局部施用鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)以治疗和预防真菌感染
阅读：221发布：2020-06-04
专利汇可以提供局部施用鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)以治疗和预防真菌感染专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含针对至少两种不同 真菌 之IgY 抗体 的组合物，所述组合物在制备药物尤其是用于 预防 和/或 治疗 所有类型真菌感染的药物中的用途，所述真菌感染例如由属于假丝 酵母 属(Candida genus)或者曲霉属(Aspergillus genus)的 生物 (尤其是对抗真菌剂较不敏感的真菌)引起的 疾病 ，还涉及使用IgY抗体的诊断方法。此外，本发明涉及用至少两种不同的假丝酵母属或者曲霉属真菌物种对 鸟 类进行免疫接种，以及诊断真菌的方法。本发明还涉及治疗和/或预防真菌感染的新方法，尤其是对抗真菌剂的敏感性降低或有抗性的真菌的感染。该方法既安全又有效。其通过使用针对真菌(特别是对抗真菌剂的敏感性降低或有抗性的假丝酵母物种)的IgY来实现。已经通过用一种或多种真菌作为 抗原 超免疫鸟类以刺激产生针对这些真菌的免疫球蛋白(IgY)，从而获得了所述特异性IgY。本发明还涉及来自含有免疫球蛋白或其 片段 的鸟卵的药物产品，其可以与其它制剂、营养剂或药物组合，从而同时、分别或依次用于预防或治疗新生儿中的胃肠道感染。，下面是局部施用鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)以治疗和预防真菌感染专利的具体信息内容。
1.包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物，所述真菌选自：白假丝酵母(Candida albicans)、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、梅林假丝酵母(Candida milleri)、嗜油假丝酵母(Candida oleophila)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosi)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和产朊假丝酵母(Candida utilis)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、灰绿曲霉群(Aspergillus glaucus group)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述至少两种物种选自：白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母。
3.根据权利要求1-2中任一项的组合物，其中所述物种之一是白假丝酵母。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述抗体是多克隆、单克隆、人源化多克隆、人源化单克隆的，或者这些抗体的抗原结合片段，或其混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其还包含可药用载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、运载体、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂、营养剂例如人乳或其替代品、功能性食品、益生菌以及无害并且不被IgY抗体所针对的细菌。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述细菌是益生菌，例如乳酸菌，如双歧杆菌，乳杆菌如路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，以及乳球菌。
7.根据权利要求5的组合物，其中所述营养剂是人乳或其替代品。
8.根据权利要求1-7中任一项的组合物，其适用于局部治疗，例如阴道或口部治疗。
9.包含针对至少两种真菌物种的IgY抗体的组合物，所述真菌选自白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉，所述组合物用于制备药物。
10.包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物，所述真菌选自白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉，所述组合物用于制备预防和/或治疗由真菌所致疾病的药物，所述真菌例如属于假丝酵母属或曲霉属的生物，尤其是对抗真菌剂较不敏感的真菌。
11.根据权利要求9的组合物，其中所述疾病选自假丝酵母过度生长造成的疾病，其选自腺体和器官功能障碍，例如肾上腺和甲状腺功能障碍、手足冷、糖尿病、低血糖、甲状腺机能减退、阳痿、体温低；胃肠功能障碍例如口臭、胃气胀、舌垢(鹅口疮)、便秘、腹泻、口干、气胀、胃灼热、消化不良、肠易激综合征、肥胖症和/或体重过度减轻；心理性和变应性功能障碍例如痤疮、视力模糊、支气管炎(复发性)、灼烧感或刺痛、化学敏感、胸痛、咳嗽、耳朵痛、枯草热、头痛、荨麻疹、肌肉痛、疼痛、无力和紧张、鼻塞、头部紧张、麻木、疼痛、肿大、关节僵硬、呼吸短促、鼻窦炎、喉咙痛；情绪性和精神性功能障碍，其选自ADD、ADHD、焦虑、抑郁、定向障碍、困倦、疲劳、不真实感、情绪不稳、活动过度、无法集中注意力、失眠、易怒、无精力、精神混乱、MS、神经质、记忆力差；皮肤功能障碍例如痤疮、肛门发痒、足癣、头皮屑、皮炎、尿疹、皮肤干燥、湿疹、过度排汗、面部皮疹、甲真菌感染、荨麻疹、脓疱病、股癣、狼疮、牛皮癣、刺痛和麻木；生殖泌尿功能障碍，选自膀胱感染(复发性)、排尿灼烧感、痛性痉挛、膀胱炎、子宫内膜异位(月经不规律或月经痛)、液体驻留(水肿)、尿频、阳痿、不育、丧失性快感、月经不调、性交痛、PMS、前列腺炎、复发性酵母性阴道炎、阴道灼烧感、发痒或有排出物。
12.根据权利要求11的组合物，其中由曲霉属造成的疾病是曲霉病，例如例如变应性支气管肺曲霉病、肺曲霉肿和侵入性曲霉病以及曲霉属细菌在呼吸道定植。
13.至少两种不同真菌用于免疫鸟类的用途，所述真菌选自白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉。
14.治疗由属于假丝酵母属和/或曲霉属的生物所致疾病的方法，其中向有此需要的个体施用包含针对至少两种真菌的IgY抗体的组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述个体是哺乳动物.
