治疗坏死性小肠结肠炎的方法
阅读：710发布：2020-05-11
专利汇可以提供治疗坏死性小肠结肠炎的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 治疗 患者的 坏死 性小肠结肠炎的方法，所述方法包括将含有一 氧 化 碳 的药物组合物 给药 患者。，下面是治疗坏死性小肠结肠炎的方法专利的具体信息内容。
1.治疗患者的坏死性小肠结肠炎的方法，所述方法包括：
判定患有或易患坏死性小肠结肠炎的患者；且给药该患者一种药物组 合物，所述组合物包含有效治疗该患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化 碳。
2.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是通过吸入给药患者的。
3.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是液体形式的，并经口服 给药患者。
4.权利要求1的方法，其中所述药物组合物直接给药至患者的腹腔。
5.权利要求1的方法，其中所述患者是婴儿。
6.权利要求5的方法，其中所述患者是早产婴儿。
7.权利要求1的方法，其中所述患者显示低出生体重。
8.权利要求1的方法，其中所述患者显示低氧。
9.权利要求1的方法，其中所述患者显示低体温。
10.权利要求1的方法，其中所述患者显示低血压。
11.权利要求1的方法，其中所述患者显示血液高粘滞性。
12.权利要求1的方法，其中所述患者显示酸中毒。
13.权利要求1的方法，其中所述患者已接受交换输血。
14.权利要求1的方法，其中所述患者已接受至少一种重量渗摩尔浓 度过高的食物。
15.权利要求1的方法，其中所述患者已接受浓缩细胞输注。
16.权利要求1的方法，其中所述患者已接受过量的钙拮抗剂。
17.权利要求1的方法，其中所述患者患有肠系膜缺血。
18.权利要求1的方法，其中所述患者患有肠壁的细菌感染。
19.权利要求1的方法，其中所述患者已接受外科手术。
20.权利要求1的方法，其中所述患者将要接受外科手术。
21.权利要求1的方法，其中所述患者正在接受外科手术。
22.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是气体形式。
23.权利要求1的方法，还包括给予患者以下治疗之一：静脉内营养； 静脉内水合作用；抗微生物剂；对患者实施鼻胃减压，对患者实施外科手 术；和对患者实施腹腔引流。
24.治疗患者的坏死性小肠结肠炎的方法，所述方法包括：
(a)鉴定患有坏死性小肠结肠炎的患者；
(b)对患者实施外科手术切除患者肠的病变部分；和
(c)在(a)之后，并且在(b)之前，期间，或之后，对该患者给药包含有效 治疗该患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化碳的药物组合物。
25.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是通过人工肺给药的。
26.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是通过体外膜气体交换 装置给药给药的。
27.治疗患者的坏死性小肠结肠炎的方法，所述方法包括：
(a)鉴定患有或易患坏死性小肠结肠炎的患者；
(b)提供含有加压气体的容器，所述加压气体包含一氧化碳气体；
(c)从所述容器内释放加压气体，形成含有一氧化碳气体的环境；和
(d)将患者暴露于所述环境，该环境中一氧化碳的量足以治疗患者的坏 死性小肠结肠炎。
28.包含医用级别的压缩一氧化碳气体的容器，所述容器带有标签， 其表明该气体可用于治疗患者的坏死性小肠结肠炎。
29.权利要求28的容器，其中的一氧化碳气体与含有氧气的气体混合。
30.权利要求29的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约 0.025％。
31.权利要求29的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约 0.05％。
32.权利要求29的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约 0.10％。
33.权利要求29的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约 1.0％。
34.权利要求29的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约 2.0％。
技术领域
背景技术
CO被认为是一种重要的信号分子(Verma等，Science 259：381-384， 1993)。据称一氧化碳是脑内的神经信使分子(Id.)和下丘脑内的神经内分泌 调节物(Pozzoli等，Endocrinology 735：2314-23171994)。和一氧化氮一样， CO是平滑肌的松弛剂(Utz等，Biochem Pharmacol.47：195-201，1991； Christodoulides等，Circulation 97：2306-9，1995)并且抑制血小板聚集 (Mansouri等，Thromb Haemost.48：286-8，1982)。一些模型中吸入低水平 的CO后显示具有抗炎效果。
坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种以肠屏障失效(gut barrier failure)，肠坏 死，脓毒症，和多系统器官衰竭为特征的新生儿疾病(参照，例如，Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
发明简述
本发明部分基于这样的发现：给药CO可阻止NEC的发展。
相应地，本发明提供了治疗，预防，或减少患者患坏死性小肠结肠炎 的危险性的方法。所述方法包括鉴定患有或易患坏死性小肠结肠炎的患者， 以及将包含有效治疗患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化碳得要区组合 物给药所述患者。本方法还包括监测患者的NEC病情和/或确定患者的病情 是否改善或NEC的患病危险性是否降低的步骤。
可以通过本领域已知的任何将气体，液体，和/或固体给药患者的方法， 例如通过吸入，吹入，输注，注射，和/或摄入将所述药物组合物给药患者。 在本发明的一个具体实施方案中，所述药物组合物通过吸入给药患者。在 另一实施方案中，所述药物组合物通过口服给药患者。在另一实施方案中， 所述药物组合物直接给药患者的腹腔。在另一实施方案中，所述药物组合 物通过体外膜气体交换装置(extracorporeal membrane gas exchange device)或 人工肺给药患者。
所述患者可以是婴儿，例如足月儿，早产儿和/或低出生体重婴儿。此 婴儿可以是新生儿，或可以是，如一周岁以内(例如，六个月，四个月，三 个月，或两个月大)。所述婴儿可以小于六周，如小于四周。NEC可以是下 列多个因素中任何因素的结果，如低氧，低体温，低血压，血液粘滞度过 高，和/或酸中毒，和/或患者接受交换输血(exchange transfusion)，至少一种 重量渗摩尔浓度过高的食物，浓缩细胞输注(packed cell transfusion)，和/或 钙拮抗剂过量。此外，NEC可以由于患者患有肠系膜缺血和/或肠壁细菌感 染的情形而引起(参照，如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编， Oxford University Press(1994))。可选地，NEC可由外科手术引起，如当患 者已经接收过手术，将要接收手术，或正在接收手术的情况。所述药物组 合物可以成为任何形式，如气体或液体形式。
本发明还涉及治疗和预防患者的坏死性小肠结肠炎的方法，所述方法 包括鉴定患有或可能患坏死性小肠结肠炎的患者，并提供含有包含CO气体 的加压气体的容器，从此容器中释放加压气体形成包含CO气体的环境，并 使患者暴露于所述环境，所述环境中的CO的量足以治疗患者的坏死性小肠 结肠炎。
另一方面，本发明提供了对患者(如婴儿)实施腹部外科手术的方法。所 述方法包括鉴定需要腹部手术的患者，其中坏死性小肠结肠炎是腹部手术 的重要危险因素；对患者实施腹部手术，并在该实施手术步骤以前，期间， 或以后，使患者吸入足以降低患者发生坏死性小肠结肠炎的危险性的量的 CO气体。
本发明还包括治疗患者的坏死性小肠结肠炎的方法。所述方法包括：(a) 鉴定患有坏死性小肠结肠炎的患者；(b)对该患者实施外科手术以切除其肠 的病变部分；和(c)在步骤(a)后以及步骤(b)以前，期间，或以后，给药患者 包含有效地治疗患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化碳的药物组合物。
本发明另一方面提供了一种容器，所述容器包含医用级别的压缩CO气 体。该容器带有说明该气体可用于治疗患者的NEC(例如婴儿患者)的标签。 CO气体可以与氮气，或与一氧化氮和氮气，或与含有氧气的气体混合。所 述混合物中CO气体的浓度至少约0.025％，例如至少约0.05％，0.10％， 0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。
本发明另一方面提供了治疗患者的NEC的方法。所述方法包括鉴定患 有或可能患有NEC的患者，以及与CO治疗联合给药患者至少一种以下治 疗方法：诱导患者的HO-1(血红素加氧酶-1)或铁蛋白；使患者体内的重组 HO-1或铁蛋白的表达；和给药患者包含HO-1，胆红素，胆绿素，铁蛋白， 或去铁铁蛋白，铁，去铁敏(desferonxamine)，或右旋糖酐铁(iron dextran)的 药物组合物。还涉及CO和以上任一成分在制备用于治疗或预防NEC的药 物中的用途。
本发明还提供了治疗患者的NEC的方法。所述方法包括鉴定患有或可 能患有NEC的患者，以及与CO治疗联合给药患者至少一种以下治疗方法： 静脉内营养；静脉内水合作用(intravenous hydration)；抗微生物剂；对患者 实施鼻胃减压，对患者实施外科手术；和对患者的腹腔(peritoneal cavity) 进行引流。
本发明还提供了CO在制备用于治疗或预防NEC的药物中的用途。该 药物可用于根据本文所述的方法治疗患有或可能患NEC的患者的NEC。该 药物可为本文所述的任何形式，如包含液体或气体CO的组合物。
除非另有限定，本文所用所有技术和科学用语都和本发明所属领域的 普通技术人员所理解的一样。适宜的方法和材料见下文，但与本文的方法 和材料类似或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明。所有公开出版 物，专利申请，专利和其它本文涉及的对比文件的全文内容都包含在文中 作参考。如有抵触，本说明书，包括定义将作为指导。所述材料，方法和 实施例均只做举例而不是限制。
本发明的的一个或多个实施方案的细节内容将在下文的说明中阐述。 本发明的其它特征，目的，和优点从以下的说明和权利要求显而易见。
附图说明
图1A是Western印迹图，它显示了和非NEC患者(对照)相比较，患有 NEC的人类新生儿的肠样品中，HO-1的表达增加(n＝3)。
图1B是Western印迹图，它显示了和母乳喂养的对照组大鼠相比较(对 照)，接受间断低氧和配方喂养(formula fed)的新生大鼠(NEC)中，回肠HO-1 蛋白在第四天增长。
图2A是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装(ileal whole mount)的显微 照片(40X放大率)，显示母乳喂养对新生大鼠的影响。此样品在第四天获 得。
图2B是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大率)， 显示母乳喂养和CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图2C是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大率)， 显示配方喂养加低氧暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。可观 察到结构改变包括绒毛萎缩和细胞空泡形成。
图2D是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大 率)，显示配方喂养加低氧暴露和CO暴露对新生大鼠的影响。与图2C中显 示的样品比较，可观察到较少的结构改变。此样品在第四天获得。
