18.可植入生物相容性物品，其包含根据权利要求16所述的多孔组织支架。
19.根据权利要求18所述的可植入生物相容性物品，其用作牙骨填料。
20.根据权利要求18所述的可植入生物相容性物品，其用作多能细胞的微载体。

说明书全文

多孔组织支架

技术领域

[0001] 本发明涉及由生物相容性聚合物的溶液制造多孔材料、尤其是具有独特孔隙几何形状的多孔组织支架的方法，并且涉及由这些支架制造的生物相容性物品。

背景技术

[0002] 生物材料经设计以取代受伤或患病的组织。理想地，它们是具有类似于它们所取代的健康组织的性质的性质的用于组织再生的支架。经设计以覆盖二维表面或填充三维空隙，它们应与愈合并行地逐渐被吸收，以便最终损伤部位变得与周围组织几乎不可辨别。为了实现这些目标，生物材料必须满足若干设计要求：它必须具有足够大的孔隙率，其表面化学和形态必须适合于细胞粘着、增殖和分化；它需要具有适当架构以引导组织再生；并且它应在不再需要支架时允许受控吸收。另外，尽管具有大幅弱化其机械性质的高的总孔隙率，支架必须具有足够的刚度、强度和韧度以在伤口愈合时履行自然组织的功能。目前可用的组织支架包含不同的不可吸收的生物相容性聚合物，例如：聚对苯二甲酸乙二酯；氟化聚合物，例如聚四氟乙烯(PTFE)和膨体PTFE的纤维；和聚氨基甲酸酯。一些可用的组织支架包含可吸收聚合物，例如聚乳酸、透明质酸、胶原蛋白和明胶。然而，其孔隙几何形状范围不是最优的。

[0003] 制备所述三维多孔聚合物支架的典型方法包括：溶剂浇铸和颗粒沥滤技术，该技术包括将聚合物与单晶盐颗粒混合、将混合物干燥、并且然后将经干燥的材料浸渍以使盐颗粒沥滤(A.G.Mikos等人,Polymer,35,1068(1994))；气体成型技术(gas-forming technique)，该技术包括用CO2气体使聚合物膨胀(L.D.Harris等人,J.Biomed.Mater.Res.,42,396(1998))；热诱导相分离技术，该技术包括将含有聚合物的溶剂浸渍于非溶剂中以使得所述聚合物多孔(C.Schugens等人,J.Biomed.Mater.Res.,30,
449(1996))；和冷冻干燥方法，该方法包括将聚合物溶解于溶剂中以制备聚合物溶液、以及然后用液氮冷冻干燥所述聚合物溶液(K.Whang,Polymer,36,837(1995))。热诱导相分离的特殊形式(也称为定向冷冻浇铸)已经获得了迄今最多被定义的多孔组织支架，并且广泛描述于文献(Wegst等人Phil.Trans.R.Soc.A2010,368第2099-2122页)中。这种方法依赖于溶剂(例如水)于分散液中的受控固化，这导致溶剂与所分散的材料之间由于固体溶剂晶体的定向生长而定向相分离。在移除溶剂(例如冷冻干燥)之后，剩下多孔材料。这种方法通过控制冷冻前沿(freeze front)行进穿过所分散的材料的速度而允许对材料的几何形状进行一定控制。包含动物衍生的天然胶原蛋白和弹性蛋白的组织支架材料Remaix和OptiMaix使用美国专利US6,447,701中所述的冷冻浇铸方法来制备。

[0004] 然而，对于许多应用来说，优选的是材料是高度均一的(例如材料密度、孔隙尺寸和孔隙定向(pore orientation)或机械性质在材料各处应具有有限变化)。当前的生物相容性聚合物多孔组织支架缺乏足够的均一性。另外，具有就细胞附着和生长而言提高的特性的优选的定制的生物相容性聚合物经设计以可完全并且分子溶解于含水溶剂或溶剂混合物中。此外，通常理想的是这些生物相容性聚合物经高度纯化并且不含可溶的和不可溶的(微粒)杂质。这种分子溶解的生物相容性聚合物的使用改进了所得多孔支架的均质性。本发明的目标是提供这样一种方法，通过所述方法可以制备包含生物相容性聚合物的高度均一的生物相容性聚合物组织支架；和用这些组织支架制备的物品。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种从包含生物相容性聚合物的液体溶液制造多孔材料的方法，所述方法包括：

[0006] a.将所述生物相容性聚合物溶液引入到具有导热表面的绝热容器中；

[0007] b.通过将所述容器在冷却装置中冷却到样品熔点(Tm)至25℃范围内的温度，任选地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分胶凝；

[0008] c.通过以下方法经由所述导热表面以受控方式使所述生物相容性聚合物凝胶/溶液冷冻：

[0009] (i)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速下降到约-10℃与约-50℃之间，以便在所述导热表面上形成生物相容性聚合物凝胶/溶液的冷冻薄层；

[0010] (ii)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速上升到接近于但仍低于所述Tm的温度；

[0011] (iii)使所述冷却装置的温度逐渐降低，以便诱发从步骤c(i)中形成的所述冷冻层引发的冰晶在所述生物相容性聚合物凝胶/溶液中有恒定单向生长率；和

[0012] d.冷冻干燥步骤c(iii)的产物。

[0013] 优选地，通过本发明的方法制造的多孔材料是多孔组织支架。

[0014] Tm(含水样品熔点)通常接近于0℃，但在添加一些有机溶剂或盐时，它可能显著偏离0℃。如果将有机溶剂和/或盐添加到样品中，导致Tm降低，那么样品熔点可能在0与-10℃之间的范围内，但大部分时间Tm在0与-5℃之间的范围内。

[0015] 通过这种方法制造的多孔组织材料具有均一多孔结构，其中平均当量圆直径(ECD)取决于靶细胞类型和组织类型和位置而在约10到约1000微米之间的范围内，并且具有小的ECD标准偏差(ECDSD)。通过本发明获得的ECDSD的典型值在ECD值的60到20％范围内。优选的ECDSD值是40％或更小。还优选的是通过这种方法制备的多孔材料的柱状多孔结构的平均ECD在约10到约1000微米之间的范围内，并且优选在约100到500微米之间的范围内。

[0016] 通过本发明的方法制造的多孔组织材料在其材料密度、孔隙尺寸和孔隙定向方面相对于现有技术中所述的材料具有改进的均一性。这使得它特别适用于多孔组织支架和生物相容性物品中。

[0017] 一般定义

[0018] 术语“包含/包括”应解释为明确指定所陈述的部分、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其它部分、步骤或组分的存在。

[0019] 除非上下文明确规定存在一个并且仅存在一个要素，否则由不定冠词“一个(a或an)”对要素的提及不排除存在多于一个要素的可能性。不定冠词“一个”因此通常意味着“至少一个”。