16.根据权利要求15的方法，其中所述个体是人。
17.一种真菌疾病的诊断方法，其特征在于用包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物来测试来自个体的血液或组织，所述真菌选自白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉，结合反应是存在该IgY抗体所针对真菌的指示。
局部施用鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)以治疗和预防真菌感染
技术领域
[0001] 本发明涉及包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物，所述组合物在制备药物尤其是用于预防和/或治疗所有类型真菌感染的药物中的用途，所述真菌感染例如由属于假丝酵母属(Candida)或者曲霉属(Aspergillus)的生物(尤其是对抗真菌剂较不敏感的真菌)引起的疾病。还涉及用至少两种不同的真菌物种对鸟类进行免疫接种。
[0002] 本发明还涉及使用IgY抗体在任何患有所有种类真菌感染(例如假丝酵母物种、曲霉物种等)的人体中预防或治疗此类疾病的方法以及诊断方法。此外，其还涉及真菌的诊断方法。
背景技术
[0003] 真菌感染可能是反复发作且严重的，对于一些患者来说危及生命。例如患有APS1的患者，用皮质类固醇或者免疫抑制剂治疗的患者，免疫系统不成熟的新生儿和/或早产儿，患有暂时免疫缺陷以及免疫缺陷疾病例如先天性免疫缺陷和AIDS的患者，免疫系统能力下降的中老年患者，用抗生素治疗的患者，等等。有效的免疫系统对于对抗感染来说是至关重要的。在新生儿中免疫球蛋白的产生非常不成熟。他们不得不完全依赖于通过胎盘从母亲输送到他们体内的免疫球蛋白，并且在怀孕的第32周之前没有免疫球蛋白输送。在癌症和AIDS患者中以及在用免疫抑制剂治疗的患者中，免疫系统被严重破坏。真菌感染在用抗生素治疗的患者中非常常见，因为他们胃肠道、呼吸道以及阴道中的正常菌群被扰乱，因此他们针对细菌和真菌的天然屏障被破坏。抗生素的使用改变了这一天然屏障，意味着真菌可以自由地进入上皮膜。这些已经损坏的上皮中的真菌感染非常难于用抗真菌剂治疗。
[0004] 目前已有的唯一治疗真菌感染的方法是使用抗真菌剂。用抗真菌剂治疗有很多缺点。最让人担忧的是一些真菌很快开始对这些药物有抗性。因此，重复使用抗真菌剂是不理想的。抗真菌剂往往与免疫抑制药物联用，并且经常有很大的毒性，尤其对肾和骨髓。新生儿与较大的儿童和成年人相比对这些毒效应更敏感。
[0005] 人对任何感染的天然应答是产生针对全身感染的IgG类抗体以及针对粘膜感染的分泌性IgA，所述粘膜包括口腔、消化道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜。当免疫系统不能产生足量的或特定类型的抗体时，能够在这些患者的治疗和预防中使用外源免疫球蛋白是一个有吸引力的替代方案。
[0006] 大量多克隆抗体的常规外部来源主要来自于用特定微生物免疫哺乳动物后该哺乳动物的血清。IgG抗体的产生需要大量哺乳动物，其不得不被重复免疫和取血。多克隆抗体本身具有免疫原性。因此，它们引发针对它们自身的抗IgG抗体，这会造成它们活性的损失。所以，它们不适于长期用于人体。
[0007] 本专利的新想法是从经免疫的鸡中产生多克隆抗体。来自鸡的免疫球蛋白(IgY)相比于哺乳动物IgG具有一些优点。因此，使用IgG还有伦理学和动物保护方面的反对意见。经口施用的IgY不引发任何抗IgY抗体。因此IgY即使在长期使用后也不会损失活性。
[0008] 考虑到与现有技术中治疗和预防患者(其易感于复发的、严重的甚至危及生命的此类感染)中真菌感染的方法相关的缺点，需要新的改进方法来治疗和预防这样的感染。
发明内容
[0009] 本发明涉及包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物，所述组合物在制备药物尤其是用于预防和/或治疗所有类型真菌感染的药物中的用途，所述真菌感染例如由属于假丝酵母属或者曲霉属的生物(尤其是对抗真菌剂较不敏感的真菌)引起的疾病，还涉及使用IgY的诊断方法。还涉及用至少两种不同的真菌物种的组合对鸟类进行免疫接种。此外，其还涉及真菌的诊断方法。
[0010] 本发明尤其涉及治疗和预防此类真菌感染的安全且有效的新方法。这通过使用针对两种或更多种真菌(特别是针对白假丝酵母(Candidaalbicans))的IgY来实现，所述IgY获得自鸟类的卵黄，所述鸟类用这些真菌进行超免疫，以刺激产生针对所述真菌的免疫球蛋白(IgY)。
[0011] 治疗所述患者的常规方法是利用抗真菌剂。这一方法具有一些缺陷。本发明人对IgY的大量研究使他们出人意料地发现，来自喂食两种或更多种真菌的鸡的包含IgY的组合物给出了非常有效的禽类IgY，其用于治疗具有真菌感染高风险的患者中的真菌感染，而没有产生抗性真菌的风险。体外试验显示，针对真菌的IgY还为机体提供针对抗真菌剂敏感性降低及甚至有抗性的真菌的保护。之前从未有人考虑过这一可能性。
[0012] 本发明还涉及来自鸟卵的药物产品，其含有免疫球蛋白或其级分，所述产品可与其它制剂或药物组合，以同时、分别或依次用于预防或治疗真菌感染。
[0013] 本发明还涉及包含任何其它营养剂的药用IgY产品，所述营养剂包括人乳或其替代品。本发明还涉及治疗或预防方法，其包括将IgY与任何营养剂一起施用。
[0014] 本发明还涉及包含缓冲剂的药用IgY产品。本发明还涉及治疗或预防方法，其包括将IgY与此类缓冲剂一起施用。
[0015] 本发明还涉及在易感于复发、重度甚至危及生命的所有种类真菌感染的患者中预防或治疗此类真菌感染。所述感染可以是任何由真菌造成的感染，最具创新性的是任何由对抗真菌剂的敏感性降低或有抗性的真菌所造成的感染，优选由假丝酵母物种造成的感染。
[0017] 图1是吸光度相对于抗白假丝酵母抗体稀释度的图，其得自测试针对白假丝酵母、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosi)之活性的ELISA体外检测。
[0018] 图2是吸光度相对于抗光滑假丝酵母抗体稀释度的图，其得自测试针对白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母之活性的ELISA体外检测。
[0019] 图3是吸光度相对于抗克鲁斯假丝酵母抗体稀释度的图，其得自测试针对白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母之活性的ELISA体外检测。
[0020] 图4是吸光度相对于抗近平滑假丝酵母抗体稀释度的图，其得自测试针对白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母之活性的ELISA体外检测。
具体实施方式