图3A是经末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿苷(dUTP)断端 (nick end)标记(TUNEL)染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显示 母乳喂养对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图3B是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示母乳喂养和CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图3C是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示配方喂养加低氧暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。取材于 低氧/配方喂养的大鼠的回肠与取材于母乳喂养的动物的回肠相比，显示出 增加的TUNEL染色。
图3D是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示配方喂养加低氧暴露以及CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获 得。可观察到TUNEL阳性的细胞减少。
图4A是柱图，它显示了和对照组相比，CO治疗可防止低氧暴露加配 方喂养的新生大鼠的血清IL-1β水平的增加(P＜0.05)。此数据是应用酶联免 疫吸附测定(ELISA)产生的。黑色柱＝暴露于空气的大鼠；灰色柱＝暴露于 CO的大鼠。
图4B是柱图，它显示了和对照组相比，CO治疗可防止低氧暴露加配 方喂养的新生大鼠的血清TNF-α水平的增加(P＜0.05)。此数据是应用ELISA 测定产生的。黑色柱＝暴露于空气的大鼠；灰色柱＝暴露于CO的大鼠。
图5是Western印迹图，它显示了和对照组相比，CO治疗可降低低氧 暴露加配方喂养的新生大鼠的回肠COX-2和IL-1β的表达。每种治疗的存 在(+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹泳道的下方(母乳喂养(BF)，配 方喂养加低氧暴露(FF/低氧)，CO暴露(CO))。印迹显示每组的3-4只动物， 并且是该研究中所有动物的代表。
图6是Western印迹图，它显示了CO暴露可消除在新生大鼠中实验 NEC诱导的回肠iNOS表达和蛋白硝化(protein nitration)。每种治疗的存在 (+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹泳道的下方(母乳喂养(BF)，配方 喂养加低氧暴露(FF/低氧)，CO暴露(CO))。
图7是柱图，它显示了CO暴露和HO-1的诱导可减少TNF-α/放线菌 素D(TNF-α/ActD)诱导的IEC-6细胞的死亡。经TNF-α(TNF；10ng/ml)/ 放线菌素D(ActD；200ng/ml)处理的IEC-6细胞的生存力在18小时后通过测 量细胞的ATP含量而被测定。CO治疗(CO；灰色柱；250ppm)在给药TNF- α/ActD前一小时开始，并在整个实验过程中维持。交叉斜纹柱＝暴露于 TNF-α/ActD前先暴露于钴卟啉(CoPP)16小时的细胞。黑色柱＝暴露于空 气的细胞。CO和CoPP都可显著减少TNF-α/ActD)诱导的IEC-6细胞的死 亡(P＜0.05)。结果是各重复三次进行的三组独立实验的平均值±标准误差。
图8A是Western印迹图，它显示了(在24小时)在经脂多糖(LPS)和/或 低氧(1％氧气)处理的IEC-6细胞中iNOS蛋白质的表达受到抑制。CO治疗 开始于加入LPS/低氧之前1小时，并维持于整个实验过程。LPS(10或 100ng/ml)加低氧的组合增加iNOS蛋白表达，但该作用可被CO抑制。每种 治疗的存在(+)或缺乏(-)分别标注于每条Western印迹的下方(脂多糖 (lps)，低氧暴露(低氧)，CO暴露(CO))。
图8B是Western印迹图，它显示了在经LPS(100ng/ml)/低氧(1％氧气； lps/低氧)处理的IEC-6细胞中大鼠iNOS启动子的活性受到CO暴露的抑 制。测定细胞的萤光素酶活性。LPS加低氧的组合可使iNOS启动子的转录 激活增加4.9±0.3倍(P＜0.05)。CO可限制此转录活化至增加1.7±0.2倍 (P＜0.05)。结果是各重复三次进行的三组独立实验的平均值±标准误差。
图8C是Western印迹图，它显示了在IEC-6细胞中，细胞因子诱导的 iNOS蛋白质的表达可被HO-1的诱导或CO治疗抑制。IEC-6细胞经含有 TNF-α(10ng/ml)，IL-1β(500U/ml)，和IFN-γ(1000U/ml)的细胞因子混合物 (CM)处理24小时。CO治疗(250ppm)开始于加入CM之前1小时，并在整 个实验过程维持。钴卟啉(CoPP)在CM治疗之前16小时给药。CM增加了 IEC-6细胞的iNOS蛋白。CO和CoPP都可抑制细胞因子诱导的iNOS蛋白 的增加。每种治疗的存在(+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹的泳道 的下方(细胞因子混合物(CM)，CO暴露(CO)，钴卟啉暴露(CoPP))。
图8D是柱图，它显示了暴露于CM加CO或CoPP之一的IEC-6细胞 上清液中亚硝酸盐的水平低于暴露于CM和空气的IEC-6细胞中的亚硝酸 盐水平(由Griess法测定)。细胞因子刺激将亚硝酸盐增加至17.2±0.9μM， 而未受刺激的对照增加到1.4±0.3μM(P＜0.01)。CO和CoPP均可显著抑制 细胞因子的这种作用，分别得到的亚硝酸盐水平为9.8±0.7和10.4±1.0(与 CM刺激的细胞相比较P＜0.05)。黑色柱＝暴露于空气的细胞；灰色柱＝暴 露于CO的细胞；和交叉斜纹柱＝暴露于CoPP的细胞。
坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种以肠屏障失效(gut barrier failure)，肠坏 死，脓毒症，和多系统器官衰竭为特征的新生儿疾病(参照，例如，Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
发明简述
本发明部分基于这样的发现：给药CO可阻止NEC的发展。
相应地，本发明提供了治疗，预防，或减少患者患坏死性小肠结肠炎 的危险性的方法。所述方法包括鉴定患有或易患坏死性小肠结肠炎的患者， 以及将包含有效治疗患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化碳得要区组合 物给药所述患者。本方法还包括监测患者的NEC病情和/或确定患者的病情 是否改善或NEC的患病危险性是否降低的步骤。
可以通过本领域已知的任何将气体，液体，和/或固体给药患者的方法， 例如通过吸入，吹入，输注，注射，和/或摄入将所述药物组合物给药患者。 在本发明的一个具体实施方案中，所述药物组合物通过吸入给药患者。在 另一实施方案中，所述药物组合物通过口服给药患者。在另一实施方案中， 所述药物组合物直接给药患者的腹腔。在另一实施方案中，所述药物组合 物通过体外膜气体交换装置(extracorporeal membrane gas exchange device)或 人工肺给药患者。
所述患者可以是婴儿，例如足月儿，早产儿和/或低出生体重婴儿。此 婴儿可以是新生儿，或可以是，如一周岁以内(例如，六个月，四个月，三 个月，或两个月大)。所述婴儿可以小于六周，如小于四周。NEC可以是下 列多个因素中任何因素的结果，如低氧，低体温，低血压，血液粘滞度过 高，和/或酸中毒，和/或患者接受交换输血(exchange transfusion)，至少一种 重量渗摩尔浓度过高的食物，浓缩细胞输注(packed cell transfusion)，和/或 钙拮抗剂过量。此外，NEC可以由于患者患有肠系膜缺血和/或肠壁细菌感 染的情形而引起(参照，如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编， Oxford University Press(1994))。可选地，NEC可由外科手术引起，如当患 者已经接收过手术，将要接收手术，或正在接收手术的情况。所述药物组 合物可以成为任何形式，如气体或液体形式。
本发明还涉及治疗和预防患者的坏死性小肠结肠炎的方法，所述方法 包括鉴定患有或可能患坏死性小肠结肠炎的患者，并提供含有包含CO气体 的加压气体的容器，从此容器中释放加压气体形成包含CO气体的环境，并 使患者暴露于所述环境，所述环境中的CO的量足以治疗患者的坏死性小肠 结肠炎。
另一方面，本发明提供了对患者(如婴儿)实施腹部外科手术的方法。所 述方法包括鉴定需要腹部手术的患者，其中坏死性小肠结肠炎是腹部手术 的重要危险因素；对患者实施腹部手术，并在该实施手术步骤以前，期间， 或以后，使患者吸入足以降低患者发生坏死性小肠结肠炎的危险性的量的 CO气体。
本发明还包括治疗患者的坏死性小肠结肠炎的方法。所述方法包括：(a) 鉴定患有坏死性小肠结肠炎的患者；(b)对该患者实施外科手术以切除其肠 的病变部分；和(c)在步骤(a)后以及步骤(b)以前，期间，或以后，给药患者 包含有效地治疗患者的坏死性小肠结肠炎的量的一氧化碳的药物组合物。
本发明另一方面提供了一种容器，所述容器包含医用级别的压缩CO气 体。该容器带有说明该气体可用于治疗患者的NEC(例如婴儿患者)的标签。 CO气体可以与氮气，或与一氧化氮和氮气，或与含有氧气的气体混合。所 述混合物中CO气体的浓度至少约0.025％，例如至少约0.05％，0.10％， 0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。
本发明另一方面提供了治疗患者的NEC的方法。所述方法包括鉴定患 有或可能患有NEC的患者，以及与CO治疗联合给药患者至少一种以下治 疗方法：诱导患者的HO-1(血红素加氧酶-1)或铁蛋白；使患者体内的重组 HO-1或铁蛋白的表达；和给药患者包含HO-1，胆红素，胆绿素，铁蛋白， 或去铁铁蛋白，铁，去铁敏(desferonxamine)，或右旋糖酐铁(iron dextran)的 药物组合物。还涉及CO和以上任一成分在制备用于治疗或预防NEC的药 物中的用途。
本发明还提供了治疗患者的NEC的方法。所述方法包括鉴定患有或可 能患有NEC的患者，以及与CO治疗联合给药患者至少一种以下治疗方法： 静脉内营养；静脉内水合作用(intravenous hydration)；抗微生物剂；对患者 实施鼻胃减压，对患者实施外科手术；和对患者的腹腔(peritoneal cavity) 进行引流。
本发明还提供了CO在制备用于治疗或预防NEC的药物中的用途。该 药物可用于根据本文所述的方法治疗患有或可能患NEC的患者的NEC。该 药物可为本文所述的任何形式，如包含液体或气体CO的组合物。
除非另有限定，本文所用所有技术和科学用语都和本发明所属领域的 普通技术人员所理解的一样。适宜的方法和材料见下文，但与本文的方法 和材料类似或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明。所有公开出版 物，专利申请，专利和其它本文涉及的对比文件的全文内容都包含在文中 作参考。如有抵触，本说明书，包括定义将作为指导。所述材料，方法和 实施例均只做举例而不是限制。
本发明的的一个或多个实施方案的细节内容将在下文的说明中阐述。 本发明的其它特征，目的，和优点从以下的说明和权利要求显而易见。
附图说明
图1A是Western印迹图，它显示了和非NEC患者(对照)相比较，患有 NEC的人类新生儿的肠样品中，HO-1的表达增加(n＝3)。
图1B是Western印迹图，它显示了和母乳喂养的对照组大鼠相比较(对 照)，接受间断低氧和配方喂养(formula fed)的新生大鼠(NEC)中，回肠HO-1 蛋白在第四天增长。
图2A是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装(ileal whole mount)的显微 照片(40X放大率)，显示母乳喂养对新生大鼠的影响。此样品在第四天获 得。
图2B是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大率)， 显示母乳喂养和CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图2C是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大率)， 显示配方喂养加低氧暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。可观 察到结构改变包括绒毛萎缩和细胞空泡形成。
图2D是经苏木精和伊红染色的回肠整体封装的显微照片(40X放大 率)，显示配方喂养加低氧暴露和CO暴露对新生大鼠的影响。与图2C中显 示的样品比较，可观察到较少的结构改变。此样品在第四天获得。
