发明背景

抗体的抗原结合域包含两个单独的区：重链可变区(VH)和轻链 可变区(VL：可以是Vκ或Vλ)。抗原结合位点本身由六个多肽环构成： 3个来自VH区(H1、H2和H3)，3个来自VL区(L1、L2和L3)。编码 VH区和VL区的V基因的多变初级库(diverse primary repertoire)是由 基因区段组合重排而产生的。VH基因由VH、D和JH三个基因区段重 组产生。在人类，约有51个功能性VH区段(Cook和Tomlinson(1995) Immunol Today，16：237)、25个功能性D区段(Corbett等(1997)J.Mol. Biol.，268：69)和6个功能性JH区段(Ravetch等(1981)Cell，27：583)， 这取决于单元型(haplotype)。VH区段编码多肽链区，构成VH区的第 一和第二抗原结合环(H1和H2)，而VH、D和JH区段组合形成VH区 的第三抗原结合环(H3)。VL基因仅由VL和JL两个基因区段重组产生。 在人类，约有40个功能性Vκ区段(Schble和Zachau(1993)Biol.Chem. Hoppe-Seyler，374：1001)、31个功能性Vλ区段(Williams等(1996)J. Mol.Biol.，264：220；Kawasaki等(1997)Genome Res.，7：250)、5个功 能性Jκ区段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.，257：1516)和4个功能性Jλ 区段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172：609)，这取决于单元 型。VL区段编码多肽链区，构成VL区的第一和第二抗原结合环(L1 和L2)，而VL和JL区段组合形成VL区的第三抗原结合环(L3)。据信， 从该初级库中选出的抗体具有足够的多样性，使得能以至少中等亲 和力结合几乎所有的抗原。高亲和力抗体由重排基因的“亲和力成 熟”产生，其中产生点突变并通过免疫系统根据改进的结合进行选 择。

对抗体结构和序列的分析已经表明，6个抗原结合环中有5个 (H1、H2、L1、L2、L3)具有数目有限的主链构象或正则结构(Chothia 和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia等(1989)Nature，342： 877)。主链构象由以下两点来确定：(i)抗原结合环的长度，和(ii)抗 原结合环和抗体构架中某个关键位置的特定残基或残基种类。对环 长度和关键残基进行分析，已经让我们能够预测由大多数人类抗体 序列所编码的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J. Mol.Biol.，227：799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，14：4628；Williams 等(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构上 多样性高得多(因为使用了D区段)，但是它也构成数目有限的短环长 度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长 度和存在与否，或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263：800； Shirai等(1996)FEBS Letters，399：1)。

包含VH区和VL区互补对的双特异性抗体是本领域已知的。这 些双特异性抗体必定包含两对VH和VL，每对VH/VL结合一个抗原或 表位。该方法涉及杂种杂交瘤(Milstein和Cuello AC，Nature 305：537- 40)、微型抗体(minibody)(Hu等(1996)Cancer Res 56：3055-3061)、双 链抗体(diabody)(Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90， 6444-6448；WO 94/13804)、螯合重组抗体(CRAb；(Neri等(1995)J.Mol. Biol.246，367-373)、biscFv(例如Atwell等(1996)Mol.Immunol.33， 1301-1312)、“杵臼结构(knobs in holes)”稳定的抗体(Carter等(1997) Protein Sci.6，781-788)。在多种情况下，每种抗体都包含两个抗原结 合位点，各自由VH区和VL区互补对形成。因此，各抗体能同时结 合两个不同抗原或表位，而与EACH抗原或表位的结合是由VH及其 互补VL区介导的。这些技术各有各的缺点；例如就杂种杂交瘤而论， 无活性VH/VL对可极大地减少双特异性IgG部分。此外，大多数双 特异性方法依赖于不同VH/VL对的缔合或VH链与VL链的缔合，以 得到两个不同VH/VL结合位点。因此，在装配分子中不可能控制结合 位点与各抗原或表位的比例，所以许多装配分子能结合一个抗原或 表位，但不结合其它抗原或表位。在某些情况下，可以改造重链或 轻链的亚单位界面(Carter等，1997)，以便改善对两个抗原或表位具有 结合位点的分子数量，但是这却不能使所有分子都能结合两个抗原 或表位。

有些证据表明，两个不同的抗体结合特异性可以结合到同一结 合位点，但是这些一般代表两个或更多个特异性，所述特异性对应 于结构相关的抗原或表位或者具有广泛交叉反应的抗体。例如交叉 反应性抗体已有描述，通常，其中两个抗原在序列和结构上相关(例 如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶(McCafferty等，WO 92/01047))，或者 对应于游离半抗原和缀合在载体上的半抗原(Griffiths AD等，EMBO J. 1994，13：14 3245-60)。在另一个实例中，WO 02/02773(Abbott Laboratories)描述了具有“双特异性”的抗体分子。所述抗体分子是 指针对多种抗原而产生或选择的抗体，使得它们的特异性跨越不止 一种抗原。WO 02/02773的抗体中的各互补VH/VL对，针对两个或更 多个结构相关抗原具有单结合特异性；这样的互补对中的VH区和VL 区各自并不具有单独的特异性。因此，抗体具有针对两个结构相关 抗原的广泛的单特异性。此外，多反应性的天然自身抗体已有描述 (Casali和Notkins，Ann.Rev.Immunol.，7，515-531)，可与至少两个(通 常更多)结构无关的不同抗原或表位反应。也已经知道，采用噬菌体 展示技术对单克隆抗体进行随机肽库的选择，将会鉴定出一系列适 合抗原结合位点的肽序列。某些序列是高度相关的，适合共有序列， 而其它序列则十分不同，称为模拟表位(mimotope)(Lane和Stephen， Current Opinion in Immunology，1993，5，268-271)。因此，显然天然四 链抗体，包括连接和互补的VH区和VL区在内，具有与许多不同抗 原结合的潜力，这些抗原来自各种各样的已知抗原。尚不太清楚在 同一抗体中怎样产生针对两个给定抗原的结合位点，尤其是当它们 并不一定是结构相关时。

蛋白质工程方法已经表明与这些方面有关。例如，也已知道可 以产生催化性抗体，其具有通过一个可变区而与金属离子结合的活 性，并具有通过与金属离子和互补可变区接触而与半抗原(底物)结合 的活性(Barbas等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，6385-6389)。 然而在这种情况下，认为与底物(第一抗原)的结合和催化，需要与金 属离子(第二抗原)的结合。因此，与VH/VL对的结合涉及单组分抗原 而不是多组分抗原。

从骆驼抗体重链单域产生双特异性抗体的方法已有描述，该方 法中在一个可变区产生对第一抗原的结合接触，在第二可变区产生 对第二抗原的结合接触。然而，可变区并不互补。因此，针对第一 抗原选择第一重链可变区，针对第二抗原选择第二重链可变区，再 将这两个区一起连接在同一链上，得到双特异性抗体片段(Conrath等， J.Biol.Chem.270，27589-27594)。然而，骆驼重链单域是异乎寻常的， 因为它们来源于没有轻链的天然骆驼抗体，而且重链单域无法与骆 驼轻链结合形成互补VH和VL对。

也已描述了单个重链可变区，来源于天然抗体，通常与轻链相 连接(来自单克隆抗体或来自结构域库；参见EP-A-0368684)。已经 知道，这些重链可变区与一个或多个相关抗原具有特异性相互作用， 但却不能结合其它重链或轻链可变区，以产生对两个或更多个不同 抗原具有特异性的配体。此外，已经知道，这些单域的体内半衰期 非常短。因此，这些结构域的治疗价值有限。

已经知道，通过将具有不同特异性的重链可变区连接在一起， 可制备双特异性抗体片段(如上所述)。该方法的缺点就是：分离的抗 体可变区可能具有疏水界面，该界面通常与轻链相互作用并且暴露 给溶剂，而且是“粘性的”，使得单域能与疏水表面结合。此外， 当配偶体轻链不存在时，两个或更多个不同重链可变区的组合及其 结合(可能通过其疏水界面)，可阻止它们结合配体中的一个、而不是 两个，而在分离时它们是可以结合两个配体的。此外，在这种情况 下，重链可变区将不与互补轻链可变区结合，因此稳定性下降且容 易解折叠(Worn和Pluckthun，1998，Biochemistry 37，13120-7)。

发明概述

本发明涉及肿瘤坏死因子1(TNFR1、p55、CD120a、P60、TNF 受体超家族成员1A、TNFRSF1A)拮抗剂以及所述拮抗剂的使用方 法。优选的拮抗剂在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有效，并且 基本上不拮抗肿瘤坏死因子2(TNFR2、P75、P80、CD120b、TNF 受体超家族成员1B、TNFRSF1B)。在某些实施方案中，所述拮抗剂 是单价的。

在其它实施方案中，所述拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，例 如对TNFR1具有结合特异性的单价抗原结合片段(例如scFv、Fab、 Fab′、dAb)。

其它优选的拮抗剂是本文所述的能结合TNFR1的配体。配体包 含对TNFR1具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或域抗体(single variable domain or domain antibody，dAb)，或所述dAb的合适形式的 互补决定区。在某些实施方案中，所述配体是dAb单体，由对TNFR1 具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或dAb组成，或者基本上由 其组成。在其它实施方案中，所述配体是包含合适形式(例如抗体形 式)的dAb(或dAb的CDR)的多肽。

在某些实施方案中，所述配体是双特异性配体，它包含能结合 TNFR1的第一dAb和具有与第一dAb不同的结合特异性的第二 dAb。在一个实例中，双特异性配体包含能结合TNFR1上第一表位 的第一dAb以及能结合不同靶上的表位的第二dAb。在另一实例中， 第二dAb能结合血清白蛋白上的表位。

在其它实施方案中，所述配体是多特异性配体，它包含对TNFR1 具有结合特异性的第一表位结合域和至少一个其它表位结合域，后 者具有不同于第一表位结合域的结合特异性。例如，第一表位结合 域可以是结合TNFR1的dAb，或者可以是包含能结合TNFR1的dAb 的CDR的结构域(例如移植到合适蛋白质支架或骨架上的CDR，例 如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)，或者 可以是结合TNFR1的结构域，其中所述结构域选自亲和体、SpA区、 LDL受体A类区或EGF区。

在某些实施方案中，所述配体或dAb单体具有一个或多个以下 特征：1)从人TNFR1上解离下来的解离常数(Kd)为50nM～20pM，K 解离速率常数为5×10-1s-1～1×10-7s-1；2)抑制肿瘤坏死因子α(TNFα) 与TNFR1结合的IC50为500nM～50pM；3)在标准L929细胞测定中， 中和人TNFR1的ND50为500nM～50pM；4)在标准细胞测定中，拮 抗TNFR1活性的ND50≤100nM，在所述测定中，当浓度≤10μM时， 激动TNFR1的活性≤5％；5)在小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休 克模型中抑制致死率；6)抗聚集作用；7)当在大肠杆菌(E.coli)或毕赤 酵母(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达时，其分泌量至少约为 0.5mg/L；8)能可逆地解折叠；9)在选自以下的慢性炎性疾病模型中 有效：小鼠胶原诱发的关节炎模型、小鼠关节炎ΔARE模型、小鼠炎 性肠病ΔARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、小鼠吸 烟所致慢性阻塞性肺病模型及合适的灵长类模型(例如灵长类胶原诱 发的关节炎模型)；和/或10)在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有 效。

在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从人TNFR1上解离 下来的解离常数(Kd)为50nM～20pM，K解离速率常数为5×10-1s-1～1 ×10-7s-1；抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1结合的IC50为 500nM～50pM；在标准L929细胞测定中，中和人TNFR1的ND50为 500nM～50pM。在其它具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从 人TNFR1上解离下来的解离常数(Kd)为50nM～20pM，K解离速率常 数为5×10-1s-1～1×10-7s-1；抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1 结合的IC50为500nM～50pM；在选自以下的慢性炎性疾病模型中有 效：小鼠胶原诱发的关节炎模型、小鼠关节炎ΔARE模型、小鼠炎性 肠病ΔARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、小鼠吸烟 所致慢性阻塞性肺病模型及合适的灵长类模型(例如灵长类胶原诱发 的关节炎模型)。在其它具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从 人TNFR1上解离下来的解离常数(Kd)为50nM～20pM，K解离速率常 数为5×10-1s-1～1×10-7s-1；在标准L929细胞测定中，中和人TNFR1 的ND50为500nM～50pM；在标准细胞测定中，拮抗TNFR1活性的 ND50≤100nM，在所述测定中，当浓度≤10μM时，激动TNFR1的活 性≤5％。

在更具体的实施方案中，所述配体或dAb单体的氨基酸序列与 选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％同源性：TAR2h-12(SEQ ID NO：32)、TAR2h-13(SEQ ID NO：33)、TAR2h-14(SEQ ID NO：34)、 TAR2h-16(SEQ ID NO：35)、TAR2h-17(SEQ ID NO：36)、TAR2h-18 (SEQIDNO：37)、TAR2h-19(SEQ ID NO：38)、TAR2h-20(SEQ ID NO： 39)、TAR2h-21(SEQ ID NO：40)、TAR2h-22(SEQ ID NO：41)、 TAR2h-23(SEQ ID NO：42)、TAR2h-24(SEQ ID NO：43)、TAR2h-25 (SEQ ID NO：44)、TAR2h-26(SEQ ID NO：45)、TAR2h-27(SEQ ID NO： 46)、TAR2h-29(SEQ ID NO：47)、TAR2h-30(SEQ ID NO：48)、 TAR2h-32(SEQ ID NO：49)、TAR2h-33(SEQ ID NO：50)、TAR2h-10-1 (SEQ ID NO：51)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO：52)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO：53)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO：54)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO： 55)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO：56)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO：57)、 TAR2h-10-8(SEQ ID NO：58)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO：59)、 TAR2h-10-10(SEQ ID NO：60)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO：61)、 TAR2h-10-12(SEQ ID NO：62)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO：63)、 TAR2h-10-14(SEQ ID NO：64)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO：65)、 TAR2h-10-16(SEQ ID NO：66)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO：67)、 TAR2h-10-18(SEQ ID NO：68)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO：69)、 TAR2h-10-20(SEQ ID NO：70)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO：71)、 TAR2h-10-22(SEQ ID NO：72)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO：73)、 TAR2h-10-29(SEQ ID NO：74)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO：75)、 TAR2h-10-35(SEQ ID NO：76)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO：77)、 TAR2h-10-37(SEQ ID NO：78)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO：79)、 TAR2h-10-45(SEQ ID NO：80)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO：81)、 TAR2h-10-48(SEQ ID NO：82)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO：83)、 TAR2h-10-56(SEQ ID NO：84)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO：85)、 TAR2h-10-66(SEQ ID NO：86)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO：87)、 TAR2h-10-65(SEQ ID NO：88)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO：89)、 TAR2h-10-69(SEQ ID NO：90)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO：91)、 TAR2h-10-61(SEQ ID NO：92)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO：93)、 TAR2h-10-63(SEQ ID NO：94)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO：95)、 TAR2h-10-55(SEQ ID NO：96)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO：97)、 TAR2h-10-70(SEQ ID NO：98)、TAR2h-34(SEQ ID NO：373)、 TAR2h-35(SEQ ID NO：374)、TAR2h-36(SEQ ID NO：375)、TAR2h- 37(SEQ ID NO：376)、TAR2h-38(SEQ ID NO：377)、TAR2h-39(SEQ ID NO：378)、TAR2h-40(SEQ ID NO：379)、TAR2h-41(SEQ ID NO： 380)、TAR2h-42(SEQ ID NO：381)、TAR2h-43(SEQ ID NO：382)、 TAR2h-44(SEQ ID NO：383)、TAR2h-45(SEQ ID NO：384)、TAR2h- 47(SEQ ID NO：385)、TAR2h-48(SEQ ID NO：386)、TAR2h-50(SEQ ID NO：387)、TAR2h-51(SEQ ID NO：388)、TAR2h-66(SEQ ID NO： 389)、TAR2h-67(SEQ ID NO：390)、TAR2h-68(SEQ ID NO：391)、 TAR2h-70(SEQ ID NO：392)、TAR2h-71(SEQ ID NO：393)、TAR2h- 72(SEQ ID NO：394)、TAR2h-73(SEQ ID NO：395)、TAR2h-74(SEQ ID NO：396)、TAR2h-75(SEQ ID NO：397)、TAR2h-76(SEQ ID NO： 398)、TAR2h-77(SEQ ID NO：399)、TAR2h-78(SEQ ID NO：400)、 TAR2h-79(SEQ ID NO：401)和TAR2h-15(SEQ ID NO：431)。

在另外的实施方案中，所述配体或dAb单体的氨基酸序列与选 自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％同源性：TAR2h-131-8(SEQ ID NO：433)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO：434)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO：435)、TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO：436)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO： 437)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO：438)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO： 439)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO：440)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO： 441)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO：442)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO： 443)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO：444)、TAR2h-80(SEQ ID NO：445)、 TAR2h-81(SEQ ID NO：446)、TAR2h-82(SEQ ID NO：447)、TAR2h- 83(SEQ ID NO：448)、TAR2h-84(SEQ ID NO：449)、TAR2h-85(SEQ ID NO：450)、TAR2h-86(SEQ ID NO：451)、TAR2h-87(SEQ ID NO： 452)、TAR2h-88(SEQ ID NO：453)、TAR2h-89(SEQ ID NO：454)、 TAR2h-90(SEQ ID NO：455)、TAR2h-91(SEQ ID NO：456)、TAR2h- 92(SEQ ID NO：457)、TAR2h-93(SEQ ID NO：458)、TAR2h-94(SEQ ID NO：459)、TAR2h-95(SEQ ID NO：460)、TAR2h-96(SEQ ID NO： 461)、TAR2h-97(SEQ ID NO：462)、TAR2h-99(SEQ ID NO：463)、 TAR2h-100(SEQ ID NO：464)、TAR2h-101(SEQ ID NO：465)、 TAR2h-102(SEQ ID NO：466)、TAR2h-103(SEQ ID NO：467)、 TAR2h-104(SEQ ID NO：468)、TAR2h-105(SEQ ID NO：469)、 TAR2h-106(SEQ ID NO：470)、TAR2h-107(SEQ ID NO：471)、 TAR2h-108(SEQ ID NO：472)、TAR2h-109(SEQ ID NO：473)、 TAR2h-110(SEQ ID NO：474)、TAR2h-111(SEQ ID NO：475)、 TAR2h-112(SEQ ID NO：476)、TAR2h-113(SEQ ID NO：477)、 TAR2h-114(SEQ ID NO：478)、TAR2h-115(SEQ ID NO：479)、 TAR2h-116(SEQ ID NO：480)、TAR2h-117(SEQ ID NO：481)、 TAR2h-118(SEQ ID NO：482)、TAR2h-119(SEQ ID NO：483)、 TAR2h-120(SEQ ID NO：484)、TAR2h-121(SEQ ID NO：485)、 TAR2h-122(SEQ ID NO：486)、TAR2h-123(SEQ ID NO：487)、 TAR2h-124(SEQ ID NO：488)、TAR2h-125(SEQ ID NO：489)、 TAR2h-126(SEQ ID NO：490)、TAR2h-127(SEQ ID NO：490)、 TAR2h-128(SEQ ID NO：492)、TAR2h-129(SEQ ID NO：493)、 TAR2h-130(SEQ ID NO：494)、TAR2h-131(SEQ ID NO：495)、 TAR2h-132(SEQ ID NO：496)、TAR2h-133(SEQ ID NO：497)、 TAR2h-151(SEQ ID NO：498)、TAR2h-152(SEQ ID NO：499)、 TAR2h-153(SEQ ID NO：500)、TAR2h-154(SEQ ID NO：501)、 TAR2h-159(SEQ ID NO：502)、TAR2h-165(SEQ ID NO：503)、 TAR2h-166(SEQ ID NO：504)、TAR2h-168(SEQ ID NO：505)、 TAR2h-171(SEQ ID NO：506)、TAR2h-172(SEQ ID NO：507)、 TAR2h-173(SEQ ID NO：508)、TAR2h-174(SEQ ID NO：509)、 TAR2h-176(SEQ ID NO：510)、TAR2h-178(SEQ ID NO：511)、 TAR2h-201(SEQ ID NO：512)、TAR2h-202(SEQ ID NO：513)、 TAR2h-203(SEQ ID NO：514)、TAR2h-204(SEQ ID NO：515)、 TAR2h-185-25(SEQ ID NO：516)、TAR2h-154-10(SEQ ID NO：517) 和TAR2h-205(SEQ ID NO：627)。

本发明涉及肿瘤坏死因子1(TNFR1)拮抗剂，所述拮抗剂能结合 肿瘤坏死因子1(TNFR1)并抑制通过TNFR1的信号转导，其中所述 拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合。在某些实施方案中，所述拮 抗剂包含第一域抗体(dAb)单体和第二dAb单体，其中所述第一dAb 单体能结合选自域1、域2、域3和域4的TNFR1域，所述第二dAb 单体能结合选自域1、域2、域3和域4的TNFR1域，其中在标准L929 细胞毒性测定或标准HeLa IL-8测定中，当浓度约为1μM时，所述 拮抗剂不激动TNFR1。

在某些实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配 体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFR1)并抑制通过TNFR1的信号转 导，其中所述dAb单体不抑制TNFα与TNFR1的结合。

在其它实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配 体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFR1)，其中所述dAb能结合TNFR1 的域1并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或者与TAR2h-205 竞争性结合人TNFR1。

在其它实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配 体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFR1)，其中所述dAb能结合TNFR1 的域3并与TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、 TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竞争性结合人TNFR1。

本发明也涉及抗体或其抗原结合片段，它们对TNFR1具有结合 特异性并在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有效。在某些实施方 案中，所述抗体或抗原结合片段是单价抗原结合片段。

本发明也提供dAb单体、以及包含dAb单体的配体，其对TNFR1 具有结合特异性并能抑制TNFR-1介导的信号传导，但基本上不抑制 TNFα与TNFR1的结合。在某些实施方案中，dAb单体抑制由TNFα 诱导的细胞表面上TNFR1的交联或成簇。

本发明也提供编码本发明配体的分离和/或重组的核酸分子、以 及包含所述重组核酸分子的载体。也提供包含本发明重组核酸分子 或载体的宿主细胞和用于制备配体的方法。

本发明也涉及药物组合物，所述组合物包含本发明的拮抗剂或 配体以及药理学上、生理上或药学上可接受的载体。

本发明也涉及治疗、抑制或预防疾病或障碍(例如慢性炎性疾 病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多发性硬化、炎性肠病、 慢性阻塞性肺病、肺炎、脓毒性休克)的方法，该方法包括给予有需 要的哺乳动物治疗有效量的本发明拮抗剂或配体。

本发明也涉及用于治疗或诊断的本发明拮抗剂或配体，以及本 发明拮抗剂或配体在制备用于治疗、抑制或预防如上所述的疾病或 障碍(例如慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多 发性硬化、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、肺炎或脓毒性休克)的药物 中的用途。在其它实施方案中，所述疾病可以是囊性纤维化或严重 甾体抵抗型哮喘。

本发明还涉及用于治疗、抑制或预防本文所述的疾病或障碍(例 如慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多发性硬 化、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、肺炎或脓毒性休克)的药物组合物， 所述组合物包含本发明的拮抗剂或配体作为活性成分。在其它实施 方案中，所述疾病可以是囊性纤维化或严重甾体抵抗型哮喘。

对TNFR1和配体具有结合特异性的单可变区或域抗体(dAb)以 及包含这些单可变区或dAb的配体，具有若干优势。例如，本文所 述的对TNFR1具有结合特异性的单可变区或dAb能拮抗TNFR1。 因此，可以给予包含本发明抗TNFR1免疫球蛋白单可变区或dAb的 治疗药(例如用于治疗、诊断或预防目的)，所述治疗药的副作用(例 如免疫抑制)危险因为结合和/或拮抗TNFR2而基本降低。靶向TNFα 的治疗药例如ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)拮抗 TNFR1和TNFR2，给予这些药物可产生免疫抑制及相关副作用(例如 严重感染)。这些副作用限制了这类药物的使用，尤其是对于需要长 期给药的慢性疾病。(Kollias G.和Kontoyiannis D.，Cytokine Growth Factor Rev.，73(4-5)：315-321(2002))。相比之下，因为本发明的配体 特异性拮抗TNFR1，所以对于慢性疾病而言，它们可以长期给予， 其副作用的危险性降低，并能提供治疗炎性病症和慢性炎性病症(包 括特征为静止期和活动性炎症期的长期疾病，例如炎性肠病和关节 炎)的优势。

附图简述

图1显示VH/HAS在位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、 H58、H95、H96、H97、H98的多样化(DVT或NNK分别编码)，它 们在VH HAS的抗原结合位点中。(SEQ ID NO：1，核苷酸序列；SEQ ID NO：2，氨基酸序列)。Vκ序列在位置L50、L53具有多样性。

图2示意图显示用于制备单链Fv(scFv)文库的质粒pIT1/pIT2的 结构，并显示跨越表达控制和克隆区的质粒核苷酸序列(SEQ ID NO：3) 以及所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。该质粒用于制备

文库1：种系Vκ/DVT VH，

文库2：种系Vκ/NNK VH，

文库3：种系VH/DVT Vκ，和

文库4：种系VH/NNK Vκ，以噬菌体展示/ScFv形式。

根据结合蛋白A和蛋白L通用配体，对这些文库进行预筛选， 使得大部分克隆和所选文库是功能性的。针对HSA(第一轮)和β-gal (第二轮)或HSA β-gal选择或者针对β-gal(第一轮)和HSA(第二轮)β- gal HSA选择，对文库进行选择。扩增序列中这些来自PCR克隆的 可溶性scFv。选出一个编码双特异性抗体K8的克隆进行进一步工 作。

图3显示以下序列的比对：VH链(VH dummy(SEQ ID NO：5)、K8 (SEQ ID NO：6)、VH2(SEQ ID NO：7)、VH4(SEQ ID NO：8)、VHC11 (SEQ ID NO：9)、VHA10sd(SEQ ID NO：10)、VHAlsd(SEQ ID NO： 11)、VHA5sd(SEQ ID NO：12)、VHC5sd(SEQ ID NO：13)、VHCllsd (SEQ ID NO：14)、VHCllsd(SEQ ID NO：15))和Vκ链(Vk dummy (SEQ ID NO：16)、K8(SEQ ID NO：17)、E5sc(SEQ ID NO：18)、C3 (SEQ ID NO：19))。

图4显示K8抗体的结合特性的表征，K8抗体的结合特性经单 克隆噬菌体ELISA而表征，发现双特异性K8抗体能结合HSA和β-gal 并展示在噬菌体表面，其吸收信号大于1.0。没有检测到与其它蛋白 质的交叉反应性。

图5显示可溶性scFv ELISA的结果，采用已知浓度的K8抗体 片段。96孔板用浓度100μg HSA、10μg/ml BSA和100μg/ml β-gal和 1μg/ml蛋白A包被。采用50μg系列稀释的K8 scFv，用蛋白L-HRP 检测结合抗体片段。ELISA结果证实了K8抗体的双特异性。

图6显示克隆K8Vκ/dummy VH的结合特征，分析采用可溶性scFv ELISA。可溶性scFv片段通过IPTG诱导产生，参见Harrison等， Methods Enzymol.1996；267：83-109，然后直接测定含有scFv的上清 液。按照实施例1所述，进行可溶性scFv ELISA，用蛋白L-HRP测 定结合scFv。ELISA结果表明，该克隆仍能结合β-gal，而结合BSA 则被消除掉。

图7显示可变区载体1和2的序列(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO： 3)。

图8是用于构建VH1/VH2多特异性配体的CH载体图谱。

图9是用于构建Vκ1/Vκ2多特异性配体的Cκ载体图谱。

图10显示TNF受体测定，与TAR1-5二聚体4、TAR1-5-19二 聚体4和TAR1-5-19单体进行比较。

图11显示比较TAR1-5二聚体1-6的TNF受体测定。所有二聚 体都经FPLC纯化，显示优化二聚体种类的结果。

图12显示不同形式的TAR1-519同型二聚体的TNF受体测定： 具有3U、5U或7U接头的dAb-接头-dAb形式，Fab形式和半胱氨 酸铰链接头形式。

图13显示文库1的Dummy VH序列。(氨基酸序列((SEQ ID NO： 5；核苷酸序列：编码链(SEQ ID NO：20)，非编码链(SEQ ID NO：21)。 VH构架序列基于种系序列DP47-JH4b。NNK随机化(N＝A或T或C 或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)结合到文库1中的位置用粗体加上下 划线表示。

图14显示文库2的Dummy VH序列。(氨基酸序列((SEQ ID NO： 22；核苷酸序列：编码链(SEQ ID NO：23)，非编码链(SEQ ID NO：24)。 VH构架序列基于种系序列DP47-JH4b。NNK随机化(N＝A或T或C 或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)结合到文库2中的位置用粗体加上下 划线表示。

图15显示文库3的Dummy Vκ序列。(氨基酸序列((SEQ ID NO： 16；核苷酸序列：编码链(SEQ ID NO：25)，非编码链(SEQ ID NO：26)。 Vκ构架序列基于种系序列DPκ9-Jκ1。NNK随机化(N＝A或T或C或 G核苷酸；K＝G或T核苷酸)结合到文库3中的位置用粗体加上下划 线表示。

图16显示抗MSA dAb MSA 16的核苷酸序列和氨基酸序列(核 苷酸序列(SEQ ID NO：27)、氨基酸序列(SEQ ID NO：28)和MSA 26(核 苷酸序列(SEQ ID NO：29)、氨基酸序列(SEQ ID NO：30))。

图17显示MSA16和26的抑制biacore。通过抑制biacore对纯 化dAb MSA16和MSA26进行分析，得出Kd。简而言之，测定dAb， 以求出在用高密度MSA包被的biacore CM5芯片上达到200RU响应 所需的dAb浓度。一旦测出所需dAb浓度，将预期Kd左右浓度范围 的MSA抗原与dAb预混合并孵育过夜。然后以30μl/分钟的高流速， 测定各预混物中dAb与MSA包被的biacore芯片的结合。

图18显示注射后MSA16的血清水平。测定小鼠的dAb MSA16 血清半衰期。给CD1小鼠单次静脉注射约1.5mg/kg MSA16。用2区 室模型建模，显示MSA16的tα为0.98小时，tβ为36.5小时，AUC 为913小时.mg/ml。与HEL4(一种抗鸡卵清溶菌酶dAb)相比，MSA16 的半衰期相当长，tα为0.06小时，tβ为0.34小时。

图19a-19c显示ELISA(图19a)和TNF受体测定(图19b、19c)， 表明TNF与包含MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab样片段的结合被 抑制。加入带有Fab样片段的MSA可降低抑制水平。一个用1μg/ml TNFα包被的ELISA板用双特异性VκCH和VκCκ Fab样片段来探测， 同时也用对照TNFα结合dAb来检测，其浓度为经计算在ELISA中 给出相似信号的浓度。在2mg/ml MSA存在或不存在下，采用双特 异性dAb和对照dAb来探测ELISA板。双特异性孔的信号下降超过 50％，但dAb孔的信号却完全没有下降(参见图19a)。在有或没有MSA 的情况下，将相同的双特异性蛋白也进行受体测定，并且也表现出 与MSA竞争(参见图19c)。这证明MSA竞争性结合双特异性蛋白和 TNFα。

图20显示TNF受体测定，表明TNF与二硫键键合的TAR1-5-19 dAb和MSA16 dAb异型二聚体的结合被抑制。加入带有二聚体的 MSA，以剂量依赖性方式降低抑制水平。在恒定浓度的异型二聚体 (18nM)和系列稀释的MSA和HAS的存在下，进行TNF受体测定(图 19(b))。一定浓度范围(最多2mg/ml)的HAS的存在不引起二聚体抑 制TNFα的能力下降。然而加入MSA，剂量依赖性地降低了二聚体 抑制TNFα的能力(图19a)。这证明MSA和TNFα竞争性结合cys键 合的TAR1-5-19、MSA16二聚体。在测定中，MSA和HAS单用对 TNF结合水平没有影响。

图21A-21M显示一些对人TNFR1具有结合特异性的人免疫球 蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：31-98和SEQ ID NO：373-401 和431)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符 号～，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两 侧是～～，CDR3的两侧是～～～。

图22A-22T显示一些编码图21A-21M所示的人免疫球蛋白可变 区的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：99-166和SEQ ID NO：402-430 和432)。所示的核苷酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符 号～，表示编码CDR的序列的位置。编码CDR1的序列的两侧是～， 编码CDR2的序列的两侧是～～，编码CDR3的序列的两侧是～～～。

图23A-23B显示一些对小鼠TNFR1具有结合特异性的人免疫球 蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：167-179)。所示的氨基酸序列 是连续的，没有空位；在某些系列中插入了符号～，表示互补决定区 (CDR)的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧 是～～～。

图24A-24C显示一些编码图23A-23B所示的人免疫球蛋白可变 区的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：180-192和626)。SEQ ID NO：186 和SEQ ID NO：626都编码SEQ ID NO：173的氨基酸序列。编码CDR1 的SEQ ID NO：626序列的两侧是～，编码CDR2的序列的两侧是～～， 编码CDR3的序列的两侧是～～～。

图25A-25L显示编码一些人免疫球蛋白可变区的核苷酸序列以 及所编码的人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：193-198 和200-295)。

图26曲线图显示在L929测定中抗TNFR1 dAb形式基本上不激 动TNFR1。将L929细胞在含有以下成分的培养基中培养：不同浓度 的抗TNFR1 dAb单体(TAR2m-21-23)、市售抗myc抗体(9E10)交联 的TAR2m-21-23单体、双特异性抗TNFR1 dAb/抗SA dAb(TAR2m- 21-23 3U TAR7m-16)或PEG化抗TNFR1 dAb单体(TAR2m-21-23 40K PEG)。就抗myc抗体交联TAR2m-21-23单体而论，在培养之前，将 dAb和抗体按2∶1的比例混合并在室温下预孵育1小时，以模拟体内 免疫交联效应。(TAR2m-21-23单体包含myc表位)。将浓度为3,000nM 的TAR2m-21-23单体与L929细胞一起孵育。TAR2m-21-23单体和 抗Myc抗体一起孵育，dAb浓度为3,000nM。将浓度为25nM、83.3nM、 250nM、833nM和2,500nM的TAR2m-21-23 3U TAR7m-16与细胞一 起孵育。将浓度为158.25nM、527.5nM、1582.5nM、5,275nM和 15,825nM的TAR2m-21-23 40K PEG与细胞一起孵育。孵育过夜后， 评价细胞存活率。结果表明，将L929细胞与10nM、1nM或0.1nM 能交联和激动TNFR1的市售抗TNFR1 IgG抗体(目录号AF-425-PB； R&D系统，Minneapolis，MN)一起孵育，导致以剂量依赖方式增加无 活力细胞，因此证明了这些细胞对TNFR1激动剂的敏感性。相比之 下，与不同数量的抗TNFR1形式孵育，并不拮抗TNFR1，也不导致 培养物中无活力细胞数量的增加，甚至当采用超过1000倍市售抗 TNFR1 IgG抗体浓度时。

图27A-27I显示一些对人TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋 白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：433-517和627)。所示的氨基酸 序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示互补决定区(CDR) 的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。

图28A-28O显示一些编码图27A-27H所示的人免疫球蛋白可变 区的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：518-602和628)。所示的核苷酸 序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示编码CDR的 序列的位置。编码CDR1的序列的两侧是～，编码CDR2的序列的两 侧是～～，编码CDR3的序列的两侧是～～～。

发明详述

在本发明说明书中描述了许多实施方案，撰写方式使得本发明 说明书能够既清楚又简明，但是应当理解，在不偏离本发明的情况 下，可以对这些实施方案进行各种组合或分开。

定义

“互补”，当两个免疫球蛋白结构域属于能构成关联对或关联 组的结构家族时，或者它们来源于这样的家族并保留了该特征时， 则它们是“互补”的。例如，抗体的VH区和VL区就是互补的；两 个VH区则不互补，两个VL区也不互补。在免疫球蛋白超家族其它 成员中也可发现互补区，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)区。在 本发明第二格局的情况下，非互补区并不协同结合靶分子，而是独 立作用于相同或不同分子上的不同靶表位。人工结构域，例如基于 蛋白质支架的结构域(它们不结合表位，除非经改造使它们结合表 位)，是非互补的。同样，基于(例如)免疫球蛋白结构域和纤连蛋白 结构域的两个结构域不是互补的。

“免疫球蛋白”，是指这样的多肽家族：其保留抗体分子的免 疫球蛋白折叠特征，含有两个β折叠，一般还含有一个保守二硫键。 免疫球蛋白超家族成员在体内参与细胞和非细胞相互作用的许多方 面，包括在免疫系统(例如抗体、T细胞受体分子等)中具有广泛作用， 参与细胞粘附(例如ICAM分子)和胞内信号转导(例如受体分子，例 如PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合域的免疫球蛋白超家族 分子。优选本发明涉及抗体。

“结合”，本发明的各可变区结合在一起构成一组结构域；例 如，互补区可以结合在一起，例如VL区与VH区结合在一起。非互 补区也能结合在一起。结构域可以以大量方式结合在一起，包括各 结构域通过共价或非共价方式连接。

“domain(域，结构域，区)”，是经过折叠的蛋白质结构，它 保留了蛋白质三级结构，但独立于蛋白质的其余部分。通常，各结 构域负责蛋白质的分离的功能性，并且在许多情况下可以添加、去 除或转移给其它蛋白质，而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其余部 分的功能。单抗体可变区(single antibody variable domain)是指经过折 叠的多肽区，包含特征为抗体可变区的序列。因此，它包含完整抗 体可变区和修饰可变区(例如其中一个或多个环已经被不具有抗体可 变区特征的序列所取代)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗 体可变区，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可 变区的折叠片段。

“库(repertoire)”，一级序列不同的多样化变异体(例如多肽变 异体)的集合。本发明所用的文库可包括含有至少1000个成员的多肽 库。

“文库(library)”，术语文库是指异源多肽或核酸的混合物。文 库由成员组成，每个成员都具有一个多肽或核酸序列。就这一方面 而言，文库(library)和库(repertoire)同义。文库成员间的序列差异造成 文库的多样性。文库可以呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者 可以呈用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、 动植物细胞等。优选各个生物体或细胞仅含有一个文库成员或数目 有限的文库成员。最好将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所 编码的多肽。因此，在一个优选的方面，文库可以呈宿主生物体群 体的形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体 含有呈核酸形式的文库的一个成员，所述核酸可以表达而产生其相 应多肽成员。因此，宿主生物体群体具有编码很大的具有遗传多样 性的多肽变异体库的潜力。

“闭合构象多特异性配体(closed conformation multi-specific ligand)”用于描述本文所定义的多特异性配体，包含至少两个本文所 定义的表位结合域(epitope binding domain)。术语“闭合构象”(多特 异性配体)是指配体的表位结合域是这样排列的：使得通过一个表位 结合域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合发生竞争。 也就是说，关联表位可以通过每个表位结合域单独结合，而不是同 时结合。采用本文所述的方法，可得到配体的闭合构象。

“抗体”，抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或其片段(例 如Fab、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗 体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，无论是来自任何物种的天然产 生的抗体，还是由重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样 品中分离的：血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。

“双特异性配体”，是指包含本文所定义的第一免疫球蛋白单 可变区和第二免疫球蛋白单可变区的配体，其中可变区能结合两个 不同抗原或同一抗原上的两个表位，而它们通常并不与单特异性免 疫球蛋白结合。例如，两个表位可以在同一半抗原上，而不是同一 表位或足够近以便结合单特异性配体。本发明的双特异性配体由具 有不同特异性的可变区组成，但不包括具有相同特异性的相互互补 的可变区对。

“抗原”，一种能与本发明的配体结合的分子。通常，抗原与 抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。抗原可以是多肽、蛋白质、 核酸或其它分子。一般而言，针对特定抗原的靶特异性而选择本发 明双特异性配体。就常规抗体及其片段而言，由可变环(L1、L2、L3 和H1、H2、H3)所限定的抗体结合位点能够结合抗原。

“表位”，与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位 限定针对抗体的最少结合位点，因此代表了抗体特异性的靶。就单 域抗体而言，表位代表了与分离的可变区结合的结构单元。

“通用配体(generic ligand)”，能结合某一库中所有成员的配体。 一般而言，并不通过上述抗原结合位点而结合。非限制性实例包括 蛋白A、蛋白L和蛋白G。

“选择”，来自筛选或来自达尔文选择过程，其中在结构域与 抗原或表位之间或者在抗体与抗原或表位之间发生结合相互作用。 因此，在互补可变区存在或不存在下，可以选择结合抗原或表位的 第一可变区。

“通用构架(universal framework)”，单抗体构架序列，对应于 序列中的保守抗体区，根据Kabat(″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest″，US Department of Health and Human Services (美国健康和人类服务部))所定义；或者对应于人种系免疫球蛋白库 或结构，根据Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定 义。本发明提供单构架或一组这样的构架的用途，已经发现它们允 许事实上任何结合特异性的来源，尽管变异仅在超变区内。

“半衰期”，是指配体的血清浓度在体内降至50％所需要的时 间，例如因为通过天然机制所致的配体降解和/或清除或螯合。本发 明的配体在体内是稳定的，其半衰期因结合抗降解和/或清除或螯合 的分子而延长。通常，这类分子是天然存在的蛋白质，它们本身在 体内具有较长的半衰期。如果配体的功能活性在体内的持续时间比 对延长半衰期的分子不具有特异性的类似配体更长的话，则配体半 衰期延长。因此，将对HSA和靶分子具有特异性的配体，与对HAS 无特异性且不结合HAS、而结合别的分子的相同配体进行比较。例 如，它能结合靶分子上的第二表位。通常，半衰期延长10％、20％、 30％、40％、50％以上。半衰期延长范围在2x、3x、4x、5x、10x、20x、 30x、40x、50x以上是可能的。或者，另外，半衰期延长范围高达30x、 40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。

“均质免疫测定(homogeneous immunoassay)”，无需分离结合 和未结合试剂的步骤就可检测被分析物的免疫测定。

“基本相同(或“基本同源”)”，第一氨基酸或核苷酸序列与第 二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或相当(例如具有相似侧 链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨 基酸或核苷酸序列具有相似活性。就抗体而言，第二抗体与第一抗 体具有相同的结合特异性并且具有第一抗体亲和力的至少50％。

本文所用的术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性” 或“极高严格性条件”描述了核酸杂交和洗涤条件。进行杂交反应 的指南可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和 Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，所述文献通过引用全部结合到本文中。 该参考文献中描述了含水方法和无水方法，都可以采用。本文所用 的具体杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，在至少50℃(对 于低严格性条件，洗涤温度可升高至55℃)洗涤两次；(2)中等严格性 杂交条件在6X SSC中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中， 在60℃洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在6X SSC中，在约 45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤一次或多次；和优选 (4)极高严格性杂交条件是0.5M磷酸钠、7％SDS中，在65℃，再在 0.2X SSC、1％SDS中，在65℃洗涤一次或多次。极高严格性条件(4) 是优选的条件，除非另有说明，否则应采用该条件。