[0021] 本发明涉及包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物，所述真菌选自：白假丝酵母、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)、梅林假丝酵母(Candida milleri)、嗜油假丝酵母(Candidaoleophila)、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和产朊假丝酵母(Candida utilis)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、灰绿曲霉群(Aspergillus glaucus group)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。
[0022] 本发明基于以下发现：来源于鸟类(例如免疫接种的鸡)的针对两种或更多种假丝酵母物种或者其它真菌的抗假丝酵母IgY具有出人意料的预防和/或治疗这些真菌感染的能力，即便这些真菌对抗真菌剂的敏感性降低或者甚至具有抗性。
[0023] IgY是对应于哺乳动物IgG的鸟类抗体，例如鸡抗体。IgY由两条轻链和两条重链组成，分子量约为180 000Da。IgY从鸡主动转运到卵以及卵黄，因此卵黄含有高浓度的IgY。
[0024] IgY可来自于任何鸟类，例如鸡形目和非鸡形目的鸟类。鸡形目的例子有火鸡、松鸡、家鸡、鹌鹑和野鸡。非鸡形目鸟类可以是鸭。
[0025] 一个卵黄含有约100-200mg的IgY抗体。大多数人通常每天食用1/2到11/2个蛋，对来自蛋的蛋白质(包括来自蛋的免疫球蛋白(IgY))已获得了耐受。这些患者在用IgY经口治疗时不会有任何变态反应。因此，当用IgY经口治疗这些患者时没有变应性应答的风险。但是，已知对蛋过敏的患者不应使用IgY治疗。2mg IgY级别的剂量可能就足以实现预防或治疗效果。
[0026] 已用微生物免疫的鸡通过产生针对所述微生物的特异性多克隆抗体来进行应答。所述抗体可从卵黄中纯化。一些体外研究显示，可以用IgY预防细菌、病毒和真菌感染。许多研究也显示，在动物中使用经口施用特异性IgY成功地治疗细菌、病毒和真菌感染。但是，没有人指出特异性IgY还可以具有针对抗真菌剂抗性真菌的活性。
[0027] 因为IgY是正常饮食成分，所以在患者中没有毒性反应的风险，除了已知对蛋过敏的人之外。
[0028] 相比于哺乳动物多克隆抗体，IgY和哺乳动物抗体与抗原上的不同表位反应。这使得得到与哺乳动物抗体不同的抗体库。特异性抗体的作用模式与在给定时刻存在的生物体数目相关。应理解，每个微生物上所附着的抗体实体与存在的微生物数目有直接的分子相关性。剂量水平还会涉及所影响组织的总表面积以及生物学参数，其影响“清除(wash out)”率。
[0029] 卵免疫球蛋白被归类为禽类IgY，其类似于哺乳动物分泌性IgA，因此是粘膜上皮环境的天然成分。
[0030] 本发明的目的之一是提供用于预防或治疗真菌感染的来自鸟卵的药物组合物，其包含免疫球蛋白或其级分。
[0031] 如上所述，真菌感染可以归因于多种因素，包括长期暴露于破坏肠微生物菌群正常平衡的抗生素。所述制备物是设计用来重建所述微生物菌群的正常平衡的。根据本发明的制剂还可用作抗真菌剂治疗的替代方案或者补充。
[0032] 根据一个实施方案，本发明包括一种组合物，其包含针对至少两种不同真菌的免疫球蛋白Y(IgY)抗体。所述真菌可选自假丝酵母属和曲霉属。
[0033] 根据一个实施方案，所述组合物可包含针对至少两种、至少三种、至少四种不同真菌的IgY抗体。
[0034] 来自假丝酵母属的合适物种有：白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母。根据一个实施方案，所述组合物可包含针对至少两种、至少三种、至少四种上述假丝酵母物种的IgY抗体。所述组合物可包含2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4和2-3种假丝酵母属物种，例如上述假丝酵母物种。因此，所述组合物可包含针对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12种上述假丝酵母物种的IgY抗体。
[0035] 来自曲霉属的合适物种有导致曲霉病的物种，例如烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉。根据一个实施方案，所述组合物可包含针对至少两种、至少三种、至少四种上述曲霉物种的IgY抗体。所述组合物可包含2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4和2-3种曲霉属物种，例如上述曲霉物种。因此，所述组合物可包含针对2、3、4、5、6、7、8、9和10种上述曲霉物种的IgY抗体。
[0036] 根据一个实施方案，所述组合物可包含针对至少两种、至少三种、至少四种上述曲霉和假丝酵母物种的IgY抗体。所述组合物可包含2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4和2-3种假丝酵母属和曲霉属的物种，例如上述的假丝酵母和曲霉物种。因此，所述组合物可包含针对1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11和12种上述假丝酵母物种并且抗1、2、3、4、5、6、7、8、9和10种上述曲霉物种的IgY抗体。
5、6、7、8、9、10、11和12种上述假丝酵母物种并且抗1、2、3、4、5、6、7、8、9和10种上述曲霉物种的IgY抗体。
[0037] 根据本发明的一个方面，所述物种之一是白假丝酵母。
[0038] 根据本发明的另一个方面，所述至少两种物种选自白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母。因此，所述组合物可包含这些假丝酵母物种中的2种、3种和全部。
[0039] 根据本发明的另一个方面，所述组合物包含白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母中的至少两种(例如2-4种)以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18种其它的上述假丝酵母和曲霉物种，例如1、2、3、4、5、6、7、8种上述的假丝酵母物种和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种上述曲霉物种。
[0040] 根据本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗独特型抗体(抗Id)、人源化抗体和抗体的抗体(其可以可溶形式或结合形式被标记)以及其能够结合抗原的片段，例如缺乏完整抗体Fc片段的Fab和F(ab′)2片段。
[0041] 术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白片段”意为抗体或抗体片段或者抗体前体，其能够结合特定微生物或其片段，从而使其成为非致病性的。
[0042] 多克隆IgY抗体可以通过用目的真菌抗原免疫的鸡来产生，如USP5,367,054以及下文实施例1中所述。
