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具有基酸取代的人源化抗TrkA抗体

阅读:995发布:2020-07-13

专利汇可以提供具有基酸取代的人源化抗TrkA抗体专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及针对TrkA受体的 抗体 及其用途,包括人源化抗-TrkA抗体。更具体地,本发明涉及含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和交换性能改变的变体人IgG4重链恒定区的具有增强的抑制性能的人源化抗-TrkA抗体。,下面是具有基酸取代的人源化抗TrkA抗体专利的具体信息内容。

1.一种人源化抗-TrkA抗体或其片段,包含:
a)重链可变区,其含有选自SEQ ID NO:1-5的序列,和
b)轻链可变区,其含有选自SEQ ID NO:6-13的序列,
其中重链可变区的CDR2包含至少一种基酸取代和/或其中重链可变区的非CDR区包含选自37、42和89的氨基酸位点的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
2.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:15的序列。
3.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:1、3和5的序列,并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:6和8的序列。
4.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体所包含的重链可变区和轻链可变区的组合包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的序列。
5.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体所包含的重链可变区和轻链可变区的组合含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列或者含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的序列。
6.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体所包含的重链可变区和轻链可变区的组合含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列。
7.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的CDR2的氨基酸取代包含选自50、60和62的氨基酸位点的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
8.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的CDR2的氨基酸取代不包含选自Y50A、P60A和T62S的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
9.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体或其片段的重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含选自V37A、G42E和V89L的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
10.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体或其片段的重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含V37A,其中所述氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
11.如权利要求1所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体所包含的重链可变区和轻链可变区的组合包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6的序列或者包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8的序列,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含选自V37A、T40A、G42E、R44G、A49S和V89L的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
12.如权利要求6所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含选自K3Q、V37A、G42E、A49S、V89L和R94K的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
13.如权利要求6所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含氨基酸取代K3Q和V37A,其中所述氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
14.如权利要求6所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包含氨基酸取代V37A,其中所述氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
15.一种人源化抗-TrkA抗体或其片段,包含:
a)重链可变区,其含有选自SEQ ID NO:31-49的序列,和
b)轻链可变区,其含有选自SEQ ID NO:6-13的序列。
16.如权利要求15所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,其中所述抗体包含:
a)重链可变区,其含有选自SEQ ID NO:32和36的序列,和
b)轻链可变区,其含有SEQ ID NO:6的序列。
17.如权利要求1到16任一项所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,还包含重链和/或轻链恒定区。
18.如权利要求1到16任一项所述的人源化抗-TrkA抗体或其片段,还包含重链和/或轻链恒定区和铰链区,其中所述重链恒定区和铰链区是人IGHG1同型或人IGHG4同型。
19.如权利要求1到16任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,还包含重链和/或轻链恒定区和铰链区,其中所述重链恒定区和铰链区是人IGHG4同型并且其中所述铰链区含有氨基酸取代S228P,其中所述氨基酸位点是应用EU编号系统标识的。
20.一种人源化抗TrkA抗体或其片段,包含:
a)重链,其含有选自SEQ ID NO:50-70的序列,和
b)轻链,其含有选自SEQ ID NO:29和30的序列。
21.如权利要求1到20任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述抗体是全长抗体。
22.如权利要求1到16任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述抗体是选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双体、三体和基因融合到相同或者不同抗体的scFv的抗体片段。
23.如权利要求1到21任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述抗体包含相对于亲本抗体的Fc区含有至少1个氨基酸修饰的变体Fc区,而包含所述变体Fc区的抗体显示出与亲本抗体相比改变的效应子功能。
24.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体或其片段能够抑制TrkA的功能活化。
25.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体或其片段能够阻断或减低TrkA的一种或多种生物学活性。
26.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体或其片段与人TrkA结合的亲和(KD)为500nM或更低。
27.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体或其片段在TF-1细胞增殖测定中具有与相应的亲本抗体相比至少相当或者更低的IC50。
28.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体的FAB片段的耐热温度超过65℃。
29.如权利要求28所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其中所述人源化抗TrkA抗体的FAB片段的耐热温度等于亲本鼠抗体的FAB片段的耐热温度。
30.一种分离的核酸,其编码权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段。
31.如权利要求30所述的分离的核酸,包含选自SEQ ID NO:73-116的核酸序列。
32.一种载体,其包含权利要求30或31的分离的核酸。
33.一种宿主细胞,其包含权利要求30或31的分离的核酸或权利要求32的载体。
34.一种产生结合人TrkA的人源化抗TrkA抗体或其片段的方法,其包括培养权利要求
33的宿主细胞以使所述核酸表达并产生抗体。
35.如权利要求1到23任一项所述的人源化抗TrkA抗体或其片段,其为固定的形式。
36.一种组合物,其包含权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段和药学上可接受的载体。
37.一种免疫交联物,其包含连接到治疗剂的权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段。
38.一种组合物,其包含权利要求37的免疫交联物和药学上可接受的载体。
39.如权利要求36或38所述的组合物,其还包含另外的药物活性剂。
40.如权利要求39所述的组合物,其中所述另外的药物活性剂是下述一种或多种:
a)镇痛
b)另外的抗TrkA抗体
c)NGF
d)抗癌剂
e)抗NGF抗体。
41.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于药物。
42.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗疼痛
43.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗慢性疼痛。
44.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗急性疼痛。
45.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗下述一种或多种相关的疼痛:炎性疼痛、手术后疼痛、操作后疼痛(包括牙痛)、神经性疼痛、周围神经病变、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、骨折疼痛、痛关节痛、疱疹后神经痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、镰状细胞危象相关的疼痛、头痛(例如偏头痛、紧张性头痛、丛集性头痛)、痛经、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、肌肉骨骼疼痛、慢性腰背痛、纤维肌痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、慢性骨盆疼痛综合征、膀胱炎、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征和/或膀胱疼痛综合征、慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、切口疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、创伤相关的疼痛、肌肉骨骼疾病相关的疼痛、强直性脊柱炎、关节周围病变、骨转移疼痛、HIV疼痛、红斑性肢痛症或者胰腺炎或肾结石引起的疼痛、恶性黑色素瘤、干燥综合症、哮喘(例如,具有严重的气道高反应性的不受控制哮喘)、顽固性咳嗽、脱髓鞘疾病、慢性酒精中毒、中风、丘脑疼痛综合征、毒素引起的疼痛、化疗疼痛、炎性肠病、肠易激综合症、炎性眼病、炎性或不稳定膀胱病症、屑病、炎性成分相关的皮肤疾病、晒斑、心肌炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管病、慢性炎性病况、炎性疼痛及相关的痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛及相关的痛觉过敏或异常性疼痛、糖尿病神经病变疼痛、灼性神经痛、交感神经维持性疼痛、传入神经阻滞综合征、上皮组织损伤或功能障碍、呼吸器官、泌尿生殖器官、胃肠道或血管区域的内脏能动性紊乱、过敏性皮肤反应、瘙痒、白癜风、综合性胃肠道病症、肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、血管舒缩或变应性鼻炎、支气管病症、消化不良、胃食管返流、胰腺炎、内脏痛和骨纤维性结构不良(FD)。
46.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗下述一种或多种相关的疼痛:胰腺炎、肾结石、子宫内膜异位症、IBD、克罗恩病、手术后的粘连、胆囊结石、头痛、痛经、肌肉骨骼痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、手术后疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、创伤相关的疼痛、神经性疼痛、肌骨骼疾病相关的疼痛、类风湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、关节周围病变、肿瘤痛、骨转移疼痛、HIV感染。
47.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或
40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗癌症、神经病症、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病、病毒性病症、HIV介导的病症、麻风病或炎性病症。
48.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗急性炎性疼痛,其中痛觉过敏被有效地逆转到与使用NSAID相同的程度。
49.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗慢性炎性疼痛,其中痛觉过敏被有效地逆转到与使用NSAID相同的程度。
50.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗骨关节炎疼痛,其中痛觉过敏被有效地逆转到与使用普瑞巴林和阿片剂相同的程度。
51.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于治疗神经性疼痛,其中痛觉过敏和异常性疼痛被有效地逆转到与使用普瑞巴林相同的程度。
52.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于诊断或预后
53.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于包含TrkA异常表达或TrkA活性异常的病况的诊断或预后。
54.权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物,或权利要求37的免疫交联物用于权利要求41到47中所述的任意疾病或病症的诊断或预后。
55.一种制品,其包含权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物或权利要求37的免疫交联物。
56.一种试剂盒,其包含权利要求1到23任一项的人源化抗TrkA抗体或其片段,权利要求36、38、39或40的组合物或权利要求37的免疫交联物。

说明书全文

具有基酸取代的人源化抗TrkA抗体

[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月8日提交的美国临时专利申请No.61/657,184的优先权益,其以引用方式全文纳入本文。

技术领域

[0003] 本发明概而言之涉及针对TrkA受体的抗体及其用途,包括人源化抗TrkA抗体以及使用抗TrkA抗体的治疗方法。一方面,本发明涉及具有增强的抑制性能的人源化抗TrkA抗体。
[0004] 另一方面,本发明涉及包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和交换性能改变的变体人IgG4重链恒定区的具有增强的抑制性能的人源化抗TrkA抗体。

背景技术

[0005] 神经营养因子属于与NGF家族第一个成员(Levi-Montalcini R(1987)EMBO J.6(5):1145-54)结 构 上 相 关 的 肽 生 长 因 子 家 族 (Barde YA(1994)
J.Neurobiol.25(11):1329-33)。神经营养素调节周围神经元和中枢神经系统的神经
元分化和存活,以及突触传递。此外,NGF可作用于多种非神经组织和细胞例如免疫细胞。NGF起作用是通过存在于靶细胞中的两种膜受体,低亲和p75受体和140kDa高
亲和力跨膜糖蛋白,TrkA(Kaplan DR et al.,(1991)Science252(5005):554-8;Klein R et al.,(1991)Cell 65(1):189-97)具有酪氨酸激酶活性。TrkA在基底前脑和纹
状体的神经嵴神经元、交感神经元以及胆能神经元中表达,其作为NGF活性的重要
介 质 (Holtzman DM et al.,(1992)Neuron 9(3):465-78;Verge VM et al.,(1992)
J.Neurosci.12(10):4011-22)。TrkA也在某些非神经组织和细胞包括B淋巴细胞中表达(Torcia M et al.,(1996)Cell 85(3):345-56)。
[0006] 神经生长因子(NGF)最初被鉴定为正在发育的神经系统中感觉和交感神经 元 的 存 活 因 子(Gorin PD&Johnson EM(1979)PNAS USA,76(10):5382-6)。 成 体内,NGF不是存活所必需的,但是其在数种急性和慢性疼痛状态产生疼痛和痛觉过敏
时起重要作用。在受伤的和炎性组织中NGF高表达,并且trkA对伤害性感受神经元
的激活通过多种机制引发并产生疼痛信号。在动物模型中通过中和NGF生物活性可
显著减少炎症相关的疼痛(Woolf CJ et al.,(1994)Neuroscience 62(2):327-31;
McMahon SB et al.,(1995)Nat.Med.1(8):774-80;Koltzenburg M et al.,(1999)Eur.J.Neurosci.11(5):1698-704),显示该神经营养因子平增加是产生全痛觉过敏反应所必需的。值得注意地,对其他神经营养因子的抑制不会抵消诱导的痛觉过敏,表明所述效应是NGF特异的(McMahon SB et al.,(1995)Nat.Med.1(8):774-80);此外,NGF抑制可在不同的神经病变相关的疼痛的治疗方案中起镇痛作用(Koltzenburg M et al.,(1999)Eur.J.Neurosci.11(5):1698-704;Ro LS et al.,(1999)Pain 79(2-3):265-74;Theodosiou M et al.,(1999)Pain,81(3):245-55;Christensen MD&Hulsebosch CE(1997)Exp.