[0020] 术语“多孔组织支架”与“多孔支架”可互换地使用，并且在本文中使用时应解释为起到组织细胞被吸引到其上并且可以附着于其上的微环境的作用的生物相容性聚合物的三维分子基体。

[0021] 如本文中所用的生物相容性聚合物意味着任何人工或天然可生物降解的或不可生物降解的聚合物，例如但不限于：胶原蛋白、明胶、壳聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、透明质酸、葡聚糖、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(ε-己内酯)、聚(酸酐)、聚原酸酯、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、聚氨基甲酸酯、聚(丙烯酸)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)共聚物(Pluronic(TM))、其共聚物或其混合物。

[0022] 如本文中所用的术语“均一”和“均一性”应解释为例如但不限于以下的参数的有限变化：孔隙尺寸、(椭圆形)圆形直径、孔隙形状、个别定向孔隙之间的观测角的范围、孔隙的平直度和机械性质(例如但不限于刚度、脆度、可压缩性)。

[0023] 如本文中所用的术语“柱状孔隙”应解释为孔隙内腔近似于圆柱或椭圆柱的孔隙几何形状，其中圆柱定义为这样一个主体，其表面通过距既定线段(该圆柱的轴)固定距离的点形成。由该表面和两个垂直于所述轴的平面封闭的实体也称为圆柱。椭圆柱是其准线是椭圆的圆柱。如本文中所用的垂直于纵向柱状孔隙方向的横截面可以具有圆度是0.5或更大的不规则形状。在一个实施方案中，圆度误差是40或更小。

[0024] 术语圆度(R)提供了孔隙圆形性的量度。正圆形的圆度是1。根据下式由孔隙面积(A)和最大直径(dmax)计算R：

[0025]

[0026] 术语当量圆直径(ECD)定义为不规则形状的孔隙的面积A，其可以用ECD表示。孔隙的ECD与实际直径之间的对应性随孔隙圆度增加而明显改善。ECD由下式给出：

[0027]

[0028] 平均ECD通过计算给定的固定表面区域中每个个别孔隙的孔隙像素并且通过简单数学变换得到每个个别孔隙ECD来测定。然后，测定平均ECD和ECDSD。这些参数在垂直于纵向孔隙方向截取的截面图像中测定。

[0029] 关于描述生物相容性支架材料中孔隙的形状、形式和分布的这些和其它参数的其它细节，参看用于解读聚合组织支架的图像的美国试验与材料协会标准指南(ASTM Standard Guide for Interpreting Images of polymeric Tissue Scaffolds)，名称：F2603-06。“ECD”的定义也可以见于这一标准中。

[0030] 如本文中所用的术语“圆柱孔隙直径”应解释为通过计算给定的固定表面区域中每个个别孔隙的孔隙像素并且通过简单数学变换得到每个个别孔隙ECD来测定的平均孔隙ECD。然后，测定平均ECD和ECDSD。这些参数在垂直于纵向孔隙方向截取的截面图像中测定。

[0031] 如本文中所用的术语“体外培养系统”应解释为任何用于细胞、组织、器官或器官部分离体生长的试剂盒、设备或化合物。

[0032] 如本文中所用的术语“生物相容性物品”应解释为任何用于治疗医疗病况或用于美容矫正的物质，其中所述物质被放在人类或动物的身体之上或之中并且不会引起不良免疫反应。这包括随时间可以降解并且可以由身体吸收的物质。这种物质可以呈任何形式，例如但不限于：绷带、粉末、海绵、止血剂和缝线、任何种类的移植物、可注射颗粒、微球、微载体、凝胶或胶泥(putty)。

[0033] 如本文中所用，“多能的”、“多能性”、“多能细胞”和等效表述是指能够在细胞培养物中增殖并且自我更新、并且分化为多种细胞群体(包括展现多能性质的细胞群体)的细胞，举例来说，多能ES细胞可以产生三种胚胎细胞谱系中的每一种。然而，多能细胞不能产生胚胎外组织，例如胎盘的羊膜、绒毛膜和其它组分，并且可能不能够制造完整生物体，即多能细胞不是“全能的”。多能性可以通过提供具有如下的稳定发育潜能的证据来展现：从单细胞的子代形成所有三种胚胎胚层的衍生物以及在注射到免疫抑制的小鼠中之后产生畸胎瘤。多能性的其它指示性证据包括已知表达于多能细胞中的基因的表达和特征性形态。本发明的多能细胞可以使用本领域技术人员已知的任何方法得到。“多能细胞”包括但不限于：干细胞；诱导多能细胞(iPS细胞)，例如诱导多能干细胞(iPSC)，例如人类诱导多能干细胞(hiPSC)或人类胚胎干细胞(hESC)；孤雌生殖(parthenogenic)细胞等。

[0034] 如本文中所用，“全能的”是指细胞发育为所有类型的细胞(包括胚胎外组织(例如胎盘))并且产生完整生物体(例如小鼠或人类)的能力。

[0035] “自我更新”是指干细胞分裂并且形成更多性质与母体干细胞相同的干细胞、从而使干细胞群体无限期地补充的能力。

[0036] 如本文中所用的术语“颗粒”应解释为具有至少20到50nm的“最小维度尺寸”的不规则或离散的任何形状的固体物质的任何颗粒，这包括微球、任何类型的粒子、任何类型的纤维或细丝(filament)。

[0037] 如本文中所用的术语“不含颗粒”意指溶液基本上不含尺寸大于50nm的颗粒，并且优选地它不含尺寸大于20nm的颗粒。任何颗粒的尺寸都可以通过电子显微镜检查或激光光散射技术(动态(PCS)或静态(SLS))来测定。颗粒的存在可以借助于各种独立方法来检测，所述方法例如：元素映射(EDAX)样品截面以观测特定元素的局部增强密度；或(光学或电子)显微镜检查样品截面以检测嵌入颗粒；或使用特定酶(例如针对胶原蛋白或明胶的胰蛋白酶)以使样品聚合物网络水解直到完成并且使用光散射技术以检测颗粒。

[0038] 术语“冷冻浇铸”和“热诱导相分离”可互换地使用，并且是指通过经由以使得溶剂与所溶解的和所分散的材料分离的方式降低溶液、分散液或溶胶-凝胶的温度来使溶剂在溶液、溶胶-凝胶或分散液内凝固而产生多孔结构的方法。通过用另一方法移除已凝固的溶剂，被溶解材料的多孔结构保留下来。通过控制温度变化在整个分散液、溶液或溶胶-凝胶中耗散的方式，可以调节孔隙的几何形状。当温度梯度在一个方向(也称为冷冻前部行进方向)上施用时，它称为“单向冷冻浇铸”。