[0043] 表述“单克隆抗体”是本领域公知的术语。可使用经典的克隆和细胞融合技术制备本发明的IgY单克隆抗体。通常，对鸡施用(例如腹膜内注射)目的免疫原(抗原)，例如目的假丝酵母物种真菌的悬液，以诱导免疫应答。可以对鸡进行加强，例如加强三次或四次。提取获得自淋巴器官例如胸腺、法氏囊、淋巴结、骨髓或者脾的淋巴细胞，例如脾细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合，其使用Kohler和Milstein(Nature 256：495-497(1975))以及Harlow和Lane(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，1988)的公知方法。以常规方式克隆所得杂交细胞，例如使用有限稀释，并培养得到的产生所需IgY的克隆。
[0044] 人源化抗体是这样获得的抗体：修饰人的异源抗体(例如小鼠抗体)，从而将其中除H链和L链的CDR(互补性决定区)之外的一级结构替换为人抗体的相应一级结构。产生它们的方法和参考文献例如描述于USP6,645,734。
[0045] 本发明的组合物还可包含可药用载体(carrier)、稀释剂、佐剂、赋形剂、运载体(vehicle)、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂、营养剂(例如人乳或其替代品)、功能性食品、益生菌以及无害并且不被IgY抗体所针对的细菌。
[0046] 当所述免疫球蛋白通过经口途径施用时，优选含有缓冲剂以阻止在低pH值下失活，其可任选地以营养添加剂的形式施用。
[0047] IgY抗体还具有使其在用于经口免疫治疗时优于IgG的生物化学特性：它们既不活化人补体系统，也不与类风湿因子、人抗小鼠IgG抗体(HAMA)或人Fc受体反应。这些全部是已知的细胞激活子和炎症介质。
[0048] 根据本发明的一个基本实施方案，通过将本发明的IgY与任何可药用载体或稀释剂混合，获得药物组合物或药剂。含有IgY的药剂可配制成冷冻干燥的或冻干的粉末、溶液、酊剂、片剂、胶囊剂、油膏剂、霜剂、阴道剂或栓剂。
[0049] 益生菌定义为活的微生物，包括乳杆菌(Lactobacilli)物种、双歧杆菌(Bifidobacterium)物种和酵母，它们可在消化后通过改善肠微生物平衡而对宿主产生有益影响。
[0050] 双歧杆菌也被归类为乳酸菌(LAB)。用作益生菌的双歧杆菌包括：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)以及乳双歧杆菌(Bifiaobacterium lactis)。用作益生菌的特定双歧杆菌菌株包括短双歧杆菌Yakult株(Bifidobacterium breve strainYakult)、短双歧杆菌RO7O(Bifidobacterium breve RO7O)、乳双歧杆菌Bb12(Bifidobacterium lactis Bb12)、长 双歧 杆菌RO23(Bifidobacteriumlongum RO23)、两歧双 歧杆 菌RO71(Bifidobacterium bifidum RO71)、婴 儿 双 歧 杆 菌 RO33(Bifidobacterium infantis RO33)、长双歧杆菌BB536(Bifidobacterium longum BB536)和长双歧杆菌SBT-2928(Bifidobacterium longum SBT-2928)。
[0051] 乳杆菌也被归类为乳酸菌(LAB)。用作益生菌的乳杆菌包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lacctbacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳 杆 菌 (Lactobacillus cellobiosus)、卷 曲 乳 杆 菌 (Lactobacilluscrispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、GG 菌(Lactobacillus GG)( 鼠 李 糖 乳 杆 菌 (Lactobacillusrhamnosus) 或 干 酪乳 杆 菌 鼠 李 糖 亚 种(Lactobacillus casei subspeciesrhamnosus))、加 氏 乳 杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 和 唾 液 乳 杆 菌 (Lactobacillus salivarus)。 植物乳杆菌299v菌株来源于酸面团。植物乳杆菌本身是人来源的。其它益生乳杆
菌菌株有嗜酸乳杆菌BG2FO4(Lactobacillus acidophilus BG2FO4)、嗜酸乳杆菌
INT-9(Lactobacillusacidophilus INT-9)、植物乳杆菌ST31(Lactobacillus plantarum ST31)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌LA1(Lactobacillusjohnsonii LA1)、嗜酸乳杆菌NCFB 1748(Lactobacillus acidophilus NCFB1748)、干酪乳杆菌Shirota(Lactobacillus casei Shirota)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、嗜酸乳杆菌DDS-1(Lactobacillusacidophilus DDS-1)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种
2038型(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus type 2038)、嗜酸乳杆菌SBT-2062(Lactobacillus acidophilus SBT-2062)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、唾液乳杆菌UCC 118(Lactobacillus salivarius UCC 118)和类干酪乳杆菌类干酪亚种F19(Lactobacillus paracasei subsp paracasei F19)。
菌菌株有嗜酸乳杆菌BG2FO4(Lactobacillus acidophilus BG2FO4)、嗜酸乳杆菌
INT-9(Lactobacillusacidophilus INT-9)、植物乳杆菌ST31(Lactobacillus plantarum ST31)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌LA1(Lactobacillusjohnsonii LA1)、嗜酸乳杆菌NCFB 1748(Lactobacillus acidophilus NCFB1748)、干酪乳杆菌Shirota(Lactobacillus casei Shirota)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、嗜酸乳杆菌DDS-1(Lactobacillusacidophilus DDS-1)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种