图3A是经末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿苷(dUTP)断端 (nick end)标记(TUNEL)染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显示 母乳喂养对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图3B是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示母乳喂养和CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。
图3C是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示配方喂养加低氧暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获得。取材于 低氧/配方喂养的大鼠的回肠与取材于母乳喂养的动物的回肠相比，显示出 增加的TUNEL染色。
图3D是经TUNEL染色的回肠整体封装的显微照片(60X放大率)，显 示配方喂养加低氧暴露以及CO暴露对新生大鼠的影响。此样品在第四天获 得。可观察到TUNEL阳性的细胞减少。
图4A是柱图，它显示了和对照组相比，CO治疗可防止低氧暴露加配 方喂养的新生大鼠的血清IL-1β水平的增加(P＜0.05)。此数据是应用酶联免 疫吸附测定(ELISA)产生的。黑色柱＝暴露于空气的大鼠；灰色柱＝暴露于 CO的大鼠。
图4B是柱图，它显示了和对照组相比，CO治疗可防止低氧暴露加配 方喂养的新生大鼠的血清TNF-α水平的增加(P＜0.05)。此数据是应用ELISA 测定产生的。黑色柱＝暴露于空气的大鼠；灰色柱＝暴露于CO的大鼠。
图5是Western印迹图，它显示了和对照组相比，CO治疗可降低低氧 暴露加配方喂养的新生大鼠的回肠COX-2和IL-1β的表达。每种治疗的存 在(+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹泳道的下方(母乳喂养(BF)，配 方喂养加低氧暴露(FF/低氧)，CO暴露(CO))。印迹显示每组的3-4只动物， 并且是该研究中所有动物的代表。
图6是Western印迹图，它显示了CO暴露可消除在新生大鼠中实验 NEC诱导的回肠iNOS表达和蛋白硝化(protein nitration)。每种治疗的存在 (+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹泳道的下方(母乳喂养(BF)，配方 喂养加低氧暴露(FF/低氧)，CO暴露(CO))。
图7是柱图，它显示了CO暴露和HO-1的诱导可减少TNF-α/放线菌 素D(TNF-α/ActD)诱导的IEC-6细胞的死亡。经TNF-α(TNF；10ng/ml)/ 放线菌素D(ActD；200ng/ml)处理的IEC-6细胞的生存力在18小时后通过测 量细胞的ATP含量而被测定。CO治疗(CO；灰色柱；250ppm)在给药TNF- α/ActD前一小时开始，并在整个实验过程中维持。交叉斜纹柱＝暴露于 TNF-α/ActD前先暴露于钴卟啉(CoPP)16小时的细胞。黑色柱＝暴露于空 气的细胞。CO和CoPP都可显著减少TNF-α/ActD)诱导的IEC-6细胞的死 亡(P＜0.05)。结果是各重复三次进行的三组独立实验的平均值±标准误差。
图8A是Western印迹图，它显示了(在24小时)在经脂多糖(LPS)和/或 低氧(1％氧气)处理的IEC-6细胞中iNOS蛋白质的表达受到抑制。CO治疗 开始于加入LPS/低氧之前1小时，并维持于整个实验过程。LPS(10或 100ng/ml)加低氧的组合增加iNOS蛋白表达，但该作用可被CO抑制。每种 治疗的存在(+)或缺乏(-)分别标注于每条Western印迹的下方(脂多糖 (lps)，低氧暴露(低氧)，CO暴露(CO))。
图8B是Western印迹图，它显示了在经LPS(100ng/ml)/低氧(1％氧气； lps/低氧)处理的IEC-6细胞中大鼠iNOS启动子的活性受到CO暴露的抑 制。测定细胞的萤光素酶活性。LPS加低氧的组合可使iNOS启动子的转录 激活增加4.9±0.3倍(P＜0.05)。CO可限制此转录活化至增加1.7±0.2倍 (P＜0.05)。结果是各重复三次进行的三组独立实验的平均值±标准误差。
图8C是Western印迹图，它显示了在IEC-6细胞中，细胞因子诱导的 iNOS蛋白质的表达可被HO-1的诱导或CO治疗抑制。IEC-6细胞经含有 TNF-α(10ng/ml)，IL-1β(500U/ml)，和IFN-γ(1000U/ml)的细胞因子混合物 (CM)处理24小时。CO治疗(250ppm)开始于加入CM之前1小时，并在整 个实验过程维持。钴卟啉(CoPP)在CM治疗之前16小时给药。CM增加了 IEC-6细胞的iNOS蛋白。CO和CoPP都可抑制细胞因子诱导的iNOS蛋白 的增加。每种治疗的存在(+)或缺乏(-)分别标注于各Western印迹的泳道 的下方(细胞因子混合物(CM)，CO暴露(CO)，钴卟啉暴露(CoPP))。
图8D是柱图，它显示了暴露于CM加CO或CoPP之一的IEC-6细胞 上清液中亚硝酸盐的水平低于暴露于CM和空气的IEC-6细胞中的亚硝酸 盐水平(由Griess法测定)。细胞因子刺激将亚硝酸盐增加至17.2±0.9μM， 而未受刺激的对照增加到1.4±0.3μM(P＜0.01)。CO和CoPP均可显著抑制 细胞因子的这种作用，分别得到的亚硝酸盐水平为9.8±0.7和10.4±1.0(与 CM刺激的细胞相比较P＜0.05)。黑色柱＝暴露于空气的细胞；灰色柱＝暴 露于CO的细胞；和交叉斜纹柱＝暴露于CoPP的细胞。
发明内容
本文术语“一氧化碳”(或“CO”)描述了气态的，压缩成液态的，或者 溶解于水溶液中的一氧化碳分子。本文术语“一氧化碳组合物″或“包含一 氧化碳的药物组合物”用于描述可给药患者和/或器官的含有一氧化碳的气 体或液体组合物，例如，NEC累及的器官。熟练医师知道在具体应用中优 选何种形式的药物组合物，例如气体，液体，或既有气体也有液体的形式。
本文术语“有效量”和“有效地治疗”指一段时间内(包括急性或慢性给 药以及定期的或连续的给药)一定量或浓度的一氧化碳，所述量或浓度在其 给药用来产生目的效果或患者体内生理结果的背景下是有效的。本发明所 用有效量一氧化碳包括例如减轻患者NEC的症状，或改善预后的量。
在气体的情况下，有效量的CO通常在约0.0000001％到约0.3％重量之 间，例如0.0001％到约0.25％重量，优选CO重量至少约0.001％，例如至 少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％， 0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。在CO溶液的情况下，有效量通 常在约0.0001到约0.0044g CO/100g溶液，例如至少约0.0001，0.0002，0.0004， 0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021， 0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或 0.0042g CO/100g水溶液。优选的范围包括，例如约0.0010到约0.0030g CO/100g液体，约0.0015到约0.0026g CO/100g液体，或者约0.0018到约 0.0024g CO/100g液体。熟练的医师应理解根据应用的情况可使用这些范围 外的量。
本文术语“患者”描述根据本发明提供的方法对其进行治疗的动物，人 或非人。本发明明确涉及兽医学应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例 如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，仓鼠，牛， 马，猫，狗，绵羊和山羊。本文术语“治疗”指延迟患者的起病，抑制， 或减轻患者的疾病(例如NEC)的影响。
本文术语“坏死性小肠结肠炎”或“NEC”是该领域公认的术语，描述 患者尤其是早产儿和新生足月儿的疾病，所述疾病以肠屏障失效，肠坏死， 脓毒症，和多系统器官功能衰竭为特征(Oxford Textbook of Surgery，Morris 和Malt编，Oxford University Press(1994))。NEC可累及肠的任何部分，例 如，小肠下部(回肠)，结肠，和/或上段小肠。发生坏死性小肠结肠炎的危 险性和许多因素相关，例如，低出生体重，低氧，低体温，低血压，血液 粘滞度过高，酸中毒，或氧自由基的存在(Id.)。其他危险因素包括脐动脉插 管，交换输血，重量渗摩尔浓度过高的食物，浓缩细胞输输注，或钙拮抗 剂(Id.)过量。这些因素可造成肠系膜缺血，引起肠壁细菌感染，从而导致 感染组织的坏死和/或肠壁穿孔和脓毒症(Id.)。NEC也可发生于因胃肠或其 他疾病情况接受外科手术的新生儿(Id.)。
熟练的医师应理解可通过该领域任何已知的方法，诊断患者患有NEC， 例如，通过内科医师的诊断(例如，应用影像技术如超声波检查，x射线， 和/或血液检查)。
被认为可能患NEC的个体可从本发明中尤为受益，主要因为在出现任 何NEC的迹象前就可开始预防性治疗。“可能患病”的个体包括，例如， 早产儿和新生婴儿，或患有上述任何疾病情况或有上述危险因素的个体。 熟练的医师应理解可通过该领域任何已知的方法，诊断患者可能患NEC， 例如，通过内科医师的诊断(例如，通过内科医师对患者危险因素的评估)。
制备气体组合物
CO组合物可以是气体CO组合物。可用于本发明的方法中的压缩气体 (compressed gas)或加压气体(pressurized gas)，可自任何商业来源获得，并可 位于任何类型的适合储存压缩气体的容器(vessel)中。例如，压缩或加压气 体可以自任何提供医用压缩气体例如氧气的来源获得。本文术语“医用级” 气体，指适合给药本文所定义的患者的气体。提供用于本发明的方法的加 压气体包括CO时，可使得所需终组合物中的所有气体(例如，CO，He，NO， CO2，O2，N2)在同一容器内，除NO和O2不能储存在一起的情况。可选的， 本发明的方法可使用多个含有单一气体的容器进行。例如，可提供含或不 含其它气体的含CO的单个容器，其含有的气体可选地与室内空气或其它容 器中含有的气体混合，所述其它容器例如含有氧气，氮气，二氧化碳，压 缩空气，或任何其它适合的气体或其混合物的容器。
根据本发明给药患者的气体组合物通常含有0％至约79％重量的氮气， 约21％至约100％重量的氧气和约0.0000001％至约0.3％重量(相当于约1 ppb或0.001ppm至约3,000ppm)CO。优选气体组合物中氮气的量是约79％ 重量，氧气量是约21％重量且CO量是约0.0001％至约0.25％重量。优选 CO的量是至少约0.001％，例如，至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025 ％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％， 0.22％，或0.24％重量。CO的优选范围包括0.005％至约0.24％，约0.01 ％至约0.22％，约0.015％至约0.20％，和约0.025％至约0.1％重量。注意 到根据应用情况，具有大于0.3％(例如1％或更高)CO浓度的气体CO组合 物可短期使用(例如一次或数次呼吸)。
可用气体CO组合物产生包含CO气体的环境(atmosphere)。包含适当水 平的CO气体的环境可通过如下方式产生：提供含有包含CO气体的加压空 气的容器，并将所述加压气体从容器中释放到室或空间内，在该室或空间 内形成包括CO气体的环境。可选地，所述气体可被释放到使气体在呼吸面 罩或呼吸管内达到最高浓度的一种仪器中，从而在呼吸面罩或呼吸管中创 造出包含CO气体的环境，使得患者成为该室内唯一暴露于非常高水平的 CO的人。
环境中CO的水平可通过本领域已知的任何方法检测或监测。这种方法 包括电化学检测，气相色谱，放射性同位素计数，红外吸收，比色法，和 基于选择性膜的电化学方法(参见，例如，Sunderman等，Clin.Chem.28： 2026-2032，1982；Ingi等，Neuron 16：835-842，1996)。亚百万分数级(亚 -ppm)CO水平可通过例如，气相色谱和放射性同位素计数检测。此外，本 领域已知亚-ppm范围内的CO水平可通过中红外气体传感器(midinfrared gas sensor)在生物组织中检测(参见，例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart. Circ.Physiol 280：H482-H488，2001)。CO传感器和气体检测仪可自多种商 业来源获得。