Neurol.147(2):463-75)。在疼痛治疗中存在很大的、未满足的医疗需求。主要种类的镇痛剂:非固醇类抗炎药(NSAID)和阿片制剂受限于他们的有效性和耐受性(Hefti FF et al.,(2006)Trends Pharmacol.Sci.27(2):85-91)。低于30%的慢性疼痛患者通过当前的治疗方法可获得充分地缓解,并且具有许多副作用,特别是长期给药时(Kalso E et al.,(2004)Pain 112(3):372-80)。公认NGF在成体的疼痛机制中具有重要作用,这提供了开发全新种类的疼痛治疗的可能。
[0007] 靶向TrkA而不靶向NGF可代表一种更好的治疗选择,由于该受体不干扰由p75受体介导的NGF功能,后者在神经元发育中具有广泛的功能。

发明内容

[0008] 本公开概而言之涉及人源化抗TrkA抗体、其制备方法以及用途。
[0009] 一方面,本公开提供了人源化抗TrkA抗体或其片段,包含:
[0010] a)重链可变区,其含有选自SEQ ID NO:1-5的序列,和
[0011] b)轻链可变区,其含有选自SEQ ID NO:6-13的序列,
[0012] 其中重链可变区的CDR2包含至少一种氨基酸取代和/或其中重链可变区的非CDR区包含选自37、42和89的氨基酸位点的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0013] 另一方面,本公开提供了编码人源化抗TrkA抗体或其片段的分离的核酸、包含所述分离的核酸的载体以及包含所述分离的核酸或所述载体的宿主细胞。本公开还提供了产生人源化抗TrkA抗体或其片段的方法。
[0014] 另一方面,本公开提供了含有人源化抗TrkA抗体或其片段的组合物以及含有连接到治疗试剂的人源化抗TrkA抗体或其片段的免疫交联物。另一方面,本公开提供了人源化抗TrkA抗体或其片段、组合物或免疫交联物用于药剂,用于治疗疼痛,用于治疗慢性疼痛,用于治疗急性疼痛,用于治疗下述一种或多种相关的疼痛:胰腺炎、肾结石、子宫内膜异位症、IBD、克罗恩病、手术后的粘连、胆囊结石、头痛、痛经、肌肉骨骼痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、手术后疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、创伤相关的疼痛、神经性疼痛、肌骨骼疾病相关的疼痛、类湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、关节周围病变、肿瘤痛、骨转移疼痛、HIV感染;用于治疗癌症、神经性病症、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病、病毒性病症、HIV介导的病症、麻风病或炎性病症以及用于诊断或预后
[0015] 另一方面,本公开提供了治疗炎性疼痛、骨关节炎疼痛和神经性疼痛的方法。一方面,在急性炎性痛觉过敏的体内模型中,以0.01mg/kg施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转急性炎性痛觉过敏。另一方面,在慢性炎性痛觉过敏的体内模型中,以0.01mg/kg施用人源化抗TrkA抗体可显著且持久地逆转慢性炎性痛觉过敏。另一方面,在慢性骨关节炎痛觉过敏的体内模型中,以0.01mg/kg施用人源化抗TrkA抗体可显著且持久地逆转慢性骨关节炎痛觉过敏。另一方面,在神经性疼痛的体内慢性缩窄性损伤模型中,以1.0mg/kg施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转神经性疼痛。
[0016] 另一方面,本公开提供了含有人源化抗TrkA抗体或其片段、组合物或免疫交联物的制品。
[0017] 另一方面,本公开提供了含有人源化抗TrkA抗体或其片段、组合物或免疫交联物的试剂盒附图说明
[0018] 图1:抗TrkA抗体的表面等离子体共振测定。数据表示为响应数(缩写为:RU;Y轴)vs.时间(X轴)。(图1A)MNAC13抗体。(图1B)BXhVH5VL1抗体。(图1C)GBR VH5(V37A)VL1抗体。(图1D)GBR VH5(K3Q,V37A)VL1抗体。
[0019] 图2:使用差示扫描量热仪的抗TrkA抗体的热稳定性测定。数据表示为过量的摩尔热容(缩写为Cp[kcal/mol/℃];Y轴)vs.温度(X轴)。(图2A)MNAC13抗体(FAB片段的Tm是Tm1,为74℃);(图2B)BXhVH5VL1抗体(FAB片段的Tm是Tm3,为76.5℃);(图
2C)GBR VH5(V37A)VL1抗体(FAB片段的Tm是Tm1,为73.6℃);(图2D)GBR VH5(K3Q,V37A)VL1抗体(FAB片段的Tm是Tm1,为73℃);(图2E)图2C和图2D的叠加;(图2F)图2B和
图2D的叠加;(图2G)图2A和图2D的叠加。
[0020] 图3:抗TrkA抗体的功能生物活性。人源化抗TrkA抗体对NGF-诱导的TF-1细胞增殖的影响;数据表示为增殖反应%(Y轴)vs.抗体浓度(μg/ml;X轴)。(图3A)GBR VH5(V37A)VL1,GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 vs.BXhVH5VL1;( 图 3B)GBR VH5(V37A)VL1,GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 vs.MNAC13;(图3C)GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 vs.GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4S228P;( 图 3D)BXhVH5VL1,BXhVH5VL3,GBR VH5(V37A)VL1 vs.GBR VH5(V37A)VL3;
(图3E)BXhVH5VL1,BXhVH3VL1,GBR VH5(V37A)VL1 vs.GBR VH3(V37A)VL1。
[0021] 图4:人源化抗TrkA抗体逆转急性炎性爪疼痛。通过足底注射CFA至AMB1小鼠一侧后肢的爪诱导所述爪的急性炎性痛觉过敏,并测定同侧(注射的)爪的负重和对侧(非注射侧)爪的负重之间的%比率(%ipsi/contra,平均值±标准误)。CFA注射(0hr)后23hr测定负重读数,CFA注射后24hr开始处理,单次腹膜注射0.0001mg/kg(白色柱)、
0.001mg/kg(内有水平线的柱)、0.01mg/kg(内有格子花的柱)和0.1mg/kg(内有对线的柱)抗TrkA抗体或者0.1mg/kg同型对照抗体(黑色柱),然后在给药后第4、8、24、48、72、
96和120hr测定负重。作为阳性对照,将小鼠口服10mg/kg吲哚美辛处理(内有垂直线的柱)。
[0022] 图5:人源化抗TrkA抗体逆转慢性炎性关节疼痛。通过关节内注射CFA至AMB1小鼠的后肢膝关节诱导所述关节的慢性炎性痛觉过敏,并测定同侧(注射的)肢体的负重和对侧(非注射侧)肢体的负重之间的%比率(%ipsi/contra,平均值±标准误)。CFA注射之前(空白)和CFA处理后第3、7和10天记录负重读数,给药后第13天开始处理,单次腹膜注射0.01mg/kg(空心方框,虚线)、1mg/kg(实心三角)和10mg/kg(空心圆)抗TrkA
抗体或者10mg/kg同型对照抗体(实心圆),然后在给药后第4、8、24、48、72和96天(括号中)测量负重。作为阳性对照,从第13天起使用60mg/kg塞来考昔每天2次(空心菱形)
处理小鼠,并在CFA处理后第13天给药后第1和8hr以及CFA处理后第14-17天给药后第
1hr测量负重。
[0023] 图6:人源化抗TrkA抗体逆转慢性骨关节炎疼痛。通过关节内注射MIA至AMB1小鼠一侧后肢的膝关节诱导慢性骨关节炎痛觉过敏,并测定同侧(注射的)肢体的负重和对侧(非注射侧)肢体的负重之间的%比率(%ipsi/contra,平均值±标准误)。MIA注
射之前和MIA注射后第3、7和10天记录基线(BL)负重读数,MIA注射后第14天开始处理,单次腹膜注射1μg/kg(空心三角)、10μg/kg(空心菱形)和100μg/kg(实心圆,虚线)
抗TrkA抗体或者10mg/kg同型对照抗体(实心圆)(图6A)。作为比较对照,MIA处理后第
14天使用口服10mg/kg曲多或30mg/kg普瑞巴林处理动物,然后在MIA处理后第16-22
天每隔1天使用30mg/kg曲马多或100mg/kg普瑞巴林处理动物(图6B)。MIA处理后第14
天给药后第4、8和24小时测量所有动物的负重,然后抗体处理组每24小时一次、曲马多和普瑞巴林处理组给药后1小时和24小时测量所有动物的负重。
[0024] 图7:人源化抗TrkA抗体逆转神经性疼痛。通过AMB1小鼠坐骨神经的慢性缩窄性损伤诱导慢性神经性痛觉过敏和异常性疼痛,并分别测定缩足所需的极限力(threshold force,g)和制冷板引起缩足的潜伏时间(秒)。手术前和手术后第7天处理起始前(0h)记录读数。然后单次腹膜注射1000μg/kg同型对照抗体(实心三角)或者10μg/kg(实心
圆)、100μg/kg(实心方框)和1000μg/kg(实心菱形)抗TrkA抗体处理动物。在7天的
给药周期中,每天1次口服施用30mg/kg/10ml普瑞巴林(实心倒三角)或盐水(空心圆)。
给药后第4h、24h及其后每隔一天记录给药后读数直至给药后第7天。所有天中给药普瑞巴林或盐水后1h记录给药后读数。

具体实施方式

[0025] 本公开涉及人源化抗TrkA抗体或其片段,他们的制备方法及用途。
[0026] 术语“TrkA”、“人TrkA”、“TrkA受体”或“人TrkA受体”在本文中等价使用,并且如果没有特别说明其意为“人TrkA”。本文中人TrkA包括人TrkA的变体、异构体及物种同源物。相应地,本公开的抗体在某些情况下可与来自人以外的物种的TrkA交叉反应。在某些实施方案中,抗体可是一种或多种人TrkA蛋白完全特异的,并且可以不显示物种或其他非人类类型的交叉反应性
[0027] TrkA也已知作为高亲和力的神经生长因子受体或1型神经营养酪氨酸激酶受体或TRK1-转化酪氨酸激酶蛋白或者原肌球蛋白相关的激酶A或酪氨酸激酶受体或酪氨酸激酶受体A或Trk-A或gp140trk或p140-TrkA或MTC或者TRK。TrkA是一种受体酪氨酸激酶,通过调节交感神经和神经元的增殖、分化和存活参与中枢神经系统和周围神经系统的发育和成熟。TrkA是NGF的高亲和力受体,NGF是TrkA的主要配体;TrkA还可结合到NTF3/神经营养因子3并被其激活。
[0028] 4种已知的人TrkA异构体的全长氨基酸序列可见于UniProt/Swiss-Prot登陆号为P04629(Consortium TU,(2012)Nucleic Acids Res.40(D1):D71-D5)。4种异构体
是通过可变剪切生产的:异构体TrkA-I可见于多数非神经组织(UniProt/Swiss-Prot
P04629-2),而TrkA-II主要在神经细胞中表达(UniProt/Swiss-Prot登录号P04629-1),异构体TrkA-III由多能性神经干和神经嵴前体特异地表达(UniProt/Swiss-Prot登录号P04629-4)。第4种异构体与异构体TrkA-II的1-71残基不同,并缺失残基393-398,称为异构体3(UniProt/Swiss-Prot登录号P04629-3)。异构体TrkA-II是已知的TrkA的主要
异构体。异构体TrkA-I具有增强的对NTF3神经营养因子的反应性,而异构体TrkA-III可持续地激活但不结合NGF。在一个优选的实施方案中,本文所用的TrkA异构体是具有SEQ ID NO:72序列的TrkA-II异构体,并且其胞外区包含SEQ ID NO:25序列。
[0029] 本文中术语“抗TrkA抗体或其片段”或“人源化抗TrkA抗体或其片段”包括结合人TrkA例如分离型人TrkA的抗体或其片段,具体地是结合TrkA-II异构体(SEQ ID NO:72)的抗体或其片段,更具体地是结合TrkA-II异构体的单价形式的人TrkA胞外区(SEQ ID NO:25)的抗体或其片段,其亲和力(KD)为500nM或更低,优选350nM或更低,更优选150nM或更低,甚至更优选100nM或更低,最优选50nM或更低,特别是30nM或更低。通常地,所述人源化抗TrkA抗体或其片段能够抑制TrkA的功能活性和/或能够阻断或减低一种或多种本来可通过NGF结合到TrkA诱导的生物活性。
[0030] 本文中,“抗NGF抗体”是指能够结合NGF优选地结合人NGF的抗体。通常地,抗NGF抗体能够抑制TrkA的功能性活化和/或能够阻断或减低TrkA的一种或多种生物活性。抗NGF抗体与NGF(例如hNGF)的结合亲和力可以是500nM或更低,优选100nM或更
低。通常地,所述抗NGF抗体应具有任意一种或多种下述特性:(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号功能介导的下游途径;(b)阻断或减低NGF受体活化(包括TrkA
受体二聚化和/或自身磷酸化);(c)增加NGF清除率;(d)抑制(减少)NGF合成、产生或
释放。抗NGF抗体是本领域公知的,见例如PCT公开No.WO 01/78698、WO01/64247、US专利No.5,844,092、5,877,016和6,153,189;Hongo et al.,(2000)Hybridoma,19:215-227;
GenBank登录号No.U39608、U39609、L17078或L17077。
[0031] 本文中术语“能够抑制TrkA的功能活化的人源化抗TrkA抗体或其片段”是指具有任意一种或多种下述特征的人源化抗TrkA抗体:(a)结合TrkA并抑制TrkA生物活性和/或由结合NGF介导的下游途径或NTF3/神经营养因子3信号功能;(b)预防、改善或治疗任意方面的疼痛;(c)阻断或减低TrkA活化或者二聚化和/或自身磷酸化;(d)增加TrkA清除率;(e)抑制或减少TrkA合成和/或细胞表面表达。
[0032] 本文中术语“能够阻断或减低TrkA的一种或多种生物活性的人源化抗TrkA抗体或其片段”是指能够直接或间接减低、抑制、中和或者清除TrkA生物活性的人源化抗TrkA抗体。
[0033] 本文中术语“TrkA生物活性”或“TrkA的生物活性”是指但不限于下述任意一种或多种:结合NGF或其他神经营养因子的能力;同源二聚化或异源二聚化和/或自身磷酸化的能力;激活NGF诱导的信号途径的能力;促进细胞分化、增殖、存活、生长、迁移以及其他细胞生理学变化(包括(对于神经元,包括周围神经元和中枢神经元)神经元形态变化)、突触发生、突触功能、神经递质和/或神经肽释放及损伤后再生的能力;以及缓解疼痛和与骨转移相关的肿瘤疼痛的能力。
[0034] 本文中术语“IC50”是指半数最大抑制浓度(IC50),可测度化合物抑制生物功能例如人源化抗TrkA抗体对NGF诱导的TF-1细胞增殖抑制的有效性。
[0035] 本文中术语“抗体”包括全长抗体和任意抗原结合片段或其单链。抗体和具体地天然产生的抗体是糖蛋白,其以单个或者多个拷贝的Y型单元存在,由4条多肽链组成。每个“Y”型包含2条相同拷贝的重链(H)和2条相同拷贝的轻链(L),以此通过其相对分子量命名。每条轻链与一条重链配对,并且每条重链与另一条重链配对。共价的链间二硫键和非共价相互作用将所述链连接到一起。抗体和具体地天然产生的抗体包含可变区,其为2个拷贝的抗原结合位点。木瓜蛋白酶,一种蛋白水解酶将“Y”型分为3个独立的分子,2个称为“Fab”片段(Fab=抗原结合片段),1个称为“Fc”片段或“Fc区”(Fc=结晶片段)。Fab片段由整条轻链和部分重链组成。重链含有1个可变区(重链可变区或VH)和3个或4个恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4,取决于抗体类别或者同型)。CH1和CH2结构域之间的区域称为铰链区,使Y型抗体分子的2个Fab臂之间具有弹性,使其可开放和关闭以适应与以固定距离分离的2个抗原决定簇的结合。IgA、IgD和IgG的重链各具有4个结构域,即1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1-3)。IgE和IgM的重链具有1个可变区和4个恒定区(CH1-4)。
所述抗体的恒定区可介导与宿主组织或因子的结合,包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和补体系统经典途径的第一组分(C1q)。每条轻链通常通过一个共价二硫键连接到重链。每条轻链包含1个可变区(轻链可变区或VL)和1个轻链恒定区。轻链恒定区是κ
轻链恒定区本文称为IGKC或者是λ轻链恒定区本文称为IGLC。本文中IGKC等价于Cκ
或者CK,并具有相同的含义。本文中IGLC等价于Cλ或者CL,并具有相同的含义。本文中术语“IGLC区”是指所有的λ轻链恒定区例如选自IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7的所有λ轻链恒定区。VH和VL区可被进一步分为超变区,称为互补决定区(CDR),散布有更为保守的区域称为框架区(FR或FW或“非CDR区”)。每条VH和VL由3个CDR和4个
FR组成,按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。
[0036] 抗体可分为类,也称为同型,通常依据恒定区确定。人恒定轻链可分为κ轻链(CK)和λ轻链(Cλ)。重链可分为μ、δ、γ、α或者ε,并分别将抗体的同型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。因此,本文中“同型”意指通过其恒定区的化学和抗原特性定义的任意类和/或亚类的免疫球蛋白。已知的人免疫球蛋白同型有IgGl(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgAl(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD) 和IgE(IGHE)。所谓的人免疫球蛋白伪伽玛IGHGP基因代表另外的人免疫球蛋白重链恒定区基因,其已经被测序但因开关区域改变而不编码蛋白(Bensmana M et al.,Nucleic Acids Res.16(7):3108)尽管具有改变的开关区域,人免疫球蛋白伪伽玛IGHGP基因具有所有重链恒定区(CH1-CH3)和铰链的开放读码框。其重链恒定区的所有开放读码框可编码具有预测的结构特征、与所有的人免疫球蛋白恒定区匹配良好的蛋白结构域。本文中所述另外的伪伽玛同型称为IgGP或IGHGP。其他已报道的伪免疫球蛋白基因例如人免疫球蛋白重链恒定区εP1和P2伪基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类最常用于治疗目的。人体内,该类包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类。小鼠体内,该类包含IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3亚类。
[0037] 本文中术语“嵌合抗体”或“嵌合抗TrkA抗体”包括可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一个物种的抗体,例如可变区序列来自小鼠抗体并且恒定区序列来自人抗体的抗体。
[0038] 本文中术语“人源化抗体”或“人源化抗TrkA抗体”包括将来自另一个哺乳动物种系例如小鼠的CDR序列移植到人框架序列中得到的抗体。在人框架序列中以及在来自另一个哺乳动物种系的CDR序列中可进行另外的框架区修饰。
[0039] 本文中术语“Fab”或“Fab区”包括含有VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可指分离体中的该区域或者全长抗体或抗体片段中的该区域。
[0040] 本文中术语“Fc”或“Fc区”包括含有除第一个恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此,Fc是指IgA、IgD和IgG的最后2个恒定区免疫球蛋白结构域,IgE和IgM的最后3个恒定区免疫球蛋白结构域,以及这些结构域N-末端的弹性铰链。对于IgA和IgM,Fc可包括J链。对于IgG,Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然所述Fc区的边界可不同,然而人IgG重链Fc区通常定义为包含C226或P230残基至其羧基末端,其中编号依据EU编号系统(Edelman GM et al.,(1969)PNAS USA 63(1):78-85)。本文中人IgG1的Fc区定义为包含P232残基到其羧基末端,其中编号依据EU编号系统。Fc可指分离体中的该区域或Fc多肽例如抗体中的该区域。
[0041] 本文中术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”包括含有抗体的第一和第二恒定区之间的氨基酸的弹性多肽。本文中“铰链区”是指仅存在于IgA、IgD和IgG中长度为6-62个氨基酸的序列区域,其包含桥接2条重链的半胱氨酸残基。结构上,IgG CH1结构域末端位于EU位点220,IgG CH2结构域起始于EU位点237的残基。因此,对于IgG,本文中抗体铰链定义为包括221(IgG1中D221)到231(IgG1中A231)位点,其中编号依据EU编号
系统。
[0042] 本文中术语“亲本抗体”、“亲本免疫球蛋白”、“亲本的抗体”或“亲本的免疫球蛋白”可等价使用,包括随后被修饰以产生变体的未修饰的抗体。所述亲本抗体可以是天然产生的抗体或者天然产生抗体的变体或工程版本。亲本抗体可指抗体本身、含有亲本抗体或编码其的氨基酸序列的组合物。本文中“亲本鼠抗体”或“相应的亲本鼠抗体”意指可结合人TrkA并且可被修饰产生变体的抗体或者免疫球蛋白,具体地如WO00/73344中公开的鼠抗体MNAC13。
[0043] 本文中术语“变体抗体”或“抗体变体”包括由与亲本相比至少1个氨基酸修饰产生的与亲本抗体序列不同的抗体序列。本文中变体抗体序列优选地具有与亲本抗体序列至少约80%,最优选地至少约90%,更优选地至少约95%氨基酸序列一致性。抗体变体可指抗体本身、含有抗体变体或编码其的氨基酸序列的组合物。
[0044] 本文中术语“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位点的氨基酸被另一种氨基酸替换。例如,R94K取代是指重链可变框架区变体的情况下,其中94位的精氨酸被赖氨酸取代的变体多肽。上述实例中,94K表示94位被赖氨酸取代。为此,多位点取代通常用斜杠分开。例如,R94K/L78V是指含有R94K和L78V取代的双变体。本文中“氨基酸插入”或“插入”意指亲本多肽序列中在特定位点加入氨基酸。例如,-94插入表明在94位点的插入。本文中“氨基酸缺失”或“缺失”意指亲本多肽序列中在特定位点移除氨基酸。例如,R94-表明缺失94位点的精氨酸。
[0045] 本文中,术语“保守的修饰”或“保守的序列修饰”意指不显著影响或改变含所述氨基酸序列的抗体结合特性的氨基酸修饰。所述保守的修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。修饰可通过本领域公知的标准技术例如定点突变和PCR介导的突变引入本发明的抗体中。保守的氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已定义的。所述家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链的氨基酸(例如苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,本发明抗体的CDR区或框架区中的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基取代并且可测试改变后的抗体(变体抗体)保留的功能。
[0046] 对于所有的人免疫球蛋白重链可变区,编号依据“EU编号系统”(Edelman GM et al.,ibid.)。对于人κ免疫球蛋白轻链恒定区(IGKC),编号依据“EU编号系统”(Edelman GM et al.,ibid.)。对于人λ免疫球蛋白轻链恒定区(IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7),编号依据“Kabat编号系统”(Kabat EA et al.,(1991)Sequences of proteins of immunological interest.第5版-US Department of Health and Human Services,NIH publication n°91-3242),如Dariavach P et al.,(1987)PNAS USA 84(24):9074-8和Frangione B et al.,(1985)PNAS USA82(10):3415-9所述。
[0047] 术语“可变区”是指介导抗原结合并决定特定抗体对特定抗原的特异性的结构域。天然产生的抗体中,抗原结合位点含有2个决定特异性的可变区:1个位于重链中,本文中称为重链可变区(VH);另1个位于轻链中,本文中称为轻链可变区(VL)。某些情况下,特异性可排他地存在于所述2个结构域的其中1个中,例如骆驼中发现的重链抗体的单结构域抗体。可变区长度通常约为110个氨基酸,包含相对不变的15-30个氨基酸的片段称为框架区(FR或非CDR区),其被较短的7-17个氨基酸的变化非常大的区域(称为超变区)分隔。
天然重链和轻链的可变区包含4个FR,其大部分采取β-折叠构象,被3个形成环状的超变区连接。每条链的超变区通过FR被非常接近地连在一起,并与其他链的超变区一起参与形成抗体的抗原结合位点(见Kabat EA et al.,ibid.)。本文中术语“超变区”是抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基,后者具有最大的序列变异度和/或参与抗原识别。对于所有可变区,编号依据Kabat(Kabat EA et al.,ibid.)。
[0048] 目前使用的许多CDR的定义都包含在本文中。Kabat定义基于序列变异度,是最常用的(Kabat EA et al.,ibid.)。Chothia反而涉及结构环的定位(Chothia&Lesk
J.(1987)Mol.Biol.196:901-917)。AbM定义在Kabat和Chothia定义之间折衷,并
被Oxford Molecular's AbM抗体模型化软件所使用(Martin ACR et al.,(1989)PNAS
USA 86:9268–9272;Martin ACR et al.,(1991)Methods Enzymol.203:121–153;
Pedersen JT et al.,(1992)Immunomethods 1:126–136;Rees AR et al.,(1996)
In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.Oxford University
Press,Oxford,141–172)。接触定义(contact definition)近年来已被引入(MacCallum RM et al.,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745),其是基于对蛋白质数据库中可获得的
复杂结构的分析。由 国际ImMunoGeneTics信息系统 (http://www.imgt.