2038型(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus type 2038)、嗜酸乳杆菌SBT-2062(Lactobacillus acidophilus SBT-2062)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、唾液乳杆菌UCC 118(Lactobacillus salivarius UCC 118)和类干酪乳杆菌类干酪亚种F19(Lactobacillus paracasei subsp paracasei F19)。
[0052] 乳球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。它们也被归类为乳酸菌(LAB)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(以前称为乳酸链球菌(Streptococcus lactis))发现于乳制品中，通常是牛奶变酸的原因。用作益生菌或者正开发用作益生菌的乳球菌包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subspecies cremoris)(乳脂链球菌(Streptococcuscremoris))、乳酸乳球菌乳酸亚种NCDO 712(Lactococcus lactis subspecieslactis NCDO 712)、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI 527(Lactococcus lactissubspecies lactis NIAI 527)、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI
1061(Lactococcuslactis subspecies lactis NIAI 1061)、高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI8W(Lactococcus lactis subspecies lactis biovar diacetylactis NIAI 8W)和高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 13675(Lactococcus lactissubspecies lactis biovar diacetylactis ATCC 13675)。
1061(Lactococcuslactis subspecies lactis NIAI 1061)、高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI8W(Lactococcus lactis subspecies lactis biovar diacetylactis NIAI 8W)和高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 13675(Lactococcus lactissubspecies lactis biovar diacetylactis ATCC 13675)。
[0053] 酿酒酵母属于酵母类。主要的益生菌酵母有布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)。布拉氏酵母也称为酿酒酵母Hansen CBS5296(Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5296)和S.boulardii。布拉氏酵母通常是非致病酵母。布拉氏酵母已用于治疗与抗生素使用相关的腹泻。
[0054] 乳球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。它们也被归类为乳酸菌(LAB)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(以前称为乳酸链球菌(Streptococcus lactis))发现于乳制品中，通常是牛奶变酸的原因。用作益生菌或者正开发用作益生菌的乳球菌包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subspecies cremoris)(乳脂链球菌(Streptococcuscremoris))、乳酸乳球菌乳酸亚种NCDO 712(Lactococcus lactis subspecieslactis NCDO 712)、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI 527(Lactococcus lactissubspecies lactis NIAI 527)、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI
1061(Lactococcuslactis subspecies lactis NIAI 1061)、高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI8W(Lactococcus lactis subspecies lactis biovar diacetylactis NIAI 8W)和高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 13675(Lactococcus lactissubspecies lactis biovar diacetylactis ATCC 13675)。
1061(Lactococcuslactis subspecies lactis NIAI 1061)、高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI8W(Lactococcus lactis subspecies lactis biovar diacetylactis NIAI 8W)和高产丁二酮乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 13675(Lactococcus lactissubspecies lactis biovar diacetylactis ATCC 13675)。
[0055] 酿酒酵母属于酵母科。主要的益生菌酵母有布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)。布拉氏酵母也称为酿酒酵母Hansen CBS5296(Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5296)和S.boulardii。布拉氏酵母通常是非致病酵母。布拉氏酵母已用于治疗与抗生素使用相关的腹泻。