制备液体组合物
包含CO的组合物也可以是液体CO组合物。液体可通过本领域已知的 任何使气体溶于液体的方法制成CO组合物。例如，所述液体可以置于所谓 的“CO2温育箱”中并暴露于持续的CO气流，优选由二氧化碳平衡，直到 液体中CO达到所需的浓度。另一实施例中，CO气体可直接″吹入(bubbled)″ 液体中，直到液体中CO达到所需的浓度。溶解于给定水溶液中的CO量随 温度的降低而增加。在另一实施例中，适宜的液体可流经允许气体进行扩 散的管道系统(tubing)，该管道系统在包含CO的环境(例如利用例如体外膜 氧合器(extracorporeal membrane oxygenator)的仪器)中运行。CO扩散进入液 体产生液体CO组合物。
大多数情况下，这种意图被引入活体动物体内的液体组合物，当其被引 入动物体内时，温度是37℃或约为37℃。
液体可以是本领域熟练技术人员已知的任何适合给药患者的液体(参见， 例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press (1994))。通常，液体是水溶液。溶液的实例包括磷酸盐缓冲的盐水溶液 (PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，柠檬酸盐溶液，和威 斯康星大学(University of Wisconsin)(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery， Morris and Malt编，Oxford University Press(1994))。在本发明的一个实施方 案中，液体是林格氏液(Ringer′s solution)，例如，乳酸盐林格氏溶液，或任 何可输注入患者体内的其它液体。在另一实施方案中，液体包括血液，例 如全血。
任何适合的液体可通过气体扩散器饱和到给定的CO浓度。可选地，可 用经质量控制含有给定水平的CO的预制溶液。可通过使用带有与CO分析 仪连接的透气但不透液的膜的仪器对剂量进行精确控制。可将溶液饱和到 所需有效浓度并保持在这些浓度。
用CO组合物治疗患者
可以通过本领域已知给药患者气体和/或液体的任何方法，用CO组合物 来治疗患者。CO组合物可被给药患有或易患NEC的患者，例如，新生儿 或早产婴儿。本发明涉及将CO组合物的系统性给药患者(如通过吸入和/或 摄入)，和将所述组合物局部给药至患者的胃肠道(如通过摄入，吹入，和/ 或导入腹腔)。
系统地递送CO
气体CO组合物可系统地递送给患者，例如患有或易患NEC的患者。气 体CO组合物通常通过嘴或鼻道吸入肺内给药，在肺内CO很容易吸收到患 者的血流内。治疗性气体组合物中所用活性化合物(CO)的浓度有赖于CO的 吸收，分布，灭活和排出(通常通过呼吸)速率以及本领域熟练技术人员已知 的其它因素。还应理解，对于任何具体受试者而言，具体的剂量方案应根 据个体需要和管理或监督组合物给药者的职业经验随时间进行调整，而且 前述的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要求的组合物的范围或实 践。本发明还涉及急性，亚急性和慢性给药CO，依据如患者NEC的严重 程度和病程而定。CO可在足以治疗病情并显示所需药理学或生物学效应的 一段时间内递送给患者(包括不定地给药)。
以下是一些可用于对患者给药气体CO组合物的方法和器械的实例。
呼吸机(ventilator)
可购买医用级CO(可有多种浓度)，所述CO与空气或其它含有氧气的气 体混合于压缩气体标准罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述气体为非活性 (non-reactive)的，而本发明方法所需浓度远远低于可燃范围(空气中10％)。 在医院中，推定要将气体递送到床边，在那里使之与氧气或室内空气在混 合器(blender)内混合，达到所需的ppm浓度(百万分之几)。患者通过呼吸机 吸入气体混合物，呼吸机的流率根据患者的舒适程度和需要设定。通过肺 图(即呼吸速率，潮气量等)可确定该流率。可将防止患者不必要地接受超过 所需量的CO的自动防故障机制(fail-safe mechamism)设计在递送系统中。患 者的CO水平可通过研究以下指标进行监测：(1)静脉血中可测的碳氧血红 蛋白(carboxyhemoglobin)(COHb)，和(2)从呼吸机侧部收集的呼出CO。可根 据患者的健康状况和标志物调节CO暴露。如果有必要，还可通过吸入100 ％的氧气洗出CO。CO是不被代谢的，因此除很小一部分被转化成CO2， 无论吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治疗性递 送CO而不导致随后的低氧。
面罩和幕(Tent)
含有CO的气体混合物如上述方法制备，从而允许患者通过面罩或幕被 动吸入。吸入浓度可改变，并通过简单地换成吸入100％的O2进行洗涤。 在面罩或幕或在其附近监测CO水平，并用自动防故障机制防止吸入过高浓 度的CO。
便携式吸入器(Portable inhaler)
压缩CO可被包装入便携式吸入器并吸入经过计量的剂量，例如使得不 住院的受体接受间歇性治疗。可将不同浓度的CO包装到容器中。该仪器可 简单到只是带有开-关阀和患者可根据标准方案或需要吸入CO的管子并含 有适宜地稀释的CO的小储罐(例如低于5kg)。
静脉内人工肺(Intravenous Artificial Lung)
设计为递送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中气体交换的导管器械) 可用于CO递送。该导管植入后，定位于一根大静脉中并可系统性递送所需 浓度的CO或将其递送到局部位点。所述递送可以是短时间内递送高浓度 CO到程序位点的局部递送，如接近小肠(所述高浓度在血流中迅速稀释)， 或者相对较长的时间内暴露于较低浓度的CO(参见，如Hattler等，Artif. Organs 18(11)：806-812(1994)；和Golob等，ASAIO J.，47(5)：432-437 (2001))。
正常气压小室(Normobaric chamber)
在某些情况下，需要将患者整体暴露于CO。患者须位于充满CO的密 闭舱中，该舱内充满的CO的水平不会导致患者有危险，或者该水平造成可 接受的危险性但不会对暴露的旁观者造成危险。完成暴露后，用空气(例如， 21％O2，79％N2)充满该舱，并使用CO分析仪分析样品，以保证在允许患 者离开暴露系统前没有任何CO存留。
系统性递送液体CO组合物
本发明还涉及，可被产生用于系统性递送给患者的液体CO组合物，例 如输注法给药患者。例如，液体CO组合物，如CO饱和的林格氏溶液可输 注给患有或易患NEC的患者。可选或此外，被CO部分或完全饱和的全(或 部分)血可输注入患者。本发明还涉及使用能够递送CO气体或液体剂型的 试剂(例如CO释放性胶(CO releasing gum)，乳膏(cream)，软膏剂(ointment) 或膜片(patch)。
CO胃肠道局部治疗
可选或此外，CO组合物可被直接用于胃肠道，如整个胃肠道的内部和/ 或外部，或其任何部分。气体组合物可通过本领域任何已知的吹入气体的 方法直接用于患者的胃肠道，如早产婴儿或新生儿。例如气体，如二氧化 碳分别在内镜和腹腔镜操作中常被吹入患者的胃肠道和腹腔中，以便于检 查(参见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。熟练的技术人员应理解类似的方法可用于对患者 的胃肠道直接给药CO组合物。本文还涉及本发明可用于帮助防止腹腔镜和 内镜检查后发生的NEC，如结肠镜和食道胃十二指肠镜检查后的NEC。
CO的含水组合物也被局部地给药患者的胃肠道。含水形式的组合物可 通过本领域任何已知的将液体给药患者的方法来给药患者。和气体组合物 一样，水组合物可直接用于胃肠道的内部和/或外部。例如，水溶液的形式 可口服给药，如使患者摄入胶囊剂形或非胶囊剂形的CO的水溶液组合物。 又例如，液体如含有溶解的CO的盐水溶液，可分别在内镜和腹腔镜手术中 被注射入患者的胃肠道和腹腔中。此外，原位(in situ)暴露可通过使用液体 CO组合物充洗胃肠道或其一部分来进行(参见Oxford Textbook of Surgery， Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
血红素加氧酶-1和其它化合物和NEC的其他治疗的应用
本发明还涉及随同一氧化碳的给药而诱导或表达血红素加氧酶 -1(HO-1)。例如，HO-1可在患有或易患NEC的患者体内诱导。本文术语“诱 导”指用细胞本身编码蛋白的内源性(例如非重组的)基因，造成分离的细胞 或组织，器官或动物的细胞中上述蛋白例如HO-1的生成增加。
HO-1可通过本领域任何已知的方法在患者体内诱导。例如HO-1的产生 可通过氯化血红素(hemin)，铁卟啉，或钴卟啉诱导。各种非血红素(non-heme) 制剂包括重金属，细胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，内毒素和热休克也 是HO-1的表达的强诱导物(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19， 1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和Tenhunen 等，J.Lab.Clin.Med.75：410-421，1970)。多种导致氧化应激的制剂可高度 诱导HO-1，所述制剂包括过氧化氢，谷胱甘肽耗竭物，UV辐射，内毒素 和氧过多(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu. Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和Keyse等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：99-103，1989)。“包含HO-1诱导物的药物组合物”指包括任何能 够在患者体内诱导HO-1的试剂的药物组合物，例如任何上述的试剂，例如 血红素，铁卟啉，和/或钴卟啉。
通过基因转移可增加细胞中HO-1的表达。本文术语“表达”指通过外 源性给药基因(例如重组基因)造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中 的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或铁蛋白。HO-1或铁蛋白优选是作 为受体的同一物种的(例如人，小鼠，大鼠等)，从而最小化任何免疫反应。 可通过组成型启动子(例如巨细胞病毒启动子)或组织特异的启动子(例如用 于哺乳动物细胞的乳清(milk whey)启动子或用于肝细胞的白蛋白启动子)驱 动表达。编码HO-1或铁蛋白的适宜基因治疗载体(例如逆转录病毒，腺病 毒，腺伴随病毒(AVV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人类免疫缺陷病毒(HIV)， 小鼠极小病毒(the minute virus of mice)，乙型肝炎病毒，流感病毒，单纯疱 疹病毒-1型，和慢病毒)可通过口服，吸入或注入给药到肠壁，肠腔或腹腔， 来给药患有或易患NEC的患者。类似的，编码HO-1或去铁铁蛋白的质粒 载体可作为例如裸露的DNA的形式，位于脂质体中的形式，或位于微颗粒 中的形式给药。
此外，外源性HO-1蛋白可通过本领域已知的任何方法直接给药患者。 外源性HO-1可直接给药，作为上述在患者体内诱导或表达HO-1的方法的 补充或可选方法。所述HO-1蛋白可在例如脂质体内，和/或作为融合蛋白 例如TAT融合蛋白(参见，例如，Becker-Hapak等，Methods 24：247-256， 2001)的形式给药患者。
可选或此外，HO-1的任何代谢产物例如胆红素，胆绿素，铁，和/或铁 蛋白可与一氧化碳联合对患者给药，以防止或治疗NEC。此外，本发明涉 及将除了铁蛋白以外的铁结合分子，例如去铁敏(DFO)，铁右旋糖苷，和/ 或去铁铁蛋白，给药患者。在本发明中还涉及，可抑制催化任何这些产物 降解的酶(例如胆绿素还原酶)以创造/增强所需的效果。上述任何物质可通 过口服，静脉内，腹腔内，或直接给药与肠道内部或外部而给药。
本发明中也可以将在给药化合物(例如CO释放性化合物，例如光活化的 CO释放性化合物)后，将CO释放到机体的化合物用于本发明的方法中，所 述化合物例如二锰十羰基，三羰基二氯钌(II)二聚体，和二氯甲烷(例如，在 400-600mg/kg之间的剂量，例如，约500mg/kg)，也可以使用碳氧血红蛋 白以及供给CO的血红蛋白替代物。
上述物质可以任何方式给药患者，例如通过口服，腹膜内，静脉内，或 动脉内给药。上述任何化合物可局部和/或系统地给药患者，并且可以联合 给药。