本文所用的术语“闭合构象”(多特异性配体)是指配体的表位结 合域彼此连接或结合，任选通过蛋白质支架的方式，使得通过一个 表位结合域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合发生 竞争。也就是说，关联表位可以通过各自的表位结合域单独结合， 而不是同时结合。采用本文所述的方法，可得到配体的闭合构象。

“开放构象(open conformation)”，是指配体的表位结合域彼此 连接或结合，任选通过蛋白质支架的方式，使得通过一个表位结合 域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合不发生竞争。

本文所用的术语“竞争”是指当第二表位与其关联表位结合域 结合时，第一表位与其关联表位结合域的结合受到抑制。例如，结 合可以是空间上受到抑制，例如通过结合域的物理阻断或通过改变 结合域的结构或环境，使其对表位的亲和力(affinity)或亲合力(avidity) 降低。

术语“免疫球蛋白单可变区”，是指能独立于其它V区(V region， V domain)而特异性结合抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、VL)；然 而，本文所用的术语免疫球蛋白单可变区可以与其它可变区(variable region，variable domain)呈现例如同型多聚体或异型多聚体的形式，其 中其它区(region，domain)不是免疫球蛋白单可变区的抗原结合所必需 的(即其中免疫球蛋白单可变区与抗原的结合独立于另外的可变区)。 “免疫球蛋白单可变区”不仅包括分离的抗体单可变区多肽，而且 包括含有抗体单可变区多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。本 文所用的术语“域抗体”或“dAb”与本文所用的术语“免疫球蛋白 单可变区”多肽同义。本文所用的免疫球蛋白单可变区多肽是指哺 乳动物(优选人，但也包括啮齿动物)免疫球蛋白单可变区多肽(例如 公开于WO 00/29004，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中) 或骆驼科动物(camelid，包括骆驼、骆马及相关种系)VHH dAb。骆驼 科动物dAb是免疫球蛋白单可变区多肽，它来自骆驼(camel)、美洲 驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和栗色骆马(guanaco) 等物种，并且包含天然缺乏轻链的重链抗体：VHH。VHH分子要比IgG 分子小约10倍，作为单一多肽，它们非常稳定，能耐受极端pH和 温度条件。

本文所用的术语“肿瘤坏死因子受体1(Tumor Necrosis Factor Receptor 1，TNFR1)拮抗剂”是指一种能结合TNFR1并能抑制TNFR1 的一个或多个功能的药物(例如分子、化合物)。例如，TNFR1拮抗 剂可抑制TNFα与TNFR1的结合和/或抑制通过TNFR1介导的信号 转导。因此，TNFR1介导的过程和细胞应答(例如在标准L929细胞 毒性测定中TNFα诱导的细胞死亡)可以被TNFR1拮抗剂所抑制。 TNFR1拮抗剂可以是例如有机小分子、天然产物、蛋白质、肽或肽 模拟物(peptidomimetic)。可以通过筛选本文所述的文库或分子集合(例 如Chemical Repository of the National Cancer Institute)或采用其它合适 方法，鉴定TNFR1拮抗剂。优选的TNFR1拮抗剂是本文所述的抗 体、抗体的抗原结合片段、配体和dAb单体。

与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的 序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的 序列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％以上。或者，当核酸区段在所选杂交条件(例如极高 严格性杂交条件)下与互补链杂交时，则存在基本的同一性。核酸可 以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或者呈部分纯化或基 本纯化的形式。

两序列间“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(这些术语 在本文可互换使用)的计算如下进行。为了优化比较目的，将序列比 对(例如为了比较目的，对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或 核酸序列中引入空位，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实 施方案中，为了比较目的，所比对的参考序列长度占参考序列总长 度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少 60％、甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，对相应氨基 酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列 中的某个位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占 据时，那么分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同 源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的％同一性是考 虑到空位数和各空位长度后的两序列共享的相同位置数的函数，需 要引入这些空位以进行两序列的最佳比对。

最好采用BLAST算法(2.0版)进行序列比对，参数设定到默认 值。BLAST算法在美国政府(“.gov”)的国立健康研究院(“nih”)国 立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information， “.ncbi”)的万维网(“www”)上、在“/Blast/”目录下、在“blast_help.html” 文件内有详细介绍。检索参数定义如下，最好是设定在已定好的默 认参数。

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是blastp、blastn、 blastx、tblastn和tblastx程序所采用的启发式检索算法；这些程序都 主要归功于采用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8(参见如上所述的“blast_help.html”文件)的统计学方法 的发现，只有很少的强化。BLAST程序专门用于序列相似性检索， 例如鉴定查询序列的同源物。这些程序一般不用于基序风格的检索。 有关序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，参见Altschul等 (1994)。

在美国国立生物技术信息中心网站可获得的5个BLAST程序来 完成以下任务：

“blastp”比较氨基酸查询序列和蛋白质序列数据库；

“blastn”比较核苷酸查询序列和核苷酸序列数据库；

“blastx”比较核苷酸查询序列(两条链)的六个框概念翻译产物 和蛋白质序列数据库；

“tblastn”比较蛋白质查询序列和所有六个读框(两条链)动态翻 译的核苷酸序列数据库。

“tblastx”比较核苷酸查询序列的六个读框翻译和核苷酸序列数 据库的六个读框翻译。

BLAST采用下列检索参数：

HISTOGRAM显示每次检索得分的直方图；默认为yes(是)。(参 见BLAST手册中的参数H)。

DESCRIPTIONS限制对指定数量报告的匹配序列简短描述的数 量；默认限制为100个描述。(参见手册的参数V)。另见EXPECT和 CUTOFF。

ALIGNMENTS将数据库序列限定在报告高打分区段对(high- scoring segment pairs，HSP)的指定数量；默认限制为50。如果数据库 序列比这更多，为了满足统计显著性的报告阈值(参见以下EXPECT 和CUTOFF)，仅报告归于最大统计显著性的匹配。(参见BLAST手 册的参数B)。

EXPECT针对数据库序列报告的匹配的统计显著性的阈值；默 认值为10，使得预期仅偶然找到10个匹配，按照Karlin和Altschul (1990)的随机模型。如果归于匹配的统计显著性大于EXPECT阈值， 则将不报告匹配。EXPECT阈值越低，严格性越高，导致报告的匹 配机会越少。分数值是可接受的。(参见BLAST手册的参数E)。

CUTOFF用于报告高打分区段对的截止(Cutoff)分值。默认值从 EXPECT值(参见上文)求出。HSP是为数据库序列而报告的，仅当归 于它们的统计显著性至少与具有等于CUTOFF值的分值的孤立HSP 一样高时。CUTOFF值越高，严格性越高，导致报告的匹配机会越 小。(参见BLAST手册的参数S)。通常，显著性阈值可以用EXPECT 更直观地控制。

MATRIX指定替代打分矩阵，用于BLASTP、BLASTX、TBLASTN 和TBLASTX。默认矩阵是BLOSUM62(Henikoff和Henikoff，1992， Proc.Natl.Aacad.Sci.USA 89(22)：10915-9)。有效替代选择包括： PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。替代打分矩阵不适用于 BLASTN；指定MATRIX在BLASTN请求中的方向返回错误响应。

STRAND将TBLASTN检索正好限制在数据库序列的顶链或底 链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索正好限制在查询序 列的顶链或底链的读框。

FILTER掩蔽具有低成分复杂性的查询序列区段(通过Wootton 和Federhen(1993)Computers and Chemistry 17：149-163的SEG程序 来确定)，或由短周期性内部重复序列组成的区段(通过Claverie和 States，1993，Computers and Chemistry 17：191-201的XNU程序来确 定，或者对于BLASTN，通过Tatusov和Lipman的DUST程序来确 定(参见NCBI的互联网站点))。过滤可从blast输出中消除具有统计 学显著性但没有生物学意义的报告(例如针对常见富含酸性、碱性或 脯氨酸区的命中)，留下更具生物学意义的查询序列区，适用于针对 数据库序列的特定匹配。

过滤程序中发现的低复杂性序列在核苷酸序列中用字母“N”替 代(例如“N”重复13次)，在蛋白质序列中用字母“X”替代(例如“X” 重复9次)。

过滤仅适用于查询序列(或其翻译产物)，而不适用于数据库序 列。对于BLASTN，默认过滤是DUST，而对于其它程序是SEG。

当用于SWISS-PROT中的序列时，SEG、XNU或这两者完全没 有掩蔽什么，这并非是不常见的，所以不应当希望过滤总会有结果。 此外，在某些情况下，序列完全被掩蔽，这表明任何针对未过滤查 询序列而报告的匹配的统计学显著性应当受到怀疑。

NCBI-gi Causes NCBI gi标识符在输出中显示，除了检索号和/或 位置名称之外。

最优选采用上述NCBI网址的“/BLAST”目录下所提供的简单 BLAST检索算法，进行序列比较。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例 如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技 术人员公知的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般 参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和 Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.，所述文献通过引用结合到本文中)和化学方法。

TNFR1是跨膜受体，它含有胞外区和胞内区，其中胞外区能结 合配体，胞内区缺乏内在信号转导活性、但能结合信号转导分子。 具有结合TNF的TNFR1复合物含有3条TNFR1链和3条TNF链。 (Banner等，Cell，73(3)431-445(1993))。TNF配体以三聚体形式存在， 它与3条TNFR1链结合(出处同上)。这3条TNFR1链在受体-配体 复合物中紧密簇集在一起，这种簇集是TNFR1介导的信号转导的先 决条件。事实上，在TNF不存在时，结合TNFR1的多价物质(例如 抗TNFR1抗体)可诱导TNFR1成簇和信号转导，并且通常用作TNFR1 激动剂。(参见例如Belka等，EMBO，14(6)：1156-1165(1995)；Mandik- Nayak等，J.Immunol.，167：1920-1928(2001))。因此，与TNFR1结合 的多价物质通常并非有效的TNFR1拮抗剂，甚至当它们阻断TNFα 与TNFR1的结合时。

TNFR1的胞外区包含13个氨基酸的氨基端区段(SEQ ID NO：603 (人)的氨基酸1-13；SEQ ID NO：604(小鼠)的氨基酸1-13)、域1(SEQ ID NO：603(人)的氨基酸14-53；SEQ ID NO：604(小鼠)的氨基酸14- 53)、域2(SEQ ID NO：603(人)的氨基酸54-97；SEQ ID NO：604(小 鼠)的氨基酸54-97)、域3(SEQ ID NO：603(人)的氨基酸98-138；SEQ ED NO：604(小鼠)的氨基酸98-138)和域4(SEQ ID NO：603(人)的氨 基酸139-167；SEQ ID NO：604(小鼠)的氨基酸139-167)，其后接着 是膜近端区(SEQ ID NO：603(人)的氨基酸168-182；SEQ ID NO：604 (小鼠)的氨基酸168-183)。(参见Banner等，Cell 73(3)431-445(1993) 和Loetscher等，Cell 61(2)351-359(1990))。域2和域3接触结合配体 (TNFβ、TNFα)。(Banner等，Cell，73(3)431-445(1993))。TNFR1胞 外区也含有一个称为前配体结合装配区或PLAD区的区(SEQ ID NO： 603(人)的氨基酸1-53；SEQ ID NO：604(小鼠)的氨基酸1-53)(美国 政府，WO 01/58953；Deng等，Nature Medicine，doi：10.1038/nm1304 (2005))。

TNFR1通过蛋白水解等过程在体内从细胞表面脱落，产生可溶 性形式的TNFR1，所述过程包括TNFR1在域4或在膜近端区(SEQ ID NO：603的氨基酸168-182；SEQ ID NO：604的氨基酸168-183)的蛋 白水解。可溶性TNFR1保留了结合TNFα的能力，因此起到TNFα 活性的内源抑制剂的作用。

本发明涉及抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体，其结合 TNFR1，但不与TNF竞争性结合TNFR1。例如，抗体或其抗原结合 片段(例如dAb)或配体能结合TNFR1的域1或TNFR1的域4。这样 的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体具有作为诊断试剂的优 势，因此可用于结合和检测、量化或测定样品中的TNFR1，但是不 与样品中的TNF竞争性结合TNFR1。因此，可以准确测定样品中是 否存在TNFR1以及样品中有多少TNFR1。在某些实施方案中，结合 TNFR1、但不与TNF竞争性结合TNFR1的抗体或其抗原结合片段(例 如dAb)或配体，就是本文所述的TNFR1拮抗剂。

本发明也涉及一种诊断试剂盒和使用说明书(例如测定样品中 TNFR1的存在和/或数量)，用于确定样品中是否存在TNFR1以及样 品中有多少TNFR1，所述试剂盒包括结合TNFR1、但不与TNF竞 争性结合TNFR1的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体。在某 些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种辅助试剂，例如合适的缓 冲剂或合适的检测试剂(例如可检测标记抗体或其抗原结合片段，其 结合能结合TNFR1、但不与TNF竞争性结合TNFR1的抗体或其抗 原结合片段(例如dAb)或配体)。

本发明也涉及一种装置，所述装置包括固体表面，其中把能结 合TNFR1、但不与TNF竞争性结合TNFR1的抗体或其抗原结合片 段(例如dAb)或配体固定在所述固体表面上，使得固定化抗体或其抗 原结合片段(例如dAb)或配体能结合TNTR1。可以使用抗体或其抗 原结合片段(例如dAb)或配体可固定在其上的任何合适固体表面，例 如玻璃、塑料、碳水化合物(例如琼脂糖珠)。如有必要，支持物可含 有所需官能团或者经过修饰以含有所需官能团，以便固定抗体或其 抗原结合片段(例如dAb)或配体。装置和/或支持物可具有任何合适形 状，例如片、小杆、带、板、玻片、小珠、小丸、盘、凝胶、试管、 球、芯片、板或皿等。在某些实施方案中，装置是浸棒(dipstick)。

本发明涉及对肿瘤坏死因子受体1(TNFR1；p55；CD120a)具有结 合特异性的TNFR1拮抗剂(例如本文所述的配体)。优选本发明的拮 抗剂对肿瘤坏死因子2(TNFR2)不具有结合特异性，或者基本上不拮 抗TNFR2。在标准细胞测定中，当拮抗剂(1nM、10nM、100nM、1μM、 10μM或100μM)导致不超过约5％的针对由TNFα(100pg/ml)诱导的 TNFR2介导的活性的抑制时，TNFR1拮抗剂基本上不拮抗TNFR2。 特别优选的TNFR1拮抗剂是用于治疗慢性炎性疾病的有效治疗药物 (是有效的，具有疗效)。例如，在某些实施方案中，TNFR1拮抗剂 在例如以下的慢性炎性疾病模型中有效：小鼠胶原诱发的关节炎模 型、小鼠关节炎ΔARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、 小鼠炎性肠病ΔARE模型、小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型或合适 的灵长类模型(例如灵长类胶原诱发的关节炎)。

TNFR1拮抗剂可以是单价或多价的。在某些实施方案中，所述 拮抗剂是单价的，含有一个与TNFR1相互作用的结合位点。单价拮 抗剂能结合一个TNFR1，而且不诱导细胞表面TNFR1的交联或成 簇，这样的交联或成簇能导致受体活化和信号转导。在具体的实施 方案中，TNFR1单价拮抗剂结合TNFR1的域1。在更具体的实施方 案中，TNFR1单价拮抗剂结合TNFR1的域1，并与TAR2m-21-23 竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。

在其它实施方案中，TNFR1拮抗剂是多价的。TNFR1多价拮抗 剂可含有两个或更多个拷贝的针对TNFR1的特定结合位点或者含有 两个或更多个能结合TNFR1的不同结合位点。例如，本文所述的 TNFR1拮抗剂可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两个或更多 个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb或者两个或更多个能结合TNFR1 的不同dAb。在标准细胞测定中，优选TNFR1多价拮抗剂基本上不 激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测定中，当浓度为 1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或5,000μM 时，导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNPR1介导的活 性)。

在某些实施方案中，TNFR1多价拮抗剂含有两个或更多个针对 TNFR1的所需表位或结构域的结合位点。例如，TNFR1多价拮抗剂 可包含两个或更多个能结合TNFR1的域1中同一表位的结合位点。

在其它实施方案中，TNFR1多价拮抗剂含有两个或更多个能结 合TNFR1的不同表位或结构域的结合位点。在一个实例中，TNFR1 多价拮抗剂包含第一结合位点和第二结合位点，其中第一结合位点 能结合TNFR1的域1中的第一表位，第二结合位点能结合域1中不 同的第二表位。在其它实例中，TNFR1多价拮抗剂可包含能结合 TNFR1的两个或更多个所需表位或结构域的结合位点。例如，TNFR1 多价拮抗剂可包含针对以下TNFR1的结构域的结合位点：域1和域 2、域1和域3、域1和域4、域2和域3、域2和域4、或域3和域 4。例如，TNFR1多价拮抗剂可包含针对TNFR1的域1、域2和域3 的结合位点，针对TNFR1的域1、域2和域4的结合位点，或针对 TNFR1的域1、域3和域4的结合位点。在某些实施方案中，TNFR1 拮抗剂是双特异性配体，其包含能结合TNFR1的域1的dAb以及能 结合TNFR1的域3的dAb。在本文所述的标准L929细胞毒性测定 或标准HeLa IL-8测定中，优选所述多价拮抗剂当浓度为约1nM、或 约10nM、或约100nM、或约1μM、或约10μM时，不激动TNFR1。

一些TNFR1拮抗剂能结合TNFR1并抑制TNFα与TNFR1的结 合。在某些实施方案中，这样的TNFR1拮抗剂能结合TNFR1的域2 和/或域3。在具体的实施方案中，所述拮抗剂与TAR2h-10-27、 TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10 或TAR2h-185-25竞争性结合TNFR1。

其它配体(其中优选的实施方案是TNFR1拮抗剂)不抑制TNFα 与TNFR1的结合。这类配体(和拮抗剂)具有作为诊断试剂的优势， 因为它们可用于结合和检测、量化或测定样品中的TNFR1，但是不 与样品中的TNF竞争性结合TNFR1。因此，可以准确测定样品中是 否存在TNFR1以及有多少TNFR1。

一些TNFR1拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合，但却抑制 通过TNFR1介导的信号转导。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFα诱 导的TNFR1成簇，而这是通过TNFR1的信号转导之前的步骤。这 类拮抗剂具有若干优势。例如，在这样的拮抗剂存在下，TNFα能结 合在细胞表面表达的并离开细胞环境的TNFR1，但是不会激活TNFR1 介导的信号转导。因此，TNFR1信号诱导的额外TNF和其它炎症 介质的产生将会被抑制。同样，能结合TNFR1并抑制通过TNFR1 介导的信号转导、但却不抑制TNFα与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂， 将不抑制内源产生的可溶性TNFR1的TNFα的结合及抑制活性。因 此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径， 所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。本发明也涉及 配体，所述配体(i)能结合TNFR1(例如在域1)，(ii)不拮抗TNFR1介 导的信号转导的活化，和(iii)不抑制TNFα与TNFR1的结合。这类配 体能结合可溶性TNFR1，但不阻止可溶性受体结合TNFα，因此将 这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述 途径在体内通过延长血清中可溶性受体的半衰期而抑制TNFα的活 性。这些优势尤其与这样的配体有关：所述配体被精制成为具有较 大流体动力学尺寸(hydrodynamic size)，例如通过连接PEG基团、血 清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、 抗体Fc区，或者通过与抗体区缀合。例如，可以把具有以下特性的 物质(例如多肽)精制成为具有较大的抗体的抗原结合片段或成为抗体 (例如精制成为Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、IgG、scFv)：(i)能结合TNFR1 (即在域1)，(ii)不拮抗TNFR1介导的信号转导的活化，和(iii)不抑制 TNFα与TNFR1(例如dAb单体)的结合。也可以通过将TNFR1结合 剂与能结合本文所述的能延长体内半衰期的抗原或表位的结合域(例 如抗体或抗体片段)缀合或连接，从而增加配体的流体动力学尺寸及 其血清半衰期(参见附录1)。例如，TNFR1结合剂(例如多肽)可以与 抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段(例如抗SA或抗 新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab′或scFv)或与抗SA亲和体或抗新 生动物Fc受体亲和体缀合或连接。

用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白 蛋白变异体的实例参见WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部 结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变 异体可用于本发明：

●SEQ ID NO：1(公开于WO 2005/077042A2，该序列通过引 用明确地结合到本说明书中)；

●白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸1-387或由其组成；

●白蛋白或其片段或变异体，其包含选自以下的氨基酸序 列：(a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸54- 61；(b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸76- 89；(c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸92- 100；(d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸 170-176；(e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基 酸247-252；(f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨 基酸266-277；(g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的 氨基酸280-288；(h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1 的氨基酸362-368；(i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1 的氨基酸439-447；(j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1 的氨基酸462-475；(k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1 的氨基酸478-486；和(l)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO： 1的氨基酸560-566。

用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、其片段和变异体 的其它实例参见WO 03/076567A2，所述文献通过引用全部结合到本 文中。具体地讲，下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明：

●人血清白蛋白，参见WO 03/076567A2，例如在图3中(该 序列信息通过引用明确地结合到本说明书中)；

●人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多 肽链组成，分子量为66，500(参见Meloun等，FEBS Letters 58：136(1975)；Behrens等，Fed.Proc.34：591(1975)；Lawn 等，Nucleic Acids Research 9：6102-6114(1981)；Minghetti 等，J.Biol.Chem.261：6747(1986))；

●白蛋白多态变异体或其类似物或片段，参见Weitkamp等， Ann.Hum.Genet.37：219(1973)；

●白蛋白片段或变异体，参见EP 322094，例如HA(1-373)、 HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369 和1-419间的片段；

●白蛋白片段或变异体，参见EP 399666，例如HA(1-177) 和HA(1-200)和HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199 间的任意数字。

当一个或多个半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段 和类似物)用于本发明的TNFR1结合配体时，可以用任何合适方法将 其缀合，例如通过与TNFR1结合部分(例如抗TNFR1 dAb或抗体片 段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其 中融合蛋白编码成为单一多肽链和半衰期延长部分(位于TNFR1结合 部分的N端或C端)。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如 WO 03/076567 A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的全部 公开内容通过引用结合到本说明书中，以提供用于本发明的实例))， 来完成缀合反应。

在更具体的实施方案中，能结合TNFR1并抑制通过TNFR1介 导的信号转导、但却不抑制TNFα与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂， 能结合TNFR1的域1或TNFR1的域4。在某些实施方案中，这种 TNFR1拮抗剂是能结合TNFR1的域1或TNFR1的域4的dAb单体 或配体。

在一个具体实施方案中，TNFR1拮抗剂(例如dAb单体或配体) 能结合TNFR1的域1，并且一旦结合TNFα后能抑制通过TNFR1介 导的信号转导。这样的拮抗剂可抑制通过TNFR1的信号转导，但不 抑制TNFα与TNFR1的结合和/或TNFR1的脱落，以产生可溶性 TNFR1。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内 源调节途径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。

其它TNFR1拮抗剂能结合TNFR1，但不结合域4。这类拮抗剂 可抑制TNFR1的功能，但不抑制可溶性TNFR1的脱落。因此，将 这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述 途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。

在某些实施方案中，所述拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、 dAb单体、配体)能结合TNFR1的域1并与TAR2m-21-23竞争性结 合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。在其它实施 方案中，所述拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、dAb单体、配体) 能结合TNFR1的域2或域4。在其它实施方案中，所述拮抗剂(例如 化合物、新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFR1的域3并与 TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h- 154-10、TAR2h-185-25或TAR2h-27-10竞争性结合TNFR1(例如人 和/或小鼠TNFR1)。

一些配体(在优选的实施方案中为TNFR1拮抗剂)能结合人 TNFR1和小鼠TNFR1。这类配体(例如拮抗剂、dAb单体)提供了这 样的优势：可用相同配体进行临床前和临床研究，而不需要用合适 替代配体来进行临床前研究。

在其它实施方案中，所述拮抗剂或配体是对TNFR1或其抗原结 合片段(例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或Fv片段(例如scFV)) 具有结合特异性的抗体。在其它实施方案中，所述拮抗剂或配体是 单价的，例如dAb或抗体的单价抗原结合片段，例如Fab片段、Fab′ 片段或Fv片段。

在本说明书中所述的本发明的其它实施方案中，在本发明的拮 抗剂或配体中不使用“dAb”，是考虑技术人员可使用包含能结合 TNFR1的dAb的CDR的结构域(例如移植到合适蛋白质支架或骨架 上的CDR，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)或 者可以是包含针对TNFR1的结合位点的蛋白质结构域，例如其中所 述结构域选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区或EGF区。因此， 总的来说，本发明的公开内容应视为提供了拮抗剂、配体以及使用 所述结构域替代dAb的方法。

优选的TNFR1拮抗剂是本文所述的配体。配体包含对TNFR1 具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或域抗体(dAb)或所述dAb的 合适形式的互补决定区。配体可以是由这样的dAb组成或基本上由 这样的dAb组成的多肽。配体也可以是包含合适形式(例如抗体形式 (例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2))的dAb(或dAb的CDR) 的多肽，包含能结合TNFR1的dAb以及能结合另一靶蛋白、抗原或 表位(例如血清白蛋白)的第二dAb的双特异性配体，或者本文所述的 多特异性配体。

TNFR1拮抗剂，包括本发明任何方面的配体、以及用于构建所 述配体的dAb单体，都可有利地从它们的关联靶上解离下来，根据 表面等离子共振的测定，Kd为300nM～5pM(即3×10-7M～5×10-12 M)、优选50nM～20pM、或5nM～200pM或1nM～100pM，1×10-7M 以下、1×10-8M以下、1×10-9M以下、1×10-10M以下、1×10-11M 以下；和/或K解离速率常数为5×10-1s-1～1×10-7s-1、优选1×10-2s-1～ 1×10-6s-1、或5×10-3s-1～1×10-5s-1、或5×10-1s-1以下、或1×10-2s-1 以下、或1×10-3s-1以下、或1×104s-1以下、或1×10-5s-1以下、或 1×10-6s-1以下。Kd速率常数定义为K解离/K缔合。

在其它实施方案中，所述拮抗剂结合TNFR1并抑制TNFR1的 一个或多个功能(例如受体成簇、受体信号传导或TNFα与TNFR1的 结合)，而且也结合TNF受体超家族的另一成员。优选该类拮抗剂也 抑制TNF受体超家族其它成员的功能(例如成员簇集、信号转导或该 成员与其关联配体的结合)。TNF受体超家族是本领域公知的一组蛋 白质，它们包括TNFR1(p55、CD120a、p60、TNF受体超家族成员 1A、TNFRSF1A)、TNFR2(p75、p80、CD120b、TNF受体超家族成 员1B、TNFRSF1B)、

CD18(TNFRSF3，LTBR，TNFR2-RP， TNFR-RP，TNFCR，TNF-R-III)，OX40(TNFRSF4，ACT35，TXGP1L)，CD40 (TNFRSF5，p50，Bp50)，Fas(CD95，TNFRSF6，APO-1，APTI)，DcR3 (TNFRSF6B)，CD27(TN-FRSF7，Tp55，S152)，CD30(TNFRSF8，Ki-1，D1S166E)， CD137(TNFRSF9，4-1BB，ILA)，TRAILR-1(TNFRSF10A，DR4，Apo2)，TRAIL- R2(TNFRSF10B，DR5，KILLER，TRICK2A，TRICKB)，TRAILR3(TNFRSF10C， DcR1，LIT，TRID)，TRAILR4(TNFRSF10D，DcR2，TRUNDD)，RANK (TNFRSF11A)，OPG(TNFRSF11B，OCIF，TR1)，DR3(TNFRSF12，TRAMP， WSL-1，LARD，WSL-LR，DDR3，TR3，APO-3)，DR3L(TNFRSF12L)，TAC1 (TNFRSF13B)，BAFFR(TNFRSF13C)，HVEM(TNFRSF14，ATAR，TR2， LIGHTR，HVEA)，NGFR(TNFRSF16)，BCMA(TNFRSF17，BCM)，AITR (TNFRSF18，GITR)，TNFRSF19，FLJ14993(TNFRSF19L，RELT)，DR6 (TNFRSF21)，SOBa(TNFRSF22，Tnfrh2，2810028K06Rik)，mSOB(THFRSF23， Tnfrh1)

在某些实施方案中，所述拮抗剂包含能结合TNFR1并抑制TNFR1 功能的第一dAb以及能结合TNF受体超家族另一成员的第二dAb， 所述另一成员例如以上列举的TNFR2(CD120b)、OX40、CD40、Fas (CD95)、TRAILR-1、TRAILR-2、TAC1、BCMA等。在另一个实施 方案中，所述拮抗剂包含能结合TNFR1并抑制TNFR1功能、并且 也能结合TNF受体超家族另一成员的dAb单体(所述功能例如受体成 簇、受体信号传导或TNFα与TNFR1的结合)，所述另一成员例如以 上列举的TNFR2(CD120b)、OX40、CD40、Fas(CD95)、TRAILR-1、 TRAILR-2、TAC1、BCMA等。

与TNFR1结合的配体和dAb单体

本发明提供包含抗TNFR1 dAb单体的配体(例如包含这种dAb 的双特异性配体)，根据表面等离子共振的测定，所述单体与TNF受 体I结合的Kd为300nM～5pM(即3×10-7M～5×10-12M)、优选50nM～ 20pM、更优选5nM～200pM、最优选1nM～100pM，例如1×10-7M 以下、优选1×10-8M以下、更优选1×10-9M以下、有利的是1×10-10 M以下、最优选1×10-11M以下；和/或K解离速率常数为5×10-1s-1～ 1×10-7s-1、优选1×10-2s-1～1×10-6s-1、更优选5×10-3s-1～1×10-5s-1 例如5×10-1s-1以下、优选1×10-2s-1以下、有利的是1×10-3s-1以下、 更优选1×10-4s-1以下、还更优选1×10-5s-1以下、最优选1×10-6s-1 以下。

优选配体或dAb单体抑制TNFα与TNFα受体1(p55受体)的结 合，其抑制浓度50(IC50)为500nM～50pM、优选100nM～50pM、更 优选10nM～100pM、有利的是1nM～100pM；例如50nM以下、优 选5nM以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM 以下。优选TNF受体1的靶是人TNFα。

优选配体或dAb结合人TNFR1并抑制人TNFα与人TNFR1的 结合，或者抑制因响应TNFα结合而通过TNFR1的信号传导。例如， 在某些实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1并抑制TNFR1 介导的信号传导，但基本上不抑制TNFα与TNFR1的结合。在某些 实施方案中，所述配体或dAb单体抑制由TNFα诱导的细胞表面上 TNFR1的交联或成簇。这类配体或dAb(例如本文所述的TAR2m- 21-23)是有利的，因为它们可拮抗细胞表面的TNFR1，但基本上不 降低内源可溶性TNFR1的抑制活性。例如，在受体结合测定中，所 述配体或dAb能结合TNFR1，但抑制TNFα与TNFR1的结合不超过 约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％ 或不超过约1％。并且，在这些实施方案中，在标准细胞测定中，所 述配体或dAb抑制TNFα诱导的TNFR1交联和/或TNFR1介导的信 号转导至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少 约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至 少约95％或至少约99％。

如本文所述，配体可以是单价的(例如dAb单体)或多价的(例如 双特异性、多特异性)。在具体的实施方案中，所述配体是能结合 TNFR1的域1的dAb单体。相对于其它结合形式(例如单克隆抗体) 来说，能结合TNFR1的域1的域抗体单体具有小足迹(small footprint)。因此，这样的dAb单体可选择性阻断域1，但不干扰TNFR1 其它结构域的功能。例如，能结合TNFR1的域1的dAb单体可拮抗 TNFR1，但不抑制TNFα与TNPR1的结合或TNFR1的脱落。

在更具体的实施方案中，所述配体是能结合TNFR1的域1并与 TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合 人TNFR1的dAb单体。

在其它实施方案中，所述配体是多价的，包含两个或更多个能 结合TNFR1的dAb单体。多价配体可含有两个或更多个拷贝的能结 合TNFR1的特定dAb，或者含有两个或更多个能结合TNFR1的dAb。 例如，本文所述的配体可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两 个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb，或者两个或更多个能 结合TNFR1的不同dAb。在一些实例种，配体是同型二聚体或同型 三聚体，它们分别包含两个或三个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb。 在标准细胞测定中，优选的多价配体基本上不激动TNFR1(作为 TNFR1激动剂)(即在测定中，当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、 10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，导致不超过约5％的由TNFα (100pg/ml)诱导的TNFR1介导的活性)。

在某些实施方案中，多价配体含有两个或更多个能结合TNFR1 所需表位或结构域的dAb。例如，多价配体可包含两个或更多个拷 贝的能结合TNFR1的域1所需表位的dAb。

在其它实施方案中，多价配体含有两个或更多个能结合TNFR1 不同表位或结构域的dAb。在一个实例中，多价配体包含第一dAb 和第二dAb，其中第一dAb能结合TNFR1的域1中的第一表位，第 二dAb能结合TNFR1的域1中不同的第二表位。在其它实例中，多 价配体包含能结合TNFR1的两个或更多个所需表位或结构域的 dAb。例如，多价配体可包含结合以下TNFR1的结构域的dAb：域 1和域2、域1和域3、域1和域4、域2和域3、域2和域4、或域 3和域4。

在某些实施方案中，多价配体是双特异性配体，所述配体包含 能结合TNFR1的域1的dAb，以及能结合TNFR1的域3的dAb。 该类配体可以高亲和力结合TNFR1，并且比起其它配体形式(例如dAb 单体)来说，对于在其表面高密度过量表达TNFR1或表达TNFR1的 细胞的结合选择性更高。

在其它具体的实施方案中，多价配体包含两个或更多个能结合 TNFR1的域1的dAb或者两个或更多个拷贝的特定dAb。该类多价 配体可以低亲和力结合TNFR1单体，但却以高亲合力结合受体多聚 体(例如在受体配体复合物中所观察到的三聚体)。因此，可以将该形 式的配体给予有效靶向受体，所述受体已彼此成簇或缔合和/或与 TNFR1介导的信号转导所需的配体(例如TNFα)簇集或缔合。

一些配体或dAb单体结合TNFR1并抑制TNFα与TNFR1的结 合。在某些实施方案中，这样的配体或dAb单体能结合TNFR1的域 2和/或域3。在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1 的域3。在更具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1 的域3并与TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、 TAR2h-154-7、TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竞争性结合TNFR1。

其它配体或dAb单体不抑制TNFα与TNFR1的结合。这类拮抗 剂具有作为诊断试剂的优势，因为它们可用于结合和检测、量化或 测定样品中的TNFR1，但是不与样品中的TNF竞争性结合TNFR1。 因此，可以准确测定样品中是否存在TNFR1以及有多少TNFR1。

一些配体和dAb单体不抑制TNFα与TNFR1的结合，但却抑制 通过TNFR1介导的信号转导。例如，配体或dAb单体可抑制TNFα 诱导的TNFR1成簇，而这是在通过TNFR1的信号转导之前的步骤。 这类配体或dAb单体具有若干优势，正如本文所讨论的有关具有这 些特性的拮抗剂。在具体的实施方案中，该类配体或dAb单体能结 合TNFR1的域1或TNFR1的域4。在某些实施方案中，所述配体是 能结合TNFR1的域1或TNFR1的域4的dAb单体。

在一个具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1 的域1，并且一旦结合TNFα后就能抑制通过TNFR1介导的信号转 导。这类配体或dAb单体可抑制通过TNFR1的信号转导，但不抑制 TNFα与TNFR1的结合和/或TNFR1的脱落产生可溶性TNFR1。因 此，将这样的配体或dAb单体给予有需要的哺乳动物，可补充内源 调节途径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。

其它配体或dAb单体能结合TNFR1，但不结合域4。这类配体 或dAb单体可抑制TNFR1的功能，但不抑制可溶性TNFR1的脱落。 因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途 径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。

在标准测定(例如本文所述的标准L929或标准HeLa IL-8测定) 中，优选的配体或dAb单体中和TNFα或TNFR1(抑制其活性)，其 中和剂量50(ND50)为500nM～50pM、优选100nM～50pM、更优选 10nM～100pM、有利的是1nM～100pM；例如50nM以下、优选5nM 以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM 以下。

在某些实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合人肿瘤坏 死因子受体1(TNFR1；p55)，根据表面等离子共振的测定，所述配 体或dAb单体从人TNFR1上解离下来的解离常数(Kd)为50nM～ 20pM，K解离速率常数为5×10-1s-1～1×10-7s-1。

在其它实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合TNFR1(其 Kd如本文所述)并且在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模 型中抑制致死率(即与合适对照相比，其预防致死或减少致死率至少 约10％)。在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中，与 合适对照相比，当给予约5mg/kg或更优选约1mg/kg的dAb单体时， 优选的dAb单体抑制致死率至少约25％或至少约50％。

在其它实施方案中，在标准细胞测定中，所述配体或dAb单体 结合TNFR1并拮抗TNFR1活性的ND50≤100nM，在浓度≤10μM时， dAb激动TNFR1的活性≤5％。

在具体的实施方案中，在标准细胞测定中，所述配体或dAb单 体基本上不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测定中， 当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或 5,000μM时，导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNPR1 介导的活性)。

在某些实施方案中，所述配体或dAb单体基本上能抵抗聚集。 例如，在某些实施方案中，当将1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、 20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml配体或dAb 溶液溶于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐水、柠檬酸缓冲盐水、 水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的溶剂，所述赋形剂例 如由FDA批准的赋形剂)时，将小于约10％、小于约9％、小于约8％、 小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于 约2％或小于约1％的配体或dAb单体聚集物，在约22℃、22-25℃、 25-30℃、30-37℃、37-40℃、40-50℃、50-60℃、60-70℃、70-80℃、 15-20℃、10-15℃、5-10℃、2-5℃、0-2℃、-10℃至0℃、-20℃至-10℃、 -40℃至-20℃、-60℃至-40℃或-80℃至-60℃的温度下，保持一段时 间，例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1 周、2周、3周、1月、2月、3月、4月、6月、1年或2年。

可采用显微镜检、通过目测或分光镜检测定溶液浊度等任何合 适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散射来评价聚集。抗聚 集的配体或dAb单体具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生 产系统(例如大肠杆菌)进行表达，容易以可溶性蛋白质的形式产生这 类配体或dAb单体并且收率高，然后可以比常规多肽更高的浓度来 配制和/或贮存，同时聚集和活性的损失较低。

另外，生产抗聚集的配体或dAb单体，可以比生产其它抗原或 表位结合多肽(例如常规抗体)更经济。例如，用于体内应用的抗原或 表位结合多肽的制备通常包括除去聚集多肽的过程(例如凝胶过滤)。 如果不能除去这样的聚集物，会使制剂不适用于体内应用，例如， 因为希望起到拮抗剂作用的抗原结合多肽如果聚集的话，可通过诱 导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。聚集蛋白也可通过在 接受它们的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性多肽的功效。

相比之下，可以制备本发明的抗聚集配体或dAb单体，用于体 内应用，而无需包括除去聚集物的过程，并且可用于体内应用，而 没有聚集多肽所引起的上述缺点。

在某些实施方案中，所述配体或dAb单体当加热到温度(Ts)和 冷却到温度(Tc)时能可逆地解折叠，其中Ts高于dAb的解链温度 (Tm)，而Tc低于dAb的解链温度。例如，dAb单体当加热到80℃ 和冷却到约室温时能可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽在解折叠 时会丧失功能，而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多肽不同于在 解折叠时聚集或不适当重折叠(即不能恢复功能)的多肽(错折叠的多 肽)。

可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价 多肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UV CD、 近UV CD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、 核磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于合适折叠的多肽功能(例 如与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个 实例中，采用功能测定，评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合 通用配体和/或靶配体，结合底物)的丧失，表明该多肽是解折叠的。

可以采用解折叠或变性曲线，测定配体或dAb单体的解折叠和 重折叠的程度。可通过纵坐标为温度与横坐标为折叠多肽相对浓度 作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何合适的方法(例如CD、荧光、 结合测定)，直接或间接测定折叠配体或dAb单体的相对浓度。例如， 可以制备配体或dAb单体溶液，然后通过CD测定溶液的椭圆率。 所得椭圆率值表示折叠配体或dAb单体的相对浓度为100％。再通过 逐渐升高溶液温度，使溶液中的配体或dAb单体解折叠，然后以合 适增量(例如温度每升高一度后)测定椭圆率。然后通过逐渐降低溶液 温度，使溶液中配体或dAb单体重折叠，再以合适增量测定椭圆率。 可以对数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折叠曲线和重 折叠曲线具有特征性的S形，它包括配体或dAb单体分子折叠部分， 配体或dAb单体分子解折叠到不同程度时的解折叠/重折叠转换部 分，以及配体或dAb单体分子解折叠部分。重折叠曲线的Y轴截距 是恢复的重折叠配体或dAb单体的相对数量。至少约50％、或至少 约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约 85％、或至少约90％、或至少约95％的恢复，表明配体或dAb单体 可逆地解折叠。

在一个优选的实施方案中，通过制备配体或dAb单体溶液并绘 制加热解折叠和重折叠曲线，测定配体或dAb单体解折叠的可逆性。 可以在任何合适溶剂中制备配体或dAb单体溶液，所述溶剂例如含 水缓冲液，其pH适于让配体或dAb单体溶解(例如pH比等电点(pI) 约高或低3个单位)。配体或dAb单体溶液足够浓，以便可检测出解 折叠/折叠。例如，配体或dAb单体溶液可以是约0.1μM至约100μM、 或优选约1μM至约10μM。

如果配体或dAb单体的解链温度(Tm)是已知的，则可将溶液加 热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后通过椭圆率或荧光(例如远-UV CD 可从200nm至250nm，固定波长CD为235nm或225nm；色氨酸荧 光发射光谱为300-450nm，激发为298nm)进行评价折叠，以提供100％ 的相对折叠配体或dAb单体。再按预定增量(例如约0.1度至约1度 的增加)，将溶液加热至比Tm高至少10度(Tm+10)，在每次增量时 测定椭圆率或荧光。然后，按预定增量，通过冷却到至少Tm-10， 使配体或dAb单体重折叠，在每次增量时测定椭圆率或荧光。如果 不知道配体或dAb单体的解链温度，可以通过从约25℃至约100℃ 逐渐增量加热，使溶液解折叠，再逐渐增量冷却到至少约25℃使其 重折叠，在每次加热和冷却增量时测定椭圆率或荧光。可以对所得 数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折叠曲线的Y轴 截距是恢复的重折叠蛋白质的相对数量。