[0056] 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是革兰氏阳性兼性厌氧菌。它是细胞色素、氧化酶和过氧化氢酶为阴性的生物，该菌不运动、不形成孢子且同型发酵。嗜热链球菌是草绿色(viridans)类型的α溶血物种。其也被归类为乳酸菌(LAB)。嗜热链球菌发现于乳和乳制品中。其为益生菌并用于酸奶的生产。唾液链球菌嗜热亚种1131型是另一种益生菌。
[0057] 上述益生菌可根据本发明使用。根据一个实施方案，使用乳杆菌例如路氏乳杆菌。
[0058] 本发明还涉及包含针对至少两种真菌物种的IgY抗体的组合物及其用于制备药物的用途，所述真菌物种选自：白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉。
[0059] 此外，本发明涉及包含针对至少两种不同真菌的IgY抗体的组合物及其用于制备预防和/或治疗由真菌(例如属于假丝酵母属或曲霉属的生物，尤其是对抗真菌剂较不敏感(即有抗性)的真菌)造成的疾病之药物的用途，所述真菌选自：白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉。
[0060] 此外，本发明涉及治疗由属于假丝酵母属和/或曲霉属的生物所致疾病的方法，其中向有需要的个体施用包含针对至少两种真菌的IgY抗体。所述个体可以是哺乳动物，尤其是人。
[0061] 本发明还涉及用至少两种不同真菌物种的组合来免疫鸟类的方法，所述真菌选自上述假丝酵母和曲霉物种。所有关于鸟类、真菌的类型以及附图中区间和附图中数字的描述适用于本发明的所有不同方面。因此，例如上述的真菌类型以及附图中区间和附图中数字也适用于上述不同类型鸟类的免疫。
[0062] 假丝酵母造成的疾病可以是假丝酵母过度生长造成的疾病，其选自腺体和器官功能障碍，例如肾上腺和甲状腺的功能障碍、手足冷、糖尿病、低血糖、甲状腺机能减退、阳痿、体温低；胃肠功能障碍例如口臭、胃气胀(bloating)、舌垢(鹅口疮)、便秘、腹泻、口干、胀气(gas)、胃灼热、消化不良、肠易激综合征、肥胖症和/或体重过度减轻；心理和变应性功能障碍例如痤疮、视力模糊、支气管炎(复发性)、灼烧感或刺痛、化学敏感、胸痛、咳嗽、耳朵痛、枯草热、头痛、荨麻疹、肌肉痛、疼痛、无力和紧张、鼻塞、头部紧张(head tension)、麻木、疼痛、肿大、关节僵硬、呼吸短促、鼻窦炎、喉咙痛；情绪性和精神性功能障碍，其选自ADD、ADHD、焦虑、抑郁、定向障碍、困倦、疲劳、不真实感、情绪不稳、活动过度、无法集中注意力、失眠、易怒、无精力、精神混乱、MS、神经质、记忆力差；皮肤功能障碍例如痤疮和肛门发痒、足癣、头皮屑、皮炎、尿疹、皮肤干燥、湿疹、过度排汗、面部皮疹、甲真菌感染、荨麻疹、脓疱病、股癣、狼疮、牛皮癣、刺痛和麻木；生殖泌尿功能障碍，选自膀胱感染(复发性)、排尿灼烧感、痛性痉挛、膀胱炎、子宫内膜异位(月经不规则的经期疼痛)、液体驻留(水肿)、尿频、阳痿、不育、丧失性快感、月经不调、性交痛、PMS、前列腺炎、复发性酵母性阴道炎、阴道灼烧感、发痒或有排出物。
[0063] 由曲霉属造成的疾病可以是曲霉病，例如变应性支气管肺曲霉病、肺曲霉肿和侵入性曲霉病，以及来自曲霉属的细菌在呼吸道定植。疾病形式的实例有鼻窦和肺的定植；鼻窦和肺中的中毒、变应性支气管肺曲霉病；肺曲霉肿、侵入性曲霉病-肺曲霉病1；CNS曲霉病、鼻窦鼻曲霉病、骨髓炎、内眼炎、心内膜炎、肾脓肿、皮肤病症(cutaneous)；灼烧感、手术后创伤、耳真菌病、外源性内眼炎、变应性真菌鼻窦炎和尿路曲霉肿。
[0064] 本发明的药物产品还可与常规感染治疗中所用的抗微生物剂类型联用，或者包含后者。
[0065] 根据本发明用于预防或治疗的IgY的产品和方法也可用于暂时性免疫缺陷的患者，例如已成功地用抗假丝酵母IgY治疗暂时性免疫抑制的白血病患者。所述施用涉及经口施用，以预防或治疗由白假丝酵母引起的口腔和咽部的假丝酵母感染。用于预防或治疗口和咽部感染的所述施用类型公开于由相同发明人之前提交的另一个专利申请，而不是本发明主题的一部分。但是，为避免肠或身体其它部分例如阴道的感染，施用抗假丝酵母IgY给免疫抑制患者以从胃肠道中除去假丝酵母的早期研究看起来是有希望的。根据本发明，为了治疗肠感染，需要将抗假丝酵母IgY用营养剂缓冲或与其相组合(如果不是施用给新生儿或者早产儿的话)。因此，本发明还涉及预防或治疗患有暂时性免疫缺陷以及免疫缺陷疾病例如AIDS的患者。
[0066] 此药剂优选与任何其它可药用载体或稀释剂一起经口、在皮肤上外用、直肠内或阴道内或者通过吸入施用。
[0067] “适用于经口施用的制剂”意为其形式适于经口施用给患者的制剂。所述制剂可以离散单元的形式存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的所述活性成分；例如粉剂或颗粒剂；例如水性或非水性液体中的溶液或悬液；或者例如水包油乳液或者油包水乳液。所述活性成分还可以大丸剂(bolus)、药糖剂或糊剂形式存在。此药剂与任何其它可药用载体或稀释剂一起经口、在皮肤上外用、直肠内或阴道内或者通过吸入施用。
[0068] 在另一个实施例中，本发明的所述药剂配制成控制释放或持续释放的制剂。
[0069] 根据本发明的另一个实施例，IgY可以在没有任何常规稀释剂或载体的情况下在营养剂例如人乳或其替代品中施用。
[0070] 在实验中，本发明人发现，以乳液剂形式施用的人乳与IgY的组合保护了IgY并保留其活性。本发明人认为，这是由于IgY与乳形成的乳液。这也可以是乳的缓冲能力的作用，其提高了IgY的寿命。
[0071] 适用于鼻或吸入施用的制剂意为其形式适于鼻或吸入施用给患者的制剂。所述制剂可含有粉剂形式的载体，其具有例如1至500微米的粒径(包括20至500微米之间增量为5微米的粒径，例如30微米，35微米等等)。其中载体是液体的适于作为例如鼻喷雾或鼻滴剂施用的合适制剂包括所述活性成分的水或油溶液。适于喷雾施用的制剂可以根据常规方法制备，可用其它治疗剂递送。吸入治疗通过计量吸入器容易地进行。
[0072] 适于直肠施用的制剂意为其形式适于直肠施用给患者的制剂。所述制剂优选是栓剂的形式，其可通过将可根据本发明使用的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或者栓剂用蜡混合而制得，所述赋形剂或载体在常温下为固体而在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。
[0074] “适于局部或表面施用的制剂”意为其形式适于局部或表面施用给患者的制剂。所述制剂可以是如本领域中普遍已知的局部油膏剂、软膏剂、粉剂、喷雾剂和吸入剂、凝胶剂(基于水或醇)、霜剂的形式，或者合并在贴剂中用于施用的基底中，其允许化合物通过透皮屏障控制释放。当配制成油膏剂时，所述活性成分可以与石蜡或水胶束油膏基底一起使用。
[0075] 在另一个实施方案中，本发明的药剂被配制成控制释放或持续释放的制剂。
[0076] 根据本发明的另一个实施方案，IgY可以在无任何常规稀释剂或载体的情况下在营养剂例如人乳或其替代物中施用。