[0039] 如本文中所用的术语“垂直的”应解释为与另一线或平面形成约80到110度的角的线或平面。

[0040] 术语“蛋白”或“多肽”或“肽”可互换地使用，并且是指由氨基酸链组成的分子，与具体作用模式、尺寸、三维结构或来源无关。

[0041] 如本文中所用的“明胶”和“明胶样”是指任何明胶，无论是通过传统方法提取还是来源上是重组的或生物合成的；或指具有明胶的至少一个结构特征和/或功能特征的任何分子。所述术语包括在明胶产品中所包含的多于一种多肽的组合物，以及对明胶材料有贡献的个别多肽。因此，如关于本发明所用的术语明胶涵盖包含明胶多肽的明胶材料，以及个别明胶多肽。可以得到明胶的多肽是具有胶原蛋白的至少一个结构特征和/或功能特征的多肽，例如胶原蛋白、原胶原和其它多肽。这样的多肽可以包括含有至少一个胶原蛋白域(Gly-Xaa-Yaa区，其中Xaa和Yaa独立地是任何氨基酸)的胶原蛋白单链或者胶原蛋白同源三聚体或异源三聚体或者其任何片段、衍生物、低聚物、聚合物或亚单位。所述术语具体地涵盖自然界中未发现的工程序列，例如改变的胶原蛋白序列，如通过缺失、添加、取代或其它变化而改变天然存在的胶原蛋白序列得到的序列。所述序列可以由例如合适改变的胶原蛋白多核苷酸构建体获得，如EP0926543、EP1014176、WO01/34646、WO04/085473、EP1894945、WO08/103041、WO08/103044、WO08/103043以及特别是EP0926543和EP1014176的实施例中所述，所述文献在此通过援引加入的方式纳入本文。

[0042] 如本文中所述的“交联剂(cross-linking agent)”是指包含交联子(cross-linker)的组合物。如本文中所用的“交联子”是指能够在有机分子中引入共价的分子内和分子间化学键的反应性化学化合物。附图说明

[0043] 图1展示了用于根据本发明从生物相容性聚合物制造多孔材料的温度/时间分布。

[0044] 图2展示了当需要较小柱状孔隙时用于根据本发明从生物相容性聚合物制造多孔材料的温度/时间。

[0045] 图3展示了一系列可以使用根据本发明的方法用无颗粒重组明胶溶液均一地制备的柱状孔隙尺寸的扫描电子显微镜(SEM)图像。上排是在中心样品部分中侧向/垂直地切割的截面的图像，并且下排从上到下横向/水平地切割2-3mm。

[0046] 图4展示了整个比较实施例3的侧向截面的光学显微照片。样品高度是12mm，并且样品圆形直径是4.5cm。

[0047] 图5展示了在上部样品区域切割的比较实施例3的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0048] 图6展示了在底部样品区域切割的比较实施例3的横向(水平)截面的SEM图像。

[0049] 图7展示了在顶部样品区域切割的比较实施例3的横向(水平)截面的SEM图像。

[0050] 图8展示了本发明实施例1的侧向截面的光学显微照片。样品高度是12mm，样品圆形直径是4.5mm。

[0051] 图9展示了根据本发明实施例1制备的样品的全样品高度的侧向(垂直)截面的SEM图像，其展示了底部的薄致密成核层和从这一层到样品顶部的均一平行孔隙。

[0052] 图10展示了在紧挨着成核层上方的下部区域切割的本发明实施例1的横向(水平)截面的SEM。

[0053] 图11展示了在样品顶部区域切割的本发明实施例1的横向(水平)截面的SEM图像。

[0054] 图12展示了接近于样品顶部切割的比较实施例4的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0055] 图13展示了在接近于样品顶部的区域切割的比较实施例4的横向(水平)截面的SEM图像。

[0056] 图14展示了整个比较实施例5的侧向截面的光学显微照片。样品高度是12mm，并且样品圆形直径是4.5mm。

[0057] 图15展示了接近于样品顶部切割的比较实施例5的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0058] 图16展示了在接近于紧挨着成核层上方的样品底部区域切割的比较实施例5的横向(水平)截面的SEM图像。

[0059] 图17展示了接近于样品顶部切割的比较实施例5的横向(水平)截面的SEM图像。

[0060] 图18展示了整个比较实施例6的侧向截面的光学显微照片。样品高度是12mm，并且样品圆形直径是4.5mm。

[0061] 图19展示了接近于样品顶部切割的比较实施例6的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0062] 图20展示了在接近于紧挨着成核层上方的样品底部区域切割的比较实施例6的横向(水平)截面的SEM图像。

[0063] 图21展示了接近于样品顶部切割的比较实施例6的横向(水平)截面的SEM图像。

[0064] 图22展示了本发明实施例3的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0065] 图23展示了在接近于紧挨着成核层上方的样品底部区域切割的本发明实施例3的横向(水平)截面的SEM图像。

[0066] 图24展示了接近于样品顶部切割的本发明实施例3的横向(水平)截面的SEM图像。

[0067] 图25展示了本发明实施例4的侧向(垂直)截面的SEM图像。

[0068] 图26展示了在接近于紧挨着成核层上方的样品底部区域切割的本发明实施例4的横向(水平)截面的SEM图像。

[0069] 图27展示了接近于样品顶部切割的本发明实施例4的横向(水平)截面的SEM图像。

具体实施方式

[0070] 令人惊讶地发现，通过在冷冻浇铸程序期间使用新的三步骤方法，可制备在于整个多孔支架材料中具有一致柱状孔隙尺寸方面比先前所述的多孔支架材料更均一的多孔组织支架。这一方法在于其至少一侧上导热的容器中进行。所述方法实质上提供了使用超低急冷温度以快速冷却和冷冻整个样品的一小部分以在所述容器的一侧的整个区域上产生薄冷冻样品层。这一冷冻薄层随后充当用于该方法的后续步骤中柱状冰晶的生长的模板冰位点。这一薄致密冷冻层的存在更均一地并且更好地控制了柱状冰晶的后续生长，并且因此更好地控制了留在生物相容性聚合物材料中的孔隙腔体的尺寸、形式和数量密度。这一层的厚度可以通过最优化冷冻容器设计的热性质和几何形状以及步骤c(i)和c(ii)中的冷却和加热速率来最小化。通常的厚度值是0.1到1.5mm，还取决于生物相容性聚合物的类型和其浓度。冷冻/温度控制可以使用本领域技术人员已知的任何合适冷却装置实现。优选地，冷却装置是冷浴。

[0071] 本发明现在将参考图1和2进行描述。

[0072] 图1和2展示了被引入到在冷浴(T0,t0)中的具有单个导热表面的绝热容器中的生物相容性聚合物溶液。可以任选地添加添加剂(例如乙醇、甲醇或乙酸或者其它无毒的或其它可易于移除的化合物)以改变最终冷冻干燥样品的平均孔隙尺寸。