在某些实施方案中，本发明的配体或dAb单体当以有效量给予 时，在慢性炎性疾病模型中有效。通常有效量为约1mg/kg至约 10mg/kg(例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约 5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。 本文所述的慢性炎性疾病模型是本领域技术人员公知的，用于预测 在人体内的疗效。现有技术没有给出在这些模型中使用TNFR1拮抗 剂(例如本文所述的单价拮抗剂、配体)的启示，也没有给出它们是否 有效的启示。

在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体在标准小鼠胶原诱 发的关节炎模型(实施例15A)中是有效的。例如与合适对照相比，在 标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可降低四肢 平均关节炎评分总和例如约1至约16、约3至约16、约6至约16、 约9至约16或约12至约16。在另一实例中，与合适对照相比，在 标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可延迟关节 炎症状发作例如达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6 天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例 中，在标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可导 致四肢平均关节炎评分总和为0至约3、约3至约5、约5至约7、 约7至约15、约9至约15、约10至约15、约12至约15或约14至 约15。

在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠关节炎ΔARE 模型中是有效的(实施例15B)。例如，与合适对照相比，在小鼠关节 炎ΔARE模型中，给予有效量的配体可降低平均关节炎评分例如达约 0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2 至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小鼠关节炎ΔARE模 型中，给予有效量的配体可延迟关节炎症状发作例如达约1天、约2 天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14 天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠关节炎ΔARE模型中， 给予有效量的配体可导致平均关节炎评分为0至约0.5、约0.5至约 1、约1至约1.5、约1.5至约2、或约2至约2.5。

在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠炎性肠病(IBD) ΔARE模型(实施例15B)中是有效的。例如，与合适对照相比，在小 鼠IBDΔARE模型中，给予有效量的配体可降低平均急性和/或慢性 炎症评分例如达约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5 至约2.5、或约2至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小 鼠IBD ΔARE模型中，给予有效量的配体可延迟IBD症状发作例如 达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、 约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠IBD ΔARE模型中，给予有效量的配体可导致平均急性和/或慢性炎症评 分为0至约0.5、约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2或约2 至约2.5。

在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠葡聚糖硫酸钠 (DSS)诱发的IBD模型中是有效的(实施例15C)。例如，与合适对照 相比，在小鼠DSS IBD模型中，给予有效量的配体可降低平均严重 性评分例如达约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5 至约2.5、或约2至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小 鼠DSS IBD模型中，给予有效量的配体可延迟IBD症状发作例如达 约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10 天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠DSS IBD 模型中，给予有效量的配体可导致平均严重性评分为0至约0.5、约 0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2或约2至约2.5。

在具体实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠吸烟所致慢性 阻塞性肺病(COPD)模型中是有效的(实施例15D)。例如，与合适对 照相比，给予有效量的配体可降低或延迟COPD症状发作。

在具体实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合TNFR1并 且包含TAR2-10的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)或与其具有至少 80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至 少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同 源性的序列。

在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合TNFR1 并包含TAR2-5的氨基酸序列(SEQ ID NO：195)或与其具有至少 80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至 少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同 源性的序列。

在其它实施方案中，所述配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb 单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd 为300nM～5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨 基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至 少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同源性：TAR2h-12 (SEQ ID NO：32)、TAR2h-13(SEQ ID NO：33)、TAR2h-14(SEQ ID NO： 34)、TAR2h-16(SEQ ID NO：35)、TAR2h-17(SEQ ID NO：36)、 TAR2h-18(SEQ ID NO：37)、TAR2h-19(SEQ ID NO：38)、TAR2h-20 (SEQ ID NO：39)、TAR2h-21(SEQ ID NO：40)、TAR2h-22(SEQ ID NO： 41)、TAR2h-23(SEQ ID NO：42)、TAR2h-24(SEQ ID NO：43)、 TAR2h-25(SEQ ID NO：44)、TAR2h-26(SEQ ID NO：45)、TAR2h-27 (SEQ ID NO：46)、TAR2h-29(SEQ ID NO：47)、TAR2h-30(SEQ ID NO： 48)、TAR2h-32(SEQ ID NO：49)、TAR2h-33(SEQ ID NO：50)、 TAR2h-10-1(SEQ ID NO：51)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO：52)、 TAR2h-10-3(SEQ ID NO：53)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO：54)、 TAR2h-10-5(SEQ ID NO：55)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO：56)、 TAR2h-10-7(SEQ ID NO：57)、TAR2h-10-8(SEQ ID NO：58)、 TAR2h-10-9(SEQ ID NO：59)、TAR2h-10-10(SEQ ID NO：60)、 TAR2h-10-11(SEQ ID NO：61)、TAR2h-10-12(SEQ ID NO：62)、 TAR2h-10-13(SEQ ID NO：63)、TAR2h-10-14(SEQ ID NO：64)、 TAR2h-10-15(SEQ ID NO：65)、TAR2h-10-16(SEQ ID NO：66)、 TAR2h-10-17(SEQ ID NO：67)、TAR2h-10-18(SEQ ID NO：68)、 TAR2h-10-19(SEQ ID NO：69)、TAR2h-10-20(SEQ ID NO：70)、 TAR2h-10-21(SEQ ID NO：71)、TAR2h-10-22(SEQ ID NO：72)、 TAR2h-10-27(SEQ ID NO：73)、TAR2h-10-29(SEQ ID NO：74)、 TAR2h-10-31(SEQ ID NO：75)、TAR2h-10-35(SEQ ID NO：76)、 TAR2h-10-36(SEQ ID NO：77)、TAR2h-10-37(SEQ ID NO：78)、 TAR2h-10-38(SEQ ID NO：79)、TAR2h-10-45(SEQ ID NO：80)、 TAR2h-10-47(SEQ ID NO：81)、TAR2h-10-48(SEQ ID NO：82)、 TAR2h-10-57(SEQ ID NO：83)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO：84)、 TAR2h-10-58(SEQ ID NO：85)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO：86)、 TAR2h-10-64(SEQ ID NO：87)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO：88)、 TAR2h-10-68(SEQ ID NO：89)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO：90)、 TAR2h-10-67(SEQ ID NO：91)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO：92)、 TAR2h-10-62(SEQ ID NO：93)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO：94)、 TAR2h-10-60(SEQ ID NO：95)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO：96)、 TAR2h-10-59(SEQ ID NO：97)、TAR2h-10-70(SEQ ID NO：98)、 TAR2h-34(SEQ ID NO：373)、TAR2h-35(SEQ ID NO：374)、 TAR2h-36(SEQ ID NO：375)、TAR2h-37(SEQ ID NO：376)、TAR2h- 38(SEQ ID NO：377)、TAR2h-39(SEQ ID NO：378)、TAR2h-40(SEQ ID NO：379)、TAR2h-41(SEQ ID NO：380)、TAR2h-42(SEQ ID NO： 381)、TAR2h-43(SEQ ID NO：382)、TAR2h-44(SEQ ID NO：383)、 TAR2h-45(SEQ ID NO：384)、TAR2h-47(SEQ ID NO：385)、TAR2h- 48(SEQ ID NO：386)、TAR2h-50(SEQ ID NO：387)、TAR2h-51(SEQ ID NO：388)、TAR2h-66(SEQ ID NO：389)、TAR2h-67(SEQ ID NO： 390)、TAR2h-68(SEQ ID NO：391)、TAR2h-70(SEQ ID NO：392)、 TAR2h-71(SEQ ID NO：393)、TAR2h-72(SEQ ID NO：394)、TAR2h- 73(SEQ ID NO：395)、TAR2h-74(SEQ ID NO：396)、TAR2h-75(SEQ ID NO：397)、TAR2h-76(SEQ ID NO：398)、TAR2h-77(SEQ ID NO： 399)、TAR2h-78(SEQ ID NO：400)、TAR2h-79(SEQ ID NO：401)和 TAR2h-15(SEQ ID NO：431)。

在其它实施方案中，所述配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb 单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd 为300nM～5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨 基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至 少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同源性： TAR2h-131-8(SEQ ID NO：433)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO：434)、 TAR2h-15-8(SEQ ID NO：435)、TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO：436)、 TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO：437)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO：438)、 TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO：439)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO：440)、 TAR2h-151-8(SEQ ID NO：441)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO：442)、 TAR2h-35-4(SEQ ID NO：443)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO：444)、 TAR2h-80(SEQ ID NO：445)、TAR2h-81(SEQ ID NO：446)、TAR2h- 82(SEQ ID NO：447)、TAR2h-83(SEQ ID NO：448)、TAR2h-84(SEQ ID NO：449)、TAR2h-85(SEQ ID NO：450)、TAR2h-86(SEQ ID NO： 451)、TAR2h-87(SEQ ID NO：452)、TAR2h-88(SEQ ID NO：453)、 TAR2h-89(SEQ ID NO：454)、TAR2h-90(SEQ ID NO：455)、TAR2h- 91(SEQ ID NO：456)、TAR2h-92(SEQ ID NO：457)、TAR2h-93(SEQ ID NO：458)、TAR2h-94(SEQ ID NO：459)、TAR2h-95(SEQ ID NO： 460)、TAR2h-96(SEQ ID NO：461)、TAR2h-97(SEQ ID NO：462)、 TAR2h-99(SEQ ID NO：463)、TAR2h-100(SEQ ID NO：464)、 TAR2h-101(SEQ ID NO：465)、TAR2h-102(SEQ ID NO：466)、 TAR2h-103(SEQ ID NO：467)、TAR2h-104(SEQ ID NO：468)、 TAR2h-105(SEQ ID NO：469)、TAR2h-106(SEQ ID NO：470)、 TAR2h-107(SEQ ID NO：471)、TAR2h-108(SEQ ID NO：472)、 TAR2h-109(SEQ ID NO：473)、TAR2h-110(SEQ ID NO：474)、 TAR2h-111(SEQ ID NO：475)、TAR2h-112(SEQ ID NO：476)、 TAR2h-113(SEQ ID NO：477)、TAR2h-114(SEQ ID NO：478)、 TAR2h-115(SEQ ID NO：479)、TAR2h-116(SEQ ID NO：480)、 TAR2h-117(SEQ ID NO：481)、TAR2h-118(SEQ ID NO：482)、 TAR2h-119(SEQ ID NO：483)、TAR2h-120(SEQ ID NO：484)、 TAR2h-121(SEQ ID NO：485)、TAR2h-122(SEQ ID NO：486)、 TAR2h-123(SEQ ID NO：487)、TAR2h-124(SEQ ID NO：488)、 TAR2h-125(SEQ ID NO：489)、TAR2h-126(SEQ ID NO：490)、 TAR2h-127(SEQ ID NO：490)、TAR2h-128(SEQ ID NO：492)、 TAR2h-129(SEQ ID NO：493)、TAR2h-130(SEQ ID NO：494)、 TAR2h-131(SEQ ID NO：495)、TAR2h-132(SEQ ID NO：496)、 TAR2h-133(SEQ ID NO：497)、TAR2h-151(SEQ ID NO：498)、 TAR2h-152(SEQ ID NO：499)、TAR2h-153(SEQ ID NO：500)、 TAR2h-154(SEQ ID NO：501)、TAR2h-159(SEQ ID NO：502)、 TAR2h-165(SEQ ID NO：503)、TAR2h-166(SEQ ID NO：504)、 TAR2h-168(SEQ ID NO：505)、TAR2h-171(SEQ ID NO：506)、 TAR2h-172(SEQ ID NO：507)、TAR2h-173(SEQ ID NO：508)、 TAR2h-174(SEQ ID NO：509)、TAR2h-176(SEQ ID NO：510)、 TAR2h-178(SEQ ID NO：511)、TAR2h-201(SEQ ID NO：512)、 TAR2h-202(SEQ ID NO：513)、TAR2h-203(SEQ ID NO：514)、 TAR2h-204(SEQ ID NO：515)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO：516)、 TAR2h-154-10(SEQ ID NO：517)和TAR2h-205(SEQ ID NO：627)。

在优选的实施方案中，所述配体或dAb的氨基酸序列与选自以 下dAb的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、 至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、 至少约98％或至少约99％同源性：TAR2h-10-27(SEQ ID NO：73)、 TAR2h-10-57(SEQ ID NO：83)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO：84)、 TAR2h-10-58(SEQ ID NO：85)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO：86)、 TAR2h-10-64(SEQ ID NO：87)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO：88)、 TAR2h-10-68(SEQ ID NO：89)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO：90)、 TAR2h-10-67(SEQ ID NO：91)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO：92)、 TAR2h-10-62(SEQ ID NO：93)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO：94)、 TAR2h-10-60(SEQ ID NO：95)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO：96)、 TAR2h-10-59(SEQ ID NO：97)和TAR2h-10-70(SEQ ID NO：98)。

特别优选的配体或dAb的氨基酸序列与SEQ ID NO：73的氨基 酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、 至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％ 或至少约99％同源性。

在其它实施方案中，所述配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb 单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd 为300nM～5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨 基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至 少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同源性：TAR2m-14 (SEQ ID NO：167)、TAR2m-15(SEQ ID NO：168)、TAR2m-19(SEQ ID NO：169)、TAR2m-20(SEQ ID NO：170)、TAR2m-21(SEQ ID NO： 171)、TAR2m-24(SEQ ID NO：172)、TAR2m-21-23(SEQ ID NO： 173)、TAR2m-21-07(SEQ ID NO：174)、TAR2m-21-43(SEQ ID NO： 175)、TAR2m-21-48(SEQ ID NO：176)、TAR2m-21-10(SEQ ID NO： 177)、TAR2m-21-06(SEQ ID NO：178)、TAR2m-21-17(SEQ ID NO： 179)。

在某些实施方案中，所述配体包含dAb单体，所述dAb单体能 结合TNFR1并与本文所公开的任何dAb竞争性结合TNFR1(例如小 鼠TNFR1和/或人TNFR1)。

优选的配体或dAb单体当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕 赤酵母)中表达时，其分泌量至少约为0.5mg/L。在其它优选的实施 方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时， dAb单体的分泌量至少约0.75mg/L、至少约1mg/L、至少约4mg/L、 至少约5mg/L、至少约10mg/L、至少约15mg/L、至少约20mg/L、 至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、 至少约45mg/L、或至少约50mg/L、或至少约100mg/L、或至少约 200mg/L、或至少约300mg/L、或至少约400mg/L、或至少约500mg/L、 或至少约600mg/L、或至少约700mg/L、或至少约800mg/L、至少约 900mg/L、或至少约1g/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌 或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，dAb单体的分泌量至少 约1mg/L到至少约1g/L、至少约1mg/L到至少约750mg/L、至少约 100mg/L到至少约1g/L、至少约200mg/L到至少约1g/L、至少约 300mg/L到至少约1g/L、至少约400mg/L到至少约1g/L、至少约 500mg/L到至少约1g/L、至少约600mg/L到至少约1g/L、至少约 700mg/L到至少约1g/L、至少约800mg/L到至少约1g/L、或至少约 900mg/L到至少约1g/L。尽管在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕 赤酵母)中表达时，本文所述的配体和dAb单体可以分泌，但是它们 也可以采用任何其它合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕 赤酵母的合成化学方法或生物学制备方法。

dAb单体可包含任何合适的免疫球蛋白可变区、优选包含人可 变区或包含人构架区的可变区。在某些实施方案中，dAb单体包含 本文所述的通用构架。

通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、 DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、 DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、 DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基 因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VL构架还可包 含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码 的构架氨基酸序列。

在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种 系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、 DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、 DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。 如有必要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5 和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。

在具体的实施方案中，dAb单体配体包含DPK9 VL构架或选自 DP47、DP45和DP38的VH构架。

dAb单体可包含通用配体的结合位点，所述通用配体例如蛋白 A、蛋白L和蛋白G。

在某些实施方案中，dAb单体包含一个或多个构架区，所述架 构区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨 基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸序列共同包含 最多5个与人种系抗体基因区段所编码的所述相应构架区的氨基酸 序列不同的氨基酸。

在其它实施方案中，dAb单体的FW1、FW2、FW3和FW4的 氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序 列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列共同包含最 多10个与所述人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序 列不同的氨基酸。

在其它实施方案中，dAb单体包含FW1、FW2和FW3区，而 且所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段 所编码的相应构架区的氨基酸序列相同。

在某些实施方案中，dAb单体不含骆驼科动物免疫球蛋白可变 区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可 变区所特有的一个或多个构架氨基酸。

与血清白蛋白结合的配体和dAb单体

本发明提供配体或dAb单体(例如包含这样的dAb的双特异性配 体)，其与血清白蛋白(SA)结合的Kd为1nM～500μM(即1×10-9～5× 10-4)、优选100nM～10μM。优选对于含有第一抗SA dAb和针对另 一靶标的第二dAb的双特异性配体来说，第二dAb对其靶标的亲和 力(例如经采用BiaCore进行表面等离子共振测定的Kd和/或K解离)为 第一dAb对SA的亲和力的1-100000倍(优选100-100000倍、更优 选1000-100000倍、或10000-100000倍)。例如，第一dAb结合SA 的亲和力约为10μM，第二dAb结合其靶标的亲和力为100pM。优 选的血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb (或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd约为50nM、优选70nM、 更优选100nM、150nM或200nM。

在某些实施方案中，对SA具有特异性的dAb单体包含MSA-16 的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)或与其具有至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、 至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同源性的序列。

在其它实施方案中，对SA具有特异性的dAb单体包含MSA-26 的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)或与其具有至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、 至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同源性的序列。

在某些实施方案中，与SA结合的dAb单体能抵抗聚集、可逆 地解折叠和/或包含如上所述的构架区，该架构区用于能结合TNFR1 的dAb单体。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明也提供分离和/或重组的核酸分子，所述分子编码本文所 述的配体和dAb单体。在某些实施方案中，分离和/或重组的核酸包 含的核苷酸序列编码能特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR)的域 抗体(dAb)单体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有 至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、 至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、 至少约98％、或至少约99％同源性：TAR2h-12(SEQ ID NO：32)、 TAR2h-13(SEQ ID NO：33)、TAR2h-14(SEQ ID NO：34)、TAR2h-16 (SEQ ID NO：35)、TAR2h-17(SEQ ID NO：36)、TAR2h-18(SEQ ID NO： 37)、TAR2h-19(SEQ ID NO：38)、TAR2h-20(SEQ ID NO：39)、 TAR2h-21(SEQ ID NO：40)、TAR2h-22(SEQ ID NO：41)、TAR2h-23 (SEQ ID NO：42)、TAR2h-24(SEQ ID NO：43)、TAR2h-25(SEQ ID NO： 44)、TAR2h-26(SEQ ID NO：45)、TAR2h-27(SEQ ID NO：46)、 TAR2h-29(SEQ ID NO：47)、TAR2h-30(SEQ ID NO：48)、TAR2h-32 (SEQ ID NO：49)、TAR2h-33(SEQ ID NO：50)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO：51)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO：52)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO： 53)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO：54)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO：55)、 TAR2h-10-6(SEQ ID NO：56)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO：57)、 TAR2h-10-8(SEQ ID NO：58)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO：59)、 TAR2h-10-10(SEQ ID NO：60)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO：61)、 TAR2h-10-12(SEQ ID NO：62)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO：63)、 TAR2h-10-14(SEQ ID NO：64)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO：65)、 TAR2h-10-16(SEQ ID NO：66)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO：67)、 TAR2h-10-18(SEQ ID NO：68)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO：69)、 TAR2h-10-20(SEQ ID NO：70)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO：71)、 TAR2h-10-22(SEQ ID NO：72)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO：73)、 TAR2h-10-29(SEQ ID NO：74)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO：75)、 TAR2h-10-35(SEQ ID NO：76)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO：77)、 TAR2h-10-37(SEQ ID NO：78)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO：79)、 TAR2h-10-45(SEQ ID NO：80)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO：81)、 TAR2h-10-48(SEQ ID NO：82)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO：83)、 TAR2h-10-56(SEQ ID NO：84)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO：85)、 TAR2h-10-66(SEQ ID NO：86)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO：87)、 TAR2h-10-65(SEQ ID NO：88)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO：89)、 TAR2h-10-69(SEQ ID NO：90)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO：91)、 TAR2h-10-61(SEQ ID NO：92)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO：93)、 TAR2h-10-63(SEQ ID NO：94)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO：95)、 TAR2h-10-55(SEQ ID NO：96)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO：97)、 TAR2h-10-70(SEQ ID NO：98)、TAR2h-34(SEQ ID NO：402)、 TAR2h-35(SEQ ID NO：403)、TAR2h-36(SEQ ID NO：404)、TAR2h- 37(SEQ ID NO：405)、TAR2h-38(SEQ ID NO：406)、TAR2h-39(SEQ ID NO：407)、TAR2h-40(SEQ ID NO：408)、TAR2h-41(SEQ ID NO： 409)、TAR2h-42(SEQ ID NO：410)、TAR2h-43(SEQ ID NO：411)、 TAR2h-44(SEQ ID NO：412)、TAR2h-45(SEQ ID NO：413)、TAR2h- 47(SEQ ID NO：414)、TAR2h-48(SEQ ID NO：415)、TAR2h-50(SEQ ID NO：416)、TAR2h-51(SEQ ID NO：417)、TAR2h-66(SEQ ID NO： 418)、TAR2h-67(SEQ ID NO：419)、TAR2h-68(SEQ ID NO：420)、 TAR2h-70(SEQ ID NO：421)、TAR2h-71(SEQ ID NO：422)、TAR2h- 72(SEQ ID NO：423)、TAR2h-73(SEQ ID NO：424)、TAR2h-74(SEQ ID NO：425)、TAR2h-75(SEQ ID NO：426)、TAR2h-76(SEQ ID NO： 427)、TAR2h-77(SEQ ID NO：428)、TAR2h-78(SEQ ID NO：429)、 TAR2h-79(SEQ ID NO：430)和TAR2h-15(SEQ ID NO：432)。

在其它实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸序列编 码能特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的域抗体(dAb)单体， 其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80％、至 少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、 至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、 或至少约99％同源性：TAR2h-131-8(SEQ ID NO：518)、TAR2h-131- 24(SEQ ID NO：519)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO：520)、TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO：521)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO：522)、TAR2h-185-23 (SEQ ID NO：523)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO：524)、TAR2h-14-2 (SEQ ID NO：525)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO：526)、TAR2h-152-7 (SEQ ID NO：527)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO：528)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO：529)、TAR2h-80(SEQ ID NO：530)、TAR2h-81(SEQ ID NO： 531)、TAR2h-82(SEQ ID NO：532)、TAR2h-83(SEQ ID NO：533)、 TAR2h-84(SEQ ID NO：534)、TAR2h-85(SEQ ID NO：535)、TAR2h- 86(SEQ ID NO：536)、TAR2h-87(SEQ ID NO：537)、TAR2h-88(SEQ ID NO：538)、TAR2h-89(SEQ ID NO：539)、TAR2h-90(SEQ ID NO： 540)、TAR2h-91(SEQ ID NO：541)、TAR2h-92(SEQ ID NO：542)、 TAR2h-93(SEQ ID NO：543)、TAR2h-94(SEQ ID NO：544)、TAR2h- 95(SEQ ID NO：545)、TAR2h-96(SEQ ID NO：546)、TAR2h-97(SEQ ID NO：547)、TAR2h-99(SEQ ID NO：548)、TAR2h-100(SEQ ID NO： 549)、TAR2h-101(SEQ ID NO：550)、TAR2h-102(SEQ ID NO：551)、 TAR2h-103(SEQ ID NO：552)、TAR2h-104(SEQ ID NO：553)、 TAR2h-105(SEQ ID NO：554)、TAR2h-106(SEQ ID NO：555)、 TAR2h-107(SEQ ID NO：556)、TAR2h-108(SEQ ID NO：557)、 TAR2h-109(SEQ ID NO：558)、TAR2h-110(SEQ ID NO：559)、 TAR2h-111(SEQ ID NO：560)、TAR2h-112(SEQ ID NO：561)、 TAR2h-113(SEQ ID NO：562)、TAR2h-114(SEQ ID NO：563)、 TAR2h-115(SEQ ID NO：564)、TAR2h-116(SEQ ID NO：565)、 TAR2h-117(SEQ ID NO：566)、TAR2h-118(SEQ ID NO：567)、 TAR2h-119(SEQ ID NO：568)、TAR2h-120(SEQ ID NO：569)、 TAR2h-121(SEQ ID NO：570)、TAR2h-122(SEQ ID NO：571)、 TAR2h-123(SEQ ID NO：572)、TAR2h-124(SEQ ID NO：573)、 TAR2h-125(SEQ ID NO：574)、TAR2h-126(SEQ ID NO：575)、 TAR2h-127(SEQ ID NO：576)、TAR2h-128(SEQ ID NO：577)、 TAR2h-129(SEQ ID NO：578)、TAR2h-130(SEQ ID NO：579)、 TAR2h-131(SEQ ID NO：580)、TAR2h-132(SEQ ID NO：581)、 TAR2h-133(SEQ ID NO：582)、TAR2h-151(SEQ ID NO：583)、 TAR2h-152(SEQ ID NO：584)、TAR2h-153(SEQ ID NO：585)、 TAR2h-154(SEQ ID NO：586)、TAR2h-159(SEQ ID NO：587)、 TAR2h-165(SEQ ID NO：588)、TAR2h-166(SEQ ID NO：589)、 TAR2h-168(SEQ ID NO：590)、TAR2h-171(SEQ ID NO：591)、 TAR2h-172(SEQ ID NO：592)、TAR2h-173(SEQ ID NO：593)、 TAR2h-174(SEQ ID NO：594)、TAR2h-176(SEQ ID NO：595)、 TAR2h-178(SEQ ID NO：596)、TAR2h-201(SEQ ID NO：597)、 TAR2h-202(SEQ ID NO：598)、TAR2h-203(SEQ ID NO：599)、 TAR2h-204(SEQ ID NO：600)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO：601)、 TAR2h-154-10(SEQ ID NO：602)和TAR2h-205(SEQ ID NO：628)。

在一个优选的实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸 序列与选自以下的核苷酸具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、 至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、 至少约98％、或至少约99％同源性：TAR2m-10-27(SEQ ID NO：141)、 TAR2m-10-57(SEQ ID NO：151)、TAR2m-10-56(SEQ ID NO：152)、 TAR2m-10-58(SEQ ID NO：153)、TAR2m-10-66(SEQ ID NO：154)、 TAR2m-10-64(SEQ ID NO：155)、TAR2m-10-65(SEQ ID NO：156)、 TAR2m-10-68(SEQ ID NO：157)、TAR2m-10-69(SEQ ID NO：158)、 TAR2m-10-67(SEQ ID NO：159)、TAR2m-10-61(SEQ ID NO：160)、 TAR2m-10-62(SEQ ID NO：161)、TAR2m-10-63(SEQ ID NO：162)、 TAR2m-10-60(SEQ ID NO：163)、TAR2m-10-55(SEQ ID NO：164)、 TAR2m-10-59(SEQ ID NO：165)和TAR2m-10-70(SEQ ID NO：166)。

在其它实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸序列编 码能特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的域抗体(dAb)单体， 其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80％、至 少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、 至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、 或至少约99％同源性：TAR2m-14(SEQ ID NO：180)、TAR2m-15(SEQ ID NO：181)、TAR2m-19(SEQ ID NO：182)、TAR2m-20(SEQ ID NO： 183)、TAR2m-21(SEQ ID NO：184)、TAR2m-24(SEQ ID NO：185)、 TAR2m-21-23(SEQ ID NO：186)、TAR2m-21-07(SEQ ID NO：187)、 TAR2m-21-43(SEQ ID NO：188)、TAR2m-21-48(SEQ ID NO：189)、 TAR2m-21-10(SEQ ID NO：190)、TAR2m-21-06(SEQ ID NO：191)和 TAR2m-21-17(SEQ ID NO：192)和TAR2m-21-23a(SEQ ID NO： 626)。

本发明也提供包含本发明重组核酸分子的载体。在某些实施方 案中，载体是包含一个或多个与本发明重组核酸操作性连接的表达 控制元件或序列的表达载体。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)和表达 控制元件进一步描述如下。

本发明也提供重组宿主细胞，所述细胞包含本发明的重组核酸 分子或载体。合适的宿主细胞以及用于制备本发明重组宿主细胞的 方法进一步描述如下。

本发明也提供制备本发明的配体(例如dAb单体、双特异性配体、 多特异性配体)的方法，该方法包括在适于所述重组核酸表达的条件 下维持包含本发明重组核酸的重组宿主细胞，由此表达重组核酸并 产生配体。在某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。

配体形式

本发明的配体可以精制成为单特异性或多特异性抗体或抗体片 段或者单特异性或多特异性非免疫球蛋白结构。合适的形式包括任 何合适的多肽结构，其中抗体可变区或其CDR可以结合起来，以便 在结构上赋予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域 已知的，例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链 抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的 同型二聚体和异型二聚体、任何前述抗原结合片段(例如Fv片段(例 如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2 片段)、单可变区(例如VH、VL)、dAb和任何前述的修饰形式(例如通 过共价连接聚烷二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合 适的聚合物)而修饰)。参见PCT/GB03/002804(2003年6月30日申 请，指定国为美国，公布号为WO 2004/081026)有关单可变区和dAb 的PEG化、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚 体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG 和优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。 PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及 的部分，全都通过引用结合到本文中。

在具体的实施方案中，所述配体(例如dAb单体、二聚体或多聚 体、双特异性形式、多特异性形式)是PEG化配体，并且能结合TNFR1 的域1和任选抑制TNFR1功能。优选的PEG化配体抑制通过TNFR1 的信号转导。优选的PEG化配体与TNFR1的域1结合的亲和力与未 PEG化的相同配体的亲和力相同。例如，在一个实施方案中，所述 配体是能结合TNFR1的域1并抑制通过TNFR1的信号转导的PEG 化dAb单体，其中PEG化dAb单体与TNFR1的域1结合的亲和力 与非PEG化形式的dAb的亲和力之间的差异不超过约1000倍、优 选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲和力相对 于未PEG化形式的亲和力来说基本不变。

结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域1、但不抑制TNFα 与受体形式结合的本发明配体，可用于阻断膜结合受体上的域1(例 如以抑制受体成簇和/或抑制信号转导)并且也结合可溶性形式，以延 长半衰期，特别是当与PEG连接或按照上述其它方法时。在一个优 选的实施方案中，所述配体不结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性 形式的域2。在另一优选的实施方案中，所述配体不结合TNFR1的 膜结合(跨膜)和可溶性形式的域3。在另一优选的实施方案中，所述 配体不结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域2或域3。

在某些实施方案中，所述配体是IgG样形式。这类形式具有常 规IgG分子的4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可 变区(VH和/或VL)已经被具有所需特异性的dAb即单可变区取代。优 选各可变区(2个VH区和2个VL区)被dAb即单可变区取代。包括在 IgG样形式中的dAb即单可变区可具有相同特异性或不同特异性。 在某些实施方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4 种特异性。例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有 相同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特 异性的dAb和另一具有不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并 且包含2个具有相同特异性的dAb和两个具有共同、却不同特异性 的dAb；可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第 二dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三 dAb的特异性的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各 自具有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例 如Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv、scFy)。优选的IgG样形式或其抗原结合 片段不交联TNFR1。

本发明的配体，包括dAb单体、二聚体和三聚体，可以连接抗 体Fc区，该区包含CH2和CH3区的一个或两个，以及任选的铰链 区。例如，编码将单核苷酸序列连接Fc区的配体的载体，可用于制 备所述多肽。

按照本发明的以下方面，本发明还提供前述dAb单体的二聚体、 三聚体和多聚体。

本发明的配体可以结合和/或制成非免疫球蛋白多配体结构的形 式，以形成多价复合物，其结合具有相同抗原的靶分子，因而提供 较高亲合力。在某些实施方案中，至少一个可变区结合抗原，以延 长多聚体的半衰期。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR 的支架，以产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细 节参见US5,831,012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的 支架。合适方法的细节参见WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质 运载蛋白和CTLA4(参见van den Beuken等，J,Mol.Biol.(2001)310， 591-601)以及例如描述于WO00/69907(Medical Research Council)的 支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它陪伴分子 多肽。

蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支 架上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样， 纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。

双特异性配体和多特异性配体

本发明人在其同时待审的国际专利申请WO 03/002609以及同时 待审的未公布的UK专利申请0230203.2中，已经描述了双特异性免 疫球蛋白配体，所述配体包含各自具有不同特异性的免疫球蛋白单 可变区。这些结构域可以彼此竞争性或独立地结合靶分子上的抗原 或表位。

本发明的双特异性配体优选包含重链区和轻链区的组合。例如， 双特异性配体可包含VH区和VL区，这两区可以连接在一起呈scFv 的形式。另外，配体可包含一个或多个CH区或CL区。例如，配体可 包含CH1区、CH2区或CH3区和/或CL区、Cμ1、Cμ2、Cμ3或Cμ4 区、或其任何组合。铰链区也可包含在其中。这样的各区组合可以 是例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、 Fab或F(ab′)2分子。也考虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和 CL区的IgG分子的单臂。

在本发明的一个优选的实施方案中，可变区选自单域V基因库。 通常，单域抗体库都展示在丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施 方案中，通过噬菌体库与抗原的结合，来选择各单域抗体。

在本发明的一个优选的实施方案中，在互补可变区不存在时， 可以通过与其靶抗原或表位的结合来选择各单可变区。在一个替代 实施方案中，在互补可变区存在时，可以通过与其靶抗原或表位的 结合来选择单可变区。因此，在第三互补可变区存在时，可以选择 第一单可变区，在第四互补可变区存在时，可以选择第二可变区。 互补的第三或第四可变区可以是天然关联可变区(它们具有与待测单 域相同的特异性)或非关联互补区-例如“dummy”可变区。

优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样 的配体也能结合在一起成为同一蛋白质，例如两个这样的配体可以 结合成IgG或多聚体形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一 实施方案中，多个双特异性配体结合形成多聚体。例如，两个不同 双特异性配体结合在一起，以产生四特异性分子。

本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的双特异性配体 的轻链可变区和重链可变区，可以在同一多肽链上或者在不同多肽 链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、通常是 柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知 的任何其它方法而连接。

在第一格局中，本发明提供双特异性配体的进一步改进，该改 进是由本发明人开发的，其中配体的一个特异性针对生物体内存在 的蛋白质或多肽，它们通过与其结合而起到延长配体半衰期的作用。

因此，第一方面，提供双特异性配体，所述配体包含对第一抗 原或表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区以及对第二抗 原或表位具有结合活性的第二互补免疫球蛋白单可变区，其中所述 抗原或表位的一个或两个起到延长配体体内半衰期的作用，而且其 中所述第一和第二区缺乏共享相同特异性的互补区，前提条件是所 述双特异性配体不由抗HSA VH区和抗β半乳糖苷酶Vκ区组成。优选 的第一或第二可变区都不结合人血清白蛋白(HSA)。

延长本文所述配体的半衰期的抗原或表位最好位于生物体内存 在的蛋白质或多肽上。实例包括胞外基质蛋白、血蛋白和生物体不 同组织中存在的蛋白质。蛋白质例如通过作为膨胀剂(bulking agent)， 或者通过将配体锚定在所需作用位点上，而起到降低配体从血液中 清除的速率。延长体内半衰期的抗原/表位的实例在以下附录1中给 出。

延长的半衰期可用于免疫球蛋白、尤其是抗体、最尤其是小体 积的抗体片段的体内应用。这类片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、 dAb)会从体内快速清除掉；因此，尽管它们能快速到达身体的大部 分部位，并且也能够快速生产和容易操作，但是它们在体内的短持 续性限制了它们在体内的应用。本发明解决了这一问题，即通过使 配体在体内半衰期延长，继而延长配体功能活性在体内的持续时间。

药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人 员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters等， Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。参考文献也可 参见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ 半衰期和曲线下面积(AUC)。

半衰期(tα和tβ)和AUC可以根据配体血清浓度与时间的曲线 而确定。WinNonlin分析包(可得自Pharsight Corp.，Mountain View， CA94040，USA)可用于例如曲线建模。在第一相(α相)，配体主要是 在患者体内分布，同时有一些消除。第二相(β相)是终末相，当配体 已经分布且血清浓度随配体从患者体内消除而下降。tα半衰期是第一 相的半衰期，tβ半衰期则是第二相的半衰期。因此，最好本发明提供 本发明配体或包含本发明配体的组合物，所述配体的tα半衰期范围 为15分钟或更长时间。在一个实施方案中，范围的下限是30分钟、 45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、 10小时、11小时或12小时。另外，或者，本发明的配体或组合物 的tα半衰期范围为最多12小时且包括12小时。在一个实施方案中， 范围的上限是11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时或 5小时。合适范围的实例为1-6小时、2-5小时或3-4小时。

最好本发明提供本发明配体或包含本发明配体的组合物，所述 配体的tβ半衰期范围为2.5小时或更长时间。在一个实施方案中，范 围的下限是3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11 小时或12小时。另外，或者，本发明的配体或组合物的tβ半衰期范 围为最多21天且包括21天。在一个实施方案中，范围的上限是12 小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天或20天。最好本发 明的配体或组合物的tβ半衰期范围为12-60小时。在另一实施方案 中，范围为12-48小时。在再一实施方案中，范围为12-26小时。

另外，除了以上标准之外，本发明提供配体或包含本发明配体 的组合物，其AUC值(曲线下面积)范围为1mg.min/ml以上。在一个 实施方案中，范围的下限是5、10、15、20、30、100、200或300， 单位为mg.min/ml。另外，或者，本发明配体或组合物的AUC范围 高达600mg.min/ml。在一个实施方案中，范围的上限是500、400、300、 200、150、100、75或50，单位为mg.min/ml。最好本发明配体的AUC 范围选自以下：15-150mg.min/ml、15-100mg.min/ml、15-75mg.min/ml 和15-50mg.min/ml。

在第一个实施方案中，双特异性配体包含两个互补可变区，即 两个可变区，它们在其天然环境下能结合在一起成为关联对或关联 组，甚至在本发明的情况下，它们分别结合其关联表位。例如，互 补可变区可以是免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)。VH区和VL 区最好由scFv或Fab抗体片段提供。可变区可连接在一起形成多价 配体，例如通过在各V区的C-端提供铰链区并在铰链区的半胱氨酸 间提供二硫键；或提供在结构域C-端带有半胱氨酸的dAb，这些半 胱氨酸是通过二硫键连接在一起；或者通过产生V-CH和V-CL，以 产生Fab形式；或者使用肽接头(例如下文所述的Gly4Ser接头)，以 产生二聚体、三聚体和多聚体。

本发明人已经知道，使用互补可变区可以让两个结构域表面包 装在一起并从溶剂中隐退(sequestered)。而且，互补区可彼此稳定。 另外，它允许产生双特异性IgG抗体，但没有现有技术所用的杂种 杂交瘤的缺点，或者不需要在亚单位界面改造重链或轻链。本发明 第一方面的双特异性配体具有至少一个VH/VL对。因此，本发明的双 特异性IgG包含两个这样的配对，在Y形分子每个臂上各有一对。 因此，不同于常规双特异性抗体或双链抗体(其中所用链的比率决定 其制剂是否成功并导致实践的困难)，本发明的双特异性配体没有链 平衡的问题。常规双特异性抗体中的链不平衡是由两个不同VL链与 两个不同VH链连接所致，其中VL链1与VH链1一起能结合抗原或 表位1，VL链2与VH链2一起能结合抗原或表位2，两个正确的配 对以某种方式彼此连接。因此，在一个分子中仅当VL链1与VH链1 配对、VL链2与VH链2配对时，才产生双特异性。这样的双特异性 分子可以两种不同方式产生。第一种，它们可以通过两个各自连接 不同抗原或表位的现有VH/VL配对连接而产生(例如在双特异性IgG 中)。在这种情况下，VH/VL配对必需以1∶1的比例混合在一起，以便 产生所有分子都为双特异性分子群体。这决不会(甚至当互补CH区 通过“杵臼结构(knobs into holes)”工程而强化时)导致双特异性分子 和仅能结合一个抗原或表位、但不结合另一个抗原或表位的分子的 混合物。第二种产生双特异性抗体的方式是通过将两个不同VH链与 两个不同VL链同时结合(例如在双特异性双链抗体)。在这种情况下， 尽管倾向于优先让VL链1与VH链1配对、VL链2与VH链2配对(这 可以通过VL和VH区的“杵臼结构”改造而强化)，但是不会在所有 分子中都得到该配对，导致混合制剂，其中发生不正确的配对，使 其不能结合抗原或表位。

按照本发明第一方面的双特异性配体方法构建的双特异性抗体 克服了所有这些问题，因为与抗原或表位1的结合存在于VH区或VL 区，与抗原或表位2的结合存在于互补VL或VH区。因为VH区和VL 区配对以1∶1比例，所有VH/VL配对都是双特异性的，因此采用这些 VH/VL配对构建的所有形式(Fv、scFv、Fab、微型抗体、IgG等)都具 有100％双特异性活性。

在本发明的情况下，第一和第二“表位”被认为是这样的表位： 所述表位不同，而且不结合单个单特异性配体。在本发明的第一格 局中，它们最好在不同抗原上，其中一个起到延长配体体内半衰期 的作用。同样，第一和第二抗原最好是不同的。

本发明的双特异性配体不包含WO 02/02773所述的配体。因此， 本发明的配体不包含互补VH/VL对，其协同结合任何一个或多个抗原 或表位。相反，本发明第一方面的配体包含VH/VL互补对，其中V 区具有不同特异性。此外，本发明第一方面的配体包含VH/VL互补对， 其对非结构相关表位或抗原具有不同特异性。结构相关的表位或抗 原是这样的表位或抗原：其具有足够的结构相似性，可以与常规VH/VL 互补对结合，其以协同方式结合抗原或表位；就结构相关的表位而 言，表位在结构上是足够相似的，使得它们“适合”于VH/VL二聚体 的抗原结合位点上形成的同一结合口袋(pocket)。

第二方面，本发明提供配体，所述配体包含具有第一抗原或表 位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区以及具有第二抗原或表位结 合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中延长配体体内半衰期的所 述第一和第二可变区的一个或两个结合抗原，可变区彼此并不互补。

在一个实施方案中，通过一个可变区的结合调节了配体通过第 二可变区的结合。

在该实施方案中，可变区可以是例如VH区对或VL区对。在第 一位点的抗原结合可调节、例如增强或抑制在第二位点的抗原结合。 例如，在第一位点的结合至少部分抑制在第二位点的抗原结合。在 这样的实施方案中，配体可以例如通过与延长配体半衰期的蛋白质 结合而在患者生物体内得以维持，直到它结合第二靶抗原并从延长 半衰期的蛋白质上解离下来。

在上述情况下，达到对结合的调节是抗原结合位点彼此结构接 近的结果。可以通过连接两个或更多个抗原结合位点的结构组分的 特性，达到这样的结构接近，例如通过提供具有相对刚性结构的配 体，这样的刚性结构能保持非常接近的抗原结合位点。最好两个或 更多个抗原结合位点彼此是物理上非常接近的，通过涉及免疫球蛋 白分子内位阻和/或构象变化的过程，使得一个位点能调节另一位点 的抗原结合。