[0077] 根据年龄、体型、体重、疾病、施用途径、所治疗疾病的诊断以及严重程度，施用的抗体或其片段的量或者给药方案在个体之间将有所不同。本领域技术人员应了解，由医生决定最优的剂量，确定剂量的方法描述于例如由Oslo等编辑的Remington′s Pharmaceutical Science，16.sup.th ed.，1980，Mack Publishing Co.。选择合适剂量抗体的指导可见于有关抗体治疗用途的文献，例如Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等编辑，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，(1985)第22章和303-357页；Smith等，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber等编辑，RavenPress，New York(1977)365-389页。
[0078] 根据上述因素，单独使用的抗体的典型剂量可以是每天1微克/千克至100毫克/千克体重或更多，优选1微克/千克至1毫克/千克。
[0079] 有利地，上文所述用于经口或胃肠外使用的药物组合物被制备成与所述活性成分的剂量相适应的单元剂量药物制剂。此单元剂量制剂包括如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)和栓剂。所含的抗体量通常是约5至约500毫克/剂量单元形式，优选地，尤其是在注射剂形式中含有约5至约100毫克的上述抗体，对于其它形式约为10至250毫克。
[0080] 包含本发明抗体的治疗/预防剂可以经口或胃肠外施用给人或哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。根据待施用的受试者、目标疾病、症状、施用途径等，剂量可有所不同。当胃肠外使用时，一般可以将药剂约0.01至20毫克/千克体重的单剂量施用，优选约0.1至10毫克/千克体重，更优选约0.1至5毫克/千克体重，每天施用1至5次，优选约1至3次。对于经口施用，可施用相应的剂量。当症状非常严重时，可以根据情况增加剂量。
[0081] 合适的24小时剂量可对应于来自免疫鸟类(例如免疫的母鸡或鸡)的0.05-10个卵黄的IgY含量。
[0082] 基于组合物中的IgY总重，本发明的组合物可包含0.1-99重量％，例如0.1-99重量％，0.1-95重量％，0.1-90重量％，0.1-85重量％，0.1-80重量％，0.1-75重量％，0.1-70重量％，0.1-65重量％，0.1-60重量％，0.1-55重量％，0.1-50重量％，0.1-45重量％，0.1-40重量％，0.1-35重量％，0.1-30重量％，0.1-25重量％，0.1-20重量％，0.1-15重量％，0.1-10重量％，0.1-05重量％的任何上述假丝酵母和/或曲霉物种，例如白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑假丝酵母。
[0083] 在实验中，本发明人发现，作为乳液剂施用的人乳与IgY的组合保护了IgY并保留其活性。本发明人认为这是由于IgY和乳形成的乳液。这也可能是乳的缓冲能力的作用，其提高了IgY的半衰期。
[0084] 本发明还涉及真菌疾病的诊断方法，其特征在于用至少一种IgY抗体检测来自个体的血液或组织，结合反应指示该IgY抗体所针对真菌的存在。
[0086] 本文引用的所有参考文献通过引用以整体并入本文。
[0087] 本文使用的表述“包含/包括”应理解为包含但不限于所述项目。
[0088] 现在通过下列非限制性实施例描述本发明。
[0089] 实施例
[0090] 实施例1
[0091] 制备真菌
[0092] 将分离自感染患者的假丝酵母物种用于体外实验中，以证明分离自用真菌抗原超免疫的家鸡的卵免疫球蛋白的预防潜力。
[0093] 将真菌培养于含100ml补充了氨基酸的2％葡萄糖、0.15％酵母氮源、0.5％硫酸铵的500ml培养瓶中。培养瓶在转动培养箱中以200rpm在37摄氏度下摇动24小时。还将真菌培养在用于检测患者样品中假丝酵母定植的假丝酵母培养板上。
[0094] 制备抗假丝酵母IgY免疫球蛋白
[0095] 在盐水中洗涤甲醛杀死的白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母和近平滑7
假丝酵母的悬液并冷冻。使用每种假丝酵母物种免疫独立的鸡组。每只鸡每次免疫使用10个假丝酵母。在胸肌中肌内免疫白色来亨鸡。对免疫来说，将0.5毫升假丝酵母悬液与相同体积的弗氏佐剂混合。初次免疫之后，鸡以3周为间隔接受两次加强免疫。使用特异性针对假丝酵母IgY的ELISA(酶联免疫吸附测定)测定从超免疫的鸡中收集的卵黄，以确定峰值抗体效价。
假丝酵母的悬液并冷冻。使用每种假丝酵母物种免疫独立的鸡组。每只鸡每次免疫使用10个假丝酵母。在胸肌中肌内免疫白色来亨鸡。对免疫来说，将0.5毫升假丝酵母悬液与相同体积的弗氏佐剂混合。初次免疫之后，鸡以3周为间隔接受两次加强免疫。使用特异性针对假丝酵母IgY的ELISA(酶联免疫吸附测定)测定从超免疫的鸡中收集的卵黄，以确定峰值抗体效价。
[0096] 当达到峰值效价时(3次免疫后)，通过将卵白与卵黄分离而收集卵黄。使用水提取方法纯化免疫球蛋白级分(Akita EM，Nakai S.Immunoglobulins from egg yolk：isolation and purification.J Food Scie1992；57：629-634)。简言之，将卵黄与卵白分离，以1∶9的比例用去离子水稀释。在4摄氏度下保存至少6小时之后，过滤含有IgY的悬液，在20摄氏度下冷冻。还通过聚乙二醇法纯化抗体。简言之，将一份卵黄与两份含5％PEG6000的0.9％NaCl混合。在4摄氏度下以2000g离心抗体制备物30分钟。离心之后，向悬液中添加固体PEG6000至终浓度12％。在4摄氏度下以2000g离心混合物30分钟，除去上清液。将含有抗体的沉淀溶于0.9％NaCl，得到纯化状态的蛋白质多克隆免疫球蛋白。
使用0.9％NaCl稀释免疫球蛋白级分至10mg/ml的浓度并冷冻。将此溶液用于评价抗假丝酵母IgY的预防潜力，如下文实施例用抗假丝酵母IgY治疗白细胞过多症儿童中所示的。
使用0.9％NaCl稀释免疫球蛋白级分至10mg/ml的浓度并冷冻。将此溶液用于评价抗假丝酵母IgY的预防潜力，如下文实施例用抗假丝酵母IgY治疗白细胞过多症儿童中所示的。
[0097] 实施例2
[0098] 细胞粘附测定
[0099] 粘附到粘膜上皮细胞被认为是感染的第一阶段。在此实施例中，使用上皮细胞和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(作为细菌的代表)来评价粘附。
[0100] 通过在PBS中离心来洗涤培养24小时的新鲜细胞，将其在PBS中重悬，与含有来自用假单胞菌免疫的鸡卵的IgY或者来自非免疫鸡的IgY(比例为100∶1)或者根本不含IgY的培养基混合，在37摄氏度下孵育2小时。孵育后，通过45gm滤器过滤培养物，以除去任何非粘附的细胞，在PBS中清洗并重悬。
[0101] 通过在400倍下显微镜检查评价粘附，使用分级测微网格来帮助精确计数。粘附率表示为可见地粘附有铜绿假单胞菌的细胞百分比。