org)定义的CDR是基于IMGT对所有免疫球蛋白的编号和所有物种的T细胞受体
V-REGION( the international ImMunoGeneTics information Lefranc
MP et al.,(1999)Nucleic Acids Res.27(1):209-12;Ruiz M et al.,(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219-21;Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res.29(1):207-9;Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res.31(1):307-10;Lefranc MP et al.,(2005)Dev.Comp.
Immunol.29(3):185-203;Kaas Q et al.,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。
[0049] 本发明中提及的所有互补决定区(CDR)的定义优选如下(编号依据Kabat EAet al.,ibid.):LCDR1:24-34;LCDR2:50-56;LCDR3:89-98;HCDR1:26-35;HCDR2:50-65;
HCDR3:95-102。可变区的“非CDR区”称为框架区(FR)。本文中,轻链可变区的“非CDR区”包含氨基酸序列:1-23(FRl)、35-49(FR2)、57-88(FR3)和99-107(FR4)。本文中,重链可变区的“非CDR区”包含氨基酸序列:1-25(FRl)、36-49(FR2)、66-94(FR3)和103-113(FR4)。
[0050] 本文中术语“全长抗体”包括组成天然生物学形式的抗体的结构,包括可变区和恒定区。例如,在多数哺乳动物包括人和小鼠中,IgG类全长抗体是四聚体并且包含两个相同对的两条免疫球蛋白链,每对具有1条轻链和1条重链,每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL并且每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、CH1(Cγl)、CH2(Cγ2)和CH3(Cγ3)。在一些哺乳动物例如骆驼和骆马中,IgG抗体可只包含2条重链,每条重链含有连接到Fc区的可变区。
[0051] 本文中抗体片段是指抗原结合片段,其包括但不限于:(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成,包括Fab′和Fab′-SH;(ii)Fd片段,由VH和CH1结构域组成;(iii)Fv片段,由单一抗体的VL和VH结构域组成;(iv)dAb片段(Ward et al.(1989)
Nature 341:544-546),其由单一可变区组成;(v)F(ab')2片段,含有两条连接的Fab片段的二价片段;(vi)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接
使得两个结构域联合形成一个抗原结合位点(Bird et al.(1988)Science 242:423-426;
Huston et al.(1988)PNAS USA85:5879-5883);(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/
US92/09965);(viii)通过基因融合构建的“双体”或“三体”、多价或多特异性片段(Tomlinson I et al.,(2000)Methods Enzymol.326:461-479;WO94/13804;Holliger et al.,(1993)PNASUSA 90:6444-6448)和(ix)基因融合到相同或者不同抗体的
scFv(Coloma&Morrison(1997)Nature Biotech.15:159-163)。
[0052] 本文中术语“效应子功能”包括抗体的Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生化事件。效应子功能包括FcγR-介导的效应子功能例如ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖的细胞介导的吞噬作用),以及补体介导的效应子功能例如CDC(补体依赖的细胞毒性)。抗体的效应子功能可通过改变(即增强或减弱,优选增强)抗体与效应分子例如Fc受体或补体成分的亲和力而改变。结合亲和力通常可通过修饰效应分子结合位点而变化,并且该情况下适于确定目标位点并以适合的方式修饰至少部分所述位点。还应理解,改变抗体与效应分子的结合位点不必须显著地改变所有的结合亲和力,而是可改变相互作用的几何位置使得效应机制无效如同非生产性结合。也应理解,效应子功能也可通过修饰不直接参与效应分子结合但参与产生效应子功能的位点而改变。通过改变抗体的效应子功能,可控制免疫应答的许多方面例如增强或抑制免疫系统的多种反应,可能在诊断和治疗中产生有利效应。
[0053] 本文中,术语“受试者”包括任意的人或非人的动物。术语“非人的动物”包括所有脊椎动物例如哺乳动物和非哺乳动物,例如灵长类、羊、狗、猫、马、、鸡、两栖类、爬行动物等。优选地,所述受试者是人。
[0054] 本发明的抗体
[0055] 一方面,本发明提供了人源化抗TrkA抗体或其片段,包括:
[0056] a)重链可变区,包含选自SEQ ID NO:1-5的序列,和
[0057] b)轻链可变区,包含选自SEQ ID NO:6-13的序列,
[0058] 其中重链可变区的CDR2包含至少1个氨基酸取代和/或其中重链可变区的非CDR区包含在选自37、42和89的氨基酸位点的氨基酸取代,其中所述每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0059] 在一些实施方案中,重链可变区的CDR2包含至少1个保守氨基酸取代。
[0060] 在一些实施方案中,重链可变区的非CDR区包含在选自37、42和89的氨基酸位点的保守氨基酸取代。
[0061] 在一些实施方案中,重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:15序列。
[0062] 在一些实施方案中,重链可变区包含选自SEQ ID NO:1、3和5的序列,并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:6和8的序列。
[0063] 在一些实施方案中,人源化抗TrkA抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区的组合,含有选自以下的序列:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:8;优选SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6序列或者SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8序列;更优选SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6序列。
[0064] 在一些实施方案中,本发明的人源化抗TrkA抗体或其片段的重链可变区不包含SEQ ID NO:71序列。
[0065] 在一些实施方案中,本发明的人源化抗TrkA抗体或其片段的重链可变区缺乏87位的丝氨酸,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0066] 在一些实施方案中,本发明的人源化抗TrkA抗体或其片段的重链可变区包含87位的苏氨酸,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0067] 在一些实施方案中,重链可变区的CDR2的氨基酸取代包括选自50、60和62氨基酸位点的氨基酸取代,优选地选自60和62氨基酸位点的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0068] 在一些实施方案中,重链可变区的CDR2的氨基酸取代不包括选自Y50A、P60A和T62S的氨基酸取代,其中每个成员的氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0069] 在一些实施方案中,如果人源化抗TrkA抗体或其片段在重链可变区的非CDR区的氨基酸取代是A49S,则人源化抗TrkA抗体或其片段在重链可变区的CDR2的氨基酸取代不是Y50A。
[0070] 在一些实施方案中,人源化抗TrkA抗体或其片段在重链可变区的非CDR区的氨基酸取代不是A49S和/或人源化抗TrkA抗体或其片段在重链可变区的CDR2的氨基酸取代不是Y50A。
[0071] 在一些实施方案中,抗体或其片段在重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自V37A、G42E和V89L的氨基酸取代,优选V37A,其中所述氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0072] 在一些实施方案中,抗体包含含有SEQ ID NO:3序列的重链可变区,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自V37A、T40A、G42E、R44G、A49S和V89L的氨基酸取代,优选地选自V37A、T40A、G42E、R44G和V89L的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0073] 在一些实施方案中,抗体包含重链可变区和轻链可变区的组合,含有序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6或者含有序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自V37A、T40A、G42E、R44G、A49S和V89L的氨基酸取代,优选地选自V37A、T40A、G42E、R44G和V89L的氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0074] 在一些实施方案中,重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自K3Q、V37A、G42E、A49S、V89L和R94K的氨基酸取代,优选地选自K3Q、V37A、G42E、V89L和R94K的氨基酸取代,更优选包括K3Q和V37A氨基酸取代并且最优选包括V37A氨基酸取代,其中每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。同样地最优选的实施方案中,重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自V37A和K3Q的氨基酸取代,包括氨基酸取代V37A以及每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0075] 在一些实施方案中,抗体包含含有序列SEQ ID NO:5的重链可变区,其中重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自K3Q、V37A、G42E、A49S、V89L和R94K的氨基酸取代,优选地选自K3Q、V37A、G42E、V89L和R94K的氨基酸取代,更优选地包括K3Q和V37A氨基酸取代,并且最优选地包括V37A氨基酸取代,其中每个成员的氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。同样地最优选的实施方案中,抗体包含含有序列SEQ ID NO:5的重链可变区,重链可变区的非CDR区的氨基酸取代包括选自V37A和K3Q的氨基酸取代,包括氨基酸取代V37A以及每个氨基酸位点是应用Kabat编号系统标识的。
[0076] 另一方面,本发明提供了人源化抗TrkA抗体或其片段,包括:
[0077] a)重链可变区,包含选自SEQ ID NO:31-49的序列,和
[0078] b)轻链可变区,包含选自SEQ ID NO:6-13的序列。
[0079] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包括:
[0080] a)重链可变区,包含选自SEQ ID NO:32、36、39、43、48和49的序列,和
[0081] b)轻链可变区,包含选自SEQ ID NO:6-13的序列或者选自SEQ ID NO:6和8的序列。
[0082] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包括:
[0083] a)重链可变区,包含选自SEQ ID NO:32、36、48和49的序列,和
[0084] b)轻链可变区,包含选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的序列。
[0085] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包括:
[0086] a)重链可变区,包含选自SEQ ID NO:32和36的序列,和
[0087] b)轻链可变区,包含SEQ ID NO:6的序列。
[0088] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包括:
[0089] a)重链可变区,包含SEQ ID NO:36的序列,和
[0090] b)轻链可变区,包含SEQ ID NO:6的序列。
[0091] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体包含重链可变区和轻链可变区的组合,该组合选自SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:8的序列,优选地选自SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:8的序列,最优选地选自SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6的序列组合。
[0092] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区,优选重链和/或轻链恒定区和铰链区。优选地,所述重链恒定区是人源的并且是例如人IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(IGHE)同型。更优选地,所述重链恒定区是人IGHG1同型或者人IGHG4同型。优选地,轻链恒定区是人源的并且是人κ(CK)或人λ(Cλ)轻链恒定区,优选人κ轻链恒定区。
[0093] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区以及铰链区,其中重链恒定区和铰链区是人IGHG1同型或人IGHG4同型。
[0094] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区以及铰链区,其中重链恒定区和铰链区是人IGHG4同型并且其中铰链区包含氨基酸取代S228P,其中氨基酸位点是应用EU编号系统标识的。
[0095] 另一方面,本发明提供了人源化抗TrkA抗体或其片段,包含:
[0096] a)重链,包含选自SEQ ID NO:50-70的序列,和
[0097] b)轻链,包含选自SEQ ID NO:29和30的序列。
[0098] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含:
[0099] a)重链,包含选自SEQ ID NO:51、52、56、57、60、64、69和70的序列,和
[0100] b)轻链,包含选自SEQ ID NO:29和30的序列,优选SEQ ID NO:29。
[0101] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含:
[0102] a)重链,包含选自SEQ ID NO:51、52、56、57、69和70的序列,和
[0103] b)轻链,包含选自SEQ ID NO:29和30的序列,优选SEQ ID NO:29。
[0104] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含:
[0105] a)重链,包含选自SEQ ID NO:51、52、56、57和70的序列,和
[0106] b)轻链,包含选自SEQ ID NO:29和30的序列,优选SEQ ID NO:29。
[0107] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含:
[0108] a)重链,包含选自SEQ ID NO:51、52、56和57的序列,和
[0109] b)轻链,包含选自SEQ ID NO:29和30的序列,优选SEQ ID NO:29。
[0110] 在一个优选的实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含:
[0111] a)重链,包含SEQ ID NO:57的序列,和
[0112] b)轻链,包含SEQ ID NO:29的序列。
[0113] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段是全长抗体。
[0114] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段是选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双体、三体和基因融合到相同或者不同抗体的scFv的抗体片段;优选为scFv或Fab;更优选为scFv二聚体或二体或者F(ab')2。
[0115] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段包含相对于亲本抗体的Fc区含有至少1个氨基酸修饰的变体Fc区,其中所述包含变体Fc区的抗体显示出与亲本抗体相比改变的效应子功能。
[0116] Fc区内的氨基酸修饰通常改变所述抗体的一种或多种功能属性,例如血清半寿期、补体结合、与Fc受体或配体结合相关的效应子功能和/或抗原依赖的细胞毒性。下文列出的Fc区内修饰是依据Fc区内残基的EU编号的。在一个实施方案中,对CH1的铰链区进行修饰,使铰链区中半胱氨酸残基的数目改变例如增加或减小。Bodmer et al.在美国专利No.5,677,425中对该方法有更详细的描述。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目改变用于例如促进轻链和重链的装配或者增加或减低抗体的稳定性。另一个实施方案中,使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物学半寿期。更具体地,将一种或多种氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区,以使得所述抗体具有与天然Fc铰链区的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合相比受损的SpA结合。Ward et al.在美国专利No.6,165,745中对该方法有更详细的描述。另一个实施方案中,将抗体修饰以增加其生物学半寿期。多种方法是可行的。例如,可引入一种或多种下述突变:T252L、T254S、T256F,如Ward的美国专利No.6,277,375中所述。可选择地,为增加生物学半寿期,可在抗体的CH1或CL区进行改变以含有来自IgG的Fc区CH2结构域的2个环的补救受体(salvage receptor)结合表位,如Presta et al.的美国专利No.5,869,046和No.6,121,022中所述。另一个实施方案中,通过用不同的氨基酸残基替换至少1个氨基酸残基改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如,可将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸用不同的氨基酸残基替换,以使得抗体具有改变的效应子配体亲和力但保留亲本抗体的抗原结合能力。与其亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。Winter et al.等在美国专利No.5,624,821和No.5,648,260中对该方法进行了更详细地描述。另一个实例中,可将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸用不同的氨基酸残基替换,以使得抗体具有改变的C1q结合和/或减小或者消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。