第一和第二抗原结合域可以共价或非共价结合。在结构域是共 价结合的情况下，可以通过例如二硫键或者通过多肽接头例如 (Gly4Ser)n而介导结合，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。

在采用例如本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出可变 区的情况下，这些可变区可包含通用构架区，使得它们可以被本文 所述的特异性通用配体所识别。有关通用构架、通用配体等的使用 参见WO 99/20749。在本发明中，有关的噬菌体展示包括噬菌体和/ 或噬菌粒的使用。

当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环 内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以 便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的， 参见例如Stemmer，Nature 370：389-391(1994)和美国专利第6,297,053 号，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法是本领域技 术人员众所周知的。

在本发明的一个优选实施方案中，“双特异性配体”是单链Fv 片段。在本发明的一个替代实施方案中，“双特异性配体”由抗体Fab 区组成。术语“Fab区”包括Fab样区，其中使用两个VH区或两个 VL区。

可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。或者它们可来自单域 抗体库，例如在丝状噬菌体表面表达的那些。可以按照下文所述进 行选择。

另一方面，本发明提供一种或多种核酸分子，所述核酸至少编 码本文所述的双特异性配体。双特异性配体可以由一个核酸分子编 码；或者，各结构域可以由各自的核酸分子编码。当配体由一个核 酸分子编码时，各结构域可表达为scFv分子形式的融合多肽，或者 可以分别表达，再随后连接在一起，例如使用化学连接剂。各自的 核酸所表达的配体可通过合适方法连接在一起。

核酸还可编码信号序列，用于在表达后将多肽从宿主细胞中输 出，而且在表达后还可与丝状噬菌体颗粒的表面组分(或选择展示系 统的其它组分)融合。

另一方面，本发明提供载体，所述载体包含编码本发明的双特 异性配体的核酸。

又一方面，本发明提供用载体转染的宿主细胞，所述载体编码 本发明的双特异性配体。

用这样的载体进行表达，可以例如在噬菌体颗粒表面产生可变 区，用于选择。这允许选择所展示的可变区，因此用本发明的方法 能选择出“双特异性配体”。

本发明还提供试剂盒，所述试剂盒至少包括本发明的双特异性 配体。

第三方面，本发明提供制备配体的方法，所述配体包含具有第 一结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区以及具有第二(不同)结合特 异性的第二单免疫球蛋白单可变区，结合特异性的一个或两个对在 体内延长配体半衰期的抗原具有特异性，该方法包括以下步骤：

a)选择能够结合第一表位的第一可变区，

b)选择能够结合第二表位的第二可变区，

c)连接可变区；和

d)选择能够结合所述第一表位和所述第二表位的配体。

配体可同时结合第一和第二表位，或者当结合域之间对表位结 合具有竞争性时，一个区的结合可阻碍另一区与其关联表位的结合。 因此在一个实施方案中，以上步骤(d)需要同时结合第一和第二(可能 的话更多)表位；在另一个实施方案中，与第一和第二表位的结合不 同时。

表位优选在各自抗原上。

配体最好包含如上所述的免疫球蛋白可变区的VH/VL组合、或 VH/VH或VL/VL组合。配体还可包含骆驼科动物VHH区，前提条件是 对在体内能延长配体半衰期的抗原具有特异性的VHH区不结合鸡卵 清溶菌酶(HEL)、猪胰腺α-淀粉酶或NmC-A；hcg、BSA-连接的RR6 偶氮染料或变异链球菌(S.mutans)HG982细胞，参见Conrath等(2001) JBC 276：7346-7350和WO99/23221，这两篇文献都没有介绍针对在 体内能延长配体半衰期的抗原特异性用途。

在一个实施方案中，在互补可变区不存在的情况下，选择所述 第一可变区用于结合所述第一表位。在另一实施方案中，在第三可 变区存在的情况下，选择所述第一可变区用于结合所述第一表位/抗 原，其中所述第三可变区不同于所述第二可变区并且与第一区互补。

同样，可以在互补可变区存在或不存在的情况下，选择第二区。

除了延长半衰期的蛋白质之外，本发明配体所靶向的抗原或表 位可以是任何抗原或表位，但最好是具有治疗益处的抗原或表位。 本发明提供配体，包括开放构象、闭合构象和分离的dAb单体配体， 它们对任何所述靶标、尤其是本文进一步鉴定的那些靶标具有特异 性。所述靶标可以是天然存在或合成的多肽、蛋白质或核酸、或其 部分。在该方面，本发明的配体能结合表位或抗原并起到拮抗剂或 激动剂(例如EPO受体激动剂)的作用。本领域技术人员将会理解， 选择是庞大的而不同的。它们可以是例如人或动物蛋白、细胞因子、 细胞因子受体、酶的辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生 长因子包括但不限于：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养蛋白-1、 EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、嗜酸 性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、EpoR、FGF(酸性)、FGF(碱性)、 成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化因子(CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、 IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、 IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质形成细胞生长因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、米勒管(Mullerian) 抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC (67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、 MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1a、MIP-1β、MIP-3α、 MIP-3β、MDP-4、髓性祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神经营 养因子、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、抑瘤素M、PDGF-AA、 PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、 干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿 瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、 TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER 3和HER4。细胞因子受体包含前述细胞因子的受体。可以理解，该 名单并非是详尽而无遗漏的。

在本发明的一个实施方案中，可变区来自针对抗原或表位的相 应抗体。在一个优选的实施方案中，可变区来自抗体单可变区库。

在第二格局中，本发明提供多特异性配体。根据本发明，术语 “多特异性配体”是指具有不止一个本文所定义的表位结合特异性 的配体。通常，多特异性配体包含两个或更多个表位结合域。

本发明的表位结合域包含蛋白质支架和表位相互作用位点(它们 最好在蛋白质支架表面)。根据本发明，最好各表位结合域具有不同 表位结合特异性。

在本发明的情况下，认为第一和第二“表位”是不同表位且不 结合一个单特异性配体的表位。它们可以在不同抗原上，或在同一 抗原上、但是有足够距离隔开，使它们不会形成一个这样的实体： 所述实体与常规抗体的一个单特异性VH/VL结合对结合。从实验上 看，如果单链抗体形式中的单个可变区的两个(域抗体或dAb)各自被 针对两个表位的单特异性VH/VL配体竞争的话，则这两个表位间的距 离不够远，不能认为是本发明的分离的表位。

根据本发明，有利的是，每个表位结合域都包含免疫球蛋白可 变区。更有利的是，每个免疫球蛋白都可变区可以是轻链可变区(VL) 或重链可变区VH。在本发明的第二格局中，免疫球蛋白结构域当存 在于本发明配体中时，是非互补的，也就是说，它们不结合形成VH/VL 抗原结合位点。因此，本发明第二格局中定义的多特异性配体包含 相同亚型的免疫球蛋白结构域，它可以是轻链可变区(VL)或重链可变 区(VH)。此外，当本发明的配体呈闭合构象时，免疫球蛋白结构域可 以是骆驼科动物VHH型。

在一个替代实施方案中，本发明的配体不包含骆驼科动物VHH 区。更具体地讲，与人VH区相比，本发明的配体不含对骆驼科动物 VHH区具有特异性的一个或多个氨基酸残基。

最好单可变区来自抗体，所述抗体是通过针对不同抗原或表位 的结合活性而选择出来的。例如，可以通过人免疫，至少部分分离 可变区。替代方法是本领域已知的，包括从人类抗体文库中分离和 人工抗体基因的合成。

可变区最好结合超抗原，例如蛋白A或蛋白L。与超抗原的结 合是正确折叠的抗体可变区的特性，允许这样的结构域从例如重组 或突变区的文库中分离出来。

表位结合域也可以基于并非免疫球蛋白结构域的蛋白质支架或 骨架。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以 产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US 5,831,012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合 适方法的细节参见WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白 和CTLA4(参见van den Beuken等，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601) 以及例如描述于WO0069907(Medical Research Council)的支架，所述 支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它多肽陪伴分子。

蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支 架上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成多价配体。 同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。

在一个实施方案中，多特异性配体包含表位结合域，它包含结 合本文所述的TNFR1的免疫球蛋白单域(dAb)的CDR，所述CDR移 植到合适的蛋白质支架或骨架上。

本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的闭合构象多特 异性配体的表位结合域，可以在相同多肽链上或者在不同多肽链上。 就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、最好是柔性接 头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知的任何 其它方法而连接。

第一和第二表位结合域可以共价或非共价结合。在结构域是共 价结合的情况下，可以通过例如二硫键介导结合。

在本发明的第二格局的某些实施方案中，表位可以彼此替代而 结合。例如，第一表位可以存在于抗原上，在所述抗原与其关联第 一结合域结合时，引起第二结合域的位阻或其构象变化，从而替代 了与第二结合域结合的表位。

最好结合下降达25％以上、最好是40％、50％、60％、70％、80％、 90％以上、优选高达100％或接近100％，使得结合完全被抑制。可 以通过常规抗原结合测定(例如ELISA)、基于荧光的技术(包括FRET) 或通过例如测定分子量的表面等离子共振等技术来测定表位的结 合。

此外，本发明提供闭合构象多特异性配体，所述配体包含具有 第一表位结合特异性的第一表位结合域以及具有第二表位结合特异 性的非互补的第二表位结合域，其中第一和第二结合特异性竞争表 位结合，使得闭合构象多特异性配体不同时结合这两个表位。

本发明的闭合构象多特异性配体不包含WO 02/02773所述的配 体。因此，本发明的配体不包含互补VH/VL对，其协同结合任何一个 或多个抗原或表位。相反，本发明的配体优选包含非互补的VH-VH 或VL-VL对。最好各VH-VH或VL-VL对中的各VH区或VL区具有不同 表位结合特异性，而且表位结合位点是这样排列的：使得在一个位 点上的表位结合与另一位点上的表位的结合发生竞争。

最好闭合构象多特异性配体可包含能够结合靶分子的第一区和 能够结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区。例如，分子或基 团可以是膨胀剂(bulky agent)，例如HSA或细胞基质蛋白。本文所用 的术语“延长配体半衰期的分子或基团”是指这样的分子或化学基 团：当给予动物时，相对于不结合分子或基团的配体来说，当所述 分子或化学基团结合本文所述的双特异性配体时，它们延长所述双 特异性配体的体内半衰期。延长配体半衰期的分子或基团的实例描 述如下。在一个优选的实施方案中，仅在半衰期延长分子或基团被 置换时，闭合构象多特异性配体能够结合靶分子。因此，例如，闭 合构象多特异性配体可以通过大体积的分子(例如HSA)而在患者血液 循环中得以保持。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体的结合 域之间的竞争导致HAS的替代和靶的结合。

在本发明第二格局的一个优选的实施方案中，表位结合域是免 疫球蛋白可变区并选自单域V基因库。通常，单域抗体库都展示在 丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施方案中，通过噬菌体库与抗 原的结合，来选择各单域抗体。在本发明的第二格局的一个优选的 实施方案中，表位结合域是免疫球蛋白可变区并选自单域V基因库。 通常，单域抗体库都展示在丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施 方案中，通过噬菌体库与抗原的结合，来选择各单域抗体。

一方面，多特异性配体包含至少两个非互补可变区。例如，配 体可包含一对VH区或一对VL区。最好这些结构域并非骆驼科动物 来源；优选它们是人结构域或者包含人构架区(FW)和一个或多个异 源CDR。CDR和构架区是免疫球蛋白可变区的结构域，正如Kabat 的Sequences of Protein of Immunological Interest数据库所定义的。

优选的人构架区是种系基因区段DP47和DPK9所编码的结构 域。最好VH区或VL区的FW1、FW2和FW3具有来自DP47或DPK9 的FW1、FW2或FW3序列。人构架可任选含有突变，例如在本发 明配体所用的人构架中共同含有最多约5个氨基酸变化或至多约10 个氨基酸变化。

根据本发明的第二格局，多特异性配体中的可变区可排列成开 放或闭合构象；也就是说，它们可以这样排列：使得可变区可独立 和同时结合其关联配体，或者使得仅一个可变区可在任何时候结合 其关联配体。

本发明人知道，在某些结构条件下，非互补的可变区(例如两个 轻链可变区或两个重链可变区)可以存在于配体中，使得第一表位与 第一可变区的结合抑制第二表位与第二可变区的结合，甚至这样的 非互补区不作为关联对一起作用。

最好配体包含两对或更多对可变区；也就是说，它包含至少4 个可变区。最好这4个可变区都包含人源构架。

在一个优选的实施方案中，人构架和人种系序列的构架相同。

本发明人认为，这样的抗体可特别用于配体结合测定，用于治 疗用途和其它用途。

在本发明的第二格局的一个实施方案中，可变区来自针对第一 和/或第二抗原或表位的抗体。在一个优选的实施方案中，可变区来 自抗体单可变区库。在一个实例中，库是在动物或合成库中不会产 生的库。在另一实例中，单可变区没有通过动物免疫而分离(至少部 分)。因此，单域可以从天然文库中分离出来。

另一方面，本发明的第二格局提供多特异性配体，它包含具有 第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性 的非互补第二表位结合域。第一和第二结合特异性可以相同或不同。

另一方面，本发明提供闭合构象多特异性配体，它包含具有第 一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的 非互补第二表位结合域，其中第一和第二结合特异性能够竞争表位 结合，使得闭合构象多特异性配体不能同时结合两个表位。

又一方面，本发明提供包含非互补结合域的开放构象配体，其 中所述结构域对同一靶标上的不同表位具有特异性。所述配体与靶 标的结合具有增加的亲合力。同样，本发明提供包含非互补结合域 的多价配体，所述结合域对相同表位具有特异性并针对包含所述表 位的多拷贝靶标，所述表位例如IL-5、PDGF-AA、PDGF-BB、TGFβ、 TGFβ2、TGFβ3和TNFeα，例如人TNF受体1和人TNFα。

在类似方面，本发明的配体可以低亲和力结合单个表位，使得 与单个表位的结合没有治疗意义；但是与两个表位结合而导致的亲 合力可提供治疗益处。在一个具体实例中，可以针对单独存在于正 常细胞类型中、但却一起存在于异常或患病细胞(例如肿瘤细胞)中的 表位。在这样的情况下，仅异常或患病细胞是本发明双特异性配体 的有效靶标。

对同一靶上多拷贝的相同表位或相邻表位具有特异性的配体(称 为螯合dAb)，也可以是三聚体或多聚体(四聚体或更高聚集体)的配 体，其包含3、4或更多个非互补结合域。例如，可以构建包含3或 4个VH区或VL区的配体。

此外，提供能结合多个亚单位靶标的配体，其中每个结合域对 所述靶标亚单位具有特异性。配体可以是二聚体、三聚体或多聚体。

优选本发明以上方面的多特异性配体是通过本发明第一方面的 方法而得到。

根据本发明第二格局的以上方面，最好第一表位结合域和第二 表位结合域是本文所述的非互补免疫球蛋白可变区。也就是说，可 以是VH-VH或VL-VL可变区。

具体地讲，可以按照本发明优选方面制备螯合dAb，即采用锚 定dAb，其中采用载体来构建二聚体、三聚体或多聚体dAb的文库， 所述载体包含接头序列上游或下游的恒定dAb，其具有插入到接头 另一侧的第二、第三和更多dAb的库。例如，锚定或导向dAb可以 是TAR1-5(Vκ)、TAR1-27(Vκ)、TAR2h-5(VH)或TAR2h-6(Vκ)。

在替代方法中，可以避免采用接头，例如通过使用结合域例如 VH和Vκ之间的非共价键或天然亲和力。因此，本发明提供制备螯合 多聚体配体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供载体，该载体包含编码对靶标上的第一表位具有特异性 的单结合域的核酸序列；

(b)提供载体，该载体编码包含对所述靶标上的第二表位具有特 异性的第二结合域的库，所述表位可以与第一表位相同或不同，所 述第二表位与所述第一表位相邻；和

(c)表达所述第一和第二结合域；和

(d)分离结合在一起的第一和第二结合域的组合，得到结合靶标 的二聚体。

第一和第二表位相邻，使得多聚体配体能同时结合这两个表位。 这提供了在结合时具有增加亲合力优势的配体。当表位相同时，可 通过靶标上存在的多拷贝表位，而得到增加的亲合力，允许同时结 合至少两个拷贝，以便亲和力效果增加。

结合域可通过若干方法并采用接头而结合。例如，结合域可包 含cys残基、抗生物素蛋白和链霉抗生物素基团或其它在合成后用于 非共价连接的方式；有效结合靶标的这些组合可以被分离出来。或 者，接头可存在于第一和第二结合域之间，它们可以作为一条多肽 从一个载体上表达，例如，如上所述，该多肽包含第一结合域、接 头和第二结合域库。

在一个优选的方面，当与抗原结合时，第一和第二结合域就天 然连接在一起；例如，VH区和Vκ区，当结合相邻表位时，以三种相 互作用方式天然连接，形成稳定二聚体。这样的连接蛋白在靶结合 测定中可以被分离出来。该方法的一个优势就是：只有以正确构象 结合紧相邻表位的结合域才可以连接，并可因其对靶标的亲合力增 加而分离。

在本发明的第二格局的以上方面的一个替代实施方案中，至少 一个表位结合域包含本文所述的非免疫球蛋白“蛋白质支架”或“蛋 白质骨架”。合适的非免疫球蛋白蛋白质支架包括但不限于选自以 下的任何以上列出的支架：SpA、纤连蛋白、GroEL和其它陪伴分子、 脂质运载蛋白、CCTLA4和亲和体。

按照本发明的第二格局的以上方面，最好表位结合域结合蛋白 质骨架。最好本发明的蛋白质骨架是免疫球蛋白骨架。

按照本发明，术语“免疫球蛋白骨架”是指如上所述的包含至 少一个免疫球蛋白折叠并起到一个或多个表位结合域核心作用的蛋 白质。

本文所述的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下 的骨架：至少包含以下部分的免疫球蛋白分子：(i)抗体的CL(κ或λ 亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区 的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫 球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。铰链区也 可包含在其中。这样的各区组合可以是例如例如模拟天然抗体，例 如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab′)2分子。本领 域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。

本文所述的骨架与表位结合域的连接可在多肽水平上得到，是 在编码骨架和/或表位结合域的核酸表达之后。或者，连接步骤可以 在核酸水平上进行。本发明的蛋白质骨架与一个或多个表位结合域 的连接方法包括采用蛋白质化学和/或分子生物学技术，这些技术是 本领域技术人员熟知的并在本文中有描述。

最好闭合构象多特异性配体可包含能够结合靶分子的第一区和 能够结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区。例如，分子或基 团可以是膨胀剂(bulky agent)，例如HSA或细胞基质蛋白。本文所用 的术语“延长配体半衰期的分子或基团”是指这样的分子或化学基 团：当给予动物时，相对于不结合分子或基团的配体来说，当所述 分子或化学基团结合本文所述的双特异性配体时，它们延长所述双 特异性配体的体内半衰期。延长配体半衰期的分子或基团描述如下。 在一个优选的实施方案中，仅在半衰期延长分子或基团替代时，闭 合构象多特异性配体能够结合靶分子。因此，例如，闭合构象多特 异性配体可以通过大体积的分子(例如HSA)而在患者血液循环中得以 保持。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体的结合域之间的竞 争导致HAS的替代和靶的结合。

在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供一种或多种核酸 分子，所述核酸至少编码本文所述的多特异性配体。在一个实施方 案中，所述配体是闭合构象配体。在另一个实施方案中，它是开放 构象配体。多特异性配体可以由一条核酸分子编码；或者，各表位 结合域可以由各自的核酸分子编码。当配体由一条核酸分子编码时， 各区可表达为融合多肽，或者可以分别表达，再随后连接在一起， 例如使用化学连接剂。各自的核酸所表达的配体可通过合适方法连 接在一起。

核酸还可编码信号序列，用于在表达后将多肽从宿主细胞中输 出，而且在表达后还可与丝状噬菌体颗粒的表面组分(或选择展示系 统的其它组分)融合。可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示的前 导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。

在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供包含本发明核酸 的载体。

再一方面，本发明提供用本发明载体转染的宿主细胞。

从这样的载体表达，可以例如在噬菌体颗粒表面产生表位结合 域，用于选择。这允许选择所展示的结构域，因此用本发明的方法 选择“多特异性配体”。

本发明还提供试剂盒，所述试剂盒至少包括本发明的多特异性 配体，所述配体可以是开放构象或闭合构象配体。本发明的试剂盒 可以是例如诊断试剂盒、治疗用试剂盒、化学或生物标本的检测试 剂盒等。

本发明提供制备多特异性配体的方法，该方法包括以下步骤：

a)选择能够结合第一表位的第一表位结合域，

b)选择能够结合第二表位的第二表位结合域，

c)连接表位结合域；和

d)选择能够结合所述第一第二表位和所述第二表位的闭合构象 多特异性配体。

在第二格局的另一方面，本发明提供制备闭合构象多特异性配 体的方法，所述配体包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合 域和具有第二表位结合特异性的非互补第二表位结合域，其中第一 和第二结合特异性竞争表位结合，使得闭合构象多特异性配体不同 时结合这两个表位；该方法包括以下步骤：

a)选择能够结合第一表位的第一表位结合域，

b)选择能够结合第二表位的第二表位结合域，

c)连接表位结合域，使得各结构域呈闭合构象；和

d)选择能够结合所述第一第二表位和所述第二表位、但不同时 结合所述第一和第二表位的闭合构象多特异性配体。

本发明的第二格局的以上方面的一个替代实施方案任选还包括 步骤(b1)，该步骤包括选择第三或更多表位结合域。这样，所产生的 多特异性配体(无论是开放还是闭合构象)包含不止两个表位结合特异 性。在本发明的第二格局的优选方面，当多特异性配体包含不止两 个表位结合域时，至少两个所述结构域呈闭合构象并竞争结合；其 它区可竞争结合或者可以独立于其关联表位而任意连接。

在本发明的第二格局中，优选第一和第二表位是不同的。它们 可以是天然存在或合成的多肽、蛋白质或核酸、或其部分。在该方 面，本发明的配体能结合表位或抗原并起到拮抗剂或激动剂(例如EPO 受体激动剂)的作用。在一个实施方案中，所述配体的表位结合域具 有相同表位特异性，并且可以例如同时结合其表位，当多拷贝的表 位存在于同一抗原上时。在另一个实施方案中，在不同抗原上提供 这些表位，使得配体能结合表位并连接抗原。本领域技术人员将会 理解，表位和抗原的选择是庞大的而不同的。它们可以是例如人或 动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的辅因子或DNA结合蛋白。 合适的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE、Apo-SAA、BDNF、 心肌营养蛋白-1、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因 子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、EpoR、FGF(酸性)、FGF(碱 性)、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化因子(CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、 IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、 IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、EP-10、角质形成细胞生长因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、米勒管(Mullerian) 抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC (67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、 MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、 MIP-3β、MIP-4、髓性祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神经营 养因子、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、抑瘤素M、PDGF-AA、 PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、 干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿 瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、 TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER 3、HER4、TACE识别位点、TNF BP-I和TNF BP-II、以及公开于 附录2或附录3的任何靶标，无论是以附录中列出的组合、不同组 合形式还是单独形式。细胞因子受体包含前述细胞因子的受体，例 如IL-1R1；IL-6R；IL-10R；IL-18R，以及附录2或附录3中列出的 细胞因子的受体以及附录2和附录3中公开的受体。可以理解，该 名单并非是详尽而无遗漏的。当多特异性配体结合两个表位(在相同 或不同抗原上)时，抗原可以从该名单中选出。在具体的实施方案中， 所述配体包含能结合TNFR1的dAb和能结合任一这样的抗原的第二 dAb或表位结合域。在这样的实施方案中，多特异性配体可包括免 疫球蛋白可变区的任何组合(例如VHVH、VHVL、VLVL)。

基于免疫球蛋白的多特异性配体的制备

本发明的双特异性配体，在本发明所需格局的构象上无论是开 放的还是闭合的，都可以按照用于抗体工程领域的先前建立的技术 来制备，用于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它改造的抗体分子。 抗体、尤其是双特异性抗体的制备技术例如参见以下综述及其中所 引用的参考文献：Winter和Milstein，(1991)Nature 349：293-299； Pluckthun(1992)Immunological Reviews 130：151-188；Wright等(1992) Crti.Rev.Immunol.，12：125-168；Holliger，P.和Winter，G.(1993)Curr. Op.Biotechn.，4，446-449；Carter等(1995)J.Hernatother.，4，463-470； Chester，K.A.和Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.，13，294-300； Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.，15，125-126；Fearon，D. (1997)Nature Biotechnol.，15，618-619；Plückthun，A.和Pack，P.(1997) Immunotechnology3，83-105；Carter，P.和Merchant，A.M.(1997)Curr. Opin.Biotechnol.，8，449-454；Holliger，P.和Winter，G.(1997)Cancer Immunol.Immunother.，45，128-130。

本发明提供用于针对两个不同抗原或表位的可变区选择和随后 的可变区组合。

可变区选择所用的技术采用的是本领域已知的文库和选择方 法。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J. Mol.Biol.，222：581；Vaughan等(1996)Nature Biotech.，14：309)是本领 域技术人员众所周知的。合成文库(Hoogenboom和Winter(1992)J. Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89： 4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13： 3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248：97)则是通常采用PCR、通 过克隆免疫球蛋白V基因而制备的。PCR过程中出现的错误可导致 高度随机化。可以分别针对靶抗原或表位选择VH和/或VL文库，在 这种情况下，直接选择或一起选择单域结合。

本发明双特异性配体的优选制备方法包括采用选择系统，其中 选择结合第一抗原或表位的可变区库，并选择结合第二抗原或表位 的可变区库。再将所选的第一和第二可变区结合在一起并选择结合 第一和第二抗原或表位的双特异性配体。选择单独、而非同时结合 第一和第二抗原或表位的闭合构象配体。

A.文库载体系统

各种选择系统是本领域已知的，适用于本发明。这些系统的实 例如下所述。

可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两 者先前都有描述(Huse等(1989)Science，246：1275；Caton和Koprowski (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，88：2432)并且用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选 多达106个不同文库成员，但是它们不适合筛选更大数量(大于106个 成员)。

文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使核酸连接 到它所表达的多肽上。本文所用的选择展示系统是允许通过单个文 库成员结合通用配体和/或靶配体的合适展示方法而选择的系统。

在大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬 菌体展示技术为代表。这种将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面 的系统(Scott和Smith(1990)Science，249：386)，已经证明可用于产生 抗体片段(及其编码它们的核苷酸序列)文库，用于体外选择和结合靶 抗原的特异性抗体片段的扩增(McCafferty等，WO 92/01047)。编码VH 区和VL区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，这样的 信号可指导它们到达大肠杆菌细胞的壁膜间隙，结果所得抗体片段 可展示在噬菌体表面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII) 融合。或者，抗体片段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬 菌体的展示系统的一个优点就是：因为它们是生物系统，所以可以 将含有所选文库成员的噬菌体在细菌细胞中进行培养，而简单扩增 所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列被噬菌 体或噬菌粒载体所包含，所以测序、表达和其后的遗传操作相对直 接。

噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法是本领域众 所周知的(McCafferty等(1990)Nature，348：552；Kang等(1991)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等(1991)Nature，352：624； Lowman等(1991)Biochemistry，30：10832；Burton等(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.， 19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling等(1991) Gene，104：147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同上； Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks等，1992，J.Biol. Chem.，267：16007；Lerner等(1992)Science，258：1313，所述文献通过 引用结合到本文中)。

一个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体-文库(Huston等， 1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary等(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty等(1990)，出处 同上；Clackson等(1991)Nature，352：624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.， 222：581；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks等(1992)J. Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施 方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见 WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)和 WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。

产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外 合成文库成员。在一个方法中，通过针对靶配体的多轮选择和PCR 扩增来选择RNA分子(Tuerk和Go1d(1990)Science，249：505；Ellington 和Szostak(1990)Nature，346：818)。一项类似技术可用于鉴定结合预 定人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.， 18：3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和 WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生 大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步 参见WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、 WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统例如 那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多 核糖体来展示多肽，用于选择。

还有一项技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与 其基因产物结合起来。例如，通过在油包水乳剂形成的微胶囊中选 择编码所需基因产物的核酸的选择系统，参见WO99/02671、 WO00/40712；Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652- 6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微胶囊中区室化， 然后在微胶囊内转录和/或翻译以产生它们相应的基因产物(RNA或 蛋白质)。随后再分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该 方法通过各种方法检测所需活性而选择目标基因产物。

B.文库构建

可以采用本领域已知技术，构建例如以上提出的文库用于选择， 或者从商业来源购买。可用于本发明的文库参见例如WO99/20749。 一旦选择载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸序列克隆到 文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子内产生多 样性；或者，可以在如上所述的诱变和多轮选择进行之前，表达并 选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化多肽的 核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR(Mullis和 Faloona(1987)Methods Enzymol，155：335，所述文献通过引用结合到 本文中)。PCR是本领域众所周知的，它是采用由热稳定的DNA依 赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，以扩增目标靶序列。各种 抗体文库的构建参见Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12，433-55 及其中引用的参考文献。

用模板DNA(至少1fg；更有用的为1-1000ng)和至少25pmol寡 核苷酸引物，进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好 采用较大量引物，因为各序列仅有少量引物库分子作为代表，而且 数量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括：2μl DNA、 25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶 (Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水加至总体积为25μl。覆盖矿 物油，进行PCR，用程序加热循环仪。PCR循环中各步骤的长度和 温度以及循环次数，按照结果所需的严格性来调整。退火温度和时 间由引物预计与模板退火的效率和可耐受的错配程度而定；显然， 当核酸分子同时扩增和诱变的话，错配是必需的，至少在合成的第 一轮。优化引物退火条件的严格性的能力是本领域普通技术人员的 知识范围之内。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始 变性通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循 环是由变性(94-99℃15秒至1分钟)、退火(按照上述温度；1-2分钟) 和延伸(72℃1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常 72℃4分钟，再接着是不确定(0-24小时)步骤，在4℃。

C.结合单可变区

本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种 方法连接，包括共价和非共价方法。

优选的方法包括采用如上所述的多肽接头，例如连接scFv分子 (Bird等(1988)Science 242；423-426)。有关合适接头的讨论参见Bird 等，Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol Methods 231 (1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85，5879-5883。 接头优选是柔性的，允许两个单域相互作用。一个接头的实例是(Gly4 Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。也可采用双链抗体 中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993)PNAS(USA)90：6444- 6448)。

在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。

可变区可采用不用接头的方法而结合。例如，可以开发二硫桥 的用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供 的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)Protem Eng.，7：697-704)或者通过可变区间界面的重构以改善“适合性(fit)”， 因而稳定相互作用(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu等 (1997)Protein Science 6：781-788)。

如果适当的话，可以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、 尤其是抗体VH区的其它技术。

根据本发明，双特异性配体在溶液中可以呈“闭合”构象。“闭 合”构型是指：其中两个区(例如VH和VL)以连接形式存在，例如连 接的VH-VL对形成抗体结合位点。例如，scFv可以呈闭合构象，这 取决于用于连接VH区和VL区的接头的排列。如果它具有足够柔性 让这两区连接，或者刚性地将它们保持在连接位置上，则这两区可 能采取闭合构象。

同样，VH区对和VL区对可存在闭合构象。通常，这将随配体分 子中的两区通过例如刚性接头紧密连接而变。闭合构象中的配体不 能同时结合延长配体的半衰期的分子和第二靶分子。因此，配体通 常只结合从延长配体半衰期的分子上解离下来的第二靶分子。

此外，无需接头的VH/VH、VL/VL或VH/VL二聚体的构建为两区 之间带来竞争。

而且，本发明的配体也可以呈开放构象。在这样的构象中，所 述配体能同时结合延长配体的半衰期的分子和第二靶分子。通常， 开放构型中的可变区(就VH-VL对而言)与以下结构域保持足够远的距 离：所述结构域不会相互作用而形成抗体结合位点、而且也不会竞 争性结合它们各自的表位。就VH/VH或VL/VL二聚体而言，这些结构 域并不通过刚性接头结合在一起。当然，这样的结构域配对也不竞 争抗原结合或形成抗体结合位点。

Fab片段和完整抗体将会主要以闭合构象存在，尽管可以理解， 开放和闭合双特异性配体在不同情况下可能以各种均衡存在。配体 与靶的结合可能会改变开放构型均衡的平衡。因此，本发明的某些 配体在溶液中可存在两种构象，其一(开放形式)可独立结合两个抗原 或表位，同时另一构象(闭合形式)仅能结合一个抗原或表位；因此， 在该构象中，抗原或表位竞争性结合配体。

尽管双特异性配体的开放形式因此在溶液中存在具有闭合形式 的均衡，但是考虑到均衡将有利于闭合形式；此外，开放形式可以 被靶向闭合构象的结合而掩蔽。因此，优选本发明的某些双特异性 配体存在两个(开放和闭合)构象间的平衡。

可以对本发明的双特异性配体进行修饰，以便有利于开放或闭 合构象。例如，VH-VL的相互关系因二硫键而稳定，从而稳定了闭合 构象。此外，可以构建用于结合各区(包括VH区和VL区对)的接头， 以有利于开放形式；例如，接头可在空间上阻碍各区的结合，例如 通过在合适位置上结合大的氨基酸残基，或者设计能物理性分离各 区的合适的刚性结构。

D.双特异性配体的表征

双特异性配体与其特异性抗原或表位的结合可以用本领域技术 人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。在本发明的一个优选 的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定结合。

可以按照任何合适方法，进行噬菌体ELISA：示例性方案如下。

可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结 合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA 筛选来自单个受感染细菌菌落的这些群体的噬菌体，以鉴定“单克 隆”噬菌体抗体。最好也筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段， 这也可通过ELISA、采用针对C-端或N-端标记等试剂来进行(参见 例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的 参考文献。

可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim 等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776) 或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。

E.双特异性配体的结构

如上所述，在本文中，抗体定义为抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgA、 IgE)或其片段(Fab、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双链抗体)，它包 含至少一个重链和轻链可变区、至少两个重链可变区或至少两个轻 链可变区。它可以至少部分来源于任何物种天然产生的抗体，或通 过重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样品中分离的：血 清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。

在本发明的一个优选实施方案中，双特异性配体包含抗体的至 少一个单重链可变区和抗体的一个单轻链可变区、或两个单重链可 变区或轻链可变区。例如，配体可包含一对VH/VL、一对VH区或一 对VL区。

所述配体的第一和第二可变区可以在同一多肽链上。或者它们 可在不同多肽链上。就它们在同一多肽链上而言，它们可以通过接 头而连接，所述接头优选为如上所述的肽序列。

第一和第二可变区可以共价或非共价结合。在它们是共价结合 的情况下，共价键可以是二硫键。

在采用例如本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出可变 区的情况下，这些可变区可包含通用构架区，使得它们可以被本文 所述的特异性通用配体所识别。有关通用构架、通用配体等的用途 参见WO 99/20749。

当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环 内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以 便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的， 参见例如Stemmer，Nature 370：389-391(1994)和美国专利第6,297,053 号，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法是本领域技 术人员众所周知的。

在本发明的一个优选实施方案中，“双特异性配体”是单链Fv 片段。在本发明的一个替代实施方案中，“双特异性配体”由Fab 形式组成。

另一方面，本发明提供核酸分子，所述核酸至少编码本文所述 的“双特异性配体”。

本领域技术人员应该理解，根据本发明该方面，抗原或表位可 同时结合同一抗体分子。或者，它们可以竞争性结合同一抗体分子。 例如，当两个表位同时结合时，双特异性配体的两个可变区能独立 结合它们的靶表位。当这些结构域竞争时，一个可变区能结合其靶 标，但是不在其它可变区结合其关联靶标的同时；或者第一可变区 能结合其靶标，但不在第二可变区结合其关联靶标的同时。

可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。或者，它们可来自单 域抗体库，例如在丝状噬菌体表面表达的那些。可以如下所述进行 选择。

一般而言，可以按照例如以下标准实验室手册的方法，构建并 操作实现本发明所需的核酸分子和载体构建体：Sambrook等(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA。

本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。

因此，另一方面，本发明提供载体，所述载体包含至少编码本 文所述的“双特异性配体”的核酸。

本文所用的载体是指这样的分离的元件：所述元件用于将异源 DNA引入细胞，用于表达和/或复制异源DNA。所述载体的选择或 构建以及随后的使用方法是本领域技术人员众所周知的。大量载体 是公众可得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。 这类载体可用于简单克隆和诱变；或者采用基因表达载体。可以选 择本发明所用的载体，以适应所需大小的多肽编码序列，长度通常 为0.25千碱基对(kb)至40kb或更大。体外克隆操作后，用载体转化 合适的宿主细胞。各载体含有不同的功能性组件，通常包括克隆(或 “多接头”)位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的 载体是表达载体，它还可具有一个或多个以下元件：增强子元件、 启动子、转录终止和信号序列，每个都位于克隆位点附近，使得它 们与编码本发明配体的基因有效连接。

克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主 细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立 于宿主染色体DNA而复制，并且还包含复制起点或自主复制序列。 这类序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322 的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合于酵母， 而各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆 载体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非 这些起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。

最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。 该基因编码转化宿主细胞在选择培养基中存活或生长所需的蛋白 质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培 养基中存活。典型的选择基因编码这样的蛋白质：所述蛋白质赋予 抗生素抗性(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)和其它毒 素抗性、补充生长培养基中所没有的营养缺陷或补充关键性营养物。

因为编码本发明配体的载体的复制是在大肠杆菌中常规进行 的，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性 的β-内酰胺酶基因。这些可以得自大肠杆菌质粒，例如pBR322或pUC 质粒，例如pUC18或pUC19。

表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与 目标编码序列操作性连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。 术语“操作性连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既 定方式起作用。控制序列与编码序列“操作性连接”是指连接方式 使得在控制序列相容的条件可进行编码序列的表达。

适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系 统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动 子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列操作性连接的 Shine-Delgarno序列。

优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达 载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单克隆的单独增殖和表 达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进 行选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可 以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导 序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大 肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链 DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的 (Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同 上)。简而言之，载体含有β-内酰胺酶基因(以便在噬菌粒上赋予选择 性)和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端→C端)： pelB前导序列(指导表达多肽到壁膜间隙)、多克隆位点(用于核苷酸 形式的克隆文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一 个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌 的不同抑制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D- 半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进 行复制，但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它 们中的一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。

编码本发明配体的载体的构建采用常规连接技术。分离的载体 或DNA片段被切割、剪裁并重新连接成产生所需载体的理想形式。 如有必要，可以用已知方式进行分析，证实所构建的载体中存在正 确序列。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细 胞、以及进行评价表达和功能的分析所用的合适方法，是本领域技 术人员已知的。通过常规方法，检测样品中存在的基因序列、或其 扩增和/或表达量，所述常规方法例如例如DNA印迹分析或RNA印 迹分析、蛋白质印迹、DNA、RNA或蛋白质斑点印迹、原位杂交、 免疫细胞化学或者核酸或蛋白质分子的测序分析。如有必要，本领 域技术人员会容易地知道如何改进这些方法。

闭合构象多特异性配体的结构

根据本发明第二格局的一方面，将两个或更多个非互补表位结 合域连接在一起，使它们呈现本文所述的闭合构象。最好除了本文 所述的接头之外，它们还可以连接骨架，以便形成和/或维持表位结 合位点彼此的闭合构象。

(I)骨架

骨架可以基于免疫球蛋白分子或者可以是如上所述来源的非免 疫球蛋白。本文所述的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选 自以下的骨架：至少包含以下部分的免疫球蛋白分子：(i)抗体的CL(κ 或λ亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2 区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免 疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以 包含铰链区域。这样的各区组合可以是例如例如模拟天然抗体，例 如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab′)2分子。本领 域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。

(II)蛋白质支架

各表位结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结 构域与一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合 域包含3个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架：基 于免疫球蛋白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的 支架、基于CTLA4的支架、基于陪伴分子例如GroEL的支架、基于 脂质运载蛋白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领 域技术人员可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。

F：用于构建双特异性配体的支架

i.主链构象的选择

免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽 管抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体结构 表明，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、 L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J. Mol.Biol.，196：901；Chothia等(1989)Nature，342：877)。因此，对环 长度和关键残基进行分析，能够预测在大多数人抗体中存在的H1、 H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227：799； Tomlinson等(1995)EMBO J.，14：4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.， 264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D 区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环 及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否，或残基种类 (Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai等(1996)FEBS Letters， 399：1)。

本发明的双特异性配体最好从结构域文库中装配，例如VH区文 库和/或VL区文库。此外，本发明的双特异性配体本身可以以文库形 式提供。在本发明的一方面，设计双特异性配体和/或结构域文库， 其中可以选择出某些环长度和关键残基，以保证各成员的主链构象 是已知的。如上所述，最好这些是天然存在的免疫球蛋白超家族分 子的真实构象，以将它们是非功能性的机会降至最低。种系V基因 区段起到一个合适的基本构架的作用，用于构建抗体或T细胞受体 文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使得少量功能性 成员具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功能。

正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目， 以预测基于主链构象的配体序列并选择用于多样化的残基，同时又 不影响正则结构。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结 构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用 4或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在 Vκ区，不同正则结构可组合产生大量的不同主链构象。假定Vλ区为 L1、L2和L3环编码各种不同正则结构，Vκ区和Vλ区可与任何VH 区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察 到的正则结构的组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的 产生对产生各种结合特异性来说是必不可少的。然而，通过构建基 于抗体文库的一种已知主链构象，已经发现，与预期相反，主链构 象的多样性并非产生足够的针对几乎所有抗原的多样性所必需的。 甚至更令人吃惊的是，一种主链构象不一定是共有结构-一种天然 存在的构象可以用作整个文库的基础。因此，在优选的方面，本发 明的双特异性配体具有一种已知主链构象。

所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子 中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用该构象时，该构象 是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构 域的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环 的主链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，就可 选择最接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选 种系基因区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区 段在自然界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最 频繁表达的。

在设计双特异性配体或其文库过程中，可以单独考虑6个抗原 结合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2 和L3，选择被20％和100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构 象。通常，所观察到的它的发生率35％以上(即介于35％和100％之 间)、更理想的是50％以上或甚至65％以上。因为绝大多数H3环没 有正则结构，所以优先选择在可展示正则结构的环中常见的主链构 象。因此，对于每个环来说，选择天然库中最常见的构象。在人抗 体中，各环最常见的正则结构(CS)如下：H1-CS 1(79％表达库)、H2- CS 3(46％)、Vκ的L1-CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、Vκ的L3-CS 1(36％) (计算假定κ∶λ的比例为70∶30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.，48：133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基 94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991) Sequences of Proteins of immunological interest，美国健康和人类服务 部)看来是最常见的。EMBL数据文库中有至少16个人类抗体序列具 有所需H3长度和关键残基，构成该构象，并且在蛋白质数据库中至 少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和1tet)。最常表达的 种系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、 Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合 适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构 象的文库的基础。