[0102] 结果显示，与未处理细菌和用正常卵提取物处理的细菌相比，在细菌用来自经免疫的鸡的免疫球蛋白处理的情况下铜绿假单胞菌对上皮细胞的粘附减少超过50％。
[0103] 上述体外实验证明，从用铜绿假单胞菌抗原超免疫的鸡产所产卵的卵黄囊中提取的纯化免疫球蛋白级分抑制了上皮细胞粘附。这些实验使人们能够得出结论，特异性卵免疫球蛋白可用于预防或治疗上皮细胞中的感染。
[0104] 针对抗真菌剂的敏感性降低或有抗性的真菌之活性的体外测定
[0105] 用于免疫和检测的光滑假丝酵母和克鲁斯假丝酵母具有抗真菌剂的抗性。用以甲醛杀死的白假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母(与免疫所用相同的菌株，在0.1M NaHCO3，pH 9.5中1∶1000稀释)的悬液包被96孔微滴定板(F96 Polysorp，Nunc，Roskilde，Denmark)，在室温下包被2小时或者4摄氏度下过夜。然后，用含有0.05％Tween 20(PBS-T)的0.02M NaH2PO4，0.15M NaCl，pH 7.2(PBS)将孔清洗三遍，在室温下轨道摇床上用125μL/孔的0.1M NaHCO3，pH 9.5中3mg牛血清白蛋白/mL封闭一小时或者在4摄氏度下过夜。如前所述的，在清洗后一式两份地添加在PBS-T中稀释的100μL的每种抗体制备物，将平板在室温下孵育1小时。如上所述再次清洗平板，在室温与在PBS-T中1∶2000稀释的100μL辣根过氧化物酶(HRP)兔抗鸡/火鸡IgG(IgY)(H+L)(Zymed，San Francisco，CA，USA)一起孵育1小时。用100μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Zymed)检测结合的二抗。十分钟后用50μL 1.8M H2SO4停止反应。在微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)上读取450纳米的吸光度。在整个实验中，高于背景ΔA450＞0.05被认为具有显著性。
[0106] ELISA结果(图1-4)显示，针对所有4种菌株的抗体显示出交叉反应性以及对光滑假丝酵母和克鲁斯假丝酵母抗真菌剂抗性菌株的强反应性。
[0107] 用抗真菌IgY治疗患者
[0108] 由真菌造成的感染特别难以根除，并且如果发展成为全身性感染的话会非常危险。
[0109] 在小型临床试验中，使用抗假丝酵母IgY治疗四个患有白血病的儿童，以预防假丝酵母感染。这些患者中没有人出现假丝酵母感染的任何症状，而患有白血病的对照儿童中有四分之三出现假丝酵母感染的症状。
[0110] 本发明不限于上文所述的实施例，其可以在不脱离本发明范围的情况下改变和/或变动。
[0111] 实施例3：IgY提取物的冷冻干燥和浓缩
[0112] 双冷冻干燥
[0113] 提供各含有4ml本发明IgY提取物的20个冷冻干燥瓶。将8.5毫克乳糖添加到其中10个瓶中。将34毫克乳糖添加到剩下10个瓶中。根据标准方案对瓶进行冷冻干燥。
[0114] 干燥之后，将每种乳糖浓度的两个瓶放在一旁，记为“单冷冻干燥”。根据下表将剩余瓶中的产物溶解于蒸馏水。对于每种乳糖浓度(“高”或“低”)：
[0115] 将4ml水添加到其中两个瓶
[0116] 将2ml水添加到其中两个瓶
[0117] 将1ml水添加到其中两个瓶
[0118] 将0.5ml水添加到其中两个瓶
[0119] 在瓶上标记所加水的量(即分别为4、2、1和0.5)。根据标准方案将含有重溶的IgY的16个瓶进行冷冻干燥。结果得到更致密的粉末。所有的溶液均成功地冷冻干燥。
[0120] IgY提取物的浓缩和冷冻干燥
[0121] 通过超滤(来自Pall，Type Centrasette，)浓缩11ml IgY溶液，截留值为30KDa，直至体积为5ml。然后将溶液转移到小管中，分别冻干。得到更致密的粉末。
[0122] 大规模浓缩和冻干
[0123] 将样品(约14l)解冻。在方法开始之前，取10ml的参考样品。首先用深滤器(Sartopure PP2 capsule，0.65μm)过滤样品，然后用除菌滤器过滤(Sartobran P sterile capsule，0.65μm+0.45μm)。在每次过滤步骤后取参考样品。过滤后的体积是13.2l。通过超滤浓缩溶液(截留值30kD)直至体积为约2.8l，对应于浓缩系数为4.7倍。
取超滤流出液和浓缩物的参考样品。
取超滤流出液和浓缩物的参考样品。
[0124] 浓缩之后，使用约2.8l浓缩的IgY提取物进行大规模冷冻干燥。提取物在具有约5毫米柱高度的铝盘上大量冻干。不加入乳糖。冷冻温度：-47℃；冷冻时间：4小时；初次冷冻干燥：温度区间：-45℃至+35℃；时间：26小时；压强190ubar。二次冷冻干燥：温度+30℃；时间：10小时；最终真空度低于1ubar。终产物是98g的IgY粉末。
[0125] 结论：开发出了令人满意的浓缩和冷冻干燥IgY的方案。
[0126] 实施例4：制备包含IgY的锭剂
[0127] 将根据实施例1制备的IgY粉末过筛。过筛后，用作起始材料的IgY粉末重量是48.24g。
[0128] 原材料：
[0129] IgY 本发明的
[0130] 甘露醇 FLUKA Medicago art nr 01-0295
[0131] 乳糖 BDH Medicago art nr 01-0070
[0132] 甘氨酸 MERCK Medicago art nr 01-0181
[0133] 硬脂酸镁
[0134] 薄荷油 Apoteket(Pharmacy)
[0135] 下文所示的量是每个片剂提供的。
[0136] 配方1：
[0137] IgY 926.00mg
[0138] 甘露醇 866.58mg
[0139] 乳糖 433.42mg
[0140] 甘氨酸 50.00mg
[0141] 硬脂酸镁 25.00mg
[0142] 薄荷油 0.02ml
[0143] 片重 2.30g
[0144] 由于压片机的最大能力得到1.15g重的片剂，因此无法压制20mm的片剂。压制此重量的片剂，然后在筛中研磨。使用此片剂总重进行新的尝试得到1.85g重的片剂。中断压片过程以添加更多的赋形剂。
[0145] 配方2
[0146] IgY 463.00mg
[0147] 甘露醇 1175.24mg
[0148] 乳糖 586.83mg
[0149] 甘氨酸 50.00mg
[0150] 硬脂酸镁 25.00mg
[0151] 薄荷油 0.02ml
[0152] 片重 2.30g
[0153] 将赋形剂与配方1的颗粒混合至终浓度为配方2。压制总共65个片剂。由于压片机是手动操作的，重量变化可能在一定程度上比通常更大。片剂总重不足以进行重量校准。通常处理约100个片剂以对机器进行校准。
[0154] 结论：IgY提取物的浓缩使得有可能实现25mm至20mm的片剂直径。开发了含有IgY的片剂总质量的配方，其得到牢固的片剂。可使用进一步的优化以实现更便利的工作质量。
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