Idusogie et al.在美国专利No.6,194,551中对该方法进行了更详细地描述。另一个实例中,改变CH2结构域的N-末端区中231到238氨基酸位点中的一个或多个氨基酸残基以改变所述抗体固定补体的能力。Bodmer et al.在PCT公开WO 94/29351中对该方法进行了更详细地描述。还有另一个实例中,通过修饰下述位点:238、239、248、249、252、254、255、
256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、
295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、
334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、
437、438或439中的一个或多个氨基酸将Fc区进行修饰,以增加抗体介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和/或增加抗体对Fcγ受体亲和力的能力。Presta在PCT公开WO 00/42072
中对该方法进行了更详细地描述。此外,可将本发明的抗体进行化学修饰(例如将一种或多种化学基团连接到抗体)或者进行修饰以改变其糖基化。
[0117] 本发明抗体的性质
[0118] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段能够抑制TrkA的功能活化。
[0119] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体能够阻断或者减低TrkA的一种或多种生物学活性。
[0120] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段与人TrkA结合的亲和力(KD)为500 nM或更低,优选350 nM或更低,更优选150 nM或更低,甚至更优选100 nM
或更低,最优选50 nM或更低,特别是30 nM或更低,例如使用BIAcore 2000装置(GE
Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,Switzerland)通过表面等离子体共振(SPR)测定或者使用本领域公知的等效装置使用重组单价人TrkA胞外域(SEQ ID NO:25)作为分析物通过捕捉装置传感器芯片上的抗体测定。本文中,关于应用TrkA受体的亲和力测量中使用的“单价体”是指人TrkA受体结构域比如人TrkA胞外域,其不是人工二聚体或多聚体如同例如如果所述结构域的氨基末端融合到免疫球蛋白Fc区所呈现的;也不是天然二聚体如同例如如果所述结构域与其天然配体NGF联接所呈现的。
[0121] 评价抗体与例如人TrkA的结合亲和力的标准测定是本领域公知的,包括例如ELISA、BIAcore、Western blot、RIA和流式细胞仪测定。实施例中详细描述了适合的测定。
抗体的结合动力学(例如结合亲和力,如KD)也可通过本领域公知的标准测定法来评价,例如通过Scatchard或者 system分析。相对结合亲和力Ki可通过本领域公知的标
准竞争测定来评价。工程化抗TrkA抗体可在TF-1细胞增殖分析中测定其抑制TrkA功能
活化的能力。可度量化合物抑制生物学功能的有效性的半数最大抑制浓度(IC50)可用于选择优选的抗体。
[0122] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段在TF-1细胞增殖分析中具有至少与相应的亲本鼠抗体等价或者更低的IC50,例如使用因子依赖的人红白血病细胞系TF-1通过所述抗体阻断细胞表面TrkA/β-NGF介导的细胞增殖的能力测量的(Kitamura T et al.,(1989)J.Cellular Physiology 140(2):323-34)。优选地,所述人源化抗TrkA抗体或其片段在TF-1细胞增殖分析中的IC50为1μg/ml或更低,更优选为0.75μg/ml,甚至更优选为0.5μg/ml或更低,最优选为0.3μg/ml或更低,特别是0.1μg/ml或更低。
[0123] 在一些实施方案中,所述人源化抗TrkA抗体或其片段具有耐热温度超过65℃优选超过70℃的FAB片段。使用差示扫描量热法分析FAB片段的热稳定性,而鉴定全长IgG中FAB片段的解链温度的中值。这些种类的量热学测量是本领域技术人员公知的,并且可依据例如Garber&Demarest(2007)BBRC355:751-7实施。令人意外地,发现本发明中人源化抗体FAB片段的耐热温度等于其亲本鼠抗体的FAB片段的耐热温度,并且具有经SPR测定的相等的亲和力和通过TF-1细胞增殖分析测得的提高的效价。因此,本发明还提供了其FAB片段的耐热温度等于其亲本鼠抗体FAB片段的耐热温度并且具有相等的与人TrkA的亲和力和提高的抑制性能的人源化抗TrkA抗体。
[0124] 在本文上下文中使用的“等于亲本鼠抗体FAB片段的耐热温度”意指人源化抗TrkA抗体或其片段具有的FAB片段的耐热温度在亲本鼠抗体FAB片段的耐热温度的
±20%范围内,优选在±15%范围内,更优选在±10%范围内,甚至更优选在±5%范围
内。优选地,本发明的人源化抗体FAB片段的耐热温度低于亲本鼠抗体FAB片段的耐热温度不超过15%。
[0125] 在本文上下文中使用的“相等的对人TrkA的亲和力”意指人源化抗TrkA抗体或其片段具有的亲和力在亲本鼠抗体的亲和力的±20%范围内,优选在±15%范围内,更优选在±10%范围内。优选地,本发明的人源化抗体的KD比亲本鼠抗体的KD低至少5%,优选地低至少10%。
[0126] 本发明还提供了可用于治疗疼痛的人源化抗TrkA抗体或其片段。
[0127] 在通过后爪足底注射完全弗氏佐剂(CFA)诱导急性炎性痛觉过敏的小鼠中测试人源化抗TrkA抗体的效应(见实施例2)。以0.01mg/kg或更高的剂量施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转痛觉过敏,这类似于使用NSAID吲哚美辛的观测结果。
[0128] 在通过关节内注射CFA至膝关节诱导慢性炎性痛觉过敏的小鼠中测试人源化抗TrkA抗体的效应(见实施例3)。以单次0.01mg/kg或更高的剂量施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转痛觉过敏,这相当于使用多剂量的COX-2选择性NSAID塞来考昔的观测结果。
[0129] 在通过关节内注射碘乙酸钠(MIA)至膝关节诱导慢性骨关节炎痛觉过敏的小鼠中测试人源化抗TrkA抗体的效应(见实施例4)。以单次0.01mg/kg或更高的剂量施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转痛觉过敏,这相当于使用多剂量的鸦片曲马多和普瑞巴林的观测结果。
[0130] 在遭受坐骨神经慢性缩窄引起的神经性疼痛的小鼠中测试人源化抗TrkA抗体的效应(CCI模型,见实施例5)。以单次0.01mg/kg或更高的剂量施用人源化抗TrkA抗体可显著逆转机械性痛觉过敏和冷痛,其测试的最高剂量1mg/kg可相当于使用多剂量普瑞巴林的观测结果。
[0131] 因此,本发明一个优选的实施方案提供了人源化抗TrkA抗体用于治疗遭受急性炎性疼痛、慢性炎性疼痛、骨关节炎疼痛和/或神经性疼痛的患者。
[0132] 核酸、载体和宿主细胞
[0133] 本发明还提供了编码抗TrkA抗体或其片段的分离的核酸、载体以及含有所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解物中或者以部分纯化或基本上纯化的形式存在。当通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域公知的技术(见例如Ausubel Fet al.,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York)从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质中将核酸纯化出来时,该核酸为“分离的”或者“呈现基本纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或不含内含子序列。在一个优选的实施方案中,所述核酸是cDNA分子。
[0134] 本发明的核酸分子可以使用标准分子生物学技术获得,例如编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL节段的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体,编码抗体的一种或多种核酸可从所述文库中回收。将外源核酸导入宿主细胞的方法是本领域公知的,并且依据所用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸沉淀、氯化钙处理、聚乙烯亚胺介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、病毒或噬菌体侵染、在脂质体中的多核苷酸的封装以及直接将DNA显微注射到细胞核中。对于哺乳动物细胞,转染可以是瞬时的或者稳定的。
[0135] 在一些实施方案中,编码抗TrkA抗体和其片段的分离的核酸包括选自SEQ ID NO73-116的核酸序列,通常为编码选自SEQ ID NO:113、114、115和116的轻链可变区或轻链的核酸分子和/或编码选自SEQ ID NO:73-112的重链可变区或重链的核酸分子。
[0136] 本发明优选的核酸分子是编码选自SEQ ID NO:113和114的轻链可变区的核酸分子和/或编码选自SEQ ID NO:74、78、81、85、90和91的重链可变区的核酸分子。更优选的是编码选自SEQ ID NO:74和78的重链可变区的核酸分子和/或编码选自SEQ ID NO:113和114的轻链可变区的核酸分子。最优选的是编码含有SEQ ID NO:74或78的核酸序列的重链可变区和/或编码含有SEQ ID NO:113的核酸序列的轻链可变区的核酸分子。
[0137] 本发明更优选的核酸分子是编码选自SEQ ID NO:115和116的轻链的核酸分子和/或编码选自SEQ ID NO:93、94、98、99、102、106、111和112的重链的核酸分子。更优选的是编码含有SEQ ID NO:93、94、98和99的核酸序列的重链的核酸分子和/或编码选自SEQ ID NO:115和116的轻链的核酸分子。最优选的是编码含有SEQ ID NO:93、94、98和99的核酸序列的重链的核酸分子和/或编码含有SEQ ID NO:115的核酸序列的轻链的核酸分子。
[0138] 一旦获得编码VH和VL节段的DNA片段,即可通过标准重组DNA技术对这些DNA片段进一步操作,例如将可变区基因转变为全长抗体链基因或者对应于上述片段的片段基因例如Fab片段基因或者scFv基因。这些操作中,将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接到编码另一种蛋白(例如抗体恒定区或弹性连接子)的另一个DNA片段。本文中术语“可操作地连接”意指将2种DNA片段连接使得由所述2种DNA片段编码的氨基酸序列保持在
框内。通过将编码VH的DNA可操作地连接到编码重链可变区(CH1、CH2和CH3)的另一个
DNA分子,可将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域公知的(见例如Kabat,EA et al.,ibid.),并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但最优选的是IgG4恒定区,优选铰链区包含氨基酸取代S228P的人IGHG4恒定区。对于Fab片段重链基因,可将编码VH的DNA可操作地连接到只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。可通过将编码VL的DNA可操作地连接到编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子而将编
码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序
列是本领域已知的(见例如Kabat EA et al.,ibid.),并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中,轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,优选κ恒定区。为产生scFv基因,将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到编码弹性连接子例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段,使VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白,其VL和VH区通过弹性连接子联接(见例如Bird et al.,ibid.;Huston et al.,ibid.;
McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-554)。多种技术已被开发用于产生抗体的抗体片段。传统地,这些片段是通过蛋白裂解酶消化完整抗体获得的(见例如Morimoto et al.,(1992)J.Biochem.Biophysical Methods,24:107-117和Brennan et al.,(1985)Science,229:81)。但是,现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如,所述抗体片段可从上述抗体噬菌体文库中分离。可选择地,Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌中回收并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al.,(1992)Bio/Technology,10:163-167)。通过另外的方法,可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。可用于产生抗体片段的其他技术对本领域技术人员是明显的。另外的实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv),见例如WO93/16185;美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”,如美国专利No.5,641,870所述。
[0139] 还可将本发明的编码抗体的核酸整合到载体中,优选表达载体以表达蛋白。多种表达载体可用于表达蛋白。表达载体可包含自我复制的非染色体载体或者整合进入宿主基因组的载体。表达载体的构建应适合宿主细胞类型。因此,可用于本发明的载体优选表达载体包括但不限于可使蛋白在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的载体。本领域已知,多种可用于本发明中以表达抗体的表达载体可通过商购或其他途径获得。
[0140] 表达载体通常包含与控制或调节序列、选择标记、任意融合伴侣和/或其他元件可操作地连接的蛋白。本文中“可操作地连接”意指将核酸置于与另外的核酸序列的功能关系中。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他控制抗体链基因转录或翻译的表达控制元件(例如polyA信号)。所述调节序列可见于例如Goeddel(Gene Expression Technology,Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中所述。通常地,这些表达载体包括可操作地连接到编码抗体的核苷酸的转录和翻译调节核酸并且典型地适合用于表达所述蛋白的宿主细胞。一般而言,所述转录和翻译调节序列可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。本领域公知,表达载体典型地包含选择基因或标记用于选择含有所述表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域公知的并且依据所用的宿主细胞而变化。例如,典型地选择标记基因可为导入所述载体的宿主细胞提供对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞使用
氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
[0141] 适于克隆或表达本文所述载体中DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。适于该目的的原核生物包括:真细菌类包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物,例如肠杆菌科例如埃希氏菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙菌属例如鼠伤寒沙门菌、沙雷菌属例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)和志贺菌属以及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌属如绿脓杆菌和链霉菌。适合的大肠杆菌克隆宿主包括E.coli 294(ATCC31,446)、E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)和E.coli W3110(ATCC 27,325)。
[0142] 除原核生物以外,真核微生物例如丝状真菌或酵母是适合的克隆或表达的宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。用于表达本发明的重组
抗体的宿主细胞优选哺乳动物宿主细胞,包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO
细胞,描述于Urlaub&Chasin(1980)PNAS USA77:4216-4220中,使用DHFR选择标记,如Kaufman&Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2细胞和HEK293-EBNA1细胞( 目录号:CRL-10852)。特别地,为使用NSO骨髓瘤细
胞,另一个优选的表达系统是WO87/04462、WO89/01036和EP0338841中公开的GS基因表达系统。
[0143] 抗体的构建及产生
[0144] 产生的针对TrkA多肽的抗体,可使用公知且为常规的方法,通过免疫动物即通过将所述多肽施用给动物优选非人动物获得,见例如Handbook of Experimental