[0073] i.将生物相容性聚合物溶液冷却，并且其至少一部分形成凝胶(1体积百分比或更多，其中凝胶通常占据最接近冷却表面的体积)(T1,t1)。

[0074] 然后使温度快速下降。

[0075] ii.将冷浴在5分钟(t2-t1)内冷却到温度(T2)，并且使生物相容性聚合物凝胶/溶液在容器的导热侧形成生物相容性聚合物溶液的冷冻薄层(T3,t3)。

[0076] iii.然后将冷浴温度在5分钟(t4-t3)内快速升高到温度(T4)，其中T4比T2更接近于Tm但仍低于Tm。

[0077] iv.至少5分钟的从T4到T5的缓慢并且逐渐斜变温度下降的时间(t5-t4)，其中T5低于T4以诱发从已经形成的生物相容性聚合物溶液冷冻层引发的冰晶在生物相容性聚合物溶液或凝胶中有柱状生长，所述冷冻层垂直于所述容器的导热侧。

[0078] 用以获得目标孔隙结构和平均ECD的温度参数T0、T1、T2、T3、T4和T5以及时间参数t1、t2、t3、t4和t5需要针对生物相容性聚合物的每种类型和浓度并且针对任何添加剂的存在而最优化。此外，样品高度需要相对于T4和t4而最优化参数T5和t5。越高的样品将需要越久的温度从T4缓慢斜变到T5的持续时间以完成冷冻过程。

[0079] 多孔材料中使用本发明的方法形成的柱状孔隙与先前所述的材料相比具有优越的均一性和对称性。优选地，将对应于步骤c i中形成的冷冻薄层并且不具有柱状孔隙的材料移除。这一致密底层典型地测量为0.1到2mm厚，但必要时，可以通过最优化冷浴温度分布而减小到小于1mm。具体来说，可优化参数t2-t1、T2、t3-t2、T3、T4和t4-t3。

[0080] 在一个优选实施方案中，温度T2在约负10℃到约负50℃范围内。从T1到T2的冷浴温度下降优选地在3分钟内实现，并且更优选地在少于2分钟内实现。这一温度变化的温度分布可以具有任何形状或形式。这包括线性和非线性分布并且可以经最优化以实现特定的均一孔隙尺寸。

[0081] 在另一优选实施方案中，温度T4是约负4℃，但总是高于温度T3。从T3到T4的冷浴温度升高优选地在2分钟内实现，并且更优选地在少于1分钟内实现。这一温度变化的温度分布可以具有任何形状或形式。这包括线性和非线性分布并且可以经最优化以实现特定的均一平均孔隙尺寸。

[0082] 温度分布T4到T5可以具有任何形状或形式。这包括线性和非线性分布并且可以经最优化以实现特定的均一孔隙尺寸。

[0083] 一般来说，T4设定得越低并且温度下降T4到T5的斜率越大，则孔隙尺寸越小。

[0084] 绝热容器可以具有任何形状或形式，并且可以由任何合适材料制造。导热表面可以由任何合适导热材料(例如金属，如铜和铝)制造，并且所述导热材料包括导热陶瓷和聚合物。

[0085] 优选地，绝热容器是PTFE或特氟隆类塑料，任选地与发泡材料(例如聚氨基甲酸酯或陶瓷泡沫)组合，并且导热表面是金属、特别是良好的热导体(如铝或铜)。

[0086] 优选地，容器是圆柱形、椭圆柱形或圆角矩形，其侧面并且任选地顶侧是绝热的。

[0087] 在步骤d中，可以使用本领域中已知的任何合适冷冻干燥方法。

[0088] 优选地，在冷冻干燥之后，将对应于步骤c(i)中形成的所述薄致密层并且不具有柱状孔隙的材料移除。

[0089] 优选地，通过本发明的方法形成的多孔材料包含多孔材料，其包含基本上不含颗粒的生物相容性聚合物，其具有一种对称的均一柱状多孔结构并且平均孔隙ECD在约10到1000微米之间。更优选地，平均孔隙ECD在约50(优选地100)到500微米之间。

[0090] 优选地，生物相容性聚合物溶液在使用之前经脱气。这可以通过本领域中已知的任何技术进行。优选地，生物相容性聚合物溶液通过将大气压力降低到低于50毫巴持续至少10分钟而脱气。

[0091] 还优选的是生物相容性聚合物溶液基本上不含颗粒。通过使用基本上不含颗粒的生物相容性聚合物分子溶液，可制备不仅在于整个多孔支架材料中具有一致柱状孔隙尺寸方面比先前所述的多孔支架材料更均一、而且由于不含颗粒而在材料密度方面更均一的多孔组织支架。在现有技术中，使用材料的悬浮液或分散液来制备多孔支架(Kuberka等人2002Int J Artif Organs20(1):67-73；Wegst等人Phil.Trans.R.Soc.A2010,368第2099-
2122页；Meghri等人2010JOM62(7):71-75；和美国专利6,447,701)。本发明的发明人已经发现，这些材料中的颗粒不仅导致材料密度方面的变化，而且还导致柱状孔隙的对称性和孔隙尺寸方面的变化。认为这第二种作用是颗粒充当在冷冻浇铸方法期间用于冰形成的成核位点的结果。在本发明中，不含这样的颗粒降低了样品凝胶/溶液的成核温度。这由以下事实示出：生物相容性聚合物分子溶液中的冰形成在比含有颗粒的系统更低的温度下发生。
不含颗粒的生物相容性聚合物溶液中的典型成核温度在-8与-30℃之间，而Schoof等人,
2001,J Biomed Mater Res58(4):352-357显示，胶原蛋白悬浮液在0℃下就冷冻。由于这一较低温度，因此生物相容性聚合物分子溶液中形成的冰晶的后续生长比在含有颗粒的系统中更突然并且更不好控制。然而，本发明的发明人已经令人惊讶地发现，这一问题可以通过在冷冻浇铸程序期间使用本发明的新的三步骤方法来规避。

[0092] 还优选的是生物相容性聚合物溶液在使用之前优选地通过0.45微米过滤器并且更优选地通过0.2微米过滤器而过滤法灭菌。

[0093] 优选在冷冻干燥(在步骤d中)之后，多孔材料被交联。

[0094] 优选地，本发明的方法用以制备多孔组织支架材料，并且在这种情况下，优选使来自步骤d的冷冻干燥材料交联。

[0095] 交联可以使用本领域技术人员已知的任何交联剂和技术。

[0096] 在一个优选实施方案中，多孔材料通过包括化学交联的方法被交联。合适的化学交联剂包括：醛或二醛，例如甲醛和戊二醛；碳化二亚胺；二异氰酸酯；二酮，例如二乙酰基与氯戊烷二酮(diacetyl and chloropentanedion)；双(2-氯乙基脲)、2-羟基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪；US3,288,775中公开的反应性含卤素化合物；US4,063,952和US5,529,892中公开的氨甲酰基吡啶鎓化合物，其中吡啶环带有硫酸酯或烷基硫酸酯基；二乙烯砜等；和S-三嗪衍生物，例如2-羟基-4,6-二氯-s-三嗪。它还包括光活化交联技术。