本发明还涉及联用给药患者CO和其它任何已知的治疗NEC的方法或化 合物来治疗NEC，所述其它方法或化合物例如停止或减少经口喂养率，例 如至少1天，例如2，3，5，或10天，或更多；给予患者静脉内水化和/或 营养，鼻胃减压，或抗微生物剂；手术干预；和/或引流患者的腹腔。手术 干预包括，如切除肠的受累部分。本文还涉及通过联合给药患者CO和其它 任何已知的防止NEC的方法，如改变患者的饮食，来预防性治疗易患NEC 的患者。
以下实施例通过举例部分说明了本发明，所述实施例不应理解为从任何 方面限制本发明。
实施例1 CO减少NEC的发病
人类肠标本的采集
在手术时采集人类肠标本并迅速冷冻。
坏死性小肠结肠炎的动物模型
用催产素(Pitocin)(1U)皮下注射，使有孕将产的Sprague-dawley大鼠诱导 到产期(term)。出生后(第0天)，立即将新生大鼠称重并随机分为两大组。 这些大鼠或被留在母亲身边并母乳喂养，或与母亲分离在恒温箱(Ohio Medical Products，Madison，WI)中圈养，强饲以专门的啮齿动物配方喂养一 天两次，并在每次喂养前经受10分钟的低氧(5％O2，95％N2，PraxAir， Pittsburgh，PA)。此配方通过将15克Similac60/40(Ross Pediatrics，Colobus， OH)加入75毫升Esbilac犬奶替代物中(Pet-Ag Inc.，Hampshire，IL)组成。 每组大鼠进一步被随机抽出，不接受任何附加治疗或接收每天一小时的CO治疗(250百万分之一；ppm，第1-3天)。CO如下所述进行递送。这些新生 大鼠将在第四天被处死。检查其肠是否有肉眼可见的坏死改变和肠积气。 末段回肠的最后2厘米被采集用来作形态学研究，并且粘膜碎屑被收集用 来检测蛋白质。
CO暴露
实验动物暴露于浓度为250ppm的CO。简而言之，含1％CO的空气和 空气(21％氧气)在不锈钢混合圆柱体内混合，然后以12升/分的流速导入 3.70ft3的玻璃暴露小室内。用CO分析仪(Interscan，Chatsworth，CA)持续测 定该小室内的CO水平。CO的浓度一直维持于250ppm。大鼠按要求被放 置于此暴露室内。
形态学分析
肠标本如上所述被采集。按照标准方案制作苏木精和伊红(H&E)染色的 载玻片，并在光学显微镜下检查。病理学家可轻易地观察到肠上皮形态学 变化的存在，包括绒毛核(villous core)分离，粘膜下层水肿，和上皮脱落 (epithelial sloughing)。
血清细胞因子测定
收集血清，用于通过依照产品说明使用QuantikineELISA(R&D systems， Minneapolis，MN)，测定大鼠TNF-α和IL-1β的水平。
细胞培养
大鼠小肠上皮细胞系IEC-6是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)获得的。细胞在含有4.5g/L葡萄糖的 Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)中，在37℃ 和10％CO2的条件下生长，所述培养基中补充加入了5％胎儿牛血清， 0.02mM谷氨酰胺(Gibco，Grand Island，NY)，0.1U/mL的胰岛素，和100U/mL 青霉素/100μg/mL链霉素。用第3代至20代的细胞进行实验。
生存力
细胞的生存力通过依据制造商的方案来测量ATP水平(CellTiter-GloTM； Promega)而测定的。
Western印迹分析
IEC-6细胞或回肠粘膜碎片收集于含有20mmol/L Tris和100μmol/L苯基 甲基磺酰氟(Sigma)，1μmol/L亮抑酶肽(Sigma)，和1μmol/L正矾酸钠(Sigma) 的裂解缓冲液中。蛋白质通过重辛可宁酸(bicinchoninic)(BCA)蛋白测定法 (Pierce，Rockford，IL)定量。对细胞裂解产物(30μg)进行十二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳。
报告物测定
pGL3/2大鼠iNOS启动子-萤光素酶报告物的构建如Beck等，FEBS Lett 435：35-38(1998)所述。生长于35mm孔中的IEC-6细胞用4μL Lipofectamine2000(Invitrogen)，0.15μg pGL3/2 DNA和0.5μg pIEP-LacZ DNA转染，作为转染效率的对照。转染的二十四小时后，将细胞处理6小 时，然后收集细胞裂解产物并使用发光计(luminometer)(Berthold，Germany) 进行萤光素酶测定(Promega)。
亚硝酸盐测定
培养基中的亚硝酸盐(nitrite)(NO2 -)用Griess方法测定。
统计学分析
结果用平均值±SEM表示。组间差异用单侧方差分析(one-way analysis of variance)进行分析，并用Student-Newman-Keuls post-hoc检验进行所有成对 比较(SigmaStat；SPSS，Chicago，IL)。当P小于0.05时，认为存在统计学显 著性。
NEC中的肠HO-1蛋白质增加
使用患有NEC的患者的人肠标本和来自非炎症状态患者的对照肠标本 分析HO-1的表达。与对照相比，NEC标本的全细胞裂解物显示HO-1的表 达增加(图1A)。
为确定实验NEC模型中肠HO-1蛋白水平是否增加，新生大鼠被随机分 组，随意地给予母乳喂养或如上所述经受间断低氧和配方喂养(H/F)。全部 动物于生命的第4天被处死，收集其末端回肠粘膜并用Western印迹分析。 和母乳喂养的对照动物相比，H/F组的HO-1蛋白表达增加(图1B)。这与之 前在肠和其他器官中的发现，即多种损伤后HO-1会上调一致。
CO防止NEC发病
母乳喂养组和H/F组的新生大鼠被随机分组，分别在第1，2和3天接 受每天一小时剂量的CO(250ppm)，或没有附加治疗。全部动物将在生命第 4天被处死。和母乳喂养的对照组(图2A，2B，2C和2D)相比较，在H/F 组中鉴定了宏观(gross)病理特征包括肠道积气和坏死(见于下面表1)和与实 验性NEC一致的组织学改变。CO治疗对母乳喂养动物的宏观和微观评估 无影响，并明显防止H/F组中的大鼠的实验性NEC的发病。在H/F组中死 亡细胞的TUNEL染色增加，其可被CO治疗减少(图3A，3B，3C和3D)。
表1.在出生后第4天新生大鼠回肠的病理学改变 母乳喂养 母乳喂养 +CO 配方喂养/ 低氧 配方喂养/低 氧+CO 总数量(n) 7 7 8 8 宏观变化(n) 肠壁坏死 0 0 5 2 肠道积气 0 0 5 1 微观变化(n) 绒毛萎缩 0 0 7 2 空泡形成 0 1 6 3 基质中的中性粒细胞 0 0 6 1
CO减少炎症的系统标志物
实验动物被处死时，收集其血清用来测定TNF-α和IL-1β的水平作为 组织炎症的系统标志物。和母乳喂养对照组相比较，H/F组的TNF-α和IL-1 β的水平都增加了33.2倍和18.5倍(图4A和4B；P＜0.05)。CO可显著降 低此种增加，分别导致TNF-α和IL-1β仅3倍和2.5倍的增加(P＜0.05)。这 些发现证明外源性CO可消除此动物模型中一些系统性后果。
CO减少炎症的肠道局部标志物
测定环加氧酶-2(COX-2)和白细胞介素-1β(IL-1β)，二者都是肠道炎症 的标志物，并被证实与NEC相关。用Western印迹法分析回肠粘膜蛋白裂 解物中的COX-2和IL-1β。在此研究中，H/F组和在约一半的动物中的回 肠COX-2以及IL-1β蛋白水平的增加相关(图5)。与其对组织学和血清细 胞因子的保护作用一致，CO治疗降低这两种蛋白的表达。CO也降低此模 型中回肠HO-1的表达(数据未显示)，很可能代表对损伤反应而出现的肠损 伤和代偿性改变的降低。
CO抑制肠可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的生成
iNOS在患NEC新生儿的人肠样品和NEC实验模型中的大鼠肠中都增 加。iNOS的诱导和一氧化氮(NO)的生成被认为通过形成反应性的氮类物 (nitrogen species)直接造成组织损伤。此研究中对回肠粘膜样品的Western 印迹分析证明H/F导致iNOS和蛋白质硝化的水平增加(图6)。硝化作用和 硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的生成被认为是由过氧亚硝酸盐，即NO和过氧化 物相互反应的毒性产物造成的。iNOS蛋白和亚硝基酪氨酸(nitrosotyrosine) 在经CO治疗的动物体内显著减少，说明CO通过减少/防止NO的生成在肠 道起保护作用。
HO-1/CO抑制IEC-6细胞死亡
为鉴定是HO-1或CO是否在体外抑制细胞死亡，使用大鼠肠上皮细胞 系IEC-6。细胞死亡通过用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(10ng/ml)加放线菌素 -D(ActD；200ng/ml)处理而诱导。细胞生存力通过对粘附细胞的结晶紫 (crystal violet)染色和细胞ATP含量的评估而分析。TNF-α/ActD降低IEC-6 细胞的生存力至未受处理的对照组的24±2.1％(图7；P＜0.05)。CO显著抑制 TNF-α/ActD诱导的细胞死亡，最终生存力为未受处理的对照组的54±5.6％ (P＜0.05)。单用CO在体外对IEC-6细胞的生存力没有可以检测到的影响。 被CoPP诱导的HO-1有相似的保护作用。
CO防止iNOS上调/NO生成
研究了CO在体外可否抑制肠上皮细胞iNOS的上调。用Western印迹法 分析LPS和/或1％氧气(低氧)对iNOS蛋白的作用。这些研究证明LPS/低 氧增加iNOS蛋白，此作用可被CO抑制(图8A)。CO对大鼠iNOS启动子 的转录激活的效应在受LPS和低氧刺激的IEC-6细胞中测定(图8B)。使用 萤光素酶分析测定，LPS加低氧的组合导致iNOS启动子的转录激活增加 4.9±0.3倍(P＜0.05)。CO限制此转录激活至仅有1.7±0.2倍的增加(P＜0.05)。 此外，CO对IEC-6细胞的NO生成的效应通过测量亚硝酸盐而测定。用已 知可上调iNOS的细胞因子混合物(TNF-α，IL-1β，干扰素-γ)刺激IEC-6 细胞。细胞因子刺激使iNOS蛋白增加(图8C)，并且使亚硝酸盐增加至 17.2±0.9μM，而未受刺激的对照组为1.4±0.3μM(P＜0.01；图8D)。CO和 CoPP可显著抑制此细胞因子效应，分别得到9.8±0.7和10.4±1.0的亚硝酸 盐水平(P＜0.05)。
上述数据显示HO-1在患NEC的人新生儿肠标本和新生大鼠实验性NEC 模型中的回肠粘膜内均上调。每天一小时外源性CO的递送防止NEC的发 病。这和以血清TNF-α和IL-1β测定的系统性炎症及以回肠粘膜IL-1β和 COX-2的表达测定的局部炎症的减少相关。NEC的发病也与回肠粘膜iNOS 的表达和蛋白质硝化的增加相关。CO疗法减弱iNOS和亚硝基化压力(stress) 的增加。在体外，HO-1的诱导或CO对IEC-6细胞内TNF-α/ActD诱导的细 胞死亡起保护作用。另外在体外，CO防止iNOS的诱导和NO的生成。
HO-1和其催化的副产品(by-products)，包括CO，很可能在肠损伤后起 防御作用。上述数据证明患NEC动物的回肠粘膜内，HO-1蛋白的水平增 加，这和之前证明在缺血/再灌注和失血性休克模型中，肠HO-1增加的研 究相一致。肠移植和缺血/再灌注之后，通过预调节(pre-conditioning)或通过 药物学(pharmacologically)进行的HO-1诱导是细胞保护性的。防止NEC发 生的CO治疗也防止HO-1上调(upregulation)。此HO-1表达的抑制可能因 于直接的负反馈环(negative feedback loop)；然而，这很可能是继发于对肠损 伤后的HO-1上调的保护作用。
每天一小时CO吸入疗法(250ppm)足够防止NEC的发病。CO在此NEC 动物模型中的保护作用很可能是多因素的。上述数据表明CO给药导致体内 肠细胞凋亡减少(如TUNEL染色测定的)以及在体外对TNF-α/ActD诱导的 IEC-6细胞死亡的改善。CO疗法还与系统和局部炎症介质的作用(elaboration) 降低有关。
iNOS/NO与炎性肠病，实验性回肠炎，内毒素休克和NEC中的粘膜损 伤和肠道屏障失效相关。上述数据证明CO在体外和体内降低iNOS的上调， 此外也减少体内亚硝基酪氨酸的合成。过氧亚硝酸盐被认为是负责肠细胞 毒性和凋亡的反应性氮类物，其和蛋白质反应导致酪氨酸残基的硝化。此 类物被认为是通过NO和过氧化物间的相互作用形成的。CO介导的肠细胞 的保护作用可通过对iNOS蛋白上调的抑制，减少随后的NO和过氧亚硝酸 盐的生成来介导。
用CO防止NEC的发病涉及维持胃肠动力和防止不适当细菌的建群。改 变的肠道建群已知对NEC发病有贡献。