Immunology,Weir DM(ed.),Vol 4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,Engla
nd,(1986)。许多温血动物例如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪可被免疫。但是,小鼠、兔、猪和大鼠尤其是小鼠通常是最适合的。也可通过本领域技术人员公知的重组DNA技术产生抗体。此外,也可通过酶或化学裂解天然产生的抗体来产生抗体。本发明的人源化抗体可通过将来自非人动物(例如小鼠)VH和/或VL区的一种或多种CDR或其部分转移到人VH和/
或VL区的一个或多个框架区构建形成。优选地,本发明的人源化抗体是通过将WO00/73344中公开的来自鼠MNAC13抗体VH和/或VL区的一种或多种CDR或其部分转移到人VH和/
或VL区的一个或多个框架区构建形成。可选择地,当需要或者希望减低所述抗体的免疫原性和/或保留结合亲和力时,可将存在于VH和/或VL区的人框架残基用相应的非人(例如小鼠)残基替代。可选择地,存在于CDR中的非人氨基酸残基可用人残基替代。本发明的嵌合抗体或人源化抗体可基于上述制备的非人单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可使用标准分子生物学技术从感兴趣的非人杂交瘤细胞获得并经加工以包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如,为产生嵌合抗体,可使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(见例如Cabilly et al的美国专利No.4,816,567)。为产生人源化抗体,可使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架区(见例如Winter的美国专利No.5,225,539和Queen et al的美国专利No.5,530,101、No.5,585,089、No.5,693,762和No.6,180,370)。
[0145] 可构建本发明的人源化抗体,其中用于重链可变区的人受体分子的选择是基于可能的受体分子可变区与鼠抗体的重链可变区之间的同源性因素。优选种系候选的人受体分子以减低可能的免疫原性。种系数据库是由读通至重链FW3区的末端及部分进入CDR3序列的抗体序列组成。为选择FW4区,可检索来自选择的种系分子的成熟抗体序列数据库或者使用来自从人供体选择的种系分子的抗体序列。人受体分子优选地选自与鼠供体分子相同的重链类,以及鼠供体分子的相同典型结构类的可变区。用于重链可变区的人受体分子选择的第二因素包括鼠供体分子和人受体分子之间CDR长度的同源性。人受体抗体分子优选地通过同源性检索V-BASE数据库进行选择,虽然也可使用其他数据库例如Kabat和公共NCBI数据库。
[0146] 可构建本发明的人源化抗体,其中用于轻链可变区的人受体分子的选择是基于可能的受体分子可变区与鼠抗体的轻链可变区之间的同源性因素。优选种系候选的人受体分子以减低可能的免疫原性。种系数据库是由读通至重链FW3区的末端及部分进入CDR3序列的抗体序列组成。为选择FW4区,可检索来自选择的种系分子的成熟抗体序列数据库或者使用来自从人供体选择的种系分子的抗体序列。人受体分子优选地选自与鼠供体分子相同的轻链类,以及鼠供体分子的相同典型结构类的可变区。用于轻链可变区的人受体分子选择的第二因素包括鼠供体分子和人受体分子之间CDR长度的同源性。人受体抗体分子优选地通过同源性检索V-BASE数据库进行选择,也可使用其他数据库例如Kabat和公共NCBI数据库。
[0147] 当抗体是通过例如将基因导入哺乳动物宿主细胞以重组抗体形式产生时,所述抗体是通过将所述宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的一段时间产
生的,或者更优选地培养足以使抗体分泌到所述宿主细胞生长的培养介质中的一
段时间。用于产生可与人TrkA结合的抗体的宿主细胞可在多种介质中培养。可
商 购 的 介 质 例 如 Ham's F10(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,Switzerland)、基 本 必 需 培 养 基(MEM;Sigma-Aldrich Chemie GmbH)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Basel,Switzerland)、EX-CELL 293、HEK293 无 血 清 培 养 基
(Sigma,Buchs,Switzerland) 和 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM;
Sigma-Aldrich Chemie GmbH)是适于培养所述宿主细胞的。可使用标准蛋白纯化方法将抗体从培养介质中回收。
[0148] 可将抗体可操作地连接到融合伴侣以使得能够靶向所表达的蛋白、纯化、筛选、展示等。可通过连接子序列将融合伴侣连接到抗体序列。所述连接子序列通常含有少量的氨基酸,通常少于10个氨基酸,虽然也可使用较长的连接子。通常地,选择具弹性且耐受降解的连接子序列。本领域技术人员应理解,许多序列中的任意序列都可用作连接子。例如,普通的连接子序列包含氨基酸序列GGGGS。融合伴侣可以是指导抗体和任意相关的融合伴侣到达目标细胞位点或者细胞外介质的靶向序列或信号序列。如本领域已知的,某些信号序列可使蛋白分泌到生长介质或者细胞内膜和外膜之间的周质空间。融合伴侣还可以是编码可用于纯化和/或筛选的肽或蛋白质的序列。所述融合伴侣包括但不限于多组氨酸标签(His-tag)(例如H6和H10或者可用于固定化金属离子亲和层析(IMAC)系统的其他标签2+
(例如Ni 亲和柱))、GST融合子、MBP融合子、Strep-tag、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列和抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag-tag等)。本领域技术人员应理解,所述标签可用于纯化、筛选或二者都有。
[0149] 抗TrkA抗体的鉴定与纯化
[0150] 可通过测量与人TrkA结合的测定和/或测量阻断TrkA结合到其配体NGF的能力的测定来筛选抗体。结合测定的一个实例是ELISA。另外,如实施例中所用的表面等离子体共振(SPR)测定可用于测定所述抗体的结合动力学的结合与解离速率常数。阻断测定的一个实例是基于流式细胞术的测定,用于测量对NGF与TrkA结合的阻断。可使用用于评估抗TrkA抗体功能活性的测定例如TF-1细胞增殖测定,其中抗体阻断细胞表面TrkA/β-NGF介导的细胞增殖的能力是使用因子依赖的人红白血病细胞系TF-1测定的(Kitamura T et al.,(1989)J.Cellular Physiology 140(2):323-34)。
[0151] 本发明的抗体可通过多种本领域技术人员公知的方法分离或纯化。标准的纯化方法包括色谱技术包括离子交换、疏水相互作用、亲和、大小或凝胶过滤和反向色谱,使用系统例如FPLC和HPLC在大气压或高压下实施。纯化方法还包括电泳、免疫学方法、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术结合蛋白浓缩也是可用的。为纯化TrkA抗
体,可将选择的宿主细胞在例如旋转瓶中培养用于单克隆抗体纯化。使用蛋白A琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)在亲和层析之前可将上清过滤并浓缩。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检测洗脱的抗体以保证纯度。因此,本发明优选的抗体是可结合人TrkA的分离的和/或纯化的抗体。
[0152] 免疫交联物
[0153] 另一方面,本发明提供了与治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素连接的、可结合人TrkA的TrkA抗体或其片段。本文中此类交联物称为“免疫交联物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫交联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害(例如可杀死细胞)的任意试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢药(例如,氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫嘌呤、阿糖胞苷、
5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如,氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如,柔红霉素(以前称
为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如,更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春碱)。可连接到本
发明抗体的治疗用细胞毒素的其它实例包括多卡米星、卡奇霉素、美登素和阿里他汀及其衍生物。卡奇霉素抗体交联物的一个实例是可商购的(麦罗塔(Mylotarg(R));美国家
用产品)。使用本领域已知的连接子技术,可将细胞毒素连接到本发明的抗体。已用于将细胞毒素交联到抗体的连接子类型的实例包括但不限于腙类、硫醚、酯类、二硫化物类和含肽的连接子。可选择这样的连接子,例如易于通过低pH在溶酶体隔室中裂解的连接子或者易于被蛋白酶例如优选地表达在肿瘤组织中的蛋白酶例如组织蛋白酶类(例如组织蛋白酶B、C、D)裂解的连接子。为进一步讨论细胞毒素的类型,用于将治疗剂交联到抗体的连接子和方法也可见Saito Get al.,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215;Trail PA et al.,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337;Payne G(2003)Cancer Cell
3:207-212;Allen TM(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763;Pastan I&Kreitman RJ(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091;Senter PD&Springer CJ(2001)Adv.Drug
Deliv.Rev.53:247-264。本发明的抗体还可连接到放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物,也称为放射性免疫交联物。可交联到抗体用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-177。制备放射性免疫交联物的方法是本领域已知的。可商购的放射性免疫交联物的实例包括 (EDEC Pharmaceuticals)和
(Corixa Pharmaceuticals),并且类似的方法可用于使用本发明的抗体制备放
射性免疫交联物。本发明的抗体免疫交联物可用于改变某些生物反应,并且其药物部分不应被解释为仅限于典型的化学治疗剂。例如所述药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。所述蛋白质可包括例如酶促活性毒素或其活性片段,例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或者白喉毒素;蛋白质例如肿瘤坏死因子或γ干扰素;
或者生物反应调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生长因子。可用于将所述治疗剂连接到抗体的技术是公知的,见例如Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld et al.,(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",in
Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel
Dekker,Inc.1987);Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical
Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)and Thorpe et al.,Immunol.
Rev.62:119-58(1982)。
[0154] 另一方面,本发明提供了与治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素一起施用的、可结合人TrkA的抗TrkA抗体或其片段,。
[0155] 药物组合物
[0156] 另一方面,本发明提供了组合物例如药物组合物,包括本发明的抗体或其片段以及药学上可接受的载体。此类组合物可包括上述的抗体和/或本发明的免疫交联物和/或治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素中的一种或其组合。例如,本发明的药物组合物可包含与靶抗原上不同表位结合的或者具有补体活性的抗体(或免疫交联物)的组合。本发明的药物组合物还可以联合治疗方式即与下述其他试剂组合施用。
[0157] 本文中“药学上可接受的载体”包括生理上适合的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂等。优选地,所述载体适合用于经静脉、肌肉内、皮下、肠胃外、脊椎或者表皮施用(例如通过注射或灌输)。依据施用途径,可将所述活性化合物即抗体或者免疫交联物包被于材料中以保护所述化合物免受可能使所述化合物失活的酸或者其他自然条件的影响。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散剂和用于即时制备无菌可注射的溶液或分散剂的无菌粉末。使用所述介质和试剂作为药物活性物质是本领域已知的。任意常规介质或试剂除非与所述活性化合物不相容,否则均可将其用于本发明的药物组合物。补体活性化合物也可纳入所述组合物。
[0158] 另一方面,本发明提供了含有本发明的人源化抗TrkA抗体或其片段以及另一种药物活性剂的组合物。优选地,所述药物活性剂是下述一种或多种:
[0159] a)镇痛剂,b)另一种抗TrkA抗体,c)NGF,d)抗肿瘤剂,e)抗NGF抗体,如下文所述。
[0160] 另一方面,本发明提供了包含含有连接到治疗剂的、可结合人TrkA的抗体或其片段的免疫交联物和药学上可接受的载体的组合物。可用的免疫交联物和治疗剂如上所述。
[0161] 本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括:(1)水溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、磷脂酰胆碱、没食子酸丙酯、α生育酚等;和(3)金属螯合剂,例如柠檬酸乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本发明的药物组合物的适合的水性载体和非水性载体实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油例如橄榄油和可注射用有机酯例如油酸乙酯。适当的流体可保留,例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、对于分散剂通过保持需要的粒度和通过使用表面活性剂。这些组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止出现微生物可通过如上所述的灭菌程序和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等来保障。所述组合物中还可能需要包含等渗剂例如糖、氯化钠等。此外,可通过包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸和明胶形成可延长吸收的注射药物剂型。
[0162] 治疗及其他用途
[0163] 本发明的抗体可用于医学中以治疗多种病症/病况,如以下所列种类。
[0164] 因此,本发明提供了治疗下述病况的方法,其包括向有需要的受试者,适当的哺乳动物受试者特别是人类受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体或衍生物以治疗所述病况。
[0165] 本发明还提供了本文所述的抗体或衍生物在制造用于治疗下述病况的药物中的用途。
[0166] 本文中术语“治疗(treatment)”包括现有病症/病况的治疗性处理。其还包括预防性处理。其还包括改善一种或多种不利的症状,即使患者并未治愈存在的病症/病况。例如,疼痛可缓解或减轻。
[0167] 优选的医疗用途是治疗疼痛。依据国际疼痛研究协会(“IASP”),疼痛通常定义为“与实际的或可能的组织损伤相关的令人不快的感觉和情绪体验,或以损伤方式描述或其二者”。所有形式疼痛的基本元素是专门的高阈值受体和神经纤维活化以警告机体可能的组织损伤。炎性细胞和过程的参与是许多疼痛状态的常见元素。术语“急性疼痛”意指即时的通常是高阈值的由伤害例如割伤、压伤、烧伤或化学刺激引起的疼痛。本文中术语“慢性疼痛”指非急性的疼痛,是炎性和神经性来源的。应理解,慢性疼痛通常是相对长的过程,例如数月或数年并且可为持续性的或者间歇性的。本发明的抗体可用于治疗慢性疼痛或急性疼痛。治疗慢性疼痛是优选的。
[0168] 疼痛可以是下述任意的或与其相关的:炎性疼痛、手术后疼痛、操作后疼痛(包括牙痛)、神经性疼痛、周围神经病变、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、骨折疼痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、镰状细胞危象相关的疼痛、头痛(例如偏头痛、紧张性头痛、丛集性头痛)、痛经、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、肌肉骨骼疼痛、慢性腰背痛、纤维肌痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、慢性骨盆疼痛综合征、膀胱炎、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征和/或膀胱疼痛综合征、慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、切口疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、创伤相关的疼痛、肌肉骨骼疾病相关的疼痛、强直性脊柱炎、关节周围病变、骨转移疼痛、HIV疼痛、红斑性肢痛症或者胰腺炎或肾结石引起的疼痛、恶性黑色素瘤、干燥综合症(Sjogren's syndrome)、哮喘(例如,具有严重的气道高反应性的不受控制的哮喘)、顽固性咳嗽、脱髓鞘疾病、慢性酒精中毒、中风、丘脑疼痛综合征、毒素引起的疼痛、化疗疼痛、炎性肠病、肠易激综合症、炎性眼病、炎性或不稳定膀胱病症、屑病、炎性成分相关的皮肤疾病、晒斑、心肌炎、皮炎,肌炎,神经炎,胶原血管病、慢性炎性病况、炎性疼痛及相关的痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛及相关的痛觉过敏或异常性疼痛、糖尿病神经病变疼痛、灼性神经痛、交感神经维持性疼痛、传入神经阻滞综合征、上皮组织损伤或功能障碍、呼吸器官、泌尿生殖器官、胃肠道或血管区域的内脏能动性紊乱、过敏性皮肤反应、瘙痒、白癜风、综合性胃肠道病症、肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、血管舒缩或变应性鼻炎、支气管病症、消化不良、胃食管返流、胰腺炎、内脏痛和骨纤维性结构不良(FD)。