[0097] 优选的化学交联剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和六亚甲基二异氰酸酯(HMDIC)。

[0098] 在另一优选实施方案中，多孔材料通过包括脱氢加热交联(dehydrothermal cross-linking)的方法被交联。

[0099] 在一优选实施方案中，优选地，生物相容性聚合物是选自聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的合成可生物降解聚合物，或选自壳聚糖、胶原蛋白、明胶、其共聚物或其混合物的天然可生物降解聚合物。在一更优选实施方案中，生物相容性聚合物溶液包含重组明胶样蛋白。

[0100] 重组明胶样蛋白的使用与由动物来源按照常规制造的明胶相比具有医疗益处。天然明胶存在安全性问题，例如对潜在免疫原性(例如抗原性和变应原性)反应的忧虑。此外，不能完全表征、纯化或令人满意地复制天然衍生的明胶混合物在制药界和医疗界中受到持续关注。还存在对于由提取和纯化过程导致的细菌污染和内毒素负荷的其它安全性忧虑。

[0101] 重组技术使得明胶样蛋白设计具有优越特征，例如低免疫原性、改进的细胞附着和受控生物可降解性。EP0926543、EP1014176、WO01/34646、WO2004/085473、EP1894945、WO2008/103041、WO2008/103044、WO2008/103043以及特别是EP0926543和EP1014176的实施例描述了重组明胶和其制造方法，其中使用甲基营养型酵母——特别是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；这些参考文献中公开的重组明胶样蛋白通过援引加入的方式纳入本文。

[0102] 优选的是用于本发明的方法中的生物相容性聚合物溶液包含含有至少一个RGD基序的重组明胶样蛋白。更优选地，生物相容性聚合物溶液包含进一步富集RGD基序的重组明胶样蛋白。在本发明的情况下的富集RGD的明胶描述于WO2004/085473和WO2008/103041中，并且其中公开的富集RGD的明胶通过援引加入的方式纳入本文。

[0103] 优选地，在重组明胶样蛋白中，RGD基序相对于氨基酸总数目的百分比是至少0.4％，并且如果所述重组明胶样蛋白包含350个或更多氨基酸，那么每个含350个氨基酸的区段含有至少一个RGD基序。

[0104] 更优选地，在重组明胶样蛋白中，RGD基序相对于氨基酸总数目的百分比是至少0.6％、尤其至少0.8％、更尤其至少1.0％、特别地至少1.2％并且更特别地至少1.5％。

[0105] 在另一优选实施方案中，重组明胶样蛋白具有降低的羟基脯氨酸残基水平。脯氨酸的羟基化为胶原蛋白中三股螺旋的形成所需，其是通过本发明形成的多孔支架材料的一个不利特征，因为其导致蛋白质类材料的微粒聚集体和纤维或细丝。优选地，在重组明胶样蛋白中，重组明胶样蛋白中少于10％、更优选地少于5％的氨基酸残基是羟基脯氨酸。尤其优选的是，重组明胶样蛋白不含羟基脯氨酸。不含羟基脯氨酸的重组明胶样蛋白的在WO2002/070000中描述的另一益处在于，与天然明胶不同，它们不展示涉及IgE的免疫反应。

[0106] 在另一优选实施方案中，明胶样蛋白经官能化以便增强细胞结合和/或具有最小免疫原性，例如EP1608681和EP1368056中公开的那些明胶样蛋白。官能化重组明胶样蛋白可以经设计以具有改进的细胞结合性质，其在植入之后刺激医疗装置周围的组织的细胞浸润。

[0107] 在另一实施方案中，用于本发明中的重组明胶样蛋白是计算等电点高于5、优选地计算等电点高于6并且最优选地计算等电点高于7的重组明胶样蛋白。

[0108] 在另一实施方案中，用于本发明中的重组明胶样蛋白的分子量是至少20kDa、更优选地25kDa、尤其至少35kDa并且更尤其至少50kDa。

[0109] 优选的是用于本发明中的重组明胶样蛋白的分子量在20kDa到75kDa范围内。

[0110] 在制备包含明胶样蛋白的多孔材料期间，可以使用多于一种形式的明胶。

[0111] 当本发明的方法用于制备多孔组织支架材料时，优选的是所用明胶应是可生物降解的并且因此在刺激/组织再生之后不需要用于其移除的侵袭手术方法。此外，生物可降解性是组织再生中的另一重要刺激因子。重组明胶是否将通过导致天然明胶降解的相同机制而分解的先验并不明显。已知，天然明胶和胶原蛋白在人体内通过蛋白酶并且更特别地是基质金属蛋白酶(MMP)降解。基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性内肽酶。MMP属于称为甲硫氨酸锌蛋白(metzincin)超家族的较大蛋白酶家族。总的来说，它们能够使所有种类的细胞外基质蛋白降解，但它们还可以处理多种生物活性分子。MMP的重要群组是胶原蛋白酶。这些MMP能够将三股螺旋原纤维胶原蛋白降解为独特的3/4和1/4片段。这些胶原蛋白是骨和软骨的主要组分，并且MMP是唯一已知的能够降解胶原蛋白的哺乳动物酶。传统上，胶原蛋白酶是：MMP-1(间质胶原蛋白酶)、MMP-8(中性粒细胞胶原蛋白酶)、MMP-13(胶原蛋白酶3)和MMP-18(胶原蛋白酶4)。MMP的另一重要群组由明胶酶形成。这些MMP的主要底物是IV型胶原蛋白和明胶，并且这些酶通过插入到催化域中的另一域的存在来区分。这一明胶结合区紧挨着锌结合基序之前定位，并且形成不破坏催化域的结构的单独的折叠单位。这一子组的两种成员是：MMP-2(72kDa明胶酶，明胶酶-A)和MMP-9(92kDa明胶酶，明胶酶-B)。然而，国际专利申请WO2008/103045公开了，不包含MMP的已知裂解位点的重组明胶通过人类基质金属蛋白酶1(MMP1)可酶促降解。显然远多于预期类型的重组明胶可以被降解。因此，包含重组明胶的多孔组织支架将展现对于在第一情况下提供细胞支架功能的组合物而言的所需的逐渐生物降解，其中随着所述支架降解其逐渐被自体细胞外基质代替。