总之，本实例说明每天一小时CO疗法防止配方喂养/低氧新生大鼠发生 实验性NEC。其机制看来涉及iNOS表达和蛋白质硝化的抑制。
实施例2.治疗NEC的方案
以下实例说明了用于治疗患有或易患NEC的患者的方案。此实例还显 示了在外科手术前，过程中和/或操作后患者的治疗方案，所述手术例如治 疗NEC的外科手术，如切除部分肠管的外科手术。熟练的医师应理解根据 患者的个体需要可采用以下描述的任何方案，并且可以和任何其他NEC的 治疗联合应用。
患者的CO治疗可从患者被诊断为患有NEC或具有与NEC相关的任何 情况，或具有与患者发生NEC的可能性增加相关的任何危险因素的当天开 始。患者可吸入从10ppm到1000ppm浓度的CO，例如，约100ppm到约 800ppm，约150ppm到约600ppm，或约200ppm到约500ppm的CO。 优选的浓度包括例如，约30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm， 200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或约1000ppm。可将CO间断或 连续地给药患者。可将CO给药患者约1，2，4，6，8，10，12，14，18， 或20天，或超过20天，如1，2，3，5，或6个月，或直至患者不再表现 NEC的症状，或直至患者被诊断为不再易患NEC。在选定的一天，CO可 全天连续地给药，或间断地给药，例如每天单次吸入CO(选用高浓度)，或 直至每天23小时，如直至每天20，15，12，10，6，3，或2小时，或至每 天1小时。
对于给药CO联合外科手术治疗NEC，在外科手术以前，其间和/或以后 可将CO系统地或局部地给药患者。患者可吸入从10ppm到1000ppm浓度 的CO，例如，约100ppm到约800ppm，约150ppm到约600ppm，或约 200ppm到约500ppm。优选的浓度包括例如，约30ppm，50ppm，75ppm， 100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或约1000ppm。 在术前，可将CO间断或连续给药患者，共约1，2，4，6，8，10，12，14， 18，或20天，或超过20天。可选或此外，可将CO在手术期间给药患者， 如通过吸入和/或局部给药。可选或此外，可将CO在术后给药患者，例如 手术完成后立刻，并在手术完成后持续约1，2，3，5，7，或10小时，或 约1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，不定期，或直至术后患者不再 患有或易患NEC。
本文描述了本发明的一些实施方案。然而应理解可进行各种修饰而 不偏离本发明的精神和范围。相应地，其它实施方案也在以下的权利要求 的范围内。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府的支持下进行的，美国国立卫生研究院(NIH)许可号为 HL55330，HL60234，和AI42365。政府对本发明具有一定的权利。
本文术语“有效量”和“有效地治疗”指一段时间内(包括急性或慢性给 药以及定期的或连续的给药)一定量或浓度的一氧化碳，所述量或浓度在其 给药用来产生目的效果或患者体内生理结果的背景下是有效的。本发明所 用有效量一氧化碳包括例如减轻患者NEC的症状，或改善预后的量。
在气体的情况下，有效量的CO通常在约0.0000001％到约0.3％重量之 间，例如0.0001％到约0.25％重量，优选CO重量至少约0.001％，例如至 少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％， 0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。在CO溶液的情况下，有效量通 常在约0.0001到约0.0044g CO/100g溶液，例如至少约0.0001，0.0002，0.0004， 0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021， 0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或 0.0042g CO/100g水溶液。优选的范围包括，例如约0.0010到约0.0030g CO/100g液体，约0.0015到约0.0026g CO/100g液体，或者约0.0018到约 0.0024g CO/100g液体。熟练的医师应理解根据应用的情况可使用这些范围 外的量。
本文术语“患者”描述根据本发明提供的方法对其进行治疗的动物，人 或非人。本发明明确涉及兽医学应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例 如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，仓鼠，牛， 马，猫，狗，绵羊和山羊。本文术语“治疗”指延迟患者的起病，抑制， 或减轻患者的疾病(例如NEC)的影响。
本文术语“坏死性小肠结肠炎”或“NEC”是该领域公认的术语，描述 患者尤其是早产儿和新生足月儿的疾病，所述疾病以肠屏障失效，肠坏死， 脓毒症，和多系统器官功能衰竭为特征(Oxford Textbook of Surgery，Morris 和Malt编，Oxford University Press(1994))。NEC可累及肠的任何部分，例 如，小肠下部(回肠)，结肠，和/或上段小肠。发生坏死性小肠结肠炎的危 险性和许多因素相关，例如，低出生体重，低氧，低体温，低血压，血液 粘滞度过高，酸中毒，或氧自由基的存在(Id.)。其他危险因素包括脐动脉插 管，交换输血，重量渗摩尔浓度过高的食物，浓缩细胞输输注，或钙拮抗 剂(Id.)过量。这些因素可造成肠系膜缺血，引起肠壁细菌感染，从而导致 感染组织的坏死和/或肠壁穿孔和脓毒症(Id.)。NEC也可发生于因胃肠或其 他疾病情况接受外科手术的新生儿(Id.)。
熟练的医师应理解可通过该领域任何已知的方法，诊断患者患有NEC， 例如，通过内科医师的诊断(例如，应用影像技术如超声波检查，x射线， 和/或血液检查)。
被认为可能患NEC的个体可从本发明中尤为受益，主要因为在出现任 何NEC的迹象前就可开始预防性治疗。“可能患病”的个体包括，例如， 早产儿和新生婴儿，或患有上述任何疾病情况或有上述危险因素的个体。 熟练的医师应理解可通过该领域任何已知的方法，诊断患者可能患NEC， 例如，通过内科医师的诊断(例如，通过内科医师对患者危险因素的评估)。
制备气体组合物
CO组合物可以是气体CO组合物。可用于本发明的方法中的压缩气体 (compressed gas)或加压气体(pressurized gas)，可自任何商业来源获得，并可 位于任何类型的适合储存压缩气体的容器(vessel)中。例如，压缩或加压气 体可以自任何提供医用压缩气体例如氧气的来源获得。本文术语“医用级” 气体，指适合给药本文所定义的患者的气体。提供用于本发明的方法的加 压气体包括CO时，可使得所需终组合物中的所有气体(例如，CO，He，NO， CO2，O2，N2)在同一容器内，除NO和O2不能储存在一起的情况。可选的， 本发明的方法可使用多个含有单一气体的容器进行。例如，可提供含或不 含其它气体的含CO的单个容器，其含有的气体可选地与室内空气或其它容 器中含有的气体混合，所述其它容器例如含有氧气，氮气，二氧化碳，压 缩空气，或任何其它适合的气体或其混合物的容器。
根据本发明给药患者的气体组合物通常含有0％至约79％重量的氮气， 约21％至约100％重量的氧气和约0.0000001％至约0.3％重量(相当于约1 ppb或0.001ppm至约3,000ppm)CO。优选气体组合物中氮气的量是约79％ 重量，氧气量是约21％重量且CO量是约0.0001％至约0.25％重量。优选 CO的量是至少约0.001％，例如，至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025 ％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％， 0.22％，或0.24％重量。CO的优选范围包括0.005％至约0.24％，约0.01 ％至约0.22％，约0.015％至约0.20％，和约0.025％至约0.1％重量。注意 到根据应用情况，具有大于0.3％(例如1％或更高)CO浓度的气体CO组合 物可短期使用(例如一次或数次呼吸)。
可用气体CO组合物产生包含CO气体的环境(atmosphere)。包含适当水 平的CO气体的环境可通过如下方式产生：提供含有包含CO气体的加压空 气的容器，并将所述加压气体从容器中释放到室或空间内，在该室或空间 内形成包括CO气体的环境。可选地，所述气体可被释放到使气体在呼吸面 罩或呼吸管内达到最高浓度的一种仪器中，从而在呼吸面罩或呼吸管中创 造出包含CO气体的环境，使得患者成为该室内唯一暴露于非常高水平的 CO的人。
环境中CO的水平可通过本领域已知的任何方法检测或监测。这种方法 包括电化学检测，气相色谱，放射性同位素计数，红外吸收，比色法，和 基于选择性膜的电化学方法(参见，例如，Sunderman等，Clin.Chem.28： 2026-2032，1982；Ingi等，Neuron 16：835-842，1996)。亚百万分数级(亚 -ppm)CO水平可通过例如，气相色谱和放射性同位素计数检测。此外，本 领域已知亚-ppm范围内的CO水平可通过中红外气体传感器(midinfrared gas sensor)在生物组织中检测(参见，例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart. Circ.Physiol 280：H482-H488，2001)。CO传感器和气体检测仪可自多种商 业来源获得。
制备液体组合物
包含CO的组合物也可以是液体CO组合物。液体可通过本领域已知的 任何使气体溶于液体的方法制成CO组合物。例如，所述液体可以置于所谓 的“CO2温育箱”中并暴露于持续的CO气流，优选由二氧化碳平衡，直到 液体中CO达到所需的浓度。另一实施例中，CO气体可直接″吹入(bubbled)″ 液体中，直到液体中CO达到所需的浓度。溶解于给定水溶液中的CO量随 温度的降低而增加。在另一实施例中，适宜的液体可流经允许气体进行扩 散的管道系统(tubing)，该管道系统在包含CO的环境(例如利用例如体外膜 氧合器(extracorporeal membrane oxygenator)的仪器)中运行。CO扩散进入液 体产生液体CO组合物。
大多数情况下，这种意图被引入活体动物体内的液体组合物，当其被引 入动物体内时，温度是37℃或约为37℃。
液体可以是本领域熟练技术人员已知的任何适合给药患者的液体(参见， 例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press (1994))。通常，液体是水溶液。溶液的实例包括磷酸盐缓冲的盐水溶液 (PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，柠檬酸盐溶液，和威 斯康星大学(University of Wisconsin)(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery， Morris and Malt编，Oxford University Press(1994))。在本发明的一个实施方 案中，液体是林格氏液(Ringer′s solution)，例如，乳酸盐林格氏溶液，或任 何可输注入患者体内的其它液体。在另一实施方案中，液体包括血液，例 如全血。
任何适合的液体可通过气体扩散器饱和到给定的CO浓度。可选地，可 用经质量控制含有给定水平的CO的预制溶液。可通过使用带有与CO分析 仪连接的透气但不透液的膜的仪器对剂量进行精确控制。可将溶液饱和到 所需有效浓度并保持在这些浓度。
用CO组合物治疗患者
可以通过本领域已知给药患者气体和/或液体的任何方法，用CO组合物 来治疗患者。CO组合物可被给药患有或易患NEC的患者，例如，新生儿 或早产婴儿。本发明涉及将CO组合物的系统性给药患者(如通过吸入和/或 摄入)，和将所述组合物局部给药至患者的胃肠道(如通过摄入，吹入，和/ 或导入腹腔)。
系统地递送CO
气体CO组合物可系统地递送给患者，例如患有或易患NEC的患者。气 体CO组合物通常通过嘴或鼻道吸入肺内给药，在肺内CO很容易吸收到患 者的血流内。治疗性气体组合物中所用活性化合物(CO)的浓度有赖于CO的 吸收，分布，灭活和排出(通常通过呼吸)速率以及本领域熟练技术人员已知 的其它因素。还应理解，对于任何具体受试者而言，具体的剂量方案应根 据个体需要和管理或监督组合物给药者的职业经验随时间进行调整，而且 前述的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要求的组合物的范围或实 践。本发明还涉及急性，亚急性和慢性给药CO，依据如患者NEC的严重 程度和病程而定。CO可在足以治疗病情并显示所需药理学或生物学效应的 一段时间内递送给患者(包括不定地给药)。