[0169] 疼痛可以是例如下述任意的或与下述任意相关的:胰腺炎、肾结石、子宫内膜异位症、IBD、克罗恩病、手术后的粘连、胆囊结石、头痛、痛经、肌肉骨骼痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、手术后疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、创伤相关的疼痛、神经性疼痛、肌骨骼疾病相关的疼痛、类风湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、关节周围病变、肿瘤痛、骨转移疼痛、HIV感染。
[0170] 多种模型已知可用于评估疼痛并且可用于筛选抗体/其衍生物。例如,可使用伤害性热板测试,如WO 00/73344公开的。所述试验可依据McMahon et al.,1995(Nature Med.1:774-780)使用抗体/衍生物作为免疫粘合素来实施。将抗体/衍生物皮下注入成体鼠的后爪3周或者使用渗透性微型真空。使用热板测试(Eddy&Leimbach(1953)J.Phar.Exp.Ther.107:385-393)间隔地评估伤害敏感度,其可模拟炎症或部分神经损伤后的痛觉过敏状态。所述情况下的伤害刺激可诱导反应(舔爪和/或跳跃),其假定综合协调超过简单反射。依据该测试,将动物放入具有加热到需要的温度通常为56℃的板作为底座的围栏中。在对照动物(使用非相关抗体处理)和使用抗TrkA抗体/衍生物处理的动物中测量两种反应(舔爪和/或跳跃)中任一种的潜伏期。
[0171] 作为热板测试的替代方案,可评估对福尔马林的伤害反应。该测试由Porro&Cavazzuti,1993(Prog.Neurobiol,41:565-607)公开,并在WO06/137106中使用。
其包括当测试前施用给给定候选者时,通过分析后续舔爪的任何减少来评估疼痛反应的下降。盐水通常用作阴性对照。
[0172] 评估痛觉过敏可使用负重法确定。小鼠通常将其体重等量地分配于其四肢。对肢体痛觉刺激例如通过局部注射完全弗氏佐剂(CFA)或碘乙酸钠(MIA)至后爪(足底)或膝关节(关节内)后,其体重重新分布以减轻分配于注射肢体的体重并增加分配于未注射肢体的体重。负重是使用双足平衡测痛仪(incapacitance tester)将其后爪置于不同的传感器上并记录两侧后爪施加的平均力测定的。负重可用于评估足底注射CFA产生的急性炎性痛觉过敏、关节内注射CFA产生的慢性炎性痛觉过敏或者关节内注射MIA产生的慢性骨关节炎痛觉过敏,细节分别见实施例2、3和4。
[0173] 评估机械性痛觉过敏可通过多种方法实现,例如Von Frey纤维丝测痛仪或Randall-Selitto爪压测痛仪(analgesiometer)。缩足阈值是对通过Von Frey纤维丝测痛仪增加施加至足底跖面压力刺激的响应测定或者对通过Randall-Selitto爪压测痛仪的楔形探针增加施加至背足跖面压力刺激的响应测定的。在对照动物和使用抗TrkA抗体/衍生物处理的动物中测量后足缩回的潜伏期。这些方法可用于评估由慢性缩窄性损伤(CCI)动物模型产生的机械性痛觉过敏,如实施例5所述。
[0174] CCI模型也是一种著名的动物模型。其包含坐骨神经慢性缩窄并且被用于诱导啮齿类动物例如小鼠或大鼠中的慢性神经性疼痛。该模型由Bennett&Xie,1998 in Pain33:87-107描述。其用于例如WO 06/131592。许多神经性疼痛的主要特征是通常无害的冷刺激开始产生疼痛。对无痛刺激反应的增强称为异常性疼痛(allodynia)。因此,诱导的神经性疼痛的程度可使用用于异常性疼痛的冷板测试来测定,见实施例5中详述。将动物放入具有制冷到需要温度的板的围栏中,温度范围可以是-5℃到15℃。在对照动物和使用抗TrkA抗体/衍生物处理的动物中测量后足缩回的潜伏期。通常,缩回的潜伏期在5℃或更低的表面温度变得与基线不同。
[0175] 所述抗体可用于治疗癌症、神经性病症、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病、病毒性病症、HIV介导的病症、麻风病或炎性病症。另外,所述抗体还可用于治疗可能与NGF水平升高相关的其他疾病,包括例如红斑狼疮、带状疱疹、疱疹后神经痛和痛觉过敏。
[0176] 多种肿瘤可表达TrkA。TrkA与NGF的相互作用可参与肿瘤发展(例如前列腺癌和胰腺癌)。在某些类型的癌症中,过量的NGF可促进神经纤维的生长和浸润。通过阻断NGF活性,可能会显著减少神经瘤的形成。此外,作为简单提供阻断效应的替代方案,抗体可偶联到细胞毒性剂并且可用于靶向表达TrkA的癌细胞。但是,不必要将所述抗体偶联至毒素。由于免疫应答,ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)上升,其中通过包被靶细胞抗体可使其易受所述系统攻击(例如通过T细胞、通过补体激活等)。优选的可治疗的癌症是前列腺癌、甲状腺癌、癌、催乳素瘤、黑色素瘤或者骨癌疼痛包括骨转移相关的癌症疼痛。
优选的可治疗的癌症是骨癌疼痛包括骨转移相关的癌症疼痛。
[0177] 所述抗体还可用于治疗多种神经病症包括神经退行性病症,例如所述抗体可用于减少神经瘤的形成。其还可用于治疗阿尔茨海默氏病或神经再生疗法。本发明的抗体可用于这样的治疗,以减轻不需要的NGF的激动剂作用(也可见下文中“联合治疗”部分)。此外,所述抗体可用于治疗神经性疼痛,如上所述。这可能与神经系统的损伤或功能障碍有关。NGF具有治疗糖尿病和麻风病的潜力,但是其具有不希望的激动剂性能包括增加疼痛敏感度,这可通过使用本发明的抗体来避免。
[0178] 还有另一种用途是治疗炎性病症。NGF是由肥大细胞、成纤维细胞和炎性过程发生位点周围的其他类型细胞释放的。具体地,肥大细胞显示出具有基本功能。其产生NGF并同时在其表面表达功能性TrkA受体。NGF/TrkA系统显示出可通过自分泌正反馈机制介导肥大细胞激活,其使得局部放大产生疼痛的炎性信号。可治疗的炎性病症的实例包括泌尿道和骨盆的炎性形式、骨关节炎、多发性硬化、肠炎、炎性肠病、膀胱炎、湿疹、接触性皮炎、关节炎包括慢性关节炎和类风湿关节炎、克罗恩氏病、银屑病和哮喘。
[0179] 本发明的抗体可用于上述治疗以减轻不需要的NGF的激动剂作用。
[0180] 本发明的抗体或其衍生物可与一种或多种其他活性剂例如药物活性剂一起用于联合治疗。其可在医学中同时施用、序贯施用或协同施用。例如,所述抗体或衍生物可与镇痛剂例如阿片类镇痛剂或非阿片类镇痛剂组合。WO06/137106中公开了可阻断TrkA生物活性的少量分子可增强阿片类药物的镇痛效果。所述镇痛的阿片类药物包括选自下述的一种或多种化合物:吗啡、可待因、双氢可待因二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、萘丁美酮、丙氧芬、喷他佐辛;和其药学上可接受的衍生物(例如其药学上可接受的盐)。适合的非阿片类镇痛剂包括非甾体抗炎药(NSAID)以及其他镇痛剂例如醋氨酚。通常可获得的用于治疗急性炎性疼痛的NSAID包括阿司匹林、布洛芬、吲哚美辛、萘普生和酮洛芬,用于治疗慢性炎性疼痛的NSAID包括塞来考昔和美洛昔康。
[0181] 另一种组合是一种或多种本发明的抗体与一种或多种其他抗体的组合。优选的组合是与一种或多种其它抗TrkA和/或抗NGF抗体的组合。所述组合与单独使用抗体治疗相比可增加治疗一种或多种本文所述病症的效力。例如,在本文所用测定程序中,两种或多种抗体的组合是最有效的。
[0182] 另一种组合是本发明的抗体与NGF的组合。如上所述,已述及使用NGF治疗多种病症包括阿尔茨海默氏病、糖尿病、麻风病等,但是已发现对于周围靶点的激动剂性能可增加疼痛敏感度。另外,通过使用本发明的抗体或衍生物,可减低疼痛敏感度,以此使基于NGF的治疗更有利。
[0183] 另一种组合是本发明的抗体与抗肿瘤剂例如烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶II抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、有丝分裂抑制剂或铂衍生剂的组合。
[0184] 本发明的抗体可通过认识适合的途径施用。其包括(但不限于)腹膜内、肌内、静脉内、皮下、气管内、口腔、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤施用。
[0185] 所述抗体通常是局部施用的,通过注射(腹膜内或颅内—通常在一个脑室—或者腹膜内或囊内)液体剂型或者通过摄取固体剂型(以丸剂、片剂、胶囊形式)或者液体剂型(以乳剂和溶液形式)。用于肠胃外施用的组合物通常包含溶解于相容的溶液优选水溶液中的免疫球蛋白溶液。这些剂型中抗体/衍生物的浓度可从低于0.005%w/v到15-20%w/v之间变化。其选择主要依据液体的体积、粘度等,以及依据所需的具体施用方式。可选择地,可制备用于固体形式施用的所述抗体。可将所述抗体与不同的惰性物质或赋形剂组合,其可包括配体例如微晶纤维素、明胶或阿拉伯胶;赋形剂例如乳糖或淀粉;试剂例如藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂如硬脂酸镁、胶体二氧化甜味剂蔗糖或糖精;或者调味剂如薄荷和水杨酸甲酯。其他药学施用体系包括水凝胶、羟甲基纤维素、脂质体、微胶囊、微乳剂、微球体等。
[0186] 如果病症是局部性的,那么在受病症影响的位点/其附近直接地局部注射是优选的施用方式。抗TrkA抗体是适于全身性施用的。全身性施用可通过注射例如持续静脉滴注、静脉推注、皮下或肌内注射进行。
[0187] 可选择地,也可使用其他形式的施用(例如经口腔、粘膜、吸入、舌下等)。但是,如果需要,递送所述抗体/衍生物可在受影响的组织附近通过局部施用(例如关节内注射或皮下、肌内注射)实施。
[0188] 所述抗TrkA抗体/衍生物可适合地配制于适合预期的施用途径的药物组合物中。用于注射的溶液可适于含有在水性介质(例如注射用水)中溶解或分散的抗体/衍生物,同时适当地包含合适的缓冲液和摩尔浓度调节剂(例如磷酸盐、盐和/或葡萄糖)。
[0189] 治疗方案(即剂量,时间和重复)可以通过所选择的施用途径单次或重复施用(例如注射)所述产品来表示。剂量施用的间隔可依据临床反应的程度和持续时间依据具体的个体和个体的临床病史来调整。
[0190] 所述抗TrkA抗体/衍生物适合地具有长作用持续时间。具体地,所述抗体施用后通过动物实验所确定的临床效应的持续时间可以长达21天。此外,抗TrkA抗体施用后可显现出比其在相关的生物学基质例如血清或血浆中可检测的存在更长的临床效应时间。
[0191] 鉴于意图长的作用持续时间(即,效应适合地持续至少1周,或者优选地至少2周例如至少3周或至少4周),适合地将所述抗体/衍生物施用至受试者的频率不超过每周一次例如不超过每2周一次或者每3周一次或每4周一次。
[0192] 所述抗TrkA抗体/衍生物适合的每日剂量范围通常地从0.1mg/kg体重到10mg/kg体重。用于治疗急性和慢性炎性疼痛的抗TrkA抗体适合的剂量是至少0.01mg/kg(见实施例2和3)。用于治疗骨关节炎疼痛的抗TrkA抗体适合的剂量是至少0.01mg/kg(见实施例4)。用于治疗神经性疼痛的抗TrkA抗体适合的剂量是至少0.01mg/kg,优选地0.1mg/kg并且最优选地1mg/kg(见实施例5)。这些剂量仅相对于小鼠的体内状况而言。本发明涉及人源化抗TrkA抗体在治疗急性炎性疼痛中的用途,其中痛觉过敏被有效地逆转至与施用NSAID所观察到的相同的程度。本发明还涉及人源化抗TrkA抗体在治疗慢性炎性疼痛中的用途,其中痛觉过敏被有效地逆转至与施用NSAID所观察到的相同的程度。本发明还涉及人源化抗TrkA抗体在治疗骨关节炎疼痛中的用途,其中痛觉过敏被有效地逆转至与施用普瑞巴林和阿片剂所观察到的相同的程度。本发明还涉及人源化抗TrkA抗体在治疗神经性疼痛中的用途,其中痛觉过敏被有效地逆转至与施用普瑞巴林所观察到的相同的程度。对于具体地施用至肿瘤,可通过直接和局部注射至肿瘤或肿瘤位点附近的组织来施用。
对于全身施用,剂量从0.05mg/kg每天到500mg/kg每天变化,虽然所述范围内较低的区间是优选的因为其更易于施用。剂量可以是校准的,例如以保证血浆中特定水平的抗体/衍生物(范围约5-30mg/ml,优选地介于10-15mg/ml),并保持该水平一段时间直至达到临床效果。
[0193] 用于确定或评估胰腺肿瘤或前列腺肿瘤阶段的有效的方法是基于血液中前列腺特异性抗原(PSA)的测量、胰腺肿瘤存活时间的测量、两种肿瘤类型对转移灶扩散的减缓或抑制的测量。
[0194] 对于在肿瘤位点直接注射,剂量依赖于不同的因素包括肿瘤的类型、阶段和肿瘤体积,以及许多其他变量。
[0195] 依据肿瘤体积,典型的治疗剂量从注射0.01mg/ml到10mg/ml变化,其可以需要的频率施用。
[0196] 无论治疗的性质如何,人源化抗体与非人源化抗体相比可慢得多地被清除并且需要更低的剂量来保持血浆中有效的水平。此外,具有高亲和力的抗体,与具有较低亲和力的抗体相比,可以较低的频率和较低的剂量施用。
[0197] 每种抗体/衍生物的治疗有效剂量可由有经验的医师在治疗过程中确定。根据需要,剂量可减少(例如为减少副作用)或者增加(例如为增加治疗效果)。
[0198] 施用之前,本发明抗体的制品可冷冻或冻干储存。然后在使用之前可将其在适合的缓冲液中重构。如果是冻干,那么重构可能会引起活性损失,抗体的施用水平可进行校准以补偿该影响。(对于一般的免疫球蛋白,IgM抗体倾向于比IgG抗体具有更大的活性损失。)
[0199] 储藏寿命也可标定,以使得抗体不会在储藏期后被使用。
[0200] 本发明的抗体或其衍生物可用于与医疗用途有关的上述任意疾病/病况的诊断或预后。例如,其可被用于促进TrkA阳性肿瘤标志物的检测,用作阿尔茨海默氏病等发病的早期标志物。
[0201] 其还可被用于诊断CIPA(“先天性无痛无汗症”)。这是一种遗传性、隐性、常染色体综合征,特征在于反复发作性发烧、无汗、缺乏对伤害性刺激的反应、精神发育迟缓和自残倾向。其来自于TrkA基因的突变。事实上,本发明的抗体或衍生物可用于范围广泛的包括TrkA异常表达(与健康个体或健康组织样本中的TrkA表达相比)或者TrkA活性异常的病况的诊断或预后。因此,本发明的范围包括包含从患者获得生物学样本并使所述样本与本发明的抗体或衍生物接触的方法。根据需要,可将所述抗体/衍生物固定。因此,所述方法包括以定量或定性方式测定所述抗体/衍生物与所述样本的结合。根据需要,其可参照阳性对照(代表健康状态)或阴性对照(代表存在/疑似病症)进行。为诊断目的,所
述抗体可用可检测的标志物标记或者不标记。(本文中术语“标志物”包括标签或任意其他可检测到的基团/可触发可检测到的变化的基团。)
[0202] 制品和试剂盒
[0203] 本公开的另一个实施方案中,制品包含本发明的抗体或其片段、组合物或免疫交联物,用于治疗一种或多种上述疾病/病况。所述制品可包含容器和在所述容器上或与其关联的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶或注射器。所述容器可由多种材料例如玻璃或者塑料制成。所述容器容纳可有效治疗所述病况的组合物并可具有无菌进入口(例如,所述容器可以是静脉注射液袋或带可由皮下注射针刺透的塞子的小瓶)。所述组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体。所述标签或包装说明书可表明所述组合物可用于治疗的病况的选择。
[0204] 此外,所述制品可包含(a)第一容器,其中含有组合物,其中所述组合物含有本发明的抗体,和(b)第二容器,其中含有组合物,其中所述组合物含有所述抗体之外的治疗剂。本发明的该实施方案的制品还可包含包装说明书,表明所述第一和第二组合物可组合使用。此类治疗剂可以是上述辅助治疗剂中的任意一种(例如,血栓溶解剂、抗血小板剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗激素化合物、保心药和/或哺乳动物的免疫功能调节剂包括细胞因子)。可选择地或者另外地,所述制品还可包含第二(或第三)容器,该容器含有药学上可接受的缓冲剂例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其还可包含商业可获得的或用户立场的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
[0205] 本发明的范围还包含试剂盒,其含有本发明的抗体、组合物或免疫交联物及其使用说明。所述试剂盒还可包含一种或多种其他试剂,例如免疫抑制剂、细胞毒素剂或放射性毒素剂或者一种或多种额外的本发明的抗体(例如,与所述第一抗体不同的结合TrkA抗原的表位的具有补体活性的抗体)。
[0206] 即使没有进一步说明,也应理解本领域技术人员可依据以上的描述及下述示例性实施例制造和使用本发明的试剂并实践所要求保护的方法。提供下述工作实施例以方便实践本发明,但不应被理解为以任何方式限定本公开的其余部分。
[0207] 实施例
[0208] 本发明的人源化抗TrkA抗体是一种新的抗TrkA抗体亚类,其可高效地抑制TrkA的功能活化。抗TrkA小鼠单克隆抗体公开于WO00/73344中称为MNAC13,其人源化变体公开于WO09/098238中,但它们未达到某些条件下例如治疗疼痛和癌症相关的疼痛时所需要的相同的抑制水平,此时高水平的抑制可产生增加的治疗效率。因此,需要开发可高效抑制TrkA的人源化抗TrkA抗体。
[0209] 评估抗体介导的TrkA功能活化的抑制的方法是本领域公知的,其包括TF-1细胞增殖测定,其中抗体阻断细胞表面TrkA/beta-NGF介导的细胞增殖的能力是使用因子依赖的人红白血病细胞系TF-1测定的(Kitamura T et al,.(1989)J.Cellular Physiology140(2):323-34)。WO09/098238中公开的人源化抗体显示出在TF-1增殖测定中的抑制活性,BXhVH5VL1候选抗体在MNAC13小鼠抗体的人源化变体中具有最高程度的抑制。此外,WO09/098238中公开的人源化抗体通过表面等离子体共振(SPR)技术检测到可直接结合到TrkA的胞外区。因此,为设计具有提高的对人TrkA的结合亲和力而且更重要地可提高在TF-1细胞增殖测定中超过BXhVH5VL1人源化变体的抑制效力的新的小鼠MNAC13抗体的人源化变体,选择WO09/098238中公开的人源化抗体的亚类用作工程化起始点。
[0210] “BXh”之后的字母是VH或VL或其二者。VH或VL分别代表具有IGHG1同型的重链,具体重链可变区由具体数字例如BXhVH5表示,或者具有κ同型的轻链,具体轻链可变区由具体数字例如BXhVL1表示。当具有具体数字的VH和具有具体数字的VL同时出现于
“BXh”之后例如BXhVH5VL1时,其代表由重链和轻链的具体组合组成的具体抗体分子,例如BXhVH5VL1抗体是指具有BXhVH5重链和BXhVL1轻链的抗体。基于WO09/098238中所述选
择的VH和VL可变区的新产生的工程化人源化变体称为“GBR”抗体。反之,相同的命名系统对于GBR抗体是有效的。本发明所用的重链可变区中的具体取代还在括号中标识。除非另有说明,否则所有的GBR抗体具有IGHG1重链同型和κ同型轻链。
[0211] 实施例1:抗体工程化
[0212] WO09/098238中公开的40种抗体中,选择5种人源化抗体用于工程化:具有重链可变区VH1(SEQ ID NO:1)和轻链可变区VL1(SEQ ID NO:6)的BXhVH1VL1、具有重链可变区VH3(SEQ ID NO:3)和轻链可变区VL1的BXhVH3VL1、具有重链可变区VH3和轻链可变区VL3(SEQ ID NO:8)的BXhVH3VL3、具有重链可变区VH5(SEQ ID NO:5)和轻链可变区VL1的BXhVH5VL1、以及具有重链可变区VH5和轻链可变区VL1的BXhVH5VL3。本文中使用的
MNAC13小鼠抗体具有重链可变区MNAC13 VH序列SEQ ID NO:20、重链序列SEQ ID NO 21和轻链序列SEQ ID NO:22。