或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率 来选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选 择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、 5或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选 所选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中所观 察到的最常见的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2 和L3五个抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合， 然后结合最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。

ii.正则序列的多样化

如果具有所选几种已知的主链构象、或者优选单一已知主链构 象，可以通过改变分子的结合位点，构建本发明的双特异性配体或 本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能性多样性的库。这 表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的多样 性，使得它们能够提供各种活性。

所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产 生的。可以随机或优选选择所改变的位置。然后，可以通过以下方 式达到变异：通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物 (天然或合成的)所取代)，产生非常大数量的变异体；或者通过用一 个或多个氨基酸的限定亚类来取代残余氨基酸，产生更数目有限的 变异体。

已经报道了各种方法，用于引入这样的多样性。易错PCR (Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226：889)、化学诱变(Deng等(1994)J. Biol.Chem.，269：9533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260： 359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变 的方法也是本领域众所周知的，它包括使用错配寡核苷酸或简并寡 核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变， 已经产生了一些合成抗体文库。使人破伤风类毒素结合Fab的H3区 随机化，以便产生各种新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，89：4457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种 系V基因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和 Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，89：4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths等 (1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。这 样的多样化可以延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等 (1996)Nature Med.，2：100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13： 475；Morphosys，WO97/08320，出处同上)。

因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而 对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通 过使用现有的转化技术或使用无细胞系统来产生代表所有可能组合 的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6×1010 个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths 等(1994)，出处同上)。

在一个优选的实施方案中，只有直接参与产生或修饰分子所需 功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，功能是结合靶标， 因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避免改变那些对分子总 体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。

正则序列的多样化，当它用于抗体区时

就抗体双特异性配体而言，靶结合位点是最常见的抗原结合位 点。因此，在高度优选的方面，本发明提供抗体双特异性配体的文 库或用于装配它们的文库，其中只有在抗原结合位点的残基才改变。 在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率抗体/ 抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗体 中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法已 经改变了相应互补决定区(CDR1)中的所有残基(定义参见Kabat等， 1991，出处同上)、本发明所用的文库中多样化的两个相比的某七个 残基。这显示了产生各种抗原结合特异性所需的功能多样性的显著 改善。

在自然界，抗体多样性是两个过程的结果：种系V、D和J基 因区段的体细胞重组，产生首次用于实验(naive)初级库(所谓的种系 和连接多样性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。对人类抗体序 列进行分析表明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心， 而体细胞高变则将多样性扩散到抗原结合位点周围区，而这些区在 初级库中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256： 813)。这一互补性可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽 管显然是抗体所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变 的残基是构成靶的结合位点的残基的亚类。如有必要，在选择期间 的不同时期，可以改变靶结合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。

就抗体库而言，产生起始“幼稚”库(initial“naive”repertoire)， 其中改变抗原结合位点的某些、而不是全部的残基。在这种情况下， 本文所用的术语“幼稚(naive)”是指没有预定靶标的抗体分子。这些 分子类似于没有经历免疫多样化的个体(例如在胎儿和新生儿个体的 情况下)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统 尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对各种抗原或表位来选 择该库。如有必要，还可在起始库改变的结构域之外引入更多多样 性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。

本发明提供两个不同的幼稚结合域库，用于构建双特异性配体 或双特异性配体的幼稚文库，其中改变了抗原结合位点中的某些或 所有残基。“初级”文库模拟天然初级库，其多样性限制在抗原结 合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具有多样性(种系多样 性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样性)。这些多样化的 残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、 H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在“体 细胞”文库中，多样性局限于重组过程中改变的残基(连接多样性)或 者是高度体细胞突变的)。这些多样化的残基包括但不限于H31、H33、 H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知 让适于这些文库多样性的以上列出的所有残基接触一个或多个抗体- 抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位点中并非所有残基 都改变，在选择中，通过改变剩余残基而结合另外的多样性，如果 需要这样的话。本领域技术人员显而易见的是，任何这些残基(或者 包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以用于抗原结合位点 的起始和/或后来的多样化。

在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸 水平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能 的氨基酸(所有20种或其亚类)可以结合在该位置。采用IUPAC命名 法，最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密 码子。NNK密码子优选用于引入所需多样性。也可以使用达到相同 末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生额外的终 止密码子TGA和TAA。

人抗体抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸残 基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置的 氨基酸组成的话，超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它 们是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙 氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种倾向于可提供主链柔 性的亲水性残基和小残基的偏倚，可能反应了表面进化，该进化倾 向于结合各种抗原或表位，并且有助于解释初级库中抗体的所需混 杂。

因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨 基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许 针对各种靶抗原来选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的 偏倚，易于用于任何多肽库。有各种方法，用于在有待改变的位置 上使氨基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见 WO97/08320)，其中优选的方法，由于容易合成，是采用常规简并密 码子。通过比较由简并密码子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各 位置上具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸的使用， 可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、 (AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，也就是说，分别用IUPAC命名 法命名的DVT、DVC和DVY-就是最接近所需氨基酸分布型的密 码子：它们编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙 氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的文库是在各多 样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。

G：能够延长配体半衰期的抗原

本发明的双特异性配体(呈现它的一个格局)能够结合一个或多个 在体内延长配体半衰期的分子。通常，这类分子是体内天然存在的 多肽，它抵抗通过内源机制所致的降解和/或清除，所述机制能够从 生物体中除去不想要的物质。例如，可从以下物质中选出延长生物 体半衰期的分子：

来自胞外基质的蛋白质；例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和 纤连蛋白。胶原是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知道约15种胶 原分子，在身体的不同部位发现，例如I型胶原(占身体总胶原的90％) 在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现，而II型胶原在软骨、 椎间盘(invertebral disc)、脊索、眼睛的玻璃体中发现。

血液中发现的蛋白质，包括：

血浆蛋白，例如血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋 白原A、血纤蛋白原B、血清淀粉样蛋白A、珠蛋白、抑制蛋白、泛 蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白；

酶和抑制剂，例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂。血纤蛋白溶解 酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性前体。它通常在血 流循环中存在。当血纤蛋白溶解酶原活化时，就转化成纤溶酶，它 打开强效酶促区，溶解血凝块中缠住血细胞的血纤蛋白原纤维。这 称为血纤蛋白溶解。

免疫系统蛋白质，例如IgE、IgG、IgM。

转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白。

防卫素，例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、2和3。

血脑屏障或神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素受体、髓 磷脂、抗坏血酸转运蛋白。

转铁蛋白受体特异性配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融 合蛋白(参见US5977307)；

脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、胰岛素、 胰岛素样生长因子1(IGF1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体、 胰岛素受体。

局限于肾脏中的蛋白质，例如多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离 子转运蛋白K1、Heymann抗原。

局限于肝脏中的蛋白质，例如醇脱氢酶、G250。

血液凝固X因子

α1抗胰蛋白酶

HNF1α

局限于肺部的蛋白质，例如分泌成分(结合IgA)。

局限于心脏中的蛋白质，例如HSP27。它与扩张型心肌病相关。

局限于皮肤的蛋白质，例如角蛋白。

骨特异性蛋白，例如骨形态发生蛋白质(BMP)，它们是表现出成 骨活性(osteogenic activity)的转化生长因子β超家族亚类。实例包括 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(也称为成骨蛋白(OP-1) 和成骨蛋白-8(OP-2)。

肿瘤特异性蛋白，包括人滋养层抗原、herceptin受体、雌激素 受体、组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)。

疾病特异性蛋白，例如仅在活化T细胞上表达的抗原：包括

LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体 (OPGL)，参见Nature 402，304-309；1999，OX40(TNF受体家族成员， 在活化T细胞上表达，已知只有共刺激T细胞分子在人T细胞白血 病病毒I型(HTLV-I)产生细胞中被特异性上调)。参见J.Immunol.2000 年7月1日；165(1)：263-70；金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括 CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH； 血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成 纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VE- GF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管 生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因 子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍生 生长因子-BB(PDGF)、CXXXC趋化因子。

应激蛋白(热激蛋白)

HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已经 死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅当作为创 伤、疾病或损伤的结果时才发生，因此，在体内，胞外HSP触发免 疫系统对抗感染和疾病的反应。结合胞外HSP的双特异性蛋白可以 局限于疾病部位。

参与Fc转运的蛋白质

Brambell受体(也称为FcRB)

该Fc受体具有两个功能，这两者可潜在用于递送。

其功能是

跨越胎盘将IgG从母亲转运给孩子

保护IgG免遭降解，因而延长IgG的血清半衰期。

认为受体从核内体中再循环IgG。

参见Holliger等，Nat Biotechnol 1997年7月；15(7)：632-6。

可以设计本发明的配体，使它对以上靶标具有特异性，而不需 要延长体内半衰期。例如，本发明的配体可以对选自前述的组织特 异性靶标具有特异性，因此使结合组织特异性治疗相关靶标的双特 异性配体或dAb单体具有组织特异性，无论半衰期怎么延长，尽管 这可导致半衰期的延长。此外，当配体或dAb单体靶向肾脏或肝脏 时，这可使配体或dAb单体改变体内替代清除途径(例如，配体可从 肝脏清除改为肾脏清除)。

H：本发明第二格局的多特异性配体的用途

本发明第二格局的多特异性配体可用于体内治疗和预防用途、 体外和体内诊断用途、体外测定和试剂用途等。例如，按照本领域 技术人员已知的方法，抗体分子可用于基于抗体的测定技术，例如 ELISA技术。

如上所述，本发明的多特异性配体可用于诊断、预防和治疗方 法。本发明的多特异性抗体在诊断中可用于蛋白质印迹分析和通过 标准免疫组织化学方法进行的原位蛋白质检测；对于这些用途而言， 可以采用本领域已知技术，对配体进行标记。另外，这类抗体多肽 可制备性地用于亲和色谱方法，当与色谱支持物例如树脂结合时。 所有这些方法都是本领域技术人员众所周知的。

本发明的闭合构象多特异性配体的诊断应用包括均质测定，用 于测定这样的分析物：所述分析物能利用闭合构象多特异性配体与 两个靶标竞争性结合的能力，使得两个靶标不能同时结合(闭合构 象)，或者它们能够同时结合两个靶标(开放构象)。

在本发明第二格局的又一方面，本发明提供均质免疫测定，采 用本发明的配体。

诊断试剂和研究测定系统制造商一直在热切寻找真正的均质免 疫测定形式，用于药物发现和开发。主要的诊断试剂市场包括在医 院、医生办公室和诊所、商业参考实验室、血库和家庭中进行的人 体检测，非人体诊断(例如食品检验、水质化验、环境监测、生物防 制(bio-defence)和兽医检查)，以及最终研究(包括药物开发；基础研 究和学术研究)。

目前，所有这些市场都采用免疫测定系统，这些都是围绕化学 发光、ELISA、荧光或(在很少的情况下)放免测定技术而建立起来的。 这些测定形式的每一种都需要分离步骤(将结合物与未结合物分开)。 在某些情况下，需要几个分离步骤。添加这些附加步骤增加了试剂 和自动化仪器、花费时间并且影响最终的测定结果。在人体诊断中， 分离步骤可以是自动化的，这掩盖了问题、但并未消除问题。机器 人技术、额外的试剂、额外的孵育时间等等都增加了相当大的成本 和复杂性。在药物开发例如高通量筛选中，当同时检测数百万份样 品且待测分子水平非常低时，增加额外的分离步骤可消除进行筛选 的能力。然而，避免分离则在读出时产生太多噪声。因此，需要真 正的均质形式，所述形式在现有检测形式所得范围内提供灵敏度。 最好测定具有完整定量读出，并具有高灵敏度和大的动态范围。灵 敏度是重要要求，因为降低了所需样品数量。这些特征都是均质系 统提供的。在样品非常珍贵的医学检验(care testing)和药物开发中， 这一点非常重要。本领域目前采用的异质系统需要大量样品和昂贵 试剂。

均质测定的应用包括癌症检查，其中最大的测定是前列腺特异 性抗原，用于筛选男人的前列腺癌。其它应用包括生育检查，它为 想怀孕的妇女提供一系列检查，包括α-hcg，用于妊娠。感染性疾病 的检测，包括肝炎、HIV、风疹和其它病毒和微生物和性传播疾病。 检测可用于血库，特别是检测HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝 炎、非甲非乙型肝炎。治疗药物监控试验包括监控处方药在患者体 内的水平，以便达到功效和避免毒性，例如地高辛对心律失常的功 效、以及精神病患者体内的苯巴比妥水平；茶碱对哮喘的功效。诊 断测定还可用于药物滥用测定，例如测定可卡因、大麻等。代谢测 定用于测定甲状腺功能、贫血和其它生理性障碍和功能。

均质免疫测定形式还用于标准临床化学测定的制造。免疫测定 和化学测定都在同一仪器上进行，对诊断测定是非常有利的。合适 的化学测定包括葡萄糖、胆固醇、钾等测定。

均质免疫测定的另一个主要用途就是药物发现和开发：高通量 筛选包括以超大体积、针对靶标测定组合化学文库。检测信号，再 将阳性组分为更小的组，最终在细胞中、继而在动物体内进行测定。 均质测定可用于所有这些类型的测定。在药物开发、尤其是动物研 究和临床试验中，大量采用免疫测定。均质测定极大地促进和简化 了这些方法。其它应用还包括食品饮料检测：检测肉类和其它食品 中的大肠杆菌、沙门氏菌(salmonella)等；水质化验，包括在水厂检 测所有类型的污染物，包括大肠杆菌；和兽医检验。

在一个广泛的实施方案中，本发明提供包含检测试剂的结合测 定，所述试剂结合本发明的闭合构象多特异性配体，其检测特性因 分析物与所述闭合构象多特异性配体的结合而改变。这样的测定可 以几种不同方式进行，每种方式采用闭合构象多特异性配体的以上 特性。

测定依赖于试剂直接或间接地被分析物取代，导致试剂的检测 特性发生变化。例如，当试剂是能够催化反应(所述反应具有可检测 终点)的酶，而配体可以结合所述酶，以阻碍例如其活性部位，从而 使酶失活。闭合构象多特异性配体也可以结合分析物，以取代酶， 通过释放活性部位而使它活化。然后，酶与底物反应，引起可检测 事件。在一个替代实施方案中，所述配体可在活性部位之外与酶结 合，影响酶的构象，因而改变其活性。例如，活性部位的结构可因 结合配体而受到限制，或者可以阻止活性所必需的辅因子的结合。

测定的实际操作可以采用本领域任何已知形式。例如，可以在 测试条上提供闭合构象多特异性配体/酶复合物；可以在测试条的不 同区提供底物，并提供含有分析物的溶剂，允许分析物通过配体/酶 复合物而迁移，取代酶，并携带它到达底物区，产生信号。或者， 可在测试棒或其它固相上提供配体/酶复合物，再浸泡到分析物/底物 溶液中，使酶释放到溶液中，以响应存在的分析物。

因为每个分析物分子潜在释放一个酶分子，所以测定是定量的， 在给定时间内产生的其信号强度依赖于溶液中分析物浓度。

采用闭合构象的分析物的其它格局也是可能的。例如，闭合构 象多特异性配体可以在变构位点结合酶，由此活化酶。在这样的实 施方案中，在分析物不存在时，酶是有活性的。加入分析物取代酶， 去除变构激活作用，从而使酶失活。

就使用酶活性作为分析物浓度的度量的以上实施方案而论，酶 的活化或失活是指酶活性的增加或降低，是以酶催化产生信号的反 应的能力而定。例如，酶可催化无法检测的底物转化成为其可检测 形式。例如，辣根过氧化物酶与显色底物或化学发光底物一起广泛 用于本领域，它们都是市售可得的。酶活性的增加或下降水平可以 介于10％和100％之间，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％或90％；在活性增加的情况下，增加可超过100％，即200％、 300％、500％以上，或者，如果抑制酶的基线活性无法检测的话，就 不能测定其增加百分比。

在另一格局，闭合构象多特异性配体能结合酶/底物对中的底物、 而不是酶。因此，底物不能利用酶，直到通过分析物结合而使酶从 闭合构象多特异性配体中释放出来。这一格局的实施与结合酶的格 局是一样的。

此外，可以使测定结合荧光分子，例如荧光素或别的荧光团， 其构象使得在结合配体后荧光被猝灭。在这种情况下，分析物与配 体的结合将取代荧光分子，从而产生信号。本发明所用的荧光分子 的替代物包括冷光试剂(例如萤光素/萤光素酶)和显色试剂(包括免疫 测定中常用的试剂，例如HRP)。

治疗和诊断组合物及其用途

本发明提供组合物以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断 方法，所述组合物包含本发明的TNFR1拮抗剂(例如配体)(例如双特 异性配体、多特异性配体、dAb单体)和药学上可接受的载体、稀释 剂或赋形剂。本发明方法的拮抗剂和配体(例如双特异性配体、多特 异性配体、dAb单体)可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。

本发明拮抗剂和配体(例如多特异性配体、双特异性配体、dAb 单体)的治疗和预防用途包括将本发明拮抗剂和/或配体给予哺乳动物 受体，例如人。双特异性和多特异性配体(例如双特异性抗体形式)以 高亲和力结合多聚体抗原。双特异性或多特异性配体可使两个抗原 交联，例如在募集的细胞毒T细胞中，从而介导肿瘤细胞系的杀伤。

优选将至少90-95％同质性(homogeneity)的基本纯化的配体或其 结合蛋白(例如dAb单体)给予哺乳动物，最优选98-99％以上同质性 供药用，尤其是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需同 质性时，配体可用于诊断或治疗(包括离体)或用于开发和实施测定方 法、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press，NY)。

例如，本发明的配体或其结合蛋白，例如dAb单体，通常可用 于预防、抑制或治疗炎性状态，包括急性及慢性炎性疾病。例如， 可以给予拮抗剂和/或配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病、变 应性超敏反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括 但不限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年 类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy) (例如关节强硬性脊椎炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如节段性 回肠炎(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎)、重症肌无力和Behcet氏综 合征)、银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。

能结合参与胞吞作用的胞外靶标(例如网格蛋白(Clathrin))的本发 明拮抗剂(例如配体)(例如双特异性配体、多特异性配体、dAb单体) 可以被胞吞，使它们能接近胞内靶标。此外，双特异性或多特异性 配体可提供这样的方法：通过该方法将特异性结合胞内靶标的结合 域(例如dAb单体)递送到胞内环境。该策略需要例如这样的双特异性 配体：其物理特性能让它在细胞内保留功能性。或者，如果最终目 的地的胞内区室是氧化态的，良好折叠的配体可能不需要游离二硫 化物。

在本发明的应用中，术语“预防”包括在疾病诱发之前给予保 护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后、而在临床上出现疾病 之前给予组合物。“治疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合 物。

最好双特异性或多特异性配体可用于针对在生物体内治疗环境 中协同作用的细胞因子和其它分子。因此，本发明提供协同能结合 细胞因子或其它分子的两个或更多个结合域(例如dAb)活性的方法， 该方法包括给予能够结合所述两个或更多个分子(例如细胞因子)的双 特异性或多特异性配体。在本发明的这一方面，双特异性或多特异 性配体可以是任何双特异性或多特异性配体，包括由互补和/或非互 补区组成的配体、开放构象的配体和闭合构象的配体。例如，本发 明的这一方面涉及VH区和VL区的组合、仅有VH区的组合和仅有VL 区的组合。

在治疗中可以多种方式达到协同。例如，仅当配体同时针对两 个靶标时，靶标组合才具有治疗活性，而仅针对一个靶标则没有疗 效。在另一个实施方案中，仅一个靶标可提供稍低或最小疗效，但 是与第二靶标一起的组合协同性地增加了疗效。优选在本发明这一 方面的双特异性或多特异性配体所结合的细胞因子选自附录2所示 的列表。

此外，双特异性或多特异性配体可用于肿瘤学用途，所述配体 的一个特异性是针对CD89(它是由细胞毒细胞表达的)，而其它特异 性则是肿瘤特异性的。所针对的肿瘤抗原的实例见附录3。

可以采用动物模型系统，用于在保护机体免遭疾病或治疗疾病 中筛选TNFR1拮抗剂(例如配体、抗体或其结合蛋白)的有效性。在 易感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight 等(1978)J.Exp.Med.，147：1653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.， 299：515)。在SJL/J雌性小鼠中，通过用来自另一物种的可溶性AchR 蛋白诱发疾病，检测重症肌无力(MG)(Lindstrom等(1988)Adv. Immunol.，42：233)。在易感的小鼠品系中，通过注射II型胶原诱发关 节炎(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42：233)。在易感大鼠中通过 注射分枝杆菌热激蛋白而诱发佐剂关节炎的模型已有描述(Van Eden 等(1988)Nature，331：171)。描述了通过给予甲状腺球蛋白，在小鼠 中诱发甲状腺(Maron等(1980)J.Exp.Med.，152：1115)。在某些品系 的小鼠中，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)可自然发生或者可以诱发产 生，所述小鼠例如Kanasawa等(1984)Diabetologia，27：113描述的那 些。小鼠和大鼠的EAE可作为模型，用于人类的MS。在该模型中， 脱髓鞘疾病可以通过给予髓磷脂碱性蛋白而诱发(参见Paterson(1986) Textbook of Immunopathology，Mischer等(主编)，Grune和Stratton，New York，第179-213页；McFarlin等(1973)Science，179：478；Satoh等 (1987)J.Immunol.，138：179)。

通常，纯化形式的本发明拮抗剂(例如配体)可与药理学上合适的 载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混 悬剂，任意包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、 林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸化林格液。可以从增稠剂中 选出合适的生理上可接受的辅料，如果需要在混悬剂中维持多肽复 合物的话，这些增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶 和藻酸盐。

静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于 林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生 物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延 长释放的制剂。

可以单独给予的组合物形式使用本发明的拮抗剂(例如配体)，或 者将其与其它药物联用。这些药物可包括各种免疫治疗药，例如环 孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可包含 各种细胞毒剂或其它药物以及本发明拮抗剂(例如配体)、或者甚至是 具有不同特异性的本发明配体(例如用不同靶抗原或表位所选择的配 体)的组合的“合剂”，无论它们是否在给药之前混合。

本发明药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员公知 的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来说，可以采用标准 技术，将本发明所选配体给予任何患者。可通过任何合适方式给予， 包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺部途径，或者 合适的是，通过导管直接输注。给药剂量和频次将取决于患者年龄、 性别和状况、同时给予的其它药物、对抗适应症(counterindication)和 临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如局部给 予肺部，通过肺部给药，例如鼻内给药)或系统给药。

可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。 已知该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知 的冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致 不同程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比 IgG抗体活性损失更高)，因此使用水平应调高以便进行补偿。

可以给予含有本发明拮抗剂(例如配体)或其合剂的组合物，用于 预防和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，达到至少部分抑制、遏 制、调节、杀伤或某些其它可检测参数的所选细胞群体的足够用量， 定义为“治疗有效量”。尽管达到该剂量所需的用量将取决于疾病 严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但是通常范围为每千克 体重0.005-5.0mg配体(例如抗体、受体(例如T细胞受体)或其结合蛋 白)，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂量。对于预防应用而言，也可 以类似或稍低剂量给予含有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、 抑制或延迟疾病发作(例如维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。 熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防 疾病。当给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防慢性炎 性疾病时，可以给予最多4次/天，每周两次，每周一次，每两周一 次，每月一次，每两月一次，其剂量例如为约10μg/kg至约80mg/kg、 约100μg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至 约70mg/kg、约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约 1mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约 20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg 至约5mg/kg、约10μg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约 3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、 约9mg/kg或约10mg/kg。在具体的实施方案中，给予TNFR1拮抗剂 (例如配体)以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病，每两周一次或每月一 次，剂量为约10μg/kg至约10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、 约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、 约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。

相对于治疗前所具有的所述症状、或者相对于未用所述组合物 或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)的所述症状而言，当一种 或多种症状减少(例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点) 时，就认为用本文所述的组合物进行的治疗是“有效”的。尽管症 状明显不同，取决于所针对的疾病或障碍，但是可以由普通有技术 的临床医生或技术人员进行测定。这些症状可以通过例如以下方法 来测定：通过监测疾病或障碍的一种或多种生化指标水平(例如疾病 相关的酶或代谢物水平，受累细胞数量等)、通过监测身体表现(例如 炎症、肿瘤大小等)、或者通过可接受的临床评价量表(例如扩大失能 状态量表(Expanded Disability Status Scale)(用于多发性硬化)、Irvine 炎性肠病问卷调查表(32点评价表，评价有关肠功能、全身症状、社 交功能和情感状态的生活质量-评分范围为32-224，评分越高表明 生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表、或本领域已知的其 它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例如一天以上，优 选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下降达一个点或 多个点，就表明是“有效”治疗。同样，相对于未经组合物治疗的 类似个体(人或动物模型)的所述症状而言，当一种或多种症状的发作 或严重程度被延迟、减少或消除时，用本文所述的组合物进行预防 就是“有效”的。

含有本发明的拮抗剂(例如配体)或其合剂的组合物可用于预防和 治疗装置，以帮助改变、钝化、杀伤或去除哺乳动物的所选靶细胞 群体。另外，本文所述的所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、 耗尽或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术， 将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体 或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回 输到哺乳动物体内。

含有本发明的拮抗剂(例如配体)的组合物可用于预防和治疗装 置，以帮助改变、钝化、杀伤或去除哺乳动物的所选靶细胞。

可以给予TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)和/或与一种或多 种其它治疗药或活性药一起配制。当TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb 单体)与其它治疗药一起给予时，TNFR1拮抗剂可以在给予其它药物 之前、同时或之后给予。通常，TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体) 和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。

在一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防慢性炎性疾病 的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮 抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防关节炎(例如类 风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、银屑 病性关节炎)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量 的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防银屑病的方 法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂 (例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防炎性肠病(例 如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)的方法，该方法包括给予有需要的 哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb 单体的配体)。

在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防慢性阻塞性 肺病(例如慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)的方法，该 方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包 含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防肺炎(例如细 菌性肺炎，例如葡萄球菌性肺炎)的方法，该方法包括给予有需要的 哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb 单体的配体)。

本发明提供治疗、抑制或预防除了慢性阻塞性肺病以外的其它 肺病和肺炎的方法。按照本发明可治疗、抑制或预防的其它肺病包 括例如囊性纤维化和哮喘(例如甾体抵抗型哮喘)。因此，在另一个实 施方案中，本发明是治疗、抑制或预防肺病(例如囊性纤维化、哮喘) 的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮 抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在具体的实施方案中，TNFR1拮抗剂是通过肺部给予，例如通 过吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)或通过系统给予 (例如胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。

在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防脓毒性休克 的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮 抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。

在本发明的第二格局的再一方面，本发明提供组合物，所述组 合物包含闭合构象多特异性配体和药学上可接受的载体、稀释剂或 赋形剂，所述配体是通过本发明的方法获得的。

此外，本发明提供用“闭合构象多特异性配体”或本发明的组 合物治疗疾病的方法。

在本发明的一个优选实施方案中，所述疾病是癌症或炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、哮喘或节段性回肠炎。

在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供诊断方法，包括 用本发明的闭合构象多特异性配体或组合物诊断疾病。因此，一般 而言，可以利用分析物与闭合构象多特异性配体的结合来替代某种 试剂(agent)，所述试剂在替代时导致信号产生。例如，分析物(第二 抗原)的结合可替代酶(第一抗原)结合抗体，提供了免疫测定的基础， 尤其是当酶通过其活性部位保持抗体时。

因此，本发明提供检测靶分子存在的方法，该方法包括：

(a)提供结合某种试剂的闭合构象多特异性配体，所述配体对靶 分子和该试剂具有特异性，其中与配体结合的试剂导致可检测信号 的产生，当替代配体时；

(b)将闭合构象多特异性配体暴露给靶分子；和

(c)检测试剂替代而产生的信号。

根据本发明的第二格局的以上方面，最好试剂是酶，当与闭合 构象多特异性配体结合时所述酶是无活性的。或者，试剂可以是选 自以下的任何一种或多种物质：酶的底物和荧光分子、发光分子或 显色分子，所述分子当与配体结合是无活性的或者被猝灭。

另外，本文所述的所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、 耗尽或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术， 将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体 或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回 输到哺乳动物体内。

实施例

下面的实施例进一步描述了本发明，这些实施例仅用于说明目 的。为了给dAb命名，本文所用的人TNFα称为TAR1，人TNFα受 体1(p55受体)称为TAR2。

实施例1.针对人血清白蛋白(HSA)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的双特异 性scFv抗体(K8)的选择

该实施例说明了制备针对β-gal和HAS的双特异性抗体的方法， 其中选择了与种系(dummy)VH区连接的Vκ可变区库用于结合β-gal， 并且选择了与种系(dummy)Vκ区连接的VH可变区库，用于结合 HAS。然后将所选的可变VH HSA和Vκ β-gal区结合在一起，选择 结合β-gal和HSA的抗体。HAS是人血中存在的半衰期延长蛋白。

本实验中使用了4个人类噬菌体抗体文库。

文库1：种系Vκ/DVT VH    8.46×107

文库2：种系Vκ/NNK VH    9.64×107

文库3：种系VH/DVT Vκ    1.47×108

文库4：种系VH/NNK Vκ    1.45×108

所有文库都基于VH(V3-23/DP47和JH4b)和Vκ(O12/O2/DPK9 和Jκ1)的单一人构架，其中侧链多样性结合到互补决定区(CDR2和 CDR3)中。

文库1和文库2含有dummy Vκ序列，而VH序列在位置H50、 H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97和H98(DVT 或NNK分别编码)上具有多样性(图1)。文库3和文库4含有dummy VH 序列，Vκ序列在位置L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96 (DVT 或NNK分别编码)上具有多样性(图1)。文库呈现噬菌粒pIT2/ScFv 形式(图2)并且已经预选出了所述文库对蛋白A和蛋白L通用配体的 结合性，使得非选择性文库中的大部分克隆都是功能性的。以上所 示的文库大小对应于预选后的大小。在针对抗原进行选择前，将文 库1和文库2混合，得到单一VH/dummy Vκ文库，将文库3和文库 4混合，形成单一Vκ/dummy VH文库。

对β-gal进行3轮选择，使用Vκ/Dummy VH文库，并对HSA进 行3轮选择，使用VH/dummy Vκ文库。就β-gal而言，噬菌体效价从 第一轮的1.1×106到第三轮的2.0×108。就HAS而言，噬菌体效价 从第一轮的2×104到第三轮的1.4×109。按照Griffith等(1993)所述， 进行选择，除了使用KM13辅助噬菌体(其含有蛋白酶切位点在D2 和D3区的pIII蛋白)而且噬菌体用1mg/ml胰蛋白酶的PBS进行洗脱 以外。加入胰蛋白酶，通过在c-myc标记的切割，切割来自辅助噬 菌体(而不是来自噬菌粒)的pIII蛋白，洗脱结合scFv-噬菌体融合体(图 2)，因而进一步富集了噬菌体表达的功能性scFvs，并相应减低了背 景(Kristensen和Winter，Folding&Design 3：321-328，1998年7月9 日)。使用浓度100μg/ml的HSA或β-gal包被的免疫管(Immunotube)， 进行选择。

为了检查结合，用单克隆噬菌体ELISA筛选来自各选择的第三 轮的24个菌落。按照Harrison等(Methods Enzymol.1996；267：83-109) 所述，产生噬菌体颗粒。96孔ELISA板用100μl 10μg/ml HSA或β-gal 的PBS，在4℃包被过夜。按照标准ELISA方案(Hoogenboom等， 1991)，采用结合噬菌体与抗M13-HRP缀合物的检测。对克隆进行 选择，得到50μl上清液中的ELISA信号大于1.0。

然后，采用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)，用针对HAS 而选择的VH/dummy Vκ文库以及针对β-gal而选择的Vκ/dummy VH 文库制备DNA制备物。为了得到大部分多样性，从3轮选择的每一 轮制备DNA制备物，再合在一起用于每种抗原。再将DNA制备物 用SalI/NotI在37℃消化过夜。接着对片段进行凝胶纯化，将来自针 对β-gal而选择的Vκ/dummy VH文库的Vκ链，连接在针对HAS而选 择的VH/dummy Vκ文库的dummy Vκ链的位置上，得到3.3×109个克 隆的文库。

然后，针对HSA(第一轮)和β-gal(第二轮)对该文库进行HSA/β- gal选择，或者针对β-gal(第一轮)和HSA(第二轮)对该文库进行β- gal/HSA选择。如上所述进行选择。在第二轮后的每种情况下，通过 单克隆噬菌体ELISA(如上所述)并通过可溶性scFv片段的ELISA， 测定48个克隆与HSA和β-gal的结合。按照Harrison等(1996)和标 准ELISA方案(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133)所 述，产生可溶性抗体片段，只是采用2％吐温(Tween)/PBS作为封闭 缓冲液，以及用蛋白L-HRP检测结合scFv。来自HSA/β-gal选择的 3个克隆(E4、E5和E8)和来自β-gal/HSA选择的2个克隆(K8和K10) 能结合这两种抗原。按照Ignatovich等(1999)J.Mol.Biol.，1999年11 月26日；294(2)：457-65所述，使用引物LMB3和pHENseq，对来自 这些克隆的scFv进行PCR扩增并测序。序列分析表明，所有克隆都 是相同的。因此，只选择一个编码双特异性抗体的克隆(K8)进行进一 步工作(图3)。

实施例2.K8抗体结合特性的表征

首先，K8抗体的结合特性通过单克隆噬菌体ELISA来表征。96 孔板用100μl 10μg/ml HSA和β-gal以及碱性磷酸酶(APS)、牛血清白 蛋白(BSA)、花生凝集素、溶菌酶和细胞色素c(以检查交叉反应)的 PBS在4℃包被过夜。按照Harrison等(1996)所述，将来自K8克隆 的噬菌粒用KM13拯救，含有噬菌体的上清液(50μl)直接进行测定。 按照标准ELISA方案(Hoogenboom等，1991)，用抗M13-HRP缀合物 检测结合噬菌体。当在噬菌体表面展示时，发现双特异性K8抗体能 结合HSA和β-gal，其吸收信号大于1.0(图4)。也观察到与BSA的 强烈结合(图4)。因为HSA和BSA在氨基酸水平上具有76％同源性， 所以毫不奇怪，K8抗体能识别这些结构相关的蛋白质。未检出与其 它蛋白质的交叉反应性(图4)。

其次，在可溶性scFv ELISA中检测了K8抗体的结合特性。按 照Harrison等(1996)，可溶性scFv片段是由IPTG诱导产生的。为了 测定K8 scFv的表达水平，按照Harlow和Lane(Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor)所述，用蛋白A-琼脂糖 Seph柱，从50ml诱导的上清液中纯化出可溶性抗体片段。按照 Sambrook等(1989)所述，测定OD280并计算蛋白质浓度。上清液中产 生的K8 scFv为19mg/L。

再用已知浓度的K8抗体片段，进行可溶性scFv ELISA。96孔 板用100μl HSA、BSA和β-gal以10μg/ml和100μl蛋白A的1μg/ml 浓度包被。采用50μl K8 scFv的系列稀释液，结合抗体片段用蛋白 L-HRP检测。ELISA结果证实K8抗体的双特异性(图5)。

为了证实与β-gal的结合是由Vκ区确定，与HSA/BSA的结合是 由K8 scFv抗体的VH区确定，经SalI/NotI消化，将Vκ区从K8 scFv DNA上切下，并连接到经SalI/NotI消化的含有dummy VH链的pIT2载 体中(图1和2)。所得克隆K8 Vκ/dummy VH的结合表征通过可溶性 scFv ELISA进行分析。按照Harrison等(1996)，可溶性scFv片段是 由IPTG诱导产生的，含有scFv的上清液(50μ)直接进行测定。按照 实施例1所述，进行可溶性scFv ELISA，结合scFv用蛋白L-HRP 测定。ELISA结果表明，该克隆仍能结合β-gal，而与BSA的结合已 被消除掉(图6)。

实施例3.针对抗原A和B的VH单域抗体的选择，以及针对抗原 C和D的Vκ单域抗体的选择

该实施例描述了针对抗原A和B的VH单域抗体，以及针对抗 原C和D的Vκ单域抗体的制备方法，即通过在互补可变区不存在时， 选择处女(virgin)单抗体可变区库对这些抗原的结合。

按照前述方法(参见实施例5，PCT/GB02/003014)，进行结合克 隆的选择和表征。选择4个克隆进行进一步工作：

VH1-抗A VH

VH2-抗B VH

VK1-抗C Vκ

VK2-抗D Vκ

可以采用以上实施例1-3所述的方法，按照所述类似方式，产 生包含VH区组合(即VH-VH配体)和VL区组合(VL-VL配体)的二聚体 分子。

实施例4.双特异性ScFv抗体的产生和表征(针对抗原A和B的 VH1/VH2以及针对抗原C和D的VK1/VK2)

该实施例证明，可以通过将针对ScFv载体中各自抗原而选择的 Vκ和VH单域结合起来，产生双特异性ScFv抗体(针对抗原A和B 的VH1/VH2以及针对抗原C和D的VK1/VK2)。

为了产生双特异性抗体VH1/VH2，经NcoI/XhoI消化，从可变 区载体1上切下VH1单域(图7)并连接到经NcoI/XhoI消化的可变区 载体2上(图7)，产生VH1/可变区载体2。通过PCR，使用引物，从 可变区载体1扩增VH2单区，将SalI限制位点引入5′端并将NotI限 制位点引入3′端。再将PCR产物用SalI/NotI消化并连接到经SalI/NotI 消化的VH1/可变区载体2上，产生VH1/VH2/可变区载体2。

VK1/VK2/可变区载体2以类似方式产生。按照前述可溶性ScFv ELISA的方法(参见实施例6，PCT/GB02/003014)，测定所产生的 VH1/VH2 ScFV和VK1/VK2 ScFv的双特异性。按照前述方法(参见 实施例8，PCT/GB02/003014)，进行竞争性ELISA。

可能结果：

-VH1/VH2 ScFv能同时抗原A和B

-VK1/VK2 ScFv能同时抗原C和D

-VH1/VH2 ScFV结合是竞争性的(当结合抗原A时，VH1/VH2 ScFv不能结合抗原B)

-VK1/VK2 ScFv结合是竞争性的(当结合抗原C时，VK1/VK2 ScFv不能结合抗原D)。

实施例5.双特异性VH1/VH2 Fab和VK1/VK2 Fab的构建及其结 合特性的分析

为了产生VH1/VH2 Fab，将VH1单域连接到经NcoI/XhoI消化 的CH载体上(图8)，产生VH1/CH，再将VH2单域连接到经SalI/NotI 消化的CK载体上(图9)，产生VH2/CK。按照前述方法(参见实施例 8，PCT/GB02/003014)，用来自VH1/CH和VH2/CK的质粒DNA用 于共转化感受态大肠杆菌细胞。

按照前述方法(参见实施例8，PCT/GB02/003014)，含有VH1/CH 和VH2/CK质粒的克隆再用IPTG诱导，产生可溶性VH1/VH2 Fab。

VK1/VK2 Fab按类似方法产生。

按照前述的竞争性ELISA(参见实施例8，PCT/GB02/003014)， 测定所产生的Fab的结合特性。

可能结果：

-VH1/VH2 Fab能同时抗原A和B

-VK1/VK2 Fab能同时抗原C和D

-VH1/VH2 Fab结合是竞争性的(当结合抗原A时，VH1/VH2 Fab 不能结合抗原B)

-VK1/VK2 Fab结合是竞争性的(当结合抗原C时，VK1/VK2 Fab 不能结合抗原D)。

实施例6.使dAb二聚体螯合

概述

用柔性多肽接头，产生dAb-接头-dAb形式的VH和VK同型二 聚体。产生dAb接头-dAb形式的载体，其含有不同长度的甘氨酸-丝 氨酸接头3U：(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：199)、5U：(Gly4Ser)5(SEQ ID NO： 629)、7U：(Gly4Ser)7(SEQ TD NO：630)。用接头的定向dAb上游和接 头之后相应第二dAb的文库，产生二聚体文库，所述接头为：TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)。采用这一方法， 选择新的二聚体dAb。通过ELISA和BIAcore研究，在细胞中和及 受体结合测定中，检测二聚化对抗原结合的影响。TAR1-5和TAR1- 27的二聚化导致结合亲和力及中和水平得到改善。

1.0方法

1.1文库的产生

1.1.1载体

消化pEDA3U、pEDA5U和pEDA7U载体，引入与dAb-接头-dAb 形式相容的不同接头长度。对于pEDA3U，使有义和反义的73个碱 基对寡聚接头退火，采用缓慢退火程序(95℃-5分钟，80℃-10分钟， 70℃-15分钟，56℃-15分钟，42℃直到使用)，在含有0.1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)的缓冲液中，用XhoI和NotI限制位点进行克隆。接 头包含3(Gly4Ser)单元和填充区，其位于SalI和NotI克隆位点之间(方 案1)。为了降低单体dAb被噬菌体展示选择的可能性，设计的填充 区包含3个终止密码子、SacI限制位点和移码突变，以便将该区放 在读框之外，当第二dAb不存在时。对于pEDA5U和pEDA7U，因 为所需接头长度，消化重叠寡聚接头，用于各载体，退火并用Klenow 延伸。然后纯化片段，用合适酶消化，再用XhoI和NotI限制位点克 隆。

方案1

1.1.2文库的制备

用NcoI和XhoI限制位点，将对应于定向dAb的N-端V基因克 隆到接头上游。VH基因具有现成的相容性位点，然而，克隆VK基 因需要引入合适的限制位点。通过使用修饰的PCR引物(VK-DLIBF：5′ cggccatggcgtcaacggacat(SEQ ID NO：377)；VK XholR：5′ atgtgcgctcgagcgtttgattt 3′(SEQ ID NO：378))，在30次循环的PCR扩 增中，使用SuperTaq(HTBiotechnology Ltd)和pfu turbo(Stratagene)的 2∶1混合物，来达到这一点。这在5′端保留NcoI位点，同时破坏相邻 SalI位点并在3′端引入XhoI位点。将5个定向dAb克隆到3个二聚 体载体的每个中：TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、 TAR2-6(VK)和TAR2-7(VK)。所有构建体都经序列分析得以证实。

每个载体((pEDA3U、pEDA 5U和pEDA 7U)：TAR1-5(VK)、 TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK))都具有接头上游的克隆 定向dAb，将相应的第二dAb的文库克隆到接头之后。为了达到这 一点，经PCR，从经过第一轮选择而回收的噬菌体扩增互补 (complimentary)dAb文库，所述噬菌体可以是当TAR1-5或TAR1-27 是定向dAb时、针对人TNFα的VK文库的第一轮选择而回收的噬菌 体(在第一轮后约1×106多样性)，或者是当TAR2-5或TAR2-6分别 是定向dAb时、针对人p55 TNF受体的VH或VK文库的第一轮选 择而回收的噬菌体(在第一轮后都约为1×105多样性)。对于VK文库， 使用引物，在30次循环的PCR扩增中，使用SuperTaq和pfu turbo 的2∶1混合物，进行PCR扩增。使用引物，对VH文库进行PCR扩 增，以便在基因的5′端引入SalI限制位点。dAb文库PCR用合适限 制酶消化，连接到相应载体接头下游，使用SalI/NotI限制位点，并 经电穿孔进入新鲜制备的感受态TG1细胞中。

各文库所得效价如下：

TAR1-5：pEDA3U＝4×108，pEDA5U＝8×107，pEDA7U＝1×108

TAR1-27：pEDA3U＝6.2×108，pEDA5U＝1×108，pEDA7U＝1×109

TAR2h-5：pEDA3U＝4×107，pEDA5U＝2×108，pEDA7U＝8×107

TAR2h-6：pEDA3U＝7.4×108，pEDA5U＝1.2×108，pEDA7U＝2.2×108

1.2选择

1.2.1  TNFα

用被动包被在免疫管上的人TNFα，进行选择。简而言之，免疫 管用1-4ml所需抗原包被过夜。免疫管再用PBS洗涤3次，用2％奶 粉/PBS封闭1-2小时，然后再用PBS洗涤3次。噬菌体溶液用2％ 奶粉/PBS稀释，在室温下孵育2小时。这些管再用PBS洗涤，噬菌 体用1mg/ml胰蛋白酶-PBS洗脱。对于TAR1-5二聚体文库，研究了 3种选择策略。第一轮选择在免疫管中进行，用1μg/ml或20μg/ml 的人TNFα包被，再用PBS 0.1％吐温洗涤20次。TG1细胞用经过洗 脱的噬菌体感染，测定效价(例如Marks等，J.Mol.Biol.，1991年12 月5日；222(3)：581-97，Richmann等，Biochemistry，1993年8月31日； 32(34)：8848-55)。

回收的效价为：

pEDA3U＝2.8×107(1μg/ml TNF)，1.5×108(20μg/ml TNF)，

pEDA5U＝1.8×107(1μg/ml TNF)，1.6×108(20μg/ml TNF)，

pEDA7U＝8×106(1μg/ml TNF)，7×107(20μg/ml TNF)。

用下面三种不同的方法进行第二轮选择。

1.在免疫管中，20次洗涤并过夜孵育，接着再是10次洗涤。

2.在免疫管中，20次洗涤并在室温下、在洗涤缓冲液中与(1μg/ml TNFα)孵育1小时，接着再是10次洗涤。

3.在链霉抗生物素珠上，使用33pmole生物素化人TNFα进行 选择(Henderikx等，2002，Selection of antibodies against biotinylated antigens.Antibody Phage Display：Methods and protocols，O′Brien和 Atkin(主编)，Humana Press)。挑取来自第二轮选择的单个克隆，接种 到96孔板中，以2ml 96孔板的形式制备粗上清液制备物。

表1.