以下是一些可用于对患者给药气体CO组合物的方法和器械的实例。
呼吸机(ventilator)
可购买医用级CO(可有多种浓度)，所述CO与空气或其它含有氧气的气 体混合于压缩气体标准罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述气体为非活性 (non-reactive)的，而本发明方法所需浓度远远低于可燃范围(空气中10％)。 在医院中，推定要将气体递送到床边，在那里使之与氧气或室内空气在混 合器(blender)内混合，达到所需的ppm浓度(百万分之几)。患者通过呼吸机 吸入气体混合物，呼吸机的流率根据患者的舒适程度和需要设定。通过肺 图(即呼吸速率，潮气量等)可确定该流率。可将防止患者不必要地接受超过 所需量的CO的自动防故障机制(fail-safe mechamism)设计在递送系统中。患 者的CO水平可通过研究以下指标进行监测：(1)静脉血中可测的碳氧血红 蛋白(carboxyhemoglobin)(COHb)，和(2)从呼吸机侧部收集的呼出CO。可根 据患者的健康状况和标志物调节CO暴露。如果有必要，还可通过吸入100 ％的氧气洗出CO。CO是不被代谢的，因此除很小一部分被转化成CO2， 无论吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治疗性递 送CO而不导致随后的低氧。
面罩和幕(Tent)
含有CO的气体混合物如上述方法制备，从而允许患者通过面罩或幕被 动吸入。吸入浓度可改变，并通过简单地换成吸入100％的O2进行洗涤。 在面罩或幕或在其附近监测CO水平，并用自动防故障机制防止吸入过高浓 度的CO。
便携式吸入器(Portable inhaler)
压缩CO可被包装入便携式吸入器并吸入经过计量的剂量，例如使得不 住院的受体接受间歇性治疗。可将不同浓度的CO包装到容器中。该仪器可 简单到只是带有开-关阀和患者可根据标准方案或需要吸入CO的管子并含 有适宜地稀释的CO的小储罐(例如低于5kg)。
静脉内人工肺(Intravenous Artificial Lung)
设计为递送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中气体交换的导管器械) 可用于CO递送。该导管植入后，定位于一根大静脉中并可系统性递送所需 浓度的CO或将其递送到局部位点。所述递送可以是短时间内递送高浓度 CO到程序位点的局部递送，如接近小肠(所述高浓度在血流中迅速稀释)， 或者相对较长的时间内暴露于较低浓度的CO(参见，如Hattler等，Artif. Organs 18(11)：806-812(1994)；和Golob等，ASAIO J.，47(5)：432-437 (2001))。
正常气压小室(Normobaric chamber)
在某些情况下，需要将患者整体暴露于CO。患者须位于充满CO的密 闭舱中，该舱内充满的CO的水平不会导致患者有危险，或者该水平造成可 接受的危险性但不会对暴露的旁观者造成危险。完成暴露后，用空气(例如， 21％O2，79％N2)充满该舱，并使用CO分析仪分析样品，以保证在允许患 者离开暴露系统前没有任何CO存留。
系统性递送液体CO组合物
本发明还涉及，可被产生用于系统性递送给患者的液体CO组合物，例 如输注法给药患者。例如，液体CO组合物，如CO饱和的林格氏溶液可输 注给患有或易患NEC的患者。可选或此外，被CO部分或完全饱和的全(或 部分)血可输注入患者。本发明还涉及使用能够递送CO气体或液体剂型的 试剂(例如CO释放性胶(CO releasing gum)，乳膏(cream)，软膏剂(ointment) 或膜片(patch)。
CO胃肠道局部治疗
可选或此外，CO组合物可被直接用于胃肠道，如整个胃肠道的内部和/ 或外部，或其任何部分。气体组合物可通过本领域任何已知的吹入气体的 方法直接用于患者的胃肠道，如早产婴儿或新生儿。例如气体，如二氧化 碳分别在内镜和腹腔镜操作中常被吹入患者的胃肠道和腹腔中，以便于检 查(参见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。熟练的技术人员应理解类似的方法可用于对患者 的胃肠道直接给药CO组合物。本文还涉及本发明可用于帮助防止腹腔镜和 内镜检查后发生的NEC，如结肠镜和食道胃十二指肠镜检查后的NEC。
CO的含水组合物也被局部地给药患者的胃肠道。含水形式的组合物可 通过本领域任何已知的将液体给药患者的方法来给药患者。和气体组合物 一样，水组合物可直接用于胃肠道的内部和/或外部。例如，水溶液的形式 可口服给药，如使患者摄入胶囊剂形或非胶囊剂形的CO的水溶液组合物。 又例如，液体如含有溶解的CO的盐水溶液，可分别在内镜和腹腔镜手术中 被注射入患者的胃肠道和腹腔中。此外，原位(in situ)暴露可通过使用液体 CO组合物充洗胃肠道或其一部分来进行(参见Oxford Textbook of Surgery， Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
血红素加氧酶-1和其它化合物和NEC的其他治疗的应用
本发明还涉及随同一氧化碳的给药而诱导或表达血红素加氧酶 -1(HO-1)。例如，HO-1可在患有或易患NEC的患者体内诱导。本文术语“诱 导”指用细胞本身编码蛋白的内源性(例如非重组的)基因，造成分离的细胞 或组织，器官或动物的细胞中上述蛋白例如HO-1的生成增加。
HO-1可通过本领域任何已知的方法在患者体内诱导。例如HO-1的产生 可通过氯化血红素(hemin)，铁卟啉，或钴卟啉诱导。各种非血红素(non-heme) 制剂包括重金属，细胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，内毒素和热休克也 是HO-1的表达的强诱导物(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19， 1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和Tenhunen 等，J.Lab.Clin.Med.75：410-421，1970)。多种导致氧化应激的制剂可高度 诱导HO-1，所述制剂包括过氧化氢，谷胱甘肽耗竭物，UV辐射，内毒素 和氧过多(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu. Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和Keyse等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：99-103，1989)。“包含HO-1诱导物的药物组合物”指包括任何能 够在患者体内诱导HO-1的试剂的药物组合物，例如任何上述的试剂，例如 血红素，铁卟啉，和/或钴卟啉。
通过基因转移可增加细胞中HO-1的表达。本文术语“表达”指通过外 源性给药基因(例如重组基因)造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中 的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或铁蛋白。HO-1或铁蛋白优选是作 为受体的同一物种的(例如人，小鼠，大鼠等)，从而最小化任何免疫反应。 可通过组成型启动子(例如巨细胞病毒启动子)或组织特异的启动子(例如用 于哺乳动物细胞的乳清(milk whey)启动子或用于肝细胞的白蛋白启动子)驱 动表达。编码HO-1或铁蛋白的适宜基因治疗载体(例如逆转录病毒，腺病 毒，腺伴随病毒(AVV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人类免疫缺陷病毒(HIV)， 小鼠极小病毒(the minute virus of mice)，乙型肝炎病毒，流感病毒，单纯疱 疹病毒-1型，和慢病毒)可通过口服，吸入或注入给药到肠壁，肠腔或腹腔， 来给药患有或易患NEC的患者。类似的，编码HO-1或去铁铁蛋白的质粒 载体可作为例如裸露的DNA的形式，位于脂质体中的形式，或位于微颗粒 中的形式给药。
此外，外源性HO-1蛋白可通过本领域已知的任何方法直接给药患者。 外源性HO-1可直接给药，作为上述在患者体内诱导或表达HO-1的方法的 补充或可选方法。所述HO-1蛋白可在例如脂质体内，和/或作为融合蛋白 例如TAT融合蛋白(参见，例如，Becker-Hapak等，Methods 24：247-256， 2001)的形式给药患者。
可选或此外，HO-1的任何代谢产物例如胆红素，胆绿素，铁，和/或铁 蛋白可与一氧化碳联合对患者给药，以防止或治疗NEC。此外，本发明涉 及将除了铁蛋白以外的铁结合分子，例如去铁敏(DFO)，铁右旋糖苷，和/ 或去铁铁蛋白，给药患者。在本发明中还涉及，可抑制催化任何这些产物 降解的酶(例如胆绿素还原酶)以创造/增强所需的效果。上述任何物质可通 过口服，静脉内，腹腔内，或直接给药与肠道内部或外部而给药。
本发明中也可以将在给药化合物(例如CO释放性化合物，例如光活化的 CO释放性化合物)后，将CO释放到机体的化合物用于本发明的方法中，所 述化合物例如二锰十羰基，三羰基二氯钌(II)二聚体，和二氯甲烷(例如，在 400-600mg/kg之间的剂量，例如，约500mg/kg)，也可以使用碳氧血红蛋 白以及供给CO的血红蛋白替代物。
上述物质可以任何方式给药患者，例如通过口服，腹膜内，静脉内，或 动脉内给药。上述任何化合物可局部和/或系统地给药患者，并且可以联合 给药。
本发明还涉及联用给药患者CO和其它任何已知的治疗NEC的方法或化 合物来治疗NEC，所述其它方法或化合物例如停止或减少经口喂养率，例 如至少1天，例如2，3，5，或10天，或更多；给予患者静脉内水化和/或 营养，鼻胃减压，或抗微生物剂；手术干预；和/或引流患者的腹腔。手术 干预包括，如切除肠的受累部分。本文还涉及通过联合给药患者CO和其它 任何已知的防止NEC的方法，如改变患者的饮食，来预防性治疗易患NEC 的患者。
以下实施例通过举例部分说明了本发明，所述实施例不应理解为从任何 方面限制本发明。
实施例1 CO减少NEC的发病
人类肠标本的采集
在手术时采集人类肠标本并迅速冷冻。
坏死性小肠结肠炎的动物模型
用催产素(Pitocin)(1U)皮下注射，使有孕将产的Sprague-dawley大鼠诱导 到产期(term)。出生后(第0天)，立即将新生大鼠称重并随机分为两大组。 这些大鼠或被留在母亲身边并母乳喂养，或与母亲分离在恒温箱(Ohio Medical Products，Madison，WI)中圈养，强饲以专门的啮齿动物配方喂养一 天两次，并在每次喂养前经受10分钟的低氧(5％O2，95％N2，PraxAir， Pittsburgh，PA)。此配方通过将15克Similac60/40(Ross Pediatrics，Colobus， OH)加入75毫升Esbilac犬奶替代物中(Pet-Ag Inc.，Hampshire，IL)组成。 每组大鼠进一步被随机抽出，不接受任何附加治疗或接收每天一小时的CO治疗(250百万分之一；ppm，第1-3天)。CO如下所述进行递送。这些新生 大鼠将在第四天被处死。检查其肠是否有肉眼可见的坏死改变和肠积气。 末段回肠的最后2厘米被采集用来作形态学研究，并且粘膜碎屑被收集用 来检测蛋白质。
CO暴露
实验动物暴露于浓度为250ppm的CO。简而言之，含1％CO的空气和 空气(21％氧气)在不锈钢混合圆柱体内混合，然后以12升/分的流速导入 3.70ft3的玻璃暴露小室内。用CO分析仪(Interscan，Chatsworth，CA)持续测 定该小室内的CO水平。CO的浓度一直维持于250ppm。大鼠按要求被放 置于此暴露室内。
形态学分析
肠标本如上所述被采集。按照标准方案制作苏木精和伊红(H&E)染色的 载玻片，并在光学显微镜下检查。病理学家可轻易地观察到肠上皮形态学 变化的存在，包括绒毛核(villous core)分离，粘膜下层水肿，和上皮脱落 (epithelial sloughing)。
血清细胞因子测定
收集血清，用于通过依照产品说明使用QuantikineELISA(R&D systems， Minneapolis，MN)，测定大鼠TNF-α和IL-1β的水平。
细胞培养
大鼠小肠上皮细胞系IEC-6是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)获得的。细胞在含有4.5g/L葡萄糖的 Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)中，在37℃ 和10％CO2的条件下生长，所述培养基中补充加入了5％胎儿牛血清， 0.02mM谷氨酰胺(Gibco，Grand Island，NY)，0.1U/mL的胰岛素，和100U/mL 青霉素/100μg/mL链霉素。用第3代至20代的细胞进行实验。