[0213] 令人意外地,所有工程化抗体都受益于重链可变区位点37(Kabat编号(Kabat EA et al,ibid.))的缬氨酸到丙氨酸的简单替换(小鼠回复突变)。该取代具有非常独特的性能,所有工程化抗体经SPR测定可广泛地提高对人TrkA的亲和力。更重要地,相同的取代可导致大多数变体在TF-1细胞增殖测定中的效能提高,当导入与VL1结构域配对的VH5结构域中(GBRVH5(V37A)VL1抗体)时,令人意外地产生与BXhVH5VL1人源化抗体相比10倍的效能提高。值得注意地,相同的GBR VH5(V37A)VL1抗体在TF-1细胞增殖测定中还显示出与MNAC13小鼠抗体相比3倍的效能提高。
[0214] 由于人源化抗体中小鼠来源的残基数量增加可增加其免疫原性风险(Harding FA et al.,(2010)MAbs 2(3):256-65),进行了进一步研究以减少工程化抗体中小鼠残基的数量。将GBR VH5(V37A)VL1抗体中位点3的小鼠赖氨酸残基变为谷氨酰胺产生GBRVH5(K3Q,V37A)VL1抗体,其具有与BXhVH5VL1人源化抗体相比相同数量的小鼠残基但具有与亲本小鼠MNAC13抗体相比提高的结合亲和力、相等的FAB热稳定性和提高的抑制效能。
[0215] 最后,由于抗体介导的效应子功能对其中只需要TrkA阻断能力的治疗不利,需要开发能够抑制TrkA但不通过免疫细胞介导杀死TrkA表达细胞的抗TrkA抗体。人IGHG4同型不携带效应子功能例如ADCC或CDC,因此当不需要效应子功能或对治疗不
利时其是非常适合的抗体类型。但是,天然产生的人IGHG4同型的一个缺点是“FAB交
换”现象,天然产生的人IGHG4抗体可以此在体内交换重链(Labrijn AF et al.,(2009)Nat.Biotechnol.27(8):767-71)。阻断重组体和内源的人IGHG4之间重链交换的方法是本领域已知的,并且所述交换已知可通过将位于铰链区的位点228(EU编号,Edelman GM et al.,ibid.)的丝氨酸残基取代为脯氨酸残基有效地阻断,以此模拟人IGHG1同型中
存在的构象铰链结构(Lewis KB et al.,(2009)Mol.Immunol.46(16):3488-94)。将GBR VH5(V37A)VL1和GBR VH5(K3Q,V37A)VL1都格式化为IGHG4 S228P免疫球蛋白用于上述
治疗目的并且显示出与他们的IGHG1同型对应物(counterpart)等同的效能,以此使得
GBRVH5(V37A)VL1 IGHG4 S228P和GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P抗体适于只需要阻断TrkA的人的治疗。
[0216] 方法
[0217] 工程化变体的设计
[0218] VH5-VL1可变区配对的3D模型使用结构同源建模服务器SWISS-MODEL(ARNOLDK ET AL.,(2006)BIOINFORMATICS 22(2):195-201;HTTP://SWISSMODEL.EXPASY.ORG) 设定为自动操作模式进行计算。反演模型的模板是实验解析的MNAC13 FAB 3D结构(PDB
code 1SEQ,www.pdb.org,Berman HM et al.,(2000)Nucleic Acids Res.28(1):235-42,Covaceuszach S et al.,(2005)Proteins 58(3):717-27)。序列比对MNAC13 VH、VH1、VH3、VH5和种系VH3-023*01(SEQ ID NO:23)结构域显示,在位点:3、5、19、37、40、42、44、49、50、
52A、53、60、62、74、82A、83、84、89和94(Kabat编号)的氨基酸不同。模型分析使得可基于其对CDR区和/或重链-轻链可变区包装的推定的影响选择位点子集。所述位点子集由以下组成:3、37、40、42、44、49、50、60、62、89和94(Kabat编号)。因此,工程化抗体具有的重链可变区包含上述可变区序列(VH1、VH3和VH5,序列分别为SEQ ID NO:1、3、5)中选自上述位点子集的单个或多个位点的取代。更具体地,工程化抗体由上述取代的重链可变区和上述两个轻链可变区VL1或VL3(SEQ ID NO 6和8)中的一个配对组成。
[0219] 分子生物学
[0220] 编码工程化重链可变区的DNA序列(cDNA)是使用WO 09/098238中所述用于BXhVH1、BXhVH3和BXhVH5的载体DNA作为PCR模板通过标准诱变技术产生的。类似地,轻链可变区cDNA是从WO 09/098238中所述用于BXhVL1和BXhVL3的载体DNA直接扩增的。可
变区cDNA是在其相应的恒定区cDNA序列上游通过PCR组装技术进一步组装的。最后,将完整的重链和轻链cDNA连接到携带CMV启动子和牛生长素polyA信号的基于改良pcDNA3.1
载体(Invitrogen,CA,USA)的独立载体中。轻链特异性载体可通过BamHI和BsiWI限制酶位点将目标轻链可变区cDNA连接到κ轻链恒定区cDNA之前表达κ同型轻链;而重链特
异性载体是使用BamHI和SalI限制酶位点将目标重链可变区cDNA连接到编码IGHG1 CH1、IGHG1铰链区、IGHG1 CH2和IGHG1 CH3恒定区的cDNA序列之前构建的。在重链和轻链两个表达载体中,分泌是受含有BamHI位点的鼠VJ2C前导肽驱动的。BsiWI限制酶位点位于κ恒定区,而SalI限制酶位点见于IGHG1 CH1区中。
[0221] 含有S228P取代的IGHG4免疫球蛋白格式化通过将上述重链特异性载体中编码IGHG1 CH1、IGHG1铰链区、IGHG1 CH2和IGHG1 CH3恒定区的cDNA序列替换为编码IGHG4 CH1、具有S228P取代的IGHG4铰链区、IGHG4 CH2和IGHG4 CH3恒定区的cDNA序列实现的。
S228P取代是通过标准PCR诱变技术导入人IGHG4重链cDNA模板的。
[0222] 抗体产生
[0223] 为瞬时表达抗体,使用聚乙稀亚胺( Polyplus transfection,IllkirchCedex,France)将等量的重链和轻链载体共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA1细胞
( 目录号:CRL-10852)中。典型地,密度为0.8-1.2百万细胞/ml的100 ml细胞
悬液使用含有50μg编码重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体的
混合物转染。将编码抗体基因的重组表达载体转入宿主细胞后,通过进一步将所述细
胞培养4至5天产生抗体使其分泌到培养介质(EX-CELL 293,HEK293无血清培养基;
Sigma,Buchs,Switzerland,补充0.1%普朗尼克酸(pluronic acid)、4 mM谷氨酰胺和
0.25μg/ml遗传霉素)中。
[0224] 抗 体 使 用 重 组 蛋 白 A 层 流 介 质 (GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,Switzerland)从不含细胞的上清中纯化,并在测定之前将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。
[0225] 使用差示扫描量热法的稳定性测试
[0226] 量热学测定是使用VP-DSC差示扫描微量热仪(GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,Switzerland)实施的。细胞体积为0.128ml、加热速率为200℃/h、
超压维持在65p.s.i.。所有使用的抗体在PBS(pH7.4)中的浓度为1mg/ml。每种蛋白
的摩尔热容是通过比较去除蛋白的、含有相同缓冲液的平行双样评价的。偏摩尔热容
和熔解曲线是使用标准程序测定的。使用Origin软件(v7.0,GE Healthcare Europe
GmbH,Glattbrugg,Switzerland)中的非二态模型进一步分析前,将温度自记曲线进行基线校正和浓度标准化。
[0227] 通过SPR的亲和力测定
[0228] SPR分析用于测量不同抗体(小鼠抗体和人源化抗体)的结合动力学的结合与解离速率常数。小鼠抗体和人源化变体的结合动力学是使用BIACORE 2000装置(GE
Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,Switzerland)在室温测定,并使用软件(v4.1,GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,Switzerland)分析的。
[0229] 由于抗体是二价分子,最好将其固定于传感芯片上。如果将所述抗体用作分析物,那么SPR测定可产生亲和力以外的化合价组成。虽然BIAcore评估软件可模拟双价和提取亲和常数,然而任何可能的条件下均优选使用单价分析物以避免任何价偏。为达到该目的,通过消化HEK293-EBNA1细胞中产生的重组人TrkA-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:24)产生单价形式的人TrkA胞外区。所述融合蛋白包含融合到IGHG1 Fc区的人TrkA胞外区(SEQ IDNO:25),其中蛋白酶特异的裂解序列包含在所述2个区之间(TEV裂解蛋白酶氨基酸序列:
ENLYFQS)。蛋白酶裂解后,使用标准的色谱技术进一步将单价形式的人TrkA胞外区纯化至同质,其包括蛋白-A步骤以移除Fc片段。最后,将所述单价的人TrkA胞外区蛋白的缓冲液更换为PBS,然后稀释于Biacore运行缓冲液中用于亲和力测定。样品纯度、均一度和分子量通过SDS-PAGE和尺寸排阻分析确定。
[0230] 通过捕获其Fc区将抗体固定使其在所述传感芯片表面正确地定向。单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体传感芯片用于捕获所有人源化抗体而不考虑其同型(Human Antibody Capture Kit,目录号BR-1008-39,GE Healthcare Europe GmbH),并且多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白传感芯片用于捕获MNAC13小鼠抗体(Mouse Antibody Capture Kit,目录号BR-1008-38,GE Healthcare Europe GmbH)。
[0231] 数据(sensorgram:fc2-fc1)使用1:1 Langmuir传质模型拟合,尽管传质测试中具有小的传质限制。为说明每次测量开始时捕获抗体的实验误差,在所有拟合中将Rmax值设定为局部(local)。解离时间是至少350秒。测定重复三次,并且包括零浓度样品作为对照。Chi2和残差值都用于评估实验数据和个体结合模型之间拟合的质量
[0232] 使用TF-1细胞的增殖测定
[0233] 悬浮适应的TF-1细胞( 目录号:CRL-2003)培养于含10%FCS和5ng/mlrhuβNGF(重组人β-NGF,R&D Systems Europe Ltd,Abingdon,UK)的完全RPMI介质中。
为所述测定,将TF-1细胞在不含人β-NGF的完全RPMI中孵育5h。饥饿步骤后,将细胞离心并接种于含有不同浓度的每种抗体和固定浓度的重组β-NGF的平底96孔板中。TF-1的接种密度为7000个细胞/孔,并且抗体-细胞混合物的总体积是200μl,含有5ng/ml人
β-NGF(终浓度)。将所述混合物在37℃补充CO2的条件下孵育4天。第3天,在不改变孵育条件下将比色染料Alamar蓝(AbD Serotec,Morphosys AbD GmbH,Düsseldorf,Germany)TM
加入每孔中。第4天,在Bio-Tek Synergy 2分光光度计/酶标仪(BioTek Instruments GmbH,Luzern,Switzerland)上使用530到560nm激发波长和590nm发射波长进行荧光
数。实验进行至少2次,并且每种抗体浓度测定3个重复。
[0234] 结果
[0235] 基于BXhVH5VL1的工程化的新的人源化抗TrkA抗体
[0236] 基于VH5-VL1可变区配对的3D模型,选择不同重链可变区(VH1、VH3和VH5)中一组共有的3D位点用于小鼠到人和人到小鼠突变,该组位点包括:3、37、40、42、44、49、50、
60、62、89和94(Kabat编号)。关于本文中所用的取代组合的工程化策略是基于推定的不同取代对CDR区和/或可变区包装和/或免疫原性影响的互补性。
[0237] 第一种方法中,小鼠到人突变和人到小鼠突变是以具有IGHG1同型格式背景的BXhVH5VL1作为候选工程化的。进行的小鼠到人突变包括以下取代:K3Q、T40A、R44G、A49S、Y50A、P60A、T62S和R94K。基于所述单个取代或组合取代的一些工程化抗TrkA抗体的产物产率和亲和力分别见表1和2。组合多数或全部小鼠到人突变导致低产物产率并且完全丧失与TrkA的结合。例如,小鼠到人取代A49S与Y50A组合可完全消除结合,其未能被其他小鼠到人取代补救,并且小鼠到人取代K3Q、T40A、R44G和R94K单独或与其他小鼠到人取代的组合都未能产生亲和力的任何提高。
[0238] 进行的人到小鼠突变包括以下取代:V37A、G42E和V89L。人到小鼠取代V37A具有最积极的影响并导致至少2倍的亲和力提高(KD下降至少2倍)(表2和图1);GBR
VH5(V37A)VL1 IGHG1抗体记录产生了2.5倍亲和力提高。将人到小鼠取代V37A与人到小鼠取代P60A和T62S组合后,这种亲和力提高被消除,但将小鼠到人取代K3Q和/或R44G
组合时可保留这种亲和力提高。总之这些结果表明了位点49和50在提供结合时的重要
性,以及人到小鼠取代V37A在使BXhVH5VL1的亲和力增强至少2倍中的独特性能。由于
抗体介导的效应子功能可能不利于只需要阻断TrkA的治疗,将GBR VH5(V37A)VL1和GBR VH5(K3Q,V37A)VL1在上述含有S228P取代的IGHG4同型中重新格式化。两种工程化抗体显示出与其IGHG1同型对应物相似的亲和力,表明V37A取代产生的亲和力提高不受同型转换的影响。
[0239] 基于BXhVH1VL1、BXhVH3VL1 BXhVH3VL1和BXhVH5VL3工程化的新的人源化抗TrkA抗体
[0240] 第二种方法中,将V37A取代导入来自WO 09/098238的其他选择的候选中,并且通过SPR分析将所述工程化抗TrkA抗体的亲和力与BXhVH5VL1和MNAC13抗体进行比较。表3和4分别示出了V37A取代抗体的产物产率和亲和力。虽然工程化抗体具有不同的产物
产率,但是所有的工程化抗体在引入V37A取代后都显示出亲和力提高。对于BXhVH3VL1、BXhVH1VL1、BXhVH3VL3和BXhVH5VL3,亲和力分别提高8%、20%、30%和55%。因此,将人到小鼠取代V37A不仅导入BXhVH5VL1中不仅可导致亲和力提高,而且最令人意外地还可导致所有人源化变体的亲和力提高。值得注意地,GBR VH5(V37A)VL1或GBR VH5(K3Q,V37A)VL1都作为IGHG1或IGHG4 S228P同型,具有的亲和力可匹配测定的MNAC13小鼠抗体的亲和力(表2和4);与BXhVH5VL1抗体相比都提高至少2倍(KD分别下降2.5到2.7倍)。
[0241] 表3和图2包括所述工程化抗体中测定的FAB片段的解链温度。单克隆抗体的熔解曲线是其同型特有的,但是即使处于全长免疫球蛋白中,FAB片段的解链温度(Tm)的中值也可容易地确定(Garber E and Demarest SJ(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355(3):751-7)。这样的FAB片段解链温度的中值可用于检测所述工程化候选的稳定性。GBR VH5(V37A)VL1和GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 FAB片段分别在73.6℃和73℃出现
单次跃迁,两者具有等同的热稳定性且FAB跃迁的形状和幅度符合协同解链,这通常发现于精细折叠的FAB片段中,表明所述工程化过程成功地保持了FAB的稳定性。当比较GBR VH5(V37A)VL1或GBR VH5(K3Q,V37A)VL1的FAB Tm与MNAC13 FAB Tm(74℃)时,其差异在
1℃之内或更小,这是另外的例证。
[0242] 工程化抗TrkA抗体的功能测试
[0243] 在TF-1细胞增殖测定中测定工程化抗TrkA抗体抑制TrkA功能活化的能力(图3)。半数最大抑制浓度(IC50)是化合物抑制生物学功能的有效性的量度,其是通过每条曲线计算的,结果见表5。注意,GBR VH1(V37A)VL1未进行测定,因为其SRP亲和力较低。
[0244] GBR VH5(V37A)VL1具有最好的效果,其次是GBR VH5(K3Q,V37A)VL1、GBRVH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P和GBR VH3(V37A)VL1,其具有相同的IC50。GBR VH3(V37A)VL3和GBR VH5(V37A)VL3抗体的IC50稍高,但是所有测试的工程化抗体都比BXhVH5VL1,GBR VH5(V37A)VL1好超过10倍。值得注意地,在TF-1细胞增殖测定中,与MNAC13小鼠抗体相比,GBR VH5(V37A)VL1抗体还显示出3倍的效能提高。所有的V37A变体与小鼠亲本抗体相比具有等同或更好的IC50。
[0245] 表1:基于BXhVH5VL1选择的工程化抗TrkA抗体的产物产率;除非另有说明否则+所有抗体都是IGHG1同型。(*)含有S228P取代的IGHG4同型。包含实施例1所述的小
鼠到人突变和人到小鼠突变。
[0246]
[0247] 表2:基于BXhVH5VL1选择的工程化抗TrkA抗体的亲和力;除非另有说明否则所有抗体都是IGHG1同型。(*)含有S228P取代的IGHG4同型。N.B.表示无结合。
[0248]
[0249] 表3:所选择工程化抗TrkA抗体的产物产率和FAB热稳定性数据;所有抗体都是IGHG1同型。
[0250]
[0251] 表4:V37A工程化抗TrkA抗体的亲和力;所有抗体都是IGHG1同型。
[0252]抗TrkA抗体 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(nM)
MNAC13 6.02x104 1.09x10-3 18
4 -2
BXhVH1VL1 3.13x10 1.33x10 426
GBR VH1(V37A)VL1 1.96x104 6.63x10-3 338
BXhVH3VL1 4.65x104 6.19x10-3 133
GBR VH3(V37A)VL1 3.82x104 4.71x10-3 123
BXhVH3VL3 3.14x104 4.59x10-3 134
GBR VH3(V37A)VL3 3.1x104 2.95x10-3 95
BXhVH5VL1 1.04x105 4.26x10-3 40.9
GBR VH5(V37A)VL1 1.4x105 2.25x10-3 16
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 1.7x105 2.62x10-3 15.4
GBR VH5VL3 6.23x104 3.95x10-3 63
GBR VH5(V37A)VL3 7.45x104 2.05x10-3 28
[0253] 表5:V37A工程化抗TrkA抗体的TF-1细胞增殖测定IC50;除非另有说明否则所有抗体都是IGHG1同型。(*)含有S228P取代的IGHG4同型。N.D.表示未测定。
[0254]抗TrkA抗体 IC50(μg/ml)
MNAC13 0.23
BXhVH5VL 1 0.73
GBR VH1(V37A)VL1 N.D.