[0112] 本发明的优选方面提供了一种制备多孔组织支架材料的方法，其包括一种包括以下步骤的方法：

[0113] a.使所述生物相容性聚合物溶解于溶剂或溶剂混合物中；

[0114] b.使所述生物相容性聚合物溶液脱气；

[0115] c.将所述生物相容性聚合物溶液引入到具有单个导热表面的绝热容器中，任选地添加添加剂；

[0116] d.通过将所述容器冷却到样品Tm至25℃范围内的温度，任选地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分胶凝；

[0117] e.通过将所述容器暴露于利用包括至少三个步骤的温度分布的冷却装置，使所述样品在控制冷冻速率的情况下单向冷冻：

[0118] (i)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速下降到约-10℃与约-50℃之间，以便在所述导热表面上形成生物相容性聚合物凝胶/溶液的冷冻薄层；

[0119] (ii)使所述冷却装置的温度在不超过5分钟内快速上升到接近于但仍低于样品Tm的温度；

[0120] (iii)使所述冷却装置的温度逐渐降低，以便诱发从步骤e(i)中形成的所述冷冻层引发的冰晶在所述生物相容性聚合物凝胶/溶液中有层状生长；

[0121] f.在减压下冷冻干燥步骤e中获得的所述材料；

[0122] g.任选地移除对应于步骤e(i)中形成的所述薄致密层并且不具有柱状孔隙的材料；和

[0123] h.使步骤g中获得的所述材料交联。

[0124] 优选地，在步骤a中，所述溶液基本上不含颗粒。

[0125] 使用根据本发明的方法，能够制备具有孔隙ECD标准偏差ECDSD狭窄的大范围的柱状孔隙的多孔组织支架材料。这通过使用从T4到T3的冷却步骤的温度分布(其控制了冷冻前沿通过生物相容性聚合物溶液的速度)来实现。一般来说，平均柱状孔隙直径随冷冻前沿行进速率的增加而减小。这种调节平均柱状孔隙直径的能力是有利的，因为不同细胞类型需要不同的关于几何形状和机械性质方面的环境。

[0126] 在一个实施方案中，本发明的方法制备这样的多孔组织支架材料，其具有均一柱状多孔结构，并且平均柱状孔隙ECD在约10到约1000微米范围内、优选地在约50到约1000微米范围内并且更优选地在约50到约500微米范围内并且尤其在约100到约500微米范围内。

[0127] 本发明的第二方面提供了一种可通过如在本发明的第一方面所述并且优选的方法获得的多孔材料。

[0128] 优选地，根据本发明的第二方面的材料是多孔组织支架。

[0129] 本发明的第三方面提供了一种体外细胞培养系统，其包含根据本发明的第二方面的多孔组织支架。

[0130] 本发明的第四方面提供了一种可植入生物相容性物品，其包含根据本发明的第二方面的多孔组织支架材料。

[0131] 本发明的第五方面提供了一种可植入生物相容性物品，其包含根据本发明的第二方面的多孔组织支架材料，其用作骨填充材料或骨填料、优选地牙骨填料。

[0132] 本发明的第六方面提供了一种可植入生物相容性物品，其包含根据本发明的第二方面的多孔组织支架材料，其用作细胞——优选地多能细胞——的微载体。

[0133] 本发明将在以下非限制性实施例中更详细地进行解释。

[0134] 实施例

[0135] 一般方法：

[0136] 1.在使生物相容性聚合物溶解之后，将样品溶液在减压下(优选地低于90毫巴持续至少5分钟)脱气。

[0137] 2.然后将样品通过灭菌(0.2微米)注射器过滤器来过滤，并且存放在圆柱形导热的经特氟隆涂布的薄壁铝容器中，其侧面用特氟隆衬套(bush)和特氟隆衬套与铝制侧面之间的绝缘聚合物泡沫绝热。

[0138] 3.任选地使样品在降低的温度T0至T1下、优选地在样品Tm与+25℃之间的温度下胶凝。

[0139] 4.然后通过以下方式使液体或胶凝的样品溶液定向冷冻：

[0140] (a)将样品容器的导热表面的温度快速降低到低零下温度T2(-10至-50℃)以形成冷冻样品薄层，并且

[0141] (b)当冷冻样品薄层覆盖整个导热表面时(T3,t3)，将导热表面的温度增加到所想要的样品冷冻速率所需的零下温度T4。

[0142] (c)使导热表面所经历的温度逐渐降低，其中温度下降速率由所想要的孔隙结构和孔隙尺寸(T4,t4至T5,t5)规定。T-分布T4到T5不一定是线性的但可以由本领域技术人员最优化。

[0143] 将冷冻样品如本领域常见地在真空下干燥以制造干燥的多孔支架。然后使所述支架在不存在水的情况下通过许多常用的试剂(HMDIC、EDC、戊二醛等)之一或方法(在真空条件下加热)交联。

[0144] 比较实施例1

[0145] 这一实施例中所用的基础胶原蛋白悬浮液由市售小牛皮胶原蛋白I型Sigma-Aldrich，产品编号C3511制备。将一定量的所述悬浮液在烧瓶中称重，并且添加水以制造2％(质量百分比)分散液。然后添加HCl以将pH值调节到3.2。根据Schoof,Apel等人2001，应添加乙酸以制造定向孔隙结构。因此，添加2.5重量％乙酸到样品中。这一胶原蛋白制剂是由牛皮肤分离的原纤维的不可溶的I型胶原蛋白。根据Schoof，这一悬浮液是含有低浓度的分子、原纤维和纤维的多分散系统。胶原蛋白聚集体的长度和宽度在大范围内变化。然后，将分散液离心以移除气泡，并且将204克的量存放到冷冻容器中。使样品在冰箱中冷却到2℃后持续2小时，并且然后放在冷浴中-5℃下以允许完全冷冻。

[0146] 结果

[0147] 干燥之后的海绵结构展示定向孔隙。然而，孔隙结构均质性不是很好。

[0148] 比较实施例2

[0149] 将经纯化的重组CBE3明胶(如EP0926543的实施例1或EP1014176的实施例1中所述制备，所述实施例通过援引加入的方式纳入本文)用于样品。乙醇(无水)来自J.T.Baker。将所用水超滤和去离子化至与药物级注射用水(WFI)相同的规格。将溶液经由通过Whatman25AS(PES)注射器过滤器0.2μm使用10ml 鲁尔注射器
(luer syringe)而过滤。用于样品冷冻和干燥的容器是0.1mm厚的聚苯乙烯10cm×10cm×
2cm(2cm＝高度)杯。所用冷冻干燥器是Zirbus3x4x5升华器。将具有Thermo-Electra手持式探头编号80106的AZ8852双输入型K/J/T温度计用于溶液温度测量。使用配备有Olympus 数码相机C-3040ZOOM和DP-Soft V3.2 软件的Olympus SZX12显微镜进行光学海绵检查。使用内部光源或FOSTECTMDCR(DDL)外部光源进行样品照明。将Jeol JSM-6330F场致发射扫描电子显微镜用于产生SEM图像。使用GEM不锈钢剃刀片(未经涂布)手动进行样品切割。