生存力
细胞的生存力通过依据制造商的方案来测量ATP水平(CellTiter-GloTM； Promega)而测定的。
Western印迹分析
IEC-6细胞或回肠粘膜碎片收集于含有20mmol/L Tris和100μmol/L苯基 甲基磺酰氟(Sigma)，1μmol/L亮抑酶肽(Sigma)，和1μmol/L正矾酸钠(Sigma) 的裂解缓冲液中。蛋白质通过重辛可宁酸(bicinchoninic)(BCA)蛋白测定法 (Pierce，Rockford，IL)定量。对细胞裂解产物(30μg)进行十二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳。
报告物测定
pGL3/2大鼠iNOS启动子-萤光素酶报告物的构建如Beck等，FEBS Lett 435：35-38(1998)所述。生长于35mm孔中的IEC-6细胞用4μL Lipofectamine2000(Invitrogen)，0.15μg pGL3/2 DNA和0.5μg pIEP-LacZ DNA转染，作为转染效率的对照。转染的二十四小时后，将细胞处理6小 时，然后收集细胞裂解产物并使用发光计(luminometer)(Berthold，Germany) 进行萤光素酶测定(Promega)。
亚硝酸盐测定
培养基中的亚硝酸盐(nitrite)(NO2 -)用Griess方法测定。
统计学分析
结果用平均值±SEM表示。组间差异用单侧方差分析(one-way analysis of variance)进行分析，并用Student-Newman-Keuls post-hoc检验进行所有成对 比较(SigmaStat；SPSS，Chicago，IL)。当P小于0.05时，认为存在统计学显 著性。
NEC中的肠HO-1蛋白质增加
使用患有NEC的患者的人肠标本和来自非炎症状态患者的对照肠标本 分析HO-1的表达。与对照相比，NEC标本的全细胞裂解物显示HO-1的表 达增加(图1A)。
为确定实验NEC模型中肠HO-1蛋白水平是否增加，新生大鼠被随机分 组，随意地给予母乳喂养或如上所述经受间断低氧和配方喂养(H/F)。全部 动物于生命的第4天被处死，收集其末端回肠粘膜并用Western印迹分析。 和母乳喂养的对照动物相比，H/F组的HO-1蛋白表达增加(图1B)。这与之 前在肠和其他器官中的发现，即多种损伤后HO-1会上调一致。
CO防止NEC发病
母乳喂养组和H/F组的新生大鼠被随机分组，分别在第1，2和3天接 受每天一小时剂量的CO(250ppm)，或没有附加治疗。全部动物将在生命第 4天被处死。和母乳喂养的对照组(图2A，2B，2C和2D)相比较，在H/F 组中鉴定了宏观(gross)病理特征包括肠道积气和坏死(见于下面表1)和与实 验性NEC一致的组织学改变。CO治疗对母乳喂养动物的宏观和微观评估 无影响，并明显防止H/F组中的大鼠的实验性NEC的发病。在H/F组中死 亡细胞的TUNEL染色增加，其可被CO治疗减少(图3A，3B，3C和3D)。
表1.在出生后第4天新生大鼠回肠的病理学改变 母乳喂养 母乳喂养 +CO 配方喂养/ 低氧 配方喂养/低 氧+CO 总数量(n) 7 7 8 8 宏观变化(n) 肠壁坏死 0 0 5 2 肠道积气 0 0 5 1 微观变化(n) 绒毛萎缩 0 0 7 2 空泡形成 0 1 6 3 基质中的中性粒细胞 0 0 6 1
CO减少炎症的系统标志物
实验动物被处死时，收集其血清用来测定TNF-α和IL-1β的水平作为 组织炎症的系统标志物。和母乳喂养对照组相比较，H/F组的TNF-α和IL-1 β的水平都增加了33.2倍和18.5倍(图4A和4B；P＜0.05)。CO可显著降 低此种增加，分别导致TNF-α和IL-1β仅3倍和2.5倍的增加(P＜0.05)。这 些发现证明外源性CO可消除此动物模型中一些系统性后果。
CO减少炎症的肠道局部标志物
测定环加氧酶-2(COX-2)和白细胞介素-1β(IL-1β)，二者都是肠道炎症 的标志物，并被证实与NEC相关。用Western印迹法分析回肠粘膜蛋白裂 解物中的COX-2和IL-1β。在此研究中，H/F组和在约一半的动物中的回 肠COX-2以及IL-1β蛋白水平的增加相关(图5)。与其对组织学和血清细 胞因子的保护作用一致，CO治疗降低这两种蛋白的表达。CO也降低此模 型中回肠HO-1的表达(数据未显示)，很可能代表对损伤反应而出现的肠损 伤和代偿性改变的降低。
CO抑制肠可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的生成
iNOS在患NEC新生儿的人肠样品和NEC实验模型中的大鼠肠中都增 加。iNOS的诱导和一氧化氮(NO)的生成被认为通过形成反应性的氮类物 (nitrogen species)直接造成组织损伤。此研究中对回肠粘膜样品的Western 印迹分析证明H/F导致iNOS和蛋白质硝化的水平增加(图6)。硝化作用和 硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的生成被认为是由过氧亚硝酸盐，即NO和过氧化 物相互反应的毒性产物造成的。iNOS蛋白和亚硝基酪氨酸(nitrosotyrosine) 在经CO治疗的动物体内显著减少，说明CO通过减少/防止NO的生成在肠 道起保护作用。
HO-1/CO抑制IEC-6细胞死亡
为鉴定是HO-1或CO是否在体外抑制细胞死亡，使用大鼠肠上皮细胞 系IEC-6。细胞死亡通过用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(10ng/ml)加放线菌素 -D(ActD；200ng/ml)处理而诱导。细胞生存力通过对粘附细胞的结晶紫 (crystal violet)染色和细胞ATP含量的评估而分析。TNF-α/ActD降低IEC-6 细胞的生存力至未受处理的对照组的24±2.1％(图7；P＜0.05)。CO显著抑制 TNF-α/ActD诱导的细胞死亡，最终生存力为未受处理的对照组的54±5.6％ (P＜0.05)。单用CO在体外对IEC-6细胞的生存力没有可以检测到的影响。 被CoPP诱导的HO-1有相似的保护作用。
CO防止iNOS上调/NO生成
研究了CO在体外可否抑制肠上皮细胞iNOS的上调。用Western印迹法 分析LPS和/或1％氧气(低氧)对iNOS蛋白的作用。这些研究证明LPS/低 氧增加iNOS蛋白，此作用可被CO抑制(图8A)。CO对大鼠iNOS启动子 的转录激活的效应在受LPS和低氧刺激的IEC-6细胞中测定(图8B)。使用 萤光素酶分析测定，LPS加低氧的组合导致iNOS启动子的转录激活增加 4.9±0.3倍(P＜0.05)。CO限制此转录激活至仅有1.7±0.2倍的增加(P＜0.05)。 此外，CO对IEC-6细胞的NO生成的效应通过测量亚硝酸盐而测定。用已 知可上调iNOS的细胞因子混合物(TNF-α，IL-1β，干扰素-γ)刺激IEC-6 细胞。细胞因子刺激使iNOS蛋白增加(图8C)，并且使亚硝酸盐增加至 17.2±0.9μM，而未受刺激的对照组为1.4±0.3μM(P＜0.01；图8D)。CO和 CoPP可显著抑制此细胞因子效应，分别得到9.8±0.7和10.4±1.0的亚硝酸 盐水平(P＜0.05)。
上述数据显示HO-1在患NEC的人新生儿肠标本和新生大鼠实验性NEC 模型中的回肠粘膜内均上调。每天一小时外源性CO的递送防止NEC的发 病。这和以血清TNF-α和IL-1β测定的系统性炎症及以回肠粘膜IL-1β和 COX-2的表达测定的局部炎症的减少相关。NEC的发病也与回肠粘膜iNOS 的表达和蛋白质硝化的增加相关。CO疗法减弱iNOS和亚硝基化压力(stress) 的增加。在体外，HO-1的诱导或CO对IEC-6细胞内TNF-α/ActD诱导的细 胞死亡起保护作用。另外在体外，CO防止iNOS的诱导和NO的生成。
HO-1和其催化的副产品(by-products)，包括CO，很可能在肠损伤后起 防御作用。上述数据证明患NEC动物的回肠粘膜内，HO-1蛋白的水平增 加，这和之前证明在缺血/再灌注和失血性休克模型中，肠HO-1增加的研 究相一致。肠移植和缺血/再灌注之后，通过预调节(pre-conditioning)或通过 药物学(pharmacologically)进行的HO-1诱导是细胞保护性的。防止NEC发 生的CO治疗也防止HO-1上调(upregulation)。此HO-1表达的抑制可能因 于直接的负反馈环(negative feedback loop)；然而，这很可能是继发于对肠损 伤后的HO-1上调的保护作用。
每天一小时CO吸入疗法(250ppm)足够防止NEC的发病。CO在此NEC 动物模型中的保护作用很可能是多因素的。上述数据表明CO给药导致体内 肠细胞凋亡减少(如TUNEL染色测定的)以及在体外对TNF-α/ActD诱导的 IEC-6细胞死亡的改善。CO疗法还与系统和局部炎症介质的作用(elaboration) 降低有关。
iNOS/NO与炎性肠病，实验性回肠炎，内毒素休克和NEC中的粘膜损 伤和肠道屏障失效相关。上述数据证明CO在体外和体内降低iNOS的上调， 此外也减少体内亚硝基酪氨酸的合成。过氧亚硝酸盐被认为是负责肠细胞 毒性和凋亡的反应性氮类物，其和蛋白质反应导致酪氨酸残基的硝化。此 类物被认为是通过NO和过氧化物间的相互作用形成的。CO介导的肠细胞 的保护作用可通过对iNOS蛋白上调的抑制，减少随后的NO和过氧亚硝酸 盐的生成来介导。
用CO防止NEC的发病涉及维持胃肠动力和防止不适当细菌的建群。改 变的肠道建群已知对NEC发病有贡献。
总之，本实例说明每天一小时CO疗法防止配方喂养/低氧新生大鼠发生 实验性NEC。其机制看来涉及iNOS表达和蛋白质硝化的抑制。
实施例2.治疗NEC的方案
以下实例说明了用于治疗患有或易患NEC的患者的方案。此实例还显 示了在外科手术前，过程中和/或操作后患者的治疗方案，所述手术例如治 疗NEC的外科手术，如切除部分肠管的外科手术。熟练的医师应理解根据 患者的个体需要可采用以下描述的任何方案，并且可以和任何其他NEC的 治疗联合应用。
患者的CO治疗可从患者被诊断为患有NEC或具有与NEC相关的任何 情况，或具有与患者发生NEC的可能性增加相关的任何危险因素的当天开 始。患者可吸入从10ppm到1000ppm浓度的CO，例如，约100ppm到约 800ppm，约150ppm到约600ppm，或约200ppm到约500ppm的CO。 优选的浓度包括例如，约30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm， 200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或约1000ppm。可将CO间断或 连续地给药患者。可将CO给药患者约1，2，4，6，8，10，12，14，18， 或20天，或超过20天，如1，2，3，5，或6个月，或直至患者不再表现 NEC的症状，或直至患者被诊断为不再易患NEC。在选定的一天，CO可 全天连续地给药，或间断地给药，例如每天单次吸入CO(选用高浓度)，或 直至每天23小时，如直至每天20，15，12，10，6，3，或2小时，或至每 天1小时。
对于给药CO联合外科手术治疗NEC，在外科手术以前，其间和/或以后 可将CO系统地或局部地给药患者。患者可吸入从10ppm到1000ppm浓度 的CO，例如，约100ppm到约800ppm，约150ppm到约600ppm，或约 200ppm到约500ppm。优选的浓度包括例如，约30ppm，50ppm，75ppm， 100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或约1000ppm。 在术前，可将CO间断或连续给药患者，共约1，2，4，6，8，10，12，14， 18，或20天，或超过20天。可选或此外，可将CO在手术期间给药患者， 如通过吸入和/或局部给药。可选或此外，可将CO在术后给药患者，例如 手术完成后立刻，并在手术完成后持续约1，2，3，5，7，或10小时，或 约1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，不定期，或直至术后患者不再 患有或易患NEC。
本文描述了本发明的一些实施方案。然而应理解可进行各种修饰而 不偏离本发明的精神和范围。相应地，其它实施方案也在以下的权利要求 的范围内。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府的支持下进行的，美国国立卫生研究院(NIH)许可号为 HL55330，HL60234，和AI42365。政府对本发明具有一定的权利。
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