GBR VH3(V37A)VL1 0.15
GBR VH3(V37A)VL3 0.29
GBR VH5(V37A)VL1 0.075
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 0.15
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1(*) 0.15
GBR VH5(V37A)VL3 0.22
[0255] 实施例2:人源化抗TrkA抗体逆转足底注射CFA诱导的爪急性炎性痛觉过敏
[0256] 足底注射完全弗氏佐剂(CFA)至小鼠的一只后爪可引起急性炎性痛觉过敏,其可用负重方法进行评估。空白小鼠通常将其体重等量地分布于其2个后爪。但是,当注射CFA的后爪发炎并产生疼痛时,其重新分配体重以减轻分配于经注射的后爪(同侧)上的体重并增加分配于非注射的后爪(对侧)上的体重。
[0257] 方法
[0258] 每只后爪的负重是使用双足平衡测痛仪(Linton Instruments,UK)测定的。将小鼠放至双足平衡测痛仪中,将其后爪置于不同的传感器上并记录两侧后爪施加的平均力超过2秒。使初次接受试验的AMB1小鼠在其鼠笼中适应操作室,食物和水不限量供应。所述AMB1小鼠是通过将小鼠TrkA的外显子1替代为其人源的对应部分,因此其专有地表达人TrkA蛋白。对双足平衡测痛仪的适应进行数天。诱导刺激之前记录基线负重。
[0259] 炎性痛觉过敏是通过足底注射CFA(20ul 1.5mg/ml溶液)至左侧后爪诱导的。记录预处理负重读数以估算CFA处理后23小时的痛觉过敏。然后依据拉丁方设计中的CFA窗口将动物排列并随机分配。CFA处理后24小时,将动物用单次腹膜注射0.1mg/kg同型对照处理或者0.0001、0.001、0.01和0.1mg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P腹膜注射(10ml/kg剂量体积)处理。非选择性NSAID吲哚美辛以10mg/kg口服(5ml/kg剂
量体积)用作阳性对照。抗体/药物处理后4、8、24、48、72、96和120小时记录负重读数。
[0260] 行为评估是盲评进行。记录同侧和对侧后爪的负重(g)读数,并表述为%负重差异(%同侧/对侧)。通过比较每个时间点的处理组与同型对照组分析数据。以重复测量ANOVA进行统计分析,然后使用InVivoStat进行计划比较试验(p<0.05为显著)。
[0261] 结果
[0262] 足底注射CFA可诱导显著的痛觉过敏,CFA处理后23小时检测到负重从同侧转移到对侧后爪,导致%同侧/对侧比率下降(图4)。CFA处理后24小时开始的同型对照处理显示出对痛觉过敏无效。0.01和0.1mg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P给药后4-48小时观察到与同型对照相比显著的痛觉过敏逆转。0.001 mg/kg或更低剂量的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1IGHG4 S228P对逆转痛觉过敏是无效的。吲哚美辛(10 mg/kg)在所有测试的时间点都可显著逆转痛觉过敏。总之,抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P可显著逆转所述爪的急性炎性痛觉过敏,与吲哚美辛类似。此外,GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P施用的有效剂量(0.01和0.1mg/kg)比吲哚美辛的有效剂量(10mg/kg)低许多倍,这表明抗TrkA抗体可以比该病况的标准治疗低得多的剂量施用。
[0263] 实施例3:人源化抗TrkA抗体逆转关节内注射CFA诱导的膝关节慢性炎性痛觉过敏
[0264] 关节内注射CFA至小鼠后肢的一侧膝关节诱导慢性炎性痛觉过敏,其可用负重方法进行评估。当注射CFA的关节发炎并产生疼痛时,其重新分配体重以减轻分配于经注射的(同侧)关节的后肢上的体重并增加分配于非注射(对侧)关节的后肢上的体重。动物模型中这些征兆的发展被认为是临床上相关的,由于其反映了与潜在病况例如骨关节炎和风湿性关节炎相关的慢性炎性关节痛患者的症状。
[0265] 方法
[0266] 使初次接受试验的AMB1小鼠在其鼠笼中适应操作室,食物和水不限量供应。所述AMB1小鼠是通过将小鼠TrkA的外显子1替代为其人源的对应部分,因此其专有地表达人TrkA蛋白。对双足平衡测痛仪的适应进行数天。诱导刺激之前记录基线负重。使用3:1混合的异氟醚和氧在无菌状况下将动物麻醉。将膝盖区剃毛并用稀释的消毒剂溶液洗净。将左膝注射10μl 10mg/ml的CFA。在返回鼠笼前,使动物在温暖环境中恢复。CFA处理后第4、7和10天使用负重方法评估动物炎性痛觉过敏的发展。基于CFA处理后第10天的测定,依据其CFA窗口将动物排列并随机分配到处理组。CFA处理后第13天,当痛觉过敏已很好地建立时,单次腹膜注射10mg/kg同型对照抗体或者以0.01、1和10mg/kg单次腹膜注射抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P处理动物。COX-2选择性NSAID塞来考昔以每天
2次60mg/kg口服作为阳性对照。对于抗体处理组,给药后第4、8、24和96小时测定负重。
对于塞来考昔处理组,CFA处理后第13天给药后第1和8小时以及CFA处理后第14-17天
给药后第1小时测定负重。行为评估是盲评进行。记录同侧和对侧后肢的负重(g)读数,并表述为%负重差异(%同侧/对侧)。通过比较每个时间点的处理组与同型对照组分析数据。以重复测量ANOVA进行统计分析,然后使用InVivoStat进行计划比较试验(p<0.05为显著)。
[0267] 结果
[0268] 将CFA注入膝关节从第3天起可引起显著且长期的痛觉过敏,检测到负重从同侧转移到对侧后肢,导致%同侧/对侧比率下降(图5)。同型对照抗体处理对痛觉过敏无效。处理过程中,使用塞来考昔(60mg/kg)给药后1小时,可检测到显著逆转痛觉过敏。单次注射0.01、1和10mg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P,从给药后4-72小时观察到显著逆转痛觉过敏,在第96小时与同型对照相比只有最大的2个剂量是显著的。总之,单剂量0.01mg/kg或更高的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P可显著并长效地逆转膝关节慢性炎性痛觉过敏,与多剂量塞来考昔类似。此外,只需要单剂量0.01mg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P即能达到与多剂量60mg/kg塞来考昔相当的效果,这表明抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1IGHG4 S228P可以比目前使用NSAID塞来考昔的标准治疗低得多的剂量和更低的频率给予。
[0269] 实施例4:人源化抗TrkA抗体逆转关节内注射MIA诱导的膝关节慢性骨关节炎痛觉过敏
[0270] 关节内注射碘乙酸钠(MIA)至小鼠的膝关节导致发展为与局部关节炎症相关的慢性炎性痛觉过敏及软骨退化。因此,MIA模型中测定的痛觉过敏与骨关节炎相关的疼痛非常相似。此外,软骨退化导致具有类神经病理性特征的慢性神经元损伤。由于抗惊厥药(anticonvuldant)普瑞巴林被推荐为治疗神经性疼痛的一线药物,其在此用作比较化合物。弱μ阿片受体激动剂曲马多越来越多地被用于治疗OA,因为与NSAID相反,曲马多既不会引起胃肠出血或肾脏问题,也不会影响关节软骨。因此,曲马多与普瑞巴林一起用作抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P的对照。
[0271] 方法
[0272] 使初次接受试验的AMB1小鼠在其鼠笼中适应操作室,食物和水不限量供应。所述AMB1小鼠是通过将小鼠TrkA的外显子1替代为其人源的对应部分,因此其专有地表达人TrkA蛋白。对双足平衡测痛仪的适应进行数天。进行基线负重读数测量。使用3:1混合的异氟醚和氧在无菌状况下将动物麻醉。将膝盖区剃毛并用稀释的消毒剂溶液洗净。将5μl100mg/ml(500μg)MIA或者盐水(sham)注入左侧后肢的膝关节。在返回鼠笼前,使动物在温暖环境中恢复。MIA处理后第3-23天,使用负重方法每隔一定时间评估动物膝关节痛觉过敏的发展。MIA处理后第14天,进行负重测定,依据其MIA响应窗口将动物排列并随机分配到处理组,然后通过单次腹膜注射1、10、100μg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P或100μg/kg同型对照抗体(5ml/kg剂量体积)进行处理。作为比较的对照,MIA处理后第14天口服10mg/kg曲马多或者30mg/kg普瑞巴林(5ml/kg剂量体积)处理动物,
然后在MIA处理后第16-22天使用30mg/kg曲马多或者100mg/kg普瑞巴林隔日处理动物
(5ml/kg剂量体积)。MIA处理后第14天在给药后4、8和24小时通过负重评估所有动物,然后每24小时评估抗体处理组,对于曲马多和普瑞巴林处理组给药后第1小时和第24小时进行评估。行为评估是盲评进行。记录同侧和对侧后肢的负重(g)读数,并表述为%负重差异(%同侧/对侧)。通过比较每个时间点(MIA处理后第3-14天)的处理组与sham
组分析数据,以分析MIA对痛觉过敏的影响。通过比较每个时间点的处理组与同型对照组分析给药后的数据。以重复测量ANOVA进行统计分析,然后使用InVivoStat进行计划比较试验(p<0.05为显著)。
[0273] 结果
[0274] 将500μg MIA注入膝关节从第3天起可引起显著的痛觉过敏,检测到负重从同侧转移到对侧后肢,导致%同侧/对侧比率下降。单次注射10μg/kg和100μg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P后第4小时到第7天,可发现每个时间点与同型对照相比显著逆转痛觉过敏(图6A)。1μg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P对痛觉过敏无效。MIA处理后第14天,给药曲马多(10mg/kg)和普瑞巴林(30mg/kg)后1小时无效,但是给药后4小时可显著逆转痛觉过敏(图6B)。由于MIA处理后第14天给药后1小时无效,将曲马多提高至30mg/kg和普瑞巴林提高至100mg/kg,都在MIA处理后第16、18和
20天在给药后1小时显示出可显著逆转痛觉过敏。总之,单剂量10μg/kg或更高的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P可显著并长效地逆转膝关节慢性骨关节炎痛觉过敏,与多剂量曲马多和普瑞巴林类似。此外,只需要单剂量10μg/kg抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P即可达到与多剂量的曲马多和普瑞巴林两种药物(剂量高出很多,分别为
30mg/kg和100mg/kg)相当的效果。因此,抗TrkA抗体可以比普瑞巴林和曲马多低得多的剂量和较低的给药频率施用。
[0275] 实施例5:人源化抗TrkA抗体逆转坐骨神经慢性缩窄性损伤诱导的周围神经性痛觉过敏和异常性疼痛
[0276] 周围神经性疼痛是由周围神经系统的损伤、功能障碍或疾病引起的慢性疼痛。其通常包括痛觉过敏(对痛性刺激的反应提高)以及异常性疼痛(对非痛性刺激的痛性反应)。神经性疼痛可由实验损伤动物体内的周围神经诱导,并且其通常是通过由宽松结扎引起的坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)实现的(Bennett&Xie(1998)Pain,33:87-107)。由于普瑞巴林被推荐为治疗神经性疼痛的一线药物,其在此用作比较化合物。
[0277] 方法
[0278] CCI手术是在氯胺酮和甲苯噻嗪(腹腔注射100和10mg/kg/10ml)麻醉下在雄性和雌性AMB1小鼠中实施的。AMB1小鼠是通过将小鼠TrkA的外显子1替代为其人源的对应部分,因此其专有地表达人TrkA蛋白。剪去毛发后,在无菌条件下将左侧大腿正中间的坐骨神经露出。在神经分支前1-2mm将3个松散结扎线(使用4-0黑丝线)围绕坐骨神经放
置。手术位点经皮缝术后使用聚维酮碘溶液处理。此后使动物恢复7天。实验前一天,使动物适应测量装置(制冷板)并记录给药前(0hr)的缩足阈值。然后将动物重组为6组。
第二天,将动物单次腹膜注射同型对照抗体(1000μg/kg/10 ml)或者不同剂量的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P(10、100和1000μg/kg/10ml)进行处理。给药后的7天中,每天1次给予普瑞巴林(30mg/kg/10ml,口服)或盐水。第4h、24h及其后每隔1天记录给药后读数直到给药后第7天。在所有中给予普瑞巴林或盐水后1h记录给药后读数。首先记录机械性痛觉过敏的给药后读数和5分钟后记录冷痛的给药后读数。机械性痛觉过敏是以使用动态足底触觉计(Plantar Von Frey instrument;Ugo Basile Srl,Italy)引起缩足所需的极限力(g)测定的。冷痛是以由制冷板引起的缩足所需的时间(秒)测定的
(IITC Life Science Inc.,USA)。
[0279] 结果
[0280] CCI手术后7天,小鼠显示出显著的机械性痛觉过敏(图7A)和冷痛(图7B),其缩足阈值和缩足潜伏期分别急剧下降。所有剂量的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P均可逆转机械性痛觉过敏,可见缩足阈值(图7A)和冷痛(图7B)的增加,并可见缩足潜伏期增加。这种逆转的程度和持续时间明显地剂量依赖,并且两个读数都与最高剂量1mg/kg(1000μg/kg)的普瑞巴林相当。单剂量施用时,1mg/kg剂量的抗体GBR VH5(K3Q,V37A)VL1IGHG4 S228P是有效的,相当于30mg/kg多剂量普瑞巴林,也显示抗TrkA抗体可以比普瑞巴林的标准治疗更低的剂量和更低的给药频率施用。
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