[0150] 样品制备

[0151] 将一定量的重组明胶CBE3称重，并且转移到300ml烧瓶中，并且随后添加热水(50-60℃)以制造4％(质量百分比)浓度。然后将CBE3溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌
30分钟以使明胶完全溶解。在使所述溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。将样品溶液(20.4g)使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器添加到冷冻容器中。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。然后使CBE3溶液在冰箱中冷却到2℃后持续2小时，并且然后放在冷浴中-5℃下。

[0152] 结果

[0153] 样品在至少24小时内保持呈凝胶状态并且不冷冻。在稍微扰动样品之后，样品在扰动位置立即开始冷冻。这显示，根据这种方法实现从底向上的定向冷冻是不可能的。

[0154] 比较实施例3

[0155] 将一定量的CBE3称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(50-60℃)以制造4％(质量百分比)浓度溶液。然后将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在将溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。随后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以隔绝空气中的粉尘并且防止水或乙醇从样品顶部蒸发。

[0156] 将样品溶液通过将其放在冰箱中2℃下至少3小时而胶凝。然后使(预胶凝)样品在恒温循环浴(2到3mm深)中经历-10℃的冷冻条件45分钟直到完全冷冻。然后将冷冻样品在真空下干燥2天。通过脱氢加热(DHT)处理进行的交联用切割成所要尺寸的样品通过将其在真空烘箱中在160℃下在少于2毫巴的压力下加热2天来进行。

[0157] 结果

[0158] 所得孔隙结构呈柱状(参看图4和5)。然而，孔隙尺寸从底部(50微米)到顶部(100微米)存在大的非所希望的差异，也参看图6和7。圆度大于0.5。顶部的平均孔隙ECD是155微米，ECDSD是46微米。

[0159] 比较实施例4

[0160] 将一定量的CBE3称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(50-60℃)以制造4％(质量百分比)溶液。然后将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在使溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。随后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。这时，经由通过0.2微米PES注射器过滤器缓慢添加溶剂来添加0.2g的乙醇(无水)，并且将混合物通过使用吸液管产生液体流来搅拌。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以隔绝空气中的粉尘并且防止水或乙醇从样品顶部蒸发。使样品溶液在设定在2℃下的冰箱中胶凝至少3小时。然后使(预胶凝)样品在恒温循环浴(2到3mm深)中经历-10℃的冷冻条件45分钟直到完全冷冻。然后将冷冻样品在真空下干燥2天。通过脱氢加热(DHT)处理进行的交联用切割成所要尺寸的样品通过将其在真空烘箱中在160℃下在少于2毫巴的压力下加热2天来进行。

[0161] 结果

[0162] 所得孔隙结构在整个样品体积内相当均质，其柱状孔隙具有狭窄尺寸分布以及约350微米的大的平均尺寸(参看图13)。然而，由于恒定温度冷浴，因此孔隙尺寸从底部到顶部存在轻微但仍然非所希望的差异(参看图12)。

[0163] 比较实施例5

[0164] 将一定量的CBE3称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(50-60℃)以制造8％(质量百分比)溶液。然后将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在使溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。随后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。通过0.2微米PES注射器过滤器缓慢添加0.2g的乙醇(无水)，并且将混合物通过使用吸液管“喷射”来搅拌。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以阻止空气中的粉尘沉降以及水或乙醇从样品顶部蒸发。

[0165] 使样品溶液在设定在2℃下的冰箱中胶凝45分钟。然后使(预胶凝)样品在冷浴(2到3mm深)中经历-10℃的冷冻条件45分钟直到完全冷冻。然后将冷冻样品在真空下干燥2天。通过脱氢加热(DHT)处理进行的交联用切割成所要尺寸的样品在真空烘箱中在160℃和少于2毫巴的压力下进行2天。

[0166] 结果

[0167] 所得孔隙结构在整个样品体积内呈柱状，其柱状孔隙具有狭窄尺寸分布以及约350微米的大的平均尺寸(在上半部样品中)。还看到从下部向上部样品体积的柱状孔隙变宽，参看图16和17。相信，这是由于使用恒定冷浴温度代替逐渐温度斜变。因此，随着冷冻前沿移动远离冷却容器，预期局部冷冻温度越来越高，并且由于这个，孔隙变得更大。

[0168] 比较实施例6

[0169] 将一定量的CBE3称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(50-60℃)以制造7.5％(质量百分比)溶液。然后将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在使溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。然后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以隔绝空气中的粉尘并且防止水或乙醇从样品顶部蒸发。通过放在冰箱中2℃下1天来使样品溶液胶凝。然后将样品放在设定在18℃下的冷浴中，并且启动泵A，在充分混合下将非常冷(-72±2℃)的液体(乙醇)以使得冷浴温度以22℃/min速率下降直到冷浴温度达到-52℃的速率泵送到冷浴中。在这一T斜变期间，冰形成的第一次出现在-16℃的冷浴温度下观测到。在
10分钟内，样品体积完全冷冻。然后将冷冻样品在真空下干燥4天。通过脱氢加热(DHT)处理进行的交联通过将样品切割成所要尺寸并且然后放在真空烘箱中在160℃和少于2毫巴的压力下2天来进行。

[0170] 结果

[0171] 所得孔隙结构在整个样品体积内呈柱状，其柱状孔隙具有狭窄尺寸分布(参看图18和19)并且约20微米的非常小的平均尺寸(在下部样品区中)(参看图20)。然而，孔隙尺寸从顶部到底部仍然存在非所希望的差异(比较图20和21)。

[0172] 本发明实施例1

[0173] 将一定量的CBE3称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(50-60℃)以制造7.5％(质量百分比)溶液。然后将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在使溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。随后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。这时，经由通过0.2微米PES注射器过滤器缓慢添加溶剂来添加0.2g的乙醇(无水)，并且将混合物通过使用吸液管“喷射”来搅拌。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以隔绝空气中的粉尘并且防止水或乙醇从样品顶部蒸发。

[0174] 使样品溶液在冷浴中10℃下胶凝20分钟。然后通过以下方式使冷浴快速冷却：在充分混合下将非常冷(-72±2℃)的液体(乙醇)以使得冷浴温度以28℃/min速率下降直到温度达到-30℃的速率泵送到冷浴中。在这一T斜变期间，冰形成的第一次出现在-25℃的冷浴温度下观测到。随后，停止冷液体泵A，并且冷浴温度在完全接触样品容器以开始覆盖有冷冻样品层所需的时间内保持相当恒定。在完全覆盖后立即以使得冷浴温度以约100℃/分钟速率增加到-4℃的速率启动温(+40℃)的液体(乙醇)泵B。一旦冷浴温度达到-4℃，就停止泵B，并且以使得冷浴温度以0.1℃/min速率降低直到完整样品体积冷冻的非常慢的速率启动泵A。