 第一轮  人  TNFα免疫管  包被浓度   第二轮   选择   方法1     第二轮     选择     方法2  第二轮  选择  方法3  pEDA3U  1μg/ml  1×109    1.8×109 2.4×1010  pEDA3U  20μg/ml  6×109    1.8×1010 8.5×1010  pEDA5U  1μg/ml  9×108    1.4×109 2.8×1010  pEDA5U  20μg/ml  9.5×109    8.5×109 2.8×1010  pEDA7U  1μg/ml  7.8×108    1.6×108 4×1010  pEDA7U  20μg/ml  1×1010    8×109 1.5×1010

对于TAR1-27，按照前述方法并经以下改进，进行选择。在用1μg/ml 或20μg/ml人TNFα包被、并用PBS 0.1％吐温洗涤20次的免疫管中， 进行第一轮选择。在20次洗涤、过夜孵育并再次20次洗涤的免疫 管中，进行第二轮选择。挑取来自第二轮选择的单个克隆，接种到96 孔板，以2ml 96孔板的形式制备粗上清液制备物。

TAR1-27效价如下：

表2.

人TNFα免疫管  包被浓度   第一轮  第二轮 pEDA3U  1μg/ml  4×109 6×109 pEDA3U  20μg/ml  5×109 4.4×1010 pEDA5U  1μg/ml  1.5×109 1.9×1010 pEDA5U  20μg/ml  3.4×109 3.5×1010 pEDA7U  1μg/ml  2.6×109 5×109 pEDA7U  20μg/ml  7×109 1.4×1010

1.2.2  TNF受体1(p55受体；TAR2)

仅对于TAR2h-5文库，按照前述方法进行选择。在用1μg/ml人 p55 TNF受体或10μg/ml人p55 TNF受体、并用PBS 0.1％吐温洗涤 20次、过夜孵育并再次20次洗涤的免疫管中，进行第三轮选择。挑 取来自第二轮和第三轮选择的单个克隆，接种到96孔板，以2ml 96 孔板的形式制备粗上清液制备物。

TAR2h-5效价如下：

表3.

  第一轮  人p55 TNF  受体免疫管包  被浓度   第一轮   第二轮 第三轮 pEDA3U  1μg/ml  2.4×106   1.2×107 1.9×109 pEDA3U  10μg/ml  3.1×107   7×107 1×109 pEDA5U  1μg/ml  2.5×106   1.1×107 5.7×108 pEDA5U  10μg/ml  3.7×107   2.3×108 2.9×109 pEDA7U  1μg/ml  1.3×106   1.3×107 1.4×109 pEDA7U  10μg/ml  1.6×107   1.9×107 3×1010

1.3  筛选

从每个3U、5U和7U文库中，适当时用不同选择方法挑取来自 第二轮或第三轮选择的单个克隆。在37℃，将克隆在含有100μg/ml 氨苄青霉素和1％葡萄糖的2xTY培养过夜。该培养物的1/100稀释 液接种到2ml含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY的2ml 96孔板形式中，在37℃振荡培养直到OD600达到约0.9。然后，培养 物用1mM IPTG在30℃诱导过夜。在sorval板式离心机中以4000rpm 离心15分钟，使上清液澄清。上清液制备物用于初步筛选。

1.3.1  ELISA

通过蛋白A/L ELISA或抗原ELISA，对二聚体重组蛋白质与单 体的结合活性进行比较。简而言之，96孔板用抗原或蛋白A/L在4℃ 包被过夜。该板用0.05％吐温-PBS洗涤，用2％吐温-PBS封闭2小 时。将样品加到该板上，在室温下孵育1小时。洗涤该板，与第二 试剂在室温下一起孵育1小时。洗涤该板，用TMB底物显色。蛋白 A/L-HRP或India-HRP用作第二试剂。对于抗原ELISA，所用抗原 浓度为1μg/ml的PBS，用于人TNFα和人THF受体1。因为大多数 情况下存在定向dAb，二聚体给出阳性ELISA信号，因此解离速率 经BIAcore检测。

1.3.2  BIAcore

对TAR1-5和TAR2h-5克隆进行BIAcore分析。对于筛选，人 TNFα以高密度(约10000RU)偶联到CM5芯片上。50μl人TNFα(50 μg/ml)以5μl分钟的乙酸盐缓冲液(pH5.5)偶联到芯片上。分析后的芯 片不能用标准方法再生，因为人TNFα不稳定，因此，每次分析样品 之后，芯片用缓冲液洗涤10分钟。对于TAR1-5，用BIAcore筛选 来自第二轮选择的克隆上清液。

采用以下选择方法，从所得每个3U、5U和7U文库中筛选出48 个克隆：

R1：1μg/ml人TNFα免疫管，R2：1μg/ml人TNFα免疫管，过 夜洗涤。

R1：20μg/ml人TNFα免疫管，R2：20/xg/ml人TNFα免疫管， 过夜洗涤。

R1：1μg/ml人TNFα免疫管，R2：33pmoles生物素化人TNFα 在珠子上。

R1：20μg/ml人TNFa免疫管，R2：33pmoles生物素化人TNFα 在珠子上。

对于筛选，人p55 TNF受体以高密度(约4000RU)偶联到CM5 芯片上。100μl人p55 TNF受体(10μg/ml)以5μl/分钟的乙酸盐缓冲液 (pH5.5)偶联到芯片上。检查标准再生条件(甘氨酸pH2或pH3)，但 是在每种情况下，抗原与TNFα一起从芯片表面除去，因此每次分析 样品之后，芯片用缓冲液洗涤10分钟。

对于TAR2-5，筛选了来自第二轮选择的克隆上清液。

采用以下选择方法，从每个3U、5U和7U文库中筛选出48个 克隆：

R1：1μg/ml人p55 TNF受体免疫管，R2：1μg/ml人p55 TNF 受体免疫管，过夜洗涤。

R1：10μg/ml人p55 TNF受体免疫管，R2：10μg/ml人p55 TNF 受体免疫管，过夜洗涤。

1.3.3  受体和细胞测定

在受体测定中，二聚体中和能力的测定如下进行：

受体结合

测定抗TNF dAb抑制TNF与重组TNF受体1(p55)结合的能力。 简而言之，Maxisorp板与30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，San Francisco，USA)一起孵育过夜。各孔用含0.05％吐温-20的磷酸缓冲 盐溶液(PBS)洗涤，再用1％BSA/PBS封闭，然后与100ng/ml TNF 受体1Fc融合蛋白(R&D系统，Minneapolis，USA)一起孵育。抗TNF dAb与TNF(其加入到洗涤孔中，终浓度为10ng/ml)混合。TNF结合 的测定如下：用0.2mg/ml生物素化抗TNF抗体(HyCult biotechnology， Uben，Netherlands)，接着用1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉 抗生物素(Amersham Biosciences，UK)，再与TMB底物(KPL， Gaithersburg，USA)一起孵育。加入HCl终止反应，在450nm读出吸 光度。抗TNF dAb活性导致TNF结合的降低，因此，与仅用TNF 对照相比，导致吸光度下降。

L929  细胞毒性测定

在小鼠L929成纤维细胞上，也测定了抗TNF dAb中和TNF细 胞毒活性的能力(Evans，T.(2000)Molecular Biotechnology 15，243- 248)。简而言之，将接种在微量滴定板上的L929细胞与抗TNF dAb、 100pg/ml TNF和1mg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)一起孵育过 夜。细胞存活率通过在490nm读出吸光度而测定，接着与[3-(4，5-二 甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基(carbboxy)甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H- 四唑(Promega，Madison，USA)一起孵育。抗TNF dAb活性导致TNF 细胞毒性的降低，因此，与仅用TNF对照相比，导致吸光度增加。

在初步筛选中，如上所述，为BIAcore分析而制备的上清液也 可用于受体测定。在受体和细胞测定中，使用纯化蛋白质，也可进 行所选二聚体的进一步分析。

HeLa IL-8测定

在HeLa细胞中，测定抗TNFR1或抗TNFα dAb中和TNF对IL-8 分泌的诱导作用(采用Akeson，L.等(1996)Journal of Biological Chemistry 271，30517-30523所述方法的改进方法，所述文献介绍了 在HUVEC中IL-1对IL-8的诱导作用；在此，我们观察了人TNFα 的诱导作用，而且我们采用HeLa细胞替代HUVEC细胞系)。简而 言之，接种在微量滴定板上的HeLa细胞与dAb和300pg/ml TNF一 起孵育过夜。孵育后，吸出上清液，通过夹心ELISA(R&D系统)测 定细胞和IL-8浓度。与仅用TNF对照相比，抗TNFR1 dAb活性导 致上清液中IL-8分泌降低。

L929测定用于以下实验；然而，优选采用HeLa IL-8测定以检 测抗TNF受体1(p55)配体；在L929测定中，小鼠p55的存在对其 使用具有某些限制。

1.4序列分析

对于在BIAcore和受体测定筛选中证明具有目标特性的二聚体 进行测序。序列详见序列表。

1.5结构形成(formatting)

1.5.1  TAR1-5-19二聚体

在细胞和受体测定中，重新精制并分析具有良好中和特性的 TAR1-5二聚体。TAR1-5定向dab被亲和力成熟克隆TAR1-5-19取 代。为了达到这一点，将该TAR1-5从单个二聚体对中克隆掉(clone out)，并用经PCR扩增的TAR1-5-19取代。另外，在3U、5U和TU 载体中构建TAR1-5-19同型二聚体。基因的N端拷贝经PCR扩增并 如上所述进行克隆，用现有的SalI和NotI限制位点克隆C-端基因片 段。

1.5.2诱变

通过定点诱变，将dAb2中存在的琥珀终止密码子(其中一个在 TAR1-5二聚体对C端的dAb)突变成谷氨酰胺。

1.5.3  Fab

将含有TAR1-5或TAR1-5-19的二聚体重新精制到Fab表达载 体中。用SfiI和NotI限制位点，将dAb克隆到含有CK基因或CH 基因的表达载体中，通过序列分析而得以证实。CK载体来源于基于 pUC的氨苄青霉素抗性载体，CH载体来源于pACYC氯霉素抗性载 体。对于Fab表达，将dAb-CH和dAb-CK构建体共转化HB2151细 胞，在含0.1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素的2xTY 中培养。

1.5.3铰链二聚化

检查了通过形成胱氨酸键的dAb二聚化。将氨基酸 EPKSGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：379)的短序列(一种修饰形式的人 IgGCl铰链)，经过改造连接在dAb的C端区。如上所述，合成编码 该序列的寡聚接头并退火。将接头克隆到含有TAR1-5-19的pEDA 载体中，用XhoI和NotI限制位点。二聚化在周质中原位发生。

1.6表达和纯化

1.6.1表达

如上所述，以2ml，96孔板形式制备上清液，用于初步筛选。初 步筛选过程后，对所选二聚体进行进一步分析。二聚体构建体在 TOP10F′或HB2151细胞上清液中表达。简而言之，将来自新鲜划线 平板的单菌落在37℃、在含100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2xTY 中培养过夜。将1/100稀释的该培养物接种到含有100μg/ml氨苄青 霉素和0.1％葡萄糖的2xTY中，在37℃振荡培养，直到OD600达到 约0.9。培养物再用1mM IPTG在30℃诱导过夜。离心除去细胞，上 清液用蛋白A或L琼脂糖纯化。

在HB2152细胞中，Fab和半胱氨酸铰链二聚体表达为周质蛋白。 将1/100稀释的过夜培养物接种到含有0.1％葡萄糖和合适抗生素的 2xTY中，在30℃振荡培养，直到OD600达到约0.9。培养物再用1mM IPTG在25℃诱导3-4小时。离心收获细胞，沉淀重悬于周质制备缓 冲液(30mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、20％蔗糖)中。离心后， 保留上清液，将沉淀重悬于5mM MgSO4。再次通过离心收获上清液， 合并，然后纯化。

1.6.2蛋白A/L纯化

从蛋白L琼脂糖(Affitech，Norway)或蛋白A琼脂糖(Sigma，UK) 中优化纯化二聚体蛋白，对其进行检测。蛋白质分批洗脱，或者用 蠕动泵通过柱洗脱。检查3种缓冲液：0.1M磷酸-柠檬酸缓冲液 (pH2.6)、0.2M甘氨酸(pH2.5)和0.1M甘氨酸(pH2.5)。确定蠕动泵条 件下的优化条件，采用0.1M甘氨酸pH2.5，超过10倍柱体积。从蛋 白A纯化，蠕动泵条件采用0.1M甘氨酸pH2.5。

1.6.3  FPLC纯化

通过FPLC分析，在AKTA Explorer 100系统(Amersham Biosciences Ltd)上进行进一步纯化。TAR1-5和TAR1-5-19二聚体的 分离是通过阳离子交换色谱(1ml Resource S-Amersham Biosciences Ltd)，用0-1M NaCl梯度/50mM乙酸盐缓冲液(pH4)洗脱。铰链二聚 体的纯化是通过离子交换(1ml Resource Q Amersham Biosciences Ltd)，用0-1M NaCl梯度/25mM Tris HCl(pH8.0)洗脱。Fab的纯化是 通过大小排阻层析，用superose 12(Amersham Biosciences Ltd)柱， 流速0.5ml/分钟的PBS(含0.05％吐温)。纯化后，采用vivaspin 5K 截止浓缩器(Vivascience Ltd)浓缩样品。

2.0  结果

2.1  TAR1-5二聚体

从第二轮选择中挑取6×96个克隆，包括所有文库和选择条件。 制备上清液制备物，用抗原和蛋白L ELISA、BIAcore和受体测定来 分析。在ELISA中，从各选择方法中鉴定出阳性结合克隆，它们分 布在3U、5U和7U文库中。然而，因为定向dAb总是存在，所以通 过该方法不能区别高和低亲和力结合物，因此进行BIAcore分析。

用2ml上清液进行BIAcore分析。BIAcore分析表明，与单体 TAR1-5相比，二聚体K解离速率有很大改进。单体K解离速率范 围为10-1M，二聚体K解离速率范围为10-3-10-4M。选择表现出解离 速度很慢的16个克隆，它们来自3U、5U和TU文库，并对其进行 测序。此外，在受体测定中，分析上清液中和人TNFα的能力。

对在这些测定中具有中和能力的6个先导克隆(以下称d1-d6)进 行测序。结果显示所得6个克隆中仅3个具有不同第二dAb(dAb1、 dAb2和dAb3)，然而，其中发现第二dAb不止一次连接不同长度的 接头。

TAR1-5d1：3U接头2nd dAb＝dAb1-1μg/ml Ag免疫管，过夜洗涤

TAR1-5d2：3U接头2nd dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管，过夜洗涤

TAR1-5d3：5U接头2nd dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管，过夜洗涤

TAR1-5d4：5U接头2nd dAb＝dAb3-20μg/ml Ag免疫管，过夜洗涤

TAR1-5d5：5U接头2nd dAb＝dAb1-20μg/ml Ag免疫管，过夜洗涤

TAR1-5d6：7U接头2nd dAb＝dAb1-R1：1μg/ml Ag免疫管，过夜洗 涤

R2：珠

进一步检测6个先导克隆。蛋白质从周质和上清液产生，用蛋 白L琼脂糖纯化，并在细胞和受体测定中进行检测。中和水平不同(表 1)。检测了蛋白质制备的优化条件。从HB2151细胞上清液中得到的 蛋白质得到最高收率(约10mg/L培养物)。将上清液与蛋白L琼脂糖 一起在室温下孵育2小时或在4℃孵育过夜。珠子用PBS/NaCl洗涤， 用蠕动泵装入FPLC柱。珠子用10倍体积的PBS/NaCl洗涤，用0.1M 甘氨酸(pH2.5)洗脱。一般而言，二聚体蛋白在单体之后洗脱下来。

TAR1-5d1-6二聚体用FPLC纯化。FPLC纯化后得到3种，经SDS PAGE鉴定。一种对应于单体，而其它两种对应于不同大小的二聚体。 两种中较大的一种可能是因为存在C端标记。在受体测定中检测这 些蛋白质。数据见表1，代表了得自两种二聚体的优化结果(图11)

将来自二聚体对(即dAb1、dAb2和dAb3)的3种第二dAb，作 为单体进行克隆，并通过ELISA以及在细胞和受体测定中进行检测。 所有3种dAb都特异性结合TNF(经抗原ELISA)，而且不与塑料或 BSA发生交叉反应。作为单体，在细胞或受体测定中，dAb都不中 和。

2.1.2  TAR1-5-19二聚体

在6个先导克隆中，用TAR1-5-19代替TAR1-5。在细胞和受体 测定中，对所有TAR1-5-19二聚体进行分析，使用总蛋白(仅纯化蛋 白L)，除非另有说明(表2)。在细胞测定中，TAR1-5-19d4和TAR1- 5-19d3具有最佳ND50(～5nM)，这与受体测定结果是一致的，并且相 比TAR1-5-19单体(ND50～30nM)来说得到了改善。尽管纯化TAR1-5 二聚体在受体和细胞测定中得到不同结果，但是TAR1-5-19二聚体 更一致。在蛋白质纯化期间，当使用不同洗脱缓冲液时会有变动。 用0.1M磷酸-柠檬酸缓冲液(pH2.6)或0.2M甘氨酸(pH2.5)洗脱，尽管 在大多数情况下从蛋白L琼脂糖中除去所有蛋白质，这使它功能更 少。

TAR1-5-19d4在发酵罐中表达，然后在阳离子交换FPLC中纯 化，得到十分纯的二聚体。与TAR1-5d4一起，通过FPLC纯化得到 3种对应于单体和两种二聚体。对该二聚体进行氨基酸测序。然后， 在受体测定中检测TAR1-5-19单体和TAR1-5-19d4，单体所得IC50 为30nM，二聚体为8nM。与TAR1-5-19单体、TAR1-5-19d4和 TAR1-5d4相比的受体测定结果见图10。

在3U、5U和7U载体中制备TAR1-5-19同型二聚体，表达并 在蛋白L上纯化。蛋白质在细胞和受体测定中进行检验，测定所得IC50 (对于受体测定)和ND50(对于细胞测定)(表3，图12)。

2.2  Fab

TAR1-5和TAR1-5-19二聚体克隆到Fab形式中，表达并在蛋白 L琼脂糖上纯化。Fab在受体测定中进行评价(表4)。结果表明， TAR1-5-19和TAR1-5二聚体的中和水平都类似于其来源的原Gly4Ser 接头二聚体。表达TAR1-5-19 Fab(其中TAR1-5-19展示在CH和CK 上)，经蛋白L纯化，在受体测定中进行评价。所得IC50约为1nM。

2.3  TAR1-27二聚体

从第二轮选择中挑取3×96个克隆，包括所有文库和选择条件。 制备2ml上清液制备物，用于在ELISA和生物测定中进行分析。抗 原ELISA得到71个阳性克隆。粗上清液的受体测定得到42个具有 抑制特性的克隆(TNF结合0-60％)。在大多数情况下，抑制特性与强 烈ELISA信号相关。对42个克隆进行测序，其中有39个具有独特 的第二dAb序列。对具有最佳抑制特性的12个二聚体进行进一步分 析。

12个中和克隆在200ml上清液制备物中表达，再在蛋白L上纯 化。它们通过蛋白L和抗原ELISA、BIAcore和在受体测定中进行评 价。在所有情况下都得到强烈阳性ELISA信号。BIAcore分析表明， 所有克隆具有快的缔合和解离速度。与单体TAR1-27相比，改进了 解离速率，然而，与先前检测的TAR1-5二聚体的速度(K解离范围 约为10-3M～10-4M)相比，TAR1-27二聚体的解离速度更快(K解离 范围约为10-1M～10-2M)。纯化二聚体的稳定性是个问题，因此为了 改进稳定性，在2 TAR1-27二聚体(d2和d16)的纯化中加入5％甘油、 0.5％Triton X100或0.5％NP40(Sigma)。加入NP40或Triton X100TM 提高纯化产物的收率约2倍。在受体测定中评价这两种二聚体。在 所有纯化条件下TAR1-27d2的IC50都约为30nM。当纯化没有使用 稳定剂时，TAR1-27d16显示出没有中和效应，但当纯化在稳定条件 下进行时，得到IC50约为50nM。没有进行进一步分析。

2.4  TAR2-5二聚体

从第二轮选择中挑取3×96个克隆，包括所有文库和选择条件。 制备2ml上清液制备物，用于分析。对各板进行蛋白A和抗原ELISA。 通过BIAcore鉴定出30个目标克隆，具有良好解离速率(K解离范围 介于10-2-10-3M)。对克隆进行测序，通过序列分析鉴定了13个独特 的二聚体。

表4：  TAR1-5二聚体

  二聚体 细胞类型 纯化 蛋白质部分 洗脱条件  受体/细胞   测定  TAR1-5d1  HB2151 蛋白L+ FPLC 小二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～30nM  TAR1-5d2  HB2151 蛋白L+ FPLC 小二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～50nM  TAR1-5d3  HB2151 蛋白L+ FPLC 大二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～300nM  TAR1-5d4  HB2151 蛋白L+ FPLC 小二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～3nM  TAR1-5d5  HB2151 蛋白L+ FPLC 大二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～200nM  TAR1-5d6  HB2151 蛋白L+ FPLC 大二聚体 0.1M甘氨 酸pH2.5  RA～100nM

*注释：二聚体2和二聚体3具有相同的第二dAb(称为dAb2)，但却具有不同接 头长度(d2＝(Gly4Ser)3、d3＝(Gly4Ser)3)。dAb1是二聚体1、5和6的配偶体dAb。 dAb3是二聚体4的配偶体dAb。配偶体dAb都不能单独中和。除非另有说明， 否则FPLC纯化是通过阳离子交换。在这些测定中，对经FPLC所得的每种二聚 体，测定优化二聚体种类。

表5：TAR1-5-19二聚体

  二聚体 细胞类型   纯化   蛋白质   部分  洗脱条件 受体/细胞   测定  TAR1-5-19d1  TOP10F’ 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～15nM  TAR1-5-19d2  (无终止密码  TOP10F’ 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0+0.05％NP  RA～2nM

 子) 40  TAR1-5-19d3  (无终止密码  子)  TOP10F’ 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5+0.05％NP 40  RA～8nM  TAR1-5-19d4  TOP10F’ 蛋白L+ FPLC FPLC纯 化部分 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～2-5  nM CA～12  nM  TAR1-5-19d5  TOP10F’ 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0+NP40  RA～8nM  CA～10nM  TAR1-5-19d6  TOP10F’ 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～10nM

表6：TAR1-5-19同型二聚体

    二聚体 细胞类     型   纯化   蛋白质   部分  洗脱条件  受体/细胞   测定 TAR1-5-19 3U 同型二聚体 HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～20nM  CA～30nM TAR1-5-19 5U 同型二聚体 HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～2nM  CA～3nM TAR1-5-19 7U 同型二聚体 HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～10nM  CA～15nM TAR1-5-19 Cys 铰链 HB2151 蛋白L+ FPLC FPLC纯 化部分 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～2nM TAR1-5-19CH/ TAR1-5-19 CK HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～1nM

表7：TAR1-5/TAR1-5-19 Fab

    二聚体 细胞类     型   纯化 蛋白质部     分   洗脱条件 受体/细胞     测定 TAR1-5CH/ dAb1 CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.6  RA～90nM TAR1-5CH/ dAb2 CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.5  RA～30nM  CA～60nM

dAb3 CH/ TAR1-5CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.6  RA～100  nM TAR1-5-19CH/ dAb1 CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～6nM dAb1 CH/ TAR1-5-19 CK  HB2151 蛋白L 0.1M甘氨 酸pH2.0 Myc/flag  RA～6nM TAR1-5-19CH/ DAb2 CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～8nM  CA～12nM TAR1-5-19CH/ dAb3 CK  HB2151 蛋白L 总蛋白 0.1M甘氨酸 pH2.0  RA～3nM

实施例7.通过末端半胱氨酸键的dAb二聚化

概述

对于dAb二聚化，将游离半胱氨酸拼接到蛋白质的C-端。当表 达时，该蛋白形成二聚体，所述二聚体可通过两个步骤的纯化方法 而纯化。

TAR1-5-19CYS二聚体的PCR构建

按照实施例8描述dAb三聚体的方法。三聚体方案得到单体、 二聚体和三聚体的混合物。

TAR1-5-19CYS二聚体的表达和纯化

按照实施例8概述的方法，从培养物上清液中，通过蛋白L琼 脂糖捕获而纯化二聚体。

TAR1-5-19CYS单体与TAR1-5-19CYS二聚体的分离

在阳离子交换分离之前，按照制造商的使用说明书，用PD-10 柱(Amersham Pharmacia)将单体/二聚体混合样品的缓冲液更换成 50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)。再将样品用于预先用50mM乙酸钠 (pH4.0)平衡的1mL Resource S阳离子交换柱(Amersham Pharmacia)。 用以下盐梯度的50mM乙酸钠(pH4.0)分离出单体和二聚体：

150-200mM氯化钠超过15倍柱体积

200-450mM氯化钠超过10倍柱体积

450-1000mM氯化钠超过15倍柱体积

仅含二聚体的部分用SDS-PAGE鉴定后合并，加入1/5体积的1M Tris(pH8.0)将pH升至8。

体外功能性结合测定：TNF受体测定和细胞测定。

采用TNF受体和细胞测定，测定二聚体对人TNFα的亲和力。 受体测定中的IC50约为0.3-0.8nM；细胞测定中的ND50约为3-8nM。 其它可能的TAR1-5-19CYS二聚体形式

PEG二聚体和委托合成的马来酰亚胺二聚体

Nektar(Shearwater)提供一系列双马来酰亚胺PEG[mPEG2- (MAL)2或mPEG-(MAL)2]，它们可让单体成为二聚体，其中用小接 头隔开dAb，这两者都连接有PEG(大小范围为5-40kDa)。已经知道， 5kDa mPEG-(MAL)2(即[TAR1-5-19]-Cys-马来酰亚胺-PEG×2，其中 马来酰亚胺一起连接在二聚体中)在TNF受体测定中的亲和力为～1- 3nM。另外，也可用TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)(Pierce Biotechnology)或其它双功能接头产生二聚体。

通过化学偶联方法，采用2，2′-二硫双吡啶(Sigma Aldrich)和还原 单体，也可产生二硫化物二聚体。将多肽接头或铰链加到dAb的C- 端。或者(Gly4Ser)n(其中n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7)、或 者免疫球蛋白(例如IgG铰链区或随机肽序列(例如选自随机肽序列文 库)等小接头，可以添加在dAb和末端半胱氨酸残基之间。这可用于 制备如上所述的二聚体。

实施例8.dAb三聚化

概述

对于dAb三聚化，蛋白质C-端需要游离半胱氨酸。半胱氨酸残 基，一旦还原得到游离巯基，则可用于将蛋白质特异性偶联到三聚 体马来酰亚胺分子上，例如TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)。

TAR1-5-19CYS的PCR构建

下列寡核苷酸专门用于具有SalI和BamHI位点的PCR TAR1-5- 19，用于克隆并引入C-端半胱氨酸残基：

               SalI

               ～～～～～～～

     Trp Ser Ala Ser Thr Aap* Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1    TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA

     ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT

     Gly Asp Arg Val Thr Ils Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp

61   GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG

     CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC

     Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lye Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln

121  TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA

     ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT

     Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

181  AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC

     TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG

     Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro

241  AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT

     TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA

                                                                     BamHI

                                                                     ～～～～～～～～ 

     Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser Gly

301  TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGC

     AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG

(*TAR1-5-19CYS序列的开始；TAR1-5-19CYS氨基酸序列(SEQ ID NO：293；TAR1-5-19CYS核苷酸序列(SEQ ID NO：294，编码链； SEQ ID NO：295，非编码链))

正向引物

5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’ (SEQ ID NO：296)

反向引物

5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’ (SEQ ID NO：297)

如下进行PCR反应(50μL体积)：200μM dNTP、0.4μM各引物、 5μL 10x Pfu Turbo缓冲液(Stratagene)、100ng模板质粒(编码TAR1-5- 19)、1μL Pfu Turbo酶(Stratagene)并用无菌水将体积调至50μL。采用 以下PCR条件：起始变性步骤94℃2分钟，再是25次循环(94℃30 秒，64℃30秒，72℃30秒)。最终延伸步骤也包括72℃5分钟。纯化 PCR产物并用SalI和BamHI消化，再连接到用相同限制酶切割的载 体上。正确克隆经DNA测序得以证实。

TAR1-5-19CYS的表达和纯化

按照制造商的方案，将TAR1-5-19CYS载体转化BL21(DE3) pLysS化学感受态细胞(Novagen)中。用100μg/mL羧苄青霉素和 37μg/mL氯霉素选择携带dAb质粒的细胞。在含有500mL terrific肉 汤(Sigma-Aldrich)、100μg/mL羧苄青霉素和37μg/mL氯霉素的2L带 挡板的瓶子中建立培养。培养物在30℃以200rpm振荡培养，直到 O.D.600为1-1.5，然后用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷， Melford Laboratories)诱导。让dAb的表达在30℃持续12-16小时。 发现大多数dAb存在于培养基中。因此，通过离心(8,000xg 30分钟)， 从培养基中分离出细胞，上清液用于纯化dAb。每升上清液中加入 30mL蛋白L琼脂糖(Affitech)，让dAb分批结合，同时搅拌2小时。 然后让树脂在重力下沉降1小时，再吸去上清液。将琼脂糖装入XK 50 柱(Amersham Phamacia)中，用10倍体积的PBS洗涤。结合dAb用 100mM甘氨酸(pH2.0)洗脱，含蛋白部分通过加入1/5体积的1M Tris (pH8.0)而中和。每升培养上清液中分离到20mg纯蛋白，其中含有 50∶50比例的单体与二聚体。

TAR1-5-19CYS的三聚化

将2.5ml 100μM TAR1-5-19CYS用5mM二硫苏糖醇还原，在室 温下放置20分钟。用PD-10柱(Amersham Pharmacia)给样品更换缓 冲液。该柱预先用5mM EDTA、50mM磷酸钠(pH6.5)平衡，按照制 造商的指南，使用样品并洗脱。将样品放在冰上备用。TMEA(三[2- 马来酰亚胺乙基]胺)购自Pierce Biotechnology。用100％DMSO(二甲 基亚砜)配制20mM TMEA贮液。发现TMEA浓度大于3∶1(dAb∶TMEA 的摩尔比)时，引起快速沉淀和蛋白质交联。当pH增加时也会增加 沉淀速率和交联速率。因此，使用100μM还原TAR1-5-19CYS，加 入25μM TMEA使蛋白质三聚化，让反应在室温下进行2小时。发 现在偶联反应进行时，加入添加剂(例如甘油或乙二醇)至20％(v/v)， 可显著减少三聚体沉淀。偶联后，SDS-PAGE分析表明，溶液中同 时存在单体、二聚体和三聚体。

三聚体TAR1-5-19CYS的纯化

每mL TMEA-TAR1-5-19cys反应物中加入40μL 40％冰乙酸， 将pH降至～4。再将样品加到1mL Resource S阳离子交换柱(Amersham Pharmacia)，该柱预先用50mM乙酸钠(pH4.0)平衡。用340-450mM 氯化钠的盐梯度、50mM乙酸钠(pH4.0)超过30倍柱体积，部分分离 二聚体和三聚体。仅含三聚体的部分用SDS-PAGE鉴定后合并，加 入1/5体积的1M Tris(pH8.0)将pH升至8。为了在浓缩步骤(采用5K 截止Viva离心浓缩器；Vivascience)中防止三聚体沉淀，向样品中加 入10％甘油。

体外功能性结合测定：TNF受体测定和细胞测定

采用TNF受体和细胞测定，测定三聚体对人TNFα的亲和力。 受体测定中的IC50约为0.3nM；细胞测定中的ND50约为3-10nM(例 如3nM)。

其它可能的TAR1-5-19CYS三聚体形式

采用以下试剂，也可将TAR1-5-19CYS制成三聚体：

PEG三聚体和委托合成的马来酰亚胺三聚体

Nektar(Shearwater)提供一系列多臂PEG，它们在PEG末端可以 被化学修饰。因此，采用在各臂末端具有马来酰亚胺官能团的PEG 三聚体，使dAb三聚体化的方式类似于以上概述的用TMEA的方式。 PEG也具有增加三聚体溶解度的优势，因而能防止聚集的问题。因 此，可以产生dAb三聚体，其中每个dAb具有与马来酰亚胺官能团 连接的C-末端半胱氨酸，所述马来酰亚胺官能团连接在PEG三聚体 上。

将多肽接头或铰链加到dAb的C-端。

或者(Gly4Ser)n(其中n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7)、或 者免疫球蛋白(例如IgG铰链区或随机肽序列(例如选自随机肽序列文 库)等小接头，可以添加在dAb和末端半胱氨酸残基之间。当用于制 备多聚体(例如二聚体或三聚体)时，这又将引入更大程度的柔性和各 个单体间的距离，这些会改善与靶标(例如多亚基靶标例如人TNFα) 的结合特性。

实施例9.针对人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的一批 单域抗体(dAb)的选择

该实施例说明了制备针对血清白蛋白的单域抗体(dAb)的方法。 描述了针对小鼠血清白蛋白(MSA)和人血清白蛋白(HSA)的dAb的选 择。该实验中使用了3个人噬菌体展示抗体文库，它们各自基于VH 的单一人构架(参见图13：基于V3-23/DP47和JH4b的dummy VH序 列)或Vκ(参见图15：基于o12/o2/DPK9和Jk1的dummy Vκ序列)， 其由NNK密码子编码的侧链多样性结合到互补决定区(CDR1、CDR2 和CDR3)中。

文库1(VH)：

在以下位置的多样性：H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、 H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98。

文库大小：6.2×109

文库2(VH)：

在以下位置的多样性：H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、 H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a、H100b。

文库大小：4.3×109

文库3(Vκ)：

在以下位置的多样性：L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、 L92、L93、L94、L96

文库大小：2×109

预选VH和Vκ文库分别对蛋白A和蛋白L通用配体的结合性， 使得在未选择文库中的大部分克隆是功能性的。以上所示的文库大 小对应于预选后的大小。

分别用各文库，针对血清白蛋白进行两轮选择。对于每次选择， 将浓度为100μg/ml的抗原/4ml PBS包被在免疫管(nunc)上。在第一 轮选择中，3个文库中的每一个都分别针对HSA(Sigma)和MSA (Sigma)进行选择。在第二轮选择中，来自第一轮选择的6个噬菌体 中的每一个都针对以下抗原进行选择：(i)再次用相同抗原(例如第一 轮MSA，第二轮MSA)和(ii)针对互换抗原(例如第一轮MSA，第二 轮HSA)，产生总共12个第二轮选择。在每种情况下，在第二轮选 择后，测定48个克隆与HSA和MSA的结合。按照Harrison等，Methods Enzymol.1996；267：83-109和标准ELISA方案(Hoogenboom等(1991) Nucleic Acids Res.，19：4133)所述，产生可溶性dAb片段，只是用2％ 吐温PBS作为封闭缓冲液，以及用蛋白L-HRP(Sigma)(用于Vκ)和 蛋白A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(用于VH)检测结合dAb。

在ELISA中测定dAb，得到大于背景的信号，表明与MSA、HSA 或这两者结合，不溶性形式仅结合塑料，但是所有都对血清白蛋白 具有特异性。对克隆进行测序(参见下表)表明，鉴定出了21个独特dAb 序列。所选Vκ dAb克隆之间的最小相似性(在氨基酸水平上)为86.25％ ((69/80)×100)；这是当所有多样化残基都不同(例如克隆24和34)时 的结果。所选VH dAb克隆之间的最小相似性为94％((127/136)× 100)。

然后，测定血清白蛋白结合dAb从溶液中捕获生物素化抗原的 能力。按照ELISA方案(同上)，只是ELISA板用1μg/ml蛋白L(对 于Vκ克隆)和1μg/ml蛋白A(对于VH克隆)包被。按照方案，从溶液 中捕获可溶性dAb，再用生物素化MSA或HSA和链霉抗生物素HRP 进行检测。生物素化MSA和HAS是按照制造商的使用说明书来制 备，其目的是为了获得平均2个生物素/血清白蛋白分子。在ELISA 中，鉴定出了24个克隆从溶液中捕获生物素化MSA。这其中有两个 (以下克隆2和38)也捕获生物素化HSA。然后，测定dAb对CM5 biacore芯片上包被的MSA的结合能力。发现8个克隆能结合biacore 上的MSA。

表8.

dAb(所有 都捕获生 物素化 MSA H 或 κ  CDR1 CDR2 CDR3 结合 biacore 上的 MSA ？ 捕获生 物素化 HSA？ Vκ文库3 模板 (dummy) κ XXXLX (SEQ ID NO：298) XASXLQS (SEQ ID NO：299) QQXXXXPXT (SEQ ID NO：300) 2，4，7，41， κ SSYLN (SEQ ID NO：301) RASPLQS (SEQ ID NO：302) QQTYSVPPT (SEQ ID NO：303) √所有4 个结合 38，54 κ SSYLN (SEQ ID NO：304) RASPIQS (SEQ ID NO：305) QQTYRIPPT (SEQ ID NO：306) √两个 结合 46，47，52，56 κ FKSLK (SEQ ID NO：307) NASYLQS (SEQ ID NO：308) QQVVYWPVT (SEQ ID NO：309) 13，15 κ YYHLK (SEQ ID NO：310) KASTLQS (SEQ ID NO：311) QQVRKVPRT (SEQ ID NO：312) 30，35 κ RRYLK (SEQ ID NO：313) QASVLQS (SEQ ID NO：314) QQGLYPPIT (SEQ ID NO：315) 9， κ YNWLK (SEQ ID NO：316) RASSLQS (SEQ ID NO：317) QQNVVIPRT (SEQ ID NO：318) 22， κ LWHLR (SEQ ID NO：319) HASLLQS (SEQ ID NO：320) QQSAVYPKT (SEQ ID NO：321) 23， κ FRYLA (SEQ ID NO：322) HASHLQS (SEQ ID QQRLLYPKT (SEQ ID NO：324)

NO：323) 24， κ FYHLA (SEQ ID NO：325) PASKLQS (SEQ ID NO：326) QQRARWPRT (SEQ ID NO：327) 31， κ IWHLN (SEQ ID NO：328) RASRLQS (SEQ ID NO：329) QQVARVPRT (SEQ ID NO：330) 33， κ YRYLR (SEQ ID NO：331) KASSLQS (SEQ ID NO：332) QQYVGYPRT (SEQ ID NO：333) 34， κ LKYLK (SEQ ID NO：334) NASHLQS (SEQ ID NO：335) QQTTYYPIT (SEQ ID NO：336) 53， κ LRYLR (SEQ ID NO：337) KASWLQS (SEQ ID NO：338) QQVLYYPQT (SEQ ID NO：339) 11， κ LRSLK (SEQ ID NO：340) AASRLQS (SEQ ID NO：341) QQVVYWPAT (SEQ ID NO：342) √ 12， κ FRHLK (SEQ ID NO：343) AASRLQS (SEQ ID NO：344) QQVALYPKT (SEQ ID NO：345) √ 17， κ RKYLR (SEQ ID NO：346) TASSLQS (SEQ ID NO：347) QQNLFWPRT (SEQ ID NO：348) √ 18， κ RRYLN (SEQ ID NO：349) AASSLQS (SEQ ID NO：350) QQMLFYPKT (SEQ ID NO：351) √ 16，21 κ IKHLK (SEQ ID NO：352) GASRLQS (SEQ ID NO：353) QQGARWPQT (SEQ ID NO：354) √ 25，26 κ YYHLK (SEQ ID NO：355) KASTLQS (SEQ ID NO：356) QQVRKVPRT (SEQ ID NO：357) √ 27， κ YKHLK (SEQ ID NO：358) NASHLQS (SEQ ID NO：359) QQVGRYPKT (SEQ ID NO：360) √ 55， κ FKSLK (SEQ ID NO：361) NASYLQS (SEQ ID NO：362) QQVVYWPVT (SEQ ID NO：363) √ VH文库1 (和2)模板 (dummy) H XXYXXX (SEQ ID NO：364) XIXXXGXXTXYADS VKG(SEQ ID NO：365) XXXX(XXXX)FDY (SEQ ID NO：366) 8，10 H WVYQMD (SEQ ID NO：367) SISAFGAKTLYADS VKG(SEQ ID NO：368) LSGKFDY (SEQ ID NO：369) 36， H WSYQMT (SEQ ID NO：370) SISSFGSSTLYADS VKG(SEQ ID NO：371) GRDHNYSLFDY (SEQ ID NO：372)