[0175] 然后将冷冻样品在真空下干燥2天。脱氢加热(DHT)交联用切割成所要尺寸的样品通过在真空烘箱中在160℃下在少于2毫巴的压力下加热2天来进行。

[0176] 结果

[0177] 所得孔隙结构在整个样品体积内非常均质，其柱状孔隙具有狭窄尺寸分布以及约350微米的大的平均尺寸。与比较实施例6(图20和21)不同，下部样品区中的孔隙结构非常类似于上部样品区中的结构(图10和11)。孔隙的圆度高于0.5，为优选的。致密成核底层(参看图8和9)可以随意进行切割和舍弃。这一实施例的平均孔隙ECD是300微米，ECDSD是90微米。

[0178] 本发明实施例2

[0179] 将一定量的去离子骨-石灰明胶称重，转移到300ml烧瓶中，并且随后添加热水(50-60℃)以制造7.5％(质量百分比)溶液。将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌30分钟以使明胶完全溶解。在将溶液冷却到室温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。注意，每当观测到或预期有过度沸腾时通过手动控制真空而使得不发生这种现象。随后将溶液使用注射器和0.2微米PES注射器过滤器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。通过0.2微米PES注射器过滤器缓慢添加0.2g的乙醇(无水)，并且将混合物通过使用吸液管“喷射”来搅拌。注意移除在填充期间或之后出现在样品中的所有表面粘附气泡。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以防止空气中粉尘的污染以及水或乙醇从样品顶部蒸发。使样品溶液在冷浴中10℃下胶凝20分钟。然后通过以下方式使冷浴快速冷却：在充分混合下将非常冷(-72±2℃)的液体(乙醇)以使得冷浴温度以28℃/分钟速率下降直到冷浴温度达到-30℃的速率泵送到冷浴中。在这一T斜变期间，冰形成的第一次出现在-25℃的冷浴温度下观测到。随后，停止冷液体泵A，并且冷浴温度在完全接触样品容器以开始覆盖有冷冻样品层所需的时间内保持相当恒定。在完全覆盖后立即以使得冷浴温度以约100℃/分钟速率增加到-4℃的速率启动温(+40℃)的液体(乙醇)泵B。一旦冷浴温度达到所要的-4℃，就停止泵B，并且以使得冷浴温度以0.1℃/分钟速率降低直到完整样品体积冷冻的非常慢的速率启动泵A。

[0180] 结果

[0181] 所得孔隙结构类似于本发明实施例1。它在整个样品体积内非常均质，其柱状孔隙具有狭窄尺寸分布以及约350微米的大的平均尺寸。下部样品区中的孔隙结构非常类似于上部样品中的结构。孔隙的圆度大于0.5，为优选的。致密成核底层可以随意进行切割和舍弃。

[0182] 本发明实施例3

[0183] 将一定量的κ-角叉菜胶称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(约70℃)以制造4.0％(质量百分比)溶液。将溶液用磁力搅拌器在70℃下于热浴中搅拌1小时以使生物相容性聚合物完全溶解。在使溶液保温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。随后将溶液使用注射器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。注意一旦有任何气泡沉积在冷冻容器中就将其从溶液中移除。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以防止空气中粉尘的污染以及水或乙醇从样品顶部蒸发。使样品溶液在冰箱中2℃下胶凝2小时，并且随后将样品安置在冷浴中达到几毫米的深度。然后通过以下方式使冷浴温度快速降低：在充分混合下将非常冷(-73±3℃)的液体(乙醇)以使得冷浴温度以20到100℃/分钟中间的速率下降直到冷浴温度达到-30至-40℃的速率泵送到冷浴中。在这一T斜变期间，冰形成的第一次出现在-20到-30℃的冷浴温度下观测到。在样品底部含有覆盖全部冷冻容器底部的薄冰层之后立即以使得冷浴温度以约100℃/分钟速率增加的高速率启动温(+50℃)的液体(乙醇)泵B。一旦冷浴温度达到所要的-4℃，就停止泵B，并且以使得冷浴温度以约0.5℃/分钟速率降低直到完整样品体积冷冻的非常慢的速率启动泵A。

[0184] 结果

[0185] 所得孔隙结构类似于本发明实施例1。它在整个样品体积内非常均质，其孔隙具有狭窄尺寸分布以及500到800微米的大的平均尺寸。下部样品区中的孔隙结构非常类似于上部样品中的结构。孔隙的圆度大过0.5，为优选的。这一实施例的平均孔隙ECD是450微米，ECDSD是200微米。致密成核底层厚度小于半毫米，并且可以随意进行切割和舍弃。参看图22、23和24。

[0186] 本发明实施例4

[0187] 将一定量的来自虾壳的壳聚糖称重，转移到300ml烧瓶中，并且添加热水(约50℃)以制造7.5％(质量百分比)溶液。将溶液用磁力搅拌器在50℃下于热浴中搅拌1小时以使生物相容性聚合物完全溶解。在使溶液保温的同时，使其在20到90毫巴的真空下脱气15分钟。随后将溶液使用注射器以20.4克的等分试样添加到冷冻容器中。注意一旦有任何气泡沉积在冷冻容器中就将其从溶液中移除。对于所有样品来说，将PE箔用作覆盖物以防止空气中粉尘的污染以及水或乙醇从样品顶部蒸发。使样品溶液在冰箱中2℃下胶凝2小时，并且随后将样品安置在冷浴中达到几毫米的深度。然后通过以下方式使冷浴温度快速降低：在充分混合下将非常冷(-73±3℃)的液体(乙醇)以使得冷浴温度以20到100℃/分钟中间的速率下降直到冷浴温度达到-30至-40℃的速率泵送到冷浴中。在这一T斜变期间，冰形成的第一次出现在-20到-30℃的冷浴温度下观测到。一旦薄冰层覆盖容器的全部冷冻表面，就以使得冷浴温度以约100℃/分钟速率增加的高的速率启动温(+50℃)液体(乙醇)泵B。当冷浴温度达到所要温度(-4℃)时，停止泵B，并且以使得冷浴温度以约0.1℃/分钟速率降低直到完整样品体积冷冻的非常慢的速率启动泵A。

[0188] 结果

[0189] 所得孔隙结构在整个样品体积内非常均质，其具有拉伸的孔隙形状和狭窄尺寸分布。平均孔隙尺寸是约100微米。下部样品区中的孔隙结构非常类似于上部样品中的结构。这一实施例的平均孔隙ECD是60微米，ECDSD是27微米。致密成核底层厚度是约半毫米，并且可以随意进行切割和舍弃。参看图25、26和27。

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