在所有情况下，构架与在相应dummy序列中的构架相同，其在 CDR中的多样性见上表。

在结合biacore上的MSA的8个克隆中，选择在大肠杆菌中高 度表达的2个克隆(克隆MSA16和MSA26)用于进一步研究(参见实 施例10)。MSA16和MSA 26的完整核苷酸序列和氨基酸序列见图 16。

实施例10.测定结合MSA的dAb MSA16和MSA26的小鼠亲和力 和血清半衰期

dAb MSA16和MSA26在大肠杆菌周质中表达，其纯化采用分 批吸附到蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)上，然后用甘氨酸 (pH2.2)洗脱。然后，通过抑制biacore分析纯化的dAb，测定Kd。简 而言之，对纯化MSA16和MS A26进行测试，以测定在高密度MSA 包被的biacore CM5芯片上达到200RU响应所需的dAb浓度。一旦 测出dAb所需浓度，将预期Kd左右的MSA抗原浓度范围与dAb预 混合并孵育过夜。然后以30μl/分钟的高流速，测定各预混物中dAb 与MSA包被的biacore芯片的结合。用所得曲线绘制Klotz曲线， 根据曲线估计对于MSA16的Kd为200nM，而对于MSA26则为70nM (图17A和图17B)。

然后，将克隆MSA16和MSA26克隆到表达载体中，所述载体 带有HA标记(核酸序列：TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA (SEQ ID NO：373)和氨基酸序列：YPYDVPDYA(SEQ ID NO：374))， 2-10mg量在大肠杆菌中表达，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech， Norway)并用甘氨酸(pH2.2)洗脱而从上清液中纯化。测定dAb的小鼠 血清半衰期。给CD1小鼠单次静脉注射约1.5mg/kg的MSA26和 MSA16。通过山羊抗HA(Abcam，UK)捕获和用4％Marvel封闭的蛋 白L-HRP(invitrogen)测定ELISA，分析血清水平。用0.05％吐温PBS 洗涤。在1x小鼠血清存在下，绘制已知浓度的dAb的标准曲线，以 保证与试验样品的可比性。用2区室模型建模，显示MSA26的tα 为0.16小时，tβ为14.5小时，曲线下面积(AUC)为465小时.mg/ml(数 据未显示)，MSA16的tα为0.98小时，tβ为36.5小时，AUC为913 小时.mg/ml(图18)。与HEL4(一种抗鸡卵清溶菌酶dAb)相比，这两 个抗MSA克隆具有相当长的半衰期，其tα为0.06小时，tβ为0.34 小时。

实施例11.VH-VH和Vκ-Vκ双特异性Fab样片段的产生

该实施例描述了制备VH-VH和Vκ-Vκ双特异性抗体(作为Fab样 片段)的方法。在构建各种所述Fab样片段之前，按照实施例9所述 的类似方法，首先从dAb文库中选出能结合所选靶标的dAb。分离 出一种能结合鸡卵溶菌酶(Sigma)的VH dAb即HEL4，也分离出能结 合TNFα受体(R和D系统)的第二VH dAb(TAR2h-5)。这些序列在序 列表中给出。通过选择和亲和力成熟，分离出能结合TNFα(TAR1-5-19) 的Vκ dAb，其序列也在序列表中给出。实施例9中描述的第二Vκ dAb (MSA26)(其序列见图17B)也可用于这些实验。

将来自含有上述4种dAb的表达载体的DNA用酶SalI和NotI 消化，切下dAb的DNA编码区。消化物通过琼脂糖凝胶电泳，纯化 出预期大小的条带(300-400bp)，切下该条带，再用Qiagen凝胶纯化 试剂盒(Qiagen，UK)进行凝胶纯化。再将编码dAb的DNA插入到CH 载体或Cκ载体中(图8和9)，如下表所示。

表9.

    dAb     靶抗原 dAb VH或   dAb Vκ   插入载   体中   标记   (C端)   抗生素     抗性 HEL4 鸡卵溶菌酶   VH   VH   Myc 氯霉素 TAR2-5 TNF受体   VH   Vκ   Flag 氨苄青霉素 TAR1-5-19 TNFα   Vκ   VH   Myc 氯霉素 MSA26 小鼠血清白蛋白   Vκ   Vκ   Flag 氨苄青霉素

VH CH和VH Cκ构建体共转化HB2151细胞。另外，Vκ CH和Vκ Cκ 构建体共转化HB2151细胞。将各共转化细胞系的培养物培养过夜(在 含有5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的2xTy中， 以维持对CH质粒和Cκ质粒的抗生素选择)。用过夜培养物接种新鲜 培养基(2xTy，10μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素)并培养至OD 0.7-0.9，然后加入IPTG进行诱导，以表达它们的CH构建体和Cκ构 建体。再通过蛋白A纯化(用于共转化的VH CH和VH Cκ)和MSA亲 和树脂纯化(用于共转化的Vκ CH和Vκ Cκ)，对表达的Fab样片段进 行纯化。

VH-VH双特异性

通过蛋白质凝胶电泳，测定VH CH和VH Cκ双特异性抗体的表 达。将凝胶印迹后，通过myc标记和flag标记，在蛋白质印迹上检 测Fab片段期望大小的条带，表明Fab样片段的VH CH和VH Cκ部分 都存在。然后，为了确定双特异性抗体的两个半边是否存在于同一Fab 样片段上，将ELISA板用100μl/孔3mg/ml鸡卵溶菌酶(HEL)的碳酸 氢钠缓冲液，在4℃包被过夜。该板再用2％吐温PBS封闭(按照实 施例1所述)，接着与VH CH/VH Cκ双特异性Fab样片段一起孵育。 通过非关联链，用9e10(一种结合myc标记的单克隆抗体，Roche)和 抗小鼠IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)，检测双特异性片段 与HEL的结合。VH CH/VH Cκ双特异性Fab样片段的信号为0.154， 相比之下，对于单独表达的VH Cκ链的背景信号为0.069。这证明Fab 样片段对靶抗原具有结合特异性。

Vκ-Vκ双特异性

在MSA亲和树脂上纯化共转化的Vκ CH和Vκ Cκ双特异性Fab 样片段之后，用所得蛋白质探测1μg/ml TNFα包被的ELISA板和 10μg/ml MSA包被的ELISA板。不出所料，当在两种ELISA板上用 蛋白L-HRP检测时，产生高于背景的信号(数据未显示)。这表明， 能够结合MSA的蛋白质部分(并因此而在MSA亲和柱上纯化)也能 在随后的ELISA中结合TNFα，这证实了抗体片段的双特异性。这 样的蛋白质部分再用于随后的两个实验。第一个，1μg/ml TNFα包被 的ELISA板用双特异性Vκ CH和Vκ Cκ Fab样片段进行探测，同时 也用对照即结合TNFα的dAb进行探测，该对照的浓度为经计算在 ELISA上得到相似信号的浓度。在2mg/ml MSA存在和不存在时， 用双特异性dAb和对照dAb探测ELISA板。双特异性孔的信号降低 超过50％，但dAb孔的信号却完全没有降低(参见图19a)。同一蛋白 也用于受体测定(有和没有MSA)，也显示出与MSA的竞争性(参见 图19c)。这证明MSA竞争性结合双特异性抗体和TNFα。

实施例12.对小鼠血清白蛋白和TNFα具有特异性的Vκ_Vκ双特异 性cys键合的双特异性抗体的产生

该实施例描述了通过二硫键的化学偶联制备对小鼠血清白蛋白 和TNFα都具有特异性的双特异性抗体片段的方法。MSA16(来自实 施例1)和TAR1-5-19 dAb都再克隆到具有C端半胱氨酸和没有标记 的基于pET的载体中。两种dAb表达水平均为4-10mg，用蛋白L- 琼脂糖亲和树脂(Affitiech，Norway)从上清液中纯化出来。半胱氨酸 标记的dAb再用二硫苏糖醇还原。TAR1-5-19 dAb再与二硫双吡啶 偶联，封闭二硫键的再形成，从而形成PEP 1-5-19同型二聚体。再 将两种不同dAb在pH6.5混合，促进形成二硫键并产生TAR1-5-19， MSA16 cys键合的异型二聚体。两种不同蛋白质缀合物的这种制备 方法最初由King等(King TP，Li Y Kochoumian L Biochemistry，1978， 第17卷：1499-506 Preparation of Protein Conjugates via intermolecular disulfide bond formation)描述的。通过阳离子交换将异型二聚体与单 体分开。通过SDS凝胶上存在预期大小的条带来证实分离。所得异 型二聚体种类在TNF受体测定中进行测定，发现其中和TNF的IC50 约为18nM。然后，用恒定浓度的异型二聚体(18nM)和系列稀释的MSA 和HAS，重复受体测定。适当浓度范围(最多2mg/ml)的HAS的存在， 并不引起二聚体抑制TNFα能力的下降。然而，加入MSA，以剂量 依赖性方式引起二聚体抑制TNFα能力的下降(图20)。这证明MSA 和TNFα竞争性结合cys键合的TAR1-5-19、MSA16二聚体。

数据汇总

上述实施例的实验中所得数据的汇总见附录4。

实施例13.抗小鼠TNFR1 dAb和抗人TNFR1 dAb的活性

表10.抗小鼠TNFR1 dAb的活性

 dAb 活性(IC50)  L929细胞测定  受体结合测定  TAR2m-19  10μM  2μM  TAR2m-20  n/d  150nM  TAR2m-21  400nM  n/d  TAR2m-24  1μM  1.3μM  TAR2m-21-23  1nM  n/d  TAR2m-21-07  10nM  n/d  TAR2m-21-43  6nM  n/d  TAR2m-21-48  6nM  n/d  TAR2m-21-10  30nM  n/d  TAR2m-21-06  100nM  n/d  TAR2m-21-17  300nM  n/d

n/d，未检出

表11.抗人TNFR1 dAb的活性

 dAb 活性(IC50)  HeLa IL-8细胞测定  受体结合测定  TAR2h-10  50nM  30nM  TAR2h-12  100nM  n/d  TAR2h-13  300nM  n/d  TAR2h-14  300nM  30nM  TAR2h-15  n/d  5nM  TAR2h-16  200nM  30nM  TAR2h-17  n/d  100nM  TAR2h-18  400nM  n/d  TAR2h-22  n/d  200nM  TAR2h-27  3000nM  30nM  TAR2h-29  300nM  300nM  TAR2h-32  100nM  n/d  TAR2h-34  n/d  300nM  TAR2h-35  800nM  n/d  TAR2h-41  30nM  8nM  TAR2h-42  10nM  15nM  TAR2h-44  300nM  10nM  TAR2h-47  n/d  8nM  TAR2h-51  n/d  80nM  TAR2h-67  300nM  n/d  TAR2h-10-1  n/d  10nM  TAR2h-10-2  n/d  11nM  TAR2h-10-3  n/d  11mM  TAR2h-10-4  n/d  8nM  TAR2h-10-5  n/d  11nM  TAR2h-10-7  30nM  n/d  TAR2h-10-27  10nM  2nM  TAR2h-10-55  20nM  n/d

n/d，未检出

MRC-5 IL-8释放测定

在以下MRC-5细胞测定中，评价了某些能结合人TNFR1的dAb 的活性。测定是基于在MRC-5细胞中TNF诱导的IL-8分泌，该测 定方法是Alceson，L等，Journal of Biological Chemistry 271：30517- 30523(1996)所述方法的改进方法，所述文献介绍了在HUVEC中IL- 1对IL-8的诱导作用。用MRC-5细胞代替HUVEC细胞系，通过评 价人TNFα对IL-8的诱导，测定了dAb的活性。简而言之，MRC-5 细胞接种在微量滴定板上，将这些板与dAb和人TNFα(300pg/ml)一 起孵育过夜。孵育后，吸出培养物上清液，通过夹心ELISA(R&D 系统)测定上清液中的IL-8浓度。与仅与TNFα一起孵育的对照孔相 比，抗TNFR1 dAb活性导致上清液中IL-8分泌降低。

实施例14.小鼠脓毒性休克模型

在良好建立的脓毒性休克综合征的实验模型中，评价抗TNFR1 dAb的体内功效(Rothe等，Circulatory Shock 44：51-56，(1995))。在该 模型中，LPS诱导的死亡取决于TNFR-1(p55)的活化。在该模型中， 用D-半乳糖胺(D-GaIN)使小鼠对LPS毒性敏感。在该项研究中，对 野生型动物致死的LPS剂量约为10ng。

腹膜内注射LPS(肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，Sigma， USA)和D-半乳糖胺(D-GaIN，Sigma，USA)。D-GalN-致敏(10mg/小鼠) 的对照小鼠在用LPS(10ng)攻击后18小时内死亡。在攻击后超过1 天的周期中，记录非致敏小鼠的死亡率。

给小鼠腹膜内注射双特异性配体(所述配体能结合小鼠TNFR1 和小鼠血清白蛋白(TAR2m-21-23 3U TAR7m-16；TAR7m-16在本文 中也称为MSA16))或ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)， 4小时后给予LPS。(参见表12)。在48小时内以4-6小时的间隔监 控存活情况。用存活率证明抗小鼠TNFR1 dAb的功效。

表12.

  治疗组     药物和剂量  LPS剂量   /小鼠   (ng)   动物数量 24小时时 存活数量     1     盐水     10     8     0/8     2     10mg/kg     ENBREL(entarecept；     Immunex Corporation)     10     8     8/8     3     5.4mg/kg     TAR2m-21-23 3U TAR7m-16     10     8     4/8     4     1mg/Kg     TAR2m-21-23 3U TAR7m-16     10     8     2/8     5     5.4mg/kg     TAR2m-21-23 3U TAR7m-16     0     2     2/2

TAR2m-21-23 3U TAR7m-16是含有dAb并能结合小鼠TNFR1 的双特异性配体，小鼠TNFR1通过肽接头与能结合小鼠血清白蛋白 的dAb结合。编码TAR2m-21-23 3U TAR7m-16的核苷酸序列和双 特异性配体的氨基酸序列分别见下列SEQ ID NO：375和SEQ ID NO： 376。

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCG

TCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCC

GCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGT

GGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTC

CAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTAT

ATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAG

GGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGG

CGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCSGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAT

CTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTATTAAGCAT

TTAAAGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGC

ATCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAG

ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGT

CAACAGGGGGCTCGGTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAA

ACGGGCGGCCGCAGAACAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT

(SEQ ID NO：375)

EVQLLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGR

GTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQ

GTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKH

LKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

QQGARWPQTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN

(SEQ ID NO：376)

在TAR2m-21-23 3U TAR7m-16治疗组中有幸存者，这证明抗 TNFR1 dAb对体内抑制受体活性是有效的，其结果证明效果是剂量 依赖性的。此外，TAR2m-21-23 3U TAR7m-16的治疗功效比 ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)的功效更好。仅用 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16治疗的动物(第5组，没有LPS攻击)的 存活率也证明，TAR2m-21-23 3U TAR7m-16无毒并且在体内通过受 体交联而不激动受体。

进一步研究证明，当TNFα不存在时，抗TNFR1 dAb不激动 TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)。将L929细胞在分别含有以下 成分之一的培养基中培养：不同浓度的TAR2m-21-23单体、与市售 抗myc抗体(9E10)交联的TAR2m-21-23单体、TAR2m-21-23 3U TAR7m-16或TAR2m-21-23 40K PEG。就与抗myc抗体交联的 TAR2m-21-23单体而言，将dAb和抗体按2∶1比例混合，在室温下 预孵育1小时，刺激体内免疫交联效应，然后进行培养。浓度为3000nM 的TAR2m-21-23单体与L929细胞一起孵育。TAR2m-21-23单体和 抗Myc抗体与浓度为3000nM的dAb一起孵育。将浓度为25nM、 83.3nM、250nM、833nM和2500nM的TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 与细胞一起孵育。将浓度为158.25nM、527.5nM、1582.5nM、5275nM 和15825nM的TAR2m-21-23 40K PEG与细胞一起孵育。孵育过夜后， 按照L929细胞的细胞毒性测定所述，评价细胞存活率。结果表明， 与不同数量的dAb一起孵育，不导致培养物中无活力细胞数量的增 加。将L929细胞与10nM、1nM和0.1nM市售抗TNFR1 IgG抗体一 起孵育，导致以剂量依赖方式增加无活力细胞，因此证明了这些细 胞对TNFR1介导的激动作用的敏感性(图26)。

实施例15.慢性炎性疾病的模型

A.小鼠胶原诱发的关节炎模型

给DBA/1小鼠注射一次Arthrogen-CIA佐剂和Arthrogen-CIA胶 原(MD-biosciences)的乳剂。在第21天，从研究中除去具有高关节炎 评分的动物，剩下的动物分成10组，雄性和雌性动物数量相等。在 第21天，治疗开始用腹膜内注射盐水、ENBREL(entarecept； Immunex Corporation)或TAR2m-21-23 40k PEG，并持续28天。对动 物四肢的每肢都进行临床关节炎评分，分值为0-4，0分代表正常肢， 4分代表涉及多关节的最严重的发炎肢。

在该模型中，四肢关节炎评分总和从最大的16降至(a)14-15，(b) 12-15，(c)10-15，(d)9-15，(e)7-15，(f)5-15，(g)3-15，或(h)1-15 是有益结果。可产生的有益结果是四肢关节炎评分总和为0、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。与未处理的对 照组相比，关节炎发作延迟也是有益结果。

临床评分清楚表明，与盐水对照相比，用TAR2m-21-23 40k PEG 进行治疗，对抑制关节炎发展具有非常好的作用，而且TAR2m-21-23 40k PEG治疗比用ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)更 好。这首次证明了抑制TNFR1对治疗慢性炎性疾病模型是有效的。

B.小鼠IBD和关节炎的ΔARE模型

在TNF mRNA的3′富含AU的元件(ARE)中带有定向缺失的小 鼠(称为TnfΔARE小鼠)过量产生TNF并发生炎性肠病，该病与节段性 回肠炎在组织病理学上相似。(Kontoyiannis等，J.Exp.Med.196： 1563-74(2002))。在这些小鼠中，节段性回肠炎样疾病在4-8周龄时 发生，并且这些动物还出现了类风湿性关节炎的临床症状。

在TnfΔARE小鼠，评价能结合小鼠TNFR1的dAb抑制节段性回 肠炎样病理和关节炎的功效。ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)用作阳性对照。按照表13所示的给药和剂量方案，将这 些药物通过腹膜内注射给予。

所研究的dAb包括：

1)具有一个40kD PEG部分的TAR2m-21-23 PEG化；

2)能结合小鼠TNFR-1和小鼠血清白蛋白的双特异性TAR2m- 21-23 3U TAR7m-16。

表13.

  组别     治疗     剂量   给药次数   动物数量     6 ENBREL (entarecept； Immunex Corporation) (每周用药3次)     10mg/kg     8     10     5 TAR2m-21-23 40kD PEG (每周用药2次)     1mg/kg     8     10     4 TAR2m-21-23 40kD PEG (每周用药2次)     10mg/kg     8     10     3 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 (每周用药2次)     1mg/kg     8     10     2 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 (每周用药2次)     10mg/kg     8     10     1 盐水     NA     8     10

在给药周期结束时，处死小鼠，切下回肠末端和近侧结肠进行 分析。

对于组织学分析，将组织样品切片并用苏木精和伊红染色，用 半定量评分系统对急性和慢性炎症进行评分。评分规定如下：急性 炎症评分0＝0-1多形核(PMN)细胞/高倍视野(PMN/hpf)；1＝2-10 PMN/hpf粘膜内；2＝11-20 PMN/hpf粘膜内；3＝21-30 PMN/hpf粘 膜内或11-20 PMN/hpf延伸到粘膜肌层下；4＝＞30 PMN/hpf粘膜内 或＞20 PMN/hpf延伸到粘膜肌层下；慢性炎症评分0＝0-10单核白细 胞(ML)/hpf(ML/hpf)粘膜内；1＝11-20 ML/hpf粘膜内；2＝21-30 ML/hpf粘膜内或11-20 ML/hpf延伸到粘膜肌层下；3＝31-40 ML/hpf 粘膜内或滤泡增生；和4＝＞40 ML/hpf粘膜内或＞30 ML/hpf延伸到 粘膜肌层下或滤泡增生。

按照以下系统，每周对关节炎的宏观表型体征进行评分：0＝没 有关节炎(正常外观和屈曲)；1＝轻度关节炎(关节变形)；2＝中度关节 炎(肿胀，关节变形)；3＝重度关节炎(严重受损的运动)。

在小鼠关节炎ΔARE模型中，TAR2m-21-23 dAb证明有良好的 体内功效，与40kD PEG化单体(TAR2m21-23 40kD PEG)和双特异 性抗TNFR1/抗SA形式(TAR2m-21-23 3U TAR7m-16)一样。在第9 周，TAR2m-21-23和TAR2m-21-23 3U TAR7m-16治疗组的平均关 节炎评分小于0.4。相比之下，盐水对照组的中度至严重关节炎的平 均关节炎评分＞1.0。与TAR2m-21-23和TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 (每周用药2次)相比，用ENBREL(entarecept；Immunex Corporation) 治疗组(每周用药3次)的平均评分为0.5-1.0。这些结果表明，用能结 合TNFR1的dAb形式的疗法，是高度有效的抗关节炎疗法，所研究 的PEG化dAb和双特异性dAb形式都是对慢性炎性疾病十分有效的 药物。而且，这些结果还证明，能结合TNFR1的dAb仅以拮抗方式 结合受体。

C.小鼠IBD DSS模型

给予小鼠溶于饮用水的葡聚糖硫酸钠(DSS)可诱发IBD。(参见例 如Okayasu I.等，Gastroenterology 98：694-702(1990)；Podolsky K.，J. Gasteroenterol.38 supp1 XV：63-66(2003))。无幽门螺杆菌(H.pylori) 的成年BDF1小鼠笼养2周，稳定它们的昼夜节律。所有小鼠都单独 放在带有专门的无病原体(SPF)屏障单元的通风笼子里，在12小时光 -暗周期下。让动物随意进食饮水。

研究进行7天。饮用水含有5％DSS，用于整个研究阶段中。所 有动物在1-7天的早晨(0900-1000)和傍晚(1600-1700)进行治疗。(参 见表14)。第1天相当于单次预防剂量。所有动物每天称重，任何腹 泻发生率都记录下来。在最后一次治疗后24小时，处死所有动物， 在处死前40分钟给予溴脱氧尿苷脉冲。从动物身上切下远侧大肠。 将远侧大肠的小样品放在“RNAlater”中，剩余部分在Carnoy氏固 定剂中固定，石蜡包埋，切片(非连续切片/每玻片)并用苏木精和伊红 染色。切片用目测评价IBD严重程度并给予严重程度评分。进行组 织学分析，测定平均损害面积(溃疡面积)、平均上皮面积和平均壁内 炎症面积。

采用Zeiss Axiohome显微镜，大肠H&E横切片可用于记录一系 列组织尺寸，这可准确量化面积。对于每个横切片，可以测量上皮 加上固有层的面积和结缔组织面积。然后可单独计算出上皮面积， 差就是固有层面积。在正常组织中，该组织对面积的相对贡献约为 10％，但是它随炎症的增加而上升。因此上皮∶固有层的相对比例发 生改变。

随着严重程度增加，该面积的深度变狭窄(由于溃疡)且结肠长度 变短。这些现象共同引起内腔横切面面积增加。因此，这一参数可 用于确定疾病的严重程度。

组织样品可通过显微镜观察并进行严重程度评分，其中0＝无 炎症；1＝隐窝底部周围轻度炎症；2＝大量炎症浸润，粘膜结构被 破坏；3＝大量炎症浸润，粘膜结构被破坏以及溃疡。

在该模型中，相对于盐水对照组严重程度评分而言，当治疗导 致严重程度评分下降，就表明有效。例如治疗组严重程度评分可以 降低0.1至约1、1至约2、或2至约3。评分约2以下、1至约2、 或1以下，表明有效。

9组(每组6只)动物如下进行治疗：

表14.

  组别     1  DSS/饮用水     2  DSS/饮用水+ip PEG TAR2m-21-23，10mg/kg 1x/d     3  DSS/饮用水+ip PEG TAR2m-21-23，1mg/kg 1x/d     4  DSS/饮用水+ip盐水     5  DSS/饮用水+经口管饲PEG TAR2m-21-23，0.25mg/动  物2x/d     6  DSS/饮用水+经口管饲盐水     7  DSS/饮用水+ip给予+ve对照，例如固醇     8  DSS/饮用水+经口管饲+ve对照，例如5’氨基水杨酸  或类似物     9  未治疗动物

经口管饲将给予ZANTAC(盐酸雷尼替丁；GlaxoSmithKline)。

D.小鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型

对抗TNFR1 dAb在小鼠亚慢性吸烟(TS)模型中疾病发展的功效 进行评价。(参见例如Wright JL和Churg A.，Chest 122：306S-309S (2002))。抗小鼠TNFR1 dAb经腹膜内注射给予，每48小时一次(在 第一次暴露给TS之前24小时开始)并且以血清半衰期延长形式(例如 包含抗SA dAb的PEG化、双特异性配体)给予。

或者，抗TNFR1 dAb将通过鼻内给药方式给予，每24小时一 次(在第一次暴露给TS之前4小时开始)并且以单体dAb给予。用 ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)作为阳性对照。每天都 接触TS，研究持续1-2周。(参见例如Vitalis等，Eru.Respir.J.，11： 664-669(1998))。最后一次TS暴露之后，分析支气管肺泡灌洗的总 细胞计数和细胞分类计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨 噬细胞和T淋巴细胞亚类。将肺叶在10％缓冲福尔马林中固定，分 析组织切片中肺泡和肺泡管的增大、小气管壁增厚情况，并进行细 胞计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细 胞亚类。因ES暴露而升高的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细 胞和T-淋巴细胞亚类数目的下降，以及TS诱导的肺泡和肺泡管的增 大和小气管壁增厚的降低，证明了功效。

实施例16.重组嵌合TNFR1分子的构建和表达

该实施例说明了由不同鼠TNFR1域和人TNFR1域组成的分子 的制备方法(Banner DW等，Cell，75(3)：431-45(1993))，使得该分子含 有4种已定义的TNFR1胞外区，但是这些在小鼠和人TNFR1蛋白 间的衍生差异是不同的。根据不同结构域的作用和功能，所产生的 嵌合受体共享人TNFR1和小鼠TNFR1的特性。该分子提供对结合 人或小鼠TNFR1的dAb、抗体及其抗原结合片段和其它分子(例如有 机化合物、NCE；或蛋白质域，例如亲和体、LDL受体域或EGF域) 的结构域特异性的评价方法。

方法

将人和小鼠TNFR1序列先通过EcoRI和NotI限制性内切核酸 酶位点克隆到毕赤酵母表达载体pPicZoα(Invitrogen)中。模板小鼠 TNFR1 DNA(因此嵌合受体构建体结束于鼠域4)含有3′6x组氨酸标 记。人TNFR1(因此嵌合受体构建体结束于人域4)在序列的3′端同时 含有Myc和6x组氨酸标记。

按照标准PCR条件，采用RubyTaq DNA聚合酶(USB Corporation， Cleveland，Ohio)、100ng模板DNA(包含全长mTNFR1或hTNFR1 DNA相关DNA小量制备物模板)，进行起始PCR。

典型的PCR反应如下进行：含聚合酶的25μl 10X RubyTaq PCR 缓冲液；2μl第一引物(来自10μM贮液)；2μl第二引物(来自10μl 贮液)；1μl(100ng)全长TNFR1模板DNA；20μl dH2O(至终体积50μl)。 反应在薄壁管中进行，并放在热循环仪中，其中按照以下参数进行 反应。

开始变性     3分钟     94℃ 变性 退火(25次循环) 延伸     30秒     94℃     30秒     55℃     1分钟     72℃ 最终延伸     10分钟     72℃

用于产生嵌合构建体的起始PCR反应的概述

    构建体* PCR次数-所用引物     模板     MHHH   PCR1-1和12     小鼠   PCR2-2和3     人     HMHH   PCR1-1和9     人   PCR2-6和13     小鼠   PCR3-2和4     人     HHMH   PCR1-1和10     人   PCR2-7和14     小鼠   PCR3-2和5     人     HHHM   PCR1-1和11     人   PCR2-2和8     小鼠     HMMM   PCR1-1和9     人   PCR2-2和6     小鼠

*注释：H＝人结构域；M＝小鼠结构域；例如MHHH＝小鼠结构域1，人结构域2-4。

将这些起始PCR所产生的PCR产物从1％琼脂糖凝胶上切下来， 用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，然后洗脱到50μl dH2O中。

用于产生嵌合TNFR1构建体的引物

引物编号 引物序列 引物1  GCCAGCATTGCTGCTAAAGAA(SEQ ID NO：605) 引物2  GGTCGACGGCGCTATTCAG(SEQ ID NO：606) 引物3  CTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGC(SEQ ID NO：607) 引物4  GTGTGTGGCTGCAGGAAGAAC(SEQ ID NO：608) 引物5  CTGCCATGCAGGTTTCTTTC(SEQ ID NO：609) 引物6  CTGCAGGGAGTGTGAAAAGGG(SEQ ID NO：610) 引物7  GTGTGTGGCTGTAAGGAGAACC(SEQ ID NO：611) 引物8  CTGCCATGCAGGGTTCTTTC(SEQ ID NO：612) 引物9  TCACACTCCCTGCAGTCCG(SEQ ID NO：613) 引物10  CAGCCACACACGGTGTCCCGG(SEQ ID NO：614) 引物11  CCTGCATGGCAGGTGCACACGG(SEQ ID NO：615) 引物12  TCACACTCCCTGCAGACTG(SEQ ID NO：616) 引物13  CAGCCACACACCGTGTCCTTG(SEQ ID NO：617) 引物14  CCTGCATGGCAGTTACACACGG(SEQ ID NO：618)

SOE PCR

装配PCR(也称为′pull-through′或剪接重叠延伸(SOE)，参见Gene， 15：77(1)：61-8(1989))使初次PCR产物无需消化或连接而联合在一 起，使用初次PCR产物互补末端。在该过程中，初次产物联合在一 起并变性，接着在Taq DNA聚合酶和dNTP存在下，让它们的互补 末端一起退火。重复退火和延伸多次循环，导致互补链补平，产生 全长模板。添加邻接全长构建体盒的引物，进行常规PCR，扩增装 配产物。进行SOE PCR，使来自上述起始PCR的不同TNFR1域一 起退火并扩增。装配SOE PCR如下进行：含MgCl2的40μl 10×PCR 缓冲液；～2μl(100ng)起始PCR1的纯化产物；～2μl(100ng)起始PCR2 的纯化产物；36μl dH2O(至终体积80μl)。在以下装配步骤后加入SOE 引物混合物：2μl 5′侧翼引物(引物1)；2μl 3′侧翼引物(引物2)；10μl 10× PCR缓冲液；6μl dH2O(至终体积20μl)。

使用下述程序进行PCR反应。起始装配循环需要约45分钟， 然后将热循环仪设置停顿在94℃。20μl引物混合物加入到各反应物 中并混合。

步骤1装配

开始变性     5分钟     94℃ 变性 退火(25次循环) 延伸     1分钟     94℃     1分钟     55℃     1分钟     72℃

步骤2扩增(停顿在94℃，然后加入引物混合物)

变性 退火(25次循环) 延伸     1分钟     94℃     1分钟     55℃     1分钟     72℃

将3-5μl各反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳，检查PCR产物。

3)将装配TNFR1嵌合体克隆到毕赤酵母表达载体中

pPicZα载体(Invitrogen)依次用EcoRI和NotI酶消化，再用 Chromaspin TE-1000凝胶过滤柱(Clontech，Mountain View，CA)纯 化。

4)将TNFR1嵌合构建体转化到大肠杆菌中

连接后的嵌合构建体转化到HB2151电感受态(electrocompetent) 大肠杆菌细胞中，在低盐LB培养基中回收1小时，然后接种在含有 0.25μg/ml零霉素(ZEOCIN)、含腐草霉素D的抗生素制剂(Cayla， Toulouse，法国)的低盐LB琼脂上，在37℃培养24小时。单菌落经 序列证实，以保证表达载体内嵌合构建体有正确序列，大规模 Maxiprep质粒制备物由各嵌合构建体载体组成。

所制备的嵌合构建体的核苷酸序列见下文。嵌合构建体根据其 结构域来源而命名(从左到右是域1至域4)。例如，HMMM含有人 域1和小鼠域2-4。含有小鼠域4的嵌合蛋白仅具有His标记并且缺 乏跨膜区和域4之间的间隔区。

HMMM

AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT

GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG

GGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGCCTCAGTTGC

AAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGCTGACAAGGACA

CGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTG

CGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAAC

ACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCC

ACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCA

TTAATGA(SEQ ID NO：619)

HHHM

AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT

GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG

GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC

TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA

CCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG

CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC

ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCC

ACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCA

TTAATGA(SEQ ID NO：620)

HHMH

AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT

GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG

GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC

TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA

CCGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTG

CGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAAC

ACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA

ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG

CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA

GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQ ID NO：621)

HMHH

AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT

GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG

GGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAGTTGC

AAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGCTGACAAGGACA

CGGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG

CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC

ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA

ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG

CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA

GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQ ID NO：622)

MHHH

AGCTTGTGTCCCCAAGGAAAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGT

GCCACAAAGGAACCTACTTGGTGAGTGACTGTCCGAGCCCAGGGCGGGATACAGTCTGCAG

GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC

TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA

CCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG

CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC

ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA

ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCIACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG

CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA

GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQ ID NO：623)

5)TNFR1嵌合构建体的制备及转化到巴斯德毕赤酵母中

将通过各大量制备(maxiprep)产生的质粒DNA用稀有切割限制 内切核酸酶PmeI消化，以便使DNA线性化，然后进行毕赤酵母转 化。线性化DNA再通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而纯化，然后重悬 于30μl dH2O。10μl线性化DNA溶液与80μl电感受态(electro- competent)KM71H毕赤酵母细胞混合5分钟，然后进行电穿孔(1.5kV， 200Ω，25μF)。细胞立即用YPDS恢复并在30℃孵育2小时，然后接 种在在含有100μg/ml零霉素(ZEOCIN)、含腐草霉素D的抗生素制剂 (Cayla，Toulouse，法国)的YPDS琼脂板上培养2天。

6)构建体在毕赤酵母中的表达

挑取各构建体的单个转化菌落，接种到5ml BMGY(作为起子培 养物)中，在30℃培养24小时。用该培养物接种500ml BMGY培养 基，在30℃培养24小时，然后在室温下以1500-3000g离心5分钟 收获细胞。将细胞重悬于100ml BMMY中，培养4天，同时交错增 加甲醇浓度(第1天0.5％，第2天1％，第3天1.5％，第4天2％)。 表达后，以3300g离心15分钟，回收上清液。

7)用Nickel树脂纯化TNFR1嵌合构建体

培养上清液先加入10mM终浓度的咪唑和2×PBS来缓冲。在室 温下加入Nickel-NT A树脂，分批吸附His-标记的蛋白质达4小时(振 荡)。上清液/树脂混合物再倒入poly-prep柱(Biorad)。树脂再用10倍 体积的2×PBS洗涤，用250mM咪唑1×PBS洗脱。更换缓冲液后， 用EndoH脱糖基化酶使嵌合构建体表达脱糖基化，再通过SDS-PAGE 得以证实。

PCR过程中所用的模板DNA序列

人(Homo sapiens)TNFR1(胞外区Genbank检索号33991418)

CTGGTCCCTCACCTAGGGGACAGGGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTCCCCAAGG

AAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG

AACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGG

AGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCA

GCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAG

TGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGG

AGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTG

CACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTC

TTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAG

TGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCA

GGCACCACA(SEQ ID N0：624)

所编码的人TNFR1胞外区具有下列氨基酸序列。

LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECE

SGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLF

QCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLP

QIENVKGTEDSGTT(SEQ ID N0：603)

鼠(小家鼠(Mus musculus))TNFR1(胞外区Genbank检索号 31560798)

CTAGTCCCTTCTCTTGGTGACCGGGAGAAGAGGGATAGCTTGTGTCCCCAAGGA

AAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGTGCCACAAAGGA

ACCTACTTGGTGAGTGACTGTCCGAGCCCAGGGCGGGATACAGTCTGCAGGGA

GTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAG

TTGCAAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGC

TGACAAGGACACGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGA

GTGAGACACACTTCCAGTGCGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGA

CAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAACACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCT

TTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCCACTGCAAGAAAAATGAGGAG

TGTATGAAGTTGTGCCTACCTCCTCCGCTTGCAAATGTCACAAACCCCCAGGAC

TCAGGTACTGCG(SEQ ID NO：625)

所编码的鼠(小家鼠(Mus musculus))TNFR1胞外区具有下列氨基 酸序列。

LVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRECE

KGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHF

QCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLP

PPLANVTNPQDSGTA(SEQ ID NO：604)

实施例17.抗TNFR1 dAb的结构域特异性

该实施例描述了用于确定结合TNFR1的dAb的结构域特异性的 方法。该方法采用表面等离子共振(SPR)(Detection of immuno- complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction，gratings.′Biosensors.1987-88；3(4)：211-25.)，以确定抗体 与固定在SPR芯片表面的完全人或小鼠生物素化TNFR1结合的能 力，当抗体孵育并与过量的实施例16所述的嵌合分子平衡之后。在 该测定中，抗TNFR1 dAb流过TNFR1表面，产生SPR信号，表示 与固定在SPR芯片上的TNFR1结合的dAb量。如果dAb经预孵育 并用包含TNFR1域(该结构域尤其可与dAb结合)的嵌合分子平衡， 那么与单独的dAb相比，该混合物流过TNFR1表面，将会产生更弱 的SPR信号。然而，如果dAb经预孵育并用不包含TNFR1域(该结 构域尤其可与dAb结合)的嵌合分子平衡，那么与单独的dAb所得到 的信号相比，该混合物流过TNFR1表面，将会产生大致相同的SPR 信号。

方法

1)SPR芯片TNFR1表面的产生

TNFR1表面的选择由待测抗TNFR1dAb的物种特异性来决定。 因此，用人TNFR1包被的表面来评价抗人TNFR1 dAb，并且用小 鼠TNFR1包被的芯片来评价抗小鼠TNFR1 dAb。

生物素化TNFR1在合适SPR缓冲液中稀释，并在BIACORE 3000 SPR仪器(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)中通过链霉抗生 物素(SA)传感器芯片。低流速(5-10μl/分钟)用于使生物素化TNFR1 和链霉抗生物素表面之间的接触时间最大化。持续流速，直到链霉 抗生物素表面被生物素化材料饱和，以产生具有最大TNFR1表面的 芯片。芯片通常结合几百个到几千个生物素化材料的SPR响应单元。

2)SPR芯片上抗TNFR1响应的效价

一个成功的竞争实验需要抗TNFR1 dAb的起始最佳浓度，使得 最少量的dAb流过其表面，给出明显的SPR信号。在某些浓度范围 内，dAb可以剂量依赖性方式结合表面，使得dAb结合的RU数能 反映流过芯片表面的dAb浓度。

为了确定这样的剂量依赖性浓度范围，在10倍系列稀释的 Biacore缓冲液(范围从1∶10稀释到1∶1,000,000稀释)中滴定抗TNFR1 dAb。然后将稀释液单独且序贯注射到TNFR1芯片表面，从最稀的 样品开始。测定各稀释液所得的最大RU数。必要时，每次注射后， TNFR1表面用合适的SPR再生缓冲液进行再生，以除去结合的抗 TNFR1 dAb。采用该方法，测出产生约100RU信号所需的抗TNFR1 dAb的最小浓度。

3)抗TNFR1 dAb/嵌合体的预平衡

一旦确定了抗TNFR1 dAb的最佳浓度，就可建立抗TNFR1 dAb/ 嵌合TNFR1混合物。建立混合物，使得抗TNFR1 dAb的终浓度与 先前测定的最佳浓度相同。反应通常在100μl体积(含有50微升2x 浓缩的抗TNFR1 dAb、40微升Biacore缓冲液和10微升纯化嵌合蛋 白)中进行。最终混合物通常的浓度为约10-100μM嵌合蛋白和约10- 100nM抗TNFR1 dAb。在室温下让混合物平衡30分钟。

4)竞争性Biacore实验

平衡后，各抗TNFR1 dAb/嵌合TNFR1混合物序贯通过TNFR1 SPR表面并测定响应单元数目。各混合物注射后，表面经再生以除 去结合的抗TNFR1 dAb，然后注射下一种混合物。用不同嵌合体所 产生的不同响应，可以测出结合特定dAb的TNFR1域。

这些研究表明，TAR2m-21-23结合小鼠TNFR1的域1， TAR2h-205结合人TNFR1的域1，TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、 TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10和 TAR2h-185-25结合人TNFR1的域3。

实施例18.筛选方法

实施例16中描述的这些嵌合受体蛋白质可用于测定或筛选，以 分离出能结合TNFR1内特定结构域的物质(例如抗体、dAb、化合物)。 简而言之，这些方法描述了将嵌合蛋白加入到粗抗体制备物中，然 后通过ELISA或表面等离子共振筛选TNFR1结合。另外，它们描述 了在表面(例如ELISA板或SPR芯片)包被的嵌合蛋白的用途并通过 测定它们与该表面上嵌合蛋白的结合而筛选抗体。

1)可溶性ELISA筛选

该方法可用于从庞大的未知特异性的抗体或抗体片段库中，快 速分离出能结合TNFR1特定结构域的抗体或抗体片段(例如dAb)。

96孔测定板用100μl/孔的嵌合TNFR1在4℃包被过夜。各孔用 0.1％TPBS(含有浓度0.1％的吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)洗涤3次。 加入200μl/孔的1％TPBS封闭该板并将该板在室温下孵育1-2小时。 各孔用PBS洗涤3次，然后加入含有可溶性抗体或抗体片段(其含有 c-Myc表位标记)/50μl 0.2％TPBS的50μl细菌上清液或periprep。将 该板在室温下孵育1小时。然后，将该板用0.1％TPBS(0.1％吐温- 20/PBS)洗涤5次，再向各孔中加入100μl第一抗c-Myc小鼠单克隆 抗体/0.1％TPBS，将该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗 体溶液，再将该板用0.1％TPBS洗涤5次。然后加入来自山羊的100μl 预稀释的抗小鼠IgG(Fc特异性)HRP缀合物(Sigma产品目录号： A0168)，将该板在室温下孵育1小时。弃去第二抗体，将该板用0.1％ TPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔中加入50μl TMB过氧 化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。加入50μl 1M盐酸， 终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔板阅读器上读出该板 在450nm处的OD值。粗制细菌上清液或peripreps中存在的、能结 合嵌合蛋白内存在的TNFR1域的这些抗体，将会给出较强烈的ELISA 信号，而那些不能结合的则不能给出信号。

2)竞争性ELISA筛选

该方法可以用于快速筛选一系列能结合TNFR1的不同粗抗体或 抗体片段制备物，以测定它们的结构域结合特异性。

96孔测定板用100μl/孔的鼠或人TNFR1(人或小鼠)在4℃包被 过夜。各孔用0.1％TPBS(含有浓度0.1％的吐温-20的磷酸缓冲盐溶 液)洗涤3次。加入200μl/孔的1％TPBS(1％吐温-20/PBS)封闭该板， 然后将该板在室温下孵育1-2小时。各孔用PBS洗涤3次。同时， 细菌上清液或peripreps用预优化浓度的嵌合TNFR1蛋白/溶液预平 衡。将含有可溶性抗体或抗体片段的50μl该粗制细菌制备物/嵌合蛋 白混合物加入到ELISA板中。将该板在室温下孵育1小时。然后， 将该板用0.1％TPBS(0.1％吐温-20/PBS)洗涤5次，再向各孔中加入 100μl第一检测抗体(或蛋白A-HRP或蛋白L HRP)的0.1％TPBS，将 该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗体溶液，再将该板用0.1％ TPBS洗涤5次。如有必要，加入来自山羊的100μl预稀释的第二抗 体-HRP缀合物，将该板在室温下孵育1小时。然后弃去第二抗体， 将该板用0.1％TPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔中加入 50μl TMB过氧化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。加入50μl 1M盐酸，终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔板阅读器上 读出该板在450nm处的OD值。ELISA信号减少，表明抗体与板上 包被的嵌合TNFR1域、而不是完整TNFR1结合，因此，该抗体能 结合嵌合蛋白内的一个结构域。

3)对与参考抗体或抗体片段竞争性结合TNFR1的抗体和抗体片段 的竞争性ELISA筛选

该方法可以用于快速筛选一系列能结合TNFR1的不同粗抗体或 抗体片段制备物，所述抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段(例如 TAR2m-21-23)竞争性结合TNFR1或者结合TNFR1的所需结构域(例 如域1)。该方法采用含有不同可检测标记(表位标记)的参考抗体或抗 体片段和试验抗体或抗体片段(例如有待筛选的抗体群体)。

96孔测定板用100μl/孔的鼠或人TNFR1在4℃包被过夜。各孔 用0.1％TPBS(含有浓度0.1％的吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)洗涤3 次。加入200μl/孔的1％TPBS(1％吐温-20/PBS)封闭该板，将该板在 室温下孵育1-2小时。各孔用PBS洗涤3次。同时，待测粗抗体制 备物与预优化浓度的参考抗体或抗体片段(例如域1-结合抗体； TAR2m-21-23)/溶液混合。正如所述，重要的是该抗体不包含与有待 筛选结构域结合特异性的抗体相同的检测标记。将50μl该粗制抗体/ 参考抗体混合物加入到ELISA板中。将该板在室温下孵育1小时。 然后，将该板用0.1％TPBS洗涤5次，向各孔中加入100μl第一检 测抗体(其结合仅存于待筛选的抗体群体中的标记)的0.1％TPBS，将 该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗体溶液，再将该板用0.1％ TPBS洗涤5次。然后，加入能识别第一检测抗体的100μl预稀释的 第二抗体-HRP缀合物，将该板在室温下孵育1小时。弃去第二抗体 溶液，将该板用0.1％TPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔 中加入50μl TMB过氧化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。 加入50μl 1M盐酸，终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔 板阅读器上读出该板在450nm处的OD值。应该平行地进行一个单 独而平行的ELISA，采用该方法，但不加参考抗体或抗体片段。与 用相同抗体制备物、而没有竞争性参考抗体或抗体片段所得到的 ELISA信号相比，在参考抗体或抗体片段存在时ELISA信号减少， 表明特定抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段竞争性结合TNFR1 域，并且与参考抗体或抗体片段一样结合同一TNFR1域。

4)SPR筛选

可以容易地修改上述ELISA方法，以便采用表面等离子共振， 例如用BIACORE 3000 SPR仪器(Biacore International AB，Uppsala， Sweden)。通常，嵌合蛋白可固定在SPR芯片上，或者嵌合蛋白可用 含有抗TNFR1抗体或抗体片段的粗制细菌上清液平衡，所得混合物 流过用全长人TNFR1或鼠TNFR1包被的SPR芯片。

实施例19.TAR2m21-23二聚体是高度亲合力的TNFR1拮抗剂

采用实施例8描述的方法，通过制备在羧基端含有cys残基的 TAR2m21-23形式，制备TAR2m21-23二聚体。蛋白质(TAR2m21-23 CYS)在毕赤酵母中表达，并用Streamline蛋白A进行纯化。非还原 性SDS-PAGE分析表明，～40-50％的蛋白质以二聚体形式存在于溶 液中。二聚体用凝胶过滤色谱进一步纯化。

2mg蛋白质浓缩至约250μl并上样到Superdex 75 HR凝胶过滤 柱(Amersham Bioscience)上，该柱先前已用PBS进行平衡。该柱运 行的流速为0.5ml/分钟，收集0.5ml流分。在280nm处监控从该柱上 洗脱的蛋白质，含有二聚体的流分经非还原性SDS-PAGE得以证实。 合并含有二聚体、但不含单体TAR2m-21-23 CYS的流分。浓缩合并 的流分，在L929 TNF细胞的细胞毒性测定(实施例6)中测定二聚体 dAb的效力。

在L929细胞毒性测定中，将TAR2m21-23二聚体的生物学效力 与单体TAR2m-21-23进行比较。在该测定中，测定了TAR2m21-23 单体和TAR2m21-23二聚体对由TNF诱导的小鼠L929细胞的细胞 毒性的抑制，其结果表示为在测定中抑制50％细胞毒性的dAb单体 或二聚体的浓度(中和剂量50，ND50)。

在测定中，单体dAb的ND50约为600pM。在测定中，二聚体dAb (TAR2m21-23二聚体)的ND50约低10倍(ND50约60-70pM)。这些结 果表明，与dAb单体相比，TAR2m21-23二聚体对细胞表面TNFR1 的亲和力具有显著提高。结果表明，TAR2m21-23二聚体同时结合细 胞表面上的两个单独的TNFR1分子，针对多聚体的所得亲合力效应 导致对TNFR1抑制的改善。

然后测定二聚体形式(TAR2m21-23二聚体)，以观察它是否表现 出TNFR1激动的任何征兆，所述TNFR1激动意即引起TNFR1交联 并促进胞内信号转导和细胞死亡的能力。采用改进L929细胞的细胞 毒性测定，可达到这一点，其中未加TNF-α，而是检测抗TNFR1抗 体或dAb形式，以观察它们是否激动TNFR1并诱导细胞死亡。在测 定中，测定了作为已知TNFR1激动剂的抗TNFR1抗体AF-425-PB (R&D系统)，以及作为已报道的TNFR1、TAR2m-21-23和TAR2m21-23 二聚体的拮抗剂的抗TNFR1抗体MAB430(R&D系统)。

在测定中，抗体AF-425-PB激活TNFR1并诱导细胞毒性，其ND50 约为100pM。在测定中，甚至已报道的拮抗剂抗体MAB430也引起 受体交联和细胞杀伤，其ND50约为10nM。相比之下，在测定中， TAR2m-21-23二聚体却不引起任何细胞死亡，甚至当以极高浓度存 在时(＞1μM)。这些结果表明，TAR2m21-23二聚体不是TNFR1激动 剂。

结果表明，结合TNFR1的dAb的二聚体、三聚体或其它多聚体 对细胞表面表达的TNFR1具有高亲合力，而且是有效TNFR1拮抗 剂。此外，该研究结果表明，结合TNFR1的域1的dAb多聚体(例 如TAR2m21-23二聚体)，能结合两个TNFR1分子(如同测定中作为 激动剂的抗体所能结合的一样)，而且与TNFR1的结构域或表位靶(域 1)的结合，阻止受体链的紧密结合，而这正是起始TNFR1信号转导 所必需的。该特性对二价分子来说是独特的，所述分子能交联细胞 表面的TNFR1，但不引起TNFR1信号转导和细胞死亡。

实施例20.结合人TNFR1和小鼠TNFR1的dAb的分离

已知序列的dAb在大肠杆菌中表达，并用蛋白A层流(streamline) 树脂纯化。洗脱到Tris-甘氨酸中，然后dAb流过SPR芯片，其上已 经固定有生物素化人TNFR1(流动池2)和生物素化鼠TNFR1(流动池 4)。(该SPR芯片用相同密度的人TNFR1和鼠TNFR1包被)。流动池 1和3为空白，作为无抗原参考表面，用于检测并减去非特异性结合。

dAb流过连续的4个流动池(即依次为流动室1、2、3和4)，测 定流动室2与流动室1之间的响应差异，也测定流动室4与流动室3 之间的响应差异。前者测定的是与人TNFR1的结合，而后者是与鼠 TNPR1的结合。记录用于结合人TNFR1和鼠TNFR1的特异性结合 曲线，在曲线中注意到，与鼠TNFR1相比，人TNFR1的缔合速率 更快。解离速率也大致相似。通过每次结合事件所得到的最大响应 单位(RU)数来评价交叉反应。在该实施例中，人生物素化TNFR1表 面在流动室2上包含约900RU的TNFR1，而在流动室4包含约1400RU 的鼠TNFR1。作为对照，浓度为2微摩尔TAR2h-154-7(一种人特异 性dAb)结合人表面的最大响应为385RU，而在小鼠表面的响应仅为 4.5RU。2微摩尔TAR2h-205在人表面得到的响应为435RU，而在小 鼠表面为266RU。

本申请书提到的所有出版物以及所述出版物中引用的参考文 献，全都通过引用结合到本文中。本领域技术人员显而易见的是， 只要不偏离本发明的范围和精神，可以对本发明描述的方法和系统 进行各种的修改和变动。尽管用具体的优选实施方案描述了本发明， 但是应该理解，要求保护的发明并不限于这些具体的实施方案。当 然，对用于实施本发明的所述方式的各种修改，对于分子生物学或 相关领域技术人员来说是显而易见的，这样的修改落入所附权利要 求书范围之内。

附录1：延长体内半衰期的多肽

α-1糖蛋白(血清类粘蛋白(Orosomucoid))(AAG)

α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)

α-1抗胰蛋白酶(AAT)

α-1微球蛋白(蛋白HC)(AIM)

α-2巨球蛋白(A2M)

抗凝血酶III(AT III)

载脂蛋白A-1(Apo A-1)

载脂蛋白B(Apo B)

β-2-微球蛋白(B2M)

血浆铜蓝蛋白(Cp)

补体成分(C3)

补体成分(C4)

C1酯酶抑制剂(C1 INH)

C-反应蛋白(CRP)

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)

铁蛋白(FER)

血纤蛋白原(FIB)

纤连蛋白(FN)

触珠蛋白(Hp)

血红素结合蛋白(HPX)

免疫球蛋白A(IgA)

免疫球蛋白D(IgD)

免疫球蛋白E(IgE)

免疫球蛋白G(IgG)

免疫球蛋白M(IgM)

免疫球蛋白轻链(κ/λ)

脂蛋白(a)[Lp(a)]

甘露糖结合蛋白(MBP)

肌红蛋白(Myo)

血纤蛋白溶解酶原(PSM)

前白蛋白(运甲状腺素蛋白(Transthyretin))(PAL)

视黄醇结合蛋白(RBP)

类风湿因子(RF)

血清淀粉样蛋白A(SAA)

可溶性转铁蛋白受体(sTfR)

转铁蛋白(Tf)

附录2

    配对     治疗相关参考 TNFα/TGF-β ●TGF-b和TNF当注射到胶原诱发的关节炎模型的踝关节中，   可显著增加关节炎症。在非胶原刺激的小鼠中没有作用。 TNFα/IL-1 ●TNF和IL-1在葡萄膜炎病理中起到协同作用。 ●TNF和IL-1在疟疾病理(低血糖，NO)中起到协同作用。 ●TNF和IL-1在炎症中协同诱导多形核(PMN)细胞迁移。

●IL-1和TNF协同诱导PMN向腹膜浸润。 ●IL-1和TNF在炎症中协同诱导内皮细胞分泌IL-1。 ●IL-1或TNF单独诱导某些细胞向膝滑膜浸润。IL-1诱导   PMN、TNF单核细胞。它们一起诱导更严重的浸润，因为   PMN增加。 ●循环心肌抑制物(存在于脓毒病中)是低水平的IL-1和TNF   协同作用。 TNFα/IL-2 ●与杀伤T细胞的协同活化最相关。 TNFα/IL-3 ●白介素3和肿瘤坏死因子α在刺激急性骨髓性白血病胚细胞   克隆生长中的协同作用，是肿瘤坏死因子α诱导第二造血细   胞因子的结果。 ●Cancer Res.1992年4月15日；52(8)：2197-201。 TNFα/IL-4 ●IL-4和TNF协同诱导VCAM在内皮细胞的表达。意味着在   哮喘中具有作用。在RA中与滑膜相关是相同的。 ●TNF和IL-4协同诱导角质形成细胞中的IL-6表达。 ●在培养的成纤维细胞样滑膜细胞(synoviocyte)中可以实现   VCAM-1水平持续上升，即通过TNFα与或者IL-4或者IL-   13联用，通过增加mRNA稳定性。Am.J.Pathol.，1999年4   月；154(4)：1149-58。 TNFα/IL-5 ●在成人及其孩子的支气管过度反应中，肿瘤坏死因子系统与   血清白介素-4、白介素-5、白介素-8、嗜酸性粒细胞阳离子   蛋白和免疫球蛋白E水平之间的关系。Allergy Asthma Proc.   2003年3-4月；24(2)：111-8。 TNFα/IL-6 ●TNF和IL-6是OH-2(一种新的人骨髓瘤细胞系)的强效生长   因子。Eur.J.Haematol.，1994年7月；53(1)：31-7。 TNFα/IL-8 ●TNF和IL-5与PMN协同活化血小板。涉及急性呼吸窘迫   综合征。 ●参见IL-5/TNF(哮喘)。白介素-8与肿瘤坏死因子-α间的协   同作用，用于嗜中性粒细胞介导的血小板活化。Eur Cytokine   Netw.1994年9-10月；5(5)：455-60。(成人呼吸窘迫综合征   (ARDS))。 TNFα/IL-9

TNFα/IL-10 ●IL-10诱导并与TNF协同诱导慢性感染的T细胞的HW表   达。 TNFα/IL-11 ●细胞因子协同诱导破骨细胞分化：由无限增殖或正常颅盖细   胞支持。Am.J.Physiol.Cell Physiol.，2002年9月；283(3)：   C679-87。(骨丢失)。 TNFα/IL-12 TNFα/IL-13 ●在培养的成纤维细胞样滑膜细胞中可以实现VCAM-1水平持   续上升，即通过TNFα与或者IL-4或者IL-13联用，通过增   加mRNA稳定性。Am.J.Pathol.，1999年4月；154(4)：1149-   58。 ●白介素-13和肿瘤坏死因子-α协同诱导人鼻成纤维细胞中嗜   酸性粒细胞趋化因子的产生。Clin Exp Allergy.2000年3月；   30(3)：348-55。 ●白介素-13和肿瘤坏死因子-α协同诱导人鼻成纤维细胞中嗜   酸性粒细胞趋化因子的产生。Clin Exp Allergy.2000年3月；   30(3)：348-55(变应性炎症)。 ●血清TNFβ和IL-13在儿童肾病综合征的治疗反应中的意   义。Cytokine，2003年2月7日；21(3)：155-9。 TNFα/IL-14 ●轻度哮喘患者吸入肿瘤坏死因子α的效果。Thorax.2002年9   月；57(9)：774-8。 TNFα/IL-15 ●轻度哮喘患者吸入肿瘤坏死因子α的效果。Thorax.2002年9   月；57(9)：774-8。 TNFα/IL-16 ●肿瘤坏死因子-α在气管上皮细胞中诱导合成白介素-16：对5-   羟色胺刺激的致敏。Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，2003年3   月；28(3)：354-62。(气管炎症) ●在类风湿性关节炎患者中，循环白介素16与促炎细胞因子   的关系。Rheumatology(Oxford).2001年4月；40(4)：474-5。   没有可用的摘要。 ●白介素16在节段性回肠炎(Crohn’s disease)中被上调，并参   与小鼠TNBS结肠炎。Gastroenterology，2000年10月；119(4)：   972-82。 TNFα/IL-17 ●对白介素-17的抑制，阻止用布氏疏螺旋体(Borrelia

  burgdorferi)攻击的接种疫苗的小鼠的关节炎的发展。Infect   Immun.，2003年6月；71(6)：3437-42。 ●白介素17与肿瘤坏死因子α在体外协同诱导软骨破坏。Ann.   Rheum.Dis.，2002年10月；61(10)：870-6。 ●GM-CSF在由IL-17和TNFα诱导的气管嗜中性粒细胞累积   中的作用。Eur Respir J.2003年3月；21(3)：387-93。(气管   炎症)。 ●摘要：在人骨关节炎膝半月板(osteoarthritic knee menisci)外   植体中，白介素-1、肿瘤坏死因子α和白介素-17协同上调   一氧化氮和前列腺素E2的产生。Arthritis Rheum.，2001年9   月；44(9)：2078-83。 TNFα/IL-18 ●在类风湿性关节炎患者的膝盖滑膜组织中，白介素-18的表   达与白介素-1β和肿瘤坏死因子α水平增加的关系。Arthritis   Rheum.2003年2月；48(2)：339-47。 ●摘要：白介素-18和肿瘤坏死因子-α在2型糖尿病患者血清   中水平上升：与糖尿病性肾病的关系。Metabolism.2003年   5月；52(5)：605-8。 TNFα/IL-19 ●摘要：IL-19诱导IL-6和TNFα的产生，并通过TNFα导致   细胞凋亡。J.Immunol.，2002年10月15日；169(8)：4288-97。 TNFα/IL-20 ●摘要：细胞因子：IL-20，皮肤炎症中的一种新效应物。Curr   Biol.2001年7月10日；11(13)：R531-4。 TNFα/补体 ●炎症和凝固：涉及脓毒症患者。Clin.Infect.Dis.，2003年5   月15日；36(10)：1259-65.Epub 2003年5月08日。综述。 TNFα/TNFγ ●脑部MHC诱导。 ●在抗病毒反应/IFN-β诱导中的协调。 ●嗜中性粒细胞活化/呼吸爆发。 ●内皮细胞活化。 ●当患者用TNF/IFN-γ作为抗病毒疗法进行治疗时，注意毒   性。 ●人星形细胞表达的CXXXC趋化因子。 ●许多论文有关炎症反应，即LPS，以及巨噬细胞活化。 ●抗TNF和抗JFN-γ协同保护小鼠免遭致死性内毒素血症。

TGF-β/IL-1 ●成骨细胞合成的前列腺素(Prostaglndin) ●肠上皮细胞产生的IL-6(炎症模型) ●在肺成纤维细胞中刺激IL-11和IL-6(炎症模型) ●在视网膜中产生IL-6和IL-8。 TGF-β/IL-6 ●软骨癌(Chondrocarcoma)增殖。 IL-1/IL-2 ●B细胞活化 ●LAK细胞活化 ●T细胞活化 ●IL-1与IL-2协同作用产生由TNFα和β(淋巴毒素)介导的、   淋巴因子活化的杀伤细胞。Cytokine，1992年11月；4(6)：   479-87。 IL-1/IL-3 IL-1/IL-4 ●B细胞活化 ●在内皮细胞活化中，IL-4诱导IL-1表达。 IL-1/IL-5 IL-1/TL-6 ●B细胞活化 ●T细胞活化(可替代辅助细胞) ●IL-1诱导IL-6表达 ●C3和血清淀粉样蛋白的表达(急性期反应) ●HIV表达 ●软骨胶原分解。 IL-1/IL-7 ●IL-7是IL-1诱导的胸腺细胞增殖的必要条件。IL-7与IL-1   参与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或肿瘤坏死因子的协同   作用。J.Immunol.，1992年1月1日；148(1)：99-105。 IL-1/IL-8 IL-1/IL-10 IL-1/IL-11 ●细胞因子协同诱导破骨细胞分化：由无限增殖或正常颅盖细   胞支持。Am.J.Physiol.Cell Physiol.，2002年9月；283(3)：   C679-87。(骨丢失)。 IL-1/IL-16 ●在类风湿性关节炎患者中，循环白介素16与促炎细胞因子   的关系。Rheumatology(Oxford).2001年4月；40(4)：474-5。

  没有可用的摘要。 IL-1/IL-17 ●对白介素-17的抑制，阻止用布氏疏螺旋体(Borrelia   burgdorferi)攻击的接种疫苗的小鼠的关节炎的发展。Infect   Immun.2003年6月；71(6)：3437-42。 ●在骨关节炎中，白介素-17对人软骨降解和滑膜炎症的作用。   Osteoarthritis Cartilage.2002年10月；10(10)：799-807。 ●摘要：在人骨关节炎膝半月板外植体中，白介素-1、肿瘤坏   死因子α和白介素-17协同上调一氧化氮和前列腺素E2的产   生。Arthritis Rheum，2001年9月；44(9)：2078-83。 IL-1/IL-18 ●在类风湿性关节炎患者的膝盖滑膜组织中，白介素-18的表   达与白介素-1β和肿瘤坏死因子α水平增加的关系.Arthritis   Rheum.2003年2月；48(2)：339-47。 IL-1/IFN-γ IL-2/IL-3 ●T细胞增殖 ●B细胞增殖 IL-2/IL-4 ●B细胞增殖 ●T细胞增殖 ●(选择性诱导CD8和NK淋巴细胞活化)IL-2R β激动剂P1-   30与IL-2、IL-4、IL-9和IL-15协同作用：生物学和分子效   应。J.Immunol.，2000年10月15日：165(8)：4312-8。 IL-2/IL-5 ●B细胞增殖/Ig分泌 ●IL-5诱导B细胞上的IL-2受体 IL-2/IL-6 ●细胞毒T细胞的发育 IL-2/IL-7 IL-2/IL-9 ●参见IL-211L-4(NK细胞) IL-2/IL-10 ●B细胞活化 IL-2/IL-12 ●在新鲜人NK细胞中，IL-12与IL-2协同诱导淋巴因子活化   的细胞毒性和穿孔蛋白和粒酶基因表达。CellImmunol.1995   年10月1日；165(1)：33-43。(T细胞活化) IL-2/IL-15 ●参见IL-2/IL-4(NK细胞) ●(T细胞活化和增殖)IL-15和IL-2：一种用于T细胞在体内   生死的物质。NatMed.2001年1月；7(1)：114-8。

IL-2/IL-16 ●IL-16和IL-2对CD4+T细胞的协同活化。J.Immunol.，1998   年3月1日；160(5)：2115-20。 IL-2/IL-17 ●白介素17早期参与人和实验性肾同种异体移植排斥的证   据。J.Pathol.，2002年7月；197(3)：322-32。 IL-2/IL-18 ●在小鼠间质性肺炎发病机制中，白介素18(IL-18)与IL-2协   同诱导小鼠致死性肺损伤：一种对细胞因子、趋化因子和   自然杀伤细胞的潜在作用。Blood.2002年2月15日；99(4)：   1289-98。 IL-2/TGF-β ●控制CD4效应物的命运：转化生长因子β1和白介素2协同   阻止细胞凋亡并促进效应物扩充。J.Exp.Med.，1995年9月   1日；182(3)：699-709。 IL-2/IFN-γ ●B细胞分泌的Ig ●IL-2诱导T细胞表达IFN-γ IL-2/IFN-α/β ●无 IL-3/IL-4 ●协同作用与肥大细胞生长 ●IL-4和GM-CSF或LL-3对人单核细胞表达CD23的协同诱   导效应：IFN-α和IFN-γ的调节效应。Cytokine.1994年7月；   6(4)：407-13。 IL-3/IL-5 IL-3/IL-6 IL-3/IFN-γ ●IL-4和IFN-γ协同提高人肠道上皮细胞中总多聚IgA受体水   平。蛋白酪氨酸激酶的作用。J.Immunol.，1996年6月15   日；156(12)：4807-14。 IL-3/GM-CSF ●细胞因子对人嗜酸性粒细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体α链   表达的差异调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体α表   达(缺乏IL-5反应性)，但上调IL-3受体α表达。J.Immunol.，   2003年6月1日；170(11)：5359-66。(变应性炎症) IL-4/IL-2 ●IL-4协同性增加IL-2和IL-12诱导的鼠NK细胞的IFN-γ表   达。Blood.2003年3月13日[Epub ahead ofprint] IL-4/IL-5 ●增加肥大细胞组胺等。响应IgE而分泌 ●Th2样细胞因子应答参与大疱性类天疱疮。IL-4和IL-5在   疾病的发病机制中的作用。Int.J.Immunopathol.Pharmacol.，

1999年5-8月；12(2)：55-61。 IL-4/IL-6 IL-4/1L-10 IL-4/1L-11 ●白介素-11与白介素-4间的协同相互作用，支持小鼠原始造   血祖细胞的增殖。Blood.1991年9月15日；78(6)：1448-51。 IL-4/IL-12 ●IL-4和IL-18对树突细胞产生IL-12依赖性IFN γ的协同作   用。J.Immunol.，2000年6月1日；164(1)：64-71。(增加Th1/Th2   分化) ●IL-4协同性增加IL-2和IL-12诱导的鼠NK细胞的IFN-γ表   达。Blood.2003年3月13日[Epub ahead of print] IL-4/IL-13 ●摘要：白介素-4和白介素-13信号转导连接图谱。Science 2003   年6月6日；300(5625)：1527-8。(过敏、哮喘) ●在小鼠变应性哮喘模型中，对IL-4/IL-13受体系统的抑制，   防止变应性致敏，而不影响已建立的过敏。J.Allergy Clin.   Immunol.，2003年6月；111(6)：1361-1369。 IL-4/1L-16 ●(哮喘)白介素(IL)-4/IL-9和外源IL-16诱导BEAS-2B细胞(一   种支气管上皮细胞系)产生IL-16。Cell Immunol.2001年2   月1日；207(2)：75-80。 IL-4/1L-17 ●白介素(1L)-4和IL-17协同刺激人结肠成肌纤维细胞分泌   IL-6。Int.J.Mol.Med.，2002年11月；10(5)：631-4。(肠炎) IL-4/IL-24 ●IL-24由大鼠巨噬细胞和人巨噬细胞表达。Immunobiology.   2002年7月；205(3)：321-34。 IL-4/IL-25 ●摘要：在肺部，新IL-17家族成员促进Th1或Th2反应：   新细胞因子IL-25的体内功能。J.Immunol.，2002年7月1   日；169(1)：443-53。(变应性炎症) ●摘要：在FcεRI介导的活化后，肥大细胞产生白介素-25。   Blood.2003年5月1日；101(9)：3594-6。Epub 2003年6月   02日(变应性炎症) IL-4/IFN-γ ●摘要：白介素4诱导内皮细胞产生白介素6：与干扰素-γ协   同。Eur.J.Immunol.，1991年1月；21(1)：97-101。 IL-4/SCF ●干细胞因子和IL-4调节人肠道肥大细胞。Immunol Rev.2001   年2月；179：57～60。综述

IL-5/IL-3 ●细胞因子对人嗜酸性粒细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体α链   表达的差异调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体α表   达(缺乏IL-5反应性)，但上调IL-3受体α表达。J.Immunol.，   2003年6月1日；170(11)：5359-66。(变应性炎症，参见摘   要) IL-5/IL-6 IL-5/IL-13 ●地塞米松对小鼠变应性气管炎症和气管过度反应的抑制：嗜   酸性粒细胞、IL-5，嗜酸性粒细胞趋化因子和IL-13的作用。   J.Allergy Clin.Immunol.，2003年5月；111(5)：1049-61. IL-5/1L-17 ●在小鼠变应性哮喘模型中，当变应原吸入后，白介素-17促   使粒细胞流向气管。Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，2003年6   月；28(1)：42-50. IL-5/IL-25 ●摘要：在肺部，新IL-17家族成员促进Th1或Th2反应：   新细胞因子IL-25的体内功能。J.Immunol.，2002年7月1   日；169(1)：443-53。(变应性炎症) ●摘要：在FcεRI介导的活化后，肥大细胞产生白介素-25。   Blood.2003年5月1日；101(9)：3594-6.Epub 2003年6月02   日(变应性炎症) IL-5/IFN-γ IL-5/GM-CSF ●细胞因子对人嗜酸性粒细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体α链   表达的差异调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体α表   达(缺乏IL-5反应性)，但上调IL-3受体α表达。J.Immunol.，   2003年6月1日；170(11)：5359-66。(变应性炎症) IL-6/IL-10 IL-6/IL-11 IL-6/IL-16 ●白介素16刺激人单核细胞表达和产生促炎细胞因子。   Immunology.2000年5月；100(1)：63-9。 IL-6/IL-17 ●白介素(IL)-17通过IL-6旁分泌/自分泌环刺激气管粘蛋白基   因表达。J.Biol.Chem.，2003年5月9日；278(19)：17036-43.   Epub 2003年3月06日(气管炎症、哮喘) IL-6/IL-19 ●摘要：IL-19诱导IL-6和TNFα的产生，并通过TNFα导致   细胞凋亡。J.Immunol.，2002年10月15日；169(8)：4288-97。

IL-6/FN-γ IL-7/IL-2 ●白介素7使移植物抗宿主病恶化。Blood.2002年10月1日；   100(7)：2642-9。 IL-7/IL-12 ●IL-7和IL-12对人T细胞活化的协同作用。J.Immunol.，1995   年5月15日；154(10)：5093-102. IL-7/IL-15 ●白介素-7和白介素-15在皮肤T细胞淋巴瘤细胞中调节bcl-   2和c-myb基因表达。Blood.2001年11月1日；98(9)：   2778-83。(生长因子) IL-8/IL-11 ●在真性红细胞增多症(polycythaemia vera)中，白介素(IL)-11   和IL-8的异常产生。Cytokine.2002年11月21日；20(4)：   178-83。 IL-8/IL-17 ●IL-17在关节破坏中的作用。Drug News Perspect.2002年1   月；15(1)：17-23。(关节炎) ●摘要：白介素-17刺激人气管上皮细胞表达白介素-8、生长   相关癌基因α和粒细胞-集落刺激因子。Am.J.Respir.Cell   Mol.Biol.，2002年6月；26(6)：748-53。(气管炎症) IL-8/GSF ●白介素-8：一种自分泌/旁分泌生长因子，用于人类造血祖   细胞与集落刺激因子-1的协同作用，以促进单核细胞-巨噬   细胞生长和分化。Exp Hematol.1999年1月；27(1)：28-36。 IL-8/VGEP ●在原发性和复发性恶性胶质瘤中，腔内VEGF、bFGF、IL-8、   IL-12水平。J.Neurooncol.，2003年5月；62(3)：297-303。 IL-9/IL-4 ●用抗白介素-9抗体治疗，在小鼠哮喘模型中抑制气管炎症   和过度反应。Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2002年8月1   日；166(3)：409-16。 IL-9/IL-5 ●肺部过量表达IL-9，诱导Th2细胞因子表达，导致免疫病   理。J.Clin.Invest.，2002年1月；109(1)：29-39。 ●Th2细胞因子和哮喘。白介素-9作为哮喘的治疗靶标。Respir   Res.2001；2(2)：80-4.Epub 2001年2月15日。综述。 ●摘要：白介素-9增加白介素-5受体表达、分化和人嗜酸性   粒细胞存活。Blood.2005年9月15日；96(6)：2163-71(哮喘) IL-9/IL-13 ●用抗白介素-9抗体治疗，在小鼠哮喘模型中抑制气管炎症   和过度反应。Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2002年8月1

  日；166(3)：409-16。 ●白介素-13对上皮细胞的直接影响，在哮喘中引起气管过度   反应和粘液过量产生。Nat Med.2002年8月；8(8)：885-9。 IL-9/I1-16 ●参见IL-4/IL-16 IL-10/IL-2 ●白介素-10(IL-10)和白介素-2(IL-2)在体液免疫应答中的相   互影响：IL-10与IL-2协同增加人B淋巴细胞的反应，其   机制不同于CD25表达的上调。Cell Immunol.1994年9月；   157(2)：478-88。 IL-10/IL-12 IL-10/TGF-β ●在正常免疫和特异性免疫疗法中，IL-10和TGF-β协同作用   于调节性T细胞对粘膜变应原的应答。Eur.J.Immunol.，2003   年5月；33(5)：1205-14。 IL-10/IFN-γ IL-11/IL-6 ●白介素-6和白介素-11通过RANKL非依赖性机制支持人破   骨细胞形成。Bone.2003年1月；32(1)：1-7。(炎症中的骨吸   收) IL-11/IL-17 ●急性和慢性皮肤损伤之间，IL-11和IL-17的极化体内表达。   J.Allergy Clin.Immunol.，2003年4月；111(4)：875-81。(变应   性皮炎) ●在鼠胶原诱发的关节炎中，IL-17通过NF-κB配体的受体活   化物/护骨蛋白平衡的损失而促进骨侵蚀。J.Immunol.，2003   年3月1日；170(5)：2655-62。 IL-11/TGF-β ●急性和慢性皮肤损伤之间，IL-11和IL-17的极化体内表达。   J.Allergy Clin.Immunol.，2003年4月；111(4)：875-81。(变应   性皮炎) IL-12/IL-13 ●在系统性红斑狼疮中，白介素-12和白介素-13的关系与类   别特异性类风湿因子和抗心磷脂抗体不平衡。Clin   Rheumatol.2003年5月；22(2)：107-11。 IL-12/IL-17 ●活动性炎性肠病中，白介素-12和-17的上调。Scand J.   Gastroenterol.，2003年2月；38(2)：180-5。 IL-12/IL-18 ●白介素12和白介素18对自然杀伤细胞的协同增殖和活化。   Cytokine.1999年11月；11(11)：822-30.

●IL-12和IL-18引起的炎性肝脂肪变性。J.Interferon Cytokine   Res.，2003年3月；23(3)：155-62。 IL-12/IL-23 ●白介素-23、而不是白介素-2是脑部自身免疫性炎症的关键   性细胞因子。Nature.2003年2月13：421(6924)：744-8。 ●摘要：IL-23在促进细胞免疫中的独特作用。J.Leukoc.Biol.，   2003年1月；73(1)：49-56。综述。 IL-12/IL-27 ●摘要：IL-27，一种由EBI3和p28蛋白组成的异型二聚体   的细胞因子，诱导幼稚CD4(+)T细胞增殖。Immunity.，2002   年6月；16(6)：779-90。 IL-12/IFN-γ ●IL-12诱导B细胞和T细胞表达IFN-γ，作为免疫刺激的组   成部分。 IL-13/IL-5 ●参见IL-5/IL-13 IL-13/1L-25 ●摘要：在肺部，新IL-17家族成员促进Th1或Th2反应：   新细胞因子IL-25的体内功能。J.Immunol.，2002年7月1   日；169(1)：443-53。(变应性炎症) ●摘要：在FcεRI介导的活化后，肥大细胞产生白介素-25。   Blood.2003年5月1日；101(9)：3594-6.Epub 2003年6月02   日(变应性炎症) IL-15/IL-13 ●白介素(IL)-13和IL-15在子宫内膜异位症妇女和正常育龄妇   女的异位和正位子宫内膜中的差异表达。Am.J.Reprod.   Immunol.，2003年2月；49(2)：75-83。 IL-15/IL-16 ●IL-15和IL-16在皮肤T细胞淋巴瘤中过量表达：在蕈样肉   芽肿病进程中的阶段依赖性增加。Exp Dermatol.2000年8   月；9(4)：248-51。 IL-15/IL-17 ●摘要：淋巴细胞和嗜中性粒细胞产生的IL-17对脂多糖诱导   的气管嗜中性粒细胞增多症是必不可少的：IL-15作为可能   的触发子。J.Immunol.，2003年2月15日；170(4)：2106-42。   (气管炎症) IL-15/IL-21 ●IIL-21与IL-15或IL-18协同增加人NK和T细胞产生IFN-γ   产生。J.Immnunol.，2003年6月1日；170(11)：5464-9。 IL-17/IL-23 ●白介素-23促进以产生白介素-17为特征的不同CD4 T细胞   活化状态。J.Biol.Chem.，2003年1月17日；278(3)：1910-4.

  Epub 2002年11月3日。 IL-17/TGF-β ●急性和慢性皮肤损伤之间，IL-11和IL-17的极化体内表达。   J.Allergy Clin.Immunol.，2003年4月；111(4)：875-81。(变应   性皮炎) IL-18/IL-12 ●白介素12和白介素18对自然杀伤细胞的协同增殖和活化。   Cytokine.1999年11月；11(11)：822-30. ●摘要：IL-12在鼠慢性移植物抗宿主病中体外抑制免疫球蛋   白的产生：Eur Immunol.1998年6月；28(6)：2017-24。 IL-18/IL-21 ●IL-21与IL-15或IL-18协同增加人NK和T细胞产生IFN-γ。   J.Immunol.，2003年6月1日；170(11)：5464-9。 IL-18/TGF-β ●用皮质类固醇治疗的格雷夫斯(Graves)氏眼病患者的血清中   的白介素18和转化生长因子β1。Int Immunopharmacol. 2003   年4月；3(4)：549-52。 IL-18/IFN-γ 抗TNFα/抗 CD4 ●DBA/1关节炎小鼠中的协同疗效。

附录3：肿瘤学组合

    靶标     疾病   配对   CD89*   用作细胞毒细胞募集物   所有   CD19   B细胞淋巴瘤   HLA-DR   CD5   HLA-DR   B细胞淋巴瘤   CD89   CD19   CD5   CD38   多发性骨髓瘤   CD138   CD56   HLA-DR   CD138   多发性骨髓瘤   CD38   CD56   HLA-DR   CD138   肺癌   CD56   CEA

  CD33   急性骨髓性淋巴瘤   CD34   HLA-DR   CD56   肺癌   CD138   CEA   CEA   Pan癌   MET受体   VEGF   Pan癌   MET受体   VEGF受体   Pan癌   MET受体   IL-13   哮喘/肺部炎症   IL-4   IL-5   嗜酸性粒细胞趋化因子   MDC   TARC   TNFα   IL-9   EGFR   CD40L   IL-25   MCP-1   TGFβ   IL-4   哮喘   IL-13   IL-5   嗜酸性粒细胞趋化因子   MDC   TARC   TNFα   IL-9   EGFR   CD40L   IL-25   MCP-1   TGFβ   嗜酸性粒细   胞趋化因子   哮喘   IL-5   嗜酸性粒细胞趋化因子-2   嗜酸性粒细胞趋化因子-3   EGFR   癌症   HER2/neu   HER3

  HER4   HER2   癌症   HER3   HER4   TNFR1   RA/节段性回肠炎   IL-1R   IL-6R   IL-18R   TNFα   RA/节段性回肠炎   IL-1α/β   IL-6   IL-18   ICAM-1   IL-15   IL-17   IL-1R   RA/节段性回肠炎   IL-6R   IL-18R   IL-18R   RA/节段性回肠炎   IL-6R

附录4

数据汇总

 靶标  dAb 平衡解离常数 Kd＝K解离/K 缔合) K解离 配体测定的 IC50 基于细胞中 和测定的 ND50  TAR1  TAR1  单体 300nM～5pM (即3×10-7～ 5×10-12)， 优选 50nM～20pM 5×10-1～ 1×10-7 500nM～ 100pM 500nM～ 50pM  TAR1  二聚体 作为TAR1单 体 作为TAR1 单体 作为TAR1单 体 作为TAR1 单体  TAR1  三聚体 作为TAR1单 体 作为TAR1 单体 作为TAR1单 体 作为TAR1 单体  TAR1-5  TAR1-27  TAR1-5-  19单体 30nM

TAR1-5- 19同型 二聚体 具有 (Gly4Ser)3接 头＝20nm 具有 (Gly4Ser)5 接头＝2nm 具有 (Gly4Ser)7接 头＝10nm 以Fab形式 ＝1nM ＝30nM ＝3nM ＝15nM TAR1-5- 19异型 二聚体 具有 (Gly4Ser)n接 头TAR1-5- 19 d2＝2nM TAR1-5-19 d3 ＝8nM TAR1- 5-19 d4＝2- 5nM TAR1-5- 19 d5＝8nM 以Fab形式 TAR1-5- 19CH d1CK＝ 6nM TAR1-5- 19CK d1CH＝ 6nM TAR1-5- 19CH d2CK＝ 8nM TAR1-5- 19CH d3CK＝ 3nM ＝12nM ＝10nM ＝12nM TAR1-5异 型二聚体 具有 (Gly4Ser)n接

头 TAR1-5 d1＝ 30nM TAR1- 5d2＝50nM TAR1-5 d3＝ 300nM TAR1- 5d4＝3nM TAR1-5 d5＝ 200nM TAR1- 5d6＝100nM 以Fab形式 TAR1-5CH d2CK＝30nM TAR1- 5CKd3CH＝ 100nM TAR1-5- 19同型 二聚体 0.3nM 3-10nM (例如3nM) TAR2 TAR2 单体 作为TAR1单 体 作为TAR1 单体 500nM～ 100pM 500nM～ 50pM TAR2-10 TAR2-5 血清白 蛋白 抗SA单 体 1nM～ 500μM，优选 100nM～ 10μM 以双特异性形 式，靶亲和力 为SA dAb亲 和力的1- 100,000倍， 例如100pM (靶)和10μM 1nM～ 500μM，优选 100nM～ 10μM 以双特异性形 式，靶亲和力 为SA dAb亲 和力的1- 100,000倍。 例如100pM (靶)和10μM

 SA亲和力。 SA亲和力。 MSA-16  200nM MSA-26  70nM

相关申请

本申请是于2004年11月10日申请的美国专利申请号10/985,847 的部分继续申请，它是：

1)于2004年10月8日申请的国际专利申请号PCT/GB2004/ 004253(指定国为美国)的部分继续申请；和

2)于2003年12月24日申请的国际专利申请号PCT/GB2003/ 005646(指定国为美国)的部分继续申请，并且要求于2002年12月27 日申请的英国申请号GB 0230202.4和于2003年11月28日申请的英 国申请号GB 0327706.8的优先权，它是

于2003年6月30日申请的国际专利申请号PCT/GB2003/002804 (指定国为美国)的部分继续申请，并且要求于2002年12月27日申 请的英国申请GB 0230202.4的优先权，它是

于2002年6月28日申请的国际专利申请号PCT/GB02/03014(指 定国为美国)的部分继续申请。

上述申请的全部公开内容都通过引用结合到